ES2200016T3 - Expresion de secuencias polinucleotidicas exogenas en un vertebrado. - Google Patents

Expresion de secuencias polinucleotidicas exogenas en un vertebrado.

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ES2200016T3
ES2200016T3 ES96104264T ES96104264T ES2200016T3 ES 2200016 T3 ES2200016 T3 ES 2200016T3 ES 96104264 T ES96104264 T ES 96104264T ES 96104264 T ES96104264 T ES 96104264T ES 2200016 T3 ES2200016 T3 ES 2200016T3
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Gary H. Rhodes
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Abstract

UN METODO PARA ENVIAR UN POLINUCLEOTIDO AISLADO AL INTERIOR DE UNA CELULA EN UN VERTEBRADO, QUE INCLUYE LA INTRODUCCION INTERESTITICIA DE UN POLINUCLEOTIDO AISLADO EN UN TEJIDO DEL VERTEBRADO DONDE EL POLINUCLEOTIDO ES RECOGIDO POR LAS CELULAS DEL TEJIDO Y EJERCE UN EFECTO TERAPEUTICO EN EL VERTEBRADO. EL METODO PUEDE SER USADO PARA ENVIAR UN POLIPEPTIDO TERAPEUTICO A LAS CELULAS DEL VERTEBRADO, PARA PROPORCIONAR UNA RESPUESTA INMUNE EN LA TRANSLACION "IN VIVO" DEL POLINUCLEOTIDO, PARA ENVIAR LOS POLINUCLEOTIDOS ANTISENTIDO, ENVIAR RECEPTORES A LAS CELULAS DEL VERTEBRADO, O PARA PROPORCIONAR UNA TERAPIA GENETICA TRANSITORIA.

Description

Expresión de secuencias polinucleotídicas exógenas en un vertebrado.
Antecedentes de la invención
La presente invención se refiere a la introducción de secuencias de ADN y de ARN en un mamífero para conseguir la expresión controlada de un péptido inmunogénico.
La investigación actual en la terapia génica se ha centrado en curas "permanentes", en las que se integra un ADN en el genoma del paciente. Actualmente, los vectores virales son los medios usados con más frecuencia para transformar las células del paciente e introducir ADN en el genoma. En un método indirecto, se usan vectores virales, que llevan nueva información genética, para infectar células diana retiradas del cuerpo, y estas células después se vuelven a implantar. Se ha informado sobre una transferencia génica directa in vivo en animales recién nacidos para formulaciones de ADN encapsulado en liposomas y ADN atrapado en proteoliposomas que contienen proteínas receptoras de envueltas virales (Nicolau et al., Proc. Natl. Acad Sci USA 80:1068-1072 (1983); Kaneda et al., Science 243:375-378 (1989); Mannino et al., Biotechniques 6:682-690 (1988). También se han descrito resultados positivos con ADN co-precipitado con fosfato cálcico (Benvenisty y Reshef Proc. Natl. Acad Sci USA 83:9551-9555 (1986)).
La aplicación clínica de la terapia génica, así como la utilización de vectores de retrovirus recombinantes, se ha retrasado debido a consideraciones de seguridad. La integración de ADN exógeno en el genoma de una célula puede producir lesiones en el ADN y posibles cambios genéticos en la célula receptora que podrían ocasionar una predisposición a una malignidad. Un método que evite estos problemas potenciales sería significativamente beneficioso para hacer que la terapia génica sea segura y eficaz.
La vacunación con proteínas inmunogénicas ha eliminado o reducido la incidencia de muchas enfermedades; sin embargo, existen dificultades importantes en el uso de proteínas asociadas con otros patógenos y estados de enfermedad como inmunógenos. Muchos antígenos proteicos no son intrínsecamente inmunogénicos. Con mucha frecuencia no son eficaces como vacunas debido a la manera en la que funciona el sistema inmune.
El sistema inmune de vertebrados consta de varios componentes que interactúan. Las partes mejor caracterizadas y más importantes son las ramificaciones humoral y celular (citolítica). La inmunidad tumoral implica anticuerpos, proteínas que se secretan en los fluidos corporales y que reconocen directamente un antígeno. Por el contrario, el sistema celular se basa en células especiales que reconocen y destruyen otras células que están produciendo antígenos extraños. Esta división funcional básica refleja dos estrategias diferentes de defensa inmune. La inmunidad humoral principalmente se dirige a antígenos que son exógenos al animal, mientras que el sistema celular responde a antígenos que se sintetizan activamente dentro del animal.
Las moléculas de anticuerpo, los efectores de inmunidad humoral, se secretan por células linfoides B especiales, células B, en respuesta a un antígeno. Los anticuerpos se pueden unir e inactivar el antígeno directamente (anticuerpos neutralizadores) o activar otras células del sistema inmune para destruir el antígeno.
El reconocimiento inmune celular está mediado por una clase especial de células linfoides, las células T citotóxicas. Estas células no reconocen antígenos enteros, sino que en su lugar responden a fragmentos peptídicos degradados de los mismos que aparecen en la superficie de la célula diana unidos a proteínas denominadas moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase I.Esencialmente todas las células nucleadas tienen moléculas de clase I. Se cree que las proteínas producidas dentro de la célula se degradan continuamente a péptidos como parte del metabolismo celular normal. Estos fragmentos se unen a las moléculas del MHC y se transportan a la superficie celular. De esta manera, el sistema inmune celular está controlando constantemente los espectros de proteínas producidos en todas las células del cuerpo y elimina cualquier célula que produzca antígenos extraños.
La vacunación es el proceso de preparación de un animal para responder a un antígeno. La vacunación es más compleja que el reconocimiento inmune y no implica sólo células B y células T citotóxicas, sino también otros tipos de células linfoides. Durante la vacunación, las células que reconocen el antígeno (células B o células T citotóxicas) se expanden clonalmente. Además, también aumenta la población de células auxiliares (células T adyuvantes) específicas para el antígeno. La vacunación también implica células presentadores de antígeno especializadas que pueden procesar el antígeno y presentarlo en una forma que pueda estimular una de las dos rutas.
La vacunación ha cambiado poco desde los tiempos de Louis Pasteur. Se introduce un antígeno extraño en un animal donde activa células B específicas por la unión a inmunoglobulinas de la superficie. También se absorbe por células procesadoras de antígenos, donde se degrada, y aparece en fragmentos en la superficie de estas células unido a moléculas del MHC de clase II. Los péptidos unidos a las moléculas de clase II son capaces de estimular la clase de células T adyuvantes. Para producir una inmunización humoral activa se requieren tanto células T adyuvantes como células B activadas. Se cree que la inmunidad celular se estimula por un mecanismo similar pero que no se comprende bien.
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De esta manera, dos rutas diferentes y distintas de procesamiento de antígenos producen antígenos exógenos unidos a moléculas de MHC de clase II donde pueden estimular células T adyuvantes, así como proteínas endógenas degradas y unidas a moléculas del MHC de clase I y reconocidas por la clase de células T citotóxicas.
Hay poca o ninguna diferencia en la distribución de las moléculas del MHC. Esencialmente todas las células nucleadas expresan moléculas de clase I, mientras que las proteínas del MHC de clase II se restringen a algunos tipos de células linfoides.
Los esquemas de vacunación normales siempre producirán una respuesta inmune humoral. También pueden proporcionar inmunidad citotóxica. El sistema humoral protege a un individuo vacunado de la exposición posterior a un patógeno y puede prevenir la extensión de una infección intracelular si el patógeno pasa por una fase extracelular durante su ciclo de vida; sin embargo, puede hacer relativamente poco para eliminar los patógenos intracelulares. La inmunidad citotóxica complementa al sistema humoral eliminando las células infectadas. De esta manera, una vacunación eficaz activaría los dos tipos de inmunidad.
La respuesta de células T citotóxicas es necesaria para retirar patógenos intracelulares tales como virus, así como células malignas. Ha resultado difícil presentar un antígeno administrado exógenamente en concentraciones adecuadas junto con moléculas de clase I para asegurar una respuesta adecuada. Esto ha impedido en gran medida el desarrollo de vacunas contra antígenos específicos de tumores (por ejemplo, en células de cáncer de mama o de colon) y contra proteínas virales débilmente inmunogénicas (por ejemplo VIH, herpes, hepatitis no A y no B, CMV y EBV).
Sería deseable proporcionar una respuesta inmune celular sola en la inmunización contra agentes tales como virus para los que se ha demostrado que los anticuerpos potencian la infectividad. También sería útil proporcionar tal respuesta contra infecciones virales tanto crónicas como latentes y contra células malignas.
El uso de vacunas peptídicas sintéticas no soluciona estos problemas porque los péptidos no se asocian fácilmente con las moléculas de histocompatibilidad, tienen una corta vida media en suero, se proteolizan rápidamente, o no localizan específicamente a monocitos y macrófagos presentadores de antígenos. En el mejor de los casos, todos los antígenos administrados exógenamente deben competir con el universo de autoproteínas por la unión a los macrófagos presentadores de antígeno.
Se realizado grandes esfuerzos para inducir respuestas inmunes contra proteínas virales poco inmunogénicas del virus del herpes, de la hepatitis no A y no B, del VIH y similares. Es difícil y peligroso propagar estos patógenos in vitro. Como se ha mencionado anteriormente, se han obtenido vacunas de péptidos sintéticos correspondientes a proteínas codificadas por virus, pero tienen varios fallos. También se ha intentado usar vectores del virus de la vaccinia para expresar proteínas de otros virus. Sin embargo, los resultados han sido decepcionantes, ya que (a) los virus de vaccinia recombinantes pueden eliminarse rápidamente de la circulación en individuos que ya son inmunes, y (b) la administración de antígenos virales complejos puede inducir un fenómeno conocido como "competición antigénica" en el que porciones débilmente inmunogénicas del virus no pueden inducir una respuesta inmune porque con estas porciones compiten otras regiones más potentes del antígeno administrado.
