ES2201077T3 - Metodo y espectrometro de masas para la desorcion e ionizacion de analitos. - Google Patents

Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE EN GENERAL A METODOS Y APARATOS PARA LA DESORCION E IONIZACION DE SUSTANCIAS DE ANALISIS CON EL FIN DE PODER REALIZAR A CONTINUACION UN ANALISIS CIENTIFICO SEGUN TALES METODOS, POR EJEMPLO, UNA ESPECTROMETRIA DE MASA O BIODETECTORES. DE MANERA MAS ESPECIFICA, ESTA INVENCION SE REFIERE AL CAMPO DE LA ESPECTROMETRIA DE MASA, ESPECIALMENTE AL TIPO DE ESPECTROMETRIA DE MASA POR TIEMPO DE VUELO DE DESORCION/IONIZACION LASERICA ASISTIDA POR UNA MATRIZ UTILIZADA PARA ANALIZAR MACROMOLECULAS, TALES COMO PROTEINAS O BIOMOLECULAS. DE MANERA MAS ESPECIFICA, ESTA INVENCION SE REFIERE A LA GEOMETRIA DE SONDAS PARA MUESTRAS, A LA COMPOSICION DE SONDAS PARA MUESTRAS Y A QUIMICAS DESDE LAS SUPERFICIES DE LAS SONDAS PARA MUESTRAS QUE PERMITEN LA CAPTURA Y DESORCION SELECTIVA DE SUSTANCIAS DE ANALISIS, INCLUIDAS LA MACROMOLECULAS INTACTAS, DIRECTAMENTE DESDE LA SUPERFICIE DE LA SONDA A LA FASE DE GAS (VAPOR) SIN LA UTILIZACION DE UNA MATRIZ QUIMICA AÑADIDA.

Description

Método y espectrómetro de masas para la desorción e ionización de analitos.

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere generalmente a métodos y aparatos para desorción e ionización de analitos con el fin de un análisis científico subsiguiente mediante tales métodos, por ejemplo, como espectrometría de masas (MS) o biosensores. Generalmente, el análisis mediante espectrometría de masas implica la vaporización e ionización de una pequeña muestra de material, usando una fuente de alta energía, tal como un láser, incluyendo un haz de láser. El material se vaporiza de la superficie de la punta de una sonda a la fase gaseosa o de vapor por el haz de láser, y, en el procedimiento, algunas de las moléculas individuales se ionizan por la ganancia de un protón. Las moléculas ionizadas cargadas positivamente se aceleran entonces a través de un corto campo de alto voltaje, y se deja que vuelen (que sean arrastradas) a una cámara de alto vacío, en cuyo extremo más alejado chocan con una superficie detectora sensible. Puesto que el tiempo de vuelo es una función de la masa de la molécula ionizada, se puede usar el tiempo transcurrido entre la ionización y el impacto para determinar la masa de la molécula que, a su vez, se puede usar para identificar la presencia o ausencia de moléculas conocidas de masa específica.

Todos los procedimientos conocidos de la técnica anterior, que presentan proteínas u otras biomoléculas grandes en una punta de una sonda para la espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción/ionización por láser (TOF), se basan en la preparación de una mezcla sólida cristalina de la proteína u otra molécula de analito en un gran exceso molar de material matriz ácido depositado sobre la superficie desnuda de una punta de sonda metálica. (La punta de la sonda para muestra es típicamente metálica, bien de acero inoxidable, de material chapado con níquel, o platino). Se pensó que era necesario embeber el analito en tal matriz a fin de evitar la destrucción de las moléculas del analito por el haz de láser. El haz de láser golpea a la mezcla sólida sobre la punta de la sonda y su energía se usa para vaporizar una pequeña porción del material de la matriz junto con algunas de las moléculas del analito embebidas. Sin la matriz, las moléculas del analito son fácilmente fragmentadas por la energía del láser, de forma que es muy difícil o imposible determinar la masa y la identidad de la macromolécula original.

Este procedimiento de la técnica anterior tiene varias limitaciones que han evitado su adaptación al análisis molecular automatizado de proteínas o de otras moléculas macrobiológicas. En primer lugar, en una mezcla muy bruta es necesario fraccionarla parcialmente (o de otro modo purificar la muestra tanto como sea posible) para eliminar la presencia de materiales extraños excesivos en la mezcla cristalina o sólida de matriz/analito. La presencia de grandes cantidades de componentes puede disminuir la señal iónica (bien desorción, ionización y/o detección) del analito seleccionado. Tal purificación consume tiempo, es cara, típicamente da como resultado una recuperación pobre (o pérdida completa) del analito, y sería muy difícil de realizar en un analizador automatizado.

En segundo lugar, aunque la cantidad de material del analito necesaria para el análisis mediante el método de la técnica anterior no es grande (típicamente en un intervalo de picomoles), en algunas circunstancias tales como en ensayos en pacientes pediátricos, los fluidos del analito están disponibles sólo en volúmenes extremadamente pequeños (microlitros) y se pueden necesitar para realizar varios análisis diferentes. Por lo tanto, incluso la pequeña cantidad (es decir, volumen) necesaria para la preparación de la mezcla cristalina de analito/matriz para un único análisis puede ser significativa. También, sólo se consume realmente en la desorción o en el análisis espectrométrico de masas una fracción minúscula (unos pocos miles o menos) de analito usado para preparar la mezcla sólida de analito/matriz para uso en la punta de la sonda. Cualquier mejora en el procedimiento de la técnica anterior que haga posible 1) usar mucho menos analito, 2) colocar el analito o múltiples analitos en la punta de la sonda o en su superficie en una localización predeterminada, 3) realizar análisis repetidos de la misma alícuota del analito (por ejemplo, antes y después de una o más reacciones químicas y/o enzimáticas), y 4) realizar el ensayo de una manera más cuantitativa, sería altamente ventajoso en muchas áreas clínicas.

En tercer lugar, la proteína del analito, u otra macromolécula, usada para preparar la disolución sólida de analito/matriz para uso en la punta de la sonda no es adecuada para cualquier ensayo o procedimiento químico subsiguiente debido a que está unida (es decir, embebida) en el material de la matriz. También, todo el material de la matriz usado hasta la fecha es fuertemente ácido, de forma que afectaría adversamente a muchas reacciones químicas que se pudieran intentar en la mezcla a fin de modificar las moléculas del analito para examen subsiguiente. Cualquier mejora en el procedimiento que haga posible realizar modificaciones o reacciones químicas subsiguientes en las moléculas del analito, sin retirarlas de la matriz o de la punta de la sonda o sin formar una "matriz" todo en conjunto, sería de un beneficio enorme para los investigadores y profesionales clínicos.

Las primeras medidas con éxito de la masa molecular de péptidos intactos y pequeñas proteínas (de sólo hasta alrededor de 15 kDa), por cualquier forma de espectrometría de masas, se obtuvieron bombardeando superficies con partículas de alta energía (espectrometría de masas con desorción por plasma y por bombardeo con átomos rápidos); este adelanto importante se produjo en 1981 y 1982. Las mejoras llegaron en 1985 y 1986, y sin embargo el rendimiento (intensidades de la señal), sensibilidad, precisión y exactitud de la masa permanecieron relativamente bajos. No se observaron proteínas de masa molecular más elevada (alrededor de 20 a 25 kDa), excepto en ocasiones raras; con estos métodos nunca se observaron proteínas que tuvieran pesos moleculares medios (aproximadamente 70 kDa). De este modo, continuó siendo irrealizable la evaluación de la mayoría de las proteínas mediante espectrometría de masas.

En 1988, Hillenkamp y sus colaboradores usaron espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser de ultravioleta, y descubrieron que, cuando las proteínas de masa molecular relativamente elevada se depositaban en la punta de la sonda en presencia de un exceso molar muy grande de una matriz química ácida, que absorbe la luz UV (ácido nicotínico), se podían desorber en estado intacto. Esta nueva técnica se denomina espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción/ionización por láser asistida por una matriz (MALDI). Obsérvese que la espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser (sin la matriz química) ya existía desde algún tiempo; sin embargo, no tenía éxito o muy poco determinando los pesos moleculares de grandes biopolímeros intactos tales como proteínas y ácidos nucleicos, debido a que se fragmentaban (destruían) con la desorción. De este modo, antes de la introducción de una matriz química, la espectrometría de masas con desorción por láser era esencialmente inútil para la detección de cambios específicos en la masa de macromoléculas intactas. Obsérvese que la formación aleatoria de cristales de la matriz y la inclusión aleatoria de moléculas de analito en la disolución sólida es técnica anterior.

Existe un número de problemas y limitaciones con los métodos de la técnica anterior. Por ejemplo, previamente, se ha encontrado que es difícil lavar contaminantes presentes en el analito o en la matriz. Otros problemas incluyen la formación de aductos iónicos de analito-sal, una solubilidad menos que óptima del analito en la matriz, una localización y concentración desconocidas de moléculas de analito en la matriz sólida, la supresión o "envenenamiento" de la señal (ion molecular) debido a la presencia simultánea de múltiples componentes, y la desorción/ionización selectiva del analito. Los investigadores anteriores, incluyendo Karas y Hillenkamp han dado a conocer una variedad de técnicas para la detección de analitos usando espectroscopía de masas, pero estas técnicas padecían de limitaciones inherentes en la sensibilidad y selectividad de las técnicas, que incluyen específicamente limitaciones en la detección de analitos en muestras no diferenciadas, de bajo volumen. (Hillenkamp, Bordeaux Mass Spectrometry Conference Report, p. 354-62 (1988); Karas y Hillenkamp, Bordeaux Mass Spectrometry Conference Report, p. 416-17 (1988); Karas y Hillenkamp, Analytical Chemistry, 60:2299 (1988); Karas, et al., Biomed. Environ. Mass Spectrum (en prensa)). El uso de haces de láser en espectrómetros de masa de tiempo de vuelo se muestra, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. nº 4.694.167; 4.686.366, 4.295.046 y 5.045.694.

La volatilización con éxito de biopolímeros de elevado peso molecular, sin fragmentación, ha permitido que se analice mediante espectrometría de masas una amplia variedad de macromoléculas biológicas. De forma más importante quizás, ha ilustrado el potencial de usar la espectrometría de masas de forma más creativa para resolver problemas encontrados rutinariamente en la investigación biológica. La atención más reciente se ha centrado en la utilidad de la espectrometría de masas (MS) de tiempo de vuelo (TOF) con desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI), principalmente debido a que es rápida (minutos), sensible (se requieren muestras de < picomoles), y permite que se analicen mezclas complejas.

Aunque la MS de MALDI-TOF continúa siendo útil para la determinación/verificación estática de masas para analitos individuales, en el caso de biopolímeros a menudo son las diferencias en la masa las que proporcionan la información más importante sobre las estructuras desconocidas. De este modo, para uso rutinario en biología estructural, una limitación desafortunada de la técnica de MS MALDI-TOF se refiere a la preparación y presentación (deposición) de la muestra sobre una superficie de la sonda inerte, específicamente, el requisito de que los analitos sean embebidos (es decir, co-solidificados) en la superficie de la sonda en una matriz recientemente preparada de ácido orgánico cristalino. La distribución aleatoria del analito en una disposición heterogénea de matriz cristalina en la superficie de la sonda requiere la deposición de mucho más analito o muestra que la necesaria para el proceso de desorción por láser, incluso para la recogida de espectros de masas más que adecuados (por ejemplo, múltiples conjuntos de 100 disparos cada uno). La porción que queda del analito habitualmente no se recupera para análisis adicionales o caracterizaciones subsiguientes. Incluso aunque se requieren típicamente 1 a 10 pmoles (algunas veces menos) del analito para la deposición en la superficie de la sonda, se ha estimado que se consumen durante la desorción por láser menos de unos pocos atomoles. De este modo, sólo 1 parte en 10^{5} ó 10^{6} del analito aplicado puede ser necesaria; el resto se pierde.

Otra pérdida importante de datos potenciales asociada con el embebimiento del analito en una matriz sólida es la reducción o la eliminación completa de la capacidad para realizar modificaciones químicas y/o enzimáticas subsiguientes al analito embebido (por ejemplo, proteína o ADN) que permanece en la superficie de la sonda. Sólo otra alícuota de analito, o la capacidad para recuperar el analito embebido libre de la matriz (difícil, con una pobre recuperación), permite realizar lo que se denomina ahora como espectrometría de masas diferencial para derivar datos estructurales.

Además, ha habido una aplicación limitada de MS en los campos biológicos, probablemente debido al hecho de que muchos biólogos y clínicos están intimidados por la MS y/o son escépticos con respecto a su utilidad. Además, la MS se percibe como inaccesible o demasiado costosa, particularmente debido a que la electroforesis en gel de poliacrilamida SDS es un sustituto adecuado, en algunos casos en los que se podría aplicar MALDI (por ejemplo, separación de fluidos biológicos brutos). Además, la MALDI ha sido poco explicada en revistas biológicas y clínicas.

Sumario de la invención

Un objeto de la invención es proporcionar métodos mejorados, composiciones de materiales y aparatos para la adsorción, desorción e ionización acopladas de múltiples analitos o de analitos seleccionados a la fase gaseosa (vapor).

Otro objeto es proporcionar un método y aparato para la detección de analitos dirigida a la afinidad, que incluye la desorción e ionización de analitos en los que el analito no está disperso en una disolución de matriz o en una estructura cristalina sino está presente dentro, sobre o por encima de una superficie unida de material "matriz" que absorbe energía, a través de sucesos de reconocimiento molecular, en una posición en la que es accesible y receptivo a una variedad amplia de reacciones de modificación o reconocimiento químicas, físicas y biológicas.

Otro objeto es proporcionar tal método y aparato en el que el material del analito está unido químicamente o adherido físicamente a un sustrato que forma una superficie de presentación de la muestra en la punta de una sonda.

Un objeto adicional es proporcionar un medio para la modificación de superficies de presentación de la muestra, cuya modificación se realiza con moléculas que absorben energía, para permitir la desorción con éxito de moléculas del analito sin adición de moléculas de matriz exógena como en la técnica anterior.

Un objeto adicional es proporcionar la densidad apropiada de moléculas que absorben energía enlazadas (covalente o no covalentemente) en una variedad de geometrías, de forma que se usan monocapas y múltiples capas de moléculas unidas que absorben energía para facilitar la desorción de moléculas del analito de masas variables.

Un objeto adicional es proporcionar múltiples combinaciones de superficies modificadas con moléculas que absorben energía, dispositivos de captura de analitos dirigidos a la afinidad, fototubos, etc.

Un objeto adicional es proporcionar tal método y aparato en el que el sustrato que forma la punta de la sonda u otra superficie de presentación de la muestra, se derivatiza con uno o más reactivos de afinidad (una variedad de densidades y grados de amplificación) para el enlace selectivo con analitos predeterminados o clases de analitos.

Un objeto adicional es proporcionar tal sistema en el que el reactivo de afinidad se enlaza químicamente o se adhiere biológicamente al analito diana o a la clase de analitos.

Aún un objeto adicional es proporcionar un método y aparato para la desorción e ionización de analitos en el que la porción sin usar de los analitos contenida en la superficie de presentación de la muestra permanece químicamente accesible, de forma que se puede realizar una serie de tratamientos químicos, enzimáticos o físicos del analito, seguido de los análisis secuenciales del analito modificado.

Un objeto adicional es proporcionar un método y aparato para las modificaciones químicas o enzimáticas combinadas de analitos diana con el fin de elucidar la estructura primaria, secundaria, terciaria o cuaternaria del analito y sus componentes.

Otro objeto es proporcionar un método y aparato para la desorción e ionización de materiales del analito, en el que se utilizan cationes distintos de protones (H^{+}) para la ionización de macromoléculas de analitos.

En consecuencia, la presente invención proporciona una sonda que es insertable de forma retirable en un espectrómetro de masas, teniendo la sonda una superficie de presentación de la muestra para exponer un analito a una fuente de energía que emite energía capaz de desorber/ionizar el analito de la sonda para la detección del analito, en la que la mencionada superficie se derivatiza con un reactivo de afinidad que es capaz de unirse al analito y que se selecciona de iones metálicos, ácidos nucleicos, péptidos, hidratos de carbono, proteínas y sus combinaciones, y en la que se proporciona sobre la superficie mencionada un material matriz que ayuda a la desorción/ionización, en asociación con el reactivo de afinidad.

La superficie de presentación de la muestra se puede seleccionar de metal revestido con un polímero sintético, vidrio, producto cerámico, polímeros sintéticos y biopolímeros. De este modo, la superficie de presentación de la muestra puede ser un metal que tiene un revestimiento de dextrano o agarosa reticulados, nailon, polietileno o poliestireno.

El reactivo de afinidad puede ser un anticuerpo, una lectina, un ión de Cu(II) o un ión Fe(III). El analito puede comprender biomoléculas, y dicho reactivo de afinidad se puede adaptar para aislar selectivamente dichas biomoléculas a partir de una muestra biológica no diferenciada.

Se pueden proporcionar, sobre la superficie de presentación de la muestra, reactivos de afinidad dispuestos en una disposición predeterminada para la adsorción selectiva de analitos diferentes. Se proporciona sobre la superficie de presentación de la muestra un material matriz que ayuda a la desorción/ionización, en asociación con el reactivo de afinidad. El material matriz puede tener un pH por encima de 6,0. El material matriz puede ser ácido nicotínico o ácido sinapínico. Se puede proporcionar una sonda de la invención con el analito unido al reactivo de afinidad.

La invención también proporciona un espectrómetro de masas para detectar un analito, que comprende:

(a) una sonda de la invención que tiene el analito unido al reactivo de afinidad;

(b) una fuente de energía para dirigir energía a la superficie de presentación de la muestra de la sonda, para desorber/ionizar el analito; y

(c) medios para detectar el analito desorbido.

Tal espectrómetro de masas puede comprender además:

un tubo de espectrómetro;

medios de vacío para aplicar vacío al interior de dicho tubo;

medios de potencial eléctrico dentro del tubo para aplicar un potencial acelerador a las moléculas del analito desorbidas; y

una muestra de analito unida mediante el reactivo de afinidad sobre dicha superficie de presentación de la muestra de la sonda, con lo que al menos una porción de dichas moléculas del analito no consumidas en dicho análisis de espectrometría de masas permanece accesible para procedimientos químicos, biológicos o físicos analíticos subsiguientes;

en el que dicha fuente de energía comprende un medio de haz de láser para producir un haz de láser dirigido a dicha muestra de analito para dar suficiente energía para desorber e ionizar una porción de dichas moléculas de analito de la mencionada muestra de analito; y

en el que dicho medio de detección comprende medios asociados con dicho espectrómetro para detectar el impacto de moléculas del analito ionizadas, aceleradas, sobre ellos.

La invención proporciona además un método para detectar un analito, que comprende:

(a) proporcionar un espectrómetro de masas de la invención;

(b) desorber al menos una porción del analito de la superficie de presentación de la muestra, de la sonda del espectrómetro de masas exponiendo al analito a energía procedente de la fuente de energía; y

(c) detectar el analito desorbido con los medios de detección.

El método puede comprender además, tras la etapa (c) de detección, la etapa de realización de un procedimiento químico o biológico en la porción de dicho analito no desorbida, para alterar la composición de dicha porción de dicho analito no desorbida; y repetir las etapas (b) y (c) con respecto a dicho analito alterado.

