ES2200812T3 - Procedimiento para purificar acido hialuronico de elevado peso molecular. - Google Patents

Procedimiento para purificar acido hialuronico de elevado peso molecular.

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ES2200812T3 ES00900777T ES00900777T ES2200812T3 ES 2200812 T3 ES2200812 T3 ES 2200812T3 ES 00900777 T ES00900777 T ES 00900777T ES 00900777 T ES00900777 T ES 00900777T ES 2200812 T3 ES2200812 T3 ES 2200812T3
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Abstract

Procedimiento para purificar ácido hialurónico de elevado peso molecular con un peso molecular no inferior a 0, 5 x 106 Daltons de una fuente biológica para obtener ácido hialurónico de elevado peso molecular de grado farmacéutico o una sal del mismo, caracterizado porque comprende: a) una etapa de ajustar el pH de una solución acuosa conteniendo ácido hialurónico de elevado peso molecular de origen biológico a un pH que oscila entre 1, 7 y 3, 3 y a continuación diafiltrar la disolución al mismo pH utilizando un filtro con un tamaño de poro que oscila entre un límite de exclusión de peso molecular nominal 100.000 Daltons a 0, 45 µm; b) una etapa de eliminar las células de la disolución acuosa que contiene el ácido hialurónico de elevado peso molecular de origen biológico, dicha etapa siendo realizada antes de la etapa a) o a continuación de la etapa a); y c) una etapa de esterilización.

Description

Procedimiento para purificar ácido hialurónico de elevado peso molecular.
La presente invención se refiere a un procedimiento para purificar ácido hialurónico de elevado peso molecular o una sal del mismo.
El ácido hialurónico es un polisacárido mucoide de origen biológico, ampliamente distribuido en la naturaleza. Por ejemplo, se conoce que el ácido hialurónico se encuentra en una multiplicidad de tejidos animales tales como el cordón umbilical, el fluido sinovial, el humor vítreo, cresta de los gallos y múltiples tejidos conectivos tales como la piel y los cartílagos.
Químicamente, el ácido hialurónico es un miembro de los glucosaminoglicanos y está constituido por unidades alternativas repetidas de ácido D-glucourónico y N-acetil-D-glucosamina, formando una cadena lineal con un peso molecular de hasta 13 x 10^{6} Daltons.
En la presente invención, ácido hialurónico de elevado peso molecular significa ácido hialurónico con un peso molecular no inferior a 0,5 x 10^{6} Daltons.
Debe destacarse en la presente descripción y reivindicaciones el término "ácido hialurónico" puede significar indiferentemente ácido hialurónico en forma de ácido o en forma de sal como por ejemplo hialuronato sódico o potásico, hialuronato magnésico, hialuronato cálcico u otros.
El ácido hialurónico de elevado peso molecular es viscoso y tiene la capacidad de mantenerse en estado de gel, actuando como lubricante, evitando la invasión de las bacterias y reteniendo agua.
Debido a dichas propiedades, el ácido hialurónico es capaz de mantener la tonicidad y elasticidad de la piel.
La utilización farmacéutica del ácido hialurónico o sus sales está ampliamente descrita en la literatura.
Debido a que el ácido hialurónico es una sustancia no inmunogénica y posee propiedades viscoelásticas e hidrofílicas, se utiliza, desde hace varios años, para reemplazar el fluido del humor vítreo y de las articulaciones o como un medio de soporte en la cirugía oftálmica, tal como se da a conocer en la patente estadounidense nº 4.141.973 de Balazs.
En los fluidos de las articulaciones, la disolución de ácido hialurónico viscosa sirve como lubricante para proporcionar un ambiente protector a las células y por tal razón, se utiliza en el tratamiento de las articulaciones inflamadas de la rodilla.
El documento EP-A-0 781 547 de Chemedica S.A. da a conocer una formulación oftálmica con base en hialuronato sódico para utilización en cirugía oftálmica.
El documento EP-A-0 719 559 de Chemedica S.A. da a conocer una disolución viscosa de hialuronato sódico para utilización como fluido de máscara para la fotoqueratectomía terapéutica utilizando un láser de excímero.
El documento EP-A-0 875 248 de Chemedica S.A. da a conocer la utilización de ácido hialurónico u una de sus sales farmacéuticamente aceptables para la preparación de una solución acuosa útil como líquido de lavaje intraarticular.
El documento EP-A-0 698 388 de Chemedica S.A. da a conocer un preparación oftálmica para utilización como lágrima artificial que contiene hialuronato como espesante viscoso.
Gracias a su naturaleza altamente hidrofílica, el ácido hialurónico también puede ser utilizado en productos cosméticos tales como lociones y cremas.
La utilización farmacéutica del ácido hialurónico o sus sales requiere, por consiguiente, un producto de elevada pureza.