Otro problema importante con las vacunas de proteínas o péptidos es la reacción anafiláctica que puede producirse cuando se repiten inyecciones de antígeno con la intención de producir una respuesta inmune potente. En este fenómeno, los anticuerpos IgE formados en respuesta al antígeno producen reacciones alérgicas severas y algunas veces fatales.
Por consiguiente, existe la necesidad de un método para invocar una respuesta inmune segura y eficaz contra este tipo de proteína o polipéptido. Además, existe una gran necesidad de un método que asocie estos antígenos con antígenos de histocompatibilidad de clase I presentes en la superficie celular para inducir una respuesta de células T citotóxicas, evitar la anafilaxis y la proteolisis del material en el suero y facilitar la localización del material en monocitos y macrófagos.
Un gran número de estados de enfermedad pueden beneficiarse de la administración de péptidos terapéuticos. Tales péptidos incluyen linfoquinas, tales como interleuquina-2, factor de necrosis tumoral, y los interferones; factores de crecimiento, tales como el factor de crecimiento de nervios, el factor de crecimiento epidérmico y la hormona de crecimiento humana; activador de plasminógeno tisular; factor VIII:C; factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos; eritropoyetina; insulina; calcitonina; timidina quinasa; y similares. Además, la liberación selectiva de péptidos tóxicos (tales como ricina, toxina diftérica o factor de veneno de cobra) en células enfermas o neoplásicas puede tener efectos terapéuticos beneficiosos importantes. Los sistemas de liberación de péptidos actuales tienen problemas significativos, incluyendo la incapacidad de incorporar eficazmente receptores de la superficie celular funcionales en las membranas celulares, y la necesidad de administrar sistémicamente grandes cantidades del péptido (produciéndose efectos secundarios sistémicos indeseables) para liberar una cantidad terapéutica del péptido dentro o sobre la célula diana.
Estos problemas descritos anteriormente asociados con la terapia génica, la inmunización y la liberación de péptidos terapéuticos a las células se solucionan por medio de la presente invención.
La presente invención se refiere a la inmunización de un vertebrado.
En un aspecto, la presente invención proporciona el uso de un liposoma cargado positivamente y un polinucleótido expresable que codifica para un péptido inmunogénico en la fabricación de un medicamento para administración a un mamífero, donde dicho medicamento se incorpora en una célula donde se forma un producto de traducción inmunogénico del polinucleótido, y el producto se procesa y se presenta por la célula en el contexto del complejo de histocompatibilidad principal, induciéndose de esta manera una respuesta inmune contra el péptido inmunogénico.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende liposomas cargados positivamente mezclados con un polinucleótido expresable que codifica para un péptido inmunogénico, para administración a un mamífero, donde dicha composición se incorpora en una célula donde se forma un producto de traducción inmunogénico del polinucleótido, y el producto se procesa y se presenta por la célula en el contexto del complejo de histocompatibilidad principal, induciéndose de esta manera una respuesta inmune contra el péptido inmunogénico.
El polinucleótido puede ser un ARNm.
El polinucleótido puede ser un ADN que comprende un promotor.
El medicamento o composición puede ser para la administración por inyección en el músculo.
El medicamento o composición puede ser para la administración por inyección en la piel.
El medicamento o composición puede ser para la administración por introducción en una cavidad corporal.
El mamífero puede ser un ser humano.
El liposoma puede comprender cloruro de N-(2,3-di-(9-(Z)octadeceniloxi))-prop-1-il-N,N,N-trimetilamonio
(DOTMA) o 1,2-bis(oleoiloxi)-3-(trimetilamonio)propano (DOTAP).
Descripción detallada de la invención
La práctica de la presente invención requiere la obtención de polinucleótidos que codifican operativamente un polipéptido para incorporación en células de vertebrados. Un polinucleótido codifica operativamente para un polipéptido cuando tiene toda la información genética necesaria para la expresión por una célula diana, tales como promotores y similares. Estos polinucleótidos pueden administrarse al vertebrado por cualquier método que suministre materiales inyectables a las células del vertebrado, tal como por inyección en el espacio intersticial de tejidos tales como músculos o piel, introducción en la circulación o en las cavidades corporales, o por inhalación o insuflación. Un polinucleótido se inyecta o se suministra de otra manera al animal con un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable. Para todas las aplicaciones, el vehículo líquido es acuoso o parcialmente acuoso, comprendiendo agua estéril sin pirógenos. El pH de la preparación se ajusta y se tampona convenientemente.
Las realizaciones de la invención requieren el uso de liposomas y el polinucleótido se asocia con un liposoma, de forma que la invención requiere un material para formar liposomas cargados positivamente, y requiere realizar preparaciones liposomales a partir de estos materiales. Al disponerse del material liposomal, el polinucleótido ventajosamente puede usarse para transfectar células in vitro para uso como agentes de inmunización, o para administrar polinucleótidos en sitios corporales donde los liposomas pueden ser absorbidos por células fagocitarias.
Materiales polinucleotídicos
Las secuencias de ADN usadas en estos métodos pueden ser las secuencias que no se integran en el genoma de la célula hospedadora. Pueden ser secuencias de ADN que no se replican o secuencias de replicación específica modificadas por ingeniería genética para carecer de la capacidad de integración en el genoma.
Los polinucleótidos terapéuticos proporcionados por la invención también pueden codificar polipéptidos que confieren inmunidad, que actúan como inmunógenos endógenos para provocar una respuesta humoral o celular, o ambas.
Las secuencias polinucleotídicas de la invención preferiblemente codifican polipéptidos inmunogénicos, y estas secuencias pueden usarse en asociación con otras secuencias polinucleotídicas que codifican proteínas reguladoras que controlan la expresión de estos polipéptidos. La proteína reguladora puede actuar uniéndose al ADN genómico para regular su transcripción; como alternativa, puede actuar por unión al ARN mensajero para aumentar o reducir su estabilidad o eficacia de traducción.
El material polinucleotídico suministrado a las células in vivo puede tomar cualquier número de formas, y la presente invención no se limita a ningún polinucleótido particular que codifique ningún polipéptido o grupo de polipéptidos particular. Puede contener sólo un fragmento de un gen, o puede codificar múltiples secuencias polipeptídicas, y además puede contener secuencias de reconocimiento y promotoras. En la bibliografía se han presentado plásmidos que contienen genes que codifican un gran número de péptidos fisiológicamente activos y antígenos o inmunógenos, y pueden obtenerse fácilmente por los especialistas en la técnica.
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Cuando el polinucleótido es un ADN, son bien conocidos los promotores adecuados para uso en diversos sistemas de vertebrados. Por ejemplo, para uso en sistemas murinos, los promotores fuertes adecuados incluyen LTR de RSV, LTR de MPSV, IEP de SV40, y el promotor de metalotioneína. Por otra parte, en seres humanos pueden usarse ventajosamente promotores tales como IEP de CMV. Dentro de los métodos contemplados por la invención se encuentran todas las formas de ADN, tanto si son replicativas como si son no replicativas, que no se integran en el genoma, y que son expresables. Al disponerse de equipos de síntesis de ácidos nucleicos automáticos, pueden sintetizarse directamente tanto ADN como ARN cuando se conoce la secuencia de nucleótidos, o por medio de una combinación de clonación por PCR y fermentación. Además, cuando se conoce la secuencia del polipéptido deseado, puede deducirse una secuencia codificante adecuada del polinucleótido.
Cuando el polinucleótido es un ARNm, puede prepararse fácilmente a partir del ADN correspondiente in vitro. Por ejemplo, las técnicas convencionales utilizan ARN polimerasas de fago SP6, T3 o T7 para preparar ARNm a partir de plantillas de ADN en presencia de los ribonucleósido trifosfatos individuales. Un promotor de fago apropiado, tal como un sitio de origen de replicación de T7, se pone en el ADN de plantilla inmediatamente cadena arriba del gen a transcribir. Los sistemas que utilizan T7 de esta manera son bien conocidos, y se describen en la bibliografía, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology, \NAK 3.8 (Vol.1 1988). Un método particularmente preferido para obtener el ARNm usado en la presente invención se indica en los ejemplos 2-5. Sin embargo, en general, será evidente que en la puesta en práctica de la presente invención puede usarse el plásmido pXGB o cualquier plásmido similar que pueda construirse fácilmente por los especialistas habituales en la técnica, con un número prácticamente ilimitado de ADNc. Tales plásmidos pueden comprender ventajosamente un promotor para una ARN polimerasa deseada, seguido de una región 5' no traducida, una región 3' no traducida y una plantilla para un tracto de poli A. Debe haber un solo sitio de restricción entre estas regiones 5' y 3' para facilitar la inserción de cualquier ADNc deseado en el plásmido. A continuación, después de la clonación del plásmido que contiene el gen deseado, el plásmido se linealiza cortando en la región de poliadenilación y se transcribe in vitro para formar transcritos de ARNm. Estos transcritos preferiblemente se proporcionan con un grupo terminal 5', como se demuestra en el ejemplo 5. Como alternativa, puede usarse una secuencia 5' no traducida tal como EMC que no requiera un grupo terminal 5'.
Aunque lo anterior representa un método preferido para preparar el ARNm, será evidente para los especialistas en la técnica que también existen muchos métodos alternativos. Por ejemplo, el ARNm puede prepararse en aparatos de síntesis de nucleótidos disponibles en el mercado. Como alternativa, puede prepararse ARNm en forma circular. Se prefieren los ARN resistentes a exonucleasas tales como un ARNm circular, un ARNm bloqueado químicamente y un ARNm con un extremo 5' terminal, debido a su mayor vida media in vivo.
En particular, un ARNm preferido es un ARNm que se autocirculariza que tiene el gen de interés precedido por la región 5' no traducida del virus de la polio. Se ha demostrado que el ARNm circular tiene una vida media extremadamente larga (Harland & Misher, Development 102: 837-852 (1988)) y que la región 5' no traducida del virus de la polio puede promover la traducción del ARNm sin el grupo protector 5' habitual (Pelletier & Sonnenberg, Nature 334: 320-325 (1988), incorporado en este documento como referencia).