El método de detección de la invención puede comprender, de este modo:

(i) proporcionar una sonda que se puede insertar de forma retirable en un espectrómetro de masas, teniendo la sonda una superficie de presentación de la muestra, para exponer un analito a una fuente de energía que emite energía capaz de desorber/ionizar al analito de la sonda para la detección del analito;

(ii) derivatizar dicha superficie de presentación de la muestra, con un reactivo de afinidad que es capaz de unirse al analito y que se selecciona de iones metálicos, ácidos nucleicos, péptidos, hidratos de carbono, proteínas y sus combinaciones;

(iii) exponer dicha superficie derivatizada, de presentación de la muestra, a una fuente de dicho analito para unir dicho analito a ella;

(iv) depositar sobre dicha superficie de presentación de la muestra un material matriz, que ayuda a la desorción/ionización, en asociación con el reactivo de afinidad;

(v) colocar la superficie derivatizada de presentación de la muestra con dichas moléculas del analito unidas a ella en un extremo de un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo y aplicar vacío y un campo eléctrico para formar un potencial acelerador dentro del espectrómetro;

(vi) golpear al menos una porción de las moléculas del analito unidas a dicha superficie derivatizada de presentación de la muestra, dentro del espectrómetro, con uno o más pulsos de láser a fin de desorber iones de dichas moléculas de analito de dicha sonda;

(vii) detectar la masa de los iones mediante su tiempo de vuelo en dicho espectrómetro de masas; y

(viii) presentar en una pantalla tal masa detectada.

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La presente invención proporciona adicionalmente:

- un método para preparar una sonda de la invención, método el cual comprende:

(i) proporcionar una sonda que se puede insertar de forma retirable en un espectrómetro de masas, teniendo la sonda una superficie de presentación de la muestra para exponer un analito a una fuente de energía que emite energía capaz de desorber/ionizar el analito de la sonda para la detección del analito;

(ii) derivatizar dicha superficie de presentación de la muestra, con un reactivo de afinidad que es capaz de unirse al analito y que se selecciona de iones metálicos, ácidos nucleicos, péptidos, hidratos de carbono, proteínas y sus combinaciones; y

(iii) depositar sobre dicha superficie de presentación de la muestra un material matriz que ayuda a la desorción/ionización, en asociación con el reactivo de afinidad;

- un método para capturar un analito en una sonda para un espectrómetro de masas, método el cual comprende:

- proporcionar una sonda que se puede insertar de forma retirable en un espectrómetro de masas, teniendo la sonda una superficie de presentación de la muestra para exponer un analito a una fuente de energía que emite energía capaz de desorber/ionizar el analito de la sonda para la detección del analito, en la que dicha superficie se derivatiza con un reactivo de afinidad que es capaz de unirse al analito y que se selecciona de iones metálicos, ácidos nucleicos, péptidos, hidratos de carbono, proteínas y sus combinaciones,

- exponer dicha superficie de presentación de la muestra de la sonda a una muestra que contiene dicho analito; y

- depositar sobre dicha superficie de presentación de la muestra un material matriz que ayuda a la desorción/ionización, en asociación con el reactivo de afinidad;

- uso de una sonda de la invención en espectrometría de masas; y

- uso de una sonda de la invención en un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo con desorción/ionización por láser.

Serán manifiestos otros objetos, características y ventajas, y la invención se entenderá más fácilmente a partir de la lectura de la siguiente memoria descriptiva y mediante referencia a los dibujos que se acompañan y que forman parte de la misma, en la que los ejemplos de las realizaciones actualmente preferidas de la invención se dan con fines de descripción.

Breve descripción de los dibujos

Los objetos y ventajas anteriores y otros objetos y ventajas de la invención serán manifiestos a partir de la siguiente memoria descriptiva y a partir de los dibujos que se acompañan.

La Figura 1A (perfil superior) muestra el espectro de masas de los tres péptidos (dominios de unión a metal de glicoproteína rica en histidina humana (GHHPH)_{2}G (1206 Da), (GHHPH)_{5}G (2904 Da), y dominio de dimerización de receptor de estrógenos humano (D473-L525) (6168,4 Da)) desorbidos en presencia de moléculas neutralizadas que absorben energía (ácido sinapínico, pH 6,2). La Figura 1B (perfil inferior) muestra la unión secuencial in situ a cobre metálico de los péptidos en presencia de moléculas neutras que absorben energía.

La Figura 2A (perfil superior) muestra el espectro de masas del fosfopéptido de caseína humana (5P, 2488 Da) desorbido en presencia de moléculas neutralizadas que absorben energía (ácido sinapínico, pH 6,5). La Figura 2B (segunda desde el perfil superior) muestra la digestión secuencial in situ con fosfatasa alcalina durante 5 minutos para eliminar grupos fosfato del fosfopéptido. La Figura 2C (tercera desde el perfil superior) muestra el espectro de masas del fosfopéptido tras una digestión adicional en fosfatasa en presencia de moléculas ácidas que absorben energía (ácido 2,5-dihidroxibenzoico, pH 2) como se describe en la técnica anterior.

La Figura 3 muestra unos espectros de masas, en material compuesto, del péptido (GHHPH)_{5}G (2904 Da) antes (perfil inferior) y después (perfil superior) de la digestión in situ por carboxipeptidasa P en presencia de moléculas neutralizadas que absorben energía (ácido sinapínico, pH 6,2).

La Figura 4 muestra unos espectros de masas de desorción por láser asistida por matriz de tipo material compuesto, de mezclas peptídicas desorbidas de sondas de vidrio sólido, de acero inoxidable revestido con polipropileno, de acero inoxidable revestido con poliestireno, y de nailon sólido.

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SEAC

La Figura 5, perfil A, muestra el espectro de masas del factor activador del esperma (933 Da) y de neurotensina (1655 Da) (y sus múltiples aductos de sodio) en la disolución peptídica no adsorbida por la superficie de IDA-Cu(II). La Figura 5, perfil B, muestra el espectro de masas de angiotensina I (1296,5 Da) más los picos del aducto de sodio que se adsorbieron selectivamente sobre la superficie de IDA-Cu(II). La Figura 5, perfil C, y la Figura 6, perfil C, muestran el espectro de masas de la misma angiotensina I adsorbida sobre IDA-Cu(II) tras lavado con agua. La Figura 6, perfil D, muestra la unión secuencial in situ a cobre (1 y 2 Cu) mediante angiotensina I adsorbida por afinidad. La Figura 6, perfil E, muestra la digestión secuencial in situ con tripsina de la angiotensina I adsorbida por afinidad.

La Figura 7 muestra el espectro de masas de mioglobina (4 a 8 fmoles) adsorbida por afinidad sobre la superficie de IDA-Cu(II).

La Figura 8 (perfil superior) muestra el espectro de masas del péptido de caseína sintética (1934 Da) con múltiples formas fosforiladas, adsorbido por afinidad, de una mezcla bruta sobre la superficie de TED-Fe(III). Tras la digestión secuencial in situ con fosfatasa alcalina, sólo quedó la forma original no fosforilada (perfil inferior).

La Figura 9, perfil A, muestra el espectro de masas de proteínas totales en una fórmula para lactantes. La Figura 9, perfil B, muestra el espectro de fosfopéptidos en la fórmula para lactantes adsorbidos por afinidad sobre la superficie de TED- Fe(III). La Figura 9, perfil C, muestra el espectro de masas de proteínas totales en un aspirado gástrico de niño prematuro obtenido tras alimentar la fórmula para lactantes. La Figura 9, perfil D, muestra el espectro de masas de fosfopéptidos en el aspirado gástrico adsorbidos por afinidad sobre superficie de TED-Fe(III).

La Figura 10A muestra los espectros de masas, en material compuesto, de glicoproteína enriquecida con histidina tanto humana como bovina adsorbida sobre superficie de IDA-Cu(II) antes y después de la digestión con N-glicanasa. Los desplazamientos másicos representan la eliminación de carbohidratos de las glicoproteínas respectivas. La Figura 10B muestra los espectros de masas, en material compuesto, de péptidos digeridos con tripsina procedentes de las proteínas desglicosiladas de las dos especies (perfil superior para la proteína humana, segundo desde el perfil inferior para la proteína bovina), y la unión in situ a Cu(II) de los péptidos digeridos con tripsina de las dos especies (segundo desde el perfil superior para la proteína humana, perfil inferior para la proteína bovina; los números 1, 2 indican el número de unión a cobre). La Figura 10C muestra que uno de tales péptidos que se unen a Cu(II) (perfil inferior) tiene al menos 4 residuos de His que se modifican específicamente mediante pirocarbonato de dietilo para formar 4 aductos N-carbetoxi-histidílicos (1-4, perfil superior). La Figura 10D muestra la secuencia parcial de C-terminal del principal péptido que se une a Cu en la glicoproteína enriquecida con histidina bovina.

La Figura 11 (perfil inferior) muestra el espectro de masas de inmunoglobulina anti-lactoferrina humana de conejo sola (control) adsorbida por afinidad sobre una superficie paramagnética de IgG anti-conejo de oveja. El perfil superior muestra el espectro de masas de un complejo de lactoferrina humana e inmunoglobulina anti-lactoferrina humana de conejo adsorbido por afinidad en una superficie paramagnética de IgG anti-conejo de oveja.

La Figura 12 muestra el espectro de masas de lactoferrina humana adsorbida por afinidad procedente de orina de niño prematuro en una superficie de nailon con inmunoglobulina anti-lactoferrina humana. La Figura 13 muestra el espectro de masas equivalente de la orina completa de niño prematuro que contiene 1 nmol/ml de lactoferrina.

La Figura 14 (perfil inferior) muestra el espectro de masas de glicoproteína enriquecida con histidina bovina pura. El perfil superior muestra el espectro de masas de glicoproteína enriquecida con histidina bovina y fragmentos adsorbidos por afinidad procedentes de calostro bovino sobre una superficie de inmunoglobulina anti- glicoproteína rica en histidina bovina.

La Figura 15 muestra el espectro de masas, en material compuesto, de los péptidos de la hormona estimulante de los folículos reconocida por los diferentes anticuerpos antihormona estimulante de folículos.

La Figura 16 muestra el espectro de masas de lactoferrina humana adsorbida por afinidad sobre un lecho único de agarosa con ADN de una sola hebra depositada sobre una sonda de 0,5 mm de diámetro.

La Figura 17 muestra el espectro de masas de lactoferrina humana adsorbida por afinidad procedente de la orina de niño prematuro sobre una superficie de ADN de una sola hebra.

La Figura 18A muestra los espectros de masas, en material compuesto, de las proteínas totales en un aspirado duodenal humano (perfil inferior) y la tripsina adsorbida por afinidad procedente del aspirado sobre una superficie inhibidora de tripsina de haba de soja (perfil superior).

La Figura 18B muestra el espectro de masas de la tripsina adsorbida por afinidad procedente de 1 \mul de aspirado sobre una superficie de nailon inhibidora de tripsina de haba de soja.

La Figura 19A muestra el espectro de masas de insulina biotinilada adsorbida por afinidad procedente de la orina humana en una superficie de estreptavidina. La Figura 19B muestra el espectro de masas de insulina biotinilada adsorbida por afinidad procedente de plasma humano sobre una superficie de estreptavidina.

La Figura 20 (perfil superior) muestra el espectro de masas de albúmina humana en suero humano. La Figura 20 (perfil inferior) muestra el espectro de masas de albúmina sérica adsorbida por afinidad procedente de suero humano sobre una superficie de azul de Cibacron.

SEND

La Figura 21 muestra la estructura molecular de la cinamamida unida a la superficie; R representa la superficie más el agente reticulante.

La Figura 22 (perfil superior) muestra el espectro de masas de mezclas peptídicas desorbidas de cinamamida unida a la superficie. La Figura 20B (perfil inferior) muestra el espectro de masas de las mismas mezclas peptídicas con cinamamida libre.

La Figura 23 muestra la estructura molecular de bromuro de cinamilo unido a la superficie; R representa la superficie más el agente reticulante.

La Figura 24 (perfil superior) muestra el espectro de masas de mezclas peptídicas desorbidas de bromuro de cinamilo unido a la superficie. La Figura 22B (perfil inferior) muestra el espectro de masas de las mismas mezclas peptídicas con bromuro de cinamilo libre.

La Figura 25 muestra la estructura molecular de MAP-ácido dihidroxibenzoico unido a la superficie; R representa la superficie más el agente reticulante.

La Figura 26 (perfil superior) muestra el espectro de masas de mezclas peptídicas desorbidas de MAP solo unido a superficie. La Figura 26 (perfil inferior) muestra el espectro de masas de las mismas mezclas peptídicas desorbidas de MAP-ácido dihidroxibenzoico unidos a la superficie.

La Figura 27A muestra el espectro de masas (región de m/z 1200-50.000) de mioglobina desorbida de ácido \alpha-ciano-4-hidroxicinámico unido a superficie. La Figura 27B muestra el mismo espectro de masas en la región de masas baja (0-1200 m/z).

La Figura 28 muestra la estructura molecular de moléculas que absorben energía unidas a una superficie de poliacrilamida, o de nailon, o acrílica, vía activación con glutaraldehído.

La Figura 29 muestra la estructura molecular de moléculas que absorben energía unidas a superficie de poliacrilamida, o de nailon, o acrílica, vía activación con divinilsulfona.

La Figura 30 muestra la estructura molecular de moléculas que absorben energía unidas a superficie de poliacrilamida, o de nailon, o acrílica, vía activación con diciclohexilcarbodiimida.

La Figura 31 muestra la estructura molecular de moléculas que absorben energía unidas a superficie de poliacrilamida o de nailon o acrílica, con múltiples péptidos antigénicos, vía activación con diciclohexilcarbodiimida.

La Figura 32 muestra la estructura molecular de ácido tiosalicílico unido a una superficie de iminodiacetato (IDA)-Cu(II).

La Figura 33 muestra el espectro de masas del dominio de dimerización de receptor de estrógenos humano desorbido de la superficie de ácid tiosalicílico-IDA-Cu(II).

La Figura 34 muestra la estructura molecular de ácido \alpha-ciano-4-hidroxicinámico unido a una superficie de DEAE.

La Figura 35A muestra el espectro de masas del dominio de dimerización del receptor de estrógenos humano desorbido de la superficie de ácido sinapínico-DEAE. La Figura 35B muestra el espectro de masas de mioglobina desorbida de una superficie de ácido \alpha-ciano-4-hidroxicinámico-DEAE.

La Figura 36 muestra la estructura molecular de ácido \alpha-ciano-4-hidroxicinámico unido a una superficie de poliestireno.

SEPAR

La Figura 37 muestra el análisis de la secuencia de C-terminal del dominio de unión a metal de glicoproteína rica en histidina, inmovilizada a la superficie vía enlace fotolítico.

Descripción detallada de la invención

Será manifiesto para el experto en la técnica que se pueden realizar diversas sustituciones y modificaciones a la invención descrita en este documento sin separarse del alcance de la invención.

El desarrollo de nuevas composiciones para elementos de sonda de MS con superficies que permitan que el elemento de sonda participe activamente en la captura y acoplamiento de analitos específicos ha definido varias nuevas oportunidades en el área que ahora se describe como espectrometría de masas de afinidad (AMS). Resumiendo, se han diseñado varios tipos de nuevos elementos de sonda para MS con superficies mejoradas para la captura por afinidad (SEAC). Tales elementos de sonda con SEAC también se dan a conocer en una publicación por los inventores (Hutchens y Yip, Rapid Commun. Mass Spectrom. 7:576-580 (1993)), que se publicó tras la presente, fecha de prioridad de EE.UU. de 28 de Mayo de 1993. Los elementos de sonda con SEAC se han usado de forma exitosa para recobrar y trabar diferentes clases de biopolímeros, particularmente proteínas, explotando lo que se conoce sobre estructuras de superficies proteínicas y reconocimiento molecular bioespecífico.

El progreso en la biología estructura continúa estando limitado por la incapacidad para obtener una información de la secuencia de biopolímeros a una velocidad aceptable o a un nivel aceptable de sensibilidad. Utilizando los métodos y aparatos de la presente invención, se ha demostrado que la AMS proporciona una oportunidad para aliviar esta limitación. Debido a que los dispositivos de captura por afinidad inmovilizados en la superficie del elemento de sonda para MS (es decir, SEAC) determinan la localización y la afinidad (especificidad) del analito por la superficie de la sonda, el proceso analítico subsiguiente con AMS es mucho más eficiente por varias razones. En primer lugar, la localización del analito sobre la superficie del elemento de sonda está predeterminada. De este modo, la desorción subsiguiente no depende ya más de una búsqueda aleatoria del campo de la matriz de la superficie de la sonda con el haz de láser incidente. En segundo lugar, se aumenta la sensibilidad de la detección del analito (y el intervalo dinámico) debido a que se eliminan los efectos de supresión de la ionización molecular a menudo observados con mezclas de complejos. En tercer lugar, el analito trabado, que no se consume realmente por el proceso de desorción inicial inducido por láser, permanece disponible para análisis subsiguientes. Si se usó una matriz exógena para promover la desorción del analito, se elimina, en la mayoría de los casos, sin pérdida del analito trabado. El analito que queda se puede modificar entonces química y/o enzimáticamente directamente in situ (es decir, mientras que aún está sobre el elemento de sonda). Cuando se analiza nuevamente por MS para determinar diferencias en la masa, se revelan detalles estructurales específicos. El procedimiento completo de análisis/modificación se puede repetir muchas veces para obtener una información estructural mientras se consumen sólo cantidades muy pequeñas de analito (algunas veces sólo unos pocos femtomoles o menos). Las demostraciones de los análisis de estructura de proteínas basados en AMS han incluido hasta la fecha tanto análisis de secuencias N- y C-terminales como la verificación de varios tipos de modificaciones post-traduccionales específicas de la secuencia que incluyen fosforilación y desfosforilación, glicosilación, reactividad con residuos de cisteína, modificaciones químicas específicas del sitio (por ejemplo, residuos de histidina), y unión a ligandos.

Más allá de las determinaciones de las secuencias de biopolímeros y de la solución de estructuras de biopolímeros individuales, está la capacidad para comprender los determinantes estructurales de las disposiciones supramoleculares funcionales. La oportunidad para investigar los determinantes estructurales de estructuras de orden superior (por ejemplo, cuaternarias) también se presenta mediante AMS. Se ha demostrado usando la presente invención que los sucesos de reconocimiento molecular no covalentes, algunos no observados fácilmente por procedimientos bioanalíticos más tradicionales (que a menudo requieren la perturbación del equilibrio y condiciones de disociación de la estructura), se investigan directamente por la evaluación de asociaciones moleculares (es decir, reconocimiento) con analitos macromoleculares que han sido trabados, directa o indirectamente, a la superficie del elemento de sonda.

Como se usa en este documento, "analito" se refiere a cualquier átomo y/o molécula, incluyendo sus complejos e iones de fragmentos. En el caso de macromoléculas biológicas, incluyen pero no se limitan a proteínas, péptidos, ADN, ARN, hidratos de carbono, esteroides, y lípidos. Obsérvese que las biomoléculas más importantes bajo investigación, por su implicación en la estructura o regulación de procesos vitales, son bastante grandes (típicamente varios miles de veces más grandes que H_{2}O).

