ES2201198T3 - Oligonucleotidos quimericos e hibridos invertidos. - Google Patents

Oligonucleotidos quimericos e hibridos invertidos.

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ES2201198T3 ES96930536T ES96930536T ES2201198T3 ES 2201198 T3 ES2201198 T3 ES 2201198T3 ES 96930536 T ES96930536 T ES 96930536T ES 96930536 T ES96930536 T ES 96930536T ES 2201198 T3 ES2201198 T3 ES 2201198T3
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Abstract

Oligonucleótido híbrido invertido que comprende una región de ribonucleótidos 2¿-O-substituidos, en el que dicha región de ribonucleótidos 2¿-O-substituidos tiene de 4 a 13 nucleósidos situados entre dos regiones de oligodesoxirribonucleótidos con enlaces fosforotioato, en el que dichas regiones de fosforotioato tienen de 5 a 46 desoxirribonucleótidos, donde 2¿-O-substituido significa la sustitución de la posición 2'' del grupo pentosa con un grupo -O-alquilo inferior que contiene de 1 a 6 átomos de carbono saturados o insaturados, o con un grupo -O-arilo o alilo que tiene de 2 a 6 átomos de carbono, en el que dicho grupo alquilo, arilo o alilo puede estar no sustituido o puede estar sustituido.

Description

Oligonucleótidos quiméricos e híbridos invertidos.
Antecedentes de la invención Campo de la invención
La invención se refiere a oligonucleótidos modificados que son útiles para el estudio de la expresión génica y para la estrategia terapéutica antisentido.
Sumario de la materia relacionada
Las posibilidades de utilización de oligonucleótidos como inhibidores de la expresión de genes específicos en una estrategia terapéutica antisentido se sugirió en primer lugar en tres artículos publicados en 1977 y 1978. Paterson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74: 4370-4374 (1977) describe cómo la traducción del ARNm en medio exento de células puede inhibirse por la unión de un oligonucleótido complementario al ARNm. Zamecnik y Stephenson, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75: 280-284 y 285-288 (1978) describen cómo un oligonucleótido sintético de 13 unidades que es complementario a una parte del genoma del virus del sarcoma de Rous (VSR) puede inhibir la replicación del VSR en cultivos de células infectadas y puede inhibir la transformación, mediada por VSR, de fibroblastos primarios de pollo en células malignas de sarcoma.
Desde la realización de estos primeros estudios ha quedado firmemente demostrada la capacidad de los oligonucleótidos antisentido para inhibir la propagación de virus. La patente U.S. nº 4.806.463 describe la inhibición de la propagación del virus de la inmunodeficiencia humana por oligonucleótidos que son complementarios a cualquiera de las diversos regiones del genoma del VIH. La patente U.S. nº 5.194.428 describe la inhibición de la replicación del virus de la gripe por oligonucleótidos con enlaces fosforotioato complementarios al gen de la polimerasa 1 del virus de la gripe. Agrawal, hace una revisión, en Trends in Biotechnology 10: 152-158 (1992), de la utilización de oligonucleótidos antisentido como agentes antivíricos.
También se han desarrollado oligonucleótidos antisentido como agentes antiparasitarios. La publicación PCT nº WO93/13740 describe la utilización de oligonucleótidos antisentido para inhibir la propagación de parásitos de malaria resistentes a fármacos. Tao et al., Antisense Research and Development 5: 123-129 (1995), describe la inhibición de la propagación de un parásito de esquistosoma por oligonucleótidos antisentido.
Más recientemente, los oligonucleótidos antisentido han resultado ser candidatos prometedores en aplicaciones terapéuticas para enfermedades originadas por la expresión de genes celulares. La publicación PCT nº WO95/09236 describe la neutralización de las anomalías morfológicas, provocadas por beta-amiloide en líneas celulares neuronales, por oligonucleótidos que inhiben la expresión de beta-amilooide. La publicación PCT nº W094/26887 describe la neutralización del corte y empalme aberrante de un transcrito de un gen de globina por oligonucleótidos complementarios a ciertas porciones de dicho transcrito. La solicitud PCT no PCT/US94/13685 describe la inhibición de la tumorogenicidad por oligonucleótidos complementarios al gen que codifica la ADN-metiltransferasa.
El desarrollo de varios oligonucleótidos antisentido como agentes terapéuticos y diagnósticos ha sido revisado recientemente por Agrawal e Iyer, Current Opinion in Biotechnology 6: 12-19 (1995).
Con el aumento del interés en la estrategia terapéutica antisentido, se han realizado diversos esfuerzos para mejorar las propiedades farmacocinéticas de los oligonucleótidos modificando la cadena principal de azúcar-fosfato. La patente U.S. nº 5.149.797 describe oligonucleótidos quiméricos tradicionales que tienen una región principal de fosforotioato interpuesta entre regiones flanqueantes de metilfosfonato o fosforamidato. La publicación PCT no W094/02498 describe oligonucleótidos híbridos tradicionales que tienen regiones de ribonucleótidos 2'-O-sustituidos flanqueando una región principal de ADN.