Este material puede prepararse a partir de una plantilla de ADN que produce un auto-empalme y genera ARNm de "lazo" circulares usando el método de Been & Cech, Cell 47:206-216 (1986) (incorporado en este documento como referencia). Nosotros modificamos ese molde incluyendo la región 5' no traducida del virus de la polio inmediatamente cadena arriba del gen de interés, siguiendo el procedimiento de Maniatis, T. et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor, Nueva York (1982).
Además, la presente invención incluye el uso de ARNm que está bloqueado químicamente en el extremo 5' y/o 3' para impedir el acceso por la RNAsa. (Esta enzima es una exonucleasa y, por lo tanto, no escinde el ARN en la mitad de la cadena.) Tal bloqueo químico puede prolongar substancialmente la vida media del ARN in vivo. En Clonetech Laboratories, Inc., Palo Alto, California, están disponibles dos agentes que pueden usarse para modificar el ARN: C2 AminoModifier (N!91! de catálogo 5204-1) y Amino-7-dUTP (Nº de catálogo K1022-1). Estos materiales añaden grupos reactivos al ARN. Después de la introducción de cualquiera de estos agentes en una molécula de ARN de interés, puede asociarse un substituyente reactivo apropiado al ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Por medio de la adición de un grupo con suficiente volumen, puede impedirse el acceso al ARN modificado químicamente por la RNAsa.
Terapia génica transitoria
A diferencia de las terapias génicas propuestas en el pasado, una ventaja principal de la presente invención es la naturaleza transitoria de la síntesis de polinucleótidos en las células. (Nosotros la llamamos terapia génica reversible o TGT). Con el ARNm introducido de acuerdo con la presente invención, el efecto generalmente durará aproximadamente un día. Además, en un notable contraste con las terapias génicas propuestas en el pasado, el ARNm no tiene que atravesar el núcleo para dirigir la síntesis de proteínas; por lo tanto, no tiene susceptibilidad genética.
Sin embargo, en algunas situaciones puede desearse un efecto más prolongado sin la incorporación del ácido polinucleico exógeno en el genoma del organismo hospedador. Para proporcionar tal efecto, una realización preferida de la invención proporciona la introducción de una secuencia de ADN que codifica para un polipéptido específico en la célula. De acuerdo con los métodos de la invención, hemos descubierto que pueden introducirse secuencias de ADN que no se replican en las células para proporcionar la producción del polipéptido deseado durante períodos de hasta aproximadamente seis meses, y no hemos observado indicios de integración de las secuencias de ADN en el genoma de las células. Como alternativa, puede conseguirse un efecto incluso más prolongado por medio de la introducción de la secuencia de ADN en la célula por medio de un vector plasmídico que tiene la secuencia de ADN insertada en su interior. Preferiblemente, el plásmido comprende además un replicador. Tales plásmidos son bien conocidos para los especialistas en la técnica, por ejemplo, el plásmido pBR322, con el replicador pMB1, o el plásmido pMK16, con el replicador ColE1 (Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York (1988) \NAK II<:1.5.2.
Los resultados de estudios del transcurso de tiempo de la expresión del ADN y el ARNm introducido en células musculares como se describe en los ejemplos 1 y 13, indican que la expresión del ARNm es más rápida, aunque tiene una duración más corta que la expresión del ADN. Puede conseguirse una expresión génica inmediata y de larga duración por la administración a la célula de una preparación liposomal que comprende tanto ADN como ARN polimerasa, tales como las polimerasas de fago T7, T3 y SP6. El liposoma también incluye una fuente inicial de la ARN polimerasa apropiada, incluyendo la propia enzima o, como alternativa, un ARNm que codifica para esa enzima. Cuando el liposoma se introduce en el organismo, libera el ADN y la fuente inicial de ARN polimerasa a la célula. La ARN polimerasa, que reconoce los promotores en el ADN introducido, transcribe los dos genes dando como resultado productos de traducción que comprenden más ARN polimerasa y el polipéptido deseado. La producción de estos materiales continúa hasta que el ADN introducido (que normalmente está en forma de un plásmido) se degrada. De esta manera, puede conseguirse la producción del polipéptido deseado in vivo en pocas horas y prolongarse durante un mes o más.
Los polinucleótidos pueden suministrarse al espacio intersticial de tejidos del cuerpo animal, incluyendo los de músculo, piel, cerebro, pulmón, hígado, bazo, médula ósea, timo, corazón, linfa, sangre, hueso, cartílago, páncreas, riñón, vesícula biliar, estómago, intestino, testículo, ovario, útero, recto, sistema nervioso, ojo, glándulas y tejido conjuntivo. El espacio intersticial de los tejidos comprende la matriz intercelular, fluida, de mucopolisacárido entre las fibras reticulares de los tejidos de los órganos, las fibras elásticas de las paredes de los vasos o cámaras, las fibras de colágeno de tejidos fibrosos o la misma matriz dentro del tejido conjuntivo que envuelve las células musculares en las lagunas de hueso. De forma similar, el espacio ocupado por el plasma de la circulación y el fluido linfático de los canales linfáticos. Se prefiere la liberación en el espacio intersticial del tejido muscular por las razones discutidas más adelante.
Pueden suministrarse convenientemente por inyección en los tejidos que comprenden estas células. Preferiblemente, se suministran y se expresan en células persistentes sin división que están diferenciadas, aunque pueden conseguirse el suministro y la expresión en células no diferenciadas o diferenciadas menos completamente tales como, por ejemplo, células madre de fibroblastos de sangre o de piel. Hemos descubierto que las células musculares in vivo son particularmente competentes en su capacidad de absorber y expresar polinucleótidos. Esta capacidad puede deberse a la arquitectura tisular singular del músculo, que comprende células multinucleadas, retículo sarcoplásmico y sistemas tubulares transversales. Los polinucleótidos pueden entrar en el músculo a través del sistema tubular transversal, que contiene fluido extracelular y se extiende profundamente en la célula muscular. También es posible que los polinucleótidos entren en células musculares dañadas que después se recuperan.
El músculo también se usa ventajosamente como un sitio para el suministro y expresión de polinucleótidos en varias aplicaciones terapéuticas porque los animales tienen una masa muscular proporcionadamente grande a la que convenientemente se accede por inyección directa a través de la piel; por esta razón, puede depositarse una dosis comparativamente grande de polinucleótidos en el músculo por inyecciones múltiples, y fácilmente se realizan inyecciones repetitivas para prolongar la terapia durante largos períodos de tiempo, y pueden realizarse de forma segura y sin experiencia o dispositivos especiales.
El tejido muscular puede usarse como sitio para inyección y expresión de polinucleótidos. En estrategias de inmunización, a las células musculares se les pueden inyectar polinucleótidos que codifican para péptidos inmunogénicos, y estos péptidos se presentarán por las células musculares en el contexto de antígenos del complejo principal de histocompatibilidad para provocar una respuesta inmune seleccionada contra el inmunógeno.
Vacunas de ADN y ARNm
De acuerdo con la invención, pueden suministrarse tanto ADN expresable como ARNm a las células para formar en las mismas un producto de traducción polipeptídico. Si los ácidos nucleicos contienen las secuencias de control apropiadas, dirigirán la síntesis de cantidades relativamente grandes de la proteína codificada. Cuando el ADN y el ARNm suministrado a las células codifica para un péptido de inmunización, los métodos pueden aplicarse para conseguir una inmunidad mejorada y más eficaz contra agentes infecciosos, incluyendo virus intracelulares, y también contra células tumorales.
Como los sistemas inmunes de todos los vertebrados funcionan de forma similar, las aplicaciones descritas pueden realizarse en todos los sistemas de vertebrados, que comprenden especies de mamíferos y de aves, así como peces.
Los métodos de la invención pueden aplicarse por inyección directa del polinucleótido en células del animal in vivo. Los polinucleótidos pueden suministrarse a diversas células del cuerpo del animal, incluyendo músculo, piel, cerebro, pulmón, hígado, bazo o las células de la sangre. La liberación de los polinucleótidos directamente in vivo preferiblemente se realiza en células de músculo o piel. Los polinucleótidos pueden inyectarse en músculo o piel usando una jeringa de inyección. También pueden suministrarse en el músculo o piel usando una pistola de vacunas.
Recientemente, se ha demostrado que, en ciertas aplicaciones, pueden usarse lípidos catiónicos para facilitar la transfección de las células, particularmente la transfección in vitro. Se prefiere la tecnología de transfección basada en lípidos catiónicos a los otros métodos; es más eficaz y conveniente que los métodos de fosfato cálcico, DEAE dextrano o electroporación, y la transfección mediada por virus, como se ha descrito previamente, puede conducir a sucesos de integración en el genoma de la célula hospedadora que ocasionan la activación de oncogenes u otras consecuencias indeseables. El conocimiento de que la tecnología de lípidos catiónicos funciona con el ARN mensajero es una ventaja adicional para esta estrategia, porque el ARN se modifica rápidamente por nucleasas intracelulares y no se integra en el genoma del hospedador. Se prefiere un sistema de transfección que produce altos niveles de expresión reversible a una metodología alternativa que requiere la selección y expansión de clones transformados de forma estable, porque muchas de las células diana deseadas no se dividen rápidamente en cultivo.
La capacidad de transfectar células con alta eficacia con liposomas catiónicos proporciona un método alternativo para la inmunización. El gen para un antígeno se introduce en las células que se han retirado de un animal. Las células transfectadas, que ahora expresan el antígeno, se vuelven a inyectar en el animal donde el sistema inmune puede responder al antígeno (ahora) endógeno. El proceso posiblemente puede mejorarse por medio de la coinyección de un adyuvante o linfoquinas para estimular adicionalmente las células linfoides.
