ES2201062T3 - Secuencias de adn implicadas en la biosintesis de sorafeno por parte de mixobacterias. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE ESENCIALMENTE A UN FRAGMENTO DEL DNA QUE PUEDE OBTENERSE DEL GRUPO DE GENES QUE RESPONDE A LA BIOSINTESIS DEL SURAFENO, DENTRO DEL GENOMA DE S. CELLULOSUM, Y COMPRENDE AL MENOS UN GEN O UNA PARTE DE GEN QUE CODIFICA PARA UN POLIPEPTIDO QUE ESTA IMPLICADO DIRECTA O INDIRECTAMENTE EN LA BIOSINTESIS DEL SURAFENO, Y A METODOS PARA LA PREPARACION DEL CITADO FRAGMENTO DEL DNA. LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE ADEMAS A MOLECULAS DEL DNA RECOMBINANTES, QUE COMPRENDEN UNO DE LOS FRAGMENTOS DEL DNA DE CONFORMIDAD CON LA INVENCION, Y A PLASMIDOS Y VECTORES DERIVADOS DE LOS MISMOS. ASIMISMO COMPRENDEN ORGANISMOS HUESPEDES QUE SE TRANSFORMAN CON EL CITADO DNA PLASMIDOS Y DNA VECTOR.

Description

Secuencias de ADN implicadas en la biosíntesis de sorafeno por parte de mixobacterias.

La presente invención está relacionada con el área de la tecnología de ADN recombinante y en particular a su aplicación a mixobacterias, aunque preferentemente a mixobacterias del grupo Sorangium/Polyangium, para la localización, identificación y clonación de genes individuales e incluso de agrupaciones genéticas enteras dentro del genoma bacteriano.

Las mixobacterias del grupo Sorangium/Polyangium son organismos altamente especializados los cuales son frecuentemente detectables en muestras de suelo, material vegetal muerto o en excremento de animales. Una característica de este grupo de microorganismos es, entre otras cosas, su capacidad de utilizar celulosa o productos de degradación que contienen celulosa como única fuente de C. Otro rasgo característico de este grupo es su capacidad de producir metabolitos secundarios altamente activos.

Hasta la fecha, se han descrito numerosas cepas de este grupo de organismos las cuales son capaces, por ejemplo, de sintetizar compuestos microbicidas de plantas. De particular importancia con relación a esto son los denominados sorafenos, cuyos pormenores estructurales son descritos en detalle, por ejemplo, en la Patente Europea 0 358 606. Los sorafenos son compuestos macrocíclicos los cuales tienen una actividad citostática y un espectro biocida favorable contra microorganismos patógenos, aunque especialmente contra hongos fitopatógenos. Estos compuestos tienen propiedades curativas, sistémicas y, en particular, preventivas muy ventajosas y, por ende, son sumamente adecuados para utilizar para el tratamiento terapéutico de mamíferos y para proteger numerosas plantas de cultivo.

También es sabido que otros representantes del grupo de mixobacterias son capaces de sintetizar compuestos altamente activos con potencia antibiótica y citostática [Reichenbach y otros (1988)]. Debido al potencial farmacéutico de estos compuestos y a su importancia, debido a esto, para la protección de las plantas, existe un gran interés en la comprensión de las bases genéticas de su síntesis a fin de proporcionar, de ese modo, la posibilidad de ser capaces de influir en las mismas específicamente cuando fuese apropiado.

Esto es deseable, en particular, debido a que las cepas productoras naturales, como también en el caso de la biosíntesis del sorafeno, a menudo proveen los metabolitos secundarios interesantes solamente en concentraciones inadecuadas las cuales están lejos de ser suficientes para satisfacer la demanda de sustancia para ensayos de actividad de rango más amplio, ni hablar de la producción comercial.

Adicionalmente, estas cepas, en muchos casos, probaron ser problemáticas y difíciles de manipular y, por lo tanto, inadecuadas para utilizar a escala industrial, por ejemplo, en un proceso de fermentación.

Por consiguiente, sería extremadamente conveniente descifrar las bases genéticas de la producción de metabolitos secundarios en representantes interesantes individuales de las mixobacterias, ya que esto abre una gran cantidad de posibilidades para intervenir directa o indirectamente en el proceso sintético. Por consiguiente, por ejemplo, sería concebible intentar aumentar la productividad de las cepas productoras mediante mutaciones o inserciones específicas de otras copias genéticas. Otra alternativa concebible se refiere a una posible transferencia del cluster genético completo el cual es responsable de la biosíntesis de metabolitos secundaria, o sino sus partes seleccionadas, en una cepa de organismo que es optimizada para propósitos de producción y la cual puede ser luego empleada para la producción de metabolitos a escala industrial.

Sin embargo, la precondición para esto es la provisión de un método el cual hace posible que estos organismos sean sometidos a manipulación genética directa y preferentemente específica utilizando técnicas de ADN recombinante, por ejemplo mediante la incorporación específica de nuevos genes o fragmentos de genes u otras secuencias de ADN, incluyendo plásmidos enteros, en el genoma de las mixobacterias.

Los representantes individuales del grupo de mixobacterias ya han sido objeto de investigaciones en esta dirección. Se ha dirigido un interés particular relacionado con esto principalmente a Myxococcus xanthus, una mixobacteria la cual, hasta la fecha, ha sido investigada bastante bien y para la cual ya se han descrito diversos métodos de transferencia de genes. Por consiguiente, por ejemplo, se utilizó inicialmente el fago de coli P1 muy intensamente para las investigaciones relacionadas con la inserción del transposón Tn5 en el cromosoma de Myxococcus xanthus [Kaiser (1984); Kuner y Kaiser (1981)] y luego, posteriormente, también para la transferencia de genes clonados en Myxococcus xanthus nuevamente en el huésped de E. coli original [O'Conner y Zusman (1983): Shimkets y otros (1983)].

Otro método para la transferencia de genes se basa en el uso del plásmido RP4 el cual tiene un muy amplio rango de huésped. Breton y otros (1985) fueron capaces de mostrar que este plásmido puede ser transferido mediante conjugación de E. coli a Myxococcus xanthus y allí sufre la integración estable en el cromosoma. En base a estas propiedades, Breton y otros (1986) y Breton y Guespin-Michel (1987) fueron capaces de integrar genes extraños en el cromosoma de Myxococcus xanthus. Según surgió de las investigaciones realizadas por Jaoua y otros (1987; 1989), la integración observada se basa muy probablemente en una denominada recombinación específica del sitio. Esta última se encuentra confinada, por ende, a sitios particulares, los cuales tienen una estrecha limitación espacial, dentro del cromosoma de Myxococcus xanthus debido a que es mediada por uno o más denominados puntos calientes en el plásmido RP4. Un sistema de transformación de este tipo es, debido a las limitaciones estructurales, muy limitado en su flexibilidad y, por consiguiente, es inadecuado para utilizar dentro del alcance de la presente invención.

Por añadidura, ha surgido en el transcurso de las investigaciones llevadas a cabo dentro del alcance de esta invención que el sistema de Myxococcus previamente conocido descrito aquí no es aplicable a las bacterias del grupo de Sorangium/Polyangium. Se presume que estos organismos carecen de los elementos estructurales específicos los cuales son necesarios para la recombinación específica del sitio en sus cromosomas. Adicionalmente, se ha descubierto que no se produce transposición estable alguna, por ejemplo, con el uso del transposón Tn5, con estos organismos tampoco.

El documento EP-A No. 92810128,6 pendiente y Jaoua y otros (1992) describen, por primera vez, un sistema de transformación el cual hace posible la manipulación genética directa y específica de representantes del grupo de mixobacterias, aunque especialmente de mixobacterias del grupo de Sorangium/Polyangium, utilizando técnicas de ADN recombinante y así provee las precondiciones para la identificación y aislamiento, descritas dentro del alcance de esta invención, de fragmentos de ADN los cuales comprenden por lo menos un gen o partes de un gen los cuales están involucrados directa o indirectamente en la biosíntesis de metabolitos secundarios, aunque especialmente en la biosíntesis de sorafenos.

El objeto que ha de lograrse dentro del alcance de esta invención se refiere así principalmente a la provisión de un fragmento de ADN el cual comprende una región de ADN la cual está involucrada directa o indirectamente en la síntesis de metabolitos secundarios en mixobacterias y, en este caso, preferentemente, en mixobacterias del grupo de Sorangium/Polyangium, aunque especialmente en la síntesis de sorafeno, y que comprende al menos uno de los genes involucrados o partes de los mismos, aunque preferentemente la totalidad de las secuencias de ADN responsables por la síntesis de metabolitos secundarios.

Desde hace mucho tiempo se ha sabido de investigaciones previas, por ejemplo en actinomicetos, que los genes que están involucrados directa o indirectamente en los pasos individuales de la biosíntesis de metabolitos secundarios son, en la mayoría de los casos conocidos hasta la fecha, organizados en la forma de agrupaciones de genes en el cromosoma bacteriano. Por el contrario, la complicación de genes unidos a plásmidos ha sido detectable hasta la fecha solamente en unos pocos casos.

Se han propuesto una cantidad de procedimientos, hasta la fecha, para aislar genes cuyos productos genéticos están implicados directa o indirectamente en la biosíntesis de antibióticos. Estos incluyen, por ejemplo, los métodos llamados de complementación, en cuyo transcurso, se intenta restaurar, con la ayuda de fragmentos obtenidos de ADN del tipo salvaje, la capacidad sintética de mutantes defectuosos los cuales, debido a una mutación específica, ya no son capaces de sintetizar al antibiótico requerido [véase, por ejemplo, Malpartida y Hopwood, 1984].

Un método alternativo para descubrir genes los cuales estén involucrados en la biosíntesis de los antibióticos de poliquétidos se describe en el documento WO 87/03907. Esto acarrea la utilización de un fragmento de ADN el cual comprende por lo menos una parte de un gen el cual está involucrado en la biosíntesis de un antibiótico de poliquétidos conocido como sonda de hibridación de ADN para seleccionar un banco genómico el cual ha sido preparado previamente a partir del ADN genómico del microorganismo interesante.

Si bien las técnicas principales para la identificación y el aislamiento de ese tipo de agrupaciones de genes son por ende conocidas, su aplicabilidad a un nuevo grupo de organismos que ha sido muy poco investigado hasta la fecha es, como regla general, problemática debido a las imponderabilidades involucradas. Este es particularmente el caso cuando, como en el presente caso, no hay información alguna disponible acerca de la organización estructural del genoma y, por lo tanto, en la búsqueda del cluster genético responsable de la biosíntesis de metabolitos secundarios, primero es necesario encontrar un punto de partida adecuado para el análisis del genoma necesario. Este es probablemente el motivo por el cual la información relativamente modesta acerca de la estructuración genética de la síntesis de metabolitos secundarios se concentra, hasta hoy, en unos pocos grupos de organismos bien investigados, mientras que casi nada se sabe de otros, tales como, por ejemplo, las mixobacterias.

Ahora es posible, por primera vez, dentro del alcance de la presente invención, utilizar el método descrito en el documento EP-A No. 92810128,6 y Jaoua y otros (1992), ubicar dentro de un genoma mixobacteriano una región de ADN la cual está involucrada directa o indirectamente en la biosíntesis de metabolitos secundarios y la cual se utiliza como punto de partida para la identificación y el aislamiento del cluster de genes que rodea esta región y posteriormente para aislar y clonar esta última. La región es, con respecto a esto, en particular una que se puede obtener del cluster de genes, que es responsable de la biosíntesis de sorafeno, dentro del genoma de S. cellulosum y la cual está involucrada en forma demostrable en la biosíntesis de sorafeno.

Por consiguiente, la presente invención se refiere, principalmente, a un fragmento de ADN el cual comprende una región de ADN la cual es preferentemente obtenible del cluster de genes, el cual es responsable de la biosíntesis de sorafeno, dentro del genoma de S. cellulosum y la cual está involucrada en forma directa o indirecta en la biosíntesis de sorafeno, incluyendo las regiones de ADN adyacentes en la derecha y en la izquierda, las cuales, debido a su función en relación con la biosíntesis de sorafeno, son reveladas como constituyentes del "cluster de genes de sorafeno" y las cuales se pueden identificar con la ayuda del fragmento de ADN previamente aislado.

Dentro del alcance de la presente invención, se prefiere un fragmento de ADN el cual comprende una región de ADN la cual se puede obtener a partir de "el cluster de genes de sorafeno" de S. cellulosum con la asistencia del método descrito en lo que sigue.

Un fragmento de ADN particularmente preferido comprende una región de ADN de 1,8 Kb la cual se puede obtener mediante el método de acuerdo con la invención a partir del genoma de Sorangium cellulosum y la cual comprende la parte de la secuencia nucleotídica ilustrada en SEC ID NO: 1, así como todas las otras secuencias de ADN las cuales se encuentran en la proximidad de esta secuencia y las cuales, debido a homologías que están presentes, pueden ser consideradas como equivalentes estructurales o funcionales y, por lo tanto, son capaces de hibridarse con esta secuencia.

Un fragmento de ADN el cual es asimismo particularmente preferido es aquel que comprende una región de ADN de 6,5 Kb la cual se puede obtener mediante el método de acuerdo con la invención a partir del genoma de Sorangium cellulosum y tiene el patrón de restricción ilustrado en la Fig. 1 y adicionalmente también incluye la región de 1,8 Kb caracterizada en detalle anteriormente.

Se prefiere, muy especialmente, un fragmento de ADN el cual comprende exclusivamente ADN genómico.

Igualmente, la presente invención abarca los fragmentos de ADN los cuales comprenden porciones de secuencias las cuales tienen homologías con la parte de la secuencia nucleotídica, ilustrada en SEC ID NO: 1, de la región de 1,8 Kb la cual se puede obtener mediante el método de acuerdo con la invención a partir del genoma de Sorangium cellulosum, el cual, por consiguiente, puede encontrarse mediante el uso de esta región o de sus partes como sonda de hibridación dentro de un banco genómico.

Asimismo, los fragmentos de ADN preferidos son aquellos que comprenden porciones de secuencias las cuales tienen homologías con el fragmento BamHI de 4,6 Kb de la región gral del cluster de genes de granaticina [ORF
1-4] de Streptomyces violaceoruber TU22 y las cuales, por ende, pueden encontrarse mediante la utilización de este fragmento de 4,6 Kb o de partes de este fragmento como sonda de hibridación dentro de un banco genómico de un organismo productor de sorafeno.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un fragmento de ADN el cual comprende una porción de un cluster de genes el cual es responsable de la biosíntesis de sorafeno, tal como, por ejemplo, de uno de los genes que está involucrado directa o indirectamente en la biosíntesis, o sus partes, como sonda para encontrar regiones de ADN superpuestas adyacentes las cuales, luego, a su vez, pueden ser nuevamente utilizadas como sondas para encontrar regiones adyacentes, lo cual finalmente conduce a la completa identificación del cluster de genes que flanquea la región de inicio o de partida y es responsable de la biosíntesis de sorafeno.

La presente invención se refiere además a las regiones de ADN las cuales se pueden obtener de la manera descrita previamente y las cuales, si es necesario, pueden ser ligadas entre si para dar un fragmento único el cual luego comprende todos aquellos genes y otras secuencias de ADN que flanquean dentro del genoma de Sorangium, la región inicial primeramente identificada en la forma de un cluster de genes y que en su totalidad son responsables de la biosíntesis de sorafeno.

Una molécula sonda preferida es un fragmento de ADN el cual comprende una región de ADN de 1,8 Kb que se puede obtener mediante el proceso de acuerdo con la invención del genoma de Sorangium cellulosum y el cual comprende la parte de la secuencia nucleotídica ilustrada en SEC ID NO: 1, aunque sus partes especialmente seleccionadas. Las secciones de secuencias particularmente preferidas son aquellas las cuales se pueden obtener de las regiones flanqueantes ubicadas a la derecha y a la izquierda, respectivamente, de dicha región de 1,8 Kb.

Igualmente preferido para utilizar como molécula sonda es un fragmento de 6,5 Kb el cual comprende una región de ADN de 6,5 Kb la cual se puede obtener mediante el proceso de acuerdo con la invención a partir del genoma de Sorangium cellulosum y el cual tiene el patrón de restricción ilustrado en la Fig. 1 y adicionalmente incluye la región de 1,8 Kb caracterizada detalladamente en lo que antecede, aunque especialmente sus partes seleccionadas. Las secciones de secuencias particularmente preferidas son aquellas las cuales se pueden obtener de las regiones flanqueantes ubicadas a la derecha y a la izquierda, respectivamente, de dicha región de 1,8 Kb.

La presente invención se refiere adicionalmente a moléculas de ADN recombinante las cuales comprenden uno de los fragmentos de ADN de acuerdo con la invención, y a los plásmidos y vectores derivados de los mismos. Igualmente se encuentran abarcados los organismos huéspedes los cuales son transformados con dicho ADN plásmido o ADN vector, incluyendo huéspedes de plantas.

