JP2000516217A

JP2000516217A - プレターゲッティング方法を使用したホウ素中性子捕獲治療法

Info

Publication number: JP2000516217A
Application number: JP10508883A
Authority: JP
Inventors: グリフィス，ゲイリー・エル; ゴヴィンダン，セレングラム・ヴイ
Original assignee: イムノメディクス，インコーポレイテッド
Priority date: 1996-07-26
Filing date: 1997-07-23
Publication date: 2000-12-05
Also published as: DE69722937D1; DE69722937T2; AU3732397A; WO1998004917A1; DK0920623T3; PT920623E; US5846741A; ES2201309T3; EP0920623A4; EP0920623A1; ATE243319T1; AU732510B2; CA2261791A1; EP0920623B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ホウ素原子を、患者の腫瘍細胞にターゲッティングする方法を提供する。その方法は、（Ａ）腫瘍細胞によって産生されるか、腫瘍細胞に関連した抗原に選択的に結合し、その接合体をその腫瘍細胞に局在化させる、結合対の第一の構成物と抗体の接合体を含むターゲッティング組成物を患者に投与するステップと、（Ｂ）所望により、クリアリング組成物を投与し、クリアリング組成物に循環する血液から非局在化接合体を除去させるステップと、（Ｃ）上記結合対の相補的な構成物およびホウ素原子を含む接合体を含むホウ素含有化合物を投与し、その化合物を腫瘍細胞に局在化させるステップとを含む。その方法は、さらにホウ素化合物のホウ素原子を照射し、それにより腫瘍細胞のＢＮＣＴを有効にするステップを包含しうる。その方法を行うための組成物およびキットも提供される。

Description

【発明の詳細な説明】プレターゲッティング方法を使用したホウ素中性子捕獲治療法この発明は、１９９２年８月２１日に提出された米国特許第５，５２５，３３８号、および１９９５年６月１日に提出された米国出願番号第０８／４５６，３９３号および１９９５年６月７日（係属中）に提出された第０８／４８６，１６６号（係属中）の米国特許法第１２０条下の優先権の利益を主張する。これらの出願およびここに引用される全ての文書は、それらの全体について引用することにより本明細書の一部をなすものとする。発明の背景技術分野本発明は、ホウ素中性子捕獲治療法（boron neutron capture therapy:ＢＮＣＴ）を有効にするためにホウ素原子を腫瘍細胞にターゲッティングさせる改善法に関する。ＢＮＣＴは、腫瘍局在化ホウ素１０原子の中性子照射によって腫瘍細胞にイオン化放射線を送達するように設計された二元系である。本発明では、例えばストレプトアビジンと接合された例えば、癌胎児性抗原特異的モノクローナル抗体（ＭＡｂ）で、癌細胞をプレターゲッティングする。その後、癌部位に局在化されるストレプトアビジンに結合する、例えばビオチンに接合したホウ素含有化合物を、投与する。その後、局在化ホウ素に放射線を照射し、それにより腫瘍細胞の治療を行う。従来の技術ホウ素中性子捕獲治療法ホウ素中性子捕獲治療法（ＢＮＣＴ）は、安定なアイソトープＢ−１０（１９．８％の割合で天然に豊富に存在するボロンの原子量１０のアイソトープ）を熱中性子で照射して、アルファ粒子およびＬｉ−７核を生成するときに起こる核反応に基づく。これらの粒子は、約１個の細胞の直径の経路長（path length）を示し、それにより高度の線形性を有するエネルギー転移を生じる。この核反応で生じたほんの少量のショートレンジの１．７ＭｅＶアルファ粒子は、細胞核を標的にし、それを破壊するのに充分である。Barth et al.，Cancer，70:2995-3007(1 992)。十分な効果（数）の熱中性子と、悪性細胞の周囲またはその範囲内に局在化した臨界量のＢ−１０とがある場合のみに、¹⁰Ｂ（ｎ、α）⁷Ｌｉ反応が生じ、それにより重要な生物学的効果が生じるため、生じる放射線は局在化したものである。Ｂ−１０の中性子捕獲断面積は、捕獲反応を生じ、組織内に見られる窒素と水素のもつ値を遥かに越え（相対的に言って、Ｎ−１４について１なら、Ｈ −１については５．３、Ｂ−１０については１１５６０），いったんＢ−１０の高い濃度差が正常細胞と悪性細胞の間に形成されれば、悪性のみが中性子照射の影響を受けることになる。これが、ホウ素中性子捕獲治療法についての科学的基礎である。Barthらの上述の文献;Barth et al.，Cancer Res.，50:1061-70(1990 );Perks et al.，Brit．J．Radiol.，61:1115-26(1988)。ＢＮＣＴのための中性子源は原子炉である。脳腫瘍を治療する初期の実験に使用された０．０２３ｅＶの範囲のエネルギーを有する熱中性子ビームは、組織によって容易に減衰を受け、ほどんど浸透しない。中性子の中間体のエネルギー（エピサーマル中性子または熱外中性子、１〜１０，０００ｅＶのエネルギー）に関する最近の進歩により、米国および欧州において計画された臨床治験でのその用途が一致を見るようになってきた。Alam et al.，J．Med．Chem.，32:2326-30 (1989)。０．７５ＭｅＶのエネルギーを有する高速中性子は、ＢＮＣＴにはほとんど使用できない。当初の計算では、腫瘍の１グラム当たり３５〜５０μｇ、または腫瘍細胞当たり１０⁹個のＢ−１０原子というホウ素濃度が、１０¹²〜１０¹³ｎ．ｃｍ³の熱中性子効果を示す、細胞殺傷核反応を維持するのに必要であると予測された。Fair child et al.，Int．J．Radiat．Oncol．Biol．Phys.，11:831(1985)。これらの計算は、非特異的ホウ素化化合物で見られる通り、均質に分配されるホウ素に基づいている。抗体基礎のホウ素剤については、腫瘍細胞にある全ての表層抗原の飽和を保証して、このレベルのホウ素の必要性が、抗体分子当たり約１０００原子であると解釈される。しかし、さらに最近のモンテカルロ計算法では、非内在性抗体に関して、ホウ素負荷は、ＭＡｂ分子当たり３００原子と同じくらい低い可能性があるという分析に至った。Kalend et al.，Med．Phys.，18:662(1991); Zamenhof et al.，J．Nat'I Cancer Inst.，84:1290-91(1992)。これは、以下の比率に基づく。０．５の核対細胞の容量比、１０μｍの有効な細胞直径を示す腫瘍細胞については、細胞表面でＢ−１０の分裂が３回あると、核内に少なくとも１つの重い粒子の軌跡を生じる。細胞表面に抗原部位を飽和させることを保証するのに、これらの条件下で、抗体分子当たり３００原子が、腫瘍細胞表面での約３回の分裂反応をさせるのに十分であることが推定された。本発明には、随伴したこれらの先行方法より単位ＭＡｂ当たり２０倍多い数のホウ素原子を付着できる方法が記述される。