La vacunación con ácidos nucleicos que contienen un gen para un antígeno también puede proporcionar una forma para dirigir específicamente la respuesta inmune celular. Las células que expresan proteínas que se secretan entrarán en las rutas de procesamiento de antígenos normales y producirán tanto una respuesta humoral como una respuesta citotóxica. La respuesta a proteínas que no se secretan es más selectiva. Es de esperar que las proteínas no secretadas sintetizadas en células que expresan sólo moléculas del MHC de clase I produzcan sólo una vacunación citotóxica. La expresión del mismo antígeno en células que llevan moléculas tanto de clase I como de clase II puede producir una respuesta más vigorosa por la estimulación tanto de células citotóxicas como de células T adyuvantes. También es posible la potenciación de la respuesta inmune por inyección del gen del antígeno junto con un fragmento peptídico del antígeno. El antígeno se presenta mediante moléculas del MHC de clase I al sistema inmune celular, mientras que el péptido se presenta mediante moléculas del MHC de clase II para estimular las células T adyuvantes. En cualquier caso, este método proporciona una forma de estimular y modular la respuesta inmune de una manera que previamente no se ha podido conseguir.
Un inconveniente importante de las vacunas de subunidad es que los antígenos de glicoproteínas rara vez se modifican correctamente en los sistemas de expresión recombinante usados para obtener los antígenos. La introducción del gen para un antígeno de glicoproteína asegurará que el producto proteico se sintetiza, se modifica y se procesa en la misma especie y en las mismas células que la proteína patógena. De esta manera, la expresión de un gen para una glicoproteína viral humana contendrá el complemento correcto de restos de azúcar. Esto es importante porque se ha demostrado que un componente substancial de los anticuerpos neutralizadores en algunos sistemas virales se dirigen a epítopos de carbohidrato.
Cualquier antígeno apropiado que sea un candidato para una respuesta inmune, ya sea humoral o celular, puede usarse en su forma de ácido nucleico. Las células pueden proceder de fibroblastos tomados de un individuo que proporciona una fuente conveniente de células que expresan sólo moléculas del MHC de clase I. Como alternativa, pueden aislarse rápidamente células de sangre periférica a partir de sangre entera para proporcionar una fuente de células que contenga proteínas tanto del MHC de clase I como de clase II. Si se desea, pueden fraccionarse adicionalmente en células B, células T adyuvantes, células T citotóxicas o macrófagos/monocitos. Las células de médula ósea pueden proporcionar una fuente de células linfoides menos diferenciadas. En todos los casos, la célula se transfectará con un ADN que contiene un gen para el antígeno o por el ARNm protegido terminalmente y poliadenilado apropiado transcrito a partir de ese gen o un ARN circular, un ARN modificado químicamente o un ARN que no requiere protección 5'. La elección del nucleótido de transfección puede depender de la duración de la expresión deseada. Para la vacunación, se prefiere una expresión reversible del péptido inmunogénico, como ocurre con la transfección del ARNm. Las células transfectadas se inyectan dentro del animal y las proteínas expresadas se procesarán y presentarán al sistema inmune por las rutas celulares normales.
Tal estrategia se ha usado para producir inmunidad citotóxica en sistemas modelo en ratones, líneas celulares y células malignas que crecen de forma continua, que pueden transformarse establemente con ADN. Cuando las células se inyectan en animales, inducen inmunidad celular al antígeno expresado. El sistema de liberación de lípidos catiónico permitirá extender esta estrategia a células normales no malignas tomadas de un paciente.
Hay varias aplicaciones para esta estrategia de dirección de inmunidad celular. La primera es la vacunación contra virus en los que se sabe que se requieren anticuerpos o que aumentan la infección viral. Hay dos estrategias que pueden aplicarse en este caso. Una puede dirigir específicamente la ruta celular durante la inmunización, eliminando de esta manera los anticuerpos potenciadores. Como alternativa, se puede vacunar con el gen para un antígeno truncado, eliminándose de esta manera los epítopos humorales que aumentan la infectividad.
El uso de una terapia de vacuna de ADN o ARNm podría proporcionar de forma similar un medio para provocar una respuesta de células T citotóxicas eficaz contra tumores débilmente antigénicos. Proponemos, por ejemplo, que si se expresara un antígeno específico de tumor por un ARNm dentro de una célula en una forma ya procesada, y se incorporara directamente en las moléculas de clase I en la superficie celular, se induciría una respuesta de células T citotóxicas.
Una segunda aplicación es que esta estrategia proporciona un método para tratar infecciones virales latentes. Varios virus (por ejemplo, hepatitis B, VIH y miembros del grupo de los virus del herpes) pueden establecer infecciones latentes en las que el virus se mantiene intracelularmente en una forma inactiva o parcialmente activa. Hay pocas formas de tratar tales infecciones. Sin embargo, por medio de la inducción de una inmunidad citolítica contra una proteína viral latente, serán dianas y se eliminarán las células infectadas de forma latente.
Una aplicación relacionada de esta estrategia es para el tratamiento de infecciones patogénicas crónicas. Hay numerosos ejemplos de patógenos que se replican lentamente y se extienden directamente de una célula a otra. Estas infecciones son crónicas, en algunos casos durando años o décadas. Son ejemplos de estos patógenos los virus lentos (por ejemplo, Visna), el agente del Scrapie y el VIH. Se pueden eliminar las células infectadas induciendo una respuesta celular contra proteínas del patógeno.
Finalmente, esta estrategia también se puede aplicar al tratamiento de enfermedades malignas. La vacunación para crear una respuesta inmune celular contra una proteína específica del estado maligno, siendo ésta un oncogen activado, un antígeno fetal o un marcador de activación, dará como resultado la eliminación de estas células. De esta forma, el uso de vacunas de ADN/ARNm podría aumentar en gran medida la inmunogenicidad de ciertas proteínas virales, y antígenos específicos del cáncer, que normalmente inducen una respuesta inmunológica deficiente. La técnica de vacunas de ARNm sería aplicable a la inducción de inmunidad de células T citotóxicas contra proteínas virales poco inmunogénicas de virus del herpes, de la hepatitis no A y no B, y del VIH, y evitaría los riesgos y las dificultades asociadas con la propagación in vitro de estos virus. En el caso de los antígenos de la superficie celular, tales como proteínas de la cubierta viral (por ejemplo, gp120 de VIH), el antígeno se expresaría en la superficie de la célula diana en el contexto del complejo principal de histocompatibilidad (MHC), lo cual se esperaría que diera como resultado una respuesta inmune más apropiada, vigorosa y real. Es este factor el que produce respuestas inmunes más eficaces observadas frecuentemente con vacunas de virus atenuados. El suministro de un solo gen de antígeno por TGT sería mucho más seguro que los virus atenuados, que pueden proporcionar una baja frecuencia de la enfermedad debido a una atenuación inadecuada.
Hay una ventaja adicional de TGT que puede explotarse durante la fase de desarrollo de vacunas. Una de las dificultades que surge con el desarrollo de las vacunas es el requisito de seleccionar diferentes variantes estructurales del antígeno, para conseguir la respuesta inmune óptima. Si la variante procede de una fuente recombinante, la proteína normalmente debe expresarse y purificarse antes de que pueda ensayarse con respecto a la antigenicidad. Éste es un proceso laborioso y que requiere mucho tiempo. Con la mutagénesis in vitro, es posible obtener y secuenciar numerosos clones de un antígeno dado. Si estos antígenos pueden seleccionarse con respecto a la antigenicidad a nivel del ADN o del ARN por TGT, el programa de desarrollo de vacunas podría realizarse de forma mucho más rápida.
Finalmente, en el caso de las vacunas de ADN/ARNm, el antígeno proteico nunca se expone directamente al anticuerpo del suero, pero siempre se produce por las propias células transfectadas después de la traducción del ARNm. Por lo tanto, la anafilaxis no debe ser un problema. De esta manera, la presente invención permite que el paciente se inmunice repetidamente sin el riesgo de reacciones alérgicas. El uso de las vacunas de ADN/ARNm de la presente invención hace que sea posible tal inmunización.
Se pueden concebir fácilmente las formas en las que esta tecnología puede modificarse para aumentar adicionalmente la inmunogenicidad de antígenos. La inmunización de células T puede aumentarse aumentando la densidad de antígenos de histocompatibilidad de clase I y de clase II sobre el macrófago u otras superficies celulares y/o induciendo en la célula transfectada la liberación de citoquinas que promuevan la proliferación de linfocitos. Para este fin, se pueden incorporar en los mismos liposomas que contienen ARNm para el antígeno, otras especies de ARNm que codifican interferones o interleuquina-1. Se sabe que estas citoquinas potencian la activación de macrófagos. Su uso sistémico se ha visto impedido debido a la aparición de efectos secundarios. Sin embargo, cuando se encapsulan en ARNm junto con ARNm para el antígeno, deben expresarse sólo por las células que coexpresan el antígeno. En esta situación, la inducción de inmunidad de células T puede aumentarse en gran medida.
Formulaciones terapéuticas
Sales de polinucleótidos: dentro del alcance de la invención se incluye la administración de sales farmacéuticamente aceptables de los polinucleótidos descritos en este documento. Tales sales pueden prepararse a partir de bases no tóxicas farmacéuticamente aceptables incluyendo bases orgánicas y bases inorgánicas. Las sales derivadas de bases inorgánicas incluyen sodio, potasio, litio, amonio, calcio, magnesio y similares. Las sales derivadas de bases no tóxicas orgánicas farmacéuticamente aceptables incluyen sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, aminoácidos básicos y similares. Como discusión útil de sales farmacéuticas, véase S.M. Berge et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 66:1- 19 (1977) cuya descripción se incorpora en este documento como referencia.