Como se usa en este documento, la expresión "iones moleculares" se refiere a moléculas en el estado cargado o ionizado, típicamente por adición o pérdida de uno o más protones (H^{+}).

Como se usa en este documento, la expresión "fragmentación molecular" o "iones fragmentos" se refiere a productos de ruptura de moléculas de analito provocados, por ejemplo, durante la desorción inducida por láser (especialmente en ausencia de matriz añadida).

Como se usa en este documento, la expresión "fase sólida" se refiere a la condiciónde estar en estado sólido, por ejemplo sobre la superficie del elemento de sonda.

Como se usa en este documento, "gas" o "fase de vapor" se refiere a moléculas en el estado gaseoso (es decir, a vacío para espectrometría de masas).

Como se usa en este documento, la expresión "desorción/ionización de analito" se refiere a la transición de analitos desde la fase sólida a la fase gaseosa como iones. Obsérvese que la desorción/ionización con éxito de grandes iones moleculares intactos mediante desorción por láser es relativamente reciente (aproximadamente 1988)- el gran adelanto fue el descubrimiento casual de una matriz apropiada (ácido nicotínico).

Como se usa en este documento, la expresión "iones moleculares en fase gaseosa" se refiere a aquellos iones que entran en la fase gaseosa. Obsérvese que los iones de gran masa molecular, tales como proteínas (masa típica = 60.000 a 70.000 veces la masa de un único protón), no son típicamente volátiles (es decir, normalmente no entran en la fase gaseosa o de vapor). Sin embargo, en el procedimiento de la presente invención, los iones de gran masa molecular, tales como proteínas, sí entran a la fase gaseosa o de vapor.

Como se usa en este documento en el caso de MALDI, el término "matriz" se refiere a uno cualquiera de varios productos químicos pequeños, ácidos, que absorben la luz (por ejemplo, ácido nicotínico o ácido sinapínico), que se mezcla en disolución con el analito de tal manera que, al secar sobre el elemento de sonda, las moléculas del analito embebidas en la matriz cristalina se desorben con éxito (mediante irradiación por láser) y se ionizan desde la fase sólida (cristales) a la fase gaseosa o de vapor y se aceleran como iones moleculares intactos. Para que el proceso MALDI tenga éxito, el analito se mezcla con una disolución recientemente preparada de la matriz química (por ejemplo 10.000:1 de matriz:analito), y se coloca sobre la superficie inerte del elemento de sonda para secarse al aire justo antes del análisis espectrométrico de masas. El gran exceso molar de la matriz, presente a concentraciones cerca de la saturación, facilita la formación del cristal y el atrapamiento del analito.

Como se usa en este documento, "moléculas que absorben energía (EAM)" se refiere a uno cualquiera de varios productos químicos pequeños, que absorben luz, que, cuando están presentes sobre la superficie de un elemento de sonda (como en el caso de SEND), facilitan la desorción limpia de moléculas desde la fase sólida (es decir, superficie) a la fase gaseosa o de vapor para la aceleración subsiguiente como iones moleculares intactos. Se prefiere el término EAM, especialmente con referencia a SEND. Obsérvese que la desorción del analito mediante el procedimiento SEND se define como un procedimiento dependiente de la superficie (es decir, el analito puro se coloca sobre una superficie compuesta de EAM unidas). Por contra, actualmente se piensa que MALDI facilita la desorción del analito mediante un procedimiento de tipo erupción volcánica que "lanza" a toda la superficie a la fase gaseosa. Además, obsérvese que algunas EAM, cuando se usan como productos químicos libres para embeber moléculas del analito, como se describe para el proceso MALDI, no funcionarán (es decir, no promueven la desorción molecular, y así no son moléculas de matriz adecuadas).

Como se usa en este documento, "elemento de sonda" o "dispositivo de presentación de la muestra" se refiere a un elemento que tiene las siguientes propiedades: es inerte (por ejemplo, típicamente acero inoxidable) y activo (elementos de sonda con superficies potenciadas para contener dispositivos de captura molecular).

Como se usa en este documento, "MALDI" se refiere a desorción/ionización por láser asistida por matriz.

Como se usa en este documento, "TOF" significa tiempo de vuelo.

Como se usa en este documento, "MS" se refiere a espectrometría de masas.

Como se usa en este documento, "MS MALDI-TOF" se refiere a espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción/ionización por láser asistida por matriz.

Como se usa en este documento, "ESI" es una abreviatura de ionización por electropulverización.

Como se usa en este documento, "enlaces químicos" se usa simplemente como un intento para distinguir una manipulación racional, deliberada y cognoscible de clases conocidas de interacciones químicas desde los tipos pobremente definidos de adherencia general observados cuando una sustancia química (por ejemplo, matriz) se coloca sobre otra sustancia (por ejemplo, una superficie inerte del elemento de sonda). Los tipos de enlaces químicos definidos incluyen enlaces electrostáticos o iónicos (+/-) (por ejemplo, entre grupos positiva y negativamente cargados en una superficie proteínica), enlaces covalentes (enlaces muy fuertes o "permanentes" que resultan de una verdadera compartición de electrones), enlaces covalentes coordinados (por ejemplo, entre grupos dadores de electrones en proteínas e iones metálicos de transición tales como cobre o hierro), e interacciones hidrófobas (tales como entre dos grupos no cargados).

Como se usa en este documento, "grupos dadores de electrones" se refiere al caso de la bioquímica en el que los átomos en las biomoléculas (por ejemplo, N, S, O) "dan" o comparten electrones con grupos pobres en electrones (por ejemplo, iones de Cu y otros iones de metales de transición).

Existe una categoría general de elementos de sonda (es decir, medios de presentación de las muestras) con superficie potenciada para la desorción/ionización por láser (SELDI), dentro de la cual hay tres (3) subcategorías separadas. Superficies potenciadas para la desorción limpia (SEND) en las que las superficies del elemento de sonda (es decir, los medios que presentan las muestras) se diseñan para contener moléculas que absorben energía (EAM) en lugar de "una matriz" para facilitar la desorción/ionización de analitos añadidos directamente (limpiamente) a la superficie. Obsérvese que esta categoría 1 (SEND) se usa sola o en combinación con superficies potenciadas para la captura por afinidad (SEAC) (categoría 2), que es según la presente invención, en la que las superficies del elemento de sonda (es decir, los medios de presentación de las muestras) se diseñan para que contengan dispositivos de captura por afinidad químicamente definidos y/o biológicamente definidos para facilitar la unión o adsorción específica o no específica (el denominado acoplamiento o trabamiento) de analitos a la superficie de la sonda, mediante una variedad de mecanismos (principalmente no covalentes). Obsérvese que la categoría 2 (SEAC), que es según la presente invención, se usa con una matriz añadida. De este modo, la combinación de SEND y SEAC representa actualmente una categoría distinta.

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La categoría 3 implica superficies potenciadas para la anexión y liberación fotolábil (SEPAR) en la que la superficie del elemento de sonda (es decir, los medios que presentan las muestras) se diseñan/modifican para que contengan uno o más tipos de moléculas reticulantes químicamente definidas para que sirvan como dispositivos de acoplamientos covalentes. Estas moléculas de anexión fotolábil (PAM) son de carácter bivalente o multivalente, esto es, se hace reaccionar primero un lado para que se una permanentemente las PAM a la superficie del elemento de sonda de los medios que presentan las muestras, y entonces el otro lado o lados reactivos de las PAM está listo para hacerlo o hacerlos reaccionar con el analito cuando el analito entra en contacto con la superficie de sonda derivatizada con PAM. Tales superficies (es decir, medios que presentan las muestras) permiten procesos de unión o adsorción (es decir, acoplamiento o trabamiento) muy fuerte (es decir, covalente, estable) del analito que son covalentes pero reversibles con la radiación (es decir, fotolábiles). Tales superficies representan plataformas para la desorción dependiente del láser de analitos que han de ser química y/o enzimáticamente modificados in situ (es decir, directamente sobre la punta de la sonda) con el fin de la elucidación estructural. Sólo se desorben aquellos analitos sobre la superficie de la sonda que están realmente irradiados (pequeño porcentaje del total). El resto de los analitos trabados permanecen unidos covalentemente y se modifican sin pérdida debido a cierto no acoplamiento inadvertido de la superficie. Obsérvese que la categoría SEPAR (categoría 3) se caracteriza por procedimientos de unión a analito que son reversibles con la exposición a la luz. Sin embargo, la inversión dependiente de la luz del enlace o enlaces de unión a la superficie del analito no permite necesariamente la desorción del analito en la fase gaseosa per se. En otras palabras, las moléculas responsables de la unión fotolábil de los analitos a la superficie de la sonda no son necesariamente las mismas que las moléculas que absorben energía (EAM) descritas para SEND. Pero aquí hay una importante excepción. La presente descripción muestra algunos productos químicos de EAM/PAM híbridos que tienen una funcionalidad dual con respecto a SEND y SEPAR. Esto es, algunas moléculas de EAM usadas actualmente para SEND se pueden modificar para que actúen como mediadores tanto en los procesos SEND como SEPAR. De forma similar, se proporcionan algunos compuestos químicos de afinidad por captura/PAM híbridos que tienen funcionalidad dual con respecto a SEAC y SEPAR. La presente descripción usa algunos dispositivos de captura por afinidad, particularmente aquellos que están definidos biológicamente, que están modificados para actuar como mediadores tanto de los procesos de SEAC como SEPAR.

La descripción presenta un medio de presentación de las muestras (es decir, superficie del elemento de sonda) con moléculas asociadas a la superficie (o unidas a la superficie) para promover la anexión (trabamiento o anclaje) y desunión subsiguiente de moléculas de analito trabado de una manera dependiente de la luz, en el que la mencionada o mencionadas moléculas de la superficie se seleccionan del grupo que constan de moléculas fotoactivas (fotolábiles) que participan en la unión (acoplamiento, trabamiento, o reticulación) de moléculas del analito al medio que presenta la muestra (mediante mecanismos de unión covalente o de otro modo. Además, también se presenta un medio de presentación de las muestras (compuesto de uno o más materiales del elemento de sonda adecuados descritos en las reivindicaciones previas), en el que el analito o analitos están unidos a la superficie de dicho medio de presentación de las muestras mediante uno o más enlaces fotolábiles de forma que el pulso o pulsos incidentes de luz (por ejemplo, procedente de uno o más láseres) se usa para romper el o los enlaces fotolábiles trabando al analito o analitos a la superficie del elemento de sonda de una manera que es consistente con la desorción subsiguiente del analito de la superficie de la fase estacionaria (sólida) de la sonda en la fase gaseosa (de vapor).

La especificidad o especificidades químicas que determinan el tipo y número de dichos puntos de unión de la molécula fotolábil entre los medios que presentan las muestras de SEPAR (es decir, superficie del elemento de sonda) y el analito (por ejemplo, proteína) pueden implicar uno cualquiera o más de un número de residuos diferentes o estructuras químicas en el analito (por ejemplo, residuos de His, Lys, Arg, Tyr, Phe y Cys, en el caso de proteínas y péptidos). En otras palabras, en el caso de proteínas y péptidos, el medio de presentación de las muestras de SEPAR puede incluir superficies de sonda modificadas con varios tipos diferentes de moléculas de unión fotolábiles para asegurar al analito o analitos con una pluralidad de diferentes tipos de puntos de unión.

La longitud de onda de la luz o intensidad de la luz (o ángulo incidente) requeridos para romper la unión o uniones fotolábiles entre el analito y la superficie del elemento de sonda pueden ser iguales o diferentes a la longitud de la luz o intensidad de la luz (o ángulo incidente) requeridos para promover la desorción del analito desde la fase estacionaria a la fase de gas o de vapor.

La unión fotolábil del analito o analitos a la superficie del elemento de sonda (es decir, medio de presentación de las muestras), particularmente biopolímeros tales como péptidos, proteínas, ácido ribonucleico (ARN), ácidos desoxirribonucleicos (ADN), e hidratos de carbono (CHO), puede implicar múltiples puntos de unión entre la superficie de la sonda y la macromolécula del analito. Una vez que el biopolímero se une vía múltiples puntos de unión, los diferentes puntos en la cadena principal del biopolímero se pueden cortar o fragmentar deliberadamente mediante medios químicos y/o enzimáticos de forma que muchos de los fragmentos resultantes son ahora analitos separados y distintos, cada uno aún unido (trabado) a la superficie de la sonda por uno o más enlaces fotolábiles, para ser desorbidos en la fase gaseosa en paralelo para análisis másicos simultáneos con un analizador de masas de tiempo de vuelo. Este procedimiento permite que se realicen determinaciones de secuencias de biopolímeros (proteína, péptidos, ARN, ADN, hidrato de carbono).

Como se usa en este documento, "afinidad" se refiere a la atracción física y/o química entre dos moléculas. Típicamente se usa por naturaleza para fines de estructura o regulación de bioactividad (es decir, transferencia de información). Habitualmente la afinidad de una biomolécula por otra es bastante específica. Se usa en el presente caso para describir el principio por el que los analitos moleculares de interés son capturados. En el caso de SEAC, los productos químicos o biomoléculas con una afinidad característica por el analito o analitos de interés se traban (unen) a la superficie del elemento de sonda para "buscar" activamente y unirse selectivamente al analito deseado.

Como se usa en este documento, "reconocimiento molecular" se refiere al suceso de interacción entre dos moléculas con una afinidad natural entre sí.

Como se usa en este documento, "captura molecular" se refiere al uso de biomoléculas trabadas para atraer y unirse (capturar) otras biomoléculas para las que existe una relación de afinidad específica.

Como se usa en este documento, "adsorción pasiva" se refiere al hecho de colocar simplemente el analito (por ejemplo, con una matriz).

Como se usa en este documento, "acoplamiento activo" se refiere a la captura deliberada de moléculas de analito sobre la superficie de un elemento de sonda activo como en el caso de SEAC.

Como se usa en este documento, "fase estacionaria" significa lo mismo que fase sólida. En el presente contexto, es tanto la propia superficie del elemento de sonda como uno de los dispositivos SEND o SEAC en partículas "externo" usado en conjunción con una superficie del elemento de sonda inerte.

Como se usa en este documento, "área específica activa" se refiere a aquella área de la superficie que se piensa o se sabe que participa en la reacción o suceso deseados (por ejemplo, unión de EAM o captura por afinidad). El área específica activa puede ser significativamente menor que el área específica total (debido a los efectos físicos tales como impedimento estérico, parte del área total puede no estar disponible o ser útil).

Como se usa en este documento, "ligando" se refiere a una molécula relativamente pequeña (cebo) que se une a una gran biomolécula (pez). En el caso presente, los ligandos se unen (químicamente unidos) a través de un brazo enlazante (línea de pesca) a la superficie del elemento de sonda. Este procedimiento permite que el suceso de captura biomolecular esté localizado en la superficie (fase estacionaria o sólida).

Como se usa en este documento, "reactivo de afinidad" se refiere a un dispositivo de captura de analito, es decir, la clase de moléculas (tanto obtenida por el hombre, no natural, natural y biológica) y/o compuestos que tienen la capacidad de ser retenidos en la superficie de presentación de las muestras (mediante enlace covalente, adsorción química, etc.) a la vez que retienen la capacidad de reconocimiento y enlace a un analito.

Como se usa en este documento, "desorción" se refiere a la partida del analito de la superficie y/o la entrada del analito en una fase gaseosa.

Como se usa en este documento, "ionización" se refiere al proceso de crear o retener en un analito una carga eléctrica igual a más o menos una o más unidades electrónicas.

Como se usa en este documento, "aducto" se refiere a la aparición de una masa adicional asociada con el analito y provocada habitualmente por la reacción de exceso de matriz (o productos de ruptura de la matriz) directamente con el analito.

Como se usa en este documento, "adsorción" significa la unión química (covalente y/o no covalente) de las moléculas que absorben energía, el reactivo de afinidad (es decir, el dispositivo de captura del analito), y/o el analito a la sonda (superficie presentadora).

Una realización de la presente invención es un aparato para medir la masa de una molécula de analito de una muestra de analito por medio de espectrometría de masas, comprendiendo dicho aparato: un tubo de espectrómetro; un medio de vacío para aplicar vacío al interior de dicho tubo; un medio de potencial eléctrico dentro del tubo para aplicar un potencial eléctrico acelerador para desorber moléculas del analito de dicha muestra de analito; un medio de presentación de las muestras que se puede insertar de forma retirable en dicho tubo de espectrómetro, para exponer dicha muestra de analito en asociación con una molécula asociada a la superficie para promover la desorción e ionización de dichas moléculas de analito, en el que dicha molécula de superficie es un dispositivo de captura por afinidad (reactivo de afinidad) y se proporciona una material matriz que ayuda a la desorción/ionización en asociación con el reactivo de afinidad sobre la citada superficie; una muestra de analito depositada sobre dicho medio de presentación de las muestras en asociación con dichas moléculas asociadas a la superficie; con lo que al menos una porción de dichas moléculas de analito no consumidas en dicho análisis de espectrometría de masas permanecerá accesible para procedimientos subsiguientes químicos, biológicos o físicos analíticos; un medio de haz de láser para producir un haz de láser dirigido a dicha muestra de analito para dar suficiente energía para desorber e ionizar una porción de dichas moléculas de analito desde dicha muestra de analito; y un medio detector asociado con dicho tubo de espectrómetro para detectar el impacto de moléculas de analito ionizadas aceleradas sobre él.

Otra realización de la presente invención es un método en espectrometría de masas para medir la masa de una molécula de analito, comprendiendo dicho método las etapas de: derivatizar una superficie de presentación de las muestras en una cara de la punta de la sonda con un dispositivo de captura por afinidad que tiene un medio para unirse con una molécula de analito; exponer dicha cara de la punta de la sonda derivatizada a una fuente de dicha molécula de analito para unir dicha molécula de analito a aquélla; colocar la punta de sonda derivatizada con dichas moléculas de analito unidas a ella en un extremo de un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo y aplicar vacío y un campo eléctrico para formar un potencial acelerador en el espectrómetro; golpear al menos una porción de las moléculas de analito unidas a dicha cara de la punta de la sonda derivatizada en el espectrómetro con uno o más pulsos de láser a fin de desorber iones de dichas moléculas de analito desde dicha punta; detectar la masa de los iones mediante su tiempo de vuelo en dicho espectrómetro de masas; y mostrar tal masa detectada. En este método, se aplica un material matriz que ayuda a la desorción/ionización a dicha cara de la punta de la sonda en asociación con dicho dispositivo de captura por afinidad. En una realización más preferida, el método según la invención comprende además retirar dicha punta de la sonda de dicho espectrómetro de masas; realizar un procedimiento químico o biológico sobre dicha porción de dichas moléculas de analito no desorbidas para alterar la composición de dicha porción de dichas moléculas de analito no desorbidas; reinsertar dicha punta de la sonda con dichas moléculas de analito alteradas sobre ella; y realizar posteriores análisis de espectrometría de masas para determinar el peso molecular de dichas moléculas de analito alteradas.

En una realización adicional, dicho dispositivo de captura por afinidad está enlazado químicamente a dicha cara de dicha punta de la sonda, está adherido físicamente a dicha cara de dicha punta de la sonda, está adaptado para unirse químicamente a dichas moléculas de analito, o está adaptado para adherirse biológicamente a dichas moléculas de analito. En una realización posterior, dichas moléculas de analito son biomoléculas y dicho reactivo de afinidad está adaptado para aislar selectivamente dichas biomoléculas a partir de una muestra biológica no diferenciada.