El ácido hialurónico se puede extraer y purificar, por ejemplo, de los cordones umbilicales, de las crestas de los gallos o de los grupos A y C de Streptococci tal como se da a conocer, por ejemplo, en los documentos de patente estadounidense US-A-4.141.937 de Balazs y US-A-5.559.104 de Romeo et al..
La producción de ácido hialurónico por los Streptococci fue dada a conocer primero por Forrest et al., en 1937, (J.Biol.Chem.,118:61 (1937)) y más adelante se demostró que el ácido hialurónico de origen animal es idéntico al ácido hialurónico de origen microbiano.
El procedimiento para producir ácido hialurónico a partir de una fuente microbiana está basado en la propiedad de los Streptococci de tener ácido hialurónico como principal componente de su cápsula.
Tales microorganismos son capaces de transformar la glucosa presente en su ambiente en ácido D-glucurónico y N-acetil-D-glucosamina y producir ácido hialurónico como un metabolito secundario, para construir sus cápsulas protectoras.
La biosíntesis del ácido hialurónico por los Streptococci se da a conocer, por ejemplo, en el documento US-A-4.897.349 de Swann et al.,
Se conocen diversos procedimientos para obtener ácido hialurónico de grado farmacéutico o su sal sódica a partir de fuentes microbianas.
Por ejemplo, los documentos US-A-4.780.414 de Nimrod et al., US-A-4.517.295 de Bracke et al., y US-A-5.563.051 de Ellwood et al., dan a conocer procedimientos para obtener ácido hialurónico mediante la continua fermentación de la bacteria Streptococcusseguida de la purificación hasta un grado farmacéutico del ácido hialurónico así obtenido.
Sin embargo, en todos estos procedimientos, la purificación del ácido hialurónico implica la precipitación del ácido hialurónico de origen microbiana utilizando una gran cantidad de disolventes orgánicos tales como etanol, acetona, isopropanol, etc..
Se conocen algunos procedimientos de purificación en los que la precipitación del ácido hialurónico de origen microbiano tiene lugar mediante sales de amonio cuaternario (patente estadounidense US-A-4.517.295 de Bracke et al.) o mediante surfactantes aniónicos o catiónicos (patente estadounidense US-A-5.316.926 de Brown et al.).
Sin embargo, los procedimientos descritos son bastante complejos, generando elevados costes de producción.
El documento de patente EP-A-0 694 616 da a conocer un procedimiento para la purificación de ácido hialurónico a partir del caldo de fermentación del Streptococcus zooepidemicus a pH 3,5; una etapa de filtrado; una etapa de eliminar las células de la solución que contiene ácido hialurónico; y una etapa de esterilización.
Se conocen algunos procedimientos de purificación en los que la disolución de ácido hialurónico es diafiltrada utilizando un filtro con límite de exclusión de peso molecular nominal de 10.000, 20.000 ó 30.000 Daltons, tal como se da a conocer, por ejemplo, en los documentos de US-A-5.563.051 de Ellwood et al., y US-A-4.517.295 de Bracke et al..
Sin embargo, debido a los pequeños límites de exclusión de peso molecular nominal utilizados, dichos procedimientos de diafiltración solamente se pueden utilizar para desechar pequeñas moléculas solubles y la disolución de ácido hialurónico diafiltrado debe procesarse todavía más lo que implica múltiples sistemas de precipitación, lo que resulta en un procedimiento complicado.
Un objetivo de la presente invención es obtener un ácido hialurónico, o una sal del mismo, de elevado peso molecular de grado farmacéutico a partir de cualquier fuente biológica, en particular de origen microbiano, con elevado rendimiento, a un precio relativamente bajo y preferiblemente sin utilizar disolventes orgánicos u otras sustancias adicionales.
Según la presente invención, dicho objetivo se ha conseguido mediante un procedimiento para purificar ácido hialurónico de elevado peso molecular a partir de un origen biológico, caracterizado por:
a)
una etapa de ajustar el pH de una disolución acuosa conteniendo ácido hialurónico de elevado peso molecular de una fuente biológica a un pH oscilando entre 1,7 a 3,3 y a continuación diafiltrando dicha disolución acuosa al mismo pH utilizando un filtro con un tamaño de poro que oscila entre un límite de exclusión de peso molecular nominal de 100.000 Daltons y 0,45 \mum;
b)
una etapa de eliminación de las células de la solución acuosa conteniendo ácido hialurónico de elevado peso molecular de origen biológico, realizándose dicha etapa tanto con anterioridad a la etapa a) como a continuación de la etapa a);
c)
una etapa de esterilización
Ventajosamente, mediante un procedimiento que incluye una etapa de diafiltración a un pH oscilando entre 1,7 y 3,3 y una etapa de eliminación de las células es posible purificar ácido hialurónico de elevado peso molecular de tal forma que se obtiene un elevado rendimiento de un ácido hialurónico de grado farmacéutico de elevado peso molecular o un sal de éste a partir de cualquier origen biológico y en particular a partir de un origen microbiano.