Los polinucleótidos para inyección, una vía de administración preferida, pueden prepararse en forma de dosificación unitaria en ampollas o en recipientes de múltiples dosis. Los polinucleótidos pueden presentarse en formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o preferiblemente acuosos. Como alternativa, la sal de polinucleótido puede estar en forma liofilizada para reconstituirse, en el momento del suministro, con un vehículo adecuado, tal como agua estéril sin pirógenos. Las formas líquidas, así como las formas liofilizadas, que se van a reconstituir comprenderán agentes, preferiblemente tampones, en cantidades necesarias para ajustar convenientemente el pH de la solución inyectada. Para cualquier uso parenteral, particularmente si la formulación se va a administrar por vía intravenosa, la concentración total de solutos debe controlarse para hacer la preparación isotónica, hipotónica o débilmente hipertónica. Se prefieren materiales no iónicos, tales como azúcares, para ajustar la tonicidad, y se prefiere particularmente la sacarosa. Cualquiera de estas formas puede comprender adicionalmente agentes de formulación adecuados, tales como almidón o azúcar, glicerol o solución salina. Las composiciones por dosificación unitaria, ya sean líquidas o sólidas, pueden contener de un 0,1% a un 99% de material polinucleotídico.
Las ampollas de dosificación unitaria o los recipientes de múltiples dosis, en los que los polinucleótidos se envasan antes del uso, pueden comprender un recipiente cerrado herméticamente que encierra una cantidad de polinucleótido o de solución que contiene un polinucleótido adecuada para conseguir una dosis farmacéuticamente eficaz del mismo, o múltiplos de una dosis eficaz. El polinucleótido se envasa como una formulación estéril, y el recipiente cerrado herméticamente se diseña para conservar la esterilidad de la formulación hasta el uso.
El recipiente en el que se envasa el polinucleótido se etiqueta, y la etiqueta lleva una indicación en la forma prescrita por una agencia gubernamental, por ejemplo, la administración de alimentos y fármacos, reflejando dicha indicación la aprobación por la agencia según las leyes federales, de la fabricación, uso o venta del material polinucleotídico para administración humana.
Las leyes federales requieren que el uso de agentes farmacéuticos en la terapia de seres humanos se apruebe por una agencia del gobierno federal. La administración de alimentos y fármacos, que emite regulaciones apropiadas para afianzar tal aprobación, detalladas en 21 U.S.C. 301-392, es la responsable de la ejecución. También se proporciona la regulación del material biológico, que comprende productos obtenidos a partir de tejidos de animales, según el artículo 42 U.S.C 262. En la mayoría de los países extranjeros se requiere una aprobación similar. Las regulaciones varían de un país a otro, pero los procedimientos individuales son bien conocidos para los especialistas en la técnica.
Dosificación y vía de administración
La dosificación a administrar depende en gran medida del estado y de las dimensiones del sujeto que se va a tratar, así como de la frecuencia de tratamiento y la vía de administración. Los regímenes para una terapia de continuación, incluyendo la dosis y la frecuencia, pueden guiarse por la respuesta inicial y por el criterio clínico. Se prefiere la vía de inyección parenteral en el espacio intersticial de tejidos, aunque pueden requerirse otras vías parenterales, tales como inhalación de una formulación de aerosol, en una administración específica, por ejemplo, en las membranas mucosas de la nariz, garganta, tejidos bronquiales o pulmones.
Regulación de TGT
Al igual que los protocolos de transferencia de genes basados en ADN requieren señales apropiadas para la transcripción (promotores, potenciadores) y el procesamiento (señales de empalme, señales de poliadenilación) del transcrito de ARNm, la TGT basada en ARNm requiere los elementos estructurales y de secuencia apropiados para una traducción eficaz y correcta, junto con los elementos que potenciarán la estabilidad del ARNm transfectado.
En general, se ha descubierto que la eficacia de la traducción se regula por elementos de secuencia específicos en la región 5' no codificante o no traducida (5'UTR) del ARN. Los motivos de secuencia positivos incluyen la secuencia consenso de inicio de la traducción (GCC)^{A}CCATGG (Kozak, Nucleic Acids Res. 15:8125 (1987)) y la estructura de protección 5^{G} 7 metil GpppG (Drummond et al., Nucleic Acids Res. 13:7375 (1985)). Los elementos negativos incluyen estructuras 5'UTR tallo- bucle intramoleculares estables (Muesing et al., cell 48:691(1987)) y secuencias AUG o fases de lectura abierta cortas precedidas por un codón AUG apropiado en el 5' UTR ((Kozak, Supra, Rao et al., Mol. and Cell. Biol. 8:284(1988)). Además, ciertos motivos de secuencia tales como la 5' UTR de la beta globina pueden actuar para potenciar la traducción (cuando se ponen adyacentes a una 5' UTR heteróloga) por un mecanismo desconocido. También hay ejemplos de secuencias de 5' UTR específicas que regulan la eficacia de la traducción eucariota en respuesta a señales ambientales. Éstas incluyen la 5' UTR de la ferritina humana (Hentze et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6730 (1987)) y hsp^{7}0,5'UTR de drosophila (Klemenz et al., EMBO Journal 4:2053 (1985)). Finalmente, existen secuencias 5' UTR virales que pueden evitar la traducción normal dependiente de grupos terminales y los controles de la traducción y mediar una traducción eficaz de ARNm virales o quiméricos (Dolph et al., J. of Virol. 62:2059 (1988)), Pelletier and Sonnenberg, Nature 334, 320 (1988)). Por lo tanto, los protocolos de la TGT basados en ARNm incluyen elementos de la traducción 5' UTR apropiados que flanquean la secuencia codificante para la proteína de interés. Además de los problemas de traducción, debe considerarse la estabilidad del ARNm durante el desarrollo de los protocolos de TGT basados en ARNm. Como indicación general, la protección terminal y la poliadenilación 3' son los determinantes positivos principales de la estabilidad del ARNm eucariota (Drummond supra; Ross, Mol. Biol. Med. 5: 1 (1988)) y actúan protegiendo los extremos 5' y 3' del ARNm de la degradación. Sin embargo, también se han definido elementos reguladores que afectan a la estabilidad de los ARNm eucariotas y, por lo tanto, deben considerarse en el desarrollo de protocolos de TGT de ARNm. El más notable y el definido más claramente de éstos son las secuencias desestabilizadoras de la región 3' no traducida rica en uridina (3'UTR) encontradas en muchos ARNm de vida corta (Shaw y Kamen Cell 46:659 (1986)), aunque hay indicios de que estos no son los únicos motivos de secuencia que ocasionan la desestabilización del ARNm (Kabnick y Housman, Mol. and Cell Biol. 8:3244 (1988)). Además, también se han mostrado secuencias reguladoras específicas que modulan la vida media del ARNm celular en respuesta a estímulos ambientales. Éstas incluyen la modulación mediada por estrógenos de la estabilidad del ARNm de la vitelogenina (Brock y Shapiro, Cell 34:207 (1983)), la regulación dependiente de hierro de la estabilidad del ARNm del receptor de transferrina (Mullner y Kuhn, Cell 53:815 (1988)) que se debe a un motivo 3' UTR específico, el control mediado por prolactina de la estabilidad del ARNm de caseína (Guyette et al., Cell 17:1013 (1989)), la regulación de la estabilidad del ARNm de fibronectina en respuesta a varios estímulos (Dean et al., J. Cell. Biol. 106:2159 (1988)), y el control de la estabilidad del ARNm de histonas (Graves et al., Cell 48:615 (1987)). Finalmente, como se han desarrollado secuencias de ARN virales que evitan los controles normales de la traducción del ARNm eucariota, de forma similar, algunas secuencias de ARN viral parecen poder conferir estabilidad en ausencia de poliadenilación 3' (McGrae y Woodland, Eur. J. of Biochem. 116:467 (1981)). Se sabe que algunos 5', tales como EMC, de acuerdo con el ejemplo 21, funcionan sin un grupo protector. Esta cacofonía de elementos moduladores de la estabilidad también debe considerarse cuidadosamente en el desarrollo de protocolos de TGT basados en ARNm, y puede usarse para modular el efecto de un tratamiento de ARNm.
Materiales que forman liposomas
En el momento actual está muy desarrollada la ciencia de formación de liposomas. Los liposomas son vesículas unilamelares o multilamelares que tienen una porción de membrana formada de un material lipófilo y una porción acuosa interior. La porción acuosa se usa en la presente invención para contener el material polinucleotídico a suministrar a la célula diana.
Se prefiere que los materiales formadores de liposomas usados en este documento tengan un grupo catiónico, tal como un grupo amonio cuaternario, y uno o más grupos lipófilos, tales como grupos alquilo saturados o insaturados que tienen de aproximadamente 6 a aproximadamente 30 átomos de carbono. En la Publicación de Patente Europea Nº 0187702 se describe un grupo de materiales adecuado. Estos materiales tienen la fórmula:
1
donde R^{1} y R^{2} son iguales o diferentes y son alquilo o alquenilo de 6 a 22 átomos de carbono, R^{3}, R^{4} y R^{5} son iguales o diferentes y son hidrógeno, alquilo de 1 a 8 carbonos, arilo, aralquilo de 7 a 11 carbonos, o cuando dos o tres de R^{3}, R^{4} y R^{5} se toman conjuntamente, forman quinuclidino, piperidino, pirrolidino o morfolino; n es de 1 a 8, y X es un anión farmacéuticamente aceptable, tal como un halógeno. Estos compuestos pueden prepararse como se detalla en la solicitud de patente identificada anteriormente; como alternativa, al menos uno de estos compuestos, el cloruro de N-(2,3-di-(9-(Z)-octadeceniloxi))-prop-1- il-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA), está disponible en el mercado en Bethesda Research Laboratories (BRL), Gaithersburg, Maryland 20877, USA.