La invención se refiere además a un método para la identificación, aislamiento y clonación de un fragmento de ADN el cual comprende una región de ADN la cual puede obtenerse, preferentemente, del cluster de genes, el cual es responsable de la biosíntesis de sorafeno, dentro del genoma de S. cellulosum y comprende por lo menos un gen o una parte de un gen u otra secuencia de ADN la cual está involucrada directa o indirectamente en la biosíntesis de sorafeno, y dicho método comprende, esencialmente, las siguientes medidas:

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(a) construcción de una genoteca de genes representativos de un organismo productor de sorafeno del grupo de mixobacterias, que comprende esencialmente la totalidad del genoma bacteriano distribuido en clones únicos;

(b) rastreo de dichos clones utilizando una sonda de ADN específica la cual se hibrida al menos con una parte del cluster de genes responsable de la biosíntesis de sorafeno;

(c) selección de aquellos clones los cuales exhiben una señal de hibridación con la sonda de ADN; y

(d) aislamiento de un fragmento de ADN de dicho clon, el cual comprende una región de ADN la cual comprende al menos un gen o parte de un gen u otra secuencia de ADN el cual está involucrado directa o indirectamente en la biosíntesis de sorafeno.

La presente invención se refiere además a un método para la identificación y aislamiento de todas aquellas secuencias de ADN las cuales están involucradas en la construcción del "cluster de genes de sorafeno" que flanquean la región inicial o de partida, que comprende

(a) construir una genoteca de genes representativos de un organismo productor de sorafeno del grupo de mixobacterias, que comprende esencialmente la totalidad del genoma bacteriano distribuido en clones únicos;

(b) hibridar dichos clones utilizando uno de los fragmentos de ADN previamente aislados o sus partes seleccionadas como molécula sonda, que se superponen al menos con una parte de las regiones de ADN adyacentes ubicadas a la derecha y a la izquierda, respectivamente, dentro del "cluster de genes de sorafeno";

(c) seleccionar aquellos clones los cuales exhiben una fuerte señal de hibridación con la sonda de ADN;

(d) aislar aquellos fragmentos los cuales comprenden regiones de ADN superpuestas de los clones seleccionados de acuerdo con (c), y aislar el fragmento que sobresale pasando la región de superposición;

(e) ensayar los fragmentos de ADN aislados de acuerdo con (d) para determinar su capacidad de funcionar dentro del "cluster de genes de sorafeno";

(f) es posible detectar una función del fragmento de ADN aislado de acuerdo con (d) dentro del alcance de la biosíntesis de sorafeno, repetir el método de acuerdo con los pasos (a) a (e), donde el fragmento de ADN aislado de acuerdo con (d), o sus partes seleccionadas, aunque especialmente aquellas de la región flanqueante a la izquierda o a la derecha de dicho fragmento, funciona como sonda de ADN, hasta que una función en la biosíntesis de sorafeno ya no es detectable dentro del alcance del ensayo de función sobre el fragmento de ADN recientemente aislado particular, y por lo tanto, se alcanza el final del cluster de genes; y

(g) llevar a cabo el método de acuerdo con los pasos (a) a (f) cuando resulte apropiado en la otra dirección la cual no ha sido previamente seleccionada.

A fin de facilitar la interpretación y la comprensión de lo que se pretende considerar como abarcado de acuerdo con la aplicación dentro del alcance de la presente invención, algunos de los términos esenciales para establecer el alcance de protección son definidos detalladamente en lo que sigue, es decir, se proporciona una explicación detallada del significado que pretenden tener dentro del alcance de esta invención:

Fragmento de ADN: Un trozo de ADN el cual puede comprender tanto secciones codificadoras como no codificadoras y las cuales pueden obtenerse directamente de una fuente natural o pueden prepararse con la ayuda de técnicas recombinantes o sintéticas o una combinación de dichas técnicas.

Secuencia de ADN codificadora: Una secuencia de ADN la cual está formada por constituyentes nucleotídicos individuales de conformidad con las reglas del código genético y la cual comprende información estructural y la cual, después de haberse llevado a cabo la transcripción y traducción, da como resultado la producción de un polipéptido correspondiente.

Gen: Una región definida la cual está ubicada dentro de un genoma y la cual, además de la secuencia de ADN codificadora antes mencionada, comprende otras secuencias de ADN, primariamente reguladoras las cuales son responsables del control de la expresión, es decir, la transcripción y traducción de la porción codificadora.

Esencialmente homóloga: Este término se refiere, principalmente, a secuencias de ADN y aminoácidos las cuales, debido a las homologías presentes, deben ser consideradas como equivalentes estructurales y/o funcionales. Las diferencias estructurales y/o funcionales entre las secuencias relevantes, las cuales como regla general deberían ser mínimas, pueden tener causas muy distintas. Por consiguiente, por ejemplo, pueden comprender mutaciones que se producen naturalmente o que son inducidas en forma artificial, o sino las diferencias a ser observadas en comparación con la secuencia inicial se basan en una modificación específica la cual puede introducirse, por ejemplo, dentro del alcance de una síntesis química.

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Las diferencias funcionales pueden ser consideradas como mínimas cuando, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, o una secuencia proteica, tiene esencialmente las mismas propiedades características que la secuencia inicial, dentro del área de actividad enzimática, de reactividad inmunológica o, en el caso de una secuencia de nucleótidos, de regulación genética.

Las diferencias estructurales pueden ser consideradas como mínimas en tanto que exista una superposición significativa o similitud entre las diferentes secuencias, o estas últimas tengan al menos propiedades físicas similares. Estas últimas incluyen, por ejemplo, la movilidad electroforética, similitudes cromatográficas, coeficientes de sedimentación, propiedades espectrofotométricas, etc. En el caso de las secuencias de nucleótidos, la concordancia debería ser de por lo menos un 60%, aunque preferentemente es del 75% y, muy en especial preferentemente es del 90% y más. En el caso de la secuencia de aminoácidos, los valores correspondientes son de por lo menos un 70%, aunque preferentemente es del 80% y, en especial preferentemente, 90%. Una concordancia del 99% es muy especialmente preferida.

Gen(es) o ADN de origen heterólogo: Una secuencia de ADN la cual codifica un producto o productos específicos o cumple con una función biológica y la cual se origina a partir de una especie diferente a aquella dentro de la cual se inserta dicho gen; dicha secuencia de ADN es denominada también gen extraño o ADN extraño o ADN exógeno.

Gen(es) o ADN de origen homólogo: Una secuencia de ADN la cual codifica un producto o productos específicos o cumple con una función biológica y la cual se origina a partir de la misma especie dentro de la cual se inserta dicho gen. Este ADN es también denominado ADN exógeno.

Homología del ADN: Grado de concordancia entre dos secuencias de ADN o más de dos.

Gen(es) sintético(s) o ADN: Una secuencia de ADN la cual codifica un producto o productos específicos o cumple con una función biológica y la cual se prepara mediante una ruta sintética.

Promotor: Una secuencia control de expresión de ADN la cual asegura la transcripción de cualquier secuencia genética de ADN homóloga o heteróloga deseada en una célula huésped siempre que dicha secuencia genética este ligada en forma operable a un promotor de este tipo y este último sea activo en dicha célula huésped.

Secuencia de terminación: La secuencia de ADN al final de una unidad de transcripción la cual señala el final del proceso de transcripción.

Promotor sobreproductor (OPP, Overproducing promoter): El promotor que es capaz en una célula huésped de ocasionar la expresión de cualquier secuencia genética funcional ligada en forma operable hasta un grado (medido en la forma del ARN o de la cantidad de polipéptido) el cual es distintivamente superior al observado naturalmente en células huéspedes no transformadas con dicho OPP.

Región 3'/5' no traducida: Secciones de ADN las cuales están situadas corriente abajo/corriente arriba de la región codificadora y las cuales, si bien son transcriptas en ARNm, no son traducidas en un polipéptido. Esta región comprende secuencias reguladoras tales como, por ejemplo, el sitio de unión de ribosomas (5').

Vector de expresión de ADN: Vehículo de clonación, tal como, por ejemplo, un plásmido o un bacteriófago, el cual comprende todas las secuencias de señal las cuales son necesarias para la expresión de un ADN insertado en una célula huésped adecuada.

Vector de transferencia de ADN: Vehículo de transferencia, tal como, por ejemplo, un plásmido o un bacteriófago vector, el cual posibilita la inserción de material genético en una célula huésped adecuada.

Recombinación homóloga: Intercambio recíproco de fragmentos de ADN entre moléculas de ADN homólogas.

Mutantes, variantes: Derivado, producido en forma espontánea o en forma artificial utilizando medidas de proceso conocidas, tales como por ejemplo, tratamiento de UV, tratamiento con agentes mutágenos etc., de un microorganismo, el cual aun tiene las características y propiedades, esenciales para la invención, de la cepa inicial que ha recibido debido a la transformación con ADN exógeno.

Para aislar los fragmentos de ADN de acuerdo con la invención, los bancos de genes inicialmente genómicos son establecidos a partir de las cepas del organismo interesantes que sintetizan un metabolito secundario requerido, aunque especialmente sorafeno.

El ADN genómico puede ser obtenido de diversas maneras a partir de un organismo huésped, por ejemplo, mediante extracción de la fracción nuclear y purificación del ADN extraído con la ayuda de métodos conocidos.

La fragmentación, la cual es necesaria para establecer un banco de genes representativo, del ADN genómico que debe ser clonado a un tamaño deseado para insertar en un vector de clonación puede producirse ya sea por esfuerzo cortante mecánico o sino preferentemente por corte con enzimas de restricción adecuadas. Con respecto a esto, se prefiere particularmente, dentro del alcance de esta invención, un clivado parcial del ADN genómico, la cual conduce a fragmentos de ADN mutuamente superpuestos.

Los vectores de clonación adecuados que ya han sido utilizados rutinariamente para producir genotecas de ADNc y/o genómicas comprenden, por ejemplo, vectores de fagos tales como los fagos \lambda carómido o vectores bacterianos tales como el plásmido pBR322 de E. coli. Otros vectores de clonación adecuados son conocidos por el experto en la materia.

Particularmente adecuados para establecer bancos genómicos son los denominados vectores cósmidos los cuales comprenden tanto porciones del ADN de plásmidos como los constituyentes, los cuales son esenciales para empaquetadura, del genoma de fagos lambda, los sitios denominados "cos". Los cósmidos adquieren, mediante la porción de plásmido, secuencias genéticas las cuales codifican uno o más marcadores los cuales son necesarios dentro del alcance de selección, como así también las regiones de ADN las cuales son esenciales para la replicación autónoma en un huésped bacteriano. Los cósmidos son, como regla general, moléculas muy pequeñas, lo cual les proporciona la capacidad de clonar fragmentos de ADN correspondientemente grandes. Esto las hace particularmente adecuadas para ser utilizadas dentro del alcance de la presente invención.

Igualmente adecuadas para establecer bancos genómicos son las variantes vectoriales derivadas de cósmidos, tales como, por ejemplo, los carómidos, los cuales comprenden una cantidad variable de "ADN completo" y, por ende, son capaces de compensar cualquier diferencia de tamaño con el ADN que se va a clonar.

Los clones adecuados los cuales comprenden los genes o fragmentos de genes requeridos pueden ser luego descubiertos a partir de las genotecas establecidas de este modo dentro del alcance de un programa de rastreo, por ejemplo con la ayuda de moléculas sondas adecuadas [sonda de ADN] y posteriormente aislados. Se encuentran disponibles diversos métodos para descubrir clones adecuados, tales como, por ejemplo, hibridación por colonias diferencial o hibridación en placas. Cuando se utilizan bancos de genes de expresión, es posible, adicionalmente, emplear métodos de detección inmunológica los cuales se basan en la identificación de los productos de traducción específicos.

Es posible utilizar como molécula sonda, por ejemplo, un fragmento de ADN el cual ya ha sido aislado previamente del mismo gen o sino de un gen estructuralmente relacionado el cual, debido a las homologías presentes, es capaz de hibridarse con la sección de secuencia correspondiente dentro del gen o del cluster de genes requerido que se va a identificar. Se prefiere para utilizar como molécula sonda, dentro del alcance de la presente invención, un fragmento de ADN el cual puede ser obtenido a partir de un gen o de otra secuencia de ADN la cual o el cual cumple una función en la síntesis de un antibiótico poliquétido conocido. Una molécula sonda particularmente preferida es un fragmento BamHI de 4,6 Kb de la región gral del cluster de genes de granaticina [ORF 1-4] de Streptomyces violaceoruber TU22 [Sherman D y otros 1989].

En lugar de la sonda de la región gral de Streptomyces violaceoruber TU22, que se utiliza para encontrar un punto de partida dentro del "cluster de genes de sorafeno" y el cual exhibe solamente una señal de hibridación débil relativa, ahora es posible también, naturalmente, utilizar partes de los fragmentos aislados dentro del alcance de la presente invención, tales como, por ejemplo, del fragmento SaII de 1,8 Kb, como moléculas sondas, las cuales, debido a las homologías presentes, también conduce a resultados inequívocos con otras cepas de Sorangium productoras de sorafeno.

Una vez que la secuencia de aminoácidos del gen que se va a aislar, o sino por lo menos partes de esta secuencia, son conocidas, es posible, en una realización alternativa, diseñar una secuencia de ADN correspondiente apropiada sobre la base de esta información de secuencia. Puesto que, como es sabido, el código genético es degenerado, es posible en la mayoría de los casos utilizar diferentes codones para uno y el mismo aminoácido. El resultado de esto es que, aparte de unos pocos casos excepcionales, como regla general, una secuencia de aminoácidos particular puede ser codificada mediante una serie entera de oligonucleótidos mutuamente similares. Sin embargo, debería señalarse con respecto a esto que solamente un miembro de esta serie de oligonucleótidos realmente concuerda con la secuencia correspondiente dentro del gen que es buscado. A fin de limitar la cantidad de oligonucleótidos posibles desde el principio, es posible, por ejemplo, recurrir a las reglas establecidas por Bibb M y otros (1984) para el uso de codones, las cuales toman en cuenta la frecuencia con la cual se utiliza un codon particular en células procarióticas con alto contenido de guanosina y citosina.

Por lo tanto, es posible, sobre la base de esta información, diseñar moléculas de oligonucleótidos las cuales se pueden utilizar como moléculas sondas para identificar y aislar clones adecuados, hibridando dichas moléculas sondas con ADN genómico en uno de los métodos previamente descritos.

A fin de facilitar la capacidad de detección del gen requerido o de las partes de un gen requerido, es posible etiquetar una de las moléculas sondas de ADN previamente descritas con un grupo adecuado, fácilmente detectable. Un grupo detectable tiene el propósito de significar, dentro del alcance de esta invención, todo material el cual tiene una propiedad física o química, fácilmente identificable, en particular.

Los materiales de este tipo ya son ampliamente utilizados, especialmente en el área de inmunoensayos, y en la mayoría de los casos, también se pueden utilizar en la presente aplicación. Pueden mencionarse en forma especial, en este punto, los grupos enzimáticamente activos tales como, por ejemplo, enzimas, sustratos enzimáticos, coenzimas e inhibidores enzimáticos, adicionalmente agentes fluorescentes y luminiscentes, cromóforos y radioisótopos tales como, por ejemplo, ^{3}H, ^{35}S, ^{32}P, ^{125}I y ^{14}C. La fácil capacidad de detección de estos marcadores se basa, por un lado, en sus propiedades físicas intrínsecamente presentes (por ejemplo, marcadores fluorescentes, cromóforos, radioisótopos) y, por el otro lado, en sus propiedades de reacción y de unión (por ejemplo enzimas, sustratos, coenzimas, inhibidores).

Los métodos generales relacionados con la hibridación de ADN son descritos, por ejemplo, por Maniatis T y otros (1982) y por Haymes BT y otros (1985).

Aquellos clones dentro de las genotecas previamente descritas los cuales son capaces de hibridarse con una molécula sonda y los cuales se pueden identificar con la ayuda de uno de los métodos de detección antes mencionados pueden ser luego adicionalmente analizados a fin de determinar el grado y naturaleza de la secuencia codificadora detalladamente.

Un método alternativo para identificar genes clonados se basa en la construcción de una genoteca la cual se construye a partir de vectores de expresión. Esto acarrea, en analogía a los métodos ya descritos previamente, ADN genómico el cual es capaz de expresar un producto genético requerido que es inicialmente aislado y posteriormente clonado en un vector de expresión adecuado. Las genotecas producidas de este modo pueden ser luego clasificadas con la ayuda de mediciones adecuadas tales como, por ejemplo, utilizando estudios de complementación, y pueden seleccionarse aquellos clones los cuales comprenden el gen requerido o por lo menos una parte de este gen como inserción.

Por consiguiente, es posible con la ayuda de los métodos previamente descritos, aislar un gen el cual codifica un producto genético en particular.

Para una caracterización adicional, las secuencias de ADN purificadas y aisladas de la manera previamente descrita son sometidas a un análisis de restricción y a un análisis de secuencias.

Los fragmentos aislados son caracterizados dentro del alcance del análisis de restricción sobre la base de sus sitios de clivado de restricción, siendo completamente digeridos con enzimas de restricción adecuadas tales como, por ejemplo, BgIII, SphI y SmaI. Dichas enzimas de restricción pueden emplearse, con relación a este tema, ya sea individualmente o en combinación entre si. El tamaño de los fragmentos resultantes puede determinarse después del fraccionamiento en un gel de agarosa mediante comparación con un estándar de tamaño.