En una realización preferida, dichos materiales matriz están en el intervalo de pH débilmente ácido a fuertemente básico. En una realización más preferida, dichos materiales matriz tienen un pH por encima de 6,0. Además, una realización adicional presenta la cara de dicha punta de sonda formada por un material eléctricamente aislante.

En otra realización posterior del aparato de la presente invención para facilitar la desorción e ionización de moléculas de analito, dicho aparato comprende: una superficie de presentación de las muestras; y una superficie asociada a la molécula, en el que dicha superficie asociada a la molécula es un dispositivo de captura por afinidad (reactivo de afinidad), estando asociada dicha superficie asociada a la molécula con dicha superficie de presentación de las muestras y que tiene un medio para unirse con dichas moléculas del analito. En dicha superficie se proporciona un material matriz que ayuda a la desorción/ionización en asociación con el agente de afinidad.

En una realización preferida, dicha superficie de presentación de las muestras comprende la superficie de una punta de sonda para uso en un analizador de espectrometría de masas de tiempo de vuelo. Además, la realización preferida presenta un dispositivo de captura por afinidad que está enlazado químicamente a dicha superficie de presentación de las muestras, está adherido físicamente a dicha superficie de presentación de las muestras, está enlazado químicamente a dichas moléculas de analito o está adaptado para adherirse biológicamente a dichas moléculas de analito. Además, la realización preferida presenta moléculas de analito que son biomoléculas, y dicho dispositivo de captura por afinidad está adaptado para aislar selectivamente dichas biomoléculas a partir de una muestra biológica no diferenciada.

Como se ha mencionado anteriormente, el aparato tiene un material matriz depositado sobre dicha superficie que presentan las muestras en asociación con dicho dispositivo de captura por afinidad (reactivo de afinidad). En una realización más preferida, el material matriz está en el intervalo de pH débilmente ácido a fuertemente básico. En una realización más preferida, el material matriz tiene un pH por encima de 6,0. Adicionalmente, una realización preferida incluye una superficie de presentación de las muestras formada por un material eléctricamente aislante.

En una realización adicional de la presente invención, se presenta un método para capturar moléculas de analito en una superficie de presentación de las muestras, y desorber/ionizar dichas moléculas del analito capturadas procedentes de dicha superficie de presentación de las muestras para el análisis subsiguiente, comprendiendo dicho método: derivatizar dicha superficie de presentación de las muestras con un dispositivo de captura por afinidad que tiene un medio para unirse con dichas moléculas de analito; exponer dicha superficie de presentación de las muestras derivatizada a una muestra que contiene dichas moléculas de analito; capturar dichas moléculas de analito en dicha superficie de presentación de las muestras derivatizada por medio de dicho dispositivo de captura por afinidad; y exponer dichas moléculas de analito, mientras están unidas a dicha superficie de presentación de las muestras derivatizada por medio de dicho dispositivo de captura por afinidad, a una fuente de energía o de luz para desorber al menos una porción de dichas moléculas de analito de dicha superficie. Este método también comprende la etapa de depositar un material matriz que ayuda a la desorción/ionización a dicha superficie de presentación de la muestra en asociación con dicho dispositivo de captura por afinidad (reactivo de afinidad).

Una realización adicional de la presente invención es un método para preparar una superficie que presenta moléculas de analito para análisis, comprendiendo dicho método: proporcionar un sustrato sobre dicha superficie para soportar dicho analito; derivatizar dicho sustrato con un dispositivo de captura por afinidad que tiene un medio para unirse selectivamente con dicho analito; depositar un material matriz que ayuda a la desorción/ionización en dicha superficie de presentación de las muestras en asociación con dicho dispositivo de captura por afinidad (reactivo de afinidad); y un medio para detectar dichas moléculas de analito enlazadas con dicho dispositivo de captura por afinidad. En una realización preferida, se proporciona la etapa adicional de aplicar un material de detección a dicha superficie. En una realización más preferida, tal material de detección comprende una especie fluorescente, una especie enzimática, una especie radioactiva, o una especie que emite luz.

En una realización adicional preferida, la fuente de energía comprende un láser. En otra realización preferida, se usa un dispositivo de captura por afinidad, y dicha fuente de energía comprende una fuente de iones. Además, una realización preferida puede incluir una porción de dichas moléculas de analito que permanecen unidas a dicha superficie de presentación de las muestras tras la exposición a dicha fuente de energía. En una realización más preferida, se incluyen las etapas adicionales de convertir al menos una porción de las moléculas de analito que quedan unidas en dicha superficie de presentación de las muestras derivatizada en moléculas de analito modificadas mediante reacción química, biológica o física, en las que dichas moléculas de analito permanecen unidas a dicha superficie de presentación de las muestras derivatizada por medio de dicho dispositivo de captura por afinidad; y exponer dichas moléculas de analito modificadas a una fuente de energía para desorber al menos una porción de dichas moléculas de analito modificadas de dicha superficie.

En un ejemplo no realizado de la presente invención, se proporciona una sonda de muestra para promover la desorción de analitos intactos en la fase gaseosa, que comprende: una superficie de presentación de las muestras; y una molécula que absorbe energía asociada con dicha superficie de presentación de las muestras, en el que dicha sonda de muestra promueve la desorción de una molécula de analito intacta colocada en, encima o entre las moléculas que absorben energía cuando dicha sonda de muestra es golpeada mediante una fuente de energía. En un ejemplo adicional, la molécula que absorbe energía se selecciona del grupo que consta de cinamamida, bromuro de cinamilo, ácido 2,5-dihidroxibenzoico y ácido \alpha-ciano-4-hidroxicinámico. También en un ejemplo, se puede utilizar una superficie de presentación de las muestras seleccionada del grupo que consta de vidrio, materiales cerámicos, materiales magnéticos revestidos con teflón (marca registrada), polímeros orgánicos y biopolímeros naturales.

En otra realización de la presente invención, se proporciona una sonda de muestra para promover la desorción de analitos intactos en la fase gaseosa, que comprende: una superficie de presentación de las muestras; y un dispositivo de captura por afinidad asociado con dicha superficie de presentación de las muestras; en el que, cuando dicha sonda de muestra es golpeada por una fuente de energía, dicha sonda de muestra promueve la transición de una molécula de analito intacto a la fase gaseosa. Se proporciona sobre dicha superficie un material matriz que ayuda a la desorción/ionización en asociación con el dispositivo de captura por afinidad (reactivo de afinidad). El dispositivo de captura por afinidad se selecciona de iones metálicos, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, hidratos de carbono, y sus combinaciones. El dispositivo de captura por afinidad puede ser un anticuerpo, lectina, unión Cu(II) o unión Fe(III). Puede ser de este modo una inmunoglobulina. En otra realización preferida, la superficie de presentación de las muestras se selecciona del grupo que consta de vidrio, materiales cerámicos, materiales magnéticos revestidos con teflón (marca registrada), polímeros orgánicos y biopolímeros naturales.

En otra realización, la sonda de muestra de la invención comprende una superficie de presentación de las muestras y al menos dos dispositivos de captura por afinidad diferentes asociados con dicha superficie de presentación de las muestras; en el que, cuando dicha sonda de muestra es golpeada por una fuente de energía, dicha sonda de muestra promueve la transición de una molécula de analito a la fase gaseosa a diferentes velocidades dependiendo del dispositivo de captura por afinidad asociado con dichas moléculas de analito.

En una realización preferida, el analito se desorbe selectivamente de la mezcla tras el golpe mediante la fuente de energía. En otra realización preferida, los dispositivos de captura por afinidad están dispuestos en disposiciones predeterminadas. En una realización más preferida, las disposiciones absorben selectivamente una pluralidad de diferentes analitos.

En una realización más preferida, se usa un aparato de la presente invención para cuantificar un analito; en el que la posición y cantidad de los dispositivos de captura por afinidad determinan la cantidad de analito adsorbido. En otra realización preferida, la unión puede ser selectiva o no selectiva.

En una realización adicional, una sonda de muestra para promover la desorción del analito intacto a la fase gaseosa comprende: una superficie de presentación de muestras; y una molécula asociada a la superficie, en el que dicha molécula asociada a la superficie puede funcionar tanto como una molécula que absorbe energía como un dispositivo de captura por afinidad.

Otra realización muestra un método para la determinación de la secuencia de biopolímeros que comprende las etapas de: unir un analito biopolimérico a la punta de una sonda que contiene una superficie de presentación de las muestras que tiene una molécula asociada a la superficie, en el que la molécula asociada a la superficie es un dispositivo de captura por afinidad; desorber el analito biopolimérico en el análisis de espectrometría de masas, en el que al menos una porción de dicho biopolímero no está desorbido de la punta de la sonda; analizar los resultados de la desorción; modificar el analito biopolimérico aún unido a la punta de la sonda; y repetir las etapas de desorción, análisis y modificación hasta que se secuencia el biopolímero. En una realización preferida, el biopolímero se selecciona del grupo que consta de proteína, ARN, ADN e hidratos de carbono.

Los siguientes ejemplos incluyen ejemplos que describen realizaciones específicas ilustrativas de la presente invención, y que no pretenden limitar el alcance de la invención, que se define por las reivindicaciones anejas. También se dan otros ejemplos no realizados de la invención.

Los Ejemplos utilizan un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo con una fuente de alta energía, tal como un haz de láser, para vaporizar el analito desde la superficie de una punta de sonda. En el procedimiento, algunas de las moléculas se ionizan. Las moléculas positivamente cargadas se aceleran entonces a través de un campo corto de alto voltaje y entran en un tubo de vuelo libre de campos. Un detector sensible colocado en el extremo del tubo de vuelo da una señal a medida que el ion molecular lo golpea. El experto en la técnica reconoce que también se pueden usar otros modos de detección e ionización.

Ejemplo 1 Moléculas que Absorben Energía en Forma Acuosa, Neutralizada

El material matriz de la técnica anterior usado en una espectrometría de masas de tiempo de vuelo por desorción con láser ayudada en matriz es fuertemente ácido. Uno de los descubrimientos actuales es que los analitos se desorben cuando se mezclan con moléculas que absorben energía neutralizadas disueltas en disolventes completamente acuosos. Mediante la neutralización adecuada a pH 6,0 o superior, el material matriz se hace enormemente pasivo a las posteriores reacciones químicas o enzimáticas llevadas a cabo sobre las moléculas de analito presentes en las superficies de la punta de la sonda. Puesto que sólo se usa una pequeña fracción de las moléculas de analito en cada medida del espectrómetro de masas por desorción, las muestras en las puntas de la sonda están disponibles para las modificaciones secuenciales in situ químicas o enzimáticas. Tras la modificación, las muestras se analizan mediante espectrometría de masas. El análisis en las mismas puntas de la sonda proporciona una determinación más exacta de la molécula y sus características, incluyendo su estructura.

La espectrometría de masas se realiza en un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo Vestec modificado modelo VT2000 o un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo MAS modelo SELDI Research Linear que usa una salida de frecuencia triple procedente de un láser pulsado de neodimio-itrio-aluminio (Nd-YAG) (355 nm, 5 ns de pulso). Los iones desorbidos por la radiación de láser pulsado son acelerados hasta una energía de 30 keV y se deja que sean arrastrados a lo largo de una región de arrastre libre de campos de 2 metros (mantenida a 10^{-6} torr). Las señales de los iones detectadas usando un multiplicador electrónico dinódico discreto de 20 etapas son amplificadas por un factor de 10 usando un preamplificador rápido antes de ser registrados usando un registro transitorio de 200 MS/s (LeCroy TR8828D, resolución en el eje y de 8 bits) o un digitalizador Tektronix capaz de promediar la señal rápida. La radiancia del láser se ajusta a tiempo real, mientras se monitoriza el procedimiento en un osciloscopio (Tektronix), a fin de logra runa señal iónica óptima. La reducción de datos (cálculos de centroide del pico y conversiones de tiempo a masa/carga) se realizan con un programa de ordenador para PC. También se puede usar un espectrómetro de masas VG TOFSpec que usa un láser de nitrógeno que genera un láser pulsado a 335 nm o un espectrómetro de masas Linear LDI 1700 que usa un láser de nitrógeno que genera un láser pulsado a 335 nm.

I. Análisis Específico

1. Se suspende ácido sinapínico (Aldrich Chemical Co., Inc. Milwaukee, WI) en agua a 20 mg/ml (pH 3,88), y se neutraliza con trietilamina (Pierce, Rockford, IL) hasta pH 6,2-6,5. Se mezcla una mezcla acuosa (1 l) de péptidos sintéticos, que contienen dominios de unión a metal de glicoproteína enriquecida con histidina humana (GHHPH)_{2}G (1206 Da), (GHHPH)_{5}G (2904 Da), y el dominio de dimerización de receptor de estrógenos humano (D473-L525) (6168,4 Da), con 2 \mul de ácido sinapínico (20 mg/ml de agua, pH 6,2) en una punta de sonda, y se analiza mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser. Tras adquirir cinco espectros (100 disparos de láser de media por espectro), se recupera la sonda, se añaden 2 \mul de Cu(SO_{4}) 20 mM, y la mezcla se vuelve a analizar mediante espectrometría de masas. La Figura 1A (perfil superior) muestra el espectro de masas de los tres péptidos desorbidos en presencia de moléculas neutralizadas que absorben energía. La Figura 1B (perfil inferior) muestra la unión in situ a metal de los péptidos en presencia de moléculas neutras que absorben energía. El péptido (GHHPH)_{2}G se puede unir a al menos 4 iones Cu(II), el péptido (GHHPH)_{5}G se puede unir a al menos 5 Cu(II), y el dominio de dimerización se puede unir a al menos 1 Cu(II) en las condiciones experimentales actuales. Se obtiene un resultado similar con ácido \alpha- ciano-4-hidroxicinámico (20 mg/ml de agua) neutralizado hasta pH 6,5.

2. Se mezcla 1 alícuota de un \mul de fosfopéptido de \beta-caseína humana (R1-K18 + 5P) (2488 Da) con 1 \mul de ácido sinapínico (20 mg/ml de agua) neutralizado hasta pH 6,5, y se analizó mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción con láser. Tras adquirir cinco espectros (100 disparos de láser de media por espectro), se retiró la sonda, el fosfopéptido restante mezclado con el ácido sinapínico neutralizado se digirió directamente en la punta de la sonda mediante 0,5 \mul de fosfatasa alcalina (Sigma), y se incubó a 23ºC durante 5 minutos. Después de adquirir 5 espectros (100 disparos de láser de media por espectro), se retiró la sonda, se llevó a cabo una digestión adicional sobre los fosfopéptidos restantes añadiendo otra alícuota de 0,5 l de fosfatasa alcalina, y se incubó a 23ºC durante 5 minutos. La muestra se volvió a analizar mediante espectrometría de masas por desorción con láser. La Figura 2A (perfil superior) muestra el espectro de masa del fosfopéptido desorbido en presencia de moléculas neutralizadas que absorben energía. La Figura 2B (segundo desde el perfil superior) muestra la digestión in situ durante 5 minutos con fosfatasa alcalina para eliminar grupos fosfato del fosfopéptido. Los picos 0P, 1P y 3P representan los productos tras la eliminación de 5, 4 y 2 grupos fosfato, respectivamente, del fosfopéptido. La Figura 2C (tercera desde el perfil superior) muestra que una digestión adicional in situ con fosfatasa alcalina puede dar como resultado casi la eliminación completa de todos los grupos fosfato del fosfopéptido. Por contra, la Figura 2D (perfil inferior) muestra que, en el experimento de control, en el que se lleva a cabo la digestión in situ con fosfatasa alcalina (0,5 \mul) en presencia de moléculas que absorben energía sin neutralización anterior (por ejemplo ácido sinapínico a pH 3,88, o ácido dihidroxibenzoico a pH 2,07), ocurrió una digestión muy limitada en 10 minutos a 23ºC.

3. Se mezcló una alícuota de 1 \mul de péptido (GHHPH)_{5}G (2904 Da) con 2 \mul de ácido sinapínico (20 mg/ml de agua) neutralizado a pH 6,2, y se analizó mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser. Tras adquirir cinco espectros (100 disparos de láser de media por espectro), los péptidos restantes mezclados con ácido sinapínico neutralizado se digirieron directamente en la punta de la sonda mediante 1 \mul de carboxipeptidasa P (Boehringer Mannheim Corp, Indianapolis, IN), y se incubó a 23ºC durante 30 minutos. La mezcla se analizó mediante espectrometría de masas. La Figura 3 muestra espectros de masas de material compuesto del péptido antes (perfil inferior) y después (perfil superior) de la digestión in situ por carboxipeptidasa P en presencia de moléculas neutralizadas que absorben energía. La disminución en la masa representa la eliminación de un residuo Gly del C-terminal del péptido.

Este ejemplo ilustra que las moléculas neutralizadas que absorben energía en disoluciones acuosas son más biocompatibles conservando la estructura y función de los analitos incluso cuando se añaden en un gran exceso molar. Su presencia no da como resultado interferencia a las reacciones in situ secuenciales químicas o enzimáticas sobre el analito que queda.

Ejemplo 2 Elementos de Sonda No Metálicos (Superficies que Presentan las Muestras)

Se ha encontrado que los elementos de sonda (puntas de sonda o superficies que presentan las muestras) usados en el procedimiento de la invención no necesitan ser metales o estar revestidos con metales, según se describe en los procedimientos de la técnica anterior. Las superficies que presentan las muestras están compuestas de una variedad de materiales, que incluyen materiales porosos o no porosos, proporcionando los materiales porosos áreas de tipo esponja, poliméricas, de gran superficie específica para la adsorción optimizada y presentación del analito.

Se funde polipropileno o poliestireno o polietileno o policarbonato en una llama abierta, y se depositan como una capa delgada sobre un elemento de sonda de acero inoxidable de 2 mm de diámetro para cubrirlo completamente. Se corta una varilla de vidrio sólido o filamentos de nailon sólidos (de hasta 1,5 mm de diámetro) o una varilla de poliacrilamida en segmentos de 1 cm, y se insertan en el soporte de la sonda de acero inoxidable. Se insertan barras de agitación magnéticas (1,5 x 8 mm, revestidas con teflón) en el soporte de la punta de la sonda de acero inoxidable. Se mezcla una alícuota de 1 \mul de mezcla peptídica que contiene (GHHPH)_{5}G y dominio de dimerización de receptor de estrógenos humano, con 2 \mul de ácido dihidroxibenzoico (disuelto en 30% de metanol, 0,1% de ácido trifluoroacético) en cada uno de tales elementos de sonda, y se analiza mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser. La Figura 4 muestra que los analitos se pudieron desorber de varios ejemplos de superficies aislantes, biocompatibles.

Estas superficies se pueden derivatizar (a densidades variables) para unirse mediante enlaces químicos (covalente o no covalente) a reactivos de adsorción por afinidad (dispositivos de captura por afinidad), moléculas que absorben energía (unión a moléculas "matriz") o moléculas de unión fotolábiles. La geometría de la superficie de presentación de las muestras se varía (es decir, tamaño, textura, flexibilidad, grosor, etc.) para adecuar a las necesidades (por ejemplo, inserción en un organismo vivo a través de espacios de tamaños predeterminados) del experimento (ensayo).