Sin embargo, estos compuestos de diéter de amonio cuaternario tienen algunos inconvenientes. Debido a los enlaces éter, no se metabolizan fácilmente in vivo. Cuando se contempla la terapia a largo plazo, hay alguna posibilidad de que estos materiales puedan acumularse en los tejidos, produciendo finalmente enfermedades de almacenamiento de lípidos y efectos secundarios tóxicos. Por consiguiente, una clase preferida de composiciones para uso en la presente invención tiene la fórmula:
2
donde R^{1} y R^{2} son iguales o diferentes y son alquilo o alquenilo de 5 a 21 átomos de carbono, R^{3}, R^{4} y R^{5} son iguales o diferentes y son hidrógeno, alquilo de 1 a 8 carbonos, arilo, aralquilo de 7 a 11 carbonos, o cuando dos o tres de R^{3}, R^{4} y R^{5} se toman conjuntamente, forman quinuclidino, piperidino, pirrolidino o morfolino; n es de 1 a 8, y X es un anión farmacéuticamente aceptable, tal como un halógeno. Estos compuestos pueden prepararse usando técnicas convencionales, tales como substitución nucleófila que implica un ácido carboxílico y un haluro de alquilo, por transesterificación, o por condensación de un alcohol con un ácido o un haluro de ácido.
Además, en la bibliografía se describen muchos compuestos lipídicos catiónicos formadores de liposomas adecuados. Véase, por ejemplo, L. Stamatatos, et al., Biochemistry 27:3917-3925 (1988); H. Eibl, et al., Biophysical Chemistry 10:261-271 (1979).
Preparación de liposomas
En el mercado están disponibles liposomas adecuados para uso en la presente invención. Los liposomas DOTMA, por ejemplo, están disponibles con la marca comercial Lipofectin de Bethesda Research Labs, Gaithersburg, Maryland.
Como alternativa, los liposomas pueden prepararse a partir de materiales de partida fácilmente adquiribles o recién sintetizados del tipo descrito previamente. La preparación de liposomas DOTAP se detalla en el ejemplo 6. La preparación de liposomas DOTMA se explica en la bibliografía, véase, por ejemplo, P. Felgner, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 84:7413-7417. Pueden usarse métodos similares para preparar liposomas a partir de otros materiales lipídicos catiónicos. Además, pueden usarse materiales convencionales de formación de liposomas para preparar liposomas con carga negativa o carga neutra. Tales materiales incluyen fosfatidil colina, colesterol, fosfatidil-etanolamina y similares. Ventajosamente, estos materiales también pueden mezclarse con materiales de partida DOTAP o DOTMA en relaciones del 0% a aproximadamente un 75%.
Pueden usarse métodos convencionales para preparar otros liposomas no catiónicos. Estos liposomas no se fusionan con las paredes celulares tan fácilmente como los liposomas catiónicos. Sin embargo, se absorben por los macrófagos in vivo y, de esta manera, son particularmente eficaces para suministrar polinucleótidos a estas células. Por ejemplo, pueden usarse dioleoil-fosfatidil colina (DOPC), dioleoilfosfatidil glicerol (DOPG), y dioleoilfosfatidil etanolamina (DOPE) en diversas combinaciones para obtener liposomas convencionales, con o sin la adición de colesterol. De esta manera, por ejemplo, pueden prepararse vesículas de DOPG/DOPC secando 50 mg de cada uno del DOPG y del DOPC en una corriente de gas nitrógeno en un vial de sonicación. La muestra se pone bajo una bomba de vacío durante una noche y se hidrata al día siguiente con agua desionizada. La muestra después se sonica durante 2 horas en un vial tapado, usando un sonicador Heat Systems modelo 350 equipado con una sonda de copa invertida (de tipo baño) a la potencia máxima mientras que el baño se hace circular a 15ºC. Como alternativa, pueden prepararse vesículas cargadas negativamente sin sonicación para producir vesículas multilamelares o por extrusión a través de membranas Nucleopore para producir vesículas unilamelares de tamaño discreto. Se conocen otros métodos y están disponibles para los especialistas en la técnica.
La presente invención se describe a continuación con detalle usando los 23 ejemplos proporcionados más adelante; sin embargo, los métodos descritos se pueden aplicar ampliamente como se describe en este documento y no pretenden limitarse por los ejemplos.
Ejemplo 1 Preparación de DOTAP de formación de liposomas
El material formador de liposomas catiónico 1,2-bis(oleoiloxi)-3-(trimetilamonio)propano (DOTAP) se prepara como se indica por L. Stamatatos, et al. (supra) o H. Eibl, et al. (supra).
En resumen, Stamatatos, et al. notifican que 1 mmol de 3-bromo-1,2 propanodiol (Aldrich) se aciló durante 48 horas a 20ºC con 3 mmol de cloruro de oleílo (recién preparado a partir de ácido oleico y cloruro de oxaloílo) en éter dietílico sin alcohol, seco, (20 ml) que contenía 5 mmol de piridina seca. El precipitado de clorhidrato de piridinio se separó por filtración y el filtrado se concentró en una atmósfera de nitrógeno y se redisolvió en 10 ml de hexano. La solución de hexano se lavó 3 veces con un volumen igual de una mezcla 1:1 de metanol/NCOONa acuoso 0,1 N, pH 3,0, 3 veces con una mezcla 1:1 de metanol/NaOH acuoso 0,1 N y una vez con NaCl acuoso al 1%. El 3-bromo-1,2-bis-(oleoiloxi)propano bruto después se agitó durante 72 horas en un tubo cerrado herméticamente con una solución de trimetilamina al 15% en dimetil sulfóxido seco (30 ml) a 25ºC. Los productos de esta reacción se disolvieron en cloroformo (200 ml), que se lavó repetidamente con una mezcla 1:1 de metanol/HCOONa acuoso 100 mM, pH 3,0 y después se evaporó al vacío para producir un aceite amarillo claro. Este material se purificó en una columna de ácido silícico (Bio-Sil A, Bio-Rad Laboratories), eluyendo con un gradiente del 0 al 15% de metanol en cloroformo para dar el producto deseado en forma pura en metanol al 9-10%. El producto purificado era un aceite incoloro viscoso que migra con un R_{f} de 0,4 en placas de cromatografía de capa fina (gel de sílice G), que se revelaron con 50:15:5:5:2 de CHCl_{3}/acetona/CH_{3}OH/CH_{3}COOH/H_{2}O.
Ejemplo 2 Preparación de plásmidos para fabricar plantillas de ADN para cualquier gen de interés
Puede prepararse un ADN de plantilla adecuado para la producción de un ARNm que codifique para un polipéptido deseado de acuerdo con la metodología de ADN recombinante convencional. Como se ha indicado previamente (P. Kreig, et al., Nucleic Acids Res. 12:7057-7070 (1984)), un grupo protector 5' facilita la traducción del ARNm. Sin embargo, se cree que las regiones 3' flanqueantes y la cola de poli A aumentan la vida media del ARNm in vivo.
El vector de clonación SP6 fácilmente adquirible proporciona regiones flanqueantes 5' y 3' procedentes de la \beta-globina, un ARNm traducido de forma eficaz. La construcción de este plásmido se detalla por Kreig, et al. (supra), y se incorpora en este documento como referencia. En este plásmido puede introducirse cualquier ADNc que contenga un codón de iniciación, y puede prepararse ARNm a partir del ADN de plantilla resultante. Este plásmido particular puede cortarse con BglII para insertar cualquier ADNc deseado que codifique para un polipéptido de interés.
Aunque pueden obtenerse buenos resultados con pSP64T cuando se linealiza y después se transcribe in vivo con la ARN polimerasa de SP6, preferimos usar las secuencias flanqueantes de la \beta-globina de xenopus de pSP64T con la ARN polimerasa del fago T7. Estas secuencias flanqueantes se purifican a partir de pSP64T como el fragmento HindIII a EcoRI pequeño (de aproximadamente 150 pb). Estas secuencias después se insertan en un fragmento HindIII/EcoRI lineal purificado (de aproximadamente 2,9 kpb) procedente de pIBI 31 (disponible en el mercado en International Biotechnologies, Inc., Newhaven, Connecticut 06535) con la ADN ligasa de T4. Los plásmidos resultantes, denominados pXBG, se seleccionan con respecto a la orientación y se utilizan para transformar células E. coli. Estos plásmidos se adaptan para recibir cualquier gen de interés en un solo sitio de restricción BglII, que se sitúa entre las dos secuencias de \beta-globina de xenopus.
Ejemplo 3 Preparación de un plásmido que codifica para la cloranfenicol acetiltransferasa
Un gen marcador conveniente para demostrar la expresión in vivo de polinucleótidos exógenos es la cloranfenicol acetiltransferasa, CAT. Se produjo un plásmido pSP-CAT que contenía el gen CAT flanqueado por las secuencias 5' y 3' de la \beta-globina de xenopus añadiendo el gen CAT en el sitio BglII de pSP64T. Usamos el gen CAT en forma del fragmento BamHI/HindIII pequeño de pSV2-CAT (disponible en la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, Nº de Acceso 37155). Sin embargo, el gen CAT se usa comúnmente en biología molecular y está disponible en numerosas fuentes. Tanto el fragmento BamHI/HindIII de CAT como el pSP64T escindido con BglII se incubaron con el fragmento de Klenow para generar extremos romos, y después se unieron con la ADN ligasa de T4 para formar pSP-CAT.
Después se generó y se purificó el fragmento PstI/HindIII pequeño, que comprende el gen CAT entre las secuencias flanqueantes 5' y 3' de la \beta-globina de pSP64T. pIBI31 (International Biotechnologies, Inc.) se escindió con PstI y HindIII, y se purificó la secuencia lineal larga. Este fragmento después se combinó con la secuencia que contenía el gen CAT y los fragmentos se unieron con la ADN ligasa de T4 para formar un plásmido denominado pT7CAT An. Los clones se seleccionan basándose en la actividad \beta-galactosidasa con Xgal y resistencia a ampicilina.
