ES2201309T3 - Terapia por captura de neutrones de boro utilizando procedimientos de direccionamiento previo. - Google Patents

Terapia por captura de neutrones de boro utilizando procedimientos de direccionamiento previo.

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Abstract

LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA UN PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR EL BLANCO DE ATOMOS DE BORO EN CELULAS TUMORALES DE UN PACIENTE, EL PROCEDIMIENTO COMPRENDE LAS ETAPAS DE: (A) ADMINISTRAR UNA COMPOSICION - BLANCO, QUE COMPRENDE UN CONJUGADO DE UN PRIMER MIEMBRO DE UN PAR DE FIJACION Y UN ANTICUERPO, CARACTERIZADO PORQUE EL ANTICUERPO SE FIJA SELECTIVAMENTE A ANTIGENOS PRODUCIDOS POR LAS CELULAS TUMORALES O ASOCIADOS A ELLAS, Y QUE PERMITE QUE EL CONJUGADO SE LOCALICE EN DICHAS CELULAS TUMORALES; (B) OPTATIVAMENTE, ADMINISTRAR UNA COMPOSICION ELIMINADORA, Y PERMITIR QUE LA COMPOSICION ELIMINADORA ELIMINE DE LA CIRCULACION EL CONJUGADO NO LOCALIZADO; (C) ADMINISTRAR UN COMPUESTO QUE CONTIENE BORO, FORMADO POR UN CONJUGADO QUE COMPRENDE UN MIEMBRO COMPLEMENTARIO DEL CITADO PAR DE FIJACION Y ATOMOS DE BORO, Y DEJAR QUE EL COMPUESTO SE LOCALICE EN LAS CELULAS TUMORALES. EL PROCEDIMIENTO PODRIA COMPRENDER ADEMAS LA ETAPA DE IRRADIAR LOS ATOMOS DE BORO DEL COMPUESTO DE BORO, EFECTUANDOSE ASI ELBNCT DE LAS CELULAS TUMORALES. SE PROPORCIONAN IGUALMENTE COMPOSICIONES Y CONJUNTOS PARA LLEVAR A LA PRACTICA EL PROCEDIMIENTO.

Description

Terapia por captura de neutrones de boro utilizando procedimientos de direccionamiento previo.
Antecedentes de la invención Campo de la invención
La presente invención se refiere a procedimientos mejorados para direccionamiento de los átomos de boro a las células del tumor para efectuar la terapia por captura de neutrones de boro (BNCT). BNCT es un sistema binario diseñado para administrar radiación ionizante a las células del tumor por irradiación de neutrones de los átomos de boro-10 localizados en el tumor. En la presente invención, las células de cáncer están previamente dirigidas, por ejemplo, con un anticuerpo monoclonal específico del antígeno carcinoembriónico (MAb) conjugado con, por ejemplo, estreptavidina. A continuación, se administra un compuesto que contiene boro conjugado, por ejemplo, con biotina, que se une a la estreptavidina localizada en la zona cancerosa. El boro localizado se puede irradiar a continuación, efectuando de este modo el tratamiento de las células del tumor.
Descripción de la técnica relacionada Terapia por captura de neutrones de boro
La terapia por captura de neutrones de boro (BNCT) se basa en la reacción nuclear que tiene lugar cuando un isótopo estable, B-10 (presente en abundancia natural del 19,8%), se irradia con neutrones térmicos para producir una partícula alfa y un núcleo de Li-7. Estas partículas presentan una longitud de recorrido de aproximadamente un diámetro celular, produciendo una transferencia de energía lineal elevada. Sólo unas pocas partículas alfa del intervalo estrecho de 1,7 MeV producidas en esta reacción nuclear son suficientes para dirigir los núcleos celulares y destruirlos. Barth et al., Cancer, 70: 2995-3007 (1992). Desde que ocurra la reacción con ^{10}B(n,\alpha)^{7}Li, y produzca por eso un efecto biológico significativo, solamente cuando existe una fluencia (número) suficiente de neutrones térmicos y una cantidad crítica de B-10 localizado alrededor de o dentro de la célula maligna, está localizada la radiación producida. La sección transversal de captura de neutrones de B-10 excede con mucho la del nitrógeno e hidrógeno hallados en los tejidos, que también pueden experimentar reacciones de captura, (números relativos: 1 para N-14, 5,3 para H-1 y 11560 para B-10), de modo que una vez se consigue una gran concentración diferencial de B-10 entre las células normales y las malignas, solamente las últimas serán afectadas en la irradiación de neutrones. Esta es la base científica para la terapia por captura de neutrones de boro. Barth et al., supra; Barth et al., Cancer Res., 50: 1061-70 (1990); Perks et al., Brit. J. Radiol., 61: 1115-26 (1988).
Los reactores nucleares son la fuente de neutrones para la BNCT. Los rayos de neutrones térmicos con energías en el intervalo de 0,023 eV, utilizados en experimentos iniciales para el tratamiento de los tumores cerebrales, son atenuados fácilmente por los tejidos y apenas penetran. Los avances más recientes con neutrones de energía intermedia (neutrones epitérmicos, energía de 1 a 10.000 eV) han conducido al consenso para su utilización en pruebas clínicas planificadas en los Estados Unidos y Europa. Alam et al., J. Med. Chem., 32: 2326-30 (1989). Los neutrones rápidos con una energía probable de 0,75 MeV son de poca utilización en BNCT.
Cálculos originales estimaron que una concentración de boro de 35 a 50 \mug por gramo de tumor, ó de 10^{9} átomos de B-10 por célula tumoral, serían necesarios para mantener una reacción nuclear de destrucción celular con fluencias de neutrones térmicos de 10^{12} a 10^{13} n.cm^{-2}. Fairchild et al., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 11: 831 (1985). Estos cálculos se basaron en el boro uniformemente distribuido, como se observa con los compuestos borados no específicos. Para los agentes de boro basados en anticuerpos, suponiendo la saturación de todos los antígenos superficiales en la célula tumoral, esta cantidad de requisitos de boro transporta aproximadamente 1000 átomos por molécula de anticuerpo. Sin embargo, los cálculos de Montecarlo más recientes condujeron al análisis de que durante una falta de interiorización del anticuerpo, la carga de boro podría ser tan baja como 300 átomos por molécula de MAb. Kalend et al., Med. Phys., 18: 662 (1991); Zamenhof et al., J. Nat'l Cancer Inst., 84: 1290-91 (1992).
Esto se basó en el siguiente justificación: para las células del tumor que presentan una relación volumétrica núcleo a célula de 0,5 y un diámetro celular efectivo de 10 \mum, tres fisiones de B-10 en la superficie de la célula producirían por lo menos una trayectoria de partícula pesada dentro del núcleo. Suponiendo la saturación de las zonas de antígeno en la superficie celular, se dedujo que en estas condiciones bastarían solamente 300 átomos por molécula de anticuerpo para producir las tres reacciones de fisión sobre la superficie de la célula tumoral. La presente invención describe un procedimiento que puede unir un número de átomos de boro 20 veces mayor por MAb que estos supuestos procedimientos anteriores.
Históricamente, BNCT se empleó en primer lugar para el tratamiento del glioblastoma (forma mortal de tumor cerebral) y de otros tumores cerebrales en un momento en que las sustancias específicas para el tumor eran casi desconocidas. Hatanaka et al., en BORON NEUTRON CAPTURE THERAPY FOR TUMORS, págs. 349-78 (Nishimura Co., 1986). Uno de los primeros compuestos borados empleados, una sustancia de boro que contiene sulfhidrilo denominada borocaptato de sodio o BSH (Na_{2},B_{12}H_{11}SH), cruza la barrera sangre-cerebro para situarse en el cerebro, y esta ha sido la base anatómica para la terapia por captura de neutrones de tumores cerebrales. Se han realizado pruebas clínicas, o se han programado, para el tratamiento de gliomas en Japón, Estados Unidos y Europa. Barth et al., Cancer, supra. Los problemas con los procedimientos anteriores de la terapia de boro inorgánico fueron que el boro alcanzó tanto las áreas objetivo como las no objetivo. Por consiguiente, cuando se irradió el boro, se destruyeron las células sanas así como las células cancerosas.
El concepto de BNCT se ha extendido a otros cánceres, estimulado por el descubrimiento de numerosas sustancias localizadoras del tumor, incluyendo los anticuerpos monoclonales dirigidos al tumor. Por ejemplo, los aminoácidos borados tal como p-borofenilalanina acumulado en las células de melanoma. Se ha demostrado el potencial para utilizar anticuerpos monoclonales borados dirigidos contra los antígenos de la superficie celular, tal como CEA, para BNCT de los cánceres. Ichihashi et al., J. Invest. Dermatol., 78: 215-18 (1982); Goldenberg et al., P.N.A.S., USA, 81: 560-63 (1984); Mizusawa et al., P.N.A.S., USA, 79: 3011-14 (1982); Barth et al., Hybridoma, 5(supp. 1): 543-5540 (1986); Ranadive et al., Nucl. Med. Biol., 20: 663-68 (1993). Sin embargo, los anticuerpos fuertemente borados fracasaron al dirigirse al tumor in vivo en modelos animales. Alam et al., supra; Barth et al., Bioconjugate Chem., 5: 58-66 (1994).