Según la etapa a) del procedimiento de la presente invención, el ácido hialurónico se diafiltra con un límite de exclusión de peso molecular nominal o tamaño de poro tal que permiten el retorno del ácido hialurónico y el paso a través del filtro de las sustancias contenidas en la solución o caldo.
El procedimiento de la presente invención puede ser realizado utilizando cualquier fuente de origen biológico de ácido hialurónico.
Ventajosamente, el ácido hialurónico de grado farmacéutico se puede obtener por medio del procedimiento de la presente invención sin trazas de disolventes orgánicos u otras sustancias añadidas, ya que en el procedimiento de purificación de la presente invención, el ácido hialurónico no se precipita con disolventes orgánicos u otras sustancias, sino que es mantenido en disolución acuosa durante todo el procedimiento.
Otros objetivos, características y ventajas de la presente invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada.
El ácido hialurónico de cualquier origen biológico se puede purificar hasta un grado farmacéutico por el procedimiento de la presente invención.
Por ejemplo, la disolución acuosa que contiene ácido hialurónico de elevado peso molecular que se trata primero, tanto según la etapa a) de la presente invención, o según la etapa b) de la presente invención, puede ser una disolución acuosa que contiene ácido hialurónico de elevado peso molecular obtenido por extracción a partir de cordón umbilical, cresta de gallo u otras.
Sin embargo, en una forma de realización preferida de la presente invención, la disolución acuosa de ácido hialurónico que primero se trata, según la etapa a), o según la etapa b), es una caldo acuoso que contienen ácido hialurónico de elevado peso molecular de origen microbiano.
La fuente de origen microbiano es preferiblemente una especie de Streptococcus que produce ácido hialurónico de elevado peso molecular y más preferiblemente la fuente está seleccionada de entre el grupo que consiste en Streptococcus zooepidemicus, Streptococcus equi y Streptococcus pyogenes.
Un caldo conteniendo ácido hialurónico de elevado peso molecular se puede preparar por cualquiera procedimiento bien conocido incluyendo la fermentación de un cultivo de Streptococcus productor de ácido hialurónico de elevado peso molecular en un medio acuoso adecuado y bajo las condiciones adecuadas. Tales procedimientos se dan a conocer en, por ejemplo, los documentos US-A-4.780.414 de Nimrod et al., US-A-5.563.051 de Ellwood et al., ó US-A-5.316.916 de Brown et al..
El procedimiento para preparar un caldo acuoso conteniendo ácido hialurónico de elevado peso molecular según la presente invención puede ser el siguiente, como ejemplo:
Al final del procedimiento de fermentación habitual, el caldo que contiene ácido hialurónico, teniendo un pH de aproximadamente 7,4, se cosecha y se transfiere a un tanque equipado con un control automático de la temperatura.
Se mantiene la temperatura a un valor que oscila entre 15ºC y 25ºC, preferiblemente a 20ºC.
La disolución acuosa de ácido hialurónico o caldo así obtenido se puede tratar a continuación según el procedimiento de purificación de la presente invención.
La diafiltración, según la etapa a) de la presente invención, de una disolución de ácido hialurónico de origen biológico a un pH oscilando entre 1,7 y 3,3, utilizando un filtro con un tamaño de poro oscilando desde un límite de exclusión de peso molecular nominal de 100.000 Daltons y 0,45 \mum, conduce a la eliminación de todas las proteínas y otros materiales solubles presentes en la disolución acuosa.
Se asume que cuando el pH de una disolución de ácido hialurónico se ajusta a un pH oscilando entre 1,7 y 3,3, se produce un tipo de entrelazamiento reversible, en el que las moléculas de ácido hialurónico forman una trama que se puede romper en otras condiciones de pH.
A un pH oscilando entre 1,7 y 3,3, la trama puede ser retenida por un filtro teniendo un tamaño de poro que oscila entre un límite de exclusión de peso molecular nominal de 100.000 Daltons y 0,45 \mum, mientras que las proteínas y otros materiales pasan a través del filtro, haciendo por ello posible la separación del ácido hialurónico de cualquier sustancia soluble contenida en la disolución.
En la etapa a), el pH de la disolución acuosa se ajusta preferiblemente a un valor oscilando entre 2,0 y 2,7 y a continuación se diafiltra dicha disolución al mismo pH.
Más preferiblemente, en la etapa a), el pH de la disolución acuosa se ajusta a un valor que oscila entre 2,3 y 2,7 y a continuación se diafiltra la disolución al mismo pH.