En la actualidad se están haciendo muchos descubrimientos sobre las propiedades farmacodinámicas de los oligonucleótidos. Agrawal et al., Clinical Pharmacokinetics 28: 7-16 (1995) y Zhang et al., Clinical Pharmacology and Therapeutics 58: 44-53 (1995) describen la farmacodinámica de oligonucleótidos anti-VIH en pacientes humanos. Algunos de estos nuevos descubrimientos han permitido superar nuevos obstáculos para la optimización de oligonucleótidos como agentes terapéuticos. Por ejemplo, Kniep et al., Nature 374: 546-549 (1995) describe el efecto mitogénico in vivo de oligonucleótidos que contienen el dinucleótido CG flanqueado por determinadas secuencias. Galbraith et al., Antisense Research and Development 4: 201-206 (1994) describen la activación del complemento por oligonucleótidos. Henry et al., Pharm. Res. 11: PPDM8082 (1994) describe la posible interferencia de oligonucleótidos con la coagulación sanguínea. Los documentos WO-A-94/08003, WO-A-95/02069 y WO-A-93/13114, así como J. Biol. Chem. vol. 268(19), págs. 14514-22 (1993) describen oligonucleótidos con una región de enlaces internucleosídicos fosforotioato, flanqueada en ambos lados por regiones de nucleósidos 2'-O-sustituidos.
Por consiguiente, se necesitan oligonucleótidos modificados que conserven las propiedades de inhibición de la expresión génica produciendo al mismo tiempo menos efectos secundarios que los oligonucleótidos convencionales.
Breve sumario de la invención
La invención se refiere a oligonucleótidos modificados que son útiles para los estudios de la expresión génica y para la estrategia terapéutica antisentido. La invención proporciona oligonucleótidos modificados que inhiben la expresión génica y que producen menos efectos secundarios que los oligonucleótidos convencionales. En particular, la invención proporciona oligonucleótidos modificados que presentan mitogenicidad reducida, activación del complemento reducida y propiedades antitrombóticas reducidas, en comparación con los oligonucleótidos convencionales.
En un primer aspecto, la invención proporciona oligonucleótidos híbridos invertidos y composiciones de material para la inhibición de la expresión de genes específicos con menos efectos secundarios. Dicha inhibición de la expresión génica puede utilizarse como un método alternativo al análisis de mutantes para determinar la función biológica de genes específicos. Dicha inhibición de la expresión génica también puede utilizarse para el tratamiento terapéutico de enfermedades causadas por la expresión de los genes de un virus o de un patógeno, o por la expresión inapropiada de genes celulares.
La invención se refiere a oligonucleótidos híbridos invertidos que tienen una región de ARN 2'-O-substituida de 4-13 nucleósidos entre dos regiones, de oligodesoxirribonucleótidos con enlaces fosforotioato, de 5-46 oligodesoxirribonucleósidos. De acuerdo con la invención, la región de ARN 2'-O substituida se encuentra entre dos regiones de oligodesoxirribonucleótidos con enlaces fosforotioato, una estructura que está "invertida" en comparación con los oligonucleótidos híbridos tradicionales.
La invención proporciona un método para la preparación de un medicamento para modular la expresión génica en un mamífero, con menos efectos secundarios. En el método según este aspecto de la invención, una composición de material según la invención se administra a el mamífero, en la que el oligonucleótido es complementario a un gen que se expresa en el mamífero. Tras la administración de la composición de material, se realizan una o más mediciones de efectos biológicos seleccionados a partir del grupo formado por activación del complemento, mitogénesis e inhibición de la formación de coágulos por la trombina.
La invención proporciona un método para la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico, con menos efectos secundarios, de una enfermedad causada por la expresión génica aberrante, en el que la composición de material según la invención se administra a un individuo que tenga la enfermedad, en el que el oligonucleótido es complementario a un gen que se expresa de modo aberrante, en el que dicha expresión aberrante causa la enfermedad. En este contexto, la expresión génica aberrante significa expresión en un organismo hospedador de un gen necesario para la propagación de un virus o de un patógeno procariótico o eucariótico, o la expresión inapropiada de un gen celular del hospedador. Expresión génica inapropiada en la célula hospedadora incluye la expresión de un alelo mutante de un gen celular, o la infraexpresión o sobreexpresión de una alelo normal de un gen celular, estando causada dicha enfermedad por dicha expresión génica inapropiada en la célula hospedadora. Tras la administración de la composición de material, se realizan una o más mediciones de efectos biológicos seleccionados a partir del grupo formado por activación del complemento, mitogénesis e inhibición de la formación de coágulos por la trombina.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra los oligonucleótidos híbridos invertidos, oligonucleótidos híbridos y oligonucleótidos con enlaces fosfodiéster y fosforotioato utilizados en los presentes estudios. Los 2'-O-metilrribonucleótidos aparecen perfilados y los nucleótidos con enlaces fosfodiéster aparecen subrayados; los restantes son nucleótidos unidos con enlaces fosforotioato.
La Figura comparativa 2 muestra los oligonucleótidos de cadena principal mixta, quiméricos y quiméricos invertidos utilizados en los presentes estudios. Los nucleótidos unidos por enlaces metilfosfonato están subrayados; todos los restantes son nucleótidos unidos con enlaces fosforotioato.
La Figura 3 muestra la captación de timidina por esplenocitos de ratón en función de la concentración de oligonucleótidos con enlaces fosforotioato o de cualquiera de los diversos oligonucleótidos híbridos invertidos.
La Figura 4 muestra el grado de inhibición de la hemólisis, mediada por el complemento, observada cuando se trata el suero con oligonucleótidos con enlaces fosforotioato o con cualquiera de los diversos oligonucleótidos híbridos invertidos.