El éxito con BNCT del cáncer requiere procedimientos para localizar una gran concentración de boro-10 en las zonas con tumor, a la vez que se dejan los órganos no objetivo exentos esencialmente de boro. Los compuestos borados sin anticuerpo que se acumulan preferentemente en el tumor, pero no específicamente, adolecen del inconveniente de que las relaciones tumor a sangre y tumor a órgano son con frecuencia menores de las teóricas, con el resultado de que podrían producirse daños a los órganos normales durante la irradiación con rayos de neutrones.
En el caso de los anticuerpos, la necesidad percibida de cargar los mismos con 1000 átomos de boro por molécula de anticuerpo ha conducido al diseño de una variedad de anticuerpos fuertemente borados utilizando, por ejemplo, polilisina, dendrímero o dextrano como vehículos intermedios de agregados de boro. Alam et al., supra; Barth et al., Bioconjugate Chem., supra. Aunque en muchos casos se encontró que se conservaba in vitro alguna unión al antígeno, estos conjugados borados se localizaron predominantemente en el hígado con escasa acumulación en el tumor en modelos tumorales animales in vivo.
Por lo tanto, es necesario un procedimiento para dirigir átomos de boro a las células del tumor que sea capaz de administrar una gran cantidad de átomos de boro a las zonas con tumor, mientras deja a las zonas no cancerosas relativamente exentas de boro.
Direccionamiento previo
El concepto de direccionamiento previo para una aplicación in vivo de diagnóstico por imagen fue propuesto por Hnatowich et al., J. Nucl. Med., 28: 1294-1302 (1987), y se examinó después desde un punto de vista teórico. Van Osdol et al., J. Nucl. Med., 34: 1552-64 (1993). El direccionamiento previo ha sido presentado recientemente por haber producido resultados preclínicos muy alentadores en radioinmunoterapia de itrio-90. Axworthy et al., J. Immunother., 16: 158 (1994). La patente U.S. nº 5.482.698, expone también varios procedimientos de direccionamiento previo.
La terapia requiere una acumulación muy absoluta del agente terapéutico en la zona del cáncer, así como una duración razonablemente larga de la absorción y de la fijación. Hace tiempo se han reconocido niveles de fondo elevados de anticuerpos no dirigidos como el principal impedimento para el objetivo superior: que se consigan relaciones de fondo. Para superar este impedimento, se han desarrollado varios procedimientos, tales como los descritos en Hansen et al., patente U.S. nº 3.927.193 y Goldenberg, patentes U.S. nº 4.331.647, nº 4.348.376, nº 4.361.544, nº 4.468.457, nº 4.444.744, nº 4.460.459, nº 4.460.561, nº 4.624.846 y nº 4.818.709.
Los procedimientos de direccionamiento previo utilizando los planteamientos biotina/avidina se describen, por ejemplo, en Hnatowich et al., J. Nucl. Med. 28: 1294, 1987; Oehr et al., J. Nucl. Med., 29: 728, 1988; Klibanov et al., J. Nucl. Med. 29: 1951, 1988; Sinitsyn et al., J. Nucl. Med., 30: 66, 1989; Kalofonos et al., J. Nucl. Med. 31: 1791, 1990; Schechter et al., Int. J. Cancer 48: 167; 1991; Paganelli et al., Cancer Res. 51: 5960, 1991; Paganelli et al., Nucl. Med. Commun. 12: 211, 1991; Stickney et al., Cancer Res. 51: 6650, 1991; y Yuan et al., Cancer Res. 51: 3119, 1991.
Estos procedimientos implican el direccionamiento previo a una zona objetivo, tal como un tumor o lesión, con una proteína objetivo, tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, conjugado con un elemento de un par de unión, tal como biotina o avidina, por lo que el conjugado de anticuerpo se localiza en la zona objetivo. A continuación, se administra un conjugado de un agente de detección o terapéutico, tal como un radioisótopo y el elemento complementario del par de unión, tal como biotina o avidina. La afinidad para la unión entre los elementos del par de unión da lugar a que el segundo conjugado se localice en la zona objetivo, donde el primer conjugado ya está unido.
En algunos de estos procedimientos, se utiliza una etapa intermedia de eliminación o de localización. En este caso, el primer conjugado comprende un elemento del par de unión (por ejemplo, biotina), el agente de eliminación y localización puede comprender el otro elemento del par de unión (por ejemplo, avidina), y el segundo conjugado comprende el mismo elemento del par de unión que el primero (por ejemplo, biotina). También se han descrito otros agentes de eliminación, tal como los anticuerpos.
\newpage
Se necesita un procedimiento para dirigir átomos de boro a células del tumor que obtenga elevadas relaciones tumor: ausencia de tumor de los átomos de boro, y que administre suficiente cantidad de átomos boro a las zonas tumorales de una manera eficaz. Asimismo se necesitan composiciones adecuadas para utilizar en tal procedimiento.
Sumario de la invención
Es, por lo tanto, un objetivo de la presente invención proporcionar un procedimiento para dirigir átomos de boro a las células del tumor que supere los problemas anteriores de mantener una elevada relación tumor: ausencia de tumor de los átomos de boro-10, para administrar eficazmente cantidades suficientes de átomos de boro-10 a las zonas con tumor y para proporcionar composiciones para su utilización en este procedimiento.
Para conseguir estos y otros objetivos de la invención, se proporciona, según un aspecto de la presente invención, un procedimiento para dirigir átomos de boro a las células del tumor en pacientes, que comprende las etapas de:
(A)
administrar al paciente una composición de direccionamiento que comprende un conjugado de un primer elemento de un par de unión y un anticuerpo, en la que el anticuerpo se une selectivamente a los antígenos producidos por o asociados a las células del tumor y dejando al conjugado que se sitúe en las células del tumor;
(B)
administrar, opcionalmente, al paciente una composición de eliminación y dejar que la composición de eliminación elimine de la circulación el conjugado no situado; y
(C)
administrar al paciente un compuesto que contiene boro que comprende un conjugado que se compone de un elemento complementario del par de unión y de átomos de boro y que deja a dicho compuesto que contiene boro que se situe en las células del tumor. El procedimiento puede comprender además la etapa de irradiar los átomos de boro del compuesto que contiene boro localizado en las células del tumor, efectuando de este modo la BNCT de las células del tumor.
El par de unión puede comprender biotina y avidina o estreptavidina, cadenas complementarias de polinucleótidos o pares enzima-substrato. Cuando el par de unión comprende biotina, la biotina puede comprender un análogo de biotina resistente a la biotinidasa que comprende un grupo de biotina unido por un péptido a un D- aminoácido no natural.
En una forma de realización de la presente invención, el compuesto que contiene boro está radiomarcado con un marcador detectable, en cuyo caso el procedimiento puede comprender además la etapa de identificar el marcador detectable del compuesto que contiene boro, determinando de este modo la situación del compuesto. En otra forma de realización de la presente invención, los átomos de boro del compuesto que contiene boro situados en las células del tumor se irradian después de identificar el marcador detectable.
Según otro aspecto de la presente invención, se ha proporcionado una composición inyectable estéril para la utilización humana, que comprende una composición para su utilización en los átomos de boro de direccionamiento a las células del tumor, que comprende un compuesto que contiene biotina que se compone de un conjugado de un elemento de un par de unión y de átomos de boro. En una forma de realización de la invención, el compuesto que contiene biotina está radiomarcado con un marcador detectable.
El elemento del par de unión puede estar compuesto por biotina, avidina o estreptavidina, una sola cadena de un polinucleótido o una enzima o substrato enzimático. Cuando el elemento del par de unión está compuesto por biotina, la biotina puede comprender un análogo de biotina resistente a la biotinidasa que se compone de un grupo de biotina unido por un péptido a un D-aminoácido no natural.
Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un kit adecuado para su utilización en un procedimiento para dirigir átomos de boro a las células del tumor en un paciente, kit que comprende:
(A)
una preparación inyectable, estéril de una composición de direccionamiento que comprende un primer elemento de un par de unión y un anticuerpo, en la que el anticuerpo se une selectivamente a los antígenos producidos por o asociados a las células del tumor;
(B)
opcionalmente, una composición de eliminación; y
(C)
un compuesto que contiene boro que comprende un conjugado que se compone de un elemento complementario del par de unión y de átomos de boro.
Los objetivos y ventajas adicionales de la invención se indican en parte en la descripción que sigue, y en parte serán evidentes a partir de la descripción, o se pueden aprender mediante la puesta en práctica la invención. Los objetivos y las ventajas se pueden realizar y obtener por medio de los procedimientos y composiciones particularmente indicadas en las reivindicaciones adjuntas.