En la etapa a), el pH se ajusta preferiblemente mediante una disolución acuosa de HCl.
En una primera forma de realización preferida del procedimiento de la presente invención, en la que la etapa b) de desechar las células se realiza a continuación de la etapa a) de diafiltración, el pH de la disolución acuosa de ácido hialurónico o caldo obtenido de una fuente de origen biológico primero se ajusta a un valor oscilando en el rango de 1,7 a 3,3, preferiblemente de 2,5 a 2,6, preferiblemente con una disolución acuosa de HCl.
A tal pH, la disolución acuosa de ácido hialurónico o caldo se transforma en un solución acuosa o caldo muy viscoelástica conteniendo ácido hialurónico de un elevado peso molecular en una disposición de entramado.
A continuación se diafiltra la solución acuosa o caldo obtenida conteniendo ácido hialurónico de elevado peso molecular, preferiblemente según un procedimiento de diafiltración de flujo cruzado, a la vez que se mantiene el mismo pH durante toda la etapa de diafiltración.
En la etapa a) del procedimiento de purificación según dicha forma de realización preferida, un filtro particularmente preferido tiene un tamaño de poro de 0,2 \mum.
En dicha etapa a) de diafiltración, la disolución acuosa viscoelástica o caldo conteniendo ácido hialurónico de elevado peso molecular es bombeada en un soporte para filtro de flujo cruzado equipado con un número adecuado de cartuchos de filtro con un tamaño de poro que oscila desde un límite de exclusión de peso molecular nominal de 100.000 Daltons hasta un tamaño de poro de 0,45 \mum, preferiblemente un tamaño de poro de 0,2 \mum y se añade agua destilada libre de pirógenos al tanque conteniendo la disolución acuosa viscoelástica conteniendo ácido hialurónico de elevado peso molecular, a la misma velocidad de flujo que el filtrado saliente, para mantener un volumen constante.
En la etapa a) del procedimiento de purificación según dicha primera forma de realización preferida, la disolución acuosas viscoelástica o caldo conteniendo ácido hialurónico de elevado peso molecular se diafiltra preferiblemente hasta que el filtrado que se descarta tiene una densidad óptica (OD) a una longitud de onda de 280 nm igual o inferior a 0,02. En tal caso, la densidad óptica del filtrado a dicha longitud de onda debe ser controlada durante todo el procedimiento de diafiltración.
Según dicha primera forma de realización preferida, la etapa a) de diafiltración está seguida de una etapa b) de eliminación de las células, preferiblemente una etapa b) de centrifugación para eliminar cualquier célula o proteína todavía presentes en la disolución o caldo diafiltrados.
En el caso de una fuente de origen microbiano, la etapa de centrifugación puede comprender, por ejemplo, ajustar el pH del caldo diafiltrado a un pH oscilando entre 3,5 y 5,0, preferiblemente 4,0 y a continuación centrifugar el caldo acuoso diafiltrado, obteniéndose por consiguiente un sobrenadante conteniendo el ácido hialurónico de elevado peso molecular.
Preferiblemente el pH del caldo diafiltrado se ajusta mediante una disolución acuosa de NaOH. Sin embargo, se pueden utilizar otras disoluciones acuosas básicas.
Según dicha primera forma de realización preferida, la etapa b) de eliminar las células está seguid por una etapa de esterilización c).
Según una segunda forma de realización preferida del procedimiento de la presente invención, la etapa b) de eliminar las células se realiza antes de la etapa de diafiltración a).
En dicha segunda forma de realización preferida, la etapa b) de eliminar las células es preferiblemente una etapa de diafiltración de flujo cruzado para eliminar las células.
En dicha etapa b) de diafiltración para eliminar las células, el pH de la disolución acuosa de ácido hialurónico o caldo obtenido de una fuente de origen biológico primero se ajusta a 3,5, preferiblemente con una disolución acuosa de HCl y a continuación la solución o caldo así obtenidos son diafiltrados al mismo pH utilizando un filtro con un tamaño de poro de 0,2 \mum.
En dicha etapa b) de diafiltración para eliminar las células, la disolución acuosa o caldo conteniendo el ácido hialurónico de elevado peso molecular es bombeada en un soporte para filtro de flujo cruzado equipado con un número adecuado de cartuchos de filtro con tañamos de poro de 0,2 \mum y se añade agua destilada libre de pirógenos al tanque que contiene la solución acuosa o caldo que contiene el ácido hialurónico de elevado peso molecular a la misma velocidad de flujo que la del filtrado saliente, para mantener un volumen constante.
A dicho pH, el filtro con un tamaño de poro de 0,2 \mum permite la retención de las células y el paso del ácido hialurónico a través del filtro.