La Figura 5 muestra la prolongación del TTPa obtenida cuando se trata el suero humano normal con oligonucleótidos con enlaces fosforotioato o con cualquiera de los diversos oligonucleótidos híbridos invertidos.
La Figura comparativa 6 muestra la captación de timidina por esplenocitos de ratón en función de la concentración de oligonucleótidos con enlaces fosforotioato o de cualquiera de los diversos oligonucleótidos quiméricos invertidos.
La Figura comparativa 7 muestra el grado de inhibición de la hemólisis, mediada por el complemento, observada cuando se trata el suero con oligonucleótidos con enlaces fosforotioato o con cualquiera de los diversos oligonucleótidos quiméricos invertidos.
La Figura comparativa 8 muestra la prolongación del TTPa obtenida cuando se trata el suero humano normal con oligonucleótidos con enlaces fosforotioato o con cualquiera de los diversos oligonucleótidos quiméricos invertidos.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
La invención se refiere a oligonucleótidos modificados que son útiles para los estudios de la expresión génica y para la estrategia terapéutica antisentido. La invención proporciona oligonucleótidos modificados que inhiben la expresión génica y que producen menos efectos secundarios que los oligonucleótidos convencionales. En particular, la invención proporciona oligonucleótidos modificados que presentan mitogenicidad reducida, activación del complemento reducida y propiedades antitrombóticas reducidas, en comparación con los oligonucleótidos convencionales..
En un primer aspecto, la invención proporciona oligonucleótidos híbridos invertidos y composiciones de material para la inhibición de la expresión de genes específicos, con menos efectos secundarios. Dicha inhibición de la expresión génica puede utilizarse como un método alternativo al análisis de mutantes o a los experimentos de "desactivación" de genes para determinar la función biológica de genes específicos. Dicha inhibición de la expresión génica también puede utilizarse para el tratamiento terapéutico de enfermedades causadas por la expresión de los genes de un virus o de un patógeno, o por la expresión inapropiada de genes celulares.
Una composición de material para la inhibición de la expresión de genes específicos con menos efectos secundarios comprende, según este aspecto de la invención, un oligonucleótido modificado que es complementario a una porción de una región o gen genómico del que se desea inhibir la expresión, o a un transcrito de ARN obtenido a partir de dicho gen. El término oligonucleótido engloba aquellos polímeros que tienen bases o azúcares químicamente modificados y/o que tienen sustituyentes adicionales, incluyendo, pero sin limitarse a los mismos, grupos lipófilos, agentes intercalantes, diaminas y adamantano. Preferiblemente, dichos oligonucleótidos tendrán de 5 a 50 nucleótidos, lo más preferiblemente de 17 a 35 nucleótidos. El término complementario significa que tiene la capacidad de hibridarse con una región o gen genómico, o con su transcrito de ARN en condiciones fisiológicas. Dicha hibridación es normalmente el resultado de la unión mediante enlaces de hidrógeno entre cadenas complementarias, preferiblemente para formar pares de bases de Watson-Crick o de Hoogsteen, aunque también pueden dar lugar a la hibridación otras formas de unión mediante enlaces de hidrógeno, así como el apilamiento de bases. En la práctica, dicha hibridación puede deducirse observando la inhibición de la expresión de genes específicos. La secuencia del gen o la secuencia del transcrito de ARN, a la que es complementaria la secuencia del oligonucleótido modificado, dependerá del efecto biológico que se busca modificar. En algunos casos, la región o gen genómico, o su transcrito de ARN puede provenir de un virus. Los virus preferidos incluyen, sin limitarse a los mismos, virus de la inmunodeficiencia humana (de tipo 1 ó 2), virus de la gripe, virus herpes simple (de tipo 1 ó 2), virus de Epstein-Barr, citomegalovirus, virus respiratorio sincicial, virus de la gripe, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C y virus del papiloma. En otros casos, la región o gen genómico, o su transcrito de ARN puede provenir de un ADN cromosómico endógeno de mamífero (incluido el hombre). Los ejemplos preferidos de dichas regiones, genes genómicos o de sus trasncritos de ARN incluyen, sin limitarse a los mismos, secuencias que codifican el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), beta-amiloide, ADN-metiltransferasa, proteína-quinasa A, proteína ApoE4, glicoproteína p, proteína c-MYC, proteína BCL-2 y CAPL. En aún otros casos, la región o gen genómico, o su transcrito de ARN puede provenir de un patógeno procariótico o eucariótico, incluidos, sin limitarse a los mismos, Plasmodium falciparum, Plasmodium malarie, Plasmodium ovale, Schistosoma spp. y Mycobacterium tuberculosis.
Además del oligonucleótido modificado según la invención, la composición de material para la inhibición de la expresión génica, con menos efectos secundarios, puede opcionalmente contener cualquiera de los excipientes o diluyentes bien conocidos, aceptables desde el punto de vista farmacéutico. Esta composición de material puede contener además uno o más oligonucleótidos adicionales según la invención, pudiendo ser dichos oligonucleótidos adicionales un oligonucleótido híbrido invertido o un oligonucleótido quimérico invertido. Alternativamente, esta composición puede contener una o más oligonucleótidos antisentido tradicionales, tales como un oligonucleótido con enlaces fosforotioato, un oligonucleótido híbrido o un oligonucleótido quimérico, o puede contener cualquier otro agente farmacológicamente activo.