Ejemplo 4 Preparación de la plantilla de ADN purificada
El ADN plasmídico del ejemplo 3 se desarrolla y se prepara según Maniatis (supra), con la excepción de que no se usa RNAsa, usando 2 centrifugaciones con CsCl para retirar el ARN bacteriano. Específicamente, se cultivaron células E. coli que contenían pT7CAT An del ejemplo 3, en medio LB que contenía ampicilina. Las células después se sedimentaron por centrifugación a 5000 rpm durante 10 minutos en una centrífuga Sorvall RC-5 (E.I. DuPont, Burbank, California 91510), se resuspendieron en TE frío pH 8,0, se centrifugaron de nuevo durante 10 minutos a 5000 rpm, se resuspendieron en una solución de glucosa a 50 mM, Tris-Cl 25 mM pH 8,0, EDTA 10 mM y lisozima a una concentración de 40 mg/ml. Después de la incubación durante 5 a 10 minutos con inversión ocasional., se añadió NaOH 0,2 N que contenía SDS al 1%, seguido, después de 10 minutos a 0ºC, de acetato potásico 3 M y ácido acético 2 M. Después de 10 minutos más, el material se centrifugó de nuevo a 6000 rpm y el sobrenadante se retiró con una pipeta. El sedimento después se mezcló en 0,6 volúmenes de isopropanol (-20ºC), se mezcló y se almacenó a -20ºC durante 15 minutos. El material después se centrifugó de nuevo a 10.000 rpm durante 20 minutos, esta vez en un rotor de cubo giratorio HB4 (DuPont, supra), después de lo cual el sobrenadante se retiró y el sedimento se lavó en EtOH al 70% y se secó a temperatura ambiente. Después, el sedimento se resuspendió en 3,5 ml de TE, seguido de la adición de 3,4 g de CsCl y 350 \mul de EtBr a una concentración de 5 mg/ml. El material resultante se puso en un tubo de sellado rápido, rellenado hasta arriba con aceite mineral. El tubo se centrifugó durante 3,5 horas a 80.000 rpm en una centrífuga VTi80 (Beckman Instruments, Pasadena, California, 91051). La banda se retiró, y el material se centrifugó de nuevo, constituyendo el volumen con 0,95 g de CsCl/ml y 0,1 ml de EtBr a 5 mg/ml en TE. El EtBr después se extrajo con un volumen igual de N-Butanol saturado con TE después de añadir 3 volúmenes de TE a la banda, desechando la fase superior hasta que la fase superior fue transparente. Después se añadieron 2,5 volúmenes de EtOH y el material se precipitó a -20ºC durante 2 horas. El precipitado de ADN resultante se usa como plantilla de ADN para la preparación de ARNm in vitro.
Ejemplo 5 Preparación de ARNm para transfección
El ADN del ejemplo 4 se linealizó cadena abajo de la cola de poli A con un exceso de 5 veces de PstI. El ADN linealizado después se purificó con dos extracciones de fenol/cloroformo, seguido de dos extracciones de cloroformo. El ADN después se precipitó con NaOAc (0,3 M) y 2 volúmenes de EtOH. El sedimento se resuspendió a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml en agua desionizada tratada con DEP.
A continuación se preparó un tampón de transcripción, que comprendía Tris HCl 400 mM (pH 8,0), MgCl_{2} 80 mM, DTT 50 mM, y espermidina 40 mM. Después se añadieron los siguientes materiales en orden a un volumen de agua tratada con DEP a temperatura ambiente: 1 volumen de tampón de transcripción de T7, preparado anteriormente; rATP, rCTP, y rUTP hasta una concentración 1 mM; rGTP hasta una concentración 0,5 mM; análogo del grupo protector 7meG(5')ppp(5')G (New England Biolabs, Beverly, Massachusetts, 01951) hasta una concentración 0,5 mM; la plantilla de ADN linealizada preparada anteriormente a una concentración de 0,5 mg/ml; RNAsin (Promega, Madison, Wisconsin) hasta una concentración de 2000 U/ml; y ARN polimerasa de T7 (N.E. Biolabs) hasta una concentración de 4000 U/ml.
Esta mezcla se incubó durante 1 hora a 37ºC. La reacción de transcripción satisfactoria se indicó por el aumento de la turbidez de la mezcla de reacción.
Después de la generación del ARNm, se añadió 2 U RQ1 DNAsa (Promega) por microgramo de plantilla de ADN usada y se dejó digerir la plantilla durante 15 minutos. Después, el ARN se extrajo dos veces con cloroformo/fenol y dos veces con cloroformo. El sobrenadante se precipitó con NaOAc 0,3 M en 2 volúmenes de EtOH, y el sedimento se resuspendió en 100 \mul de agua desionizada tratada con DEP por 500 \mul de producto de transcripción. Esta solución se pasó sobre una columna de Sephadex G50 sin RNAsa (Boehringer Mannheim Nº 100 411). El ARNm resultante fue suficientemente puro como para usarse en la transfección de vertebrados in vivo.
Ejemplo 6 Preparación de liposomas
En la práctica de la presente invención, pueden usarse ventajosamente varios métodos de preparación de liposomas. Un liposoma particularmente preferido se obtiene a partir de DOTAP como se indica a continuación:
Una solución de 10 mg de dioleoil fosfatidiletanolamina (PE) y 10 mg de DOTAP (del ejemplo 1) en 1 ml de cloroformo se evapora a sequedad bajo una corriente de nitrógeno, y el disolvente residual se retira al vacío durante una noche. Se preparan liposomas resuspendiendo los lípidos en agua desionizada (2ml) y sonicando la suspensión hasta que se vuelva transparente en un vial cerrado. Estas preparaciones son estables durante al menos 6 meses.
Se prepararon complejos polinucleotídicos mezclando 0,5 ml de solución de polinucleótido (por ejemplo, del ejemplo 5) a una concentración de 0,4 mg/ml por adición lenta a través de una jeringa, con una agitación vorticial suave constante, con una solución de 0,5 ml de liposomas DOTMA/PE o DOTAP/PE sonicados a 20 mg/ml, a temperatura ambiente. Este procedimiento produce complejos cargados positivamente que suministran espontáneamente el polinucleótido en células in vivo. Pueden usarse diferentes relaciones entre liposomas cargados positivamente y polinucleótido para adaptarse a las necesidades particulares en cualquier situación particular. Como alternativa, como se presenta por Felgner et al. (supra), puede ser ventajoso diluir el polinucleótido (ADN o ARN) con solución salina tamponada de Hepes (NaCl 150 mM; Hepes 20 mM, pH 7,4) antes de combinar los materiales para formar espontáneamente complejos de liposoma/polinucleótido. Sin embargo, en muchos casos, se cree que es preferible el uso de soluciones que tienen una baja resistencia iónica (tales como sacarosa) en lugar de solución salina; en particular, se cree que tales soluciones facilitan la liberación de polinucleótidos en la célula minimizando la precipitación del complejo de polinucleótido/lípido.
Ejemplo 7 Expresión in vivo de ARNm introducido por medio de liposomas y sin el uso de liposomas en la rata
Se demostró la capacidad del ARNm que codifica para la cloranfenicol acetil transferasa (CAT) para transfectar células in vivo y la posterior expresión de la proteína CAT, por inyección directa de 0,200 \mul de cada una de las formulaciones indicadas más adelante, preparadas como se indica, en el músculo abdominal de ratas, formando una vesícula. Se ensayaron seis réplicas de cada formulación. Después de un período de 12 a 14 horas, se escindió el segmento del músculo abdominal en el que se realizó la inyección, que pesaba aproximadamente de 0,1 a 0,2 gramos, se trituró y se puso en un mortero desechable de 1,5 ml (Kontes, Morton Grove, Illinois) junto con 200 ml de una formulación acuosa que tenía los siguientes componentes: Tris 20 mM, pH 7,6; MgCl_{2} 2 mM; y tensioactivo Triton X-100 al 0,1%. El contenido del mortero después se trituró durante 1 minuto con una mano desechable. El mortero después se cubrió (con Parafilm) y se puso en una bomba de ruptura de células Parr de 1 litro (Parr Instrument Company, Moline, Illinois) y se presurizó a 6 atmósferas con nitrógeno a 4ºC. Después de 30 minutos, la presión se liberó rápidamente para romper el tejido y producir un lisado bruto. El lisado después se centrifugó en una microcentrífuga a 13.000 rpm, a 4ºC, durante 10 minutos. El sobrenadante después se decantó y se almacenó a -20ºC hasta que se analizó.
Los lisados después se ensayaron con respecto a la presencia de la proteína CAT por cromatografía de capa fina. Primero, se incubaron 75 \mul de cada muestra (del sobrenadante preparado anteriormente) durante dos horas a 37ºC con 5 \mul de C^{14} cloranfenicol (Amersham), 20 \mul de Acetil CoA 4 mM; y 50 \mul de Tris 1 M, pH 7,8. Posteriormente, se añadieron 20 \mul de Acetil CoA 4 mM y la mezcla se incubó de nuevo durante 2 horas a 37ºC. La solución resultante se extrajo con 1 ml de EtOAc, y la fase orgánica se retiró y se liofilizó en una centrífuga de vacío (SpeedVac, Savant Co.). El sedimento se resuspendió en 20 \mul de EtOAc, y se aplicó en puntos sobre una placa de cromatografía de capa fina de gel de sílice. La placa se reveló durante 45 minutos en 95% de cloroformo/5% de metanol, se secó y se pulverizó con un indicador radioluminiscente (Enhance Spray for Surface Radiography, New England Nuclear Corp.). La placa después se intercaló con una película kodak XAR5 con la exposición durante una noche a -70ºC, y la película se reveló según las instrucciones del fabricante. Se obtuvieron los siguientes resultados:
\newpage
Formulación Expresión de ARNm
(Nº positivo/total)
1. 1 ml de Optimem; 37,5 \mug de DOTMA 0/6
2. 1 ml de Optimem; 15 \mug de ARN de CAT. 3/6
3. Formulación 1 más 15 \mug de ARN de CAT 4/6
4. Sacarosa al 10%; 37,5 \mug de DOTMA; 15 \mug de ARN de CAT 3/6
5. Sacarosa al 10%; 187 \mug de DOTMA; 75 \mug de ARN de CAT 0/6
Optimem: medio sin suero (Gibco Laboratories, Life Technologies, Inc, Grand Island, N.Y. 14072)
DOTMA: (marca Lipofectin; Bethesda Research Labs, Gaithersburg, MD)
ARN de CAT: del ejemplo 5
Todas las formulaciones se realizaron en agua sin RNAsa tratada con DEPC (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT 06535).