En la etapa b) del procedimiento de purificación según dicha segunda forma de realización preferida, la disolución acuosa conteniendo el ácido hialurónico de elevado peso molecular preferiblemente se diafiltra hasta que se hayan añadido 10 volúmenes de agua destilada libre de pirógenos.
En la etapa a) de dicha segunda forma de realización preferida, el pH de la disolución acuosa de ácido hialurónico libre de células obtenida en la etapa b) primero se ajusta a un pH de 1,7 a 3,3, preferiblemente a 2,4, preferiblemente con una disolución acuosa de HCl.
A tal pH, la disolución acuosa de ácido hialurónico se transforma en una solución acuosa muy viscoelástica conteniendo el ácido hialurónico de elevado peso molecular en forma de entramado.
La disolución acuosa conteniendo el ácido hialurónico de elevado peso molecular así obtenida se diafiltra a continuación, preferentemente según un procedimiento de flujo cruzado, a la vez que se mantiene el mismo pH de la disolución durante todo la etapa de diafiltrado.
En la etapa a) del procedimiento de purificación de la presente invención según dicha segunda forma de realización preferida, un filtro particularmente preferido tiene un limite de exclusión de peso molecular nominal de 300.000 Daltons.
En dicha etapa a) de diafiltración, la disolución acuosa viscoelástica conteniendo ácido hialurónico de elevado peso molecular preferiblemente se bombea en un soporte de filtro equipado con un número adecuado de cartuchos de filtro con un tamaño de poro oscilando entre un límite de exclusión de peso molecular nominal de 100.000 Daltons y 0,45 \mum, preferiblemente un límite de exclusión de peso molecular nominal de 300.000 Daltons y se concentra y a continuación se añade agua destilada libre de pirógenos en el tanque que contiene la solución acuosa viscoelástica concentrada conteniendo ácido hialurónico de elevado peso molecular, a la misma velocidad de flujo que la del filtrado saliente, para mantener el volumen constante.
En la etapa a) del procedimiento de purificación de la presente invención según dicha segunda forma de realización preferida, la solución acuosa viscoelástica conteniendo el ácido hialurónico de elevado peso molecular preferentemente se diafiltra hasta que se han añadido 15 volúmenes de agua destilada libre de pirógenos. Se desecha el filtrado.
Por la aplicación de dicho segunda forma de realización preferida, se evita ventajosamente una centrifugación.
Según dicha segunda forma de realización preferida, la etapa a) de diafiltración está seguida por una etapa c) de esterilización.
La etapa de esterilización según la presente invención es preferiblemente una etapa de filtrado esterilizante.
En la presente invención, la filtración esterilizante se puede realizar según un procedimiento estándar de esterilización por filtración.
Según dicha primera forma de realización preferida, la etapa de esterilización por filtración se realiza ajustando el pH del sobrenadante obtenido en la etapa b) de la centrifugación a un valor de 7,0 y a continuación filtrando el sobrenadante a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,2 \mum.
Según dicha segunda forma de realización preferida, la etapa de esterilización por filtración se realiza ajustando el pH de la disolución diafiltrada conteniendo ácido hialurónico obtenido en la etapa a) a un valor de 7,0 y a continuación filtrando la disolución a través de u filtro con un tamaño de poro de 0,2 \mum.
En estas dos formas de realización preferidas, el pH preferiblemente se ajusta mediante una disolución acuosa de NaOH. Sin embargo, se pueden utilizar otras soluciones acuosas básicas.
A continuación, la disolución estéril se puede concentrar utilizando un filtro con un límite de exclusión de peso molecular nominal de 5.000 a 10.000 Daltons.
Una vez concentrada, finalmente la disolución esterilizada se puede liofilizar para obtener un polvo seco de ácido hialurónico sal del mismo.
El ácido hialurónico o sal del mismo obtenidos por el procedimiento de purificación según la presente invención es de grado farmacológico y el rendimiento es de aproximadamente 70 a 90 % en peso en relación con el ácido hialurónico contenido en la disolución cruda.
El ácido hialurónico o sal del mismo obtenidos por el procedimiento de la presente invención es notable por la ausencia de pirogenicidad y actividad inflamatoria.
El ácido hialurónico o la sal del mismo obtenido por el procedimiento de purificación de la presente invención contiene entre 90% y 95% en peso de ácido hialurónico consistente en ácido D-glucurónico y N-acetil-D-glucosamina en la proporción de 1:1, aproximadamente 3% a 5% en peso de agua, menos de 0,2% en peso de proteína y menos de un 0,3% en peso de ácidos nucleicos y menos de un 0,3% en peso de azúcares neutros.
El procedimiento según la presente invención es muy simple y ventajoso desde el punto de vista económico y ecológico ya que no se implica ninguna otras sustancias que HCl o NaOH. Cuando se utiliza el procedimiento de purificación de la presente invención, el ácido hialurónico o sus sales no contienen trazas de disolventes orgánicos.