Según la invención, la composición de material comprende oligonucleótidos híbridos invertidos que tienen una región de ARN 2'-O-substituido de 4-13 nucleósidos entre dos regiones de oligodesoxirribonucleótidos con enlaces fosforotioato de 5-46 desoxirribonucleótidos. La región de ARN 2'-O-substituido está entre dos regiones de oligodesoxirribonucleótidos con enlaces fosforotioato, una estructura que está "invertida" en comparación con los oligonucleótidos híbridos tradicionales. Por tanto, los oligonucleótidos según la invención se denominan oligonucleótidos híbridos invertidos. La región de ARN 2'-O-substituido tiene preferiblemente de 4 a 13 nucleósidos 2'-O-sustituidos unidos entre sí por enlaces internucleosídicos 5' a 3'. Preferiblemente, el tamaño total del oligonucleótido híbrido invertido será de 15 a 35 ó 50 nucleótidos. Lo más preferible es que los ribonucleósidos 2'-O-sustituidos estén unidos entre sí mediante un enlace 5' a 3' de fosforotioato, fosfotriéster o fosfodiéster. A los efectos de la invención, el término "2'-O-sustituido" significa la sustitución de la posición 2' del grupo pentosa con un grupo -O-alquilo inferior que contiene 1-6 átomos de carbono saturados o insaturados, o con un grupo -O-arilo o alilo que tiene 2-6 átomos de carbono, en el que dicho grupo alquilo, arilo o alilo puede estar no sustituido o puede estar sustituido, por ejemplo, con grupos halo, hidroxi, trifluorometilo, ciano, nitro, acilo, aciloxi, alcoxi, carboxilo, carbalcoxilo o amino; pero no con un grupo 2'-H. La región o regiones flanqueadas por fosforotioato tienen de 5 a 46 nucleósidos unidos entre sí por enlaces fosforotioato 5' a 3', y preferiblemente de 5 a 26 de tales nucleósidos unidos con enlaces fosforotioato. Lo más preferible es que las regiones de fosforotioato tengan de 5 a 15 nucleósidos unidos con enlaces fosforotioato. Los enlaces fosforotioato pueden ser enantiómeros R_{p} y S_{p} mezclados, o pueden ser estereorregulares o sustancialmente estereorregulares en forma R_{p} o S_{p} (véase Iyer et al., Tetrahedron Asymmetry 6: 1051-1054 (1995)).
Las regiones de ribonucleótidos 2'-O-sustituidos pueden incluir un enlace internucleosídico no iónico o estar formadas en su totalidad por enlaces internucleosídicos no iónicos. Además, los oligonucleótidos según la invención pueden contener combinaciones de una o más regiones de ribonucleótidos 2'-O-sustituidos y una o más regiones no iónicas. (Véase Nucleosides & Nucleotides 14: 1031-1035 (1995) para las técnicas de síntesis pertinentes.)
En un segundo aspecto, la invención proporciona un método para la preparación de un medicamento para modular la expresión génica en un mamífero, con menos efectos secundarios. En el método según este aspecto de la invención, se proporciona una composición de material según la invención para su administración al mamífero, en la que el oligonucleótido es complementario a un gen que se expresa en el mamífero. Preferiblemente, dicha administración puede ser parenteral, oral, intranasal o intrarrectal. Tras la administración de la composición de material, se realizan una o más mediciones de los efectos secundarios biológicos seleccionados a partir del grupo formado por activación del complemento, mitogénesis e inhibición de la formación de coágulos por la trombina.
En un tercer aspecto, la invención proporciona un método para la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico, con menos efectos secundarios, de una enfermedad causada por la expresión génica aberrante, comprendiendo el método el suministro de una composición de material, según la invención, para su administración a un individuo que tenga la enfermedad, en el que el oligonucleótido es complementario a un gen que se expresa de modo aberrante, en el que dicha expresión aberrante causa la enfermedad. En este contexto, la expresión génica aberrante significa expresión en un organismo hospedador de un gen necesario para la propagación de un virus o de un patógeno procariótico o eucariótico, o expresión inapropiada de un gen celular del hospedador. La expresión génica inapropiada en la célula hospedadora incluye la expresión de un alelo mutante de un gen celular, o la infraexpresión o sobreexpresión de una alelo normal de un gen celular, de modo que la enfermedad es causada por dicha expresión génica inapropiada en la célula hospedadora. Preferiblemente, dicha administración debería ser parenteral, oral, sublingual, transdérmica, tópica, intranasal o intrarrectal. La administración de las composiciones terapéuticas puede realizarse utilizando procedimientos conocidos con dosificaciones y durante períodos de tiempo eficaces para reducir los síntomas o marcadores indirectos de la enfermedad. Cuando se administra por vía sistémica, la composición terapéutica se administra preferiblemente en una dosificación suficiente para alcanzar un nivel sanguíneo del oligonucleótido desde aproximadamente 0,01 micromolar hasta aproximadamente 10 micromolar. Para la administración localizada, pueden ser eficaces concentraciones mucho menores que éstas, y pueden tolerarse concentraciones mucho mayores. Preferiblemente, una dosificación total del oligonucleótido se situará desde aproximadamente 0,1 mg de oligonucleótido por paciente y día hasta aproximadamente 200 mg de oligonucleótido por kg de peso corporal y día. Puede ser deseable administrar de modo simultáneo o secuencial una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más de las composiciones terapéuticas de la invención a un individuo, como un episodio único de tratamiento. Tras la administración de la composición de material, se realizan una o más mediciones de efectos biológicos seleccionados a partir del grupo formado por activación del complemento, mitogénesis e inhibición de la formación de coágulos por la trombina.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar de modo adicional ciertas realizaciones preferidas de la invención y no pretenden limitar el alcance de la invención.