歴史的に、腫瘍特異的物質がほとんど未知である時に、ＢＮＣＴが神経芽細胞腫（胎児形態の脳腫瘍）および他の脳腫瘍の治療に最初に使用された。Hatanaka et al.，「腫瘍のためのホウ素中性子捕獲治療法」(Boron Neutron Capture Th erapy For Tumors)，349-78（Nishimura Co.，1986）中。使用された最初のホウ素化化合物の１つである、ナトリウムボロカプテートすなわちＢＳＨ（Ｎａ₂，Ｂ₁₂Ｈ₁₁ＳＨ）と称されるスルフィジリル含有ホウ素物質は、脳に局在化する血液と脳の間のバリアーを越えた。これが脳腫瘍の中性子捕獲治療法の解剖学的基礎となった。日本、米国および欧州で、神経芽細胞腫の治療についての医療治験が行われてきているか予定されている。Barth et al.，Cancer，上述。上述の無機ホウ素治療法での問題は、ホウ素が、標的および非標的領域の両方に達することであった。したがって、ホウ素が照射された場合、健全な細胞並びに癌性細胞が破壊された。ＢＮＣＴの概念は、他の癌に広げられ、腫瘍を標的とするモノクローナル抗体を含めた、腫瘍に局在する多くの物質が発見された。例えば、ｐ−ボロノフェニルアラニンのようなホウ素化アミノ酸は、黒色腫に蓄積した。癌のＢＮＣＴのための、ＣＥＡのような細胞表層抗原に向けられたホウ素化モノクローナル抗体を使用する潜在力が示されてきた。Ichihashi et al.，J．Invest Dermatol.，78: 215-18(1982);Goldenberg et al.，P.N.A.S.，USA，81:560-63(1984);Mizusawa et al.，P.N.A.S.，USA，79:3011-14(1982);Barth et al.，Hybridoma，5(supp ．1):543-5540(1986);Ranadive et al.，Nucl．Med．Biol.，20:663-68(1993)。しかし、高度にホウ素化された抗体は、動物モデルでインビトロで腫瘍を標的にすることに失敗した。Alam et al.，上述、Barth et al.，Bioconjugate Chem. ，5:58-66(1994)。癌に対するＢＮＣＴの成功は、非標的器官は基本的にホウ素を含まないままで、腫瘍部位に高濃度のホウ素１０を局在化させる方法を必要とする。優先的に、しかし特異的ではなく腫瘍に蓄積する非抗体ホウ素化化合物は、正常な器官に対する損傷は中性子ビームを照射する間に生じうるという結果を伴って、腫瘍対血液および腫瘍対器官比が、理想よりしばしば低いという欠点を有する。抗体の場合、抗体１分子に１０００個のホウ素原子を付ける必要があると考えられたので、ホウ素クラスターの中間体担体として、例えば、ポリリシン、デンドリマーまたはデキストランを用い、様々の高度にホウ素化された抗体が設計されるに至った。Alam et al.，上述、Barth et al.，Bioconjugate Chem.，上述。多くの例で、ある種の抗原結合は、インビドロで維持されることが分かっていたが、これらのホウ素化接合体は、インビボの動物腫瘍モデルで腫瘍にほどんど成長を伴わずに、肝臓に優先的に局在化した。したがって、非癌部位を相対的にホウ素を含まないままで、多量のホウ素原子を腫瘍部位に送達することができる腫瘍細胞にターゲッティングさせる方法の必要性がある。プレターゲッティングインビボの画像作成のためのプレターゲッティングの概念は、Hnatowich et a l.，J．Nucl．Med.，28:1294-1302(1987)によって提唱され、理論的見解から後に試験した。Van Osdol et al.，J．Nucl．Med.，34:1552-64(1993)。プレターゲッティングは、イットリウム９０放射線免疫療法で前治験結果が非常に促進する結果になったことが最近報告された。Axworthy et al.，J．Immunother.，16: 158(1994)。米国出願番号第０７／９３３，９８２号（１９９２年８月２１日提出、１９９５年１２月２８日に特許証発行料金が支払われた、米国特許第５，４８２，６９８号、米国出願番号第０８／４０９，９６０号（１９９５年３月２５日、係属中、および米国出願番号第０８／４８６，１６６号（１９９５年６月７日提出、係属中）にも、種々のプレターゲッティング方法が開示されている。これらの文献の全ての内容は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。治療法は、癌部位での治療剤の非常に完全な増大、並びに納得できる長期の摂取および結合を必要とする。高いバックグラウンドレベルの標的としない抗体は、達成されるべき、高い標的：バックグラウンド比に対する主な障害として長年認識されてきた。この障害を乗り越えるために、Hansen et al.，米国特許第３，９２７，１９３号およびGoldenbergの米国特許第４，３３１，６４７号、第４，３４８，３７６号、第４，３６１，５４４号、第４，４６８，４５７号、第４，４４４，７４４号、第４，４６０，４５９号、第４，４６０，５６１号、第４，６２４，８４６号および第４，８１８，７０９号に記載されるもののような種々の方法が開発されてきた。そしてその全ての開示は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。ビオチン／アビジンアプローチ法を用いたプレターターゲティング方法は、例えばHnatowich et al.，J．Nucl．Med.，28:1294，1987;Oehr et al.，J．Nucl ．Med.，29:728，1988;Klibanov et al.，J．Nucl．Med.，29:1951，1988;Sinit syn et al.，J．Nucl．Med.，30:66，1989;Kalofonos et al.，J．Nucl．Med.， 31:1791，1990;Schechter et al.，Int．J．Cancer，48:167，1991;Paganelli e t al.，Cancer Res.，51:5960，1991;Paganelli et al.，J．Nucl．Med．Commun .，12:211，1991;Stickey et al.，Cancer Res.，51:6650，1991;およびYuan et al.，Cancer Res.，51:3119，1991に記載され、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。これらの方法は、ビオチンまたはアビジンのような結合対の１つの構成物に接合される抗体または抗体フラグメントのような標的タンパク質で、腫瘍または病巣のような標的部位をプレターゲッティングすることを含み、それにより抗体接合体を標的部位に局在させる。その後、放射性アイソトープのような検出または治療剤の接合体、およびアビジンまたはビオチンのような結合対の相補的構成物を投与する。結合対の構成物の間の結合アフィニティーによって、第一の接合体が既に結合している標的部位に第二の接合体を局在化させる。これらの方法の内のいくつかでは、中間的なクリアリングまたは局在化の段階が使用される。