Ejemplo 3 Desorción por láser dirigido a la afinidad (Superficie Potenciada de Captura por Afinidad, SEAC - la invención)

Este ejemplo describe el uso de reactivos de afinidad en fase sólida ya existentes y nuevos diseñados para (1) la captura (adsorción) de uno o más analitos, (2) la preparación de estos analitos capturados (por ejemplo, lavado con agua u otras disoluciones tamponadas o no tamponadas para eliminar contaminantes tales como sales, y ciclos múltiples de lavado, tales como con disolvente orgánico polar, disolvente que disuelve detergentes, ácido diluido, base diluida o urea), y (3) de forma más importante, la transferencia directa de estos analitos capturados y preparados a la superficie de la sonda para desorción subsiguiente del analito (para detección, cuantificación y/o análisis de masas). Los dispositivos de captura por afinidad están inmovilizados en una variedad de materiales, que incluyen materiales eléctricamente aislantes (porosos y no porosos), materiales flexibles o no rígidos, materiales ópticamente transparentes (por ejemplo, vidrio, que incluye vidrio de densidades variables, grosores, colores y con índices de refracción variables), así como materiales menos reactivos, más biocompatibles (por ejemplo, biopolímeros tales como agarosa, dextrano, celulosa, almidones, péptidos, y fragmentos de proteínas y de ácidos nucleicos). La punta preferida de la sonda, o superficie de la muestra, para adsorción/presentación selectiva de muestra para análisis de masas es (1) acero inoxidable (u otro metal) con un revestimiento polimérico sintético (por ejemplo, dextrano o agarosa reticulados, nailon, polietileno, poliestireno) adecuado para la unión covalente de biomoléculas específicas u otros reactivos de afinidad no biológicos, (2) vidrio o material cerámico y/o (3) plásticos (polímeros sintéticos). Las estructuras químicas implicadas en la inmovilización selectiva de reactivos de afinidad a estas superficies de sonda englobarán la variedad conocida de medios de inmovilización covalente o no covalente dependientes de oxígeno, dependientes de carbono, dependientes de azufre, y/o dependientes de nitrógeno.

I. Ion metálico inmovilizado a la superficie como dispositivo de captura por afinidad

1. Se queda un ion Cu(II) mediante el grupo iminodiacetato (IDA) unido covalentemente a perlas de agarosa porosas (Sepharose quelante de flujo rápido, Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ, densidad del ligando 22-30 \mumoles/ml de gel) o bien a perlas de gel de sílice sólidas (quelante TSK-SW, ToyoSoda, Japón, densidad del ligando 15-20 \mumoles/ml de gel). Se mezcla una mezcla de péptidos sintéticos que contienen neurotensina (1655 Da), péptido activante del esperma (933 Da) y angiotensina I (1296,5 Da) con un volumen empaquetado de 50 \mul de TSK-SW IDA-Cu(II) a pH 7,0 (20 mM de fosfato de sodio, cloruro de sodio 0,5 M) a 23ºC durante 10 minutos. El gel se separa de la disolución peptídica restante por centrifugación, y entonces se lava con 200 \mul de tampón de fosfato de sodio con cloruro de sodio, pH 7,0, tres veces para eliminar los péptidos unidos no específicamente. Finalmente, el gel se suspende en 50 \mul de agua. Se mezclan alícuotas de 2 \mul de suspensión de gel y disolución peptídica no adsorbida con 1 \mul de ácido sinapínico (disuelto en metanol) en una punta de sonda de acero inoxidable, y se analiza mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo por desorción con láser. Tras adquirir cinco espectros (media de 100 disparos de láser por espectro) en diversos puntos de la punta de la sonda, se eliminó el ácido sinapínico mediante metanol. Se añadió una alícuota de 2 \mul de CuSO_{4} 20 mM, entonces se mezcló con 1 \mul de ácido sinapínico, y se volvió a analizar mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo por desorción con láser. Tras adquirir otros cinco espectros (media de 100 disparos de láser por espectro) en diversos puntos de la punta de la sonda, el ácido sinapínico se eliminó mediante metanol. El péptido restante adsorbido en perlas de gel de IDA-Cu(II) se digirió entonces con 1 \mul de tripsina (Sigma) en bicarbonato de sodio 0,1 M, pH 8,0, a 23ºC durante 10 minutos en una cámara de humedad. Las perlas de gel se lavaron entonces con agua para eliminar la enzima y la sal antes de que se añadiera 1 \mul de ácido sinapínico, y la mezcla se analizó mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo por desorción con láser. La Figura 5A muestra las señales moleculares (y los múltiples aductos de Na) del factor activante del esperma (933 Da) y de neurotensina (1655 Da) en la disolución peptídica restante no absorbida por IDA-Cu(II). No hay ningún pico significativo que corresponde a la angiotensina I (1296,5 Da). El espectro de masas en la Figura 5B muestra los picos de angiotensina I más el aducto de Na que son adsorbidos selectivamente sobre el gel de IDA-Cu(II). Cuando el gel de IDA-Cu(II) se lavó posteriormente con 500 \mul de agua, dos veces, el espectro de masas resultante muestra sólo el ion progenitor de angiotensina I y ningún pico de aductos (Figuras 5 y 6, perfiles C). La Figura 6D muestra la unión in situ a cobre (1 y 2 Cu) por el péptido de angiotensina. La Figura 6E muestra la digestión in situ con tripsina del péptido de angiotensina en la posición única Arg2 en la secuencia.

Este ejemplo ilustra que: a) la desorción con láser se lleva a cabo con éxito sobre el analito adsorbido por afinidad sobre el ion metálico inmovilizado a la superficie; b) una vez unido, la superficie se lava con diversos disolventes para eliminar todos los compuestos contaminantes en la muestra para dar un espectro de masas muy limpio del analito; c) el dispositivo de captura por afinidad selecciona sólo el analito de estructura definida (en este caso, se adsorbe selectivamente la angiotensina I de la mezcla peptídica mediante IDA-Cu(II) debido a que este péptido tiene un N-terminal libre y dos residuos aminoácidos de histidina en la secuencia, propiedades ambas que se requieren para la unión fuerte a Cu(II); mientras que tanto el factor activante del esperma como la neurotensina tienen el N-terminal bloqueado y ningún residuo aminoácido de histidina en su secuencia); d) los análisis de estructura y de función mediante las modificaciones secuenciales in situ químicas o enzimáticas se llevan a cabo sobre el analito adsorbido con una pérdida mínima en cada etapa de reacción y lavado; y e) se usa un elemento de sonda con un sustrato (por ejemplo, angiotensina I) unido a superficie para monitorizar la actividad enzimática específica (por ejemplo, tripsina) in situ (por ejemplo, dentro del tubo gastrointestinal del cuerpo humano).

2. Se mezcló una disolución de mioglobina de corazón de caballo (325 pmoles, 16.952 Da) con 50 \mul de TSK-SW IDA-Cu(II) a pH 7,0 (fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M) a 23ºC durante 10 minutos. El gel se separó de la disolución mediante centrifugación, y entonces se lavó con 50 \mul de tampón, dos veces, y 500 \mul de agua, dos veces. Entonces se estimó espectrofotométricamente la cantidad de mioglobina restante en todas estas disoluciones, y entonces se puede calcular la cantidad adsorbida sobre el gel. El gel se suspende en 50 \mul de agua, y entonces se diluye en series en agua. Se mezcla una alícuota de 0,5 \mul de la suspensión del gel diluida con 1 \mul de ácido sinapínico (disuelto en 30% de metanol, 0,1% de ácido trifluoroacético), y se analizó mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo por desorción con láser. La Figura 7 muestra que se obtiene una señal detectable (señal/ruido = 6, tras hacer la media de 50 disparos de láser) de mioglobina con una cantidad calculada de 4 a 8 fmoles depositados sobre la punta de la sonda.

Este ejemplo ilustra que los analitos adsorbidos por afinidad sobre una superficie son mucho más fáciles de transferir y están libres de cualquier pérdida por adsorción no específica en la superficie del recipiente y de los dispositivos de transferencia. El analito adsorbido se secuestra en áreas predeterminadas (que incluso son menores que el tamaño del punto del láser) de la superficie de presentación de las muestras en cantidades bajas (ato a femtomoles) a una densidad definida de superficie o concentración local requerida para la detección eficiente mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo por desorción/ionización con láser.

3. Se sintetizan péptidos de \beta-caseína humana (E2-K18) en un sintetizador de péptidos Applied Biosystem Modelo 430A usando el protocolo NMP-HOBt. Los residuos de Ser a fosforilar se acoplan a la cadena de péptido sin grupo protector de la cadena lateral. La Ser no protegida se fosfinila primero usando N,N-diisopropilfosforamidito de di-t-butilo. El éster de fosfito se oxida entonces con peróxido de t-butilo, se lava y se rompe de la resina. Se eliminan todos los grupos productores de la cadena lateral con ácido trifluoroacético al 95%. Los fosfopéptidos brutos se extraen con étermetil-t- butílico, y se secan. Esta preparación bruta de fosfopéptidos sintéticos se disuelve en 50 mM de MES, cloruro de sodio 0,15 M, pH 6,5, y se mezcla con 50 \mul de tris(carboximetil)-etilendiamina (TED)-Fe(III) sobre Sepharose porosa (sintetizada como se describe por Yip, T.-T. y Hutchens, T.W., Protein Expression and Purification 2: 355-362 (1991), densidad del ligando 65 \mumoles/ml) a 23ºC durante 15 minutos. El gel se lava con 500 \mul del mismo tampón tres veces, y entonces con 500 \mul de agua una sola vez. Se mezcla una alícuota de 1 \mul de gel con 1 \mul de ácido sinapínico (disuelto en 30% de metanol, 0,1% de ácido trifluoroacético) en la punta de la sonda, y se analiza mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo por desorción con láser. Tras adquirir cinco espectros (media de 100 disparos de láser por espectro) en diversos puntos de la punta de la sonda, se elimina el ácido sinapínico mediante metanol, y los fosfopéptidos restantes adsorbidos sobre TED-Fe(III) se digieren directamente en la punta de la sonda mediante 1 \mul de fosfatasa alcalina (suspensión de fosfato de amonio, Sigma) en 50 mM de HEPES, pH 7,0, a 23ºC durante 10 minutos en una cámara de humedad. El gel se lava con agua para eliminar la enzima y la sal. Se añade ácido sinapínico, y la muestra se vuelve a analizar mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo por desorción con láser. La Figura 8 (perfil superior) muestra la distribución del péptido caseínico (1934 Da) con múltiples formas fosforiladas. Tras la digestión in situ con fosfatasa alcalina, sólo queda la forma original no fosforilada (perfil inferior).

Este ejemplo ilustra la aplicación de SEAC como una monitorización rápida de la síntesis de fosfopéptidos en una mezcla bruta sin limpieza previa. La identidad del fosfopéptido se confirma fácilmente mediante digestión in situ con fosfatasa alcalina.

4. Se mezclan alícuotas de 100 \mul de fórmula para niños prematuros (SIMILAC, Meade Johnson) y contenido gástrico de aspirado de infante prematuro 90 minutos tras la administración de la fórmula con 50 \mul de Sepharose con TED-Fe(III) en 0,1 M de MES, 0,15 M de cloruro de sodio, pH 6,5, a 23ºC durante 15 minutos. El gel se lavó con 500 \mul del mismo tampón, tres veces, y entonces con 500 \mul de agua, una vez. Se mezclaron alícuotas de 1 \mul de suspensiones de gel o fórmula para niño prematuro o aspirado gástrico con 2 \mul de ácido sinapínico (disuelto en acetonitrilo al 50%, ácido trifluoroacético al 0,1%) en la punta de la sonda, y se analizó mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo por desorción con láser. La Figura 9 muestra que el espectro de masas de todo el aspirado gástrico (segundo a partir del perfil superior) es bastante similar al de la fórmula completa de infante (perfil inferior) en la región de 1.000- 15.000 Da. Sin embargo, los espectros de masas de los analitos adsorbidos selectivamente mediante TED-Fe(III) procedentes de las dos muestras son bastante diferentes; hay más fosfopéptidos de bajo peso molecular (es decir, unión mediante TED-Fe(III)) presente en el aspirado gástrico (perfil superior) que en la fórmula (segundo desde el perfil inferior) debido a la digestión proteolítica gástrica de las fosfoproteínas presentes en la fórmula.

Este ejemplo ilustra que SEAC es particularmente útil analizando analitos específicos en muestras biológicas. Los fosfopéptidos son más difíciles de detectar en presencia de otros componentes contaminantes en una muestra compleja debido a que se ionizan menos en el modo de ion positivo. Sin embargo, cuando los fosfopéptidos se adsorben selectivamente y se eliminan todos los otros componentes en la muestra, no ocurre tal depresión de la señal.

5. Se mezclan alícuotas de 200 \mul de glicoproteína enriquecida con histidina humana y bovina con 50 \mul de Sepharose (Pharmacia) IDA-Cu(II) a pH 7,0 (fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M) a 23ºC durante 10 minutos. El gel se lava con 500 \mul de tampón, dos veces, y 500 \mul de agua, una vez. Se mezclan alícuotas de 1 \mul de gel con 2 \mul de ácido sinapínico (disuelto en metanol al 30%, ácido trifluoroacético al 0,1%), y se analizaron mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo por desorción con láser. Tras adquirir cinco espectros (media de 100 disparos de láser por espectro) en diversos puntos de la punta de la sonda, se eliminó el ácido sinapínico mediante lavado con metanol. Las glicoproteínas restantes adsorbidas sobre el gel de IDA-Cu(II) se digirió entonces con N-glicanasa en fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 0,5 M, urea 3 M, pH 7,0 a 37ºC toda la noche en una cámara de humedad. Tras lavar con agua para eliminar la enzima y la sal, se añadieron 2 \mul de ácido sinapínico y la muestra se analizó mediante espectrometría de masas. Tras adquirir cinco espectros (media de 100 disparos de láser por espectro) en diversos puntos de la punta de la sonda, se eliminó el c sinapínico mediante metanol. Se añadieron alícuotas de 2 \mul de tripsina en bicarbonato de sodio 0,1 M, y se incubaron a 37ºC durante 30 minutos en una cámara de humedad. Tras un lavado con agua para eliminar la enzima y la sal, se añadió ácido sinapínico, y la muestra se analizó mediante espectrometría de masas. Tras adquirir cinco espectros (media de 100 disparos de láser por espectro) sobre diversos puntos de la punta de la sonda, se eliminó el ácido sinapínico mediante metanol. Se añadieron alícuotas de 2 \mul de CuSO_{4} 20 mM. Esto fue seguido de la adición de 2 \mul de ácido sinapínico, y entonces de los análisis por espectrometría de masas. Tras adquirir cinco espectros (media de 100 disparos de láser por espectro) en diversos puntos de la punta de la sonda, se eliminó el ácido sinapínico mediante metanol. Se añadieron alícuotas de 2 \mul de pirocarbonato de dietilo (Sigma) en HEPES 5 mM, pH 6,5, y se incubaron a 23ºC durante 30 minutos. Tras un lavado con agua para eliminar los productos químicos y las sales del tampón, se añadieron 2 \mul de ácido sinapínico, y la muestra se analizó mediante espectrometría de masas. Para obtener una secuencia parcial de los péptidos unidos a metal, en lugar de modificar los residuos de histidina con pirocarbonato de dietilo, añadir 1 \mul de carboxipeptidasa Y (Boehringer Mannheim) a la digestión tríptica adsorbida sobre la superficie, e incubar a temperatura ambiente en una cámara de humedad durante 5 minutos. Lavar la enzima y la sal con agua, añadir 1 \mul de ácido sinapínico y analizar mediante espectrometría de masas. La Figura 10A muestra los espectros de masas de materiales compuestos de glicoproteína enriquecida con histidina tanto humana como bovina adsorbida sobre Sepharose con IDA-Cu(II) antes y después de la digestión con N-glicanasa. Los desplazamientos másicos representan la eliminación del hidrato de carbono de las glicoproteínas respectivas. La Figura 10B muestra los espectros de masas de materiales compuestos de péptidos digeridos con tripsina procedentes de proteínas desglicosiladas de las dos especies (perfil superior para la proteína humana, segundo desde el perfil inferior para la proteína bovina) y la unión in situ a Cu(II) de los péptidos digeridos con tripsina de las dos especies (segundo desde el perfil superior para la proteína humana, perfil inferior para la proteína bovina; los números 1, 2 indican el número de unión de cobre). La Figura 10C muestra que uno de tales péptidos que se une a Cu(II) (perfil inferior) tiene al menos 4 residuos His que se modifican específicamente por pirocarbonato de dietilo para formar 4 aductos N-carbetoxi-histidílicos (1-4, perfil superior). La Figura 10D muestra la secuencia C-terminal parcial del principal péptido que se une a Cu en la glicoproteína rica en histidina bovina. Este ejemplo ilustra el uso efectivo de SEAC para investigar la estructura y función de dominios de unión a metal de proteínas procedentes de diferentes especies.

II. Anticuerpo inmovilizado a la superficie como dispositivo de captura por afinidad

1. Se genera de forma habitual un anticuerpo policlonal antilactoferrina humana de conejo frente a lactoferrina humana purificada de Bethyl Laboratories (Montgomery, TX). El anticuerpo es purificado por afinidad mediante adsorción tiofílica y se inmoviliza en columnas de lactoferrina. Se obtiene IgG anti-conejo de oveja unida covalentemente a perlas magnéticas de Dynal AS, Oslo, Noruega (perlas de poliestireno supermagnético de 2,8 \mum uniformes, densidad de ligando 10 \mug de IgG de oveja por mg de perla). Se incuba lactoferrina humana (1 nmoles, marcado isotópicamente con ^{69}Fe, 81.100 Da) con anticuerpo antilactoferrina humana de conejo en 20 mM de fosfato de sodio, 0,15 M de cloruro sódico, pH 7,0 a 37ºC durante 30 minutos. Subsiguientemente, se añaden 40 \mul de IgG anti-conejo de oveja sobre dinaperlas (6-7 x 10^{3} perlas/ml), y se incuba a 37ºC durante 30 minutos. Las perlas se lavan con 500 \mul de tampón de fosfato de sodio tres veces, y 500 \mul de agua, dos veces. La cantidad final de lactoferrina humana unida al complejo se estima que es 4 pmoles. Aproximadamente la décima parte de las perlas se transfieren a una punta de sonda magnética revestida con teflón, mezclada con 2 \mul de ácido sinapínico (disuelto en 30% de metanol, 0,1% de ácido trifluoroacético), y se analiza mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser. La Figura 11 muestra la presencia de lactoferrina (81,143 Da) en el complejo de antígeno/anticuerpo primario/anticuerpo secundario (perfil superior), mientras que el control de anticuerpo primario/anticuerpo secundario (perfil inferior) muestra sólo la señal del anticuerpo de conejo (149.000 Da para la únicamente cargada, y 74.500 Da para la doblemente cargada).

Este ejemplo ilustra que a) la desorción por láser se lleva a cabo de forma exitosa sobre analito adsorbido por afinidad en un anticuerpo inmovilizado sobre la superficie (si la señal de analito se identifica de forma no ambigua en una mezcla de complejo de anticuerpo primario/analito, en este método para identificar el analito se usa cualquier dispositivo de captura, por ejemplo, anticuerpo secundario inmovilizado a la superficie, proteína A, proteína G, estreptavidina, de los anticuerpos primarios); b) el principio del descubrimiento de la proteína vía sucesos de reconocimiento molecular específicos en los que se detecta uno de los analitos a través de su asociación con la diana principal de captura; y c) el uso de una superficie magnética como dispositivo de captura eficiente.