Descripción detallada de las formas de realización preferidas
La presente invención supera los problemas antes mencionados mediante la BNCT dirigida al anticuerpo desacoplando las etapas de administración del anticuerpo y del boro utilizando, por ejemplo, un procedimiento de direccionamiento previo en dos o tres etapas. Mientras que los procedimientos anteriores de BNCT dirigido al anticuerpo implican cargar aproximadamente 1500 átomos de boro-10 en una sola molécula de anticuerpo, la presente invención no carga el anticuerpo de direccionamiento con boro, eliminando de este modo el problema relacionado con la hipersustitución boro-mAb.
En la presente invención, una gran concentración de boro está específicamente situada en las zonas del tumor dirigiendo previamente las zonas tumorales con un anticuerpo monoclonal selectivo del antígeno tumoral conjugado con un elemento de un par de unión, tal como avidina o estreptavidina. El anticuerpo utilizado selectivamente se une a los antígenos producidos por o asociados con las células del tumor. La utilización de un anticuerpo monoclonal selectivo es inherentemente más específica que los compuestos borados utilizados anteriormente que se acumulan en las zonas tumorales de modo preferente, pero no selectivamente.
Después que el conjugado de anticuerpo-avidina se ha situado en las zonas tumorales, y opcionalmente, después que se ha administrado el agente de eliminación y permitido que elimine de la circulación el conjugado no localizado, se administra un compuesto que contiene boro que comprende de un conjugado que se compone del elemento complementario del par de unión, tal como biotina, y de boro. La afinidad entre los elementos de par de unión conduce al compuesto que contiene boro a situarse en las zonas tumorales, efectuando de este modo la administración selectiva de los átomos de boro en las células del tumor.
Los estados cancerosos que se pueden dirigir y tratar según la presente invención incluyen melanomas, sarcomas, neuroblastomas, leucemias, linfomas, gliomas y mielomas.
Un par de unión frecuente utilizado en los procedimientos de direccionamiento previo es la avidina o la estreptavidina y la biotina. La avidina, hallada en la clara de huevo, presenta una afinidad de unión muy elevada por la biotina, que es una vitamina del complejo B. Wilcheck et al., Anal. Biochem., 171: 1 (1988). La estreptavidina (SAv), procedente del Streptomyces avidinii, es similar a la avidina, pero presenta una unión al tejido no específica inferior y por consiguiente con frecuencia se utiliza en lugar de la avidina. Tanto la avidina como la estreptavidina presentan una tetravalencia para la biotina, permitiendo de este modo la amplificación cuando la primera se une a la biotina.
El sistema estreptavidina-biotina representa la interacción biológica no covalente más fuerte conocida entre una proteína y un ligando (K_{a}=10^{15} M^{-1}). Rosebrough, Nucl. Med. Biol., 20: 663-68 (1993). Por consiguiente, se utiliza en una forma de realización preferida de la invención. La estreptavidina es un tetrámero con un peso molecular de 60 KD, con cuatro zonas de reconocimiento de biotina, mientras que la biotina es una molécula orgánica pequeña. La estreptavidina se puede modificar covalentemente en sus residuos de lisina y unirse a un anticuerpo. La biotina se puede transformar fácilmente en su terminal carboxilo para unirse a numerosas especies, incluyendo un dextrano borado. La fuerte interacción estreptavidina-biotina conducirá a la unión de los dos componentes in vivo.
La estreptavidina posee un pI de -6 comparada con >10 para la avidina, que hace que la carga de SAv se aproxime a la neutralidad a pH fisiológico a diferencia de la fuerte carga positiva de la avidina. Además, la avidina es "viscosa" in vivo e in vitro. Rosebrough, supra. Por estas razones, se prefiere la estreptavidina a la avidina para preparar conjugados utilizados según la presente invención. Sin embargo, se pueden utilizar tanto la avidina como la estreptavidina, y, tal como se utilizan en la descripción siguiente, los términos avidina y estreptavidina incluyen tanto la avidina como la estreptavidina.
Formas modificadas de avidina, tales como la avidina desglucosilada y/o la avidina neutralizada, se pueden utilizar asimismo según la presente invención, como formas recombinantes de avidina o estreptavidina.
La presente invención comprende procedimientos en los que existe una reducción de la inmunogenicidad de la avidina o de la composición de direccionamiento acoplando el agente inmunógeno con un polímero de carbohidrato o grupos poliol. Ejemplos de carbohidratos útiles o de grupos poliol incluyen dextrano, polisacáridos, polietilenglicol (PEG) y similares.
Otros procedimientos de direccionamiento previo útiles según la presente invención están descritos, como por ejemplo, la hibridación específica de fragmentos de polinucleótido complementario, incluyendo ADN, ARN y análogos sintéticos de polinucleótidos tales como PNAs, se pueden utilizar como mecanismo de reconocimiento de un sistema de direccionamiento previo. En tal procedimiento, una cadena de polinucleótido actúa como un elemento de un par de unión y la cadena complementaria actúa como el elemento complementario del par de unión. Véase también Bos et al., Cancer Res. 54: 3479- 3486 (1994). La principal ventaja de este sistema sobre los sistemas biotina/avidina sería la supuesta inmunogenicidad inferior de una pieza relativamente corta de ADN comparada con la especie avidina de 60.000 Dalton.
Otro enfoque del direccionamiento previo implica administrar un enzima unido a un anticuerpo, seguido de la administración de un inhibidor del enzima de alta afinidad (específico para el enzima) unido a un complejo quelato-isótopo. Este procedimiento presenta la ventaja sobre otros procedimientos biespecíficos anteriores de conservar tanto las zonas de unión al antígeno del anticuerpo, como la ventaja adicional de utilizar un mecanismo de direccionamiento secundario de alta afinidad (K_{d}, dihidrofolato reductasa:metotrexato = 10^{-10}). Las combinaciones de enzima y substrato de enzima también se pueden utilizar como pares de unión en los procedimientos de direccionamiento previo. Como en el procedimiento expuesto anteriormente, se puede observar menos antigenicidad que en el sistema avidina/biotina.
Todavía otro enfoque para el direccionamiento previo comprende la utilización de un polinucleótido de doble cadena como un elemento de un par de unión y un agente de intercalado como el otro elemento del par de unión. Por ejemplo, un oligonucleótido de doble cadena se puede unir a un anticuerpo o a un fragmento de anticuerpo para dirigirse a las células del tumor. A continuación, se administra el compuesto que contiene boro que se compone de boro y un agente de intercalado apropiado, que se sitúa en las células del tumor a modo de afinidad entre el oligonucleótido y el agente de intercalado.
Mientras que los ejemplos indicados en la presente memoria describen la utilización de la avidina y de la biotina como par de unión, cualquier par de unión se puede utilizar de acuerdo con la presente invención en la manera descrita para la avidina y la biotina.
Se pueden utilizar anticuerpos o fragmentos de anticuerpo para dirigir previamente el primer elemento del par de unión a las zonas tumorales. Se prefieren los anticuerpos monoclonales debido a sus altas especificidades. Se preparan fácilmente por lo que se consideran ahora procedimientos convencionales de inmunización de mamíferos en la preparación de antígenos inmunógenos, fusión de linfa inmunógena o células de bazo con una línea celular inmortal de mieloma y aislamiento de los clones específicos de hibridoma. No están excluidos más procedimientos no convencionales para preparar anticuerpos monoclonales, tales como las fusiones interespecies y las manipulaciones de ingeniería genética de zonas hipervariables, ya que es principalmente la especificidad por el antígeno de los anticuerpos lo que afecta su utilidad en la presente invención. Se apreciará que se puedan utilizar las técnicas más recientes para la producción de monoclonales, p. ej.: monoclonales humanas, monoclonales interespecie, monoclonales híbridas
(p. ej.: hombre/ratón), anticuerpos modificados genéticamente y similares.
Los fragmentos de anticuerpo útiles en la presente invención incluyen F(ab')_{2}, F(ab)_{2}, Fab', Fab, Fv y similares, incluyendo los fragmentos híbridos. Los fragmentos preferidos son Fab', F(ab')_{2}, Fab, y F(ab)_{2}. También sirven cualesquiera de los subfragmentos que conservan la zona hipervariable de unión al antígeno de una inmunoglobulina y que presentan un tamaño similar o más pequeño que un fragmento de Fab'. Éste incluye proteínas modificadas genéticamente y/o recombinantes, de una sola cadena o de cadena múltiple, que incorporan una zona de unión al anticuerpo y una función diferente in vivo como vehículos de direccionamiento de la misma forma sustancialmente que los fragmentos de inmunoglobulina natural. Tales moléculas de unión de una sola cadena están expuestas en la patente U.S. nº 4.946.778. Los fragmentos Fab' del anticuerpo se pueden preparar convenientemente por escisión reductora de los fragmentos F(ab')_{2}, que pueden prepararse por digestión de la inmunoglobulina íntegra con pepsina. Los fragmentos Fab de anticuerpo se pueden preparar por digestión de la inmunoglobulina íntegra con papaína, en condiciones reductoras, o mediante escisión de los fragmentos F(ab)_{2} que resultan de la digestión cuidadosa con papaína de la inmunoglobulina íntegra. Los fragmentos se pueden producir asimismo mediante ingeniería genética.
