JPH11310595A - オリゴペプチドの１工程塩変換および精製方法 - Google Patents

オリゴペプチドの１工程塩変換および精製方法

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JPH11310595A
JPH11310595A JP11084386A JP8438699A JPH11310595A JP H11310595 A JPH11310595 A JP H11310595A JP 11084386 A JP11084386 A JP 11084386A JP 8438699 A JP8438699 A JP 8438699A JP H11310595 A JPH11310595 A JP H11310595A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ２つの作業工程を１工程にまとめ、かつピリ
ジンの使用を避ける、オリゴペプチドの塩変換および精
製のための更なる方法を提供する。 【解決手段】 塩変換および精製すべきオリゴペプチド
を、その塩酸塩の形でアセテート含有溶剤による液体ク
ロマトグラフィーを介して精製する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、オリゴペプチドの
１工程塩変換および精製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】オリゴペプチドは、屡々生物学的活性を
示し、かつ従って治療剤として使用される。例として
は、ＬＨＲＨアゴニストおよびアンタゴニストが挙げら
れ、これらは就中、一定の型の癌の治療に使用される。
【０００３】精製すべきオリゴペプチドは、当業者に公
知の方法によって製造することができる。適当な方法
は、特に固体担体材料上でのメリフィールドのペプチド
合成または溶液中での慣用の合成を包含する。メリフィ
ールドの固相合成および溶液中での合成の両者において
は、分子中の一定の部位が、製造の最後に分解して除去
される保護基を有することが不可欠である。固相合成に
おいては、更に、オリゴペプチドを固体担体から分離す
る必要がある。ペプチド合成の更なる詳細は、関連文献
（Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Vo
l.15/1および15/2；M.Bodanszky, Principles of Pepti
de Synthesis, Springer Verlag 1984）を参照のこと。
【０００４】製造すべきペプチドが医薬品であるなら
ば、患者に薬剤の適用と一緒にいかなる異物または他の
潜在的に有害な物質を与えてはならないため、屡々オリ
ゴペプチドがその酢酸塩の形で存在することが所望され
る。
【０００５】しかしながら屡々、合成に関連する事情の
ため、オリゴペプチドは必ずしも酢酸塩の形で存在する
ことがない場合がある。というのも、酢酸以外の酸が保
護基の最終的な開裂のために使用される必要があるこ
と、またはペプチドの遊離した形は製造できないかまた
は困難を伴ってのみ製造でき、かつ酢酸による酢酸塩へ
の簡単な変換が不可能であることのどちらかだからであ
る。保護基の開裂または合成に必要な樹脂からのペプチ
ドの開裂のためには、一般に比較的強酸、例えばトリフ
ルオロ酢酸、塩酸または臭化水素酸を使用する必要があ
る。これらの開裂方法の更なる詳細は、再び標準テキス
ト（Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie,
Band 15/1および15/2；M.Bodanszky, Principles of Pe
ptide Synthesis, Springer Verlag 1984）を参照のこ
と。
【０００６】動物またはヒトに使用するために必要な関
連するオリゴペプチドの酢酸塩を製造するためには、前
記の場合においてオリゴペプチドを強制的に塩変換させ
ることである。
【０００７】有効物質として試験されるべきオリゴペプ
チドまたは既に治療剤として市販されているオリゴペプ
チドは、その純度に関して特定の必要条件を満たさねば
ならない。適当な慣用の精製方法がないため、合成中に