この場合に、第一の接合体は、結合対（例えば、ビオチン）の１つの構成物を包含し、クリアリング・局在化剤は、結合対の他の構成物（例えば、アビジン）を包含し、第二の接合体は、第一のものと結合対の同じ構成物（例えばビオチン）を包含する。抗体のような他のクリアリング剤も記載されている。ホウ素原子の高い腫瘍：非腫瘍比を得て、効果的な手段で十分な量のホウ素原子を腫瘍部位に送達する腫瘍細胞にホウ素原子をターゲッティングする方法の必要性がある。このような方法に使用するのに適した組成物が必要とされる。発明の概要したがって、ホウ素１０原子の高い腫瘍：非腫瘍比を維持するという先の問題を克服する、ホウ素原子を腫瘍細胞にターゲッティングし、十分な量のホウ素１０原子を有効に腫瘍部位に送達する方法と、この方法に使用するための組成物を提供することが本発明の目的である。これらのそして本発明の他の目的を達成する上で、本発明の１つの局面にしたがって、ホウ素原子を患者の腫瘍細胞にターゲッティングする方法が提供され、（Ａ）腫瘍細胞によって産生されるか、腫瘍細胞に関係した抗原に選択的に結合する抗体と、ある結合対の第一の構成物との接合体を含むターゲッティング組成物を患者に投与して、その接合体を腫瘍細胞に局在化させるステップと、（Ｂ）所望により（含まれいてもいなくても良い任意の構成要素として）、クリアリング組成物を患者に投与し、クリアリング組成物により血液循環中から非局在化接合体を除去するステップと、（Ｃ）上記結合対の相補的構成物およびホウ素原子を包含する接合体を含むホウ素含有化合物を患者に投与し、該ホウ素含有化合物を腫瘍細胞に局在化させるステップとを含んでなる。その方法は、さらに腫瘍細胞に局在化されたホウ素含有化合物のホウ素原子を照射し、それにより腫瘍細胞のＢＮＣＴを有効にするステップを包含する。この結合対は、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、ポリヌクレオチドの相補的な鎖、または酵素−基質対を含むものであっても良い。結合対がビオチンを含む場合、このビオチンは人工のＤ−アミノ酸にペプチド結合したビオチン部分を包含するビオチニダーゼ耐性ビオチン類似体を含んでもよい。本発明の１つの実施態様で、ホウ素含有化合物は検出可能な標識で放射性標識され、その場合、その方法は、さらにホウ素含有化合物の検出可能な標識を検出し、それにより化合物の配置を決定する段階を包含する。本発明の別の実施態様では、腫瘍細胞に局在したホウ素含有化合物のホウ素原子を、検出可能な標識が検出された後に放射線照射する。本発明のもう１つの側面によれば、ホウ素原子を腫瘍細胞にターゲッティングするのに使用するための組成物を含むヒト用途のための注射可能な滅菌組成物が提供され、結合対の構成物とホウ素原子との接合体を含むビオチン含有化合物を含む。本発明のもう１つの実施態様では、ビオチン含有化合物は、検出可能な標識で放射性標識される。結合対の構成物は、ビオチンまたはアビジンまたはストレプトアビジン、一本鎖のポリヌクレオチド、または酵素または酵素基質を含んでもよい。結合対の構成物がビオチンを包含する場合、ビオチンは人工のＤ−アミノ酸にペプチド結合したビオチン部分を含むビオチニダーゼ耐性ビオチン類似体を包含してもよい。本発明の別の側面によれば、ホウ素原子を患者の腫瘍細胞にターゲッティングする方法での用途に適切なキットが提供され、そのキットは、（Ａ）腫瘍細胞によって産生されるか、または腫瘍細胞に関係した抗原に選択的に結合する抗体と、ある結合対の第一の構成物とを含むターゲッティング組成物の注射可能な、滅菌製剤と、（Ｂ）所望により（含まれていてもいなくても良い任意の構成要素として）、クリアリング組成物と、（Ｃ）結合対の相補的構成物およびホウ素原子を含む接合体を含むホウ素含有化合物とを含んでなるものである。本発明のさらなる目的および利点は、続く説明である程度説明され、その説明から明らかである程度明らかになるか、または本発明の実施例によって学ぶことができる。その目的および利点は、添付の請求項に特に指摘される方法および組成物によって認識することができる。好ましい実施態様の詳細な説明本発明は、例えば、２または３段階のプレターゲッティング手段による抗体およびホウ素送達段階を別に行うことによって抗体を標的とするＢＮＣＴに関する上述の問題を克服する。抗体を標的とするＢＮＣＴの先行方法が、約１５００個のホウ素１０原子を、抗体の単一の分子に付与することに関与する一方で、本発明は、標的抗体にホウ素を付加せず、それにより、ホウ素によるｍＡｂの過置換に関連した問題を排除する。本発明では、アビジンまたはストレプトアビジンのような結合対の１つの構成物に接合した腫瘍抗原選択的モノクローナル抗体で、腫瘍部位をプレターゲッティングすることにより、高濃度のボロンを特異的に腫瘍部位に局在化される。使用する抗体は、腫瘍細胞によって産生されるかまたは腫瘍細胞に関係した抗原に選択的に結合する。選択されたモノクローナル抗体の使用は、腫瘍部位に優先的に、しかし選択的にではなく蓄積し、すでに使用が試みられたホウ素化化合物よりいっそう特異性が高い。抗体−アビジン接合体は、腫瘍部位に局在した後、必要に応じて、クリアリング剤を投与しても、しなくても良い。血液循環中から非局在化された接合体を除去した後、ビオチンのような結合対の相補的構成物とホウ素を包含する接合体を含むホウ素含有化合物が投与される。結合対の構成物の間のアフィニティーは、ホウ素含有化合物を腫瘍部位に局在させ、それにより腫瘍細胞へのホウ素原子の選択的送達を有効にする。ターゲッティングされ、本発明によって処置できる癌の状態としては、癌腫、黒色腫、肉腫、神経芽腫、白血病、リンパ腫、神経膠腫および骨髄腫が挙げられる。プレターゲッティング方法に使用される共通の結合対は、アビジンまたはストレプトアビジンおよびビオチンである。卵白に見られるアビジンは、Ｂ複合体ビタミンであるビオチンに関して非常に高い結合アフィニティーを示す。Wilcheck et al.，Anal．Biochem.，171:1(1988)。ストレプトマイセス・アビジニ（Stre ptomyce savidinii）から誘導されたストレプトアビジン（ＳＡｖ）は、アビジンに類似し、非特異的組織結合が低いことを示し、それによりしばしばアビジンの適所に使用される。アビジンおよびストレプトアビジンの両方は、ビオチンに４価を示し、したがって前者がビオチンに結合する場合に増幅する可能性がある。ストレプトアビジン−ビオチン系は、タンパク質とリガンドの間の最強の非共有結合形の生物学的相互作用（Ｋ_m＝１０¹⁵Ｍ^-1）を表す。RosebroughのJ．Nucl ．Med．Biol.，20:663-68(1993)。したがって、本発明の好ましい実施態様で使用される。ストレプトアビジンは、４つのビオチン認識部位を有する、６０ＫＤの分子量を示す４量体である一方で、ビオチンは小さな有機分子である。ストレプトアビジンは、そのリジン残基で共有結合的に修飾され、抗体に付着されうる。ビオチンは、ホウ素化デキストランを含めた多数の種への付着のためにそのカルボキシル末端で十分に変換できる。強力なストレプトアビジン−ビオチン相互作用は、インビボでの２つの成分が結合することにつながる。