Debería observarse que se pueden utilizar mezclas de antibióticos y clases de inmunoglobulina, en tanto que pueden hibridar anticuerpos. Anticuerpos multiespecíficos, incluyendo los biespecíficos y los híbridos, y fragmentos de anticuerpo sirven en los procedimientos de la presente invención y se componen de, por lo menos, dos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo diferentes sustancialmente monoespecíficos, en los que por lo menos dos de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo se unen específicamente a por lo menos dos antígenos diferentes producidos por o relacionados con células de cáncer o por lo menos dos epítopos o moléculas diferentes de una sustancia marcadora producida por o relacionada con las células de cáncer. Los anticuerpos y los fragmentos de anticuerpo multiespecíficos con especificidades dobles se pueden preparar análogamente a los híbridos con marcador antitumoral expuestos en la patente U.S. nº 4.361.544. Otras técnicas para preparar anticuerpos híbridos se exponen en, p. ej.: las patentes U.S. nº 4.474.893 y nº 4.479.895 y en Milstein et al., Immunol. Today, 5: 299 (1984).
Se prefieren los anticuerpos que presentan una inmunorreactividad específica a una sustancia marcadora producida por o relacionada con las células de cáncer de por lo menos el 60% y una reactividad cruzada con otros antígenos o sustancias no dirigidas de menos del 35%.
Como se expuso anteriormente, son conocidos los anticuerpos contra antígenos tumorales. Por ejemplo, los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo que unen específicamente marcadores producidos por o relacionados con tumores se han expuesto, entre otros, en Hansen et al., patente U.S. nº 3.927.193 y Goldenberg, patentes U.S. nº 4.331.647, nº 4.348.376, nº 4.361.544, nº 4.468.457, nº 4.444.744, nº 4.818.709 y nº 4.624.846. En particular, se utilizan ventajosamente anticuerpos contra un antígeno, p. ej.: un tumor gastrointestinal, de pulmón, de mama, de próstata, de ovario, de testículo, de cerebro o linfático, un sarcoma o un melanoma.
Los anticuerpos y los fragmentos de anticuerpo útiles en los procedimientos de la presente invención se pueden conjugar mediante una variedad de procedimientos conocidos en la materia. Muchos de estos procedimientos se exponen en las patentes y solicitudes de patente U.S. antes citadas. Véase también Childs et al., J. Nuc. Med., 26: 293 (1985).
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Un anticuerpo preferido para utilizar en la presente invención es MN-14, anticuerpo de CEA de segunda generación que presenta diez veces más afinidad para CEA que la versión de primera generación, NP-4. Hansen et al., Cancer, 71: 3478-85 (1993). MN-14 interioriza lentamente, haciéndolo adecuado para un enfoque de direccionamiento previo.
En tanto que se prefieren los anticuerpos como agentes de direccionamiento, también se pueden utilizar otros agentes de direccionamiento.
La presente invención proporciona además un compuesto que contiene boro que comprende un conjugado que se compone de biotina y átomos de boro. La biotina es preferentemente un análogo de biotina resistente a la biotinidasa, descrito con más detalle más adelante. La biotina se une a un vehículo intermedio que, a su vez, se acopla a aproximadamente 1.500 átomos de boro. El vehículo intermedio puede ser, por ejemplo, dextrano. Otras moléculas de vehículo serán evidentes para los expertos en la materia e incluyen los animodextranos, Shih et al., patente U.S. nº 5.057.313, otros polisacáridos, polipéptidos sintéticos, tales como polilisinas, ácidos poliglutámicos y policisteínas y polímeros sintéticos tales como polietilenimina, poliolefinas, polialcoholes, ácidos policarboxílicos y dendrímeros starburst. Otro ejemplo de vehículos adecuados son los copolímeros, tales como los de la fórmula (Lys)_{n}-(aax)_{q}-(Glu)_{m}-(aay)_{p}, en la que n, m, p y q son enteros y aax y aay son aminoácidos no específicos que pueden ser iguales o diferentes entre sí y que se seleccionan de entre los aminoácidos naturales y sus D-isómeros.
En una forma de realización, existen de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 grupos de biotina conjugados con cada molécula de dextrano. Para conseguir la administración óptima de los átomos de boro-10 a las zonas tumorales, es deseable que tengan un promedio de sólo un grupo de biotina por cada molécula de compuesto biotina-dextrano-boro. Debido a que cada molécula de avidina o de estreptavidina se puede unir hasta a cuatro moléculas de biotina, se pueden administrar hasta 6000 átomos de boro por mol de anticuerpo situado previamente en las zonas tumorales. Teóricamente, cada una de las cuatro zonas de unión a la biotina de estreptavidina se cargarán con un grupo biotina-dextrano-(boro)_{x}.
El compuesto que contiene boro de la presente invención aumenta la cantidad de boro que se puede administrar por molécula de anticuerpo utilizada en la primera etapa de direccionamiento previo y es una ventaja importante de la presente invención. La utilización de este compuesto según la presente invención consigue o supera la alta concentración de boro en el tumor necesaria para una BNCT eficaz. Por consiguiente, las composiciones y los procedimientos de la presente invención sirven para dirigir los átomos de boro a las zonas tumorales para la terapia de los tumores malignos normales mediante BNCT.
En tanto que el compuesto que contiene boro está descrito anteriormente como un compuesto biotinilado, la presente invención incluye formas de realización en las que el compuesto que contiene boro comprende un conjugado que se compone de átomos de boro y de cualquier elemento de un par de unión, tal como un polinucleótido, un enzima o un substrato de enzima, tal como se expuso anteriormente.
En una forma de realización preferida, el compuesto que contiene boro además está radiomarcado con un marcador detectable. Esto permite la determinación de la situación del compuesto administrado que contiene boro. Los expertos en la materia conocen los radiomarcadores adecuados, e incluyen, por ejemplo, los isótopos emisores de radiaciones gamma. El compuesto puede estar marcado por los procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el compuesto que contiene boro puede estar conjugado con un agente quelante tal como, por ejemplo, DTPA, que quela el radiomarcador, o un ligando de tiol para dirigir el marcado mediante Tc-99m utilizando procedimientos conocidos, tales como los descritos en la patente U.S. nº 5.514.363. Cuando se utiliza un compuesto radiomarcado que contiene boro, el radiomarcador se puede detectar antes de irradiar el boro para asegurar que el compuesto se ha localizado en las células del tumor y que el boro no localizado se ha eliminado de la circulación. Esta forma de realización minimiza los riesgos de dañar las células sanas cuando se irradia el boro, porque la irradiación se puede retardar hasta que el compuesto que contiene boro se ha localizado en las células del tumor. El rayo de neutrones se enfoca ventajosamente a las zonas de los grupos localizados de boro-10 para mejorar además la precisión de la captura por neutrones.
En una forma de realización preferida de la presente invención, los grupos de boro que contienen sulfhidrilo, borocaptato de sodio o BSH (Na_{2}B_{12}H_{11}SH), se utilizan para borar el dextrano. Se ha documentado que éstos no son tóxicos. Barth, Cancer Res., supra; Haselberger et al., Cancer Res. 54: 6318-20 (1994). Éstos están enriquecidos preferentemente con boro-10, conteniendo, por ejemplo hasta el 95 al 98% de boro-10.
La preparación de un conjugado de borocaptato-dextrano se ilustra más adelante en el Esquema I. También son conocidos otros compuestos de boro-10 enriquecidos, tales como los carboranos enriquecidos con boro-10. Ejemplos de éstos están descritos el la patente U.S. nº 4.824.659. Estos compuestos se pueden utilizar según la presente invención, por ejemplo, conjugando los carboranos con el vehículo seleccionado.
En una forma de realización de la presente invención, se utiliza un planteamiento de direccionamiento previo en dos etapas. Como en las demás formas de realización de la presente invención, este planteamiento separa la etapa de localización del anticuerpo de la etapa de deposición del boro en las zonas tumorales. Por ejemplo, las zonas tumorales se dirigen previamente con avidina o un conjugado de estreptavidina-MAb. Después que ha pasado un periodo de tiempo para el direccionamiento del tumor, se administra un no-anticuerpo, compuesto biotinilado que contiene boro, tal como los compuestos que contienen boro descritos anteriormente. Este compuesto se une a la avidina o a la estreptavidina situada en las zonas tumorales mediante el grupo biotina, suministrando de este modo átomos de boro a las zonas tumorales. Este procedimiento evita lo que se refiere acerca del comportamiento in vivo de los anticuerpos borados porque el compuesto que contiene boro no comprende un anticuerpo.