Para el análisis de secuencia, los fragmentos de ADN previamente aislados son inicialmente desintegrados con la ayuda de enzimas de restricción adecuadas en fragmentos y posteriormente clonados en vectores de clonación adecuados tales como, por ejemplo, los vectores M13 mp18 y mp19. El secuenciado se lleva a cabo, como regla general, en la dirección 5' \rightarrow 3', preferentemente utilizando el método de terminación de cadena de didesoxinucleótidos de Sanger [Sanger y otros, 1977] o el método de Maxam y Gilbert [Maxam y Gilbert, 1980]. A fin de evitar errores en el secuenciado, resulta ventajoso secuenciar las dos hebras de ADN en paralelo. Los equipos portátiles de secuenciado estandarizados los cuales ayudan a reducir el esfuerzo experimental y cuyo uso es por ende preferido, dentro del alcance de esta invención, son ahora obtenibles. El análisis de la secuencia de nucleótidos y de la correspondiente secuencia de aminoácidos se lleva a cabo, preferentemente, con asistencia de computadoras utilizando un software de computación comercialmente obtenible adecuado [por ejemplo, software GCG de la Universidad de Wisconsin].

Se encuentran disponibles diversas alternativas para el análisis del fragmento de ADN clonado con respecto a su función dentro del alcance de la biosíntesis de sorafeno.

Por lo tanto, por ejemplo, existe la posibilidad dentro del alcance de experimentos de complementación con mutantes defectuosos no solo de establecer la complicación en principio de un gen o fragmento genético en la biosíntesis de metabolitos secundarios sino, adicionalmente, de verificar específicamente el paso sintético en el cual está involucrado el fragmento de ADN.

En una forma alternativa de análisis, la demostración se lleva a cabo en exactamente el sentido opuesto. La transferencia de plásmidos los cuales comprenden secciones de ADN que tienen homologías con secciones correspondientes en el genoma mixobacteriano da como resultado la integración de dichas secciones de ADN homólogas en el ADN cromosómico de las mixobacterias en el sitio de la homología mediante recombinación homóloga. Si la sección de ADN homóloga es, como en el presente caso, una región dentro de un cluster de genes intacto, la integración de plásmidos da como resultado la inactivación de este cluster mediante la denominada fractura genética y por consiguiente en una suspensión en la producción de metabolitos secundarios.

Las bases para llevar a cabo el método de detección descrito anteriormente son descritas en EP-A No. 92810128,6 y Jaoua y otros (1992). Fue posible mostrar allí por primera vez que es posible para el ADN extraño de origen homólogo o heterólogo o una combinación de material genético de origen homólogo y heterólogo ser insertado en la célula mixobacteriana y allí integrado, mediante recombinación homóloga, específicamente en un sitio, el cual es precisamente definido sobre la base de las homologías presentes, en el cromosoma de dichas mixobacterias siempre y cuando estas últimas tengan suficientes homologías con las secciones correspondientes dentro del genoma.

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De acuerdo con el presente estado del conocimiento, se presume que una región homóloga la cual comprende al menos 100 pb, aunque preferentemente más de 1000 pb, es suficiente para traer aparejado el evento de recombinación requerido.

Sin embargo, se prefiere una región homóloga la cual se extiende en un rango entre 0,3 y 4 Kb, aunque en particular en un rango entre 1 y 3 Kb.

Se produce preferentemente, para la preparación de plásmidos adecuados que tienen homología con el cromosoma mixobacteriano, lo que es suficiente para la integración por medio de recombinación homóloga, un paso de subclonación en el cual el ADN cósmido aislado anteriormente es digerido y se aíslan fragmentos de tamaño adecuado y seguidamente se los clona en un plásmido adecuado.

La ligadura de fragmentos de ADN homólogos y de fragmentos de ADN de origen homólogo y heterólogo en un vector de clonación adecuado tiene lugar con la ayuda de métodos standard como los descriptos, por ejemplo, por Maniatis y otros, 1982.

Por regla general, esto conlleva la integración del vector y el ADN inicialmente cortado con enzimas de restricción adecuadas. Entre los ejemplos de enzimas de restricción adecuadas se cuentan las que producen fragmentos con extremos romos, como por ejemplo SmaI, HpaI y EcoRV, o de lo contrario enzimas que forman extremos pegajosos, como por ejemplo EcoRI, SacI, BamHI, SaII, PvuI, etc.

Tanto los fragmentos con extremos romos y los que tienen extremos cohesivos que son complementarios entre sí pueden ser ligados nuevamente, con el auxilio de ADN ligasas adecuadas, a fin de producir una sola molécula de ADN continua.

Los extremos romos se pueden producir asimismo mediante el tratamiento de los fragmentos de ADN que tienen extremos pegajosos que sobresalen con el fragmento Klenow del ADN polimerasa de E. coli, llenando las brechas con los nucleótidos complementarios apropiados.

Por otro lado, también se pueden producir extremos pegajosos artificialmente, por ejemplo adhiriendo colas de homopolímeros complementarios a los extremos de una secuencia de ADN necesaria y de la molécula vector cortada utilizando una desoxinucleotidil-transferasa terminal o, de lo contrario, adhiriendo secuencias oligonucleótidos sintéticos (ligantes) que tienen un sitio de escisión de restricción y seguidamente cortando con la enzima apropiada.

En principio, es posible utilizar, para la preparación y replicación de las construcciones antes descriptas, todos los vectores de clonación convencionales, como por ejemplo vectores plásmidos o vectores bacteriófagos, siempre que tengan secuencias de replicación y control que tengan origen en especies que sean compatibles con la célula huésped.

Por regla general, el vector de clonación tiene un origen de replicación; además de los genes específicos que dan lugar a características de selección fenotípica en la célula huésped transformada, en especial a las resistencias a los antibióticos. Los vectores transformados pueden ser seleccionados sobre la base de estos marcadores fenotípicos después de la transformación en una célula huésped.

Los marcadores fenotípicos seleccionables que se pueden utilizar dentro del alcance de la presente invención comprenden, por ejemplo, sin que esto represente una limitación al tema central de la invención, resistencias a la ampicilina, tetraciclina, cloranfenicol, higromicina, G418, kanamicina, neomicina y bleomicina. Por ejemplo, una prototrofía por determinados aminoácidos puede funcionar también, por ejemplo, como marcador seleccionable.

Son especialmente preferidos dentro del alcance de la presente invención los plásmidos de E. coli tales como, por ejemplo, el plásmido pSUP2021 utilizado dentro del alcance de la presente invención.

Son especialmente adecuados como células huésped para la clonación antes descripta dentro del alcance de la presente invención las procariotas, incluyendo los huéspedes bacterianos tales como, por ejemplo, A. tumefaciens, E. coli, S.typhimurium y Serratia marcescens, además de las pseudomonas, actinomycetes, salmonellas y mixobacterias en sí.

Los huéspedes de E. coli son especialmente preferidos, como por ejemplo la cepa HB101 de E. coli.

Más aun, se producen células competentes de la cepa HB101 de E. coli con la ayuda de los métodos utilizados habitualmente para la transformación de E. coli [ver: "Técnicas Generales de ADN recombinante"].

Las colonias obtenidas como resultado de la transformación y la posterior incubación en un medio adecuado son sometidas a rastreo diferencial cultivándolas en un medio selectivo. Seguidamente, es posible entonces aislar el ADN plásmido apropiado de las colonias que comprenden plásmidos con fragmentos de ADN clonados en los mismos.

De esta manera se obtienen plásmidos recombinantes de diversos tamaños. Luego es posible, después del análisis de restricción, la selección de plásmidos de tamaño adecuado para la posterior inserción del ADN plásmido en la célula mixobacteriana. Esta transferencia de ADN puede tener lugar además directamente o, de lo contrario, utilizando un huésped intermediario (célula donadora) dentro del alcance de una transferencia conjugatoria.

La transferencia conjugatoria de una célula donadora al receptor mixobacteriano es la preferida dentro del alcance de la presente invención.

Más aun, el ADN a transferir dentro del alcance de esta transferencia conjugatoria puede ser clonado inicialmente, de acuerdo con lo descripto anteriormente, en uno de los vectores de clonación utilizados habitualmente y seguidamente transformado en un huésped intermediario adecuado que funciona como célula donadora. Sin embargo, es posible evitar la ruta perimetral por medio del huésped intermediario utilizando una cepa huésped que se adecuada tanto para la clonación de ADN como para usar como célula donadora dentro del alcance de la conjugación.

Los huéspedes intermediarios que se pueden utilizar como células donadoras dentro del alcance de la presente invención son esencialmente células procarióticas seleccionadas entre el grupo que consiste en E. coli, pseudomonas, actinomycetes, salmonelas y las mixobacterias mismas.

La condición previa para la transferencia conjugatoria de ADN plásmido de una célula donadora a un receptor es la presencia de las funciones de transferencia (tra) y movilización (mob). En ese aspecto, la función de movilización debe comprender por lo menos el origen de la transferencia (oriT) y estar situada en el plásmido a transferir. Por el contrario, la función de transferencia (tra) puede estar situada en el plásmido, o bien en un plásmido asistente o, de lo contrario, estar presente integrada en el cromosoma de la célula donadora.

Los plásmidos que cumplen la condición previa antes mencionada y, por lo tanto, son preferidos dentro del alcance de la presente invención, pertenecen esencialmente a los grupos de incompatibilidad P, Q, T, N, W y Coll. El prototipo de los plásmidos del grupo P es el plásmido RP4. Es especialmente preferido dentro del alcance de la presente invención el plásmido pSUP2021 que comprende un fragmento de 1,9 kb del plásmido RP4 que tiene, como constituyente de la función mob (RP4mob), el origen de transferencia (oriT). También se pueden usar otros plásmidos con la función mob (RP4mob) tales como, por ejemplo, pSUP101, pSUP301, pSUP401 pSUP201, pSUP202, pSUP203 o pSUP205 y los derivados de los mismos [Simon y otros (1988)], dentro del alcance del método de acuerdo con la presente invención.

Ha demostrado ser ventajoso exponer al receptor mixobacteriano durante el curso de la transferencia conjugatoria a un breve tratamiento térmico antes de la incubación con la cepa donadora. Las células receptoras son preincubadas preferentemente a una temperatura de 35ºC a 60ºC, preferentemente a una temperatura de 42ºC a 55ºC y muy especialmente, preferentemente a una temperatura de 48ºC a 52ºC durante uno a 120 minutos, pero especialmente durante 5 a 20 minutos.

En una realización preferida de la presente invención se utiliza una cepa donadora de E. coli que comprende los genes de transferencia (tra) del plásmido RP4 en el ADN cromosómico. La cepa donadora de E. coli W3101(pME305) que comprende el plásmido pME305 que posee la función de transferencia (tra) de RP4 es la especialmente dentro del alcance de la presente invención.

Son de especial interés para las técnicas metodológicas y, por lo tanto muy especialmente preferidas dentro del alcance de la presente invención, las cepas bacterianas que son adecuadas tanto como huéspedes para la clonación de vectores con secuencias de ADN integradas y para usar como células donadoras dentro del alcance de la transferencia conjugatoria. También son especialmente preferidas las cepas bacterianas que son negativas para la restricción y, por consiguiente no degradan el ADN extraño insertado. Ambos criterios mencionados se cumplen de manera ideal en la cepa ED8767(pUZ8) de E. coli a la que, sin embargo, se menciona en este punto sólo como representante de otras cepas bacterianas adecuadas y no con intención de limitar la solicitud de manera alguna.

Aparte de la transferencia génica conjugatoria antes descripta de una célula donadora a un receptor mixobacteriano, también es posible, naturalmente, utilizar otros métodos de transferencia génica para insertar material genético en mixobacterias. Se puede mencionar aquí fundamentalmente la transferencia génica por medio de electroporación, dentro de cuyo alcance se expone a las células mixobacterianas brevemente a altas potencias de campo eléctrico [Kuspa y Kaiser (1989)]. Las condiciones generales esbozadas para la electroporación de las células procarióticas han sido descriptas en forma detallada en US-P 4.910.140.

También se puede utilizar el fragmento de ADN de acuerdo con la presente invención, que comprende una región de ADN que está implicada directa o indirectamente en la biosíntesis del sorafeno y que puede ser obtenida de la manera antes descripta del cluster de genes de la biosíntesis de sorafeno como clon de partida para la identificación y aislamiento de otras regiones de ADN que son adyacentes y se traslapan con éstas últimas de dicho cluster de genes.

Esto se puede realizar, por ejemplo, llevando a cabo lo que se denomina "walking" de cromosomas, utilizando el fragmento de ADN antes aislado o, de lo contrario, en especial sus secuencias flanqueantes situadas 5' y 3', dentro de una biblioteca compuesta por fragmentos de ADN con regiones de ADN que se traslapan entre sí. El procedimiento dentro del alcance del "walking" de cromosomas es conocido por las personas capacitadas en esta técnica. Se pueden obtener detalles, por ejemplo, de las publicaciones de Smith CL y otros (1987) y Wahl GL y otros (1987).

La condición previa para el walking de cromosomas es la presencia de clones con fragmentos de ADN coherentes y que se traslapan mutuamente de máxima longitud dentro de una biblioteca genética y de un clon de partida adecuado que comprende un fragmento ubicado en la vecindad, o bien preferentemente dentro de la región a analizar. Si no se conoce la ubicación exacta del clon de partida. el walking se lleva a cabo preferentemente también en ambas direcciones.

El paso de walking en sí se inicia utilizando el clon inicial, una vez que ha sido identificado y aislado, como sonda en una de las reacciones de hibridación antes descriptas a fin de detectar clones adyacentes que tengan regiones con se traslapen con el clon inicial. Más aun, es posible, por el análisis de hibridación, identificar el fragmento que se proyecta a más distancia más allá de la región de traslape. Se utiliza luego este fragmento como clon de partida para el segundo paso de walking, y en este caso se identifica el fragmento que se traslapa con dicho segundo clon en la misma dirección. De esta manera, por el avance continuo a lo largo del cromosoma, se obtiene una colección de clones de ADN traslapados que cubren un gran rango de ADN. Seguidamente, en caso de ser apropiado, después de llevar a cabo uno o varios pasos de subclonación, estos pueden ser ligados entre haciendo uso de métodos conocidos para dar un fragmento que comprenda parte o, preferentemente, todos los constituyentes esenciales para la síntesis del sorafeno.

En lugar del fragmento completo de gran tamaño y de difícil manejo, es preferible utilizar, para la reacción de hibridación con el fin de identificar clones con regiones flanqueantes traslapadas, un fragmento de la región flanqueante izquierda o derecha y que puede ser obtenido mediante un paso de subclonación. En virtud del menor tamaño de dicho fragmento parcial, la reacción de hibridación da lugar a menos señales de hibridación positivas por lo que el esfuerzo analítico es claramente menor que cuando se utiliza el fragmento completo. También es aconsejable caracterizar en detalle el fragmento parcial a fin de excluir la presencia de porciones de relativamente gran tamaño de secuencias repetitivas, que pueden estar diseminadas en todo el genoma y, por consiguiente, constituirían un gran impedimento para una secuencia de pasos de walking pretendida.

Dado que el cluster de genes responsable de la biosíntesis del sorafeno cubre una región muy grande del genoma, es ventajoso, dentro del alcance de la presente invención, llevar a cabo el denominado walking de pasos grandes o walking de cósmidos. En estos casos, es posible, recurriendo a vectores cósmidos que permiten la clonación de fragmentos de ADN de gran tamaño, cubrir una región de ADN de gran tamaño, que puede comprender hasta 45 kb, con un solo paso de walking.

En una realización específica de la presente invención, para construir un banco génico de S. cellulosum se aísla y seguidamente se digiere con la ayuda de endonucleasas de restricción adecuadas el ADN completo en un tamaño en el orden de 100 Kb.

En este aspecto es preferible una digestión parcial repetida 3 veces con Sau3A, en la que las digestiones individuales se llevan a cabo independientemente una de otra, a fin de alcanzar así un nivel de restricción con máximas diferencias.

Seguidamente, el ADN digerido es extraído de la manera habitual a fin de separar la endonucleasa que aún está presente y es precipitado y, por último, concentrado. Luego el concentrado de fragmentos obtenido es fraccionado, por ejemplo por medio de una centrifugación en gradiente de densidades, de acuerdo con el tamaño de los fragmentos individuales. Las fracciones que se obtienen de esta manera pueden ser analizadas, después de la diálisis, en un gel de agarosa. Las fracciones que comprenden fragmentos de tamaño adecuado son agrupadas y concentradas para su posterior procesamiento. Se consideran particularmente adecuados dentro del alcance de la presente invención los fragmentos con un tamaño en el orden de 30 kb a 45 kb, aunque preferentemente de 40 kb a 45 kb.

Simultáneamente con la fragmentación antes descripta, o más tarde, se digiere completamente un vector cósmido adecuado tal como, por ejemplo, pHC79 [Hohn y Collins, 1980] con una enzima de restricción tal como, por ejemplo, BamHI para la reacción posterior con ligasa.