2. Se une covalentemente lactoferrina antihumana de conejo purificada por afinidad a la punta de un elemento de sonda de nailon activado (2 mm de diámetro) vía glutaraldehído. Esta se sumerge en 1 ml de orina de niño prematuro, pH 7,0, que contiene 350 fmoles de lactoferrina humana, y se agita a 4-8ºC durante 15 h. La punta de la sonda de nailon se retiró y se lavó con 1 ml de 20 mM de fosfato de sodio, 0,5 M de cloruro de sodio, 3 M de urea, pH 7,0, tres veces, y 1 ml de agua, dos veces. Se añadió una alícuota de 2 \mul de ácido sinapínico (disuelto en 30% de metanol, 0,1% de ácido trifluoroacético), y la muestra se analizó por espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser. La Figura 12 muestra el ion molecular de lactoferrina humana (señal/ruido = 2,5, media de 25 disparos de láser) en el espectro de masas. La Figura 13 muestra el espectro de masas equivalente de orina completa de niño prematuro que contiene 1 nmol/ml de lactoferrina; la supresión de la señal provocada por la presencia de otros componentes en la muestra de orina es tan importante que incluso la adición de un exceso de varios miles de veces sobre 350 fmoles/ml de lactoferrina, según se describe para la Figura 12, no se puede detectar.

Este ejemplo ilustra el uso de un dispositivo SEAC sobre una superficie plana (una configuración bidimensional) de un elemento de sonda flexible. Este dispositivo SEAC se puede usar para aislar materiales analito dianas de muestras biológicas no diferenciadas, tales como sangre, lágrimas, orina, saliva, fluidos gastrointestinales, fluido de la médula espinal, fluido amniótico, médula ósea, bacterias, virus, células en cultivo, tejido de biopsia, tejido vegetal o fluidos vegetales, tejidos o fluidos de insectos, etc. La etapa de adsorción por afinidad específica limpió el analito de contaminación de otros componentes en una mezcla compleja, y de este modo supera el efecto de depresión de la señal especialmente cuando el analito está presente en una concentración muy baja (femtomoles/ml).

3. Se logra una mejora adicional de la sensibilidad de la detección mediante la técnica SEAC mediante amplificación de un marcador isotópico unido al analito. Una forma de hacer esto es mediante la combinación de catálisis enzimática y el sistema de estreptavidina/biotina. Tras capturar cantidades pequeñas de lactoferrina en un elemento de sonda de nailon según se describe en el Ejemplo 3.II.2, se usa anticuerpo antilactoferrina biotinilado o ADN de una sola hebra biotinilada para unirse específicamente a la lactoferrina. Entonces se añade estreptavidina para unirse específicamente al marcador biotinilado. Finalmente se añade fosfatasa alcalina biotinilada para unirse específicamente a la estreptavidina. Puesto que varias de tal fosfatasa alcalina biotinilada se puede unir a una estreptavidina, existe un nivel principal de amplificación. El nivel secundario de amplificación proviene de la catálisis enzimática, en la que la enzima puede lograr un número de velocidad de recambio de 10^{2} a 10^{3} min^{-1}. El ensayo de la actividad enzimática de la fosfatasa alcalina se puede lograr fácilmente usando un sustrato fosforilado de bajo peso molecular tal como ATP, NADPH o un fosfopéptido. La eficiencia para detectar el desplazamiento de masa de un analito de bajo peso molecular es mucho mayor que la de una glicoproteína de 80 kDa.

4. La última mejora de detección actualmente se logra mediante la amplificación basada en el principio de reacción de cadena de polimerasa. Tras capturar cantidades pequeñas de lactoferrina en un elemento de sonda de nailon según se describe en el Ejemplo 3.II.2, se usa anticuerpo antilactoferrina biotinilado o ADN de una sola hebra biotinilada para unirse específicamente a la lactoferrina. Entonces se añade estreptavidina para unirse específicamente al marcador isotópico biotinilado. Finalmente se añade una pieza de ADN lineal biotinilado para unirse a la estreptavidina. Este marcador isotópico de ADN unido se amplifica en un procedimiento de reacción en cadena de polimerasa de 30 ciclos. Cada ciclo consta de una etapa de desnaturalización de 1 minuto a 94ºC, una reacción de hibridación de 1 minuto a 58ºC y una reacción de extensión del cebador durante 1 minuto a 72ºC. Este técnica proporciona factores de amplificación en el intervalo de 10^{5}. El ADN amplificado se detecta directamente mediante espectrometría de masas por desorción con láser usando ácido 3-OH picolínico como la matriz.

5. Se genera de forma habitual anticuerpo antiglicoproteína rica en histidina bovina de conejo policlonal frente a glicoproteína rica en histidina bovina purificada por Bethyl Laboratories (Montgomery, TX). El anticuerpo se purifica por afinidad mediante adsorción tiofílica, y se inmoviliza en columnas de glicoproteína ricas en histidina bovina. El anticuerpo purificado se inmoviliza en Affigel 10 (BioRad Laboratories, Hercules, CA, densidad de ligando 15 \mumoles/mg de gel) según la instrucción del fabricante. Se diluye una alícuota de 200 \mul de calostro bovino con 200 \mul de 20 mM de fosfato de sodio, pH 7,0, y se mezcla con 50 \mul de anticuerpo inmovilizado a 23ºC durante 30 minutos. El gel se lava con 500 \mul de 20 mM de fosfato de sodio, 0,5 M de cloruro de sodio, 3 M de urea, pH 7,0, tres veces, y 500 \mul de agua, dos veces. Se mezcló una alícuota de 1 \mul del gel lavado con 2 \mul de ácido sinapínico (disuelto en 30% de metanol, 0,1% de ácido trifluoroacético) sobre la punta de una sonda, y se analizó mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser. La Figura 17 muestra los espectros de masas de material compuesto de glicoproteína rica en histidina bovina purificada (perfil inferior) y proteínas adsorbidas por afinidad procedentes de calostro bovino (perfil superior). El resultado indica la presencia de glicoproteína rica en histidina intacta, y sus principales fragmentos proteolíticos en el calostro bovino.

Este ejemplo ilustra el uso efectivo de SEAC como una técnica rápida y simple para detectar y caracterizar nuevas proteínas en una pequeña cantidad de fluido biológico. Este resultado apoya los hallazgos iniciales obtenidos por la técnica tremendamente intensa de inmunotransferencia de electroforesis en gel de poliacrilamida.

6. Se logró el mapa del epítopo del anticuerpo con la técnica SEAC. Se inmovilizan tres fuentes diferentes de hormona estimulante de folículos antihumana (un policlonal específico frente a beta FSH de Chemicon International, Temecula, CA, un monoclonal específico frente a epítope beta 3 de Serotec, Indianapolis, IN, un monoclonal de Biodesign, Kennebunk, ME) sobre AffiGel 10 según la instrucción del fabricante. Estos anticuerpos inmovilizados se ensayan todos para unirse específicamente a la hormona estimulante del folículo incubando con dos preparaciones diferentes de hormona estimulante del folículo (una preparación semipura de Chemicon, y una preparación bruta de Accurate Chemical and Scientific Corp.), y entonces se analizó mediante espectrometría de masas en presencia de ácido sinapínico. Entonces, la preparación semipura de FSH humana (Chemicon) se digiere con tripsina, y se hacen reaccionar alícuotas separadas (7 \mul) con los anticuerpos inmovilizados (10 \mul de una suspensión en gel 1:1) en disolución salina tamponada con fosfato a 4ºC durante 2 h. Tras lavar con disolución salina tamponada con fosfato y con agua, las proteínas adsorbidas se analizaron mediante espectrometría de masas con desorción por láser en presencia de ácido sinapínico. La Figura 15 muestra los espectros de masas de material compuesto de los péptidos de la hormona estimulante de folículos reconocidas por los diferentes anticuerpos. Los dos anticuerpos monoclonales reconocen claramente diferentes epítopes, mientras que el anticuerpo policlonal reconoce múltiples epítopes comunes a los reconocidos por ambos anticuerpos monoclonales.

III. Ácido nucleico inmovilizado a la superficie como el dispositivo de captura por afinidad

1. Se obtienen ADN de una sola hebra inmovilizada sobre perlas de agarosa al 4%, de GIBCO BRL (Gaithersburg, MD, densidad de ligando 0,5-1,0 mg de ADN/ml de gel). Se mezcla una alícuota de lactoferrina humana ^{125}I (equivalente a 49 nmoles) con 100 \mul de ADN de una sola hebra inmovilizado en 20 mM de HEPES, pH 7,0 a temperatura ambiente durante 10 min. El gel se lava con 500 \mul de tampón HEPES, cinco veces, y entonces se suspende en un volumen igual de agua. La cantidad de lactoferrina unida por perla se estima que es de 62 fmoles determinando la radioactividad y contando el número de perlas por unidad de volumen. Se depositan diversos números de perlas (de 1 a 12) en puntas de sonda de 0,5 mm de diámetro, se mezclan con 0,2 \mul de ácido sinapínico (disuelto en 30% de metanol, 0,1% de ácido trifluoroacético), y se analiza mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser. La Figura 16 muestra el espectro de masas de lactoferrina adsorbida por afinidad sobre una única perla de agarosa con ADN de una sola hebra. Este es un espectro representativo de un total de cinco (media de 100 disparos de láser por espectro) obtenidos de la perla única.

Este ejemplo ilustra que la desorción por láser se lleva a cabo con éxito sobre el analito adsorbido por afinidad sobre biopolímero inmovilizado a la superficie, tal como ácido nucleico. La especificidad de interacción entre lactoferrina humana y ADN ha sido documentada y explotada eficazmente en la captura de cantidades minúsculas de lactoferrina procedente de orina de niño prematuro. En este caso, la combinación de la eficiencia de transferencia del dispositivo de captura por afinidad de lactoferrina con la sensibilidad de la espectrometría de masas por desorción con láser aumenta enormemente la sensibilidad de la detección.

2. Se mezcla una alícuota de 1 ml de orina niño prematuro que contiene 30 pmoles de lactoferrina humana ^{59}Fe con 20 \mul de agarosa con ADN de una sola hebra en 0,1 M de HEPES pH 7,4 a 23ºC durante 15 min. El gel se lavó con 500 \mul de tampón HEPES, dos veces, y 500 \mul de agua, dos veces. El gel se suspendió en un volumen igual de agua, y se mezcló 1 l de la suspensión (que contiene no más de 350 fmoles de lactoferrina adsorbida, según se determinó por radioactividad), con 1 \mul de ácido sinapínico (disuelto en 30% de metanol, 0,1% de ácido trifluoroacético) en una punta de sonda, y se analizó mediante espectrometría de masa de tiempo de vuelo con desorción por láser. La Figura 17 muestra el espectro de masas de lactoferrina extraída de orina mediante ADN inmovilizado a la superficie como el dispositivo de captura por afinidad.

Este ejemplo ilustra la eficiencia y sensibilidad de la detección de cantidades minúsculas de analito de elevado peso molecular en fluido biológico con el dispositivo de captura de tipo ADN.

IV. Biomolécula miscelanea inmovilizada en la superficie como el dispositivo de captura por afinidad

1. Se inmoviliza inhibidor de tripsina de haba de soja (Sigma) sobre AffiGel 10 (BioRad) según las instrucciones del fabricante. Se mezcla una alícuota de 100 \mul de aspirado duodenal humano con 50 \mul de inhibidor de tripsina de haba de soja inmovilizado a la superficie, a pH 7,0 (20 mM de fosfato de sodio, 0,5 M de cloruro sódico) a 23ºC durante 15 min. El gel se lava entonces con 500 \mul de tampón de fosfato, tres veces, y 500 \mul de agua, dos veces. Se mezclaron alícuotas de 1 \mul de suspensión en gel del aspirado duodenal original con 2 \mul de ácido sinapínico (disuelto en 50% de acetonitrilo, 0,1% de ácido trifluoroacético), y se analizó mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser. La Figura 18A muestra el espectro de masas del material compuesto del aspirado duodenal total (perfil inferior) y las proteínas adsorbidas mediante inhibidor de tripsina de haba de soja inmovilizado a la superficie (perfil superior). El pico principal en la muestra capturada por afinidad representa la tripsina. Se obtienen resultados similares con sólo 1 \mul de fluido duodenal depositado en a) la punta de un elemento de sonda de nailon acoplado a inhibidor de tripsina de haba de soja vía glutaraldehído, y b) la punta de un elemento de sonda acrílico revestido con poliacrilamida acoplado con inhibidor de tripsina de haba de soja vía glutaraldehído o divinilsulfona (Figura 18B).

Estos resultados indican a) la falta de ambigüedad al detectar y caracterizar un analito específico en fluidos biológicos, y b) la factibilidad de toma de muestras in situ insertando un elemento de sonda flexible (por ejemplo nailon) a través de un endoscopio directamente en el cuerpo humano (por ejemplo intestino delgado) para fines de diagnóstico.

2. Se obtiene estreptavidina inmovilizada sobre dinaperlas (perlas uniformes, de 2,8 \mum, superparamagnéticas, de poliestireno) procedentes de Dynal, AS, Oslo, Noruega. Se mezclan alícuotas de 150 \mul de plasma u orina humana que contiene 18 pmoles de insulina biotinilada (Sigma) con 20 \mul de una suspensión de estreptavidina inmovilizada en dinaperlas a pH 7,0 (20 mM de fosfato de sodio, 0,5 M de cloruro de sodio) a 23ºC durante 10 minutos. Las perlas se lavan entonces con 500 \mul de tampón que contiene 3 M de urea, tres veces, y 500 \mul de agua, una vez. Se mezclan alícuotas de 0,5 \mul de la suspensión de las perlas con 2 \mul de ácido sinapínico (disuelto en 30% de metanol, 0,1% de ácido trifluoroacético), y se analizó mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser. La Figura 19A muestra el espectro de masas de insulina biotinilada adsorbida por afinidad procedente de orina. Los múltiples picos representan la insulina derivatizada con uno a tres grupos biotina. La Figura 19B muestra el espectro de masas de insulina biotinilada adsorbida por afinidad procedente de plasma.

Este ejemplo ilustra que la desorción por láser se lleva a cabo sobre analito adsorbido por afinidad vía la unión biotina-estreptavidina. En vista de la fuerte unión entre biotina y avidina (Ka = 10^{15} M^{-1}), este sistema sirve como un dispositivo SEAC ideal para proteínas y ácidos nucleicos en una superficie de sonda en la que se llevan a cabo modificaciones in situ químicas y enzimáticas secuenciales.

3. Se expresó el dominio (84 residuos) de unión a ADN de receptor de estrógenos humano, en bacterias. El vector de expresión del plásmido pT_{7}ERDBD (J. Schwabe, MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK) se transforma en células BL21(DE3)plyS de E. coli (Novagene). La expresión del dominio de unión a ADN se induce mediante 1 mM de isopropiltiogalactósido (GIBCO BRL), y la bacteria se cosechó tras inducción durante 3 h. La bacteria inducida completa se analizó directamente mediante espectrometría de masas de desorción/ionización por láser asistida en matriz para verificar que el dominio de unión a ADN es el péptido principal sintetizado. El péptido se purifica mediante HPLC en fase inversa a partir del lisado bacteriano, y se moviliza en AffiGel 10 (BioRad). Se sintetiza una secuencia de ADN de 30-bp que contiene el elemento de respuesta a estrógenos, mediante Genosys (Houston, TX). Se estudia la interacción de formas unidas a apo, Zn y Cu adsorbidas por afinidad a la superficie, de dominio de unión a ADN con ácido nucleico de secuencia específica (elemento de respuesta a estrógenos) sobre elementos de sonda de vidrio usando ácido 3-hidroxipicolínico como la matriz.

Este ejemplo ilustra el uso del dominio funcional superficial proteínico como dispositivo de captura en SEAC. El efecto de la unión a metal sobre la estructura y la función de tales dominios superficiales de proteínas se puede investigar.

4. Se usan diferentes alícuotas de lectinas inmovilizadas sobre superficies (por ejemplo Con A-Sepharose, lectina de germen de trigo-Sepharose, Pharmacia) para unir los glicopéptidos en digestiones trípticas de glicoproteína enriquecida con histidina humana y bovina. Tras lavar con tampones y agua para eliminar los péptidos no unidos, se realiza la digestión enzimática secuencial in situ con FUCasa I, MANasa I, HEXasa I, NANasa III y PNGasa (Glyko, Inc, Novato, CA). Las muestras se analizan con espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser para estudiar la composición de hidratos de carbono de los glicopéptidos en las dos proteínas. Este ejemplo ilustra el uso del dispositivo de SEAC para trabar un glicopéptido, cuyo componente de hidratos de carbono se puede secuenciar entonces in situ.

V. Colorante inmovilizado a la superficie como el dispositivo de captura por afinidad (no de la invención)

Se obtiene de Sigma agarosa Cibacron Blue 3GA (Tipo 3000, agarosa en perlas al 4%, densidad de ligando 2-5 \mumoles/ml de gel). Se mezcla una alícuota de 200 \mul de plasma humano con 50 \mul de Cibacron Blue inmovilizado a superficie a pH 7,0 (20 mM de fosfato de sodio, 0,5 M de cloruro sódico) a 23ºC durante 10 min. El gel se lava entonces con 500 \mul de tampón, tres veces, y 500 \mul de agua, dos veces. Se mezcla una alícuota de 1 \mul de suspensión de gel con 2 \mul de ácido sinapínico (disuelto en 50% de acetonitrilo, 0,1% de ácido trifluoroacético), y se analizó mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser. La Figura 20 muestra la adsorción selectiva de albúmina de suero humano (ion doblemente cargado [M+2H]^{2+}, 32.000 m/z, ion cargado una sola vez [M+H]^{+}, 64.000 m/z, ion dímero 2[M+H]^{+}, 128.000 m/z) procedente de la muestra de suero mediante Cibacron Blue inmovilizado sobre superficie (perfil inferior). Otros colorantes inmovilizados ensayados incluyen Reactivo Rojo 120-agarosa, Reactivo Azul-agarosa, Reactivo Verde-agarosa, Reactivo Amarillo-agarosa (todos de Sigma), y cada uno selecciona diferentes proteínas del plasma humano.

Ejemplo 4 Desorción Limpia Potenciada de la Superficie (SEND)

Este ejemplo describe el método para la desorción e ionización de analitos en el que el analito no se dispersa en una estructura cristalina de matriz sino que está presente dentro, sobre o encima de una superficie unida de moléculas que absorben energía en una posición que es accesible y receptiva a una amplia variedad de reacciones de modificación o reconocimiento químico, físico y biológico. La superficie se derivatiza con la densidad apropiada de moléculas que absorben energía enlazadas (covalente o no covalentemente) en una variedad de geometrías de forma que se usan monocapas y múltiples capas de moléculas que absorben energía unidas para facilitar la desorción de moléculas de analito de masas variables.

Los Ejemplos mostrados a continuación Grupos I-IV) demuestran que SEND y SEAC combinados en los que las moléculas que absorben energía adsorbidas (enlazadas) también actúan como reactivos de adsorción por afinidad, potencian la captura de moléculas de analito. Sin embargo, la presente invención no utiliza los reactivos de afinidad de los Grupos I, III y IV. Sólo los ejemplos del Grupo II, por lo tanto, son según la invención.