Se pueden utilizar otros pares de unión aparte de biotina y avidina, tales como polinucleótidos y pares enzima/substrato de enzima expuestos anteriormente.
Después que el compuesto de boro se ha situado en la zona del tumor, los átomos de boro se pueden irradiar según los procedimientos convencionales de BNCT, efectuando de este modo la terapia de las células del tumor.
Otra forma de realización de la presente invención utiliza una etapa intermedia entre la etapa de administración del conjugado del anticuerpo y la etapa de administración del boro. En esta etapa se utiliza un agente de eliminación para efectuar la eliminación rápida del anticuerpo en circulación y se asegura que la concentración final de boro en circulación se mantiene despreciable o no existente.
En una forma de realización, el agente de eliminación comprende un conjugado que se compone de galactosa, albúmina de suero humano (HSA) y biotina. Tal agente de eliminación se elimina rápidamente de la circulación mediante receptores de asialoglucoproteína en el hígado.
En otra forma de realización preferida, el agente de eliminación es un anticuerpo antiidiotípico. Este anticuerpo puede ser galactosilado para conseguir la eliminación rápida como se describió anteriormente.
Las vías de administración de las composiciones utilizadas en la presente invención comprenden la intravenosa, intraarterial, intrapleural, intraperitoneal, intratecal, subcutánea o por perfusión.
Las mediciones de la duración de las dos o tres etapas de direccionamiento previo se pueden optimizar para aumentar la eficacia de la administración del boro. La duración de la absorción máxima del tumor del conjugado del anticuerpo, por ejemplo, de estreptavidina-MN14, se puede determinar en primer lugar determinando la dosis óptima de SAv, y además determinando la duración de la absorción máxima del tumor a esta dosis. En una prueba, la duración de la acumulación máxima en el tumor se halló que estaba comprendida entre 48 horas y 72 horas. Óptimamente, el agente de eliminación, tal como HSA-biotina glucosilada sin marcador o el anticuerpo antiidiotípico, se administran en este periodo.
En diferentes procedimientos de direccionamiento previo, el agente de eliminación se administró 24 horas después de la inyección de un conjugado de estreptavidina- IgG. Axworthy et al., documento WO 93/25240. Esta medición del tiempo "temprana" puede evitar la sustitución de algunas zonas de estreptavidina mediante la biotina endógena. Hnatowich et al., Nucl. Med. Commun. 15: 575-77 (1994).
Un agente de eliminación que comprende un conjugado de galactosa-HSA- biotina reduce la concentración de conjugado primario de mAb-SAv en circulación por debajo de aproximadamente el 5% de ID/g. A partir de los estudios iniciales, los presentes inventores han demostrado que la concentración en la sangre del conjugado del anticuerpo desciende drásticamente en el tiempo "cero" durante la administración de un agente de eliminación antiidiotípico. Esto es, el conjugado en circulación se elimina en teoría instantáneamente. El compuesto biotinilado que contiene boro, por consiguiente, se puede administrar dentro de 2 a 4 h de la etapa de eliminación y se puede administrar inmediatamente después de la etapa de eliminación cuando se utiliza un agente de eliminación antiidiotípico.
La consecución de bajos niveles de boro en circulación, y en particular, la consecución de la eliminación casi absoluta del boro en circulación, presenta la ventaja de reducir la toxicidad generalizada observada cuando el haz de neutrones irradia los átomos de boro. Esto es, porque poco o nada de boro está en circulación, solamente las células tumorales dirigidas están afectadas por la irradiación de átomos de boro por el haz de neutrones.
En una forma de realización de la invención, se utiliza un agente de eliminación antiidiotípico, se administra el compuesto que contiene boro y se expone al paciente a un haz de neutrones térmicos poco después de administrar el compuesto que contiene boro, por ejemplo, inmediatamente después se administra el compuesto que contiene boro, irradiando de este modo los átomos de boro en el momento en que la cantidad de boro localizada en las células direccionadas del tumor está en un máximo. En una variación de esta forma de realización, el compuesto que contiene boro está marcado con un marcador detectable y el marcador detectable se identifica antes de la irradiación de los átomos de boro. Esta última variación permite al especialista asegurarse de que el compuesto que contiene boro está localizado antes de irradiar el boro, minimizando de este modo los riesgos de daño a las células sanas.
Por otra parte, el compuesto que contiene boro se puede administrar por vía parenteral dentro de las 24 h de la 2ª etapa o hasta 3 días después. Cuanto mayor sea el retraso después de la primera etapa, menor será la cantidad (y relación) del agente de eliminación necesario.
En una forma de realización de la invención, no se utiliza ningún agente de eliminación y el compuesto que contiene boro se administra a partir de aproximadamente 5 hasta aproximadamente 20 días después de la administración del conjugado del anticuerpo. Esta forma de realización presenta ventajas para los pacientes que muestran rápida eliminación en la sangre y acumulación en el tumor de los compuestos dirigidos, por ejemplo, porque presentan una masa tumoral pesada que está expresando grandes cantidades de antígeno.
La dosis óptima del compuesto biotinilado de boro a administrar está en función de la cantidad de avidina o de estreptavidina que puede ser acomplejada por el compuesto, así como en función de la cinética de la eliminación in vivo del compuesto. Como se expone más adelante, las biodistribuciones de biotina-dextrano-(boro)_{x} marcado con
I-125 en ratones normales balb/C en cinco puntos de tiempo dieron esta información. El doble experimento de marcado en ratones lampiños con tumor (3ª etapa) define la incorporación de material borado en el tumor y otros órganos. Dependiendo de cuánto dure el marcado con I- 125 para eliminarse de los órganos no dirigidos, se pueden modificar la medición del tiempo y la dosificación de la tercera etapa.
En una forma de realización del procedimiento de la presente invención, el conjugado del elemento anticuerpo-par de unión, tal como un conjugado de anticuerpo- avidina o de anticuerpo-polinucleótido, se inyecta por vía parenteral, generalmente a una dosis de anticuerpo de hasta 1 g, por ejemplo comprendido en un intervalo de dosis desde aproximadamente 50 mg a aproximadamente 500 mg. Éste se puede administrar como una sola inyección o en dosis divididas.
Después de 1 a 5 días, más preferentemente en menos de 2 días y aún en menos de 1 día, cuando el primer agente implica una pequeña molécula y de direccionamiento rápido, tal como un fragmento o subfragmento de anticuerpo, se puede administrar por vía parenteral una dosis de agente de eliminación sin marcar. La dosis puede ser, por ejemplo, 2,5 a 10 veces la dosis de la primera etapa (que se puede determinar además midiendo la cantidad de anticuerpo a partir de la primera etapa de circulación en la sangre en el momento de la inyección de la segunda etapa). El agente de eliminación puede ser administrado como una sola inyección o en dosis divididas, en las que la administración del agente de eliminación en 2 dosis se prefiere en determinadas circunstancias.
A continuación, el compuesto elemento-boro del par de unión, tal como un compuesto biotinilado de boro, se administra en el momento y en la dosis apropiados, determinados como se describió anteriormente. Por ejemplo, cuando el sistema avidina-biotina se utiliza como par de unión, la dosis de boro biotinilado puede estar comprendida entre aproximadamente 2 mg y aproximadamente 2 g. La dosis mayor representa aproximadamente un exceso molar 4X de compuesto biotinilado para el conjugado de avidina-anticuerpo inyectado, que permite la saturación de todas las zonas de unión a la biotina en el conjugado de avidina dirigido previamente. La dosis más baja refleja la observación de que sólo una pequeña cantidad del compuesto de boro biotinilado necesita alcanzar las zonas tumorales.
Las formas de realización de la invención se pueden ilustrar además mediante ejemplos que muestran con detalle los aspectos de la invención. Estos ejemplos ilustran elementos específicos de la invención y no están construidos como limitativos del alcance de la misma.
I. Preparación de los reactivos Preparación y análisis del conjugado Ab de estreptavidina-MN-14
Se hace reaccionar un MN-14-IgG tiolado con estreptavidina asociada a maleimido. Una conjugación típica optimizada implica utilizar un exceso molar de 5 veces de conector sulfo-SMCC disponible en el comercio (sulfosuccinimidil 4-[N-maleimidometil] ciclohexano-1-carboxilato) para la derivación de la estreptavidina, un exceso molar de 5 veces de 2-iminotiolano para tiolar MN-14, y aproximadamente una relación molar 1:1 de proteínas, a pH 6,4, para acoplamiento. Las purificaciones por HPLC de preparación en una columna Spherogel TSK-G 3000-SWG (Tosohaas, Montgomeryville, PA), utilizando solución salina tamponada con fosfato 0,2 M a pH 6,8 separan el conjugado 1:1 de los materiales de partida y agregados sin reaccionar.