Los siguientes ejemplos del procedimiento para obtener ácido hialurónico de elevado peso molecular o sus sales de grado farmacéutico según el procedimiento de la presente invención se proporcionan con propósito informativo solamente y no se pretende que limiten el ámbito de la presente invención.
Ejemplos Preparación de un caldo acuoso conteniendo ácido hialurónico de elevado peso molecular a partir de fuentes microbianas
Se cultivaron células de Streptococcus equi a una temperatura de 37ºC en un medio de cultivo adecuado compuesto de:
Glucosa 60 g
Soytone 15 g
Extracto de levadura 5 g
Fosfato potásico monobásico 2,5 g
Sulfato magnésico heptahidrato 1,2 g
Agua purificada libre de pirógenos 1 l
Se esterilizaron diez litros de medio y se inocularon con un cultivo de 1-2% Streptococcus equi teniendo una densidad óptica (OD) de aproximadamente 7 medida a la longitud de onda de 650 nm.
Durante la fermentación, el pH del caldo fue mantenido automáticamente a 7,4 añadiendo 5 N NaOH. La aireación se mantuvo a 1 volumen de aire por volumen de medio por minuto y la agitación se mantuvo a 250 rpm durante todo el período de fermentación.
Transcurridas 20 horas, el caldo se cosechó y se transfirió a un depósito adecuado con una capacidad de 50 l.
Procedimiento de purificación según una primera forma de realización preferida de la presente invención
Bajo continua agitación, se ajustó el pH del caldo preparado tal como se indico anteriormente a 2,5 con 6N HCl, obteniéndose de tal forma un caldo de elevada viscosidad con la apariencia de un glóbulo espeso.
A continuación se bombeó el caldo acuoso en un soporte para filtro de diálisis de flujo cruzado, equipado con tres cartuchos de filtro de 0,2 \mum dispuestos uno sobre le otro. El filtro utilizado fue un casete SARTOCON, Mod. nº 302 186 07 06 W-SG fabricado por SARTORIUS con un tamaño de poro de 0,2 \mum.
Al principio de la alimentación del caldo acuoso al filtro, la válvula del filtrado se mantuvo cerrada para recircular el caldo acuoso durante varios minutos, hasta que el sistema se hubo estabilizado y no aparecieron burbujas en el retenido.
A continuación se abrió la válvula del filtrado y se añadió continuamente agua destilada libre de pirógenos al depósito conteniendo el caldo acuoso, a la misma velocidad de flujo que la del filtrado saliente, para mantener constante el volumen del caldo acuoso. La presión de entrada se mantuvo entre 1 y 3 bars, preferiblemente a 2 bars.
Se detuvo la diafiltración cuando la absorbancia del filtrado a una longitud de onda de 280 nm fue 0,012 OD. Se desechó el filtrado.
El pH del caldo diafiltrado se ajustó a 4 con 5 N HaOH y a continuación se centrifugó el caldo a 9.000 rpm y 15ºC en una centrífuga refrigerada.
A continuación se ajustó el pH del sobrenadante a pH 7,0 con 5N NaOH y se filtró la disolución a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,2 \mum, para esterilizar la disolución, según un procedimiento estándar para esterilización por filtrado.
A continuación se liofilizó la disolución estéril según un procedimiento de liofilizado estándar para obtener un polvo seco de hialuronato sódico.
En el presente ejemplo, el rendimiento en ácido hialurónico fue de aproximadamente 85 a 87% con respecto al contenido en ácido hialurónico en la disolución cruda y el producto tuvo las siguientes características:
\newpage
- Contenido en hialuronato sódico: 96,5%
-
Viscosidad intrínseca (25ºC) = 2100 ml/g (correspondiente a un peso molecular de 1,7 x 10^{6} Daltons)
- Contenido en agua: 3,1%
- Contenido en proteína: 0,08%
- Contenido en ácidos nucleicos: 0,01%
- Contenido en azúcar neutro: 0,01%
Por consiguiente el hialuronato sódico de elevado peso molecular obtenido puede ser utilizado para preparar composiciones farmacéuticas.
Procedimiento de purificación según una segunda forma de realización preferida de la presente invención
Bajo agitación continua, se ajustó el pH de 5 litros del caldo acuoso conteniendo ácido hialurónico de elevado peso molecular de origen microbiano preparado según se describió anteriormente, a pH 3,5 con 6N HCl y se mantuvo a dicho nivel durante toda la etapa de diafiltración de flujo cruzado para eliminar las células.