ストレプトアビジンは、アビジンについては＞１０であるのに比較して、^-６のｐＩを示すので、アビジンの強力な正の電荷に対比して、生理学的ｐＨでは中性にちかい電荷を有する。さらに、アビジンは、インビボで、インビトロで「粘着性」である。Rosebrough、上述。これらの理由として、ストレプトアビジンは、本発明にしたがって使用される接合体を製造するためにはアビジンであることが好ましい。しかし、アビジンとストレプトアビジンとの両方とも使用でき、以下の説明で使用される場合、アビジンおよびストレプトアビジンの語句は、アビジンとストレプトアビジンとの両方を包含する。脱グリコシル化アビジンおよび／または中和アビジンのようなアビジンの修飾形態も、アビジンまたはストレプトアビジンの組換え形態で可能なように、本発明にしたがって使用できる。本発明は、免疫原性剤を、炭化水素ポリマーまたはポリオール基と結合させることによってアビジンの免疫原性またはターゲッティング組成物の減少がある方法を含む。有用な炭化水素またはポリオール基の例としては、デキストラン、ポリサッカライド、ポリエチレングルコール（ＰＥＧ）等が挙げられる。本発明に関して有用な他のプレターゲッティング方法が、例えば、共に係属中の米国特許出願シリアル番号第０８／４８６，１６６号に記載され、その内容は、全体にここに組込まれる。例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＳｓのようなポリヌクレオチドの合成類似体を含めた相補的ポリヌクレオチドフラグメントの特異的ハイブリダイゼーションは、プレターゲッティング系の認識機構として使用できる。このような方法で、一本鎖のポリヌクレオチドは、結合対の１つの構成物として作用し、相補鎖は、結合対の相補構成物として作用する。Bos et al. ，Cancer Res.，54:3479-3486(1994)も参照。ビオチン／アビジン系を越えるこの系の主要な利点は、６０，０００ダルトンのアビジン種に比較して、推定される低い免疫原性の相対的に短い断片のＤＮＡのでありえる。プレターゲッティングについての別のアプローチ法は、抗体に結合した酵素を投与し、続いて、キレート−アイソトープ複合体に結合された高アフィニティーの酵素阻害剤（酵素に対して特異的な）を投与することを含む。この方法は、抗体の両方の抗原結合部位を保持する先の二元特異的な方法を越える利点、高アフィニティー（Ｋα、ジヒドロホレートリダクターゼ：メソトレキレート−１０^-m ）二次ターゲッティング機構を利用するさらなる利点を示す。酵素および酵素基質の組合せも、プレターゲッティング法で結合対として使用できる。上で記載されたＤＮＡ方法とのように、アビジン／ビオチン系でより少ない抗原性が観察されうる。プレターゲッティングに対するさらに別のアプローチ法は、結合対の１つの構成物として二本鎖ポリヌクレオチドを、結合対の他の構成物として挿入剤を使用することを包含する。例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドを、腫瘍細胞にターゲッティングするための抗体または抗体フラグメントに付着させることができる。その後、ホウ素および適切な挿入剤を包含するホウ素含有化合物を投与し、オリゴヌクレオチドと挿入剤との間のアフィニティーの手段により腫瘍細胞に局在化する。ここで説明される実施例には、結合対としてアビジンおよびビオチンを使用することが記載されている一方で、本発明によれば、アビジンおよびビオチンについて記載される方法でその他の任意の結合対を使用できる。抗体または抗体フラグメントは、腫瘍細胞に対する結合対の第一の構成物をプレターゲッティングするのに使用できる。それらの高い特異性のために、モノクローナル抗体が好まれる。免疫原性抗原標品で哺乳類を免疫化させ、不死の骨髄腫セルラインと免疫リンパまたは脾臓細胞と融合させ、および特異的ハイブリドーマクローンを単離する従来の手段が何であるかをここで考えることによって、それらは十分に製造される。本発明でのそれらの利用性に影響を及ぼす抗体の第一の抗原特異性であるので、超可変領域の種間融合および遺伝子的操作のようなモノクローナル抗体を製造するためのより一般的でない方法は排除されない。例えばヒト・モノクローナル、種間モノクローナル、キメラ（例えばヒト／マウス）モノクローナル、遺伝子的に操作された抗体等のようなモノクローナルの生成のための新しい技術も、利用できるとが理解される。本発明に有用な抗体フラグメントとしては、ハイブリドーマフラグメントを含めた、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆ（ａｂ）₂、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖなどが挙げられる。好ましいフラグメントは、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）₂である。免疫グロブリンの超可変の抗原結合領域を保持し、Ｆａｂ’フラグメントと類似するかまたはより小さいサイズを示す任意のサブフラグメントも有用である。これは、一重鎖かまたは多重鎖のいずれかが、天然の免疫グロブリンフラグメントと実質的に同じ方法で標的伝播体としてインビボで抗原結合部位およびさもなければ官能基を組込む、遺伝子的に操作されたおよび／または組換えタンパク質が含まれる。このような一重鎖結合分子は、米国特許第４，９４６，７７８号に記述され、引用することによい本明細書の一部をなす。Ｆａｂ’抗体フラグメントは、それ自身無傷の免疫グロブリンのペプシン消化によって製造できるＦ（ａｂ’）₂フラグメントを還元的に切断することによって通常に製造できる。Ｆａｂ抗体フラグメントは、還元条件下で無傷の免疫グロブリンのパパイン消化によって、または全免疫グロブリンの慎重なパパイン消化から生じるＦ（ａｂ ’）₂フラグメントを切断することによって製造することができる。そのフラグメントも、遺伝子的に操作することにより製造してもよい。抗体をハイブリッドすることができるように、抗体および免疫グロブリン・クラスの混合物を使用できることに注目すべきである。二元特異的およびハイブリッドを含めた複数特異的な抗体および抗体フラグメントは、本発明の方法で有用であり、少なくとも２つの該抗体または抗体フラグメントが、癌細胞によって産生されたかまたは関連した少なくとも２つの別々の抗原に、または癌細胞によって産生されたかまたは関連したマーカー物質の少なくとも２つの別々のエピトープまたは分子に特異的に結合する、少なくとも２つの別々の実質的に単独特異的な抗体または抗体フラグメントから構成される。二重の特異性を示す複数特異的抗体および抗体フラグメントは、米国特許第４，３６１，５４４号に開示された抗腫瘍マーカーハイブリッド類に類似に製造できる。ハイブリッド抗体を製造するための他の技術は、例えば米国特許第４，４７４，８９３号および第４，４７９，８９５号に、Milstein et al.，Immunol．Today，5:299(1984)に開示される。