Se puede llevar a cabo la ligadura del ADN cósmido con los fragmentos de S. cellulosum que han sido fraccionados de acuerdo con su tamaño utilizando una ADN ligasa T_{4}. La mezcla de ligadura que se obtiene de esta manera es empacada, después de un tiempo de incubación suficiente, en fagos \lambda, utilizando, por razones de economía del método, preferentemente uno de los kits de empaque comerciales que se pueden obtener actualmente de diversos proveedores tales como, por ejemplo como por ejemplo STRATAGEN O PR\OmegaMEGA.

Las partículas de fagos así obtenidas son utilizadas luego para infectar una cepa huésped adecuada. Es preferible una cepa de E. coli como, por ejemplo, E. coli HB101. La selección de clones transfectados y el aislamiento del plásmido ADN se puede llevar a cabo por medio de métodos generalmente conocidos.

El rastreo del banco génico para detectar los fragmentos de ADN que cumplen una función en la biosíntesis del sorafeno se lleva a cabo con la ayuda de una sonda de hibridación específica que, según se presume, comprende regiones de ADN que tienen suficiente homología con las regiones correspondientes dentro del "cluster de genes del sorafeno".

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El material de partida que se puede utilizar para la preparación de dicha sonda de hibridación es el plásmido pIJ5200 [Sherman y otros, 1989] que comprende un fragmento BamHI de 4,6 kb de la región gral [cluster de genes de la granaticina ORF 1-4] de Streptomyces violaceoruber Tü22 clonado en el sitio de escisión con BamHI de pUC18.

A fin de eliminar las secuencias de ADN interferentes que se originan de los vectores plasmídicos y que pueden tener efectos adversos sobre el análisis del banco de genes de las 4,6 kb, dicho fragmento es clonado preferentemente en un vector de Streptomyces y este último es transformado en una cepa de Streptomyces competente.

Después de la selección y el análisis de restricción, se seleccionan los clones adecuados que comprenden el fragmento de 4,6 kb clonado en el plásmido ADN y se los cultiva para el aislamiento del plásmido. Se aísla el plásmido ADN con la ayuda de métodos conocidos tales como, por ejemplo, el método del gradiente de CsCl, y se separa el fragmento de 4,6 kb tras la digestión completa del plásmido ADN con BamHI.

El fragmento de 4,6 kb aislado de esta manera es marcado radiactivamente llevando a cabo la traslación de la mella utilizando d-CTP^{32}. En este caso es aconsejable, también, por razones de economía del método, utilizar un kit de traslación de la mella como el comercializado, por ejemplo, por Bethesda Research Laboratories Life Technologies Inc.

Actualmente también es posible, naturalmente, utilizar como molécula sonda, en lugar de la sonda que se utilizaba para encontrar un punto de partida dentro del "cluster de genes del sorafeno" y que se obtenía de la región gral de Streptomyces violaceoruber Tü22, y que revela sólo una señal de hibridación relativamente débil, partes de los fragmentos aislados dentro del alcance de la presente invención, como por ejemplo un fragmento SaII de 1,8 kb, que lleva, en virtud de las homologías presentes, a resultados inequívocos con otras cepas de Sorangium también productoras de sorafeno.

El rastreo del banco de genes con la ayuda de la sonda radiactivamente marcada tiene lugar preferentemente en el marco de un análisis de hibridación. Este último se puede llevar a cabo, por ejemplo, en la forma de hibridación de colonias descripta, por ejemplo, por Maniatis y otros [página 326-328; (1982)].

Los clones que exhiben las señales de hibridación más potentes son seleccionados e incubados en un medio adecuado [por ejemplo, medio LB] y luego utilizados para aislar el plásmido ADN [de acuerdo con lo descripto por Maniatis y otros (1982); páginas 368 y 369].

A continuación se digieren los plásmidos aislados con una enzima de restricción adecuada tal como, por ejemplo, SaII, y los fragmentos obtenidos de esta manera son fraccionados en un gel de agarosa. Los fragmentos así producidos son sometidos luego a una hibridación Southern que se puede llevar a cabo dentro del marco de una transferencia de capilaridad Southern. Se selecciona un clon cósmido [p98/1] que exhibe una fuerte banda a 1,8 kb en la audiorradiografía para el trabajo subsiguiente. Este clon cósmido es cultivado en primer lugar en un medio adecuado para la amplificación del ADN plásmido. Una vez aislado el ADN plásmido, éste es digerido por completo con una enzima de restricción adecuada [por ejemplo SaII] y los fragmentos que se obtienen de esta manera son fraccionados por electroforesis en un gel de agarosa. Luego se puede separar del gel de agarosa el fragmento de ADN de 1,8 kb requerido, por electroelución.

El fragmento de 1,8 Kb que se obtiene de esta manera es clonado seguidamente en un plásmido bacteriano en una reacción de la ligasa. El plásmido pBR322 de E. coli es el preferido dentro del marco de la presente invención.

El ADN ligado así obtenido es posteriormente clonado en células a las que se ha tornado competentes, de una cepa recA^{-} de E. coli, aunque preferentemente en células de la cepa HB101 de E. coli (Maniatis y otros, 1982; páginas 250 y 251) y transferido a un medio selectivo.

Se pueden encontrar colonias adecuadas mediante el rastreo diferencial de las colonias transformadas así obtenidas, y se puede aislar su plásmido ADN [de acuerdo con lo descripto por Maniatis y otros, páginas 368 y 369]. Seguidamente, el plásmido ADN aislado es cortado con una enzima de restricción como por ejemplo SaII y analizado por electroforesis en geles de agarosa para determinar el tamaño de sus fragmentos insertados, preferentemente empleando como modelo comparativo el cósmido antes seleccionado [p98/1].

A continuación se puede aislar del gel un plásmido [p108/III2] que comprende un fragmento adicional del tamaño requerido de la manera antes descripta. Luego se puede confirmar la identidad de este fragmento adicional al fragmento de 1,8 kb del cósmido antes seleccionado [p98/1] por transferencia Southern e hibridación con la sonda de ADN de 4,6 kb de S. violaceoruber.

El análisis de funciones del fragmento de ADN de 1,8 kb antes aislado se puede llevar a cabo dentro del alcance de un experimento de ruptura de genes.

Esto conlleva en primer lugar la digestión completa del ADN cósmido [p98/1] con la ayuda de una enzima de restricción adecuada y el fraccionamiento de los fragmentos así obtenidos; por ejemplo, cuando se utiliza PvuI, se pueden obtener fragmentos de un tamaño de aproximadamente 10, 6,5, 4,2 y 4 kb. Seguidamente se pueden clonar los fragmentos del tamaño necesario en un vector adecuado que comprende las funciones requeridas para la transferencia conjugatoria. El preferido es el plásmido pSUP2021 que comprende un fragmento del plásmido RP4, que tiene una función mob (RP4mob) y como constituyente de su función mob, un origen de transferencia (oriT). Es tras la transformación de las células huésped que han sido tornadas competentes -que son preferentemente células de la cepa HB101 de E. coli- que es posible identificar y seleccionar de manera muy sencilla los clones positivos, es decir los clones cuyo plásmido ADN comprende fragmentos del tamaño requerido.

Los plásmidos obtenidos de este modo pueden ser utilizados luego para la transferencia conjugatoria en S. cellulosum. La cepa donadora que puede ser utilizada para ello preferentemente es la cepa de E. coli que comprende los genes de transferencia (tra) del plásmido RP4 incorporado al ADN cromosómico. Es preferida dentro del alcance de la presente invención la cepa donadora de E. coli W3101 (pME305) que comprende el plásmido "helper" (del inglés: auxiliar) pME305 que posee la función de transferencia (tra) de RP4.

Son de especial interés para las técnicas metodológicas y, por lo tanto, muy especialmente preferidas dentro del alcance de la presente invención, las cepas bacterianas que son adecuadas tanto como huéspedes par la clonación de vectores con secuencias integradas de ADN como para usar como células donadoras dentro del marco de la transferencia conjugatoria. Del mismo modo, son especialmente preferidas las cepas bacterianas que son negativas a la restricción y, por consiguiente, no degradan el ADN extraño insertado. Ambos criterios precedentemente mencionados se cumplen de manera ideal mediante la cepa de E. coli ED8767(pUZ8) cuyo uso es, por lo tanto, especialmente preferido dentro del alcance de la presente invención.

Cuando se utiliza el plásmido helper pUZ8, que no tiene el gen de resistencia a la ampicilina, es posible prescindir del paso de clonación en el huésped intermediario HB101 de E. coli puesto que ahora es posible la clonación en la cepa donadora ED8767 de E. coli que está destinada a la transferencia conjugatoria.

El plásmido pUZ8 es un derivado del plásmido RP4 que abarca una amplia gama de huéspedes y ha si descripta por Datta y otros (1971). Las modificaciones, comparadas con el plásmido inicial RP4 se relacionan esencialmente con el gen de resistencia a la ampicilina y con la inserción del elemento IS21, ambos suprimidos, y con la incorporación de un gen adicional que confiere resistencia a los iones de mercurio [ver Jaoua y otros (1987)].

Por lo tanto, ahora el plásmido ADN puede ser directamente transformado en la cepa de E. coli ED8767. Para ello, se preparan células competentes de la cepa de E. coli ED8767 con el auxilio de los métodos utilizados habitualmente para la transformación de E. coli [ver: "Técnicas Generales de ADN recombinante"].

Las colonias producidas tras la transformación y la posterior incubación en un medio selectivo adecuado son sometidas a un rastreo diferencial mediante cultivo en medio con contenido de ampicilina [60 \mug/ml] y sin ampicilina. A continuación es posible aislar las colonias que han perdido su resistencia a la ampicilina debido a la integración de los fragmentos de ADN de Sorangium. Los cultivos que se obtienen de esta manera pueden ser empleados posteriormente directamente como células donadoras para la transferencia conjugatoria de los plásmidos recombinantes en células de Sorangium cellulosum.

Para la transferencia en sí, se mezclan células de Sorangium cellulosum en fase estacionaria con un cultivo en fase logarítmica tardía de células donadoras de E. coli que comprenden una proporción comparable de células.

En este caso, resulta ventajoso exponer a las células receptoras de Sorangium a un breve tratamiento térmico en un baño de agua antes de la conjugación con E. coli. Se pueden obtener los mejores resultados con la cepa SJ3 de Sorangium cellulosum con un tratamiento térmico a una temperatura de 50ºC por espacio de 10 minutos. Se pueden obtener frecuencias de transferencia de 1-5 x 10^{-5} en estas condiciones, lo que corresponde a un aumento en un factor de 10 en comparación con un método que no comprende el mencionado tratamiento térmico.

Tras la realización de diversos pasos de selección, es posible obtener transconjugantes de Sorangium cellulosum que comprenden el plásmido ADN requerido. La frecuencia de transformación para la transferencia del plásmido ADN a Sorangium es, en promedio, de 1-3 x 10^{-6} sobre la base de la cepa receptora.

La transferencia de plásmidos que comprenden secciones de ADN que son homólogas de las secciones correspondientes dentro del genoma de Sorangium cellulosum lleva a la integración de dichas secciones de ADN en el ADN cromosómico de Sorangium cellulosum en el sitio de homología por medio de la recombinación homóloga. Si la región homóloga es una sección dentro de un cluster de genes, por ejemplo el necesario para la biosíntesis del sorafeno, la integración del plásmido da lugar a la desactivación de este cluster por la denominada ruptura de genes. Este método permite entonces el análisis de la función de un fragmento de ADN clonado en Sorangium cellulosum.

Para examinar la función de los fragmentos PvuI del cósmido p98/1, se transfieren colonias transconjugantes bien cultivadas y se las cultiva en un medio selectivo que contiene kanamicina, fleomicina y estreptomicina como agentes selectivos.

Se sigue uno o más pasos intermedios de cultivo mediante la transferencia a un medio que contiene un adsorbente tal como, por ejemplo, una resina absorbente polimérica que fija el sorafeno liberado por las bacterias.

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Tras una incubación de varios días, se retira el adsorbente y se extrae el sorafeno adherente, por ejemplo mediante agitación con un solvente adecuado tal como, por ejemplo, isopropanol. Luego se puede llevar a cabo el análisis cuantitativo del sorafeno con el auxilio de un método de HPLC, preferentemente utilizando un detector de UV a una longitud de onda de 210 nm.

Para una mayor caracterización del fragmento de 6,5 Kb antes descripto, se somete a este último a un análisis de restricción, y seguidamente se secuencia el fragmento de 1,8 Kb comprendido en dicho fragmento de 6,5 Kb.

Para caracterizar el fragmento PvuI de 6,5 Kb sobre la base de los sitios de escisión de restricción, dicho fragmento es digerido por completo con enzimas de restricción adecuadas tales como, por ejemplo, BgIII, SphI y SmaI, que se emplean solas o combinadas entre sí. Se puede determinar el tamaño de los fragmentos así obtenidos tras el fraccionamiento en un gel de agarosa mediante comparación con un standard de tamaño.

La digestión del fragmento PuvI de 6,5 Kb con BgIII da origen a dos fragmentos de un tamaño de 4,3 Kb y 2,3 Kb, y la realizada con SphI da origen a 4 fragmentos de 2,8 Kb, 1,5 Kb, 0,7 Kb de tamaño. La combinación de las dos enzimas [BgIII y SphI] da lugar a 5 fragmentos de 1,6 Kb, 1,5 Kb, 1,5 Kb, 1,2 Kb, 0,7 Kb de tamaño. La digestión con SmaI produce tres fragmentos que tienen un tamaño de 2,9 Kb, 2,0 Kb y 1,6 Kb.

En este caso, debido al método de medición empleado, el tamaño real de los fragmentos puede diferir en +/- 10% del valor consignado. Se puede establecer la posición de los sitios de escisión de BgII, SphI y SmaI en el fragmento de 6,5 Kb del cósmido p98/1 basándose en el tamaño de los fragmentos encontrados, como se ilustra en la Fig. 1.

Como preliminar para la posterior secuenciación del fragmento de 1,8 Kb comprendido en el fragmento de 6,5 antes caracterizado, se lo aísla en primer lugar del plásmido [p108/III2] y seguidamente se lo clona en un vector adecuado.

Se puede demostrar la identidad del fragmento SaII de 1,8 Kb comprendido en el fragmento PvuI de 6,5 Kb del clon pSN105/7 con respecto al fragmento de 1,8 Kb clonado en el plásmido p108/1112 basándose en experimentos de hibridación.

Es preferible dentro del alcance de la presente invención un vector M13mp18 o M13mp19, cada uno de los cuales puede ser obtenido en el comercio, por ejemplo de GIBCO-BRL (Basilea, Suiza). La clonación en estos vectores y la posterior transfección de un huésped de E. coli adecuado se puede llevar a cabo por métodos descriptos por Maniatis y otros (1989) [página 4.35-4.38].

Las calvas de fagos recombinantes (incoloras) obtenidas de esta manera pueden ser aisladas de la manera descripta por Maniatis y otros [página 4.25 (1989)] y replicadas en un huésped de E. coli apropiado. Del mismo modo, se puede llevar a cabo el análisis de los fagos recombinantes para un fragmento de inserción del tamaño correcto por medio de métodos conocidos utilizando electroforesis en gel [Maniatis y otros [página 4.39-4,40; 1989)]. Luego se aísla una cantidad mayor del ADN monocatenario de los fagos con la inserción necesaria [Maniatis y otros [página 4.29-4,30; (1989)].

Se puede llevar a cabo preferentemente la secuenciación del ADN utilizando un kit de secuenciación comercial. El preferido dentro del marco de la presente invención es el kit de secuenciación T7 de PHARMACIA, que funciona por el método didesoxi de Sanger (1977). Esto conlleva el empleo del ADN monocatenario anteriormente aislado como modelo. Todas las operaciones de secuenciación se llevan a cabo de acuerdo con las instrucciones del kit de secuenciación T7 de Pharmacia (instrucciones de 1991, No. xy-010-00-08) utilizando el cebador universal contenido en el kit y el ^{35}S dATP (Amersham) que se utiliza para la marcación radiactiva. Las muestras que se pueden obtener de esta manera son fraccionadas a continuación por electroforesis en un gel de poliacrilamida desnaturalizante (al 6%) y examinadas por autorradiografía con una película de rayos X [Kodak X-OmatS]. Se pueden encontrar detalles del procedimiento en los siguientes ejemplos y en las instrucciones de Maniatis y otros [página 13.45-13.58; 1989)].

Es posible, sobre la base de la información de secuencias de ADN que se obtiene de esta manera, sintetizar oligonucleótidos que luego pueden ser empleados como cebadores para la secuenciación de regiones de los fragmentos SaII de 1,8 Kb que están situados más en el interior.

Realizaciones ejemplares no restrictivas Técnicas Generales de ADN recombinante

Dado que muchas de las técnicas de ADN recombinante utilizadas en la presente invención son de rutina para la persona capacitada en la técnica, sólo se presenta a continuación una breve descripción de estas técnicas utilizadas en general. Todos estos métodos han sido descriptos en la referencia de Maniatis y otros (1982) a menos que se haga especial referencia a los mismos.