A continuación se bombeó el caldo acuoso (5 litros) en un soporte para filtro de flujo cruzado, equipado con tres cartuchos de filtro de 0,2 \mum dispuestos uno sobre otro. El filtro utilizado fue un casete SARTOCON, Mod. nº 302 186 07 04 O-SG fabricado por SARTORIUS, con un tamaño de poro de 0,2 \mum.
Al principio de la alimentación del caldo acuoso al filtro, la válvula del filtrado se mantuvo cerrada para recircular el caldo acuoso durante varios minutos, hasta que el sistema se hubo estabilizado y no se produjeron burbujas en el retenido.
La válvula del filtrado se abrió a continuación y se añadió continuamente al depósito que contiene el caldo acuoso un equivalente de 10 volúmenes de agua destilada libre de pirógenos, a la misma velocidad de flujo que el del filtrado saliente, para mantener constante el volumen del caldo acuoso. La presión de entrada osciló entre 1 y 3 bars, preferiblemente a 2 bars.
Se descartó el retenido y el filtrado (50 litros) conteniendo el ácido hialurónico de elevado peso molecular libre de células fue tratado todavía más.
A continuación se ajustó el pH de la disolución diafiltrada (50 litros) conteniendo el ácido hialurónico así obtenido a 2,4, obteniéndose de esta forma una disolución muy viscosa y se mantuvo a dicho nivel durante todo el procedimiento de diafiltración por flujo cruzado.
El caldo acuoso (50 litros) fue a continuación bombeado en un soporte de filtro de flujo cruzado, equipado con tres cartuchos de filtro de 300.000 Daltons dispuestos uno sobre el otro. El filtro utilizado fue un casete SARTOCON, Mod. nº 302 146 790 07 7E-SG fabricado por SARTORIUS con un tamaño de poro de 300.000 Daltons.
Al principio de la alimentación del caldo acuoso al filtro, la válvula de filtrado se mantuvo cerrada para recircular el caldo acuoso durante varios minutos, hasta que el sistema se estabilizó y no se hubo burbujas en el retenido.
A continuación se abrió la válvula del filtrado y se concentró el caldo acuoso para reducir el volumen a 7,5 litros. Se desecho el filtrado (42,5 litros).
A continuación, se añadieron continuamente al depósito que contiene el caldo acuoso 15 volúmenes equivalentes de agua destilada libre de pirógenos, a la misma velocidad de flujo que la del filtrado saliente, para mantener constante el volumen del caldo acuoso. La presión de entrada osciló entre 1 y 3 bars, preferiblemente 2 bars. Se descartó el filtrado (116 litros)
A continuación se detuvo la alimentación de agua y se concentró el caldo acuoso.
El pH de la disolución diafiltrada concentrada (4 litros) se ajustó a continuación a pH 7,0 con 5 N NaOH y se filtró la disolución a través de un filtro estático con un tamaño de poro de 0,2 \mum, para esterilizar la disolución, según un procedimiento estándar de esterilización por filtrado.
A continuación la disolución estéril fue liofilizada según un procedimiento de liofilización estándar para obtener un polvo seco de hialuronato sódico.
En el presente ejemplo, el rendimiento en ácido hialurónico fue de aproximadamente 83 a 85% con respecto al contenido en ácido hialurónico en la disolución cruda y el producto tuvo las siguientes características:
\newpage
- Contenido en hialuronato sódico: 97,0%
-
Viscosidad intrínseca (25ºC) = 2100 ml/g (correspondiendo a un peso molecular de 1,7x 10^{6} Daltons).
- Contenido en agua: 2,9%
- Contenido en proteína: 0,08%
- Contenido en ácidos nucleicos: 0,01%
- Contenido en azúcar neutro: 0,01%
El hialuronato sódico de elevado peso molecular obtenido de esta forma se puede utilizar para preparar composiciones farmacéuticas.

Claims (28)

1. Procedimiento para purificar ácido hialurónico de elevado peso molecular con un peso molecular no inferior a 0,5 x 10^{6} Daltons de una fuente biológica para obtener ácido hialurónico de elevado peso molecular de grado farmacéutico o una sal del mismo, caracterizado porque comprende:
a)
una etapa de ajustar el pH de una solución acuosa conteniendo ácido hialurónico de elevado peso molecular de origen biológico a un pH que oscila entre 1,7 y 3,3 y a continuación diafiltrar la disolución al mismo pH utilizando un filtro con un tamaño de poro que oscila entre un límite de exclusión de peso molecular nominal 100.000 Daltons a 0,45 \mum;
b)
una etapa de eliminar las células de la disolución acuosa que contiene el ácido hialurónico de elevado peso molecular de origen biológico, dicha etapa siendo realizada antes de la etapa a) o a continuación de la etapa a); y
c)
una etapa de esterilización.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la solución acuosa conteniendo ácido hialurónico de elevado peso molecular de origen biológico que es tratada en primer lugar, según la etapa a) o según la etapa b), es un caldo acuoso conteniendo ácido hialurónico de elevado peso molecular de origen microbiano.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque la fuente de origen microbiano es una especie de Streptococcus productora de ácido hialurónico de elevado peso molecular.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque la especie de Estreptocuccus productora de ácido hialurónico de elevado peso molecular está seleccionada de entre el grupo consistente en Streptococcus zooepidermicus, Streptococcus equi y Streptococcus pyogenes.