El análisis del conjugado de estreptavidina-IgG en SDS-PAGE indicó un peso molecular de aproximadamente
210 K daltons. Las pruebas de unión a biotina realizadas utilizando un derivado de biotina-(ITC-Bz-DTPA) marcado con In-111 detectaron una absorción de cuatro equivalentes de biotina-DTPA por equivalente de conjugado de estreptavidina-IgG, demostrando de este modo tanto la pureza del conjugado como la preservación de los cuatro dominios de unión de la biotina en el conjugado.
Estudios de unión competitiva in vitro utilizando análisis ELISA han demostrado que la afinidad de unión para el antígeno (CEA) era muy similar a la del MN-14 sin modificar.
Experimentos de direccionamiento in vivo en ratones lampiños GW39 con tumor utilizando SAv-MN14-IgG marcado con I-125 y MN-14-IgG sin modificar marcado con I-125 mostraron direccionamiento similar y modelos de eliminación como se muestra en la Tabla 1 a continuación.
TABLA 1 Biodistribuciones de I-131-MN14 (A) y de I-125-[SAv-MN14] (B) en ratones lampiños GW39 con tumor (% ID/g, n=5)
Tejido 24 h 72 h 168 h
Tumor GW39: \hskip0,45cm A 15,37 \pm 6,34 19,71 \pm 6,22 95,77 \pm 46,4
B 12,18 \pm 4,74 12,52 \pm 3,19 57,91 \pm 29,0
Hígado: \hskip1,4cm A 3,79 \pm 0,70 2,74 \pm 0,41 1,46 \pm 0,36
B 4,49 \pm 0,30 3,78 \pm 0,53 1,80 \pm 0,26
Bazo: \hskip1,7cm A 3,20 \pm 0,89 2,67 \pm 0,46 1,25 \pm 0,43
B 2,31 \pm 0,62 2,86 \pm 0,48 1,68 \pm 0,21
Riñón de L.: \hskip0,8cm A 4,93 \pm 1,14 2,56 \pm 0,42 1,39 \pm 0,54
B 3,43 \pm 1,34 1,78 \pm 0,20 1,31 \pm 0,16
Pulmones: \hskip1cm A 7,34 \pm 0,43 4,10 \pm 0,92 2,64 \pm 0,83
B 5,34 \pm 0,71 2,15 \pm 0,19 1,43 \pm 0,04
Sangre: \hskip1,4cm A 14,00 \pm 0,81 9,97 \pm 1,44 5,22 \pm 1,51
B 11,39 \pm 0,88 7,56 \pm 0,88 2,82 \pm 0,82
El conjugado de MN14-estreptavidina preparado y purificado por el procedimiento descrito anteriormente es un conjugado preferido para utilizar en la primera etapa de direccionamiento previo de la presente invención.
Preparación del agente de eliminación galactosidil-HSA-biotina
Se biotiniliza HSA utilizando sulfosuccinimido biotina disponible en el comercio en tampón de fosfato a pH
7,5-8,0. Se hace reaccionar cianometil 2,3,4,6-tetra- O-acetil-1-tio-\beta-D-galactopiranosido con metóxido de sodio 0,1 M al 10% v/v en metanol para generar el derivado del tioimidato galactosil aminorreactivo. Stowell et al., Adv. Carbohydr. Chem. Biochem., 37: 225-81 (1980). El HSA biotinilado, tamponado a pH 7,5-9,0 se incuba con varias cantidades en exceso molar del tioimidato y el anticuerpo glucosilado se purifica por cromatografía de permeación sobre gel.
El alcance de la glucosilación se mide indirectamente determinando los grupos amino disponibles en HSA antes y después de la glucosilación. Esto implica la reacción con la fluorescamina y la determinación de la intensidad de la fluorescencia en un fluorómetro. Stocks et al., Analyt. Biochem., 154: 232-34 (1984).
Las cantidades de biotinilación y galactosilación de la albúmina del suero humano necesarias para acomplejar
SAv-MN14 circulante sin acomplejar el conjugado localizado en el tumor y para eliminar rápidamente de la circulación se pueden optimizar preparando diferentes conjugados que difieren en las relaciones de sustitución de galactosa y biotina y comparando la eliminación.
Este conjugado de galactosa-HSA sirve como agente de eliminación en los procedimientos de la presente invención.
Preparación de un compuesto de biotina-dextrano-boro 1. Preparación de un conjugado de sulfhidrilborano-dextrano (compuesto 3 en el Esquema I)
El dextrano de peso molecular 70.000 se bora con borocaptato utilizando un procedimiento publicado de 2 etapas. Holmberg et al., Bioconjugate Chem., 4: 570-73 (1993). Este procedimiento sencillo implica la alilación de los grupos hidroxilo del dextrano, seguido de una adición tipo radical libre del borocaptato. Se ha observado que este procedimiento incorpora estructuras de 100 a 125 átomos de boro, o de 1200 a 1500, por cadena de dextrano. El producto obtenido por este procedimiento es soluble en agua. Según Holmberg et al., supra, se alilaron el 70% de los hidroxilos y una eficacia del 50% en la boración del alil dextrano produjo el conjugado con un contenido de boro de 150 \mug boro/mg y un contenido de azufre del 1,5 al 4%. Éste corresponde a estructuras de boro de 100 a 120 átomos de boro, o de 1200 a 1500, por cadena de dextrano.
En particular, el dextrano (2 g, 70 kD) se aliló en solución acuosa con 29 mmol de bromuro de alilo en presencia de 12,5 mmol de hidróxido de sodio durante 2 h a 60ºC. Después de este periodo se acidificó la mezcla de reacción, se precipitó repetidamente en acetona, se lavó varias veces con etanol y por último se dializó. El producto intermedio se hizo básico a continuación con 40 mmol de hidróxido de sodio y se hizo reaccionar con 2,8 g de ácido
6-bromohexanoico a 70-80ºC durante 5 h. Se enfrió la solución, se acidificó y se purificó por diálisis.
El dextrano doblemente derivado se bora por reacción de los grupos alil dextrano con borocaptato de sodio ("BSH" ó Na_{2}B_{12}H_{11}SH; undecahidro-mercapto- closo-dodecacarborato de sodio; Boron Biologicals, Raleigh, NC). En resumen se hizo reaccionar alil dextrano (20 mg) con 30 mg de borocaptato de sodio y 20 mg de persulfato de amonio en 
\hbox{2 ml}
de agua durante 3 h a 50ºC. El producto intermedio se purifica por cromatografía en columna PD-10 y por diálisis repetida frente a agua.
El contenido de boro del conjugado de sulfhidrilborano-dextrano se determina utilizando espectroscopía de emisión atómica ICP, así como el contenido de azufre. El análisis de azufre indicó la presencia de estructuras de boro de 124,3 mientras que el microanálisis para el contenido de boro proporciona una figura de estructuras de boro de 137 (1644 átomos de boro) por mol de dextrano. Las determinaciones de boro de muestras no biológicas se pueden realizar mediante productos comerciales (Galbraith Laboratories).
El dextrano-70 borado derivado con ácido carboxílico (12,5 mg) se trató con 1-etil-3-(3-dimetilamino-propil) carbodiimida (12,5 mg) y un exceso de cincuenta veces de etilendiamina a pH 5,3 durante 4 h a temperatura ambiente. Se retiraron los reactivos en exceso del polímero intermedio por filtración repetida a través de una membrana 
\hbox{Centricon-30}
y el intermedio purificado se intercambió con tampón en un tampón de fosfato 0,1 M a pH 7,7. Este material se hizo reaccionar con un exceso molar de quince veces de sulfosuccinimido biotina durante una hora y por último se purificó utilizando una membrana Centricon-30. El análisis HABA indicó que el dextrano-70 borado y biotinilado contenía aproximadamente dos grupos de biotina por unidad de polímero.
Mientras que en este ejemplo se utiliza dextrano con peso molecular 70 KD, en la farmacocinética in vivo del dextrano borado puede ser preferible la utilización del dextrano con mayor o menor peso molecular.
2. Carboxialquilación del conjugado de sulfhidrilborano-dextrano
Para reaccionar con un análogo de biotina que contiene amina, el conjugado de dextrano se deriva en primer lugar con átomo 6-bromohexanoico para introducir los grupos de ácido carboxílico necesarios. La carboxilación y la reacción de alilación descritas anteriormente son químicamente el mismo tipo de reacción de alquilación. Estas dos reacciones se pueden combinar en una operación reaccionando en primer lugar con dextrano, en condiciones básicas, con bromuro de alilo y a continuación reaccionando con ácido bromohexanoico. Una operación conjunta similar se ha descrito para la conjugación de mitomicina con un anticuerpo utilizando dextrano como vehículo intermedio. Noguchi et al., Bioconj. Chem., 3: 132-37 (1992).