少なくとも６０％の癌細胞によって産生されるか、または関連したマーカー基質に対して特異的免疫反応性と、３５％より少ない他の抗原または標的とされない物質に対して交差反応性とを示す抗体が好まれる。上で開示される通り、腫瘍抗原に対する抗体が知られている。例えば、癌によって産生されるか、または関連したマーカーを特異的に結合する抗体および抗体フラグメントが、とりわけ、Hansenらの米国特許第３，９２７，１９３号および Goldenbergの米国特許第４，３３１，６４７号、第４，３４８，３７６号、第４，３６１，５４４号、第４，４６８，４５７号、第４，４４４，７４４号、第４，８１８，７０９号、および第４，６２４，８４６号に開示されてきた。特に、抗原に対する抗体、例えば胃腸、肺、胸、前立腺、卵巣、精巣、脳またはリンパの腫瘍、肉腫または黒色腫が有利に使用される。本発明の方法に有用な抗体および抗体フラグメントは、当業界で公知の種々の方法により接合されうる。これらの方法の多くは、上で引用された米国特許および特許出願に開示される。Childs et al.，J．Nuc．Med.，26:293(1985)参照。本発明に使用するために好まれる抗体は、第一世代版ＮＰ−４よりＣＥＡに１０倍以上のアフィニティーを示す第二世代ＣＥＡ−抗体であるＭＮ−１４である。Hansen et al.，Cancer，71:3478-85(1993)。ＭＮ−１４は、プレターゲッティングアプローチ法に適切になりがら、ゆっくりと内在化する。抗体が、好ましいターゲッティング剤である一方で、米国特許出願番号第０８／４８６，１６６号に開示されるもののような他のターゲッティング剤も使用でき、その内容は、それらを全体として引用することにより本明細書の一部をなすものとする。本発明は、ビオチンおよびホウ素原子を包含する接合体を含むホウ素含有化合物をも提供する。ビオチンが、以下にさらに詳細に記載されるビオチニダーゼ耐性ビオチン類似体であるのが好ましい。ビオチンは、すぐにおよそ１，５００個のホウ素原子に結合される中間体担体に付着される。中間体担体は、例えばデキストランでありうる。他の担体分子は、当業者に明らかであり、Shih et al.，米国特許第５，０５７，３１３号のアミノデキストラン、ポリリシン、ポリグルタミン酸およびポリシステインのような他の多糖、天然および合成のポリペプチド、およびポリエチレンイミン、ポリオレフィン、ポリアルコール、ポリカルボン酸およびスターバースト・デンドリマー（starburst dendrimers）のような合成高分子が挙げられる。適切な担体の別の例は、式（Ｌｙｓ）_a−（ａａｘ）_q− （Ｇｌｕ）_m−（ａａｙ）_p（式中、ｎ、ｍ、ｐおよびｑは、整数であり、ａａｘは、互いに同じであっても、異なっていてもよく、天然のアミノ酸およびそれらのＤ−異性体から選択される不特定のアミノ酸である）を示すもののような共重合体である。１つの実施態様では、各デキストラン分子に接合した約１から３個のビオチン部分がある。腫瘍部位にホウ素１０原子を最適に送達するために、平均ビオチン −デキストラン−ホウ素化合物の各分子当たりちようど１個のビオチン部分を示すことが望まれる。アビジンまたはストレプトアビジンの各分子が、４個までのビオチン分子を結合できるので、腫瘍部位に予め局在化された抗体の１モル当たり６０００個までのホウ素の原子が送達されうる。理想的には、ストレプトアビジンの４個のビオチン結合部位の各々には、ビオチン−デキストラン−（ホウ素）_xが付着する。本発明のホウ素含有化合物は、第一のプレターゲッティング段階で使用される抗体分子１個当たりの送達されうるホウ素の量を増幅し、本発明の重要な利点の一つである。本発明したがって、この化合物を利用すると、効果的なＢＮＣＴに要求される腫瘍での高いホウ素濃度に達するかまたは越える。したがって、本発明の組成物および方法は、ＢＮＣＴによる一般の悪性腫瘍の治療のためのホウ素原子を腫瘍部位にターゲッティングするのに有用である。ホウ素含有化合物が、ビオチニル化化合物として上で記載される一方で、本発明は、ホウ素含有化合物が、上で検討された通り、ホウ素原子および、ポリヌクレオチド、酵素または酵素基質のような結合対の任意の構成物を含む接合体を包含する実施態様を含む。好ましい実施態様では、ホウ素含有化合物も、検出可能な標識で放射性標識される。これは、投与されるホウ素含有化合物の所在を決定することを可能にする。適切な放射性標識は、当業者に公知であり、例えばガンマ輻射アイソトープが挙げられる。その化合物は、当業界で公知の方法により標識できる。例えば、ホウ素含有化合物は、放射性標識をキレート化する例えばＤＴＰＡのようなキレート剤、または、米国特許第５，５１４，３６３号に記載されたもののような公知方法を用いてＴｃ−９９ｍによって直接標識するためのチオールリガンドに接合されうる。放射性標識ホウ素含有化合物が使用される場合、放射性標識は、ホウ素が照射される前に検出されて、その化合物が腫瘍細胞に局在化したこと、および非局在化ホウ素が、血液循環から取除かれたことを確かめうる。ホウ素含有化合物が腫瘍細胞に局在化するまで、照射を遅延できるので、この実施態様は、ホウ素が照射されたときに健全な細胞に損傷を与える危険を最小限にする。中性子ビームは、有利に局在化ホウ素１０部分の部位に焦点が合わされて、さらに中性子捕獲の精度を改善する。本発明の好ましい実施態様では、スルフィジリル含有ホウ素部分、ナトリウムボロカプテートまたはＢＳＨ（Ｎａ₂Ｂ₁₂Ｈ₁₁ＳＨ）は、デキストランをホウ素化するのに使用される。これらは、無毒である証拠が提出されている。Barth，C ancer Res.，上述、Haselberger et al.，Cancer Res.，54:6318-20(1994)。これらは、好ましくは、例えば９５〜９８％までのホウ素１０を含めた富化ホウ素１０である。ボロカプレート−デキストラン接合体の製造は、以下の反応図式Ｉに例示される。ホウ素１０富化カルボランのような他のホウ素１０富化化合物も知られる。これらの例は、米国特許第４，８２４，６５９号に記載され、その内容は、その全体を引用することにより本明細書の一部をなすものとする。これらの化合物は、例えば、カルボランを選択された担体に接合させることにより、本発明にしたがって使用できる。本発明の１つの実施態様では、２段階のプレターゲッティングアプローチ法が使用される。本発明の他の実施態様のように、このアプローチ法は、抗体局在化段階を、ホウ素を腫瘍部位に沈着させる段階から分離する。例えば、腫瘍部位は、アビジンまたはストレプトアビジンとＭＡｂの接合体でプレターゲッティングされる。腫瘍ターゲッティングのための時間が経過した後、非抗体、上で記載されたホウ素含有化合物のようなビオチニル化ホウ素含有化合物が投与される。この化合物は、ビオチン部分を介して腫瘍部位に局在化されたアビジンまたはストレプトアビジンに結合し、それによりホウ素原子を腫瘍部位に送達する。ホウ素含有化合物が、抗体を含有しないので、この方法は、ホウ素化抗体のインビボ作用についての懸念を避ける。上で検討されたポリヌクレオチドおよび酵素／酵素基質対のようなビオチンおよびアビジン以外の結合対が使用できる。ビオチニル化ホウ素化合物が、腫瘍部位に局在化した後、ホウ素原子は、従来のＢＮＣＴ方法にしたがって照射され、それにより腫瘍細胞の治療を効果的にできる。