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A. Corte con endonucleasas de restricción

La mezcla de reacción contiene típicamente aproximadamente 50 a 500 \mug/ml de ADN en la solución de buffer recomendada por el fabricante, fundamentalmente New England Biolabs, Beverly, MA y Böhringer, Mannheim (FRG). Se agregan 2 a 5 unidades de endonucleasas de restricción por cada \mug de ADN y se incuba la mezcla de reacción a una temperatura recomendada por el fabricante durante una a tres horas. La reacción se detiene calentando a 65ºC por espacio de 10 minutos o mediante extracción con fenol, seguida por precipitación del ADN con etanol. Esta técnica ha sido descripta además en las páginas 104 a 106 de la referencia de Maniatis y otros (1982).

B. Tratamiento del ADN con polimerasa a fin de generar extremos romos

Se agregan 50 a 500 \mug/ml de fragmentos de ADN a una mezcla de reacción en el buffer recomendado por el fabricante, principalmente New England Biolabs, Beverly, MA y Böhringer, Mannheim (FRG). La mezcla de reacción contiene los cuatro desoxinucleótido trifosfatos en concentraciones de 0,2 mM. La reacción tiene lugar a 15ºC por espacio de 30 minutos y luego se la detiene mediante calentamiento a 65ºC durante 10 minutos. Se utiliza el fragmento grande, o fragmento Klenow de la ADN polimerasa para los fragmentos obtenidos mediante corte con endonucleasas de restricción que generan extremos prominentes 5', tales como EcoRi y BamHI. Se utiliza la T4 ADN polimerasa para los fragmentos obtenidos por medio de endonucleasas que generar extremos prominentes 3', como PstI y SacI. El uso de estas dos enzimas ha sido descripto en las páginas 113 a 121 de la referencia de Maniatis y otros (1982).

C. Electroforesis en geles de agarosa y purificación de los fragmentos de ADN de los geles

Se lleva a cabo la electroforesis en geles de agarosa en un aparato horizontal de acuerdo con lo descripto en las páginas 150 a 163 de la referencia de Maniatis y otros. El buffer utilizado es el buffer de tris-acetato descripto en dicha referencia. Los fragmentos de ADN son teñidos con 0,5 \mug/ml de bromuro de etidio, que ya está presente normalmente en el gel durante la electroforesis o se lo agrega después de la electroforesis. Se visualiza el ADN mediante iluminación con luz ultravioleta de gran longitud de onda.

Cuando se han de separar los fragmentos del gel, se utiliza una agarosa que gelifica a baja temperatura y puede ser adquirida a Sigma Chemical, St. Louis, Missouri. Después de la electroforesis, el fragmento buscado es escindido, colocado en un tubo de plástico, calentado a 65ºC por espacio de aproximadamente 15 minutos, extraído tres veces con fenol y precipitado dos veces con etanol. Este método constituye una leve modificación del descripto en la página 170 de la obra de Maniatis y otros (1982). Por otro lado, se puede aislar el ADN de la agarosa con la ayuda del kit Geneclean (Bio 101 Inc., La Jolla, CA, USA).

D. Deleción de los fosfatos 5' terminales de los fragmentos de ADN

Durante los pasos de clonación del plásmido, el tratamiento del vector plásmido con fosfatasa reduce la recirculación del vector (descripta en la página 13 de la referencia de Maniatis y otros). Una vez cortado el ADN con la endonulcleasa de restricción adecuada, se agrega una unidad de fosfatasa alcalina de intestino de ternero, obtenida de Boehringer-Mannheim, Mannheim. El ADN es incubado a 37ºC durante una hora y seguidamente extraído dos veces con fenol y precipitado con etanol.

E. Ligamiento de los fragmentos de ADN

Cuando se pretende ligar entre sí los fragmentos con extremos pegajosos complementarios, se incuban aproximadamente 100 ng de cada fragmento en una mezcla de reacción de 20 a 40 \mul con aproximadamente 0,2 unidades de T4 ADN ligasa de New England Biolabs en el buffer recomendado por el fabricante. La incubación se lleva a cabo a 15ºC por espacio de 1 a 20 horas. Cuando se desea ligar fragmentos de ADN con extremos romos, se los incuba de la manera antes indicada excepto que se aumenta la cantidad de ADN ligasa T4 de 2 a 4 unidades.

F. Transformación de ADN en E. coli

Se utilizan las cepas de E. coli HB101, W3101 y ED8767 para la mayoría de los experimentos. Se inserta el ADN en E. coli por el método del cloruro de calcio de acuerdo con lo descripto por Maniatis y otros (1982), páginas 250 a 251.

G. Rastreo de E. coli para la detección de plásmidos

Después de la transformación, se analiza a las colonias de E. coli para detectar la presencia del plásmido requerido mediante un método rápido de aislamiento de plásmidos. En las páginas 366 a 369 de la referencia de Maniatis y otros (1982) se describen dos métodos habituales.

H. Aislamiento del plásmido ADN en gran escala

Los métodos para aislar plásmidos de E. coli en gran escala han sido descriptos en las páginas 88 a 94 de la referencia de Maniatis y otros (1982).

Figuras

La Figura 1 [Fig. 1] ilustra un mapa de restricción del fragmento PvuI de 6,4 (6,5) Kb del cósmido p98/1. La barra indica el fragmento SaII de 1,8 Kb y la región rayada de la barra representa el subfragmento SaII-BgIIII secuenciado.

La Figura 2 [Fig. 2] ilustra el mapa de restricción de la inserción de 40 Kb del cósmido p98/1. Las barras indican la posición de los cuatro fragmentos PvuI analizados por ruptura de genes. No se ilustran otros sitios PvuI fuera de estos fragmentos PvuI.

Ejemplo 1 Clonación de un fragmento del "cluster de genes de sorafeno" de Sorangium cellulosum 1.1 Construcción de un banco génico de cósmidos de Sorangium cellulosum 1.1.1. Aislamiento de ADN genómico de alto peso molecular

El ADN genómico completo de alto peso molecular [aproximadamente 100 Kb] de Sorangium cellulosum es aislado de la cepa M15 con la ayuda de métodos de por sí conocidos.

De manera específica, esto ocasiona inicialmente que las células de Sorangium cellulosum sean cultivadas a una temperatura de 28ºC en 200 ml de un medio G51b (ver sección: Medios y Buffers) con agitación continua a 180 rpm durante 10 días. Las células se eliminan, a continuación, por centrifugación a 10.000 rpm (Sorvall GSA Rotor; DuPont Instruments, Newton, Connecticut, EE.UU) y se suspenden nuevamente en 36 ml de un buffer de STE (ver sección: Medios y Buffers) al cual se agrega lisozima (Boehringer Mannheim, FRG) en una concentración final de 5 mg/ml. Esta mezcla se incuba a 37ºC durante 30 minutos. A continuación, se agregan 16 ml de un buffer de lisis (ver sección: Medios y Buffers) y esta nueva mezcla se incuba a 55ºC durante una hora más.

El lisado de la célula obtenible de esta forma se enriquece con CsCl a una concentración final de 1 g/ml y esta mezcla luego se centrifuga a 10.000 rpm (Sorvall SA600 Rotor, DuPont Instruments) durante 10 minutos para eliminar los constituyentes particulados. Otra centrifugación del lisado se lleva a cabo a 45.000 rpm (Beckman Vti50Rotor; Beckman Instruments Inc., Palo Alto, EE.UU) durante un período de 18 horas y a una temperatura de 20ºC.

El ADN genómico luego puede ser aislado de la fracción de viscosidad elevada, fácilmente visible, por ejemplo, pinchando simplemente el tubo centrífugo plástico con la ayuda de una aguja de inyección de calibre 16 y permitiendo que salga el contenido. Las fracciones de viscosidad elevada que comprenden el ADN de peso molecular alto se recolectan y a continuación se combinan.

A continuación la fracción que contiene ADN se dializa extensamente con buffer de TE (ver sección: Medios y Buffers) y el ADN se concentra mediante precipitación de etanol. El precipitado se centrifuga y se suspende el pellet nuevamente en 2 ml de buffer de TE y se almacena a 40ºC hasta nuevo procesamiento.

1.1.2. Digestión parcial del ADN de peso molecular alto

El ADN aislado previamente se digiere, a continuación, con la ayuda de las enzimas de restricción adecuadas. A fin de lograr diferentes niveles de restricción, el ADN se somete a tres digestiones parciales independientes con Sau3A (Promega, Medison, WI, EE.UU) en una solución de buffer también suministrada por el fabricante. La cantidad de ADN empleada es en cada caso de 100 \mug y la concentración de enzimas es de 0,04, 0,02 o 0,01 unidades/\mug de ADN. El tiempo de incubación es de 30 minutos a 37ºC. La actividad enzimática se detuvo agregando Na_{2}EDTA a una concentración final de 50 mM. Esta mezcla de reacción se extrajo dos veces con fenol:cloroformo (50:50) y una vez con cloroformo, seguido de una precipitación de etanol. El ADN digerido parcialmente se suspende nuevamente en buffer de TE, y se reúnen todas las muestras y se ajustan a una concentración de 1 mg/ml.

El ADN pretratado de esta forma luego se calienta a 65ºC durante 5 minutos y se fracciona de acuerdo con el tamaño por centrifugación (Rotor Beckmann SW-28; 25.000 rpm (82,700 x g) a 20ºC durante 16-18 horas) en un gradiente de densidad de sucrosa de 10% a 40% de concentración (10%-40% de sucrosa en pasos al 5% en NaCl 1M, 20 mM tris (pH 8.0) EDTA 5 mM ). Los gradientes se fraccionaron en alícuotas de 0,5 ml cada una, y las muestras del orden de 30 \mul de tamaño se eliminaron de cada segunda alícuota, se dializaron y se analizaron con un patrón de tamaño en un gel de agarosa al 0,4%.

1.1.3. Construcción de un banco genómico

El vector pHC79 del cósmido (Hohn B y Collins J. 1980) se completó digerido con BamHI, fue extraído con fenol:cloroformo (50:50) y a continuación fue precipitado y concentrado con etanol.

Esas fracciones de ADN de S. cellulosum digeridas parcialmente con Sau3A que comprenden los fragmentos de ADN con tamaños del orden de 35 Kb a 45 Kb se reunieron y se concentraron mediante una precipitación en etanol.

A continuación se procede al tratamiento con fosfatasa alcalina de estómago de ternero (Promega), que se lleva a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

La ligadura del ADN del cósmido al ADN de S. cellulosum que ha sido fraccionado de acuerdo con el tamaño, se lleva a cabo con la ayuda de una ADN ligasa T4. Esto permite que los dos materiales de partida de ADN se mezclen en cantidades aproximadamente equimolares (aproximadamente 6 \mug de ADN de S. cellulosum y aproximadamente 1 \mug de ADN del vector), seguido de un tratamiento con calor a 65ºC durante 15 minutos y mediante una precipitación de etanol renovada. La concentración final del ADN completo es 500 \mug de ADN/ml a 800 \mug de ADN/ml en un volumen total de 10 \mul. Esta mezcla de reacción se incubó primero a temperatura ambiente durante varias horas y luego a 15ºC durante otras 10 a 14 horas.

Uno a dos \mul de la mezcla de ligadura luego se empaquetaron en fagos de lambda utilizando un kit de empaquetadura comercial in vitro que puede obtenerse, por ejemplo, de STRATAGENE, Inc. en La Jolla, California (EE.UU) o PROMEGA en Madison, Wi, EE.UU. Las partículas de fago resultantes se utilizaron para infección de bacterias de una hebra de E. coli recA adecuada (por ejemplo de la hebra de E. coli HB101). El procedimiento específico para esto es tal que

(a) las bacterias primero se cultivan como cultivo durante la noche en un medio de caldo Luria (10 g/l de triptona Bacto; 5 g/l de extracto de levadura; 5 g/l de NaCl) suplementado con maltosa al 4% y MgSO_{4} 10 mM;

(b) el cultivo se diluye en el mismo medio y se deja desarrollar hasta que se alcance una densidad óptica (OD_{600}) de 0,5 (fase med-log) (aproximadamente 2 horas);

(c) 0,2 ml del cultivo de E. coli se transfiere a un tubo Eppendorf estéril, se agrega 50 \mul de las partículas de fago "empaquetado", y la mezcla completa se mezcla completamente;

(d) después de la incubación a 37ºC durante 15 minutos, se agrega 1 ml de solución de caldo Luria y se continúa con la incubación durante 1 hora más;

(e) para seleccionar los clones transfectados, las alícuotas de 0,1 ml se colocan en placas sobre un agar de caldo Luria suplementado con 50 mg/l de ampicilina; y

(f) el ADN del plásmido se aísla con la ayuda de métodos conocidos de las colonias resultantes de la selección.

La titulación del material de fago revela un total de aproximadamente 50.000 partículas/ml de fago.

1.2 Preparación de la sonda de ADN marcada en forma radioactiva de S. violacerouber Tu22

Utilizado como material de partida para preparar la sonda de ADN se halla el plásmido pU5200 (Sherman y Otros, 1989) que comprende un fragmento BamHI de 4,6 Kb de la región gral (cluster de genes granaticin ORF 1-4) del Streptomyces violaceoruber Tu22 clonado en el sitio de clivado BamHI de pUC18 (obtenible de GIBCO BRL, Basel, CH).

A fin de obtener un fragmento de ADN que esté libre de las secuencias de ADN que son homólogas con las secuencias pBR322 o pUC18 correspondientes, se clona primero el fragmento BamHI de 4,6 Kb en el vector de esptreptomyces pU486 (Ward y Otros, 1986). Para esto, aproximadamente 4 \mug del plásmido pU5200 (Sherman y Otros, 1989) se corta completamente con BamHI, y los fragmentos resultantes se separan uno de otro mediante electroforesis de gel de agarosa.

Los fragmentos de 4,6 kb requeridos luego se eliminan de la agarosa por electroelución. Para esto, primero se corta una tira de aproximadamente 2 mm a 3 mm de ancho del gel de agarosa con un escalpelo estéril y se coloca en un tubo de diálisis (tubo de diálisis preparado de ¼ de pulgada de diámetro obtenible, por ejemplo, de BRL). El tubo de diálisis que contiene el bloque de agarosa luego se trata en buffer de TAE 1 x (tris-acetato 0,04 M; EDTA 0,002 M) en una cámara de electroforesis de agarosa horizontal con una corriente de 100 miliamperes de modo que la corriente fluya en los ángulos correctos al eje largo del tubo de diálisis durante 2 horas. Al cabo de la reversión de la corriente durante 45 segundos, el tubo de diálisis se abre y se fuerza el contenido (buffer y bloque de agarosa), utilizando una jeringa de 5 ml, lentamente a través de un filtro de fibra de vidrio (Whatman GF/C; Whatman Scientific Ltd., Kent, GB). El filtro luego se lava con 200 \mul de buffer de TAE (1 x), y luego se agrega ARNt (ARN de transferencia de levadura química, obtenible, por ejemplo, de Böhringer Mannheim, FRB) a una concentración final de 4 \mul a la muestra filtrada. La muestra de ADN luego se extrae con fenol/cloroformo (Maniatis y Otros, 1982, página 458) y se precipita con etanol (Maniatis y Otros, 1982; pág 461). El precipitado resultante se coloca en 30 \mul a 40 \mul de buffer de TE.

Aproximadamente 0,5 \mug del fragmento obtenido de esta forma se mezcla con aproximadamente 0,1 \mug del ADN del vector pIJ486 (Ward y Otros, 1986), el cual se corta previamente con BamHI, y se precipita con etanol (Maniatis y Otros, 1982; página 461) y se liga con ADN ligasa T4 (obtenible de Börhinger Mannheim, FRG) en 20 \mul de buffer de reacción (como se especifica por el fabricante) a aproximadamente 15ºC durante la noche, 2-5 \mul de esta mezcla de ligadura se transforma en la hebra de Streptomyces pilosus M1/5 (Schupp y Otros 1988) mediante el método protoplast descripto por Hopwood y Otros, (1985)). Los transformantes se seleccionaron después de la incubación (28ºC) durante 18 horas vertiendo 4 ml de agar nutriente blando (Difco) que contiene 250 \mug/ml de tiostrepton (ver Schupp y Otros, 1985) en el agar R2YE (Hopwood y Otros, 1988). Después de la incubación a 28ºC durante 7 días, se seleccionaron las colonias para aislamiento del ADN del plásmido. El aislamiento del ADN se llevó a cabo mediante una leve modificación (de acuerdo con Schupp y Otros, 1988) del método de Bimboim & Doly (1979). El ADN del plásmido aislado se digiere a continuación con BamHI, y tanto el ADN digerido como el no digerido se analizan con la ayuda de electroforesis de gel.

Las colonias que tenían un fragmento de BamHI adicional de 4,6 Kb se cultivaron en 500 ml de un medio de 148G (Schupp y Otros, 1986, y se aisló el plásmido de ADN con la ayuda de los métodos de gradiente CsCl (Hopwood y Otros, 1985). Los plásmidos obtenibles del modo descripto previamente y que tienen el fragmento de BamHI de 4,6 Kb de S. violaceoruber se denominan p82/11 y p82/21.