El orden de alquilación se diseña para limitar la cantidad de grupos de ácido carboxílico introducidos con el fin de conseguir una relación biotina-dextrano de aproximadamente uno en la próxima etapa. El alcance de la carboxialquilación se determina por valoración con metóxido de sodio. Cualquier reducción ligera en el número de átomos de boro introducida como resultado de esta "doble derivación" no debería ser demasiado inquietante debido al gran número de átomos de boro que se pueden cargar por este procedimiento, y debido a la ampliación de 4 veces de la localización del boro por mol del conjugado de SAv-IgG localizado en las zonas tumorales.
3. Biotinilación de silfhidrilborano-dextrano (Esquema 1)
Una forma de realización preferida de la presente invención utiliza un análogo de biotina especialmente diseñado que contiene amina (compuesto 7 del Esquema 1). Este compuesto tiene un brazo intercalador entre el grupo biotina y el terminal amina y tiene una sustitución de N-metil en el enlace péptido de la biotina. Por otra parte, se puede utilizar un análogo de biotina resistente a la biotinidasa que comprende una biotina unida por el péptido a un
D-aminoácido no natural y que termina además en un grupo amino para conjugación al borocaptato de dextrano sustituido en el carboxilo. Estas propiedades del enlace específico biotina-péptido evitan o minimizan el reconocimiento por las biotinidasas del suero y los compuestos son por lo tanto más estables. Evangelatos et al., Analyt. Biochem., 196: 385-89 (1991).
El agente de biotinilación que contiene amina se condensa con silfhidrilborano-dextrano carboxialquilado utilizando carbodiimida soluble en agua ("EDC") y N-hidroxi-sulfosuccinimida a un pH de aproximadamente 6 a temperatura ambiente. La estructura del producto final del requisito se muestra como compuesto 4 en el Esquema 1.
El alcance de la formación de la amida se puede controlar variando el exceso molar de la amina utilizada. Noguchi et al., supra. Tal manipulación se puede utilizar para controlar la cantidad de biotina introducida, con el objetivo de introducir una media de aproximadamente 1 grupo de biotina por cadena de dextrano. Las relaciones molares de sustitución finales proceden de las determinaciones de las relaciones biotina- dextrano y boro-dextrano y de la unión a concentraciones conocidas de estreptavidina.
II. Experimentos en animales
Para experimentos en animales se utilizó el modelo de ratón lampiño con xenotrasplante de tumor en las células LS174T. Tom et al., In-Vitro, 12: 180-91 (1976). Se cultivan células de tumor en un cultivo celular antes de la inyección subcutánea e intramuscular de 5x10^{6} células en el ratón lampiño. Se extraen tumores de 10 a 14 días para desarrollar hasta un tamaño útil (50 a 100 mg), en cuyo momento los animales están listos para su utilización.
Se utilizan 10 \muCi/ratón de conjugado de anticuerpo radioyodado o de sulfhidril-borano biotinilado. Se utilizan grupos de cinco ratones para determinar las biodistribuciones en cada punto de tiempo en estudios farmacocinéticos que implican las dos primeras etapas del direccionamiento previo, la administración del conjugado de 
\hbox{estreptavidina-MAb}
y la etapa de eliminación.
Para las biodistribuciones que utilizan animales utilizados sucesivamente en las tres etapas, incluyendo la tercera etapa de administración de boro, se examinan hasta 10 ratones por punto de tiempo. De éstos, algunos (3 a 5) se utilizan exclusivamente para la determinación de las biodistribuciones del boro. A estos ratones codificados se les administró solamente SAv-MN14 frío y biotin-dextrano-(boro)_{x}, aunque con idénticas dosis de proteína y de dextrano, pero sometidos por otra parte a idénticas condiciones experimentales, como ratones lampiños que serán examinados con compuestos radioyodados.
La dosis de proteína del reactivo de la primera etapa (I-131-MN14-SAv) necesaria para saturar las células del tumor y el periodo de acumulación máxima en el tumor a esta dosis de conjugado se determina administrando 10, 50, 100 y 250 \mug de conjugado (utilizando conjugado adicional sin marcar según se necesite) para cuatro grupos de ratones con tumores y determinando las biodistribuciones a los 1, 2, 3 y 5 días para cada grupo de cinco ratones.
Se evalúa la inmunorreactividad de SAv-MN14 marcado con I-131 acomplejando con un exceso de 80 veces de antígeno CEA (Scripps Clinic, La Jolla, CA) y analizando el cambio de retención de HPLC hasta casi el volumen hueco de la columna. También se pueden realizar análisis de rutina de unión competitiva in vitro con las preparaciones SAv-MN14. La eliminación del conjugado de SAv-MN14 en circulación se evalúa utilizando el conjugado de biotina-HSA-galactosa descrito anteriormente. Esto se realiza administrando un segundo MAb marcado con I-125 a 3 grupos de ratones (5/grupo) que llevan ya I-131-SAv/MN14 en el momento de la absorción máxima del tumor. Se determinan las biodistribuciones de ambos marcadores a las 2, 4 y 24 horas después de la inyección del segundo MAb.
Tom et al., In-vitro, supra, describe un procedimiento para radioyodaciones con isótopos I-131 y I-125 utilizando un procedimiento con cloramina T. Una radioyodación típica es la siguiente: fosfato de sodio 0,5 M (50 \mul) a pH 7,4, anticuerpo (51 \mug/0,85 mCi de yoduro) y cloramina T (4,25 \mug) se añaden al vial que contiene yoduro radioactivo. Después de aproximadamente 1 hora, se añade metabisulfito de sodio (8,5 \mug en 50 \mul de agua) y el producto marcado se purifica pasándolo a través de una columna PD-10 (Pharmacia). La recuperación de radioactividad es aproximadamente del 70%. Este procedimiento puede no ser preferido, sin embargo, para la radioyodación de los conjugados de estreptavidina-mab, debido a la inestabilidad oxidativa de la estreptavidina a causa de los residuos de triptófano en su campo de unión a la biotina.
Se prefiere el siguiente procedimiento: [I-125]-N-succinimidil-4- yodobenzoato (1,7 mCi, NEN DuPont) se seca en una corriente de aire durante 40 minutos para eliminar el disolvente orgánico y se trata con 200 \mug de estreptavidina-MAb en 500 \mul de tampón de borato 0,5 M, a pH 9,5. La reacción se deja que proceda durante 1 h a temperatura ambiente, en cuyo tiempo la reacción se enfría bruscamente mediante la adición de glicina 1 M, a pH 8,5 y la mezcla de reacción se deja reposar durante una hora adicional. El producto SA- mab radioyodado se purifica en una columna PD-10 equilibrada en HSA al 1% en PBS a pH 7,0. Se obtiene un rendimiento radioquímico de aproximadamente el 55%.
Se realizan determinaciones similares para evaluar la eliminación con otros agentes de eliminación, tal como con un anticuerpo antiidiotípico.
Para los experimentos en animales que implican la tercera etapa, etapa de administración del boro, el agente de eliminación de la segunda etapa no está radiomarcado. En cambio, el modelo de eliminación del primer anticuerpo se controla utilizando su propio marcador. Para el análisis de la tercera etapa, el destino del marcador I-125 unido al anticuerpo e I-131, unido ahora a estructuras de boro, se determina en experimentos farmacocinéticos in vivo.
Existen numerosos ejemplos para la yodación de compuestos borados utilizando diferentes procedimiento. Varadarajan et al., Bioconj. Chem., 2: 102-110 (1991). El material se purifica en una columna PD-10 disponible y la pureza se evalúa en una columna analítica de permeación sobre gel Biosep-SEC-S4000 (Phenomenex, Torrance, CA) que es adecuada para análisis de dextranos (agua como fase móvil). Se emplea la identificación por el índice radioactivo así como de refracción. Si la pureza evaluada es menor del 90%, se consigue la eliminación de las posibles impurezas de radioyodo más pequeñas mediante el microconcentrador Centricon 30 (Amicon, Danvers, MA).
Se realizan determinaciones cuantitativas para caracterizar el compuesto dextrano-boro biotinilado y para determinar la acumulación in vivo de boro en el tumor a diferentes tiempos después de la administración del compuesto de boro en experimentos en animales. La determinación del boro se realiza en el tejido animal utilizando el procedimiento rápido que es sensible para determinar los niveles sub-ppm de boro. Fairchild et al., Cancer Res., 50: 4860-4865 (1990).
Eficacia de un procedimiento de direccionamiento previo en tres etapas
Se utilizó el conjugado de SAv-MN14 descrito anteriormente para las determinaciones de biodistribución in vivo en ratones lampiños con xenotrasplantes de carcinoma de colon humano. La segunda etapa que implica la eliminación del conjugado en circulación se realizó utilizando el segundo anticuerpo antiidiotípico galactosilado o un complejo de galactosa-HSA-biotina. Para la tercera etapa se utilizó un compuesto de biotina marcado con In-111 que comprende la propiedad estructural resistente a la biotinidasa, descrita anteriormente. Se obtuvieron excelente relaciones tumor a ausencia de tumor para biodistribuciones de In-111, como se observa en la Tabla 2. La Tabla 2 refleja el hecho de que casi todos los conjugados se han eliminado de la circulación utilizando el agente de eliminación de la segunda etapa.