Ejemplo 8 Vacunación con ARNm de ratones para producir la proteína gp120 del VIRUA VIH
Se prepara una formulación liposomal que contiene ARNm que codifica para la proteína gp120 del virus VIH de acuerdo con los ejemplos 1 a 5, con la excepción de que el gen para gp120 (pIIIenv3-1 del Aids Research and Reagent Program, National Institute of Allergy and Infectious Disease, Rockville, MD 20852) se inserta en el plásmido pXBG en el procedimiento del ejemplo 4. Se inyecta un volumen de 200 \mul de una formulación, preparada de acuerdo con el ejemplo 6 y que contiene 200 \mu g/ml de ARNm de gp120 y 500 \mu g/ml de una mezcla 1:1 de DOTAP/PE en sacarosa al 10%, en la vena de la cola de ratones 3 veces al día. Aproximadamente 12-14 horas después de la última inyección, se retira un segmento de músculo del sitio de inyección y se prepara como un lisado celular de acuerdo con el ejemplo 7. La proteína gp120 específica de VIH se identifica en el lisado también de acuerdo con los procedimientos del ejemplo 7.
La capacidad del anticuerpo gp120 presente en el suero de los ratones vacunados con ARNm para proteger contra la infección por VIH se determina por un ensayo de reducción de placas HT4-6C como se indica a continuación:
Se obtienen células HT4-6C (célula CD4+ HeLa) a partir de Dr. Bruce Chesebro, (Rocky Mountain National Lab, Montana) y se desarrollan en cultivo en medio RPMI (BRL, Gaithersburg, MD). El grupo de células después se divide en lotes. Algunos de los lotes se infectan con VIH añadiendo aproximadamente de 10^{5} a 10^{6} unidades infecciosas de VIH a aproximadamente 10^{7} células HT4-6C. Otros lotes se ensayan con respecto al efecto protector del suero inmune gp120 contra la infección por VIH añadiendo tanto el VIH como aproximadamente 50 \mul de suero de un ratón vacunado con ARNm de gp120. Después de 3 días de incubación, las células de todos los lotes se lavan, se fijan y se tiñen con violeta de cristal, y se cuenta el número de placas. El efecto protector del suero inmune gp120 se determina como la reducción en el número de placas en los lotes de células tratadas tanto con suero de ratón vacunado con ARNm de gp120 como con VIH en comparación con el número de placas en lotes tratados con VIH solo.
Ejemplo 9 Vacunación con ARNm de ratones SCID que llevan células madre humanas con ARNm de NEF seguido de exposición a VIH
Varios ratones inmunodeficientes combinados (ratones SCID (Molecular Biology Institute, (MBI), La Jolla, CA 92037)) se reconstituyeron con linfocitos de sangre periférica humana adulta por inyección en la cavidad peritoneal de acuerdo con el método de Mosier (Mosier et al., Nature 335:256 (1988)). Después se realizó la inyección intraperitoneal de 400 a 4000 unidades infecciosas de VIH-1. Los ratones se mantuvieron en una instalación de contención de animales de nivel P3 en cajas de manipulación con guantes cerradas herméticamente.
Se preparó ARNm que codificaba para la proteína nef de VIH obteniendo el gen nef en forma de un plásmido (pGM92, del NIAID, Rockville, MD 20852); retirando el gen nef del plásmido; insertando el gen nef en el plásmido pXBG para la transcripción; y purificando el producto de transcripción de ARNm de nef como se describe en los ejemplos 2 a 5. El ARNm de nef después se incorporó en una formulación de acuerdo con el ejemplo 6. Se realizaron diariamente en animales experimentales inyecciones de 200 \mul en la vena de la cola de una solución de sacarosa al 10% que contenía 200 \mug/ml de ARN de nef y 500 \mug/ml de una mezcla 1:1 de DOTAP:DOPE (en forma de complejo de ARN/liposomas), mientras que a los animales de control se les inyectaron de forma similar complejos de ARN/liposomas que contenían 200 \mug/ml de ARNt de levadura y 500 \betag/ml de una mezcla 1:1 de liposomas DOTAP/DOPE. A las 2, 4 y 8 semanas después de la inyección, se obtuvieron muestras de biopsia a partir de órganos linfoides inyectados y se prepararon para un análisis de inmunohistoquímica. En los mismos puntos de tiempo, se obtuvieron muestras de sangre y se ensayaron con respecto a los niveles de p24 por medio de un kit ELISA (Abbott Labs, Chicago, IL) y con respecto a la titulación de virus por el ensayo de placas del ejemplo 8. La inmunotinción para VIH-1 se realizó como se ha descrito (Namikawa et al., Science 242:1648 (1988)) usando el suero policlonal de un paciente infectado con VIH. Se contaron las células positivas y se determinó el número de células infectadas por campo de alta potencia (400x). Usando estos ensayos, se observó una reducción de al menos dos veces en el número de células de tinción positiva a las 8 semanas, y la titulación y expresión de p24 se redujo al menos en un 50%. Conjuntamente, estos resultados indican un efecto antiviral moderado del tratamiento (in vivo).
Un volumen de 200 \mul de la formulación, que contiene 200 \mug/ml de ARNm de nef, y 500 \mug/ml de una mezcla de 1:1 de DOTAP:DOTE en sacarosa al 10% se inyecta en la vena de la cola de ratones SCID que contienen células madre humanas tres veces al día. Después de la inmunización, los ratones se exponen por infección a una dosis eficaz de virus VIH. Se retiran periódicamente muestras de sangre de la vena de la cola y se controlan para la producción de la proteína p24 de VIH característica por un ensayo de kit ELISA (Abbott Labs, Chicago, IL).
Ejemplo 10 Un método para proporcionar adenosina desaminasa a ratones por transfección de ARNm in vivo
La secuencia de longitud completa para el ADNc del gen de la adenosina desaminasa (ADA) humana se obtiene a partir del fragmento EcoR1-Accl de 1.300 pb del clon ADA 211 (Adrian, G. et al. Mol. Cell Biol. 4:1712 (1984). Este fragmento se transforma en un fragmento de extremos romos, se une a engarces de BglII y después se digiere con BglII. El fragmento modificado se inserta en el sitio BglII de pXBG. El ARNm de ADA se transcribe y purifica de acuerdo con los ejemplos 2 a 5, y el ARNm de ADA purificado se incorpora en una formulación de acuerdo con el ejemplo 6. A ratones Balb 3T3 se les inyectan directamente en la vena de la cola 200 \mul de esta formulación, que contiene 200 \mug/ml de ARNm de ADA, y 500 \mug/ml de DOTAP en sacarosa al 10%.
La presencia de ADA humana en los tejidos del hígado, piel y músculo de los ratones se confirma por un procedimiento de enfoque isoeléctrico (IEF). Los extractos de tejido se electroenfocaron entre pH 4 y 5 en un gel no desnaturalizante. El gel después se tiñó para la actividad ADA in situ como se indica por Valerio, D. et al. Gene 31:137-143 (1984).
Se realiza una separación preliminar de ADA humano y no humano por cromatografía líquida de proteínas rápida (FPLC). Las proteínas se fraccionan en una columna MonoQ (HR5/5) de Pharmacia (Piscataway, NJ) con un gradiente lineal de KCl de 0,05 a 0,5 M, Tris 20 mM (pH 7,5). La actividad para ADA dentro de las fracciones se mide haciendo reaccionar las fracciones con ^{14}C-adenosina (Amersham, Chicago, IL) que se convierte en inosina. Se usa cromatografía de capa fina (NaPi 0,1 M pH 6,8, sulfato amónico saturado:alcohol n-propílico/100:60:2) para separar la inosina radiactiva de la adenosina del substrato.

Claims (16)

1. Uso de un liposoma cargado positivamente y un polinucleótido expresable que codifica para un péptido inmunogénico, en la fabricación de un medicamento para administración a un mamífero, donde dicho medicamento se incorpora en una célula en la que se forma un producto de traducción inmunogénico del polinucleótido, y el producto se procesa y presenta por la célula en el contexto del complejo principal de histocompatibilidad, induciendo de esta manera una respuesta inmune contra el péptido inmunogénico.
2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho polinucleótido es un ARNm.
3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho polinucleótido es una ADN que comprende un promotor.
4. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el medicamento es para administración por inyección en el músculo.
5. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el medicamento es para administración por inyección en la piel.
6. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicho medicamento es para administración por introducción en una cavidad corporal.
7. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde dicho mamífero es un ser humano.
8. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde dicho liposoma comprende cloruro de N-(2,3-di-(9-(Z)octadeceniloxi))-prop-1-il-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA) o 1,2-bis(oleoiloxi)-3-(trimetilamonio)propano (DOTAP).
9. Una composición que comprende liposomas cargados positivamente mezclados con un polinucleótido expresable que codifica para un péptido inmunogénico, para administración a un mamífero, donde dicha composición se incorpora en una célula en la que se forma un producto de traducción inmunogénico del polinucleótido, y el producto se procesa y presenta por la célula en el contexto del complejo de histocompatibilidad principal, induciendo de esta manera una respuesta inmune contra el péptido inmunogénico.
10. Una composición de acuerdo con la reivindicación 9, donde dicho polinucleótido es un ARNm.
11. Una composición de acuerdo con la reivindicación 9, donde dicho polinucleótido es un ADN que comprende un promotor.
12. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, para la administración por inyección en el músculo.
13. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, para la administración por inyección en la piel.
14. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, para la administración por introducción en una cavidad corporal.
15. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, donde dicho mamífero es un ser humano.
16. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15, donde dicho liposoma comprende cloruro de N-(2,3-di-(9-(Z)octadeceniloxi))-prop-1-il-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA) o 1,2-bis(oleoiloxi)-3-(trimetilamonio)propano (DOTAP).
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