Para marcación radioactiva del fragmento de ADN de 4,6 Kb, aproximadamente 1 \mug del plásmido p82/21 se corta completamente con BamHI, y los fragmentos obtenidos de esta forma se separaron uno de otro mediante electroforesis con gel de agarosa. El fragmento de 4,6 Kb se aísla a continuación del gel de agarosa mediante electroelución (ver anterior). Aproximadamente 0,2 \mug del fragmento de BamHI de 4,6 kb aislado de esta forma se emplea para la marcación radioactiva por medio de una traslación por cortes (Rigby DWJ y Otros, 1977). La traslación por cortes se puede llevar a cabo utilizando el sistema de traslación por cortes disponible de GIBCO BRL (Bethesda Research Laboratories Life Technologies Inc.) en Basle, CH, mientras tiene lugar la marcación, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con 80 Z\muCi de d-CTP ^{32}P. El fragmento de 4,6 Kb marcado se puede separar de los nucleótidos no-incorporados mediante el pasaje a través de una columna por cortes que contiene Sephadex G-50 (Pharmacia Biosystems, Dübendorf, CH) y subsiguiente elución de fracciones de 200 \mul con buffer de TE.

1.3 Hibridación de clones individuales dentro del banco génico del cósmido de Sorangium-cellulosum utilizando la sonda de ADN del S. violaceoruber

Mediante la infección de bacterias de la hebra de E. coli HB101 con 100 \mul de fagos lambda empaquetados in vitro (de acuerdo con el Ejemplo 1.1), después de colocar en placas Petri con agar de LB suplementado con ampicilina (60 \mug/ml), es posible obtener un amplio número de colonias (hasta 1300 colonias y más) resistentes a la ampicilina. Estas colonias pueden ensayarse por medio de hibridación de colonia en filtros de nylon en la siguiente forma (Instrucciones Amersham para filtros Hybond):

Un filtro de nylon (Membrana de Transferencia Amersham Hybond-N; Amersham International, Amersham, Reino Unido) se colocó en las colonias y al cabo de un minuto, con las colonias hacia arriba, se colocó sobre un papel de filtro estéril (Whatman No.3). Para producir una réplica de las colonias, se presionó un segundo filtro sobre el primero y a continuación se colocó sobre placas de agar de LB (suplementada con 60 \mug/ml de ampicilina) y se incubó en adelante a 37ºC hasta que las colonias alcanzaron un diámetro de aproximadamente 1 mm. El primer filtro, con las colonias hacia arriba, se colocó luego sobre una pila de un total de 5 papeles Whatman No. 3 impregnados con una solución de desnaturalización (NaCl 1,5 M; NaOH 0,5 M). Después de actuar durante 7 minutos, los filtros se colocaron de la misma forma en un nuevo filtro impregnado con una solución de neutralización (NaCl 1,5 M; Tris-HCl 0,5M (pH 7,2); EDTA 0,001 M). Esta solución se dejó actuar durante 3 minutos antes de que el tratamiento con la solución de neutralización se repita una vez más.

Los filtros luego se introdujeron brevemente en 2x SSC (NaCl 0,3 M; citrato de sodio 0,03 M (Maniatis y Otros, 1982) y, para secado, se colocaron en filtros Whatman No. 3 secos (colonias hacia arriba) y se secaron al aire. A fin de fijar el ADN, los filtros se envolvieron en una película Saran (Dow Chemical Company) y se irradiaron con luz UV (312 nm) en un transiluminador UV (CAMAG Reprostar, Camag, Muttenz, CH) durante 5 minutos (colonias hacia abajo).

Posteriormente, para la pre-hibridación, los filtros se incuban a 65ºC durante 90 minutos con un buffer de la siguiente composición: 2 X SSC [Maniatis et al, 1982] + 1 X Denhard [Maniatis et al, 1982] + 0,5% SDS + 50 \mug/ml de ADN de esperma de salmón [sal de sodio ADN, Tipo III, de Ensayos de Salmón; SIGMA Chemical Co., St. Louis, Estados Unidos de America] (desnaturalizado por calentamiento a 100ºC durante 10 minutos). Para la hibridación, se agregan alrededor de 2 x 10^{5} cpm/ml de fragmento de ADN de 4,6 Kb, marcado por traslación por cortes, a partir de plásmido pCT82/21 [ver ejemplo 1.2], previamente desnaturalizado por calentamiento a 100ºC durante 10 minutos.

La hibridación real toma lugar luego a 65ºC durante 24 horas.

Luego de la hibridación, el filtro se lava primero con 2x SSC a temperatura ambiente durante 15 minutos, luego en 2x SSC a 60ºC durante 15 minutos, subsiguientemente en 2x SSC + 0,1% SDS a 60ºC durante 30 minutos y por último en 0,5x SSC a 60ºC durante 15 minutos. La autoradiografía siguiente se lleva a cabo con una película de rayos X [por ejemplo Fuji RX (película de rayos X para usos médicos)] durante 24 horas.

1.4 Análisis de las colonias que contienen cósmidos por medio de aislamiento de plásmidos e hibridación Southern

Los clones de cósmidos obtenibles por el método descripto anteriormente y que muestren las señales más fuertes en la hibridación de colonias se transfieren del plato de agar a 2 ml de un medio LB y se incuban a 37ºC durante toda la noche. Se usa luego una alícuota de 1 ml de estos cultivos para aislar el ADN del plásmido [como se describe por Maniatis et al., (1982); páginas 368-369].

Los plásmidos aislados luego se digieren con SaII, y los fragmentos obtenidos de esta forma se separan sobre un gel de agarosa tris-acetato 0,8% [1 x TAE] a 1,2 volt/cm durante 15 horas. Subsecuentemente, el gel se trata primero durante 2 x 15 minutos en una solución desnaturalizante [1,5 M de NaCl; 0,5 M de NaOH] y subsiguientemente durante 2 x 15 minutos en una solución neutralizante [1,5 M de NaCl; 0,5 M de Tris-HCl; 1 mM de EDTANa_{2} (pH 7,2)] con agitación suave a temperatura ambiente. Luego el ADN se transfiere por medio de un borrón capilar de Southern [Maniatis et al, 1982; páginas 383-386] un buffer SSC concentrada 10 veces a una membrana de nitrocelulosa [0,45 \mu nitrocelulosa; Bio-Rad Laboratories, Richmond, USA] y subsiguientemente se fija a la membrana a 80ºC al vacío durante 2 horas.

Para la subsiguiente hibridación, el filtro se incuba primero para la pre-hibridación a 65ºC durante 120 minutos con un buffer de la siguiente composición: 2 X SSC [Maniatis et al, 1982] + 1 X Denhard [Maniatis et al, 1982] + 0,5% SDS + 50 \mug/ml de ADN de esperma de salmón (desnaturalizado por calentamiento a 100ºC durante 10 minutos). Para la hibridación real, se agrega alrededor de 8 x 10^{6} cpm del fragmento de ADN de 4,6 Kb, marcado por traslación por cortes, a partir de plásmido p82/21 [ver ejemplo 1.2], previamente desnaturalizado por calentamiento a 100ºC durante 10 minutos. La hibridación toma luego lugar a 65ºC durante 36 horas.

Luego de la hibridación, el filtro se lava dos veces en 2x SSC + 0,1% SDS a 55ºC durante 20 minutos y luego en 0,2 x SSC + 0,1% SDS a la misma temperatura durante 20 minutos. La autoradiografía siguiente se lleva a cabo con una película de rayos X [por ejemplo Fuji RX (película de rayos X para usos médicos)] durante 48 horas.

Se selecciona para trabajo futuro un cósmido [p98/1] que muestra una banda fuerte de 1,8 Kb en la autoradiografía.

1.5 Subclonado del fragmento SaII de 1,8 Kb del cósmido p98/1 en el vector pBR322 de E. coli

Para la preparación de una cantidad mayor del cósmido p98/1, se preparan 20 ml de cultivo de la cepa HB101/p98/1 de E. coli correspondiente [ver ejemplo 1.1] en un medio LB y se incuba durante toda la noche. Luego es posible aislar una mayor cantidad de ADN de cósmido p98/1 de este cultivo [15 ml] [ver Maniatis et al., (1982); páginas 368-369].

Alrededor de 3 \mug del ADN del cósmido p98/1 se digieren completamente con SaII, y los fragmentos obtenibles de esta forma se separan por electroforesis sobre gel de agarosa tris-acetato al 0,8% [1 x TAE] a 1,2 volt/cm durante 15 horas. El fragmento de ADN de 1,8 Kb requerido se remueve luego de la agarosa por electro-elución en analogía con el procedimiento descripto en el ejemplo 1.2.

Se mezclan 30 \mul de la muestra del fragmento de SaII de 1,8 Kb obtenido de esta forma con alrededor de 0,05 \mug del plásmido pBR322 que se cortó previamente con SaII, y se precipitan con etanol [Maniatis et el., (1982); página 461] y luego se ligan con ADN ligasa T4 [Böhringer Mannheim, FRG] en 20 \mul de un buffer de reacción [como se especifica por el fabricante] a alrededor de 15ºC durante toda la noche.

El ADN ligado resultante [5 \mul] se clona subsecuentemente en células de la cepa HB101 de E. coli que se han hecho competentes como se describe por Maniatis et al. (1982) [páginas 250-251] y se plaquean en agar LB suplementado con 50 \mug/ml de ampicilina.

Se pueden encontrar las colonias sensibles a la tetraciclina por barrido diferencial de las colonias transformadas sobre agar LB con 50 \mug/ml de ampicilina o con 50 \mug/ml de ampicilina y 20 \mug/ml de tetraciclina, y puede ser aislado el ADN del plásmido [como se describe en Maniatis et al., 1982; páginas 368-369]. El ADN del plásmido aislado se corta luego con SaII y se analiza por electroforesis en gel de agarosa por el tamaño de sus fragmentos insertados, empleando como comparación el cósmido p98/1 que también se aplica.

Se puede luego aislar un plásmido [p102/III2] que comprende un fragmento adicional del tamaño requerido a partir del gel del modo previamente descripto. La identidad de este fragmento adicional al fragmento SaII de 1,8 Kb del cósmido p98/1 se puede confirmar luego en una transferencia Southern [como se describe en el ejemplo 1.4] y la hibridación con la sonda de ADN BamHI de 4,6 Kb de S. violaceoruber.

1.6 Secuenciación del subfragmento SaII/Bg1II de 0,78 Kb del fragmento SaII de 1,8 Kb del plásmido p108/III2

Para la secuenciación, se aísla primero el fragmento SaII de 1,8 Kb del plásmido p108/III2 descripto en el ejemplo 1.5. Por ello, se cortan completamente alrededor de 2 \mug del plásmido p108/III2 con SaII y se separan por electroforesis en gel de agarosa tris-acetato al 0,8% a 1,2 volt/cm durante 15 minutos. Luego el fragmento SaII de 1,8 Kb se aísla por electro-elución de modo análogo al procedimiento descripto en el ejemplo 1.5.

Subsiguientemente, el fragmento SaII [alrededor de 0,3 \mug] se liga directamente al sitio de clivado de SaII del vector M13mp18 [alrededor de 0,02 \mug].

Como una alternativa para esto, el fragmento SaII puede ser también adicionalmente cortado con BgIII y ligado en la forma de dos sub-fragmentos BgIII-SaII [2 fragmentos, total alrededor de 0,3 \mug] en el vector M13mp19 que está previamente cortado con SaII y BamHI [alrededor de 0,1 \mug] [la unión con la ADN ligasa T4 puede llevarse a cabo como se describe en el ejemplo 1.5]. Los vectores M13mp18 y M13mp19 están comercialmente disponibles de GIBCO-BRL (Basilea, Suiza). El clonado dentro de estos vectores y la subsiguiente transfección de células de E. coli JM101 se puede llevar a cabo por el método descripto por Maniatis et al. (1989) [página 4.35-4.38].

En cada caso, 12 placas de fago recombinante (sin color) obtenidos de esta manera se aíslan como se describe en Maniatis et al. [página 4.25; (1989)] y se replican en E. coli JM101. El análisis de los fagos recombinantes para un fragmento insertado del tamaño correcto puede asimismo llevarse a cabo por medio de métodos conocidos usando electroforesis en gel [Maniatis et al. [página 4.39-4.40; (1989)]. Se aísla luego una mayor cantidad de ADN de cadena simple a partir de los fagos con el inserto requerido [Maniatis et al., página 4.29-4.30; (1989)].

La secuenciación de ADN se puede llevar a cabo con la ayuda del kit de secuenciación T7 de Pharmacia por el método de dideoxi de Sanger (1977). Para ello, se emplea como patrón el ADN de cadena simple aislado previamente. Todas las operaciones de secuenciación se llevan a cabo de acuerdo con las instrucciones del kit de secuenciación T7 de Pharmacia (1991 instrucciones, No. xy-010-00-08) usando el cebador universal contenido en el kit y la ^{35}S dATP [Amersham International; Amersham; Reino Unido] que se usa para el marcado radioactivo. Las muestras obtenidas de este modo se separan subsiguientemente por electroforesis sobre gel de poliacrilamida desnaturalizante (6%) y se examina por autoradiografía con una película de rayos X [Kodak X-OmatS]. Los detalles del procedimiento pueden encontrarse en las instrucciones de Maniatis et al. [página 13.45-13.58; (1989)].

Se sintetizan 4 oligonucleótidos sobre la base de la información de la secuencia de ADN obtenida anteriormente para determinar la secuencia de ADN en la región central de los dos sub-fragmentos SaII-BgIII.

Los oligonucleótidos Oli1 y Oli2 pueden ser empleados como cebadores para la secuenciación en la siguiente estrategia de secuenciación para secuenciar el sub-fragmento SaII/BgIII localizada en 5'. Los dos oligonucleótidos tienen las siguientes secuencias de bases:

- 5' TAC TGG TAT CGA AAC CT 3'(151-167) = Oli1 (SEC. ID. Nº 2)

- 5' GAA GAC GAC GTG GTC TT 3'(642-626) = Oli2 (SEC. ID. Nº 3)

La estrategia de secuenciación para el fragmento SaII/BgIII de 0,78 Kb se puede distinguir mediante un gráfico como sigue:

1

Clave:

- oligonucleótidos sintetizados:	5' \Rightarrow 3'
- cebador universal del kit:	5' \rightarrow 3'

2. Sub-clonado de fragmentos PvuI del cósmido p98/1 y transferencia conjugativa en S. cellulosum

Debido a que el vector pSUP2021 que se usa para el experimento de ruptura del gen descripto en el ejemplo 3 tiene un sitio de clivado PvuI único en el gen Amp^{R}, los fragmentos PvuI se usan correspondientemente de aquí en más para las etapas de sub-clonado y la transferencia conjugativa.

2.1 Sub-clonado de fragmentos PvuI del cósmido p98/1 en el plásmido pSUP2021

El cósmido p98/1 [alrededor de 4 \mug] se corta completamente con PvuI, y los fragmentos resultantes se separan por electroforesis sobre gel de agarosa tris-acetato al 0,8% [1 x buffer TAE] a 1,2 volt/cm durante 18 horas (figura 2) en analogía con el procedimiento descripto en el ejemplo 1.5.

Los fragmentos bien separados [alrededor de 6,5 Kb, alrededor de 10 Kb y una fracción de 4 Kb y 4,2 Kb] se aíslan por electroforesis por el método descripto en el ejemplo 1.5 y cada uno se resuspende en 40 \mul de buffer TE. Se mezclan 35 \mul de cada una de las muestras obtenibles de esta forma de los 4 fragmentos con alrededor de 0,05 \mug del plásmido pSUP2021 [Simon R et al., 1983] que se corta previamente con PvuI, se precipita con etanol [como se describe en Maniatis et al. (1982); página 461] y subsiguientemente se liga con ADN ligasa T4 [obtenible de Böhringer, Mannheim, FRG] en 20 \mul de buffer de reacción a alrededor de 15ºC durante toda la noche.

Las células de E. coli HB101 hechas competentes como se describe en Maniatis et al. (1982) se transforman [Maniatis et al. (1982); página 250-251] con en cada caso 10 \mul de las 3 muestras de ADN obtenibles a partir de la reacción de la ligasa anteriormente descripta, y se plaquean sobre gel LB con 30 \mug/ml de cloranfenicol. Se ensaya cada una de las colonias transformadas de este modo para su sensibilidad a la ampicilina. Las colonias sensibles a la ampicilina se identifican subsiguientemente y se usan como material de partida para el aislamiento del ADN del plásmido [Maniatis et al. (1982); páginas 368-369]. Los plásmidos aislados se cortan luego con PvuI y se analizan por electroforesis en gel de agarosa. Se usa el cósmido p98/1 cortado con PvuI como estándar de comparación. De esta forma es posible identificar un total de tres plásmidos que comprenden el fragmento requerido. El plásmido con el fragmento que comprende alrededor de 6,5 Kb se llama pSN105/7. El plásmido con el fragmento que comprende alrededor de 10 Kb se llama pSN120/10. Los plásmidos con los fragmentos que comprenden 4 Kb y 4,2 Kb se llaman pSN120/43-49 y pSN120/46 respectivamente y contienen los fragmentos de tamaños 4 y 4,2 Kb.