Ejemplo 1 Síntesis, desprotección y purificación de los oligonucleótidos
Los oligonucleótidos con enlaces fosforotioato se sintetizaron utilizando un sintetizador automático de ADN (Modelo 8700, Biosearch, Bedford, MA.) utilizando técnicas de beta-cianoetilfosforamidito en una escala de 10 micromoles. Para generar los enlaces fosforotioato, el enlace fosfito intermediario obtenido después de cada acoplamiento se oxidó utilizando 3H-1,2-benzoditiol-3H-ona-1,1-dióxido (Véase Beaucage, en Protocols for Oligonucleotides and Analogs: Synthesis and Properties, Agrawal (editor), Humana Press, Totowa, N.J., págs. 33-62 (1993).) Se utilizó una síntesis similar para generar los enlaces fosfodiéster, con la salvedad de que se realizó una oxidación estándar utilizando un reactivo de yodo estándar. Los oligonucleótidos híbridos invertidos se sintetizaron de modo similar, con la salvedad de que el segmento que contenía los 2'-O-metilrribonucleótidos se preparó utilizando 2'-O-metilrribonucleósidos con enlaces fosforamidito, seguido por la oxidación, hasta formar un enlace fosforotioato o fosfodiéster, como se ha descrito anteriormente. La desprotección y la purificación de oligonucleótidos se llevó a cabo según un procedimiento estándar, (Véase Padmapriya et al., Antisense Res. & Dev. 4: 185-199 (1994)),
Ejemplo 2 Reducción de la activación del complemento in vitro por oligonucleótidos híbridos invertidos
Para determinar el efecto relativo de la estructura híbrida invertida en el agotamiento del complemento mediado por oligonucleótidos, se realizaron los siguientes experimentos. Se extrajo sangre venosa de voluntarios humanos adultos sanos. Se preparó el suero para el ensayo de la actividad hemolítica del complemento recogiendo la sangre en recipientes al vacío (Becton Dickinson #6430 Franklin Lakes, N.J.) sin aditivos comerciales. Se dejó coagular la sangre a temperatura ambiente durante 30 minutos, se enfrió en hielo durante 15 minutos, después se centrifugó a 4ºC para separar el suero. El suero recogido se mantuvo en hielo, si el ensayo se realizaba el mismo día, o, alternativamente, se conservó a -70ºC. A continuación se incubaron el tampón, el oligonucleótido con enlaces fosforotioato o el oligonucleótido híbrido invertido, con el suero. Se realizó un ensayo CH50 estándar (véase Kabat y Mayer (eds): Experimental Immunochemistry, 2a Edición, Springfield, IL., C. C. Thomas (1961), p. 125) para la lisis, mediada por el complemento, de eritrocitos de oveja (Colorado Serum Co.) sensibilizados con anticuerpo contra eritrocitos de oveja (hemolisina, Diamedix, Miami, FL.), utilizando determinaciones duplicadas de por lo menos cinco diluciones de cada suero de prueba, y midiendo después la liberación de hemoglobina en los sobrenadantes exentos de células por espectrofotometría a 541 nm.
Ejemplo 3 Reducción de la mitogenicidad in vitro de oligonucleótidos híbridos invertidos
Para determinar el efecto relativo de la estructura híbrida invertida en la mitogenicidad mediada por oligonucleótidos, se realizaron los siguientes experimentos. Se extrajo el bazo de un ratón CD1 macho (4-5 semanas, 20-22 g; Charles River, Wilmington, MA.). Se prepararon suspensiones de células únicas picando el tejido cuidadosamente con los bordes esmerilados de un portaobjetos. Las células se cultivaron después en medio RPMI completo [medio RPMI enriquecido con suero bovino fetal (FBS) al 10%, 2-mercaptoetanol (2-ME) 50 micromolar, 100 U/ml de penicilina, 100 microgramos/ml de estreptomicina, L-glutamina 2 mM]. Para reducir al mínimo la degradación de oligonucleótidos, el FBS se calentó primero durante 30 minutos a 65ºC (oligonucleótidos con enlaces fosfodiéster) o a 56ºC (todos los oligonucleótidos restantes). Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 100.000 células por pocillo (volumen de 100 microlitros/pocillo). Se añadieron los oligonucleótidos en 10 microlitros de tampón TE (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM) a cada pocillo. Tras 44 horas de cultivo a 37ºC, se añadió un microcurio de timidina tritiada (Amersham, Arlington Heights, IL.) en 20 microlitros de medio RPMI durante un período de marcado de 4 horas. Después se recogieron las células en un colector automático de células (Skatron, Sterling, VA.) y se evaluaron los filtros con un contador de centelleo. En experimentos testigo para valorar la mitogenicidad, se trataron las células de modo idéntico, con la salvedad de que se añadió a las células medio (testigo negativo) o concanavalina A (testigo positivo), en vez de los oligonucleótidos. Los resultados de estos estudios se muestran en la Figura 1. Todos los oligonucleótidos híbridos invertidos demostraron ser menos inmunogénicos que los oligonucleótidos con enlaces fosforotioato. Los oligonucleótidos híbridos invertidos que tenían enlaces fosfodiéster en la región 2'-O-metilo resultaron ser algo menos inmunogénicos que los que contenían enlaces fosforotioato en dicha región. No se observaron diferencias significativas en la mitogenicidad cuando la región de 2'-O-metilrribonucleótidos se redujo de 13 a 11 o a 9 nucleótidos. Estos resultados indican que la incorporación de la estructura híbrida invertida en un oligonucleótido puede reducir su mitogenicidad.