本発明のもう１つの実施態様は、抗体接合体送達段階とホウ素送達段階との間の中間段階を使用する。この段階では、循環する抗体を迅速に取除くのを有効にするのに、クリアリング剤が使用され、循環での最終ホウ素濃度が、取るに足らないか、または存在していないままにすることを確実にする。１つの実施態様では、クリアリング剤は、ガラクトース、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびビオチンを包含する接合体を含む。このようなクリアリング剤は、肝臓内のアシアログリコタンパク受容体により、循環系から迅速に取除かれる。もう１つの好ましい実施態様では、クリアリング剤は、米国出願番号第０８／４８６，１６６号に記載される通り、抗イディオタイプ性抗体である。この抗体は、上で記載される通り、ガラクトシル化されて、迅速な除去あるいはクリアリングを達成できる。本発明に使用される組成物の投与の経路としては、静脈内、動脈内、胸膜腔内、腹腔内、鞘内、または還流によることが挙げられる。２または３のプレターゲッティング段階のタイミングは、ホウ素送達の確実性を増大させるのに最適化できる。ストレプトアビジンＭＮ１４の例えば抗体接合体の最大腫瘍摂取の時間は、最適ＳＡｖ用量を最初に測定し、最大腫瘍摂取の時間を測定することにより決定できる。ある試験では、最大腫瘍の成長の時間は、４８時間と７２時間の間であると思われる。最適には、未標識グリコシル化ＨＳＡ−ビオチンまたは抗イディオタイプの抗体のようなクリアリング剤は、この時に投与される。様々なプレターゲッティング方法で、クリアリング剤を、ストレプトアビジン −ＩｇＧ接合体の注射の２４時間後に投与した。Axworthy et al.，国際公開第９３／２５２４０号。この「初期」タイミングは、内生ビオチンによるある種のストレプトアビジン部位の置換を回避できる。Hnatowich et al.，Nucl．Med．C ommun.，15:575-77(1994)。ガラクトース−ＨＳＡ−ビオチン接合体を包含するクリアリング剤は、一次ｍＡｂ−ＳＡｖ接合体を循環する濃度を約５％ＩＤ／ｇに下げる。当初の研究かet al.，本発明者は、抗イディオタイプクリアリング剤を投与する上で、抗体接合体の血液濃度が「ゼロ」時に劇的に低下することを示す。すなわち、実質的に即座に循環する接合体は取除かれる。したがって、ビオチニル化ホウ素含有化合物は、クリアリング段階の時間（２〜４時間）以内に投与されてよく、抗イディオタイプのクリアリング剤が使用されるクリアリング段階直後に投与されてよい。低濃度の循環ホウ素の達成、特に循環ホウ素のほとんど完全なクリアリングの達成は、ホウ素原子が中性子ビームにより照射される時に、観察される全身性毒性を減少させる利点を示す。すなわち、ホウ素が循環にほとんどないか、またはまったくないので、標的腫瘍細胞のみが、中性子ビームによるホウ素原子の照射によって影響される。本発明の１つの実施態様で、抗イディオタイプのクリアリング剤が使用され、ホウ素含有化合物が投与され、ホウ素含有化合物が投与されるすぐ後、例えばホウ素含有化合物が投与された直後に、患者が熱中性子ビームに曝され、それにより標的腫瘍細胞に局在されるホウ素の量が最大である時にホウ素原子を照射する。多様なこの実施態様で、ホウ素含有化合物は、検出可能な標識で標識され、ホウ素原子の照射前に、検出可能な標識が検出される。この後者バージョンは、専門家に、ホウ素が照射される前にホウ素含有化合物が、局在化され、それにより健全な細胞に損傷を与える危険性を最小限にすることを保証する。代替的に、ホウ素含有化合物は、第二段階の２４時間以内、または３日後までに非経口で投与できる。第一段階後遅延が長くなればなるほど、必要とされるクリアリング剤の量（および比）が低くなる。本発明の１つの実施態様で、使用されるクリアリング剤はなく、抗体接合体の投与の約５から約２０日後にホウ素含有化合物を投与する。この実施態様は、例えば、それらが、多量の抗原を発現している重い腫瘍負荷を示すので、迅速な血液クリアリングおよび標的とされる合物の腫瘍成長を示す患者にとって有益である。投与するビオチニル化ホウ素化合物の最適用量は、その化合物により複合化されるべきであるアビジンまたはストレプトアビジンの量の関数、並びにその化合物のインビボのクリアリング速度論の関数である。以下に検討される通り、５倍の点でｂａｌｂ／正常マウスでのＣＩ−１２５−標識ビオチン−デキストラン− （ホウ素）_xの生物分布は、この情報を生む。腫瘍罹患ヌードマウス（第三段階）での二重標識試験は、腫瘍および他の器官にホウ素化材料を組込むことを正確に概説する。Ｉ−１２５標識を、非標識器官から取除くのにどの位の時間がかかるかによって、第三段階のタイミングおよび用量が変えられる。本発明の方法の実施態様で、抗体とアビジンまたは抗体とポリヌクレオチドの接合体のような抗体結合対構成物接合体は、通常１ｇまでの抗体用量で、例えば約５０ｍｇから約５００ｍｇの用量範囲内で、非経口に注射される。これは、単独注射として、または分割用量で投与できる。第一の剤が、抗体フラグメントまたはサブフラグメントのような小さくそして迅速なターゲッティング分子を含む場合、１〜５日後、さらに好ましくは２日未満で、１日未満でさえ、未標識クリアリング剤の用量は、非経口に投与できる。例えば、その用量は、（第二段階の注入の時に血液中で循環する第一の段階から抗体の量を測定することによっても測定できる）第一段階の用量の２．５から１０倍でありうる。クリアリング剤は、単独注射としてまたは分割用量で与えることができ、２用量中のクリアリング剤を投与することが特定の環境では好まれる。その後、ビオチニル化ホウ素化合物のような結合対構成物ホウ素化合物を、上述の通り測定された適切な時間および用量で投与する。例えば、アビジン−ビオチン系が、結合対として使用される場合、ビオチニル化ホウ素の用量は、約２ｍｇから約２ｇでありうる。高用量は、注入アビジン−抗体接合体に対してビオチニル化化合物のおよそ４×モル過剰を示し、予め標的とされたアビジン接合体の全てのビオチン−結合部位の飽和を可能にする。低用量は、ほんの少量のビオチニル化ホウ素化合物が腫瘍部位に達する必要があるという観察に反映される。本発明の実施態様は、さらに本発明の局面を詳細に示す実施例を通してさらに例示できる。これらの実施例は、本発明の特定の要素を例示し、その範囲を限定すると解釈されるべきでない。Ｉ．試薬の製造ストレプトアビジン−ＭＮ−１４Ａｂ接合体の製造および分析：チオール化ＭＮ−１４−ＩｇＧを、マレイミド付随ストレプトアビジンと反応させる。特徴的な最適接合は、ストレプトアビジン誘導について、５倍モル過剰の市販のスルホ−ＳＭＣＣリンカー（４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボン酸スルホスクシニミジル）を、チオール化ＭＮ−１４について５倍モル過剰の２−イミノチオランを、結合については約１：１モル比のタンパク質をｐＨ６．４で使用することを含む。ｐＨ６．８での０．