形成する生成混合物は一般にクロマトグラフィー、特に
高圧液体クロマトグラフィーによって精製される。この
目的のために、オリゴペプチドを溶剤中、有利には溶離
剤として選択された移動溶剤の溶剤混合物中に取り込
み、これをカラムに適用する。
【０００８】オリゴペプチドに関しては、幾つかの方法
が塩変換および精製に関する文献に既に記載されてい
る。ガブリエル（Gabriel）によれば（Int.J.Peptide P
roteinRes.1987, 30, 40-43）、オリゴペプチドＧＲＦ
（１〜４４）−ＮＨ2は、そのトリフルオロ酢酸塩から
酢酸塩にピリジン含有溶剤および酢酸含有溶剤を使用す
る高圧液体クロマトグラフィーによって変換することが
できる。かかる方法の後に、必然的にオリゴペプチド中
に残留するピリジン残分に関しては、勿論該物質の毒性
学的特性に関して問題が残る。また、危険なピリジンを
比較的大量必要とする精製方法は、工業的な安全性の側
面から不所望である。
【０００９】ヘーゲル他（Hoeger et al）（Biochromat
ography 1987, 2, 134-142）は、ピリジン含有溶剤系の
使用は避けてＧｎＲＨペプチドを塩変換および精製しよ
うと試みた。フッ化物塩から出発して、２工程の逆相勾
配クロマトグラフィーを、リン酸トリエチルアンモニウ
ム（ＴＥＡＰ）およびトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）緩衝
液中で改質剤（modifier）としてアセトニトリルを使用
して実施した。精製ペプチド分画を凍結乾燥し、引き続
き希酢酸での陰イオン交換クロマトグラフィーまたは酢
酸アンモニウム／アセトニトリル勾配における逆相クロ
マトグラフィーによって酢酸塩に変換した。
【００１０】欧州特許第０１４５２５８号明細書は、就
中ＬＨＲＨアゴニストの群のノナペプチドおよびデカペ
プチドのＨＦ塩の精製を記載している。ここではまた、
塩変換は精製工程と別々に、まず高圧条件下で陰イオン
交換クロマトグラフィーによって、引き続き酢酸アンモ
ニウムおよびアセトニトリルからなる溶離剤によってオ
クタデシル−シラン処理したケイ酸ゲル相上で最終的な
精製をして実施する。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、２つ
の作業工程を１工程にまとめ、かつピリジンの使用を避
ける、オリゴペプチドの塩変換および精製のための更な
る方法を提供することである。
【００１２】前記課題およびより明確には特定しないが
先行技術から明白である更なる課題は、請求項１の特徴
部である。本発明の方法の有利な変更は請求項１に関す
る従属請求項である。
【００１３】
【課題を解決するための手段】塩変換および精製すべき
オリゴペプチドを、その塩酸塩の形でアセテート含有溶
剤による液体クロマトグラフィーによって精製すること
によって、事実上塩化物不含の精製オリゴペプチドの酢
酸塩が、極めて簡単であるが、それにもかかわらず有利
な方法で得られる。従って、本発明による方法を使用す
ることで、今まで２工程でまたは毒性学的に有害なピリ
ジンを使用することによってのみ達成できた当該オリゴ
ペプチドの効果的な精製と塩変換を、ピリジンを添加す
ることなく単一の作業工程にまとめることが可能であ
る。有利には、本発明によって得られる生成物分画を、
合しかつ凍結乾燥によって乾燥させる。該酢酸塩は、塩
化物から約８５％の収率で得られる。このようにして９
９．５％までのパーセンテージで得られる純粋なオリゴ
ヌクレオチドの酢酸塩は、適当な配合後に医学的治療お
よび療法のための有効成分として使用することができ
る。
【００１４】本発明の方法ためには、オリゴペプチドは
その塩化物の形で使用する必要がある。これを解決する
ための最も簡単な方法は保護基の開裂のために塩酸を使
用することである。しかしながら他方では、開裂剤の酸
強度の結果として生じるペプチド加水分解および側鎖の
基での他の二次反応は、不所望な競合反応を構成する。
これらの理由および他の理由（例えばＴＦＡ中でのペプ
チドの可溶性）のため、あまり強くない無水の酸、例え
ばトリフルオロ酢酸または無水の強酸混合物、例えばＨ