Ejemplo 4 Reducción de la inhibición de la coagulación in vitro por oligonucleótidos híbridos invertidos
Para determinar el efecto relativo de la estructura híbrida invertida en la mitogenicidad provocada por oligonucleótidos, se realizaron los siguientes experimentos. Se extrajo sangre venosa de voluntarios humanos adultos sanos. Se preparó el plasma para el ensayo del tiempo de coagulación recogiendo la sangre en recipientes al vacío siliconizados que contenían citrato de sodio (Becton Dickinson #367705), seguido por dos centrifugaciones a 4ºC para preparar el plasma bajo en plaquetas. Se mantuvieron partes alícuotas de plasma en hielo, se les añadieron varios compuestos de prueba y, o bien se analizaron inmediatamente o se congelaron rápidamente en hielo seco para su conservación posterior a -20ºC antes del ensayo de coagulación. Se midió el tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa) por duplicado en un aparato Electra 1000C (Medical Laboratory Automation, Mount Vernon, N.Y.) siguiendo las instrucciones recomendadas por el fabricante, utilizando Actin FSL (Baxter Dade, Miami, FL.) y calcio para iniciar la formación de coágulos, que se midió por fotometría. La prolongación del TTPa se consideró una indicación de la inhibición de la coagulación producida, como efecto secundario, por el oligonucleótido. Los resultados se muestran en la Figura 5, para los oligonucleótidos híbridos invertidos (y en la Figura comparativa 8 para los oligonucleótidos quiméricos invertidos). Los oligonucleótidos tradicionales con enlaces fosforotioato producen la mayor prolongación del TTPa, de entre todos los oligonucleótidos probados. Los oligonucleótidos híbridos tradicionales produjeron una prolongación algo reducida del TTPa. En comparación con los oligonucleótidos tradicionales con enlaces fosforotioato o con los oligonucleótidos tradicionales híbridos, todos los oligonucleótidos híbridos invertidos probados produjeron una prolongación significativamente reducida del TTPa. Los oligonucleótidos híbridos invertidos que tenían enlaces fosfodiéster en la región de ribonucleótidos 2'-O-sustituidos presentaron la máxima reducción en este efecto secundario, presentando uno de dichos oligonucleótidos que tenía una región de 2'-O-metil-ARN con enlaces fosfodiéster de 13 nucleótidos una muy escasa prolongación del TTPa, incluso a concentraciones de oligonucleótidos de 100 microgramos/ml. Estos resultados indican que los oligonucleótidos híbridos invertidos pueden presentar ventajas en la reducción del efecto secundario de inhibición de la coagulación cuando se administran para modular la expresión génica in vivo.
Ejemplo 5 Reducción en la activación del complemento in vivo por oligonucleótidos híbridos invertidos
Se aclimatan monos Rhesus (4-9 kg de peso corporal) a las condiciones del laboratorio durante por lo menos 7 días antes del estudio. En el día del estudio, se administra sedación leve a cada animal con ketamina-HCl (10 mg/kg) y diazepam (0,5 mg/kg). Se provoca la anestesia hasta el nivel quirúrgico y se mantiene durante el procedimiento por venoclisis continua de ketamina. El oligonucleótido con enlaces fosforotioato o el oligonucleótido híbrido invertido se disuelve en solución salina normal y se administra por infusión intravenosa con un catéter en la vena cefálica, utilizando una bomba de infusión programable a una velocidad de suministro de 0,42 ml/minuto. Para cada oligonucleótido, se administran dosis de oligonucleótidos de 0, 0,5, 1, 2, 5 y 10 mg/kg a dos animales durante un período de infusión de 10 minutos. Se toman muestras de sangre arterial 10 minutos antes de la administración de oligonucleótidos y 2, 5, 10, 20, 40 y 60 minutos tras el comienzo de la infusión, así como 24 horas después. Se utiliza el suero para determinar el complemento CH50, siguiendo el procedimiento convencional de lisis, dependiente del complemento, de eritrocitos de oveja (véase Kabat y Mayer, 1961, citado anteriormente). A la máxima dosis, el oligonucleótido con enlaces fosforotioato provoca un descenso en el complemento CH50 del suero comenzando en el plazo de 5 minutos tras el comienzo de la infusión. Se espera que los oligonucleótidos híbridos invertidos muestren, en estas condiciones, un descenso mucho más reducido, o indetectable, en el complemento CH50 del suero.
Ejemplo 6 Reducción de la mitogenicidad in vivo de oligonucleótidos híbridos invertidos
Se inyecta a ratones CD1, por vía intraperitoneal, una dosis de 50 mg/kg de peso corporal de oligonucleótidos con enlaces fosforotioato u oligonucleótidos híbridos invertidos. Cuarenta y ocho horas después, se sacrifican los animales y los bazos se extraen y se pesan. Se espera que los animales tratados con oligonucleótidos híbridos invertidos no muestren un aumento significativo en el peso del bazo, mientras que se espera que aquellos tratados con oligonucleótidos con enlaces fosforotioato presenten aumentos leves en el peso del bazo.