２Ｍリン酸緩衝食塩水を用いてたセファロゲル（Spherogel）ＴＳＫ−Ｇ３０００−ＳＷＧカラム（ペンシルベニア州（ＰＡ，モンゴメリービル（Montgomeryville）のトソハース（Tosohaas））での分取ＨＰＬＣ精製は、未反応出発物質および凝集体から１：１接合体を分離する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥストレプトアビジン−ＩｇＧ接合体の分析は、約２１０Ｋダルトンの分子量を示した。Ｉｎ−１１１−標識ビオチン−（ＩＴＣ−Ｂｚ−ＤＴＰＡ）誘導体を用いて行ったビオチン結合アッセイは、１当量のストレプトアビジン−ＩｇＧ接合体による４当量のビオチン−ＤＴＰＡの摂取を示し、したがって、接合体での接合体純度と４つのビオチン結合ドメインの全ての保護との両方を確立した。ＥＬＩＳＡアッセイを用いたインビトロ拮抗結合研究は、抗原（ＣＥＡ）についての結合アフィニティーが未修飾ＭＮ１４のものと非常に類似することを示した。Ｉ−１２５標識ＳＡｖ−ＭＮ１４−ＩｇＧおよびＩ−１２５標識未修飾ＭＮ１４−ＩｇＣを用いたＧＷ３９腫瘍ヌードマウスでのインビボのターゲッティング実験は、以下の表１に示される通り類似のターゲッティングおよびクリアリングパターンを示した。表１ＧＷ３９腫瘍罹患ヌードマウスでのＩ−１３１−ＭＮ１４（Ａ）とＩ−１２５−［ＳＡｖ−ＭＮ１４］（Ｂ）との生物分布（％ＩＤ／ｇ、ｎ＝５）上述の方法によって製造されそして精製されたＭＮ１４−ストレプトアビジン接合体は、本発明の第一のプレターゲッティング段階に使用される好ましい接合体である。ガラクトシル−ＨＳＡ−ビオチンクリアリング剤の製造：ｐＨ７．５〜８．０で、リン酸緩衝液中の市販のスルホスクシニミドビオチンを用いて、ＨＳＡをビオチニル化する。シアノメチル・２，３，４，６−テトラ −Ｏ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを、メタノール中の１０％ｖ／ｖ０．１Ｍナトリウムメトキシドと反応させて、アミン反応性ガラクトシル・チオイミデート誘導体を生じる。Stowell et al.，Adv．Carbohydr．Chem ．Biochem.，37:225-81(1980)。ｐＨ７．５〜９．０に調整したビオチニル化ＨＳＡを、種々のモル過剰量のチオイミデートとインキュベートし、グリコシル化抗体を、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。グリコシル化の範囲は、グリコシル化の前後にＨＳＡ上で利用できるアミノ基を測定することによって直接測定する。これは、蛍光アミンとの反応、および蛍光光度計での蛍光強度の測定を含む。Stocks et al.，Analyt．Biochem.，154巻、232-34(1984)。腫瘍局在接合体を錯体化することなく、循環ＳＡｖ−ＭＮ１４を錯体化し、循環から迅速に排除するために必要とされるヒト血清アルブミンのビオチニル化およびガラクトシル化のレベルは、ガラクトースおよびビオチン置換比で異なる様々な接合体を製造すること、その排除を比較することによって最適になる。このガラクトース−ＨＳＡ接合体は、本発明の方法でクリアリング剤として有用である。ビオチン−デキストラン−ホウ素化合物の製造１．スルフィジリルボラン−デキストラン接合体の製造（反応図式Ｉ中の化合物３）：７０，０００ＭＷデキストランを、公表された２段階手段を使用してボロカプテートでホウ素化する。Holmberg et al.，Bioconjugate Chem.，4:570-73(1993 )。この簡潔な方法は、デキストランの水酸基のアリル化、続いてボロカプテートの遊離ラジカル型付加を含む。この方法は、デキストラン鎖当たり１００〜１２５個のホウ素ケージ、または１２００〜１５００個のホウ素原子を組込むことが分かっている。この方法によって得られた生成物は、水溶性である。Holmberg et al.，上述にしたがって、７０％の水酸基をアリル化し、アリルデキストランのホウ素化で５０％効率が、１５０μｇホウ素／ｍｇのホウ素含有率、および１．５−４％の硫黄含有率を示す接合体を生じた。これは、デキストラン鎖当たり１００〜１２０のホウ素ケージ、または１２００〜１５００のホウ素原子に対応する。特に、デキストラン（２ｇ、７０ｋＤ）を、２時間、６０℃で、１２．５ミリモルの水酸化ナトリウムの存在下で２９ミリモルの臭化アリルを有する水溶液中でアリル化させた。この時の後、反応混合液を酸性化し、繰返しアセトンから沈殿させ、エタノールで数回洗浄し、最後に透析した。その後、４０ミリモルの水酸化ナトリウムで中間産物を塩基化し、７０〜８０℃で、５時間、２．８ｇの６ −ブロモヘキサン酸と反応させた。溶液を冷却し、酸性化し、透析により精製した。デキストラン・アリル基をナトリウム・ボロカプテート（「ＢＳＨ」またはＮａ₂Ｂ₁₂Ｈ₁₁ＳＨ、ジナトリウム・ウンデカヒドロ−メルカプト−クロソ−ドデカカルボラート、ノースカロライナ州（ＮＣ，ローリー（Raleigh）のボロン・バイオロジカルズ（Boron Biologicals））と反応させることによって、二重に誘導されたデキストランを、ホウ素化させる。簡潔には、アリルデキストラン（２０ｍｇ）を、３時間、５０℃で３０ｍｇのナトリウム・ボロカプテートおよび２０ｍｇの過硫酸アンモニウムと反応させた。ＰＤ−１０カラムクロマトグラフィーにより、繰返し水で透析することにより、中間産物を精製する。スルフィジリルボラン−デキストラン接合体のホウ素含有率を、硫黄含有率からと同様に、ＩＣＰ−原子照射分光学を用いて測定する。硫黄分析は、１２４．３個のホウ素ケージの存在を示した一方で、ホウ素含有率の微量分析は、デキストランのモル当たり１３７個のホウ素ケージ（１６４４個のホウ素原子）の数を示す。非生物学的サンプルのホウ素測定を、化合物の排出口によって行うことができる（ガルブライス・ラボラトリーズ（Galbraith Laboratories））。カルボン酸誘導ホウ素化デキストラン７０（１２．５ｍｇ）を、ｐＨ５．３で、４時間、室温で１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（１２．５ｍｇ）および４０倍過剰のエチレンジアミンで処理した。過剰反応物を、セントリコン（Centricon）−３０の膜を通して繰返し濾過することにより、高分子中間体からクリアリングし、精製中間体を、ｐＨ７．７で０．１Ｍリン酸緩衝液に緩衝液交換した。この材料を、１時間、１５倍のモル過剰のスルホスルシンイミドピオチンと反応させ、最終的にセントリコン（Centricon）−３０膜を用いて精製した。ＨＡＢＡアッセイは、ビオチニル化ホウ素化−デキストラン−７０が、高分子単位当たりおよそ２個のビオチン部分を含むことを示した。７０ｋＤ分子量のデキストランが、このサンプルに使用されるときに、ホウ素化デキストランのインビボ薬理動態は、高いかあるいは低い分子量のデキストランのいずれかを好ましく利用できる。２．スルフィジリルボラン−デキストラン接合体のカルボキシアルキル化：アミノ含有ビオチン類似体と反応させるために、デキストラン接合体を、最初に６−ブロモヘキサン酸で誘導して、必要なカルボン酸基を導入する。上に記載されるカルボキシアルキル化およびアリル化反応は、両方とも化学的に同じタイプのアルキル化反応である。