Ｂｒ／酢酸を屡々かかる保護基の開裂のために使用す
る。
【００１５】ここで、全く意想外であるが、にもかかわ
らず有利には、保護されたオリゴペプチドを水性濃塩酸
を使用しても脱保護でき、それから形成するオリゴペプ
チドの塩が、あまり強くない無水トリフルオロ酢酸、あ
るいはそれと有機溶剤との混合物での、またはＨＢｒ／
酢酸系でのより慣用の開裂と比較して、副生成物を非常
に低い割合で含有することが判明した。このことは、明
らかでも容易に推考できるものでもない。
【００１６】有利には、前記のオリゴペプチドからの保
護基の開裂は、温度範囲−２５℃〜３０℃、特に有利に
は−１０℃〜１０℃、より特に有利には０℃〜５℃で実
施される。
【００１７】オリゴペプチドの塩化物は、液体クロマト
グラフィーによる精製のために濃塩酸水溶液の形で使用
してもよい。しかしながら、有利には塩化物を、例えば
保護基を開裂させた後に凍結乾燥によって単離し、次い
でまずそれを液体クロマトグラフィー溶剤系または酢酸
中に溶解させ、これをカラムに添加することにより単離
する。
【００１８】有利には、高圧液体クロマトグラフィーが
オリゴペプチドを精製するための液体クロマトグラフィ
ー法として使用される。以下の組成の溶剤が勾配溶離の
ための溶剤系として使用される： 溶剤Ａ 溶剤Ｂ ｉ．水８５〜９８％ ｉ．水２０〜４８％ ｉｉ．酢酸２〜１０％ ｉｉ．酢酸２〜１０％ ｉｉｉ．アセトニトリル０〜５％ ｉｉｉ．アセトニトリル５０〜７０％ または 溶剤Ａ 溶剤Ｂ ｉ．水８５〜９８％ ｉ．水０〜１０％ ｉｉ．酢酸２〜１０％ ｉｉ．酢酸２〜１０％ ｉｉｉ．メタノール０〜５％ ｉｉｉ．メタノール８０〜９８％。
【００１９】勾配溶離のためには、有利には以下のもの
からなる溶剤混合物を使用する： 溶剤Ａ 溶剤Ｂ ｉ．水９２％ ｉ．水２８％ ｉｉ．酢酸５％ ｉｉ．酢酸５％ ｉｉｉ．アセトニトリル３％ ｉｉｉ．アセトニトリル６７％ または 溶剤Ａ 溶剤Ｂ ｉ．水９０％ ｉ．水５％ ｉｉ．酢酸５％ ｉｉ．酢酸５％ ｉｉｉ．アセトニトリル５％ ｉｉｉ．アセトニトリル９０％。
【００２０】有利には、精製はカラム温度５℃〜５０
℃、特に有利には１５℃〜３５℃、より特に有利には２
０℃〜３０℃で実施する。
【００２１】カラム圧力は、５〜１００バール、有利に
は２０〜８０バール、特に有利には３０〜６０バールに
すべきである。原則的に、精製のための固定相として当
業者に公知の材料を使用してもよい。逆相材料が特に適
当である。逆相材料とは、担体材料、例えばシリカゲル
または有機ポリマーをベースとするカラム充填体を意味
すると解される。シリカゲルの場合においては、親水性
表面をオルガノシランによって変性させてもよい。この
目的のために、Ｃ−２、Ｃ−８またはＣ−１８変性が特
に適当である。特に有利には、Ｃ−１８変性ＲＰ−１８
相、より特に有利にはＭａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ社
のＮｕｃｌｅｏｓｉｌ（Ｒ）３００−７−Ｃ18またはＭ
ｅｒｃｋ社のＰｕｒｏｓｐｈｅｒ（Ｒ）ＲＰ１８（１０
μｍ）を使用する。
【００２２】本発明の明細書中でのオリゴペプチドと
は、アミノ酸５〜２５個を有するペプチドを意味すると
解される。アミノ酸８〜１２個を有する範囲のオリゴペ
プチドが有利である。アミノ酸１０個を有するオリゴペ
プチドの使用が極めて特に有利である。
【００２３】オリゴペプチドの塩変換および精製のため
の前記の液体クロマトグラフィー法は、いわゆる擬似移
動床技術（simulated moving bed method）ならびに循
環クロマトグラフィーによって実施することができる。
【００２４】特に有利には、本発明による方法は、ＬＨ
ＲＨアンタゴニストであるセトロレリックス（Cetrorel
ix）（１）およびアンタレリックス（Antarelix）
（２）を製造するための合成において使用される。
【００２５】Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ（２）−Ｄ−Ｐｈｅ（４
Ｃｌ）−Ｄ−Ｐａｌ（３）−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｃｉ
ｔ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2・２
ＣＨ3ＣＯＯＨ１ Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ（２）−Ｄ−Ｐｈｅ（４Ｃｌ）−Ｄ−
Ｐａｌ（３）−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｈｃｉ−Ｌｅｕ−
Ｌｙｓ（ε−イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−Ｎ
Ｈ2・２ＣＨ3ＣＯＯＨ２ セリンおよびチロシンの側鎖におけるｔ−ブチル保護基
の導入は、合成において特に適当であると判明した。目
的の生成物を得るためには、これらの保護基を酸性条件
下（ＴＦＡまたはＨＣｌ）で再び分解除去せねばならな
い。塩酸によるｔ−ブチル基の開裂においては、ＴＦＡ
を使用する場合よりも副生成物の形成が極めて少ない。
最適化した分離方法はクロマトグラフィー法に適当であ
り、かつ３０ｃｍ以上の内径およびクロマトグラフィー
運転（chromatography run）につき２００ｇ以上の注入
量を有する分取ＨＰＬＣカラムの使用を可能にする。
【００２６】本発明による方法の結果として、前記のオ
リゴペプチドは、例えばより有利であり、従って経済的
により有利な方法において数キログラム（multikilogra
m）の規模で製造することができる。
【００２７】本明細書中に記載されている本発明のため
の出発物質は当業者に自体公知の方法によって製造する
ことができる。関連するテキスト（Houben-Weyl, Metho
dender organischen Chemie, Vol.15/1および15/2；M.B
odanszky, Principles of Peptide Synthesis, Springe
r Verlag 1984）を参照のこと。
【００２８】本発明を以下の実施例により説明するが、
本発明はこれにより限定されるものではない：
【実施例】例１： Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｄ−ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐａｌ
−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｃｉｔ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒ
ｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2・２ＨＣｌ（１ａ）（セトロレ
リックス塩酸塩）の製造 Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｄ−ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐａｌ
−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｃｉｔ−
Ｌｅｕ−Ａｒｇ（ＨＣｌ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ
2５０ｇ（３１．６５ミリモル）を、激しく撹拌しなが
ら氷冷濃塩酸２００ｍｌ中に添加する。反応混合物を０
℃〜５℃で約１時間撹拌し、ｎ−ブタノール０．７５ｌ
および氷０．５ｋｇの撹拌混合物中に添加し、水１２０
ｍｌの添加後に相を分離し、有機相のｐＨを水酸化ナト
リウムで約２に調整し、かつブタノール溶液を真空で蒸
発させる。残留物をｔ−ブチルメチルエーテル０．５ｌ
中に懸濁し、吸引濾過し、ｔ−ブチルメチルエーテル
０．５ｌで洗浄し、かつ真空で乾燥させる。
【００２９】１ａの収率：４９ｇ（１０３％、物質はＮ
ａＣｌ約４重量％を含有する）、ＨＰＬＣ純度９４．４
面積％（area%）（図６参照）。
【００３０】例２： Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｄ−ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐａｌ
−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｃｉｔ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒ
ｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2・２ＴＦＡ（１ｂ）（セトロレ
リックストリフルオロ酢酸塩）の製造 Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｄ−ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐａｌ
−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｃｉｔ−
Ｌｅｕ−Ａｒｇ（ＨＣｌ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ
2１ｇ（０．６３３ミリモル）をトリフルオロ酢酸１０
ｍｌ中に溶解させ、溶液を１．５時間撹拌し、次いで氷
冷ジイソプロピルエーテル１００ｍｌに添加する。生成
物１ｂを吸引濾過し、ジイソプロピルエーテルで洗浄
し、かつ真空で乾燥させる。
【００３１】１ｂの収率：１．０５ｇ（１００％）、Ｈ
ＰＬＣ純度８９．６面積％（図７参照）。
【００３２】例３： Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｄ−ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐａｌ
−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｈｃｉ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ε−
イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2・２ＨＣ
ｌ（２ａ）（アンタレリックス塩酸塩）の製造 Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｄ−ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐａｌ
−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｈｃｉ−
Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ε−Ｂｏｃ）（ε−イソプロピル）−
Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2７７．３ｇ（４６．２ミリ
モル）を、激しく撹拌しながら氷冷濃塩酸４００ｍｌに
添加する。約１時間後に、反応混合物を水０．８５ｌお
よび氷０．８５ｋｇの混合物中に注入し、この水溶液を
その都度ｎ−ブタノール０．９ｌで２回抽出し、合した
ブタノール相のｐＨを炭酸水素ナトリウム飽和水溶液で
約２に調整し、相を分離し、有機相を真空で乾燥させ
る。残留物をｔ−ブチルメチルエーテル２ｌで浸漬し、
吸引濾過し、ｔ−ブチルメチルエーテルで洗浄し、かつ
真空で乾燥させる。
【００３３】収率７２ｇ（１０４％、物質はＮａＣｌ２
重量％および残留ブタノールを含有している）、ＨＰＬ
Ｃ純度９４．０％（図８参照）。
【００３４】例４： Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｄ−ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐａｌ
−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｈｃｉ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ε−
イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2・２ＴＦ
Ａ（２ｂ）（アンタレリックストリフルオロ酢酸塩）の