Una medida exacta de los fragmentos anteriormente mencionados da como resultado lo siguiente:

tamaño usado en el texto [Kb]	tamaño exacto como se midió [Kb]	nombre del plásmido
10	12,5	pSN120/10
6,5	6,4	pSN105/7
4,2	4	pSN120/43-49
4	3,8	pSN120/46

2.2 Transferencia conjugativa de plásmidos recombinantes en S. cellulosum 2.2.1 Transformación de plásmidos pSN105/7, pSN120/10, pSN120/43-49 y pSN120/46 en E. coli

Los plásmidos pSN105/7, pSN120/10, pSN120/43-49 y pSN120/46, cuya preparación y aislamiento se describió previamente en el ejemplo 7.1, se transforman dentro de la cepa ED8767 de E. coli que comprende el plásmido asistente pUZ8 [Hedges RW y Matthew M (1979)].

El plásmido pUZ8 es un derivado del plásmido RP4 que comprende un rango de huéspedes muy amplio y está descripto en Datta et al (1971). Las modificaciones comparadas con el plásmido inicial RP4 se refieren esencialmente al gen de la resistencia a ampicilina y a la inserción del elemento IS21, ambos eliminados, y a la incorporación de un gen adicional que confiere resistencia a iones mercurio [ver Jaoua et al (1987)].

Las colonias que resultaron luego de la transformación y subsiguiente incubación sobre agar LB suplementada con tetraciclina [10 \mug/ml] y cloranfenicol [25 \mug/ml] durante 24 horas se someten a un barrido diferencial por plaqueo paralelo sobre un medio que contiene ampicilina [60 \mug/ml] y otro libre de ampicilina. Seguidamente es posible aislar aquellas colonias que, debido a la integración de los fragmentos de ADN de Sorangium, han perdido su resistencia a ampicilina. Los cultivos obtenibles de esta manera pueden emplearse luego directamente como células donantes para la transferencia conjugativa de los plásmidos recombinantes dentro de las células de Sorangium cellulosum.

2.2.2 Transferencia conjugativa

Para la transferencia real, se mezclan 15 ml del cultivo SJ3 de Sorangium cellulosum en la fase estacionaria [1-4 x 10^{9} células/ml] con 10 ml del cultivo de fase log tardía de células donantes ED8767 de E. coli que comprenden un número comparable de células. Estos pueden luego ser centrifugados juntos a 4000 rpm durante 10 minutos y resuspendidos en 500 \mul de un medio G51b o G51t.

Está probado en este caso que es ventajoso exponer a las células receptoras de Sorangium a un tratamiento térmico breve en un baño de agua antes de la conjugación con E. coli. Los mejores resultados de transferencia con la cepa SJ3 de Sorangium cellulosum se pueden alcanzar con un tratamiento térmico a una temperatura de 50ºC durante 10 minutos. Se pueden alcanzar frecuencias de transferencia de 1-5 x 10^{-5} bajo estas condiciones, que corresponden a un incremento por un factor de 10 comparado con un método sin tratamiento térmico previo.

La transferencia a platos con medio sólido So1E es seguida por incubación a 30ºC durante dos días. Las células son luego recolectadas y resuspendidas en 1 ml de medio G51b o G51t. Se plaquean 100 \mul de esta suspensión bacteriana sobre un medio So1E selectivo, que aparte de kanamicina [25 mg/l], contiene también fleomicina [20 a 35 mg/l] y estreptomicina [300 mg/l] como agentes selectivos. La contra-selección de las cepas donantes [E. coli W3101 (pME305)] tiene lugar con la ayuda de la estreptomicina.

Las colonias que han crecido en este medio So1E selectivo luego de un tiempo de incubación de 10 a 14 días a una temperatura de 30ºC son transconjugantes de Sorangium cellulosum que han adquirido resistencia a fleomicina por transferencia conjugativa de los plásmidos pSN105/7, pSN120/10, pSN120/43-49 y pSN120/46. Estas colonias resistentes a fleomicina pueden ser usadas para investigaciones biológicas moleculares subsiguientes. La frecuencia de transformación para la transferencia del ADN del plásmido a Sorangium oscila entre 1-3 x 10-6 basada en la cepa receptora SJ3.

3. Caracterización de los fragmentos identificados previamente 3.1 Cesión del fragmento SaII 1,8 Kb en el fragmento PvuI 6,5 Kb del cósmido p98.1

Los plásmidos pSN105/7, pSN120/10, pSN120/43-49 y pSN120/46, cuya preparación y aislamiento han sido descripton en el Ejemplo 2.1, se digieren completamente con SaII y PvuI, y los fragmentos se fraccionan en un gel de agarosa tris-acetato al 0,8% como en el Ejemplo 1.4 y se transfieren por borrón capilar de Southern a una membrana de nitrocelulosa. La hibridación se llevó a cabo usando el fragmento SaII 1,8 Kb del plásmido p108/III2 como sonda, bajo las condiciones descriptas en el Ejemplo 1.4, realizándose el último paso de lavado por filtrado a 65ºC (en 0,2 x SSC + 0,1% de SDS).

La evaluación del gel de agarosa y del autorradiograma muestra que el clon pSN105/7 comprende en su fragmento PvuI que comprende 6,5 Kb, un fragmento SaII a 1,8 Kb que es idéntico al fragmento 1,8 Kb clonado en el plásmido p108/112.

3.2 Caracterización del fragmento PvuI 6,5 Kb del cósmido p98/1 por restricción de las regiones de clivado

El plásmido pSN105/7 se digiere con PvuI tal como se describió en el Ejemplo 3.1 y los dos fragmentos obtenidos de esta forma se fraccionan en un gel de agarosa tris-acetato al 0,8% [1 x TAE] a 1,2 volt/cm durante 15 horas. El fragmento de ADN que es 6,5 Kb en tamaño se elimina luego del gel mediante electro-elución en analogía con el procedimiento descripto en el Ejemplo 1.2 y recogido en 30 \mul del buffer TE.

Para caracterizar el fragmento PvuI 6,5 Kb mediante restricción de las regiones de clivado, el fragmento de ADN 6,5 Kb resultante se digiere con, en cada caso independientemente uno del otro, BgIII, SphI y Smal así como también completamente, y el tamaño de los fragmentos resultantes se determina luego del fraccionamiento sobre gel de agarosa tris-acetato [1 x TAG]. Para esto, un \lambda ADN de corte HindIII (obtenido a través de GIBCO-BRL, Basilea, Suiza) se utiliza como patrón de comparación de los tamaños de los fragmentos de ADN en el mismo gel. A fin de poder establecer con claridad la posición de los fragmentos individuales en lo que respecta a uno del otro, el fragmento 6,5 Kb se digiere además con todas las combinaciones imaginables de dos de las enzimas de restricción antes mencionadas en cada caso.

La digestión con BgIII produce dos fragmentos de 4,3 Kb y 2,3 Kb de tamaño, y aquella con Sphl produce 4 fragmentos de 2,8 Kb, 1,5 Kb y 0,7 Kb de tamaño. La digestión con Smal produce 3 fragmentos de 2,9 Kb, 2,0 Kb y 1,6 Kb de tamaño. En este caso, el tamaño real de los fragmentos puede diferir en +/- 10% del valor mencionado debido al método de medición usado. La posición de las regiones de clivado BgIII y SphI en el fragmento de 6,5 Kb del cósmido p98/1 puede establecerse basándose en los tamaños de fragmentos encontrados tal como se describió en la Fig. 1.

4. Ensayo de función 4.1 El análisis del efecto del fragmento PvuI del cósmido p98/1 en la producción de sorafeno por S. cellulosum luego de la ruptura de genes

La transferencia de plásmidos que comprenden secciones de ADN que son homólogas con las secciones correspondientes dentro del genoma Sorangium cellulosum lleva a la integración de dichas secciones de ADN en el ADN de Sorangium cellulosum cromosomal en la región de homología mediante recombinación homóloga.

Si la región homóloga es una sección dentro del cluster de genes, por ejemplo el de la biosíntesis de sorafeno, la integración de plásmidos lleva a la inactivación de este cluster por la así llamada ruptura de genes. Por lo tanto, este método permite la función de un fragmento de ADN clonado en Sorangium cellulosum a ser analizado.

Para controlar la función de los fragmentos PvuI del cósmido p98/1, se eliminan colonias transconjugantes bien desarrolladas [ver Ejemplo 2.2.2] de las placas principales con un aro de plástico estéril y se plaquean en un medio So1E selectivo que contiene canamicina [25 mg/l], fleomicina [20-35 mg/l] y estreptomicina [300 mg/l] como agentes selectivos. Luego de un tiempo de incubación [a 30ºC] de 8-10 días, se eliminan aproximadamente 1-2 x 10^{9} células con un aro de plástico estéril y se transfieren a un medio G-55 de 2 ml [sin resina].

Luego de incubación a 30ºC y 180 rpm durante 3-4 días, las muestras de cada 1 ml [1 x 4 x 10^{9} células/ml] se transfirieron a un recipiente Erlenmeyer con 10 ml del medio G55 [sin resina]. Después de incubación bajo condiciones idénticas por otros 3-4 días, se realizó otra transferencia [5 ml; 1-4 x 10^{9} células/ml] pero esta vez en un medio G55 [50 ml] que contenía adicionalmente una resina adsorbente tal como, por ejemplo, AMBERLITE XAD-1180® [ROHM & HAAS DEUTSCHLAND GmbH, Frankfurt, República Federal de Alemania]. La determinación cuantitativa del sorafeno producido tiene lugar luego de la incubación a 30ºC y 180 rpm durante 7 días.

La determinación del sorafeno se lleva a cabo sin la ayuda del análisis de HPLC. Esto implica que los cultivos se filtren inicialmente con succión a través de un filtro de poliéster [Sartorius, B 420-47-N]. La resina que queda en el filtro se resuspende luego en 50 ml de isopropanol y se extrae a 30ºC y 180 rpm durante una hora. Se elimina 1 ml de esta suspensión y se centrifuga a 12.000 rpm en un Microcentrifugador Eppendort. Se diluyen 200 \mul del sobrenadante con 600 \mul de isopropanol, y la cantidad de sorafeno contenida en el mismo se determina por medio de una HPLC con un detector de rayos UV. La longitud de onda de detección es de 210 nm.

En total, se sometieron a ensayo 35 transconjugantes diferentes con plásmidos pSN105/7 integrados, 14 transconjugantes con plásmidos pSn120/10, 18 transconjugantes con plásmidos pSn120/43-49 y 8 transconjugantes con plásmidos pSn120/46 del modo descripto anteriormente.

El análisis de HPLC reveló en este caso que todos los transconjugantes no producían más sorafeno. En contraste, el sorafeno A fue detectable en una concentración de 50-100 mg/l con los controles positivos, con la cepa del recipiente SJ3 y con la cepa transconjugante con el plásmido recombinante pSJB55.

Esto significa que, después de la integración en el ADN de Sorangium cellulosum cromosomal, todos los 4 fragmentos PvuI bloquean con claridad la producción de sorafeno. Estos fragmentos comprenden, por lo tanto, una parte de los genes que están involucrados directa o indirectamente en la síntesis de sorafeno.

5. Identificación del "cluster de genes de sorafeno" 5.1 Aislamiento de los clones de cósmido con inserciones superpuestas

Los clones con fragmentos de la inserción p98/1 producen una señal de hibridación fuerte se seleccionan con la ayuda de hibridación de colonia de acuerdo con el método descripto en el punto 1.3 del banco de genes cósmidos producidos como en el Ejemplo 1.1. Usados como sondas de hibridación están ya sea el fragmento de p98/1 1,8 Kb rotulado radioactivamente o, de otra forma, fragmentos SaII seleccionados preferiblemente que pueden se cedidos en base a la distribución de los fragmentos SaII en la parte sorangium de P98/1 a las zonas de flanqueo izquierda o derecha de la inserción p98/1.

5.2 Confirmación de la superposición de nuevos cósmidos con p98/1

Mediante el análisis de hibridación es posible identificar fragmentos que se superponen con la inserción de p98/1 en las direcciones 3' ó 5'. Estos se aislan y se utilizan para los pasos de walking subsiguientes.

El análisis de hibridación comprende los siguientes pasos específicos:

El ADN plásmido se aisla por el método descripto en el Ejemplo 1.4 de los clones de cósmido que muestran una señal fuerte en el método descripto anteriormente [comparar con 1.4]. Los plásmidos aislados se digieren luego con SaII y, en paralelo, con PvuI, y los fragmentos obtenidos de este modo se fraccionan en un gel de agarosa y posteriormente se transfieren por medio de borrón capilar de Southern [Maniatis et al., 1982; páginas 383-386] a una membrana de nitrocelulosa.

Mediante hibridación del filtro con el fragmento SaII 1,8 Kb o con un fragmento SaII de la zona de flanqueo de la inserción de p98/1 como sonda para la superposición de los nuevos clones de cósmidos es posible que sean confirmados y cedidos al lado derecho o izquierdo de la inserción de p98/1. Los métodos mencionados en la presente pueden llevarse a cabo exactamente en conformidad con las técnicas descriptas en el punto 1.4.

El número de fragmentos SaII y PvuI comunes encontrados en el plásmido p98/1 y los nuevos clones de cósmidos proveen más información acerca del tamaño de las superposiciones en la región de inserción. Es posible, cuando fuera adecuado, aislar otros cósmidos con regiones del cromosoma Sorangium cellulosum que están ubicados aún más a la izquierda o derecha del fragmento de inserción con respecto al plásmido p98/1. Para esto, se repite el procedimiento anterior con un fragmento SaII de un cósmido "derecho" o "izquierdo" relativo a la inserción p98/1 como sonda.

5.3 Análisis de función

Los fragmentos de ADN adyacentes y de superposición identificados del modo descripto anteriormente se examinan con respecto a su función en la biosíntesis de sorafeno dentro del alcance de una "ruptura de genes" tal como se describió en los Ejemplos 2.1-2.2.2. El proceso de walking con nuevos cósmidos continúa hasta que se llegue a fragmentos que no tienen efecto en la producción de sorafeno y que, por lo tanto, se ubican fuera del "cluster de genes de sorafeno". De esta forma es posible ubicar y clonar el cluster de genes completo que comprende la inserción del cósmido p98/1.

5.4 Mapeo de los fragmentos de restricción

Mediante mapeo de restricción es posible establecer la secuencia de los fragmentos de restricción resultantes y, por lo tanto, construir un mapa de restricción exacto de la región entera. En paralelo con esto, la secuencia de ADN de los fragmentos individuales se determina por el procedimiento descripto en el Ejemplo 1.6.

Declaración jurada

Los siguientes microorganismos y plásmidos han sido depositados dentro del alcance de la presente solicitud en el "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH", que está reconocido como depositario internacional en conformidad con el Tratado de Budapest, en Braunschweig (República Federal de Alemania) en cumplimiento con los requisitos del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos para los fines del procedimiento de la patente.