I. Moléculas que absorben energía unidas mediante enlace covalente a la superficie

1. Se disuelve cinamamida (Aldrich) (no una matriz a una longitud de onda de láser de 355 nm por la técnica anterior) en isopropanol:carbonato de sodio 0,5 M (3:1), y se mezcló con divinilsulfona (Fluka, Ronkonkoma, NY) activada Sepharose (Pharmacia) a 23ºC durante 2 h. Las moléculas que absorben energía en exceso se lavan con isopropanol. La estructura molecular propuesta se presenta en la Figura 21. Se depositan en las puntas de sondas alícuotas de 2 \mul de las moléculas unidas o libres, se añade 1 \mul de dominio de dimerización de receptor de estrógenos humano en 0,1% de ácido trifluoroacético sobre la parte superior, y se analiza mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser. Los resultados muestran que las señales del ion péptido se detectan sólo en la superficie con moléculas que absorben energía unidas (Figura 22, perfil superior), y las moléculas libres no son efectivas (Figura 22, perfil inferior).

2. Se disuelve bromuro de dinamilo (Aldrich) (no una matriz a una longitud de onda de láser de 355 nm por la técnica anterior) en isopropanol:carbonato de sodio 0,5 M (3:1), y se mezcló con Sepharose activada con divinilsulfona (Fluka) a 23ºC durante 15 h. Las moléculas que absorben energía en exceso se lavan con isopropanol. La estructura molecular propuesta se presenta en la Figura 23. Se depositan sobre las puntas de las sondas alícuotas de 2 \mul de las moléculas unidas o libres, se añade a la parte superior 1 \mul de mezclas peptídicas en ácido trifluoroacético al 0,1%, y se analiza mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser. Los resultados muestran que las señales del ion peptídico se detectan sólo en la superficie con moléculas que absorben energía unidas (Figura 24, perfil superior) y las moléculas libres no son efectivas (Figura 24, perfil inferior).

3. Se activa el ácido dihidroxibenzoico mediante diciclohexilcarbodiimida y se mezcla con resina ramificada Fmoc-MAP 8 (Applied Biosystems, Forster City, CA) a 23ºC durante 15 h. El exceso de moléculas que absorben energía se lava mediante metanol. En la Figura 25 se presenta la estructura molecular propuesta. Se depositan sobre las puntas de la sonda alícuotas de 1 \mul de la superficie ramificada MAP 8, con y sin moléculas unidas que absorben energía, se añadió 1 \mul de mezclas peptídicas en 0,1% de ácido trifluoroacético encima, y se analizó mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser. El resultado muestra que las señales de ion peptídico se detectan sólo sobre la superficie sin moléculas unidas que absorben energía (Figura 26, perfil inferior), la superficie de control sin ninguna de las moléculas que absorben energía no es efectiva (Figura 26, perfil superior).

4. Se disolvió ácido \alpha-ciano-4-hidroxicinámico en metanol, y se mezcló con AffiGel 10 o AffiGel 15 (BioRad) a diversos pH a 23ºC durante 2-24 horas. El exceso de moléculas que absorben energía se lava mediante metanol. Se depositan sobre las puntas de la sonda alícuotas de 2 \mul de las moléculas unidas, se añade 1 \mul de mezclas peptídicas o mioglobina, o tripsina o anhidrasa carbónica encima, y se analiza mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser. El resultado muestra que la señal del ion de mioglobina se detecta sobre la superficie sin moléculas unidas que absorban energía (Figura 27A) con muy pocas señales de iones de masa baja contaminantes (Figura 27B).

5. Se prepara una disolución de polietilamida al 40%, y se moldea en la forma deseada de una punta de sonda. Se deja que el gel se seque al aire hasta que no se observa una reducción apreciable del tamaño. La punta se sumerge en disolución de 9% de glutaraldehído/tampón (v/v), y se incuba con agitación suave a 37ºC durante 2 horas. Tras la incubación, se usó tampón para eliminar por enjuague el exceso de glutaraldehído. La punta activada se añade a una disolución de moléculas que absorben energía, tamponada saturada, y se incuba a 37ºC (aprox.) durante 24 horas (aprox.) con agitación suave. Se usan disolventes orgánicos para solubilizar las moléculas que absorben energía en situaciones que lo requieran. La punta se enjuaga con tampón, y se coloca en una disolución de 9% de etanolamina/agua (v/v) para incubar a 25ºC con agitación suave durante 30 minutos. Seguidamente, la punta se enjuaga con tampón, y se añade a una disolución de 5 mg/ml de cianoborohidruro sódico/tampón para incubar a 25ºC durante 30 minutos. Finalmente, la punta se enjuaga bien con tampón, y se almacena hasta su uso. Se lleva a cabo la misma reacción sobre puntas de nailon que se prepara mediante hidrólisis con HCl 6 N bajo sonicación durante 2 minutos, y entonces se enjuaga bien con agua y tampón. LA misma reacción también se lleva a cabo sobre puntas acrílicas activadas sumergiendo en NaOH al 20% durante 7 días con sonicación cada día durante 30-60 min, y entonces se lavan. En la Figura 28 se muestra la estructura molecular general propuesta de la superficie.

6. Se prepara una disolución de poliacrilamida al 40%, y se moldea en la forma deseada de una punta de sonda. El gel se seca al aire hasta que no se observa una reducción apreciable del tamaño. Se prepara un tampón de carbonato de sodio 0,5 M con un pH de 8,8, como tampón de enjuague. La punta se coloca entonces en una disolución de divinilsulfona (Fluka) y tampón a una relación de 10:1, respectivamente, y se incubó durante 24 horas. La punta se enjuaga con tampón, y se coloca en una disolución tamponada de moléculas que absorben energía, a un pH de 8, para incubar durante 2 horas. La misma reacción se lleva a cabo sobre puntas de nailon que se prepara mediante hidrólisis con HCl 6 N con sonicación durante 2 minutos, y entonces se enjuaga bien con agua y tampón. También la misma reacción se lleva a cabo sobre puntas acrílicas activadas sumergiendo en NaOH al 2% durante 7 días con sonicación cada día durante 30-60 min, y entonces se lavan. En la Figura 29 se muestra la estructura molecular general propuesta de la superficie.

7. Se prepara una disolución de poliacrilamida al 40% y se moldea en la forma deseada de una punta de sonda. El gel se seca al aire hasta que no se observa ninguna reducción apreciable del tamaño. Se mezcla una disolución de moléculas que absorben energía a 100 mg/ml en diclorometano/NMP (2:1, respectivamente) y una disolución de diciclohexilcarbodiimida 1 M/NMP a una relación de 1:2 (EAM:DCC), respectivamente. La disolución de EAM/DCC se incuba seguidamente a 25ºC durante 1 hora mientras se agita. Tras la incubación, se observa un precipitado blanco. El precipitado blanco se filtra en un filtro de vidrio sinterizado. El caudal es el EAM activado con DCC. Seguidamente, la punta se coloca en la disolución de EAM activada con DCC, y se incuba a 25ºC durante 2 horas (aprox.). La punta se enjuaga finalmente con una variedad de disolventes, tales como acetona, diclorometano, metanol, NMP, y hexano. La misma reacción se lleva a cabo sobre puntas de nailon que se prepara mediante hidrólisis con HCl 6 N con sonicación durante 2 minutos, y entonces se enjuaga bien con agua y tampón. La misma reacción también se lleva a cabo sobre puntas acrílicas activadas sumergiendo en NaOH al 20% durante 7 días con sonicación cada día durante 30-60 min, y entonces se lava. En la Figura 30 se muestra la estructura molecular general propuesta de la superficie.

8. Se prepara una disolución de poliacrilamida al 40% y se moldea en la forma deseada de una punta de sonda. El gel se seca al aire hasta que no se observa ninguna reducción apreciable del tamaño. Se mezclan una disolución de 100 mg/ml de N-\alpha- Fmoc-N-\varepsilon-Fmoc-L-lisina en diclorometano/NMP (2:1, respectivamente) y una disolución de DCC 1 M/NMP, a una relación de 1:2 (lisina:DCC), respectivamente. La disolución de lisina/DCC se incuba a 25ºC durante 1 hora con agitación. Tras la incubación, se observa un precipitado blanco, y se filtra con un filtro de vidrio sinterizado. El caudal es lisina activado con DCC. La punta se coloca en la disolución de lisina activada con DCC, y se incuba a 25ºC durante 2 horas (aprox.). La punta se coloca seguidamente en 5 ml de piperidina, y se incuba a 25ºC durante 45 minutos con agitación suave. La lisina activada con DCC se hace reaccionar repetidamente en ciclos consecutivos con la punta hasta que se obtiene la ramificación de lisina deseada. Se mezclan una disolución de EAM a 100 mg/ml en diclorometano/NMP (2:1 respectivamente) y una disolución de DCC 1 M/NMP, a una relación de 1:2 (EAM:DCC), respectivamente. La disolución de EAM/DCC se incuba a 25ºC durante 1 hora con agitación. Tras la incubación, se observa un precipitado blanco, y se filtra con un filtro de vidrio sinterizado. El caudal que pasa es la EAM activada con DCC. La EAM contiene un grupo funcional ácido que reacciona con la DCC. La punta se coloca en la disolución de EAM activada con DCC, y se incuba a 25ºC durante 2 horas (aprox.) con agitación suave. Finalmente, la punta se enjuaga con diclorometano en exceso, NMP, y metanol, antes del uso. La misma reacción se lleva a cabo sobre puntas de nailon que se prepara mediante hidrólisis con HCl 6 N con sonicación durante 2 minutos, y entonces se enjuaga bien con agua y tampón. La misma reacción también se realiza sobre puntas acrílicas activadas sumergiendo en NaOH al 20% durante 7 días con sonicación cada día durante 30-60 min, y entonces se lavaron. En la Figura 31 se muestra la estructura molecular general propuesta de la superficie.

II. Moléculas que absorben energía unidas mediante enlace covalente coordinado a la superficie

1. Se disuelve ácido tiosalicílico (Aldrich) en agua o 50% de metanol en agua, o metanol. Estas disoluciones se usaron como tales, o el pH de las disoluciones se ajusta hasta 6,5 con bicarbonato sódico 0,5 M o hidróxido amónico o trietilamina. El ion Cu(II) se quela con iminodiacetato (IDA) (Sepharose Quelante de Flujo Rápido, Pharmacia) o tris(carboximetil)etilendiamina (TED) (sintetizada como se describe por Yip y Hutchens, 1991) inmovilizados sobre la superficie del gel. Las disoluciones de molécula que absorbe energía se mezclan con el gel de IDA-Cu(II) o TED-Cu(II) a 4º hasta 23ºC durante 5 minutos hasta 15 horas. Las moléculas en exceso que absorben energía se lavan con agua, o metanol al 50% en agua, o con metanol. En la Figura 32 se muestra la estructura molecular propuesta de la superficie. Se depositan alícuotas de 1 \mul de las moléculas unidas que absorben energía sobre las puntas de la sonda, se añade encima 1 \mul de mezclas peptídicas o de dominio de dimerización del receptor de estrógenos o mioglobina en ácido trifluoroacético al 0,1%, y se analiza mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser. La Figura 33 muestra un espectro de masas representativo del dominio de dimerización del receptor de estrógenos desorbido de esta superficie.

2. Se logran fácilmente reacciones secuenciales in situ sobre muestras depositadas encima de una superficie EAM. Se prepara ácido tiosalicílico unido covalentemente coordinado a IDA-Cu(II) sobre una superficie de la sonda, como se describe en la Sección 2.1. Se deposita una alícuota de 1 \mul de péptido (GHHPH)_{5}G sobre la superficie, y se analiza mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser. Tras obtener varios espectros (cada uno una media de 50 disparos de láser), se retira la muestra. Se añade directamente sobre la superficie una alícuota de 2 \mul de carboxipeptidasa Y (Boehringer Mannheim), y se incuba a 37ºC en una cámara de humedad durante 5 minutos hasta 1 h. La digestión in situ con enzima se termina mediante 1 \mul de ácido trifluoroacético al 0,1%, y la muestra se vuelve a analizar mediante espectrometría de masas.

3. Otra ilustración de la reacción secuencial in situ es la digestión con tripsina seguido de secuenciamiento C-terminal. Se prepara ácido tiosalicílico unido covalentemente coordinado a IDA-Cu(II) sobre una superficie de la sonda, según se describe en la Sección 2.1. Se deposita sobre la superficie una alícuota de 1 \mul de dominio de dimerización (6168,4 Da) de receptor de estrógenos, y se analiza mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser. Tras obtener varios espectros (cada uno una media de 20 disparos de láser), se retira la muestra. Se añade sobre la superficie una alícuota de 1 \mul de tripsina (Sigma) en bicarbonato de sodio 0,1 M, y se incuba a 37ºC durante 15 min. La digestión in situ con enzima se termina mediante 1 \mul de ácido trifluoroacético al 0,1%, y la muestra se vuelve a analizar mediante espectrometría de masas. Tras obtener varios espectros (cada uno una media de 20 disparos de láser), se retira la muestra. Se añade directamente sobre la superficie una alícuota de 2 \mul de carboxipeptidasa Y (Boehringer Mannheim), y se incuba a 37ºC en una cámara de humedad durante 1 h. La digestión in situ con enzima se termina mediante 1 \mul de ácido trifluoroacético al 0,1%, y la muestra se vuelve a analizar mediante espectrometría de masas.

III. Moléculas que absorben energía unidas mediante enlace iónico a la superficie

Se suspende en agua ácido sinapínico o ácido \alpha-ciano-4- hidroxicinámico, y se ajusta el pH hasta 6,6 con hidróxido sódico diluido. Se lava el tentáculo DEAE Fractogel (EM Separations, Gibbstown, NJ) con HEPES 20 mM, pH 6,0, y se secó por succión. La disolución de moléculas que absorben energía se mezcla con el gel de DEAE a 23ºC durante 15 horas. El gel se lavó con agua hasta que se eliminó todo el exceso de moléculas que absorben energía. En la Figura 34 se muestra la estructura molecular propuesta de la superficie. Se deposita sobre las puntas de la sonda una alícuota de 0,5 \mul de moléculas unidas que absorben energía, se añade encima 1 \mul de dominio de dimerización de receptor de estrógenos o mioglobina en ácido trifluoroacético al 0,1%, y se analiza mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser. Las Figuras 35A y B muestran el espectro de masas.

IV. Moléculas que absorben energía unidas mediante enlaces hidrófobos/Van der Waals a las superficies

1. Se disolvió ácido \alpha-ciano-4-hidroxicinámico en metanol al 50% en agua y dimetilsulfóxido. Se mezcló con poliestireno aminometilado a 23ºC durante 15 horas. El exceso de moléculas que absorben energía se lavó con metanol al 50% en agua. En la Figura 36 se muestra la estructura molecular propuesta. Se depositó sobre la punta de la sonda una alícuota de 1 \mul de las moléculas unidas que absorben energía, se añadió encima 1 \mul de péptido, y se analizó mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción con láser.

Ejemplo 5 Superficies potenciadas para unión fotolábil y liberación (SEPAR)

A menudo la disposición lineal de los bloques constructores individuales (monómeros) que definen la estructura y características de biopolímeros tales como ADN, ARN, y proteínas, es desconocida, pero se descodifican o secuencian (en todo o en parte) con un método que implica determinaciones diferenciales de masas de analitos biopoliméricos parcialmente digeridos (es decir, químico o enzimático) mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo (TOF) con desorción/ionización por láser.

Los biopolímeros dados se acoplan primero a la superficie de la sonda SELDI mediante uno o más (múltiples) enlaces fotolíticos (es decir, sensibles a la luz) covalentes. Después, se rompe (es decir, se elimina) un número diverso de unidades individuales (monómeros) en los extremos del biopolímero, en una única reacción mediante métodos enzimáticos o químicos. Los analitos que permanecen en la superficie de la sonda constan de una variedad (población) de biopolímeros de masas definidas perdiendo números diferentes de sus unidades monómeras en los extremos. Una porción pequeña pero suficiente de los biopolímeros modificados está sin acoplar (no trabada) desde la superficie del elemento de sonda mediante luz láser, es decir, mediante ruptura de los enlaces fotolíticos con luz UV entre 260 nm y 365 nm. Los biopolímeros desacoplados se desorben/ionizan mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo.

I. Acoplamiento de biopolímeros a la superficie SELDI

Están implicados tres componentes: 1) una superficie que es activada para que reaccione con grupos amina o carboxilo, o ambos; 2) un compuesto fotolítico, típicamente un compuesto con un grupo azo de la fórmula general R_{1}-N=N-R_{2}, por ejemplo, ácido 5-(4-aminofenilazo)salicílico (Aldrich), azodicarbonamida (Aldrich), u otros mecanismos que generan tal enlace fotolítico, tal como las químicas reactivas de hidrógeno activo con compuestos de diazonio; y 3) un biopolímero, por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos, hidratos de carbono.

Primeramente se debe unir un compuesto fotolítico a la superficie activada, por ejemplo, un azodicarbonamida a superficies reactivas con aminas, ácido aminofenilazosalicílico a superficies reactivas con aminas o con carboxilos. Entonces se debe activar el compuesto fotolítico o el biopolímero mediante una de las muchas químicas convencionales, por ejemplo, química reactiva de aminas-bromuro de cianógeno, ésteres de N-hidroxisuccinimida, activación de FMP, mediada por EDC, divinilsulfona; químicas reactivas con hidroxilos-activación epoxídica, divinilsulfona; químicas reactivas con sulfhidrilos-activación yodoacetílica, maleimida, divinilsulfona, activación epoxídica; químicas reactivas con carbonilos-hidrazida, aminación reductora; químicas reactivas con hidrógenos activos-diazonio, que también genera un enlace azofotolítico al mismo tiempo. Finalmente, se debe unir el biopolímero al compuesto fotolítico a través de uno o más (múltiples) enlaces. Lavar el exceso de productos químicos con disolventes acuosos y orgánicos, disolventes de fuerza iónica elevada y bajo pH en múltiples ciclos.

II. Análisis espectrométrico de masas para verificar la integridad estructural

El láser de UV de 260 a 360 nm romperá el enlace fotolítico. Los biopolímeros no acoplados se desorben/ionizan mediante MALDI TOF (el experto en la técnica sabe que también se pueden usar SEND, SEAC y SEPAR).

III. Secuenciación in situ del biopolímero

Esto se logra por cualquiera de los métodos enzimáticos o químicos de degradación secuencial bien conocidos, por ejemplo, secuenciación N-terminal de proteínas con aminopeptidasa, secuenciación C-terminal de proteínas con carboxipeptidasa, secuenciación N-terminal de proteínas con degradación de Edman; secuenciación de ácidos nucleicos con exonucleasa, secuenciación de ácidos nucleicos con el método de Sanger; secuenciación de hidratos de carbono con enzimas específicas tales como neuraminidasa, manasa, fucasa, galactosidasa, glucosidasa, O- o N-glicanasa. Tras lavar para eliminar el exceso de reactivo y productos de reacción, los analitos que permanecen trabados sobre la superficie vía múltiples enlaces fotolíticos que constan de una población de biopolímeros de masas definidas con números diferentes de sus monómeros de los extremos perdidos, se analizan mediante MALDI TOF MS (el experto en la técnica sabe que también se puede usar SEND, SEAC y SEPAR).