製造 Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｄ−ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐａｌ
−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｈｃｉ−
Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ε−Ｂｏｃ）（ε−イソプロピル）−
Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2１ｇ（０．６ミリモル）を
トリフルオロ酢酸１０ｍｌ中に溶解させ、溶液を約１．
５時間撹拌し、次いで氷冷ジイソプロピルエーテル１０
０ｍｌに添加する。生成物１ｂを吸引濾過し、ジイソプ
ロピルエーテルで洗浄し、かつ真空で乾燥させる。
【００３５】２ｂの収率：１．０１ｇ（１００％）、Ｈ
ＰＬＣ純度８９．４面積％（図９参照）。
【００３６】例５： 慣用の溶液における合成の粗生成物（例１）からのセト
ロレリックスの分取精製 例１の方法からの粗生成物１８ｇを３０％酢酸５００ｍ
ｌ中に溶解させ、濾過（Ｓｅｉｔｚ Ｋ−７００フィル
ターによる）後に、カラム（長さ２５０ｍｍ、内径１０
０ｍｍ）に適用する。Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ社
のＮｕｃｌｅｏｓｉｌ ３００−７−Ｃ18または場合に
よりＭｅｒｃｋ社のＰｕｒｏｓｐｈｅｒＲＰ １８（１
０ｍｍ）を固定相として使用してもよい。まず、カラム
を移動相Ａ（超純水９７０ｍｌ＋アセトニトリル３０ｍ
ｌ＋１００％酢酸５０ｍｌ）９５％と移動相Ｂ（アセト
ニトリル７００ｍｌ＋超純水３００ｍｌ＋１００％酢酸
５０ｍｌ）５％との溶剤混合物で２０分間コンディショ
ニングする。次いで、クロマトグラフィーをＮｕｃｌｅ
ｏｓｉｌ相上で以下の勾配プログラムによって実施す
る： 時間（分） 濃度Ａ（容量％） 濃度Ｂ（容量％） ０ ９５ ５ ９ ９５ ５ １０ ７７ ２３ ２２ ７７ ２３ ３７ ６７ ３３ ４７ ０ １００ ５５ ０ １００。
【００３７】溶離剤の流量は２００ｍｌ／分であり、カ
ラム圧力３８〜６０バールはその都度勾配条件によって
増加させる。
【００３８】場合により、クロマトグラフィーをＰｕｒ
ｏｓｐｈｅｒ担体上で以下の勾配プログラムによって実
施する： 時間（分） 濃度Ａ（容量％） 濃度Ｂ（容量％） ０ ９５ ５ ２０ ９５ ５ ２１ ７０ ３０ ６０ ６５ ３５ ６１ ０ １００ ７０ ０ １００。
【００３９】溶離剤の流量はその都度３００ｍｌ／分で
あり、その都度勾配条件によってカラム圧力３５〜５０
バールをかける。
【００４０】ピーク検出は２７０ｎｍのＵＶ光で実施
し、手動で分画を実施する。立ち上がり端および立ち下
がり端（rising and falling edges）（純度約９５％）
が観察され、メインピーク（純度＞９９．５％）から分
離し、これを再循環させる。アセトニトリルを分画から
約１％の濃度まで水流ポンプによる真空下に約５０℃で
回転蒸発器において除去する。次いで、濃縮した溶離液
を凍結乾燥する。
【００４１】使用される粗生成物のＨＰＬＣ分析：図１
に示す。
【００４２】粗生成物の特性： ペプチド純度：９４．４面積％ クロリド含有量：６．２％ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ相上でのセトロレリックス合成粗生
成物の分取ＨＰＬＣ：図２に示す。
【００４３】Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒ担体上でのセトロレリ
ックス合成粗生成物の分取ＨＰＬＣ：図３に示す。
【００４４】精製した目的の生成物のＨＰＬＣクロマト
グラム図４に示す。
【００４５】目的の生成物の特性 ペプチド純度：９９．７５％ クロリド含有量：２２０ｐｐｍ アセテート含有量：６．５％ 例６： 慣用の溶液における合成の粗生成物からのアンタレリッ
クスの分取精製 粗生成物１５ｇを３０％酢酸５００ｍｌ中に溶解させ、
濾過（Ｓｅｉｔｚ Ｋ−７００フィルターによる）後
に、カラム（長さ２５０ｍｍ、内径１００ｍｍ）に適用
する。Ｍｅｒｃｋ社のＰｕｒｏｓｐｈｅｒ ＲＰ １８