Microorganismo/Plásmido	Fecha de depósito	Número de depósito
PSN105/7	25-08-1992	DSM 7217
Clonado en E. coli

Soluciones de medios y buffer

Medio G51b (pH 7,4)
Glucosa	0,2%
Almidón	0,5%
[almidón de papa, tipo Noredux; CERESTAR ITALIA S.p.a., Milan, Italia]
Peptona [Laboratorios DIFCO, Estados Unidos]	0,2%
Probion S	0,1%
[Proteína celular simple; HÖCHST AG, Frankfurt, FRG]
CaCl_{2} x 2 H_{2}O	0,05%
MgSO_{4} x 7 H_{2}O	0,05%
HEPES [FLUKA]	1,2%

Medio G5lt (ph 7,4)
Glucosa	0,2%
Almidón	0,5%
[almidón de papa, tipo Noredux; CERESTAR ITALIA S.p.a., Milan, Italia]
Triptona [MARCO, Hackensack, NJ Estados Unidos]	0,2%
Probion S	0,1%
[Proteína celular simple; HÖCHST AG, Frankfurt, FRG]
CaCl_{2} x 2 H_{2}O	0,05%
MgSO_{4} x 7 H_{2}O	0,05%
HEPES [FLUKA]	1,2%

Medio G52c (pH 7,4)
Glucosa	2,0 g/l
Almidón	8,0 g/l
[almidón de papa, tipo Noredux; CERESTAR ITALIA S.p.a., Milan, Italia]
Harina de semilla de soja no oleaginosa	2,0 g/l
[MUCEDOLA S.r.l., Settimo Milanese, Italia]
Extracto de levadura	2,0 g/l
[FOULD \textamp SPRINGER, Maison Alfort, Francia]
CaCl_{2} x 2 H_{2}O	1,0 g/l
MgSO_{4} x 7 H_{2}O	1,0 g/l
Fe-EDTA [8 g/l solución stock]	1,0 ml
HEPES [FLUKA]	2,0 g/l
Agua destilada hasta	1000 ml
El pH se ajusta a 7,4 con NaOH antes de la esterilización
[120ºC durante 20 minutos]. pH luego de la esterilización: 7,4

Medio: G-55 frasco de 200 ml con 50 ml de medio
Almidón	8,0 g/l
[almidón de papa, tipo Noredux; CERESTAR ITALIA S.p.a., Milan, Italia]
Dextrina de papas [suministrado por Blattmann, Wädenswil, CH]	8,0 g/l
Glucosa	2,0 g/l
Harina de semilla de soja no oleaginosa	2,0 g/l
[MUCEDOLA S.r.l., Settimo Milanese, Italia]
Extracto de levadura	2,0 g/l
[FOULD \textamp SPRINGER, Maison Alfort, Francia]
DL-ácido aspártico (C_{4}H_{7}NO_{7})	1,0 g/l
CaCl_{2} x 2 H_{2}O	1,0 g/l
MgSO_{4} x 7 H_{2}O	1,0 g/l
HEPES (Fluka No.54461)	12,0 g/l
Fe-EDTA [8 g/l solución stock]	1,0 g/l
MZM 1 (resina)	50,0 ml/l
Agua corriente hasta	1000 ml
pH antes de esterilización: ajustar a 7,5 con NaOH
PH luego de esterilización: 7,4-7,5
Inóculo: 5 ml de un cultivo bien desarrollado
[ca 1-4 x 10^{9} células/ml]

Medio SolE (pH 7,4)
Glucosa*	0,35%
Triptona [MARCO, Hackensack, NJ Estados Unidos]	0,05%
MgSO_{4} x 7 H_{2}O	0,15%
Sulfato amónico*	0,05%
CaCl_{2} x 2 H_{2}O*	0,1%
K_{2}HPO_{4}*	0,006%
Ditionita sódico*	0,01%
Fe-EDTA*	0,0008%
HEPES [FLUKA]	1,2%
Sobrenadante de un cultivo S. cellulosum estacionario esterilizado*	3,5% (v/v)
Agar	1,5%
*La adición se lleva a cabo luego de la esterilización
pH se ajusta a 7,4 con NaOH antes de la esterilización [120ºC durante 20 minutos]

Medio LB
Triptona	10,0 g/l
Extracto de levadura	5,0 g/l
NaCl	5,0 g/l

Buffer STE (pH 8,0)
Sucrosa	25%
EDTANa_{2}	1 mM
Tris-HCl	10 mM

Buffer RLM (pH 7,6)
SDS	5%
EDTANa_{2}	125 mM
Tris-HCl	0,5 mM

Buffer TER
Tris-HCl (pH 8,0)	10 mM
l mM EDTANa_{2}	1 mM
RNAse	10 \mug/ml

Buffer de ligadura
MgCl_{2}	0,1 M
Tris-HCl (pH 7,8)	0,5 M

Buffer de lisis [pH 7,6]
Sarkosil de sodio	5%
Na_{2}-EDTA	125 mM
Tris-HCl	0,5 M

Buffer TE
Tris-HCl [pH 8,0]	10 mM
Na_{2}EDTA	1 mM

Listado de referencias

Bibb M et al, Gene 30 157-166, 1984

Birnboim und Doly, Nucl Acids Res 7 1513-1523, 1979

Breton AM et al, J Bacteriol, 161: 523-528 (1985)

Breton AM et al. J Biotechnol, 4: 303-311 (1986)

Breton AM und Guespin-Michel JF, FEMS Microbiol Lett, 40: 183-188 (1987)

Datta N et al, J Bacteriol 108: 1244-1249 (1971)

Haymes BT et al, Nucleic Acid Hybridisation a Practical Approach, IRL Press, Oxford, England (1985)

Hedges RW and Matthew M, Plasmid 2, 269-278, 1979

Hohn B und Collins J, Gene 11, 291, 1980

Hopwood et al, "Genetic Manipulaúon of Streptomyces a Laboratory Manual" The John Innes Foundation, Norwich UK, 1985

Jaoua S et al, Plasmid 18: 111-119 (1987)

Jaoua S et al, Plasmid 23: 183-193 (1990)

Jaoua S et al, Plasmid 28: 157-165 (1992)

Kaiser D, Genetics of Myxobacteria, in: "Myxobacteria: Development and Cell Interactions", ed E Rosenberg, pp 163-184, Springer Verlag, Berlin/New York (1984);

Kuner JM und Kaiser D, Proc Natl Acad Sci USA, 78 425-429 (1981)

Kuspa und Kaiser, J Bacteriol Vol 171(5), 2762-2772 (1989)

Malpartida und Hopwood [Nature 309, 462-464, 1984).

Maxam and Gilbert, "Sequencing end-labelled DNA with base-specific chemical cleavage", in: Methods in Enzymology 65: 499-560, Academic Press, New York, London, (1980).

Maniatis T, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Habor, NY (1982)

O'Conner KA und Zusman DR, J Bacteriol, 155: 317-329 (1983)

Reichenbach et al. Trends in Bilotechnology, Vol 6(6), (1988)

Rigby DWJ et al, J Mol Biol 113, 237-251, 1977

Sherman D et al, EMBO J 8, 2717-2725, 1989

Shlmkets LJ et al, Proc Natl Acad Sci USA, 80: 1406-1410 (1983)

Simon R et al. Bior/Technol. Nov 83, 784-791, 1983

Smith CL et al, Methods Enzymol 151, 461-489 (1987)

Schupp T et al, Gene 64 179-188, 1988

Schupp T et al, FEMS Microbiol Letters 36, 237-251, 1986

Wahl GM et al, Proc Natl Acad Sci, USA 84, 2160-2164 (1987

Ward et al, Mol Gen Genet 203, 468-478, 1986

Bibliografía sobre patentes

EP-A 0 358 606

US-P 4,910,140

WO 87/03907

(1) INFORMACION GENERAL:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE

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(A)

NOMBRE: CIBA-GEIBY AG

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(B)

CALLE: Klybeckstr. 141

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(C)

CIUDAD: Basilea

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(E)

PAIS: Suiza

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(F)

CODIGO POSTAL: 4002

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(G)

TELEFONO: + 41 61 69 11 11

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(H)

TELEFAX: + 41 61 696 79 76

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(I)

TELEX: 962 991

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(ii)

TITULO DE LA INVENCION: Secuencias de ADN implicadas en la biosíntesis del metabolito secundario por acción de mixobacterias

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

NUMERO DE SECUENCIAS: 3

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(iv)

FORMA LEGIBLE POR COMPUTADORA

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(A)

TIPO DE MEDIO: disco floppy

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(B)

COMPUTADORA: IBM compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

SOFTWARE: Patentin Release #1,0, Versión #1,25 (EPO)

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEC ID NO: 1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 784 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

HEBRA: doble

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Sorangium cellulosum

\vskip0.666000\baselineskip

(vii)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CLON: clon cósmido p98/1

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..784

OTRA INFORMACION: /producto = "Constituyente del cluster de genes de sorafeno"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEC ID NO: 1:

2

3

INFORMACION PARA SEC ID NO: 2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

HEBRA: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..17

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

OTRA INFORMACION: /producto = "oligo sintético"

/rótulo = Olil

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TACTGGTATC GAAACCT

\hfill

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA LA SEC ID NO: 3:

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

HEBRA: única

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA. lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLECULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

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(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..17

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

OTRA INFORMACION: /producto = "oligo sintético"

/rótulo = Oli2

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 3:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GAAGACGACG TGGTCTT

\hfill

Claims (36)

1. Un fragmento de ADN de un genoma mixobacteriano que comprende una región de ADN que comprende por lo menos un gen que participa directa o indirectamente en la biosíntesis de sorafeno, incluyendo las regiones adyacentes de ADN de la derecha y de la izquierda, que, debido a su función en relación con la biosíntesis de sorafeno y según se reveló, son constituyentes del "cluster de genes de sorafeno" y que pueden ser identificadas con la ayuda del fragmento BamHI de 4,6 Kb de la región gral del cluster de genes de granaticina de Streptomyces violaceoruber Tü22 como sonda de hibridación dentro del banco genómico.

2. Un fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual dicha región de ADN puede obtenerse a partir de un cluster de genes que es responsable de la biosíntesis de sorafeno en el genoma de una mixobacteria del grupo sorangium/polyangium.

3. Un fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual dicha región de ADN puede obtenerse a partir de un cluster de genes que es responsable de la biosíntesis del sorafeno en el genoma de S. cellulosum.

4. Un fragmento de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el cual dicho fragmento comprende una región de ADN SaII de 1,8 Kb que puede obtenerse a partir del genoma de Sorangium cellulosum y que comprende la parte de la secuencia nucleotídica descripta en la SEC. ID. NO 1, así como todas las demás secuencias de ADN que participan directa o indirectamente en la biosíntesis de sorafeno y que, debido a las homologías presentes, pueden ser consideradas equivalentes estructurales y funcionales, y por lo tanto son capaces de hibridarse con esta secuencia.

5. Un fragmento de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el cual dicho fragmento comprende una región de ADN PvuI de aproximadamente 6,5 Kb que puede obtenerse a partir del genoma de Sorangium cellulosum y tiene el patrón de restricción descripto en la Figura 1 y adicionalmente incluye la región de 1,8 Kb caracterizada en detalle anteriormente.

6. Un fragmento de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el cual dicho fragmento comprende una región de ADN que comprende por lo menos un gen que participa directa o indirectamente en la biosíntesis de sorafeno, incluyendo las regiones adyacentes de ADN de la derecha y de la izquierda, que tienen homologías con el fragmento BamHI de 4,6 Kb de la región gral del cluster de genes de granaticina [ORF 1-4] de Streptomyces violaceoruber Tü22 y que por ende pueden ser halladas por medio del uso de este fragmento de 4,6 Kb o de partes de este fragmento como sonda de hibridación dentro de un banco genómico de un organismo productor de sorafeno.

7. Un fragmento de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el cual dicho fragmento de ADN comprende exclusivamente ADN genómico.

8. Un fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 4, en el cual dicho fragmento de ADN de 1,8 Kb es un fragmento SaII del genoma de Sorangium cellulosum.

9. Un fragmento de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende la parte de la secuencia nucleotídica descripta en SEC ID NO. 1, o una secuencia que participa directa o indirectamente en la biosíntesis de sorafeno y que, debido a las homologías presentes, pueden ser consideradas equivalentes estructurales y funcionales de dicha parte de la secuencia, y por lo tanto son capaces de hibridarse con esta secuencia.

10. Un fragmento de ADN que tiene la secuencia de nucleótidos descripta en SEC ID. NO. 1.

11. Un fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 5, en el cual dicho fragmento de ADN de aproximadamente 6,5 Kb es un fragmento PvuI del genoma de Sorangium cellulosum.

12. Una molécula de ADN recombinante que comprende uno de los fragmentos de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

13. Un vector que comprende uno de los fragmentos de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

14. Un vector de acuerdo con la reivindicación 13, que es un vector de transformación.

15. Un vector de acuerdo con la reivindicación 13, que es un vector de expresión.

16. Un organismo huésped que comprende un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15.

17. Un método para la identificación, el aislamiento y la clonación de un fragmento de ADN que puede ser obtenido a partir de un cluster de genes, que es responsable de la biosíntesis de sorafeno, dentro del genoma de S. cellulosum y que comprende por lo menos un gen que participa directa o indirectamente en la biosíntesis de sorafeno, dicho método esencialmente comprende las siguientes medidas:

(a)

la construcción de una colección de genes representativos de un organismo productor de sorafeno del grupo de mixobacterias, que esencialmente comprende la totalidad del genoma bacteriano distribuido en clones individuales;

(b)

el rastreo de dichos clones usando una sonda de ADN específica del fragmento BamHI de 4,6 Kb de la región gral del cluster de genes de granaticina de Streptomyces violaceoruber Tü22 o del ADN de acuerdo con la reivindicación 1, que se hibrida por lo menos con una parte del cluster de genes que participa directa e indirectamente en la síntesis de sorafeno, incluyendo las regiones adyacentes de ADN de la derecha y de la izquierda, que, debido a su función en relación con la biosíntesis de sorafeno y según se reveló, son constituyentes del "cluster de genes de sorafeno";

(c)

la selección de aquellos clones que exhiban una señal de hibridación con la sonda ADN, y

(d)

el aislamiento de un fragmento de ADN de dicho clon, que comprende por lo menos un gen que participa directa o indirectamente en la biosíntesis de sorafeno.

18. Un método de acuerdo con la reivindicación 17, en el cual dicho organismo productor de sorafeno es una mixobacteria del grupo sorangium/polyangium.

19. Un método de acuerdo con la reivindicación 17, en el cual dicho organismo productor de sorafeno es Sorangium cellulosum.

20. Un método de acuerdo con la reivindicación 17, en el cual dicha colección de genes es una genoteca.

21. Un método de acuerdo con la reivindicación 17, en el cual dicha sonda de hibridación es un fragmento de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.

22. Un método de acuerdo con la reivindicación 17, en el cual dicha sonda de hibridación es un fragmento de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11.

23. Un método de acuerdo con la reivindicación 17, en el cual las secciones de secuencia que se originan a partir de las regiones flanqueadoras, ubicadas a la derecha y a la izquierda de dichos fragmentos de ADN se usan como sonda de hibridación.

24. Un método de acuerdo con la reivindicación 17, en el cual la función del fragmento de ADN, aislado de acuerdo con el punto (d), en la biosíntesis de sorafeno se detecta dentro del alcance de investigaciones de ruptura de genes.

25. Un método para la identificación y el aislamiento de todas aquellas secuencias de ADN que participan en la construcción del "cluster de genes de sorafeno" que flanquea la región inicial o de comienzo, el cual comprende:

(a)

la construcción de una colección de genes representativos de un organismo productor de sorafeno a partir del grupo de mixobacterias, que esencialmente comprende la totalidad del genoma bacteriano distribuido en clones individuales;

(b)

la hibridación de dichos clones usando uno de los fragmentos de ADN previamente aislados de acuerdo con la reivindicación 1 o partes seleccionadas de los mismos como molécula sonda, que se superponen por lo menos con una parte de las regiones de ADN adyacentes ubicadas a la derecha y a la izquierda, respectivamente, dentro del "cluster de genes de sorafeno";

(c)

la selección de aquellos clones que exhiban una fuerte señal de hibridación con la sonda de ADN;

(d)

el aislamiento de los fragmentos que comprenden regiones de ADN superpuestas de los clones seleccionados de acuerdo con el punto (c) y el aislamiento del fragmento que sobresale pasando la región de superposición;

(e)

el ensayo de los fragmentos de ADN aislados de acuerdo con el punto (d) para determinar su capacidad para funcionar dentro del "cluster de genes de sorafeno";

(f)

si es posible la detección de una función del fragmento de ADN aislado de acuerdo con el punto (d) dentro del alcance de la biosíntesis de sorafeno, la repetición del método de acuerdo con las etapas (a) a (e), en donde el fragmento de ADN aislado de acuerdo con el punto (d), o partes seleccionadas del mismo, pero especialmente las de la región flanqueadora de la derecha o de la izquierda de dicho fragmento, funcionan en este caso como sonda de ADN, hasta que una función en la biosíntesis de sorafeno no puede detectarse dentro del alcance del ensayo de función sobre el fragmento de ADN en particular recientemente aislado, alcanzando por lo tanto el final del cluster de genes; y

(g)

la ejecución del método de acuerdo con las etapas (a) a (f), si corresponde, en la otra dirección que no fue previamente seleccionada.

26. Un método de acuerdo con la reivindicación 25, en el cual dicho organismo productor de sorafeno es una mixobacteria del grupo sorangium/polyangium.

27. Un método de acuerdo con la reivindicación 25, en el cual dicho organismo productor de sorafeno es Sorangium cellulosum.

28. Un método de acuerdo con la reivindicación 25, en el cual dicha colección de genes es una genoteca.

29. Un método de acuerdo con la reivindicación 25, en el cual dicha sonda de hibridación es un fragmento de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.

30. Un método de acuerdo con la reivindicación 25, en el cual dicha sonda de hibridación es un fragmento de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11.

31. Un método de acuerdo con la reivindicación 25, en el cual la secciones de secuencia que se originan a partir de regiones flanqueadoras, ubicadas a la derecha y a la izquierda de dichos fragmentos de ADN se usan como sonda de hibridación.

32. Un método de acuerdo con la reivindicación 25, en el cual se identifica un fragmento adecuado en la etapa (d) por medio de análisis de hibridación.

33. Un método de acuerdo con la reivindicación 25, en el cual la función del fragmento de ADN aislado de acuerdo con el punto (d), en la biosíntesis de sorafeno se detecta dentro del alcance de investigaciones de ruptura de genes.

34. Una molécula sonda que comprende partes seleccionadas de las regiones de ADN que están ubicadas en un fragmento de ADN de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 11 para hallar regiones adyacentes que se superponen con dichas regiones de ADN.

35. Una sonda molécula de acuerdo con la reivindicación 34, en la cual dichas partes seleccionadas se pueden obtener a partir de las regiones flanquedoras, ubicadas a la derecha y a la izquierda de dichas regiones de ADN.

36. El uso de un fragmento de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 como molécula sonda en un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 25.