TABLA 2
Biodistribuciones del compuesto de biotina marcado con In-111 en ratones lampiños con GW39 (% ID/g, n=3) después del direccionamiento previo con SAv-MN14, eliminación del conjugado en circulación con un agente de eliminación de galactosa-HSA-biotina y la administración del compuesto de biotina de la tercera etapa. La eliminación del agente de la primera etapa de la circulación se pone en evidencia mediante el conjugado no acomplejable en sangre. Bajos niveles en los órganos normales reflejan la ausencia de zonas de reconocimiento de biotina del conjugado.
Tejido 4 h 24 h 96 h
Tumor GW39 3,13 \pm 2,84 8,40 \pm 5,33 6,30 \pm 1,51
Hígado 0,22 \pm 0,07 0,33 \pm 0,01 0,21 \pm 0,11
Bazo 0,20 \pm 0,08 0,19 \pm 0,06 0,33 \pm 0,14
Riñón de L 1,61 \pm 0,80 0,93 \pm 0,21 0,85 \pm 0,18
Pulmones 0,30 \pm 0,11 0,20 \pm 0,12 0,08 \pm 0,03
Sangre 0,60 \pm 0,24 0,37 \pm 0,32 0,05 \pm 0,03
Un compuesto de la tercera etapa que incorpora un grupo dextrano- borocaptato como el descrito anteriormente consigue similares relaciones tumor: ausencia de tumor a las presentadas por este compuesto no borado.
III. Procedimientos para dirigir átomos de boro a células tumorales
El siguiente ejemplo ilustra un procedimiento de direccionamiento previo en dos etapas según la presente invención. Las dos etapas son las siguientes:
Etapa 1: El conjugado de SAv-MN14 descrito anteriormente se administra a un paciente de cáncer y se deja que se localice en las zonas tumorales.
Etapa 2: Se administra el compuesto dextrano-borocaptato biotinilado descrito anteriormente y se localiza en las zonas tumorales debido a la afinidad entre los grupos de biotina en el compuesto y los grupos de estreptavidina localizados en la zona del tumor en la etapa 1.
Una vez el boro se ha localizado en la zona del tumor, se puede irradiar según los procedimientos BNCT convencionales para efectuar la terapia de las células del tumor.
El ejemplo siguiente ilustra un procedimiento de direccionamiento previo en tres etapas según la presente invención. Las tres etapas son las siguientes:
Etapa 1: Se administra el conjugado de SAv-MN14 descrito anteriormente a un paciente de cáncer y se deja que se localice en las zonas tumorales.
Etapa 2: Se elimina el conjugado en circulación utilizando el compuesto galactosa-HSA-biotina descrito anteriormente. El acomplejamiento de biotina-SAv producirá una rápida eliminación del complejo asociado a la galactosa (gal-HSA-biotina-SAv-MN14), de la circulación, por los receptores de asialoglucoproteína en el hígado. Ong et al., Cancer Res., 51: 619-26 (1991).
Como alternativa, se puede utilizar un anticuerpo antiidiotípico galactosilado como agente de eliminación.
Etapa 3: Se administra el compuesto dextrano-borocaptato biotinilado descrito anteriormente y se localiza en las zonas tumorales debido a la afinidad entre los grupos de biotina en el compuesto y los grupos de estreptavidina localizados en la zona del tumor en la etapa 1.
Una vez el boro se ha localizado en la zona del tumor, se puede irradiar según los procedimientos BNCT convencionales.
El ejemplo siguiente ilustra un procedimiento preferido según la presente invención. El procedimiento comprende:
1.
Administrar el conjugado de SAv-MN14 descrito anteriormente y dejar que el conjugado se localice en la zonas del tumor.
2.
Administrar un agente de eliminación, tal como el complejo galactosa-HSA-biotina descrito anteriormente o un anticuerpo antiidiotípico, para eliminar el conjugado no localizado de la circulación.
3.
Administrar un compuesto de dextrano-borocaptato biotinilado que está marcado con un marcador detectable y dejar que este compuesto se localice en las zonas del tumor debido a la afinidad entre los grupos de biotina en el compuesto y los grupos de estreptavidina localizados en la zona del tumor en la primera etapa.
4.
Detectar el marcador identificable en el compuesto de dextrano-borocaptato biotinilado para asegurarse que el compuesto que contiene boro se ha localizado en las células del tumor y que el compuesto no localizado que contiene boro se elimina de la circulación.
5.
Irradiar los átomos de boro localizados en la zona del tumor, efectuando de este modo la BNCT de las células del tumor.

Claims (15)

1. Kit para dirigir átomos de boro a las células del tumor en un paciente, que comprende en recipientes independientes:
(a)
una preparación inyectable, estéril de una composición de direccionamiento que comprende (i) un primer elemento de un par de unión específico y (ii) un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo con unión al antígeno, en el que dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une selectivamente a un antígeno producido por o asociado a las células del tumor y presente en las células del tumor; y
(b)
un compuesto de boro que comprende un conjugado que comprende (i) un elemento complementario del par de unión específico y (ii) átomos de boro.
2. Kit según la reivindicación 1, que comprende además en un recipiente independiente una composición de eliminación.
3. Kit según la reivindicación 1, caracterizado porque los elementos del par de unión específico se seleccionan de entre el grupo constituido por un oligonucleótido de una sola cadena, un oligonucleótido de doble cadena, un agente intercalador, un enzima, un substrato de enzima, avidina, estreptavidina y biotina.
4. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la biotina se proporciona como análogo de biotina resistente a la biotinidasa que comprende un grupo de biotina unido a un D-aminoácido no natural mediante un enlace péptido.
5. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo monoclonal anti-CEA de tipo III o un fragmento de unión al antígeno del mismo.
6. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la composición de eliminación comprende uno o más de los conjugados galactosilados de albúmina de suero humano (HSA) y biotina, un anticuerpo antiidiotípico y un anticuerpo galactosilado antiidiotípico.
7. Composición de boro inyectable y estéril para su utilización en el hombre que comprende una composición para su utilización en átomos de boro para direccionamiento a células tumorales, que comprende un compuesto de átomo de boro que comprende un conjugado de
(i)
un elemento de un par de unión específico, seleccionado de entre el grupo constituido por un oligonucleótido de una sola cadena, un oligonucleótido de doble cadena, un enzima, un substrato de enzima, avidina, y biotina, en el que la biotina se suministra como análogo de biotina resistente a la biotinidasa que se compone de un grupo de biotina unido a un D-aminoácido no natural mediante un enlace péptido; y
(ii)
átomos de boro.
8. Compuesto de boro según la reivindicación 7, que comprende un conjugado del elemento del par de unión específico y dextrano, derivado con 1.200 a 1.500 átomos de boro.
9. Compuesto de boro según la reivindicación 8, en el que el dextrano está derivado con borocaptato de sodio (Na_{2}B_{12}H_{11}SH).
10. Compuesto de boro según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que el compuesto de boro está radiomarcado con un marcador detectable.
11. Compuesto de boro según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que el elemento del par de unión específico en el conjugado es la biotina y el compuesto de boro comprende de 1 a 3 moléculas de biotina por molécula del compuesto.
12. Utilización de un compuesto de boro según la reivindicación 4, 7, 8, 9, 10 u 11 para la preparación de una composición para dirigir átomos de boro a las células del tumor en un paciente, en la que
(i)
el compuesto de boro se dirige previamente a las células del tumor administrando una composición de direccionamiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y permitiendo que la composición se localice en las células del tumor; y
(ii)
en la que se permite que el compuesto de boro sea localizado en las células del tumor.
13. Utilización de un compuesto de boro según la reivindicación 4, 7, 8, 9, 10 u 11 para la preparación de una composición para efectuar la terapia por captura de neutrones de boro (BNCT) de las células tumorales en un paciente, en la que:
(i)
el compuesto de boro se dirige previamente a las células del tumor
(a)
administrando una composición de direccionamiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y permitiendo que la composición se localice en las células del tumor; y
(ii)
se permite que el compuesto de boro sea localizado en las células del tumor; y
(iii)
los átomos de boro del compuesto de boro localizado en las células del tumor se irradian para efectuar la BNCT de las células del tumor.
14. Utilización según la reivindicación 12 ó la reivindicación 13, en la que el compuesto de boro comprende un radiomarcador y la localización del compuesto de boro se determina detectando el radiomarcador.
15. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, caracterizada además porque se administra una composición de eliminación según la reivindicación 6 después de dejar que la composición de direccionamiento se localice en las células del tumor.
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