（１０ｍｍ）を固定相として使用する。まず、カラム
を、移動相Ａ（超純水９７０ｍｌ＋アセトニトリル３０
ｍｌ＋１００％酢酸５０ｍｌ）９５％と移動相Ｂ（アセ
トニトリル７００ｍｌ＋超純水３００ｍｌ＋１００％酢
酸５０ｍｌ）５％との溶剤混合物で２０分間コンディシ
ョニングする。
【００４６】次いで、クロマトグラフィーを以下の勾配
プログラムによって実施する： 時間（分） 濃度Ａ（容量％） 濃度Ｂ（容量％） ０ ９５ ５ １５ ９５ ５ １６ ７０ ３０ ５６ ６５ ３５ ５７ ０ １００ ６５ ０ １００。
【００４７】溶離剤の流量は３００ｍｌ／分であり、そ
の都度勾配条件によってカラム圧力３５〜５０バールを
かける。ピーク検出は２７０ｎｍのＵＶ光で実施し、手
動で分画を実施する。立ち上がり端および立ち下がり端
（純度約９５％）が観察され、メインピーク（純度＞９
９．５％）から分離し、これを再循環させる。アセトニ
トリルを分画から約１％の濃度まで水流ポンプによる真
空下に約５０℃で回転蒸発器において除去する。次い
で、濃縮した溶離液を凍結乾燥する。
【００４８】Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒ担体上でのアンタレリ
ックス合成粗生成物の分取ＨＰＬＣ：図５に示す。
【００４９】目的の生成物の特性： ペプチド純度：９９．３９％ クロリド含有量：＜２００ｐｐｍ アセテート含有量：７．５％ 例７： メタノール／水／酢酸系におけるセトロレリックスの分
取精製 粗生成物４ｇを３０％酢酸６０ｍｌ中に溶解させ、濾過
（Ｓｅｉｔｚ Ｋ−７００フィルターによる）後に、カ
ラム（長さ２５０ｍｍ、内径４０ｍｍ）に適用する。Ｍ
ｉｌｌｉｐｏｒｅ社のＤｅｌｔａｐａｋ ３００Å、１
５ｍｍを固定相として使用する。まず、カラムを、移動
相Ａ（超純水９５０ｍｌ＋メタノール５０ｍｌ＋１００
％酢酸６０ｍｌ）で２０分間コンディショニングする。
次いで、クロマトグラフィーを、以下の勾配プログラム
によって実施する（移動相Ｂ：メタノール９５０ｍｌ＋
超純水５０ｍｌ＋１００％酢酸６０ｍｌ）： 時間（分） 濃度Ａ（容量％） 濃度Ｂ（容量％） ０ １００ ０ １０ １００ ０ １１ ７０ ３０ ４０ ３０ ７０ ４１ ０ １００ ５０ ０ １００。
【００５０】溶離剤の流量は６０ｍｌ／分であり、その
都度勾配条件によってカラム圧力２０〜３０バールをか
ける。ピーク検出は２７０ｎｍのＵＶ光で実施し、手動
で捕集を実施する。立ち上がり端および立ち下がり端
（純度約９５％）が観察され、メインピーク（純度＞９
９．５％）から分離し、これを再循環させる。メタノー
ルを分画から約１％の濃度まで水流ポンプによる真空下
に約５０℃で回転蒸発器において除去する。次いで、濃
縮した溶離液を凍結乾燥する。 目的の生成物の特性 ペプチド純度：９９．６０％ クロリド含有量：２２０ｐｐｍ アセテート含有量：７．１％
【図面の簡単な説明】
【図１】例５において使用される粗生成物のＨＰＬＣ分
析を示す。
【図２】例５におけるＮｕｃｌｅｏｓｉｌ相上でのセト
ロレリックス合成粗生成物の分取ＨＰＬＣを示す。
【図３】例５におけるＰｕｒｏｓｐｈｅｒ担体上でのセ
トロレリックス合成粗生成物の分取ＨＰＬＣを示す。
【図４】例５における精製した目的の生成物のＨＰＬＣ
クロマトグラムを示す。
【図５】例６におけるＰｕｒｏｓｐｈｅｒ担体上でのア
ンタレリックス合成粗生成物の分取ＨＰＬＣを示す。
【図６】例１における生成物１ａのＨＰＬＣクロマトグ
ラムを示す。
【図７】例２における生成物１ｂのＨＰＬＣクロマトグ
ラムを示す。
【図８】例３における生成物２ａのＨＰＬＣクロマトグ
ラムを示す。
【図９】例４における生成物２ｂのＨＰＬＣクロマトグ
ラムを示す。
フロントページの続き (72)発明者 カールハインツ ドラウツ ドイツ連邦共和国 フライゲリヒト ツア マリーンルーエ 13 (72)発明者 トーマス ミュラー ドイツ連邦共和国 ブルーフケーベル ヴ ィルヘルム−ブッシュ−リング 13

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 オリゴペプチド酢酸塩を得るためにアセ
    テート含有溶剤を使用する液体クロマトグラフィーによ