Secuenciación interna múltiple con métodos enzimáticos o químicos, por ejemplo, ruptura de proteínas con endoproteasa o bromuro de cianógeno seguido de degradación secuencial de N- y/o C-terminal; ruptura de ácidos nucleicos con endonucleasas seguido de degradación secuencial con exonucleasa o método químico; ruptura de cadenas de polisacáridos con endoglicosidasa H o endoglicosidasa F seguido de ruptura secuencial con enzimas específicas. Tras lavar para eliminar el exceso de reactivos y productos de reacción, los analitos que permanecen sobre la superficie que constan de múltiples poblaciones de biopolímeros de masas definidas con pérdida de diferentes números de sus monómeros en los extremos, se analizan mediante MALDI TOF MS.

IV. Ejemplos Específicos de Secuenciación

Se proporciona una demostración de este principio mediante la determinación de la secuencia presente de aminoácidos de un péptido de 26 residuos:

GHHPHGHHPHGHHPHGHHPHGHHPHGHHPHG

Este péptido (GHHPH)_{5}G define el dominio de unión a metal con la secuencia intacta de la proteína de 80 kDa conocida como glicoproteína rica en histidina (HRG).

Se lavan perlas de vidrio con grupos arilamina en la superficie como ligandos de acoplamiento (Sigma) con y suspendidas en HCl 0,3 M frío. Se añade una disolución acuosa de 50 mg/ml de NaNO_{2} a las perlas, en una relación de 1:5 (v/v) (NaNO_{2}:HCl) y se incuba a 4ºC durante 15 minutos con agitación suave. Tras la incubación todas las perlas se lavan con HCl 0,3 M frío y tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 8,0. El péptido a secuenciar se añade a las perlas en tampón de fosfato de sodio a pH 8,0, y se incuba durante 24 horas a 4ºC con agitación suave. Las perlas con péptidos acoplados se lavaron con tampón de fosfato de sodio, tampón de fosfato de sodio con alta concentración de sal (por ejemplo, 1,0 M), ácido diluido y disolvente orgánico (por ejemplo, metanol) hasta que no se detectó señal peptídica en el supernato mediante espectrometría de masas MALDI-TOF (el experto en la técnica sabe que también se puede usar SEND, SEAC, y SEPAR) o mediante absorbancia a 220 nm. Entonces se deposita una alícuota de 1 \mul de las perlas sobre la punta de la sonda, se mezcla 1 \mul de ácido sinapínico (disuelto en 50% de metanol/0,1% de ácido trifluoroacético) con las perlas, y la muestra se analiza mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser. Tras obtener varios espectros (cada uno una media de 50 disparos de láser), los péptidos que quedan sobre la superficie se lavaron para que estuvieran libres de ácido sinapínico con metanol, y entonces se digirieron con carboxipeptidasa Y (Boehringer Mannheim) a 23ºC en una cámara de humedad. Los péptidos digeridos se lavan seguidamente con disolución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 8,0. Se añade una alícuota de 1 \mul de ácido sinapínico a la superficie, y se analiza nuevamente mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser. El resultado del análisis de la secuencia C-terminal de la secuencia GHHPHG se muestra en la Figura 37. Se observa una secuencia naciente del péptido. La secuencia se deduce mediante las diferencias en la masa entre los picos.

El segundo ejemplo es la secuenciación simultánea de múltiples péptidos unidos covalentemente mediante enlaces fotolíticos a una superficie. Se trabó el dominio de dimerización (6168,4 Da) del receptor de estrógenos humano a la superficie vía múltiples enlaces fotolíticos. El péptido tiene tres residuos metionínicos en su secuencia, y se rompen específicamente mediante bromuro de cianógeno para generar péptidos de masas 2170,8 Da (D1-M18), 3118,77 Da (A19-M45), 535,62 Da (S46-M50) y 397,62 Da (E51-L53). Todos estos péptidos están unidos a la superficie vía los enlaces fotolíticos. Cada uno de estos se digieren subsiguientemente in situ con carboxipeptidasa Y para generar una secuencia naciente que se resuelve completamente de la otra.

Otro enfoque para la determinación estructural de las proteínas es la secuenciación simultánea N-terminal de múltiples péptidos generados por digestión tríptica de una proteína acoplada a una superficie mediante múltiples enlaces fotolíticos. Se trabó la cadena de insulina B a la superficie vía múltiples enlaces fotolíticos. El péptido tiene dos residuos de lisina/arginina en su secuencia que se rompen específicamente mediante tripsina para generar péptidos de masas 2585,9 Da (F1-R22) y 859,0 Da (G23-K29), los cuales ambos están unidos a la superficie vía los enlaces fotolíticos. Cada uno de estos se somete subsiguientemente in situ a digestión con aminopeptidasa o a múltiples ciclos de degradación de Edman para generar una secuencia naciente que se resuelve completamente de la otra.

El acoplamiento y secuenciación de ácidos nucleicos se realiza con un procedimiento similar. Se lavan perlas de vidrio con grupos arilamínicos superficiales como ligandos de acoplamiento (Sigma), con y suspendidos en HCl 0,3 M frío. Se añade una disolución acuosa de 50 mg/ml de NaNO_{2} a las perlas, en una relación de 1:5 (v/v) (NaNO_{2}:HCl), y se incuba a 4ºC durante 15 minutos con agitación suave. Tras la incubación, las perlas se lavan con HCl 0,3 M frío y tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 8,0. El ADN (por ejemplo elemento sensible al receptor de estrógenos, un oligonucleótido de 30 pares de bases) a secuenciar se añade a las perlas en tampón de fosfato de sodio a pH 8,0, y se incuba durante 24 h a 4ºC con agitación suave. Las perlas con ADN acoplado se lavan con tampón de fosfato de sodio, tampón de fosfato de sodio con concentración elevada de sal (por ejemplo, 1,0 M), ácido diluido y disolvente orgánico (por ejemplo, metanol) hasta que no se detecta ninguna señal de ADN en el sobrenadante mediante espectrometría de masas MALDI-TOF (el experto en la técnica sabe que también se puede usar SEND, SEAC, y SEPAR) o mediante absorbancia a 260 nm. Entonces se deposita sobre la punta de la sonda una alícuota de 1 \mul de las perlas, se mezcla 1 \mul de ácido 3-hidroxipicolínico (disuelto en metanol al 50%/ácido trifluoroacético al 0,1%) con las perlas, y la muestra se analiza mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser. Tras obtener varios espectros de masas (cada uno una media de 50 disparos de láser), el ADN que queda unido sobre la superficie se lava libre de ácido 3-hidroxipicolínico con metanol, y se digiriere con exonucleasa (Boehringer Mannheim) a 23ºC en una cámara de humedad. El ADN digerido sobre la superficie se lava seguidamente con disolución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 8,0 para eliminar el exceso de reactivo y productos de reacción. Se añade a la superficie una alícuota de 1 \mul de ácido 3-hidroxipicolínico, y se analiza nuevamente mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser. Se genera una secuencia naciente del ADN. La secuencia se deduce mediante las diferencias en la masa entre dos picos.

Se oxidan cadenas de hidratos de carbono mediante peryodato, y se activan para que se acoplen específicamente a un compuesto fotolítico sobre una superficie. Se lleva a cabo la secuenciación del hidrato de carbono trabado, con enzimas específicas, tales como neuraminidasa, manasa, fucasa, galactosidasa, glucosidasa, O- o N-glicanasa, y se determina mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción con láser. Se acopla ácido 5-(4-aminofenilazo)salicílico (Aldrich) a una superficie reactiva con carboxilos, tal como arilamina sobre perlas de vidrio de poros controlados. Los restos de hidratos de carbonos de glicoproteína rica en histidina humana y bovina se oxidan mediante concentración baja (0,2 M) de metaperyodato de sodio en agua a 23ºC durante 90 minutos. Los reactivos en exceso se lavan con agua. Se añaden las proteínas al ácido 5-(4-aminofenilazo)salicílico acoplado a las perlas de vidrio de poros controlados en tampón de fosfato, pH 8,0. Entonces se añade cianoborohidruro de sodio (0,6 mg/100 \mul), y se agita en una campana de humos a 23ºC durante 18 h. Se lava extensamente con agua, NaCl 1 M, y entonces con agua nuevamente para eliminar el exceso de reactivos y de proteínas sin reaccionar. Entonces se deposita sobre la punta de la sonda una alícuota de 1 \mul de las perlas, se mezcla con las perlas 1 \mul de ácido sinapínico (disuelto en metanol al 50%/ácido trifluoroacético al 0,1%), y la muestra se analiza mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser. Las proteínas restantes unidas sobre la superficie se lavan libres de ácido sinapínico con metanol, y se incuban con 2 \mul de tripsina en tampón de fosfato, pH 8,0, a 37ºC durante 30 minutos. La superficie con glicopéptidos unidos se lava a conciencia con solución salina tamponada con fosfato y agua para eliminar el exceso de reactivo y de péptidos no unidos. Se mezcla con las perlas una alícuota de 1 \mul de ácido sinapínico, y la muestra se analiza mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser. Tras obtener varios espectros de masas (cada uno una media de 50 disparos de láser) los glicopéptidos restantes sobre la superficie de la sonda se lavan libres de ácido sinapínico con metanol, y se digieren en secuencia o en combinación con N-acetilneuraminidasa (NANasa III, Glyko, tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 6,0, 37ºC, 1 h), manosidasa (MANasa I, Glyko, fosfato de sodio 50 mM, pH 6,0, 37ºC 18 h), fucosidasa (FUCasa I, Glyko, fosfato de sodio 50 mM, pH 5,0, 37ºC 18 h), N-acetilglucosaminidasa (HEXasa I, Glyko, fosfato de sodio 50 mM, pH 5,0, 37ºC 4 h), O-glicosidasa (Glyko, fosfato de sodio 50 mM, pH 5,0, 37ºC 18 h) o N-glicanasa (PNGasa F, Glyko, fosfato de sodio 100 mM, pH 8,6, 37ºC, 18 h). Los glicopéptidos fragmentados sobre la superficie se lavan finalmente con disolución salina tamponada con fosfato y con agua para eliminar los reactivos y los productos de reacción. Se añade a la superficie una alícuota de 1 \mul de ácido sinapínico, y se analiza nuevamente mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción por láser. Se observan secuencias nacientes de los glicopéptidos. Las secuencias se deducen mediante las diferencias en la masa entre dos picos.

Todas las patentes y publicaciones mencionadas en esta memoria descriptiva son indicativas de los niveles de aquellos expertos en la técnica a los que pertenece la invención.

El experto en la técnica apreciará fácilmente que la presente invención se adapta bien para llevar a cabo los objetos y obtener los fines y ventajas mencionadas, así como aquellos inherentes en ella. Los oligonucleótidos, compuestos, métodos, procedimientos y técnicas descritos aquí son presentemente representativos de las realizaciones preferidas, están destinadas a ser ejemplares y no pretenden ser limitaciones del alcance. A los expertos en la técnica se les ocurrirán cambios en ella y otros usos, que están englobados en el alcance de protección como se define mediante las reivindicaciones anejas.

Claims (29)

1. Una sonda que se inserta de forma retirable en un espectrómetro de masas, teniendo la sonda una superficie de presentación de la muestra para exponer un analito a una fuente de energía que emite energía capaz de desorber/ionizar al analito desde la sonda para la detección del analito, en la que dicha superficie está derivatizada con un reactivo de afinidad que es capaz de unirse al analito y que se selecciona de iones metálicos, ácidos nucleicos, péptidos, hidratos de carbono, proteínas y sus combinaciones, y en la que se proporciona un material matriz para ayudar a la desorción/ionización sobre dicha superficie en asociación con el reactivo de afinidad.

2. Una sonda según la reivindicación 1, en la que dicha superficie de presentación de la muestra se selecciona de metal revestido con un polímero sintético, vidrio, material cerámico, polímeros sintéticos y biopolímeros.

3. Una sonda según la reivindicación 2, en la que dicha superficie de presentación de la muestra es un metal que tiene un revestimiento de dextrano o agarosa reticulados, nailon, polietileno o poliestireno.

4. Una sonda según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el analito comprende biomoléculas y dicho reactivo de afinidad está adaptado para aislar selectivamente dichas biomoléculas a partir de una muestra biológica no diferenciada.

5. Una sonda según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el reactivo de afinidad es un anticuerpo.

6. Una sonda según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el reactivo de afinidad es una lectina.

7. Una sonda según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el reactivo de afinidad es un ion Cu(II) o un ion Fe(III).

8. Una sonda según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que los reactivos de afinidad dispuestos en una disposición predeterminada están proporcionados sobre dicha superficie de presentación de la muestra para la adsorción selectiva de diferentes analitos.

9. Una sonda según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el material matriz tiene un pH por encima de 6,0.

10. Una sonda según la reivindicación 9, en la que el material matriz es ácido nicotínico o ácido sinapínico.

11. Una sonda según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el analito está unido al reactivo de afinidad.

12. Un espectrómetro de masas para detectar un analito, que comprende:

(a) una sonda según la reivindicación 11;

(b) una fuente de energía para dirigir energía a la superficie de presentación de la muestra de la sonda, para desorber/ionizar el analito; y

(c) medios para detectar el analito desorbido.

13. Un espectrómetro de masas según la reivindicación 12, que comprende además:

un tubo de espectrómetro;

medios de vacío para aplicar vacío al interior de dicho tubo;

medios de potencial eléctrico dentro del tubo para aplicar un potencial acelerador a las moléculas del analito desorbidas; y

una muestra de analito unida mediante el reactivo de afinidad sobre dicha superficie de presentación de la muestra de la sonda, con lo que al menos una porción de dichas moléculas del analito no consumidas en dicho análisis de espectrometría de masas permanece accesible para procedimientos químicos, biológicos o físicos analíticos subsiguientes;

en el que dicha fuente de energía comprende un medio de haz de láser para producir un haz de láser dirigido a dicha muestra de analito para dar suficiente energía para desorber e ionizar una porción de dichas moléculas de analito de la mencionada muestra de analito; y

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en el que dicho medio de detección comprende medios asociados con dicho espectrómetro para detectar el impacto de moléculas del analito ionizadas aceleradas, sobre ellos.

14. Un método para detectar un analito, que comprende:

(a) proporcionar un espectrómetro de masas como se define en la reivindicación;

(b) desorber al menos una porción del analito de la superficie de presentación de la muestra, de la sonda del espectrómetro de masas exponiendo al analito a energía procedente de la fuente de energía; y

(c) detectar el analito desorbido con los medios de detección.

15. Un método según la reivindicación 14, que comprende además, tras la etapa (c) de detección, la etapa de realización de un procedimiento químico o biológico en la porción de dicho analito no desorbida, para alterar la composición de dicha porción de dicho analito no desorbida; y repetir las etapas (b) y (c) con respecto a dicho analito alterado.

16. Un método según la reivindicación 14, que comprende:

(i) proporcionar una sonda que se puede insertar de forma retirable en un espectrómetro de masas, teniendo la sonda una superficie de presentación de la muestra, para exponer un analito a una fuente de energía que emite energía capaz de desorber/ionizar al analito de la sonda para la detección del analito;

(ii) derivatizar dicha superficie de presentación de la muestra, con un reactivo de afinidad que es capaz de unirse al analito y que se selecciona de iones metálicos, ácidos nucleicos, péptidos, hidratos de carbono, proteínas y sus combinaciones;

(iii) exponer dicha superficie derivatizada, de presentación de la muestra, a una fuente de dicho analito para unir dicho analito a ella;

(iv) depositar sobre dicha superficie de presentación de la muestra un material matriz, que ayuda a la desorción/ionización, en asociación con el reactivo de afinidad;

(v) colocar la superficie derivatizada de presentación de la muestra con dichas moléculas del analito unidas a ella en un extremo de un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo y aplicar vacío y un campo eléctrico para formar un potencial acelerador dentro del espectrómetro;

(vi) hacer golpear al menos una porción de las moléculas del analito unidas a dicha superficie derivatizada de presentación de la muestra, dentro del espectrómetro, con uno o más pulsos de láser a fin de desorber iones de dichas moléculas de analito de dicha sonda;

(vii) detectar la masa de los iones mediante su tiempo de vuelo en dicho espectrómetro de masas; y

(viii) presentar en una pantalla tal masa detectada.

17. Un método para preparar una sonda como se define en la reivindicación 1, comprendiendo dicho método:

(i) proporcionar una sonda que se puede insertar de forma retirable en un espectrómetro de masas, teniendo la sonda una superficie de presentación de la muestra para exponer un analito a una fuente de energía que emite energía capaz de desorber/ionizar el analito de la sonda para la detección del analito;

(ii) derivatizar dicha superficie de presentación de la muestra, con un reactivo de afinidad que es capaz de unirse al analito y que se selecciona de iones metálicos, ácidos nucleicos, péptidos, hidratos de carbono, proteínas y sus combinaciones; y

(iii) depositar sobre dicha superficie de presentación de la muestra un material matriz que ayuda a la desorción/ionización, en asociación con el reactivo de afinidad;

18. Un método para capturar un analito en una sonda para un espectrómetro de masas, comprendiendo dicho método:

- proporcionar una sonda que se puede insertar de forma retirable en un espectrómetro de masas, teniendo la sonda una superficie de presentación de la muestra para exponer un analito a una fuente de energía que emite energía capaz de desorber/ionizar el analito de la sonda para la detección del analito, en la que dicha superficie se derivatiza con un reactivo de afinidad que es capaz de unirse al analito y que se selecciona de iones metálicos, ácidos nucleicos, péptidos, hidratos de carbono, proteínas y sus combinaciones,

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- exponer dicha superficie de presentación de la muestra de la sonda a una muestra que contiene dicho analito; y

- depositar sobre dicha superficie de presentación de la muestra un material matriz que ayuda a la desorción/ionización, en asociación con el reactivo de afinidad;

19. Un método según la reivindicación 18, en el que dicha superficie de presentación de la muestra se selecciona de metal revestido con un polímero sintético, vidrio, material cerámico, polímeros sintéticos y biopolímeros.

20. Un método según la reivindicación 19, en el que dicha superficie de presentación de la muestra es metal que tiene un revestimiento de dextrano o agarosa reticulados, nailon, polietileno o poliestireno.

21. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, en el que el analito comprende biomoléculas, y dicho reactivo de afinidad está adaptado para aislar selectivamente dichas biomoléculas a partir de una muestra biológica no diferenciada.

22. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, en el que el reactivo de afinidad es un anticuerpo.

23. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, en el que el reactivo de afinidad es una lectina.

24. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, en el que el reactivo de afinidad es un ion Cu(II) o un ion Fe(III).

25. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 24, en el que los reactivos de afinidad dispuestos en una disposición predeterminada se proporcionan sobre dicha superficie de presentación de la muestra para la adsorción selectiva de diferentes analitos.

26. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 25, en el que el material matriz que ayuda a la desorción/ionización tiene un pH por encima de 6,0.

27. Un método según la reivindicación 26, en el que el material matriz es ácido nicotínico o ácido sinapínico.

28. Uso de una sonda como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en espectrometría de masas.

29. Uso según la reivindicación 28, en el que la sonda se usa en un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo con desorción/ionización por láser.