Ejemplo 7 Reducción de la inhibición de la coagulación in vivo por oligonucleótidos híbridos invertidos
Se tratan monos Rhesus como en el ejemplo 5. A partir de las muestras de sangre completa extraídas se prepara el plasma para el ensayo de coagulación, que se realiza como se ha descrito en el ejemplo 4. Se espera que la prolongación del TTPa esté sustancialmente reducida en el caso de los oligonucleótidos híbridos invertidos, en comparación con los oligonucleótidos tradicionales con enlaces fosforotioato.
Ejemplo 8 Efecto de la estructura híbrida invertida sobre la actividad de la RNasa H
Con el objeto de determinar la capacidad de los oligonucleótidos híbridos invertidos para activar RNasa H cuando se unen a una molécula de ARN complementario, se realizaron los siguientes experimentos. Cada oligonucleótido con enlaces fosforotioato u oligonucleótido híbrido invertido se incubó junto con una cantidad molar equivalente de oligorribonucleótido complementario (concentración de 0,266 micromolar de cada uno), en una cubeta que contenía un volumen final de 1 ml de tampón de RNasa H (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 10 mM, KCl 0,1 M, glicerol al 2%, DTT 0,1 mM). Las muestras se calentaron hasta 95ºC, después se enfriaron gradualmente hasta la temperatura ambiente para permitir la hibridación y la formación de estructuras de cadena doble. Las estructuras de cadena doble hibridadas se incubaron durante 10 minutos a 37ºC, después se añadieron 5 unidades de RNasa H y se inició la recogida de datos durante un período de tres horas. Los datos se registraron utilizando un espectrofotómetro GBC 920 (GBC Scientific Equipment, Victoria, Australia) a 259 nm. La degradación por la RNasa H se determinó por desplazamiento hipercrómico.
Los resultados se muestran en la Tabla I siguiente.
TABLA I Degradación de oligonucleótidos por la RNasa H
Oligo nº (Características) Semivida Oligo nº (Características) Semivida
GEM91 (todo PO) 8,8 s Hyb115 (5' MP) 11,5 s
GEM91 (todo PS) 22,4 s Hyb116 (quimérico)* 9,7 s
GEM91H (híbrido) 32,7 s Hyb117 (quimérico)* 8,1 s
Hyb108 (híb. inv.) 15,4 s Hyb118 (quim. inv.) 11,5 s
Hyb109 (híb. inv.) 7,9 s Hyb119 (quim. inv.) 14,4 s
Hyb110 (híb. inv.) 10,4 s Hyb120 (quim. inv.) 9,3 s
Hyb111 (híb. inv.) 12,9 s Hyb121 (3' MP) 21,2 s
TABLA I (continuación)
Oligo nº (Características) Semivida Oligo nº (Características) Semivida
Hyb112 (híb. inv.) 12,5 s Hyb122 (quimérico)* 23,0 s
Hyb113 (híb. inv.) 10,9 s Hyb123 (quimérico)* 41,8 s
Hyb114 (híb. inv.) 20,3 s Hyb124 (quimérico)* no detect.
*= comparativo
Como se esperaba, los oligonucleótidos con enlaces fosfodiéster se comportaron como buenos cosustratos para la degradación de ARN, mediada por la RNasa H, con una semivida de degradación de 8,8 segundos. Los oligonucleótidos con enlaces fosforotioato produjeron un aumento en la semivida de 22,4 segundos. La introducción de un segmento de 2'-O-metilrribonucleótido en cualquiera de los extremos del oligonucleótido empeoró aún más la actividad de la RNasa H (semivida = 32,7 segundos). En contraposición, la introducción de un segmento de 2'-O-metilo en medio del oligonucleótido (estructura híbrida invertida) siempre dio lugar a una mejora en la degradación mediada por la RNasa H. Cuando una región de 13 2'-O-metilrribonucleósidos con enlaces fosfodiéster estaba flanqueada en ambos lados con ADN con enlaces fosforotioato, se observó la máxima actividad de la RNasa H, con una semivida de 7,9 segundos. La introducción de grandes bloques de nucleósidos unidos por enlaces metilfosfonato en el extremo 3' del oligonucleótido o bien no produjo ningún efecto o provocó un deterioro adicional de la actividad de la RNasa H incluso cuando se encontraban en una configuración quimérica. Sin embargo, la introducción de nucleósidos unidos por enlaces metilfosfonato en el extremo 5' aumentó la actividad de la RNasa H, particularmente en la configuración quimérica con un solo conector de metilfosfonato en el extremo 3' (la mejor semivida = 8,1 segundos). Todos los oligonucleótidos quiméricos invertidos con regiones principales de metilfosfonato (ejemplos comparativos) flanqueadas por regiones de fosforotioato dieron lugar a buenos resultados de la RNasa, con un intervalo de semivida de 9,3 a 14,4 segundos. Estos resultados indican que la introducción de la estructura híbrida invertida (o quimérica invertida) en oligonucleótidos que contienen fosforotioato puede restablecer parte o toda la capacidad del oligonucleótido para actuar como cosustrato de la RNasa H, una característica potencialmente importante para un agente antisentido eficaz.