5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque en la etapa a), el pH de la disolución acuosa conteniendo ácido hialurónico de elevado peso molecular se ajusta a un valor que oscila entre 2,0 y 2,7 y a continuación se diafiltra la disolución al mismo pH.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque en la etapa a), el pH de la disolución acuosa conteniendo ácido hialurónico de elevado peso molecular se ajusta a un valor que oscila entre 2,3 y 2,7 y a continuación se diafiltra la disolución al mismo pH.
7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque en al etapa a), el pH de la disolución acuosa conteniendo ácido hialurónico de elevado peso molecular se ajusta mediante una disolución acuosa de HCl.
8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la etapa de esterilización c) es una etapa de esterilización por filtración.
9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la etapa c) de esterilización está seguida por una etapa d) de liofilización de la disolución esterilizada para obtener un polvo seco de ácido hialurónico o una sal del mismo.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque la disolución esterilizada es concentrada antes de la etapa de liofilización.
11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la etapa b) de eliminación de las células se realiza a continuación de la etapa de diafiltración a).
12. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque en la etapa a), el pH de la disolución acuosa conteniendo ácido hialurónico de elevado peso molecular se ajusta a 2,5 - 2,6 y a continuación la disolución se diafiltra al mismo pH.
13. Procedimiento según las reivindicaciones 11 ó 12, caracterizado porque el filtro utilizado para la diafiltración de la etapa a) tiene un tamaño de poro de 0,2 \mum.
14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque en la etapa a), se diafiltra la disolución de ácido hialurónico hasta que el filtrado para descartar tiene una densidad óptica (OD) a una longitud de onda de 280 nm igual a o inferior a 0,02.
15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, caracterizado porque la etapa b) de eliminar las células es una etapa de centrifugación.
16. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado porque la etapa de centrifugación comprende ajustar el pH de la disolución acuosa diafiltrada obtenida en la etapa a) a un pH que oscila entre 3,5 y 5,0 y centrifugar la disolución acuosa diafiltrada para obtener un sobrenadante conteniendo ácido hialurónico.
17. Procedimiento según la reivindicación 16, caracterizado porque el pH de la solución acuosa diafiltrada obtenida en la etapa a) se ajusta a pH 4,0.
18. Procedimiento según la reivindicación 17, caracterizado porque el pH se ajusta mediante una disolución acuosa de NaOH.
19. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, caracterizado porque la etapa de esterilización c) es una etapa de esterilización por filtración que comprende ajustar el pH del sobrenadante obtenido en la etapa b) de centrifugación a un valor de 7 y filtrar el sobrenadante a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,2 \mum.
20. Procedimiento según la reivindicación 19, caracterizado porque el pH se ajusta mediante una disolución acuosa de NaOH.
21. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la etapa b) de eliminar las células se realiza antes de la etapa a).
22. Procedimiento según la reivindicación 21, caracterizado porque la etapa b) de eliminar las células es una etapa de diafiltración para eliminar las células.
23. Procedimiento según la reivindicación 22, caracterizado porque la etapa de diafiltración b) para eliminar las células comprende ajustar el pH de una disolución acuosa conteniendo ácido hialurónico de elevado peso molecular de origen biológico a un pH de 3,5 y a continuación diafiltrar la disolución al mismo pH utilizando un filtro con un tamaño poro de 0,2 \mum.
24. Procedimiento según la reivindicación 23, caracterizado porque el pH se ajusta mediante una disolución acuosa de HCl.
25. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, caracterizado porque el filtro utilizado para la etapa de diafiltración a) tiene un tamaño de poro con límite de exclusión de peso molecular nominal de 300.000 Daltons.
26. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25, caracterizado porque en la etapa a), el pH de la disolución acuosa conteniendo el ácido hialurónico de elevado peso molecular se ajusta a 2,4 y a continuación se diafiltra la disolución al mismo pH.
27. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 26, caracterizado porque la etapa c) de esterilización es una etapa de esterilización por filtración que comprende ajustar el pH de la disolución acuosa obtenida en al etapa a) de diafiltración a un valor de 7 y filtrar la disolución acuosa a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,2 \mum.
28. Procedimiento según la reivindicación 27, caracterizado porque el pH se ajusta mediante una disolución acuosa de NaOH.
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