    ってオリゴペプチドを１工程で塩変換および精製する方
    法において、精製のために該オリゴペプチドをその塩酸
    塩の形で使用するオリゴペプチドの１工程塩変換および
    精製方法。
  2. 【請求項２】 オリゴペプチドの保護された前駆体を濃
    塩酸で脱保護することを特徴とする、請求項１記載のオ
    リゴペプチドの１工程塩変換および精製方法。
  3. 【請求項３】 オリゴペプチドの純塩化物を、その塩酸
    溶液の凍結乾燥によって得ることを特徴とする、請求項
    ２記載のオリゴペプチドの１工程塩変換および精製方
    法。
  4. 【請求項４】 オリゴペプチドの塩化物を濃塩酸水溶液
    の形で使用することを特徴とする、請求項１記載のオリ
    ゴペプチドの１工程塩変換および精製方法。
  5. 【請求項５】 純塩化物を、液体クロマトグラフィー溶
    剤または酢酸中に溶解させた後で使用することを特徴と
    する、請求項１から３までのいずれか１項記載のオリゴ
    ペプチドの１工程塩変換および精製方法。
  6. 【請求項６】 該方法を温度−２５〜３０℃で実施する
    ことを特徴とする、請求項２記載のオリゴペプチドの１
    工程塩変換および精製方法。
  7. 【請求項７】 液体クロマトグラフィーとして高圧液体
    クロマトグラフィーを使用することを特徴とする、請求
    項１記載のオリゴペプチドの１工程塩変換および精製方
    法。
  8. 【請求項８】 クロマトグラフィーを以下の組成： 溶剤Ａ 溶剤Ｂ ｉ．水８５〜９８％ ｉ．水２０〜４８％ ｉｉ．酢酸２〜１０％ ｉｉ．酢酸２〜１０％ ｉｉｉ．アセトニトリル０〜５％ ｉｉｉ．アセトニトリル５０〜７０％ または 溶剤Ａ 溶剤Ｂ ｉ．水８５〜９８％ ｉ．水０〜１０％ ｉｉ．酢酸２〜１０％ ｉｉ．酢酸２〜１０％ ｉｉｉ．メタノール０〜５％ ｉｉｉ．メタノール８０〜９８％ を有する溶剤系を使用して実施することを特徴とする、
    請求項７記載のオリゴペプチドの１工程塩変換および精
    製方法。
  9. 【請求項９】 クロマトグラフィーを以下の溶剤系： 溶剤Ａ 溶剤Ｂ ｉ．水９２％ ｉ．水２８％ ｉｉ．酢酸５％ ｉｉ．酢酸５％ ｉｉｉ．アセトニトリル３％ ｉｉｉ．アセトニトリル６７％ または 溶剤Ａ 溶剤Ｂ ｉ．水９０％ ｉ．水５％ ｉｉ．酢酸５％ ｉｉ．酢酸５％ ｉｉｉ．アセトニトリル５％ ｉｉｉ．アセトニトリル９０％ を使用して実施することを特徴とする、請求項８記載の
    オリゴペプチドの１工程塩変換および精製方法。
  10. 【請求項１０】 該方法を温度５℃〜５０℃で実施する
    ことを特徴とする、請求項８または９記載のオリゴペプ
    チドの１工程塩変換および精製方法。
  11. 【請求項１１】 該方法を圧力５〜１００バールで実施
    することを特徴とする、請求項８から１０までのいずれ
    か１項記載のオリゴペプチドの１工程塩変換および精製
    方法。
  12. 【請求項１２】 固定相として、逆相カラム材料を使用
    することを特徴とする、請求項８から１１までのいずれ
    か１項記載のオリゴペプチドの１工程塩変換および精製
    方法。
  13. 【請求項１３】 オリゴペプチドとして、アミノ酸少な
    くとも５個および多くて２５個のペプチドを使用するこ
    とを特徴とする、請求項１記載のオリゴペプチドの１工
    程塩変換および精製方法。
  14. 【請求項１４】 アミノ酸８〜１６個のペプチドを使用
    することを特徴とする、請求項１３記載のオリゴペプチ
    ドの１工程塩変換および精製方法。
  15. 【請求項１５】 アミノ酸１０個のペプチドを使用する
    ことを特徴とする、請求項１４記載のオリゴペプチドの
    １工程塩変換および精製方法。
  16. 【請求項１６】 液体クロマトグラフィーを、擬似移動
    床法または循環クロマトグラフィーによって実施するこ
    とを特徴とする、請求項１記載のオリゴペプチドの１工
    程塩変換および精製方法。
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