Ejemplo 9 Efecto de la estructura híbrida invertida en la temperatura de fusión
Para determinar el efecto de la estructura híbrida invertida en la estabilidad de la estructura de cadena doble formada entre un oligonucleótido antisentido y una molécula diana, se realizaron los siguientes experimentos. Se registraron los datos de desnaturalización térmica (Tm) utilizando un espectrofotómetro GBC 920, que tenía seis cubetas de 10 mm montadas en un carrusel doble. En los experimentos de Tm se ajustó y controló la temperatura por medio de un controlador de temperatura de efecto Peltier conectado a un ordenador, utilizando el software suministrado por GBC, siguiendo las instrucciones del fabricante. Los datos de Tm se analizaron por el método de la primera derivada y por el método del punto medio, con ayuda del software. Los experimentos de Tm se realizaron en un tampón que contenía PIPES 10 mM, pH 7,0, EDTA 1 mM, NaCl 1 M. Se conectó un baño refrigerado VWR 1166 (VWR, Boston, MA.) al controlador de temperatura de efecto Peltier para absorber el calor. La concentración de cadenas de oligonucleótido se determinó utilizando los valores de absorbancia a 260 nm, teniendo en cuenta los coeficientes de extinción.
Los resultados se muestran en la Tabla II siguiente.
TABLA II Estabilidad de la estructura de cadena doble de los oligonucleótidos
Oligo nº (Características) Tm (ºC)* Oligo nº (Características) Tm (ºC)*
GEM91 (todo PO) 72,0 Hyb115 (5' MP) 61,8
GEM91 (todo PS) 63,6 Hyb116 (quimérico)* 61,0
GEM91H (híbrido) 67,0 Hyb117 (quimérico)* 60,5
Hyb108 (híb. inv.) 76,4 Hyb118 (quim. inv.) 57,9
Hyb109 (híb. inv.) 80,0 Hyb119 (quim. inv.) 57,7
Hyb110 (híb. inv.) 74,2 Hyb120 (quim. inv.) 56,8
Hyb111 (híb. inv.) 76,9 Hyb121 (3' MP) 60,7
Hyb112 (híb. inv.) 72,1 Hyb122 (quimérico)* 60,5
Hyb113 (híb. inv.) 74,3 Hyb123 (quimérico)* 59,0
Hyb114 (híb. inv.) 71,3 Hyb124 (quimérico)* no detect.
*= comparativo
*= con ARN complementario
Estos resultados demuestran que la conversión de un oligonucleótido con enlaces fosfodiéster a un oligonucleótido con enlaces fosforotioato se traduce en una reducción de la estabilidad de la estructura de cadena doble, y que la introducción de enlaces metilfosfonato reduce aún más la estabilidad de la estructura de cadena doble. La estabilidad de la estructura de cadena doble puede restablecerse añadiendo 2'-O-metilrribonucleótidos, y puede superar a la del oligonucleótido con enlaces fosfodiéster cuando se utiliza una estructura híbrida invertida. A la inversa, la utilización de una estructura quimérica invertida se traduce en las mínimas temperaturas de fusión observadas para cualquiera de los oligonucleótidos con metilfosfonato que se hibridan, aunque se mantenía la estabilidad de la estructura de cadena doble incluso muy por encima de las temperaturas fisiológicas. En conjunto, estos resultados sugieren que la estructura híbrida invertida o la estructura quimérica invertida pueden utilizarse para el diseño a medida de oligonucleótidos para obtener estabilidades particulares deseadas de la estructura de cadena doble en aplicaciones experimentales o terapéuticas particulares.

Claims (8)

1. Oligonucleótido híbrido invertido que comprende una región de ribonucleótidos 2'-O-substituidos, en el que dicha región de ribonucleótidos 2'-O-substituidos tiene de 4 a 13 nucleósidos situados entre dos regiones de oligodesoxirribonucleótidos con enlaces fosforotioato, en el que dichas regiones de fosforotioato tienen de 5 a 46 desoxirribonucleótidos, donde "2'-O-substituido" significa la sustitución de la posición 2' del grupo pentosa con un grupo -O-alquilo inferior que contiene de 1 a 6 átomos de carbono saturados o insaturados, o con un grupo -O-arilo o alilo que tiene de 2 a 6 átomos de carbono, en el que dicho grupo alquilo, arilo o alilo puede estar no sustituido o puede estar sustituido.
2. Oligonucleótido híbrido invertido según la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido tiene de 15 a 50 nucleótidos.
3. Oligonucleótido híbrido invertido según la reivindicación 1, en el que los ribonucleótidos 2'-O-substituidos están unidos entre sí por medio de un enlace 5' a 3' de fosforotioato, fosfotriéster o fosfodiéster.
4. Oligonucleótido híbrido invertido según la reivindicación 1, en el que la posición 2' del grupo pentosa está sustituida con un grupo -O-alquilo inferior.
5. Oligonucleótido híbrido invertido según la reivindicación 2, en el que la región de ribonucleótidos 2'-O-substituidos tiene de 4 a 10 nucleótidos.
6. Utilización de un oligonucleótido híbrido invertido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para la preparación de una composición farmacéutica para la inhibición de la expresión génica.
7. Composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido híbrido invertido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el oligonucleótido es complementario a un gen que se expresa para modular la expresión génica en un mamífero.
8. Composición farmacéutica según la reivindicación 7, en la que el oligonucleótido es complementario de un gen que se expresa de modo aberrante.
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