これらの２つの反応は、最初にデキストランを、臭化アリルと塩基性条件下で反応させ、その後、ブロモヘキサン酸と反応させることにより、１回の操作で組込まれる。同様の連係操作は、中間担体としてデキストランを使用して抗体とマイトマイシンの接合体について記載された。Noguchi et al.，Bioconj．Chem.，3:132-37(1992)。アルキル化の手順は、次の段階で約１のビオチン−デキストラン比を達成するために、導入されるカルボン酸基のレベルを限定するように設定される。カルボキシル化の範囲は、ナトリウムメトキシドで滴定することによって決定する。この「二重誘導」の結果として導入されたホウ素原子の数における任意のわずかな減少は、この方法によって負荷できる多量のホウ素原子のために、腫瘍部位に局在されるＳＡｖ−ＩｇＧ接合体のモル当たりホウ素局在化の４倍の増幅のために、あまりに面倒になるべきでない。３．スルフィジリルボラン−デキストランのビオチニル化（反応図式１）：本発明の好ましい実施態様は、特に設計されたアミン含有ビオチン類似体（反応図式１の化合物７）を使用する。この化合物は、ビオチン部分とアミン末端の間にスペーサーアームを有し、ビオチンペプチド結合にＮ−メチル置換を有する。代替的に、人工のＤアミノ酸にペプチド結合したビオチンを含み、さらにカルボキシル置換デキストランボロカプテートに接合のためのアミノ基で終わっているビオチニダーゼ耐性ビオチン類似体が使用できる。特定のビオチン−ペプチド結合のこれらの特徴は、血清ビオチニダーゼによって認識を防止するか最小限し、したがって、化合物は、さらに安定である。Evangelatos et al.，Analyt．Bi ochem.，196:385-89(1991)。アミン含有ビオチニル化剤を、ｐＨ約６で室温で、水溶性アルボジイミド（「ＥＤＣ」）およびＮ−ヒドロキシスルホスクシニミドを用いて、カルボキシルアルキル化スルフィジリルボラン−デキストランで濃縮する。不可欠な最終産物の構造は、反応図式１の化合物４として示される。アミド形成の範囲は、使用したアミンのモル過剰量を変えることによって制御することができる。Noguchi et al.，上述。このような操作を使用して、デキストラン鎖当たり平均約１ビオチン部分を導入することを目的として、導入されるビオチンの量を制御することができる。最終モル置換比は、ビオチンとデキストランの比およびホウ素とデキストランの比の測定から、公知濃度のストレプトアビジンに結合することから誘導される。ＩＩ．動物実験ＬＳ１７４Ｔ細胞腫瘍異種移植ヌードマウスモデルを、動物実験に使用する。 Tom et al.，In-Vitro，12:180-91(1976)。腫瘍細胞を、ヌードマウスに５×１０⁶細胞の皮下または筋肉内注射の前に細胞培養基で育成する。腫瘍は、有用なサイズ（５０〜１００ｍｇ）まで育成するのに１０〜１４日かかり、その間に動物を使用する準備ができている。１０μＣｉ／マウスの放射性ヨウ化抗体接合体またはビオチニル化スルフィジリル−ボランを使用する。５匹のマウスのグループを、プレターゲッティングの第一の２段階、ストレプトアビジン−ＭＡｂ接合体の投与、および洗浄段階を含めた薬理動態研究において各時点での生物分布を測定するのに使用する。ホウ素送達の第三段階を含めた３つの段階の全てにおいて連続に使用される動物を使用する生物分布について、１時点当たり１０匹までのマウスを試験した。それらの内、あるもの（３から５）は、全くホウ素生物分布を測定するためにのみに使用される。同じタンパク質とデキストラン用量で、しかしさもなければ放射性ヨウ化化合物で試験されるヌードマウスと同じ実験条件にかけられるが、これらのコードマウスには、冷ＳＡｖ−ＭＮ１４とビオチン−デキストラン−（ホウ素）_xのみが与えられた。腫瘍細胞を飽和するのに必要とされる最初の段階の試薬（Ｉ−１３１−ＭＮ１４−ＳＡｖ）のタンパク質用量および接合体のその用量での最大の腫瘍成長の時間を、１０、５０、１００および２５０μｇの接合体を４つのグループの腫瘍のあるマウスに（必要な場合追加の未標識接合体を使用して）投与し、５匹の各グループについて１、２、３および５日目に生物分布を測定することによって測定する。Ｉ−１３１で標識したＳＡｖ−ＭＮ１４の免疫反応性は、８０倍過剰の抗原ＣＥＡ（カリフォルニア州、ラホーヤ（La Jolla）のスクリップス（Scripps））と複合化させ、カラムの空隙率に接近するＨＰＬＣ維持のシフトを分析することによって評価する。日常のインビトロ拮抗結合アッセイも、ＳＡｖ−ＭＮ１４製造で行うことができる。循環するＳＡｖ−ＭＮ１４接合体のクリアランス（除去の程度）を、上述のビオチン−ＨＳＡ−ガラクトース接合体を使用して評価する。これは、最大の腫瘍摂取の時に、Ｉ−１２５で標識した第二のＭＡｂを、Ｉ−１３１−ＳＡｖ／ＭＮ１４をすでに担持する３つのグループのマウス（５／グループ）に投与することによって行われる。その標識の両方の生物分布を、第二のＭＡｂの２、４および２４時間の後の注射時に測定する。 Tom et al.，In-vitro，上述，には、クロラミンＴ手段を用いてＩ−１３１およびＩ−１２５アイソトープでの放射性ヨウ化の方法が記載されている。典型的な放射性ヨウ化は、以下の通りである。０．５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４（５０μｌ，抗体（５１μｌ／０．８５ｍＣｉのヨウ化物，およびクロラミンＴ（４．２５μｇ）を、放射性よう化物を含むバイアルに添加する。約１時間後、ナトリウムメタビスルフィット（５０μｌ水中の８．５μｇ）を添加し、標識産物を、ＰＤ−１０カラム（ファルマシア（Pharmacia））に通すことによって精製する。放射活性の回復は、約７０％である。しかし、この手段は、そのビオチン−結合ドメイン中のトリプトファン残基のためのストレプトアビジンの酸化的不安定性のために、ストレプトアビジン−ｍａｂ接合体の放射性ヨウ化について行うことができない。以下の方法を行う。［Ｉ−１２５］−Ｎ−スクシニミジル−４−ヨードベンゾエート（１．７ｍＣｉ、エヌイーエヌ・デュポン（NEN Dupont））を、４０分間の空気流で乾燥させて、有機溶媒を除去し、ｐＨ９．５で、５００μＬの０．５Ｍホウ酸緩衝液中の２００μｇのストレプトアビジン−ｍａｂで処理する。反応を１時間室温で継続させ、その時に、反応液を、ｐＨ８．５で１Ｍグリシンを添加することによつて急冷し、反応混合液を、さらに１時間放置させる。放射性ヨウ化ＳＡ−ｍａｂ産物を、ｐＨ７．０のＰＢＳ中の１％ＨＳＡで平衡になったＰＤ−１０カラムで精製する。およそ５５％の放射性化合物収量が得られる。同様の測定を行って、抗イディオタイプの抗体のような他の洗浄剤で空隙を評価する。ホウ素送達段階である第三の段階を含む動物試験のために、第二ステージのクリアリング剤は、放射性標識されない。その代替的に、第一の抗体の隙間パターンをそれ自身の標識を用いて監視する。第三段階の分析について、抗体とＩ−１３１に付着し、ホウ素ゲージに付着したＩ−１２５による標識の結果を、インビボ薬理動態実験で確かめられる。様々な方法を用いて、ホウ素化化合物のヨウ化についての多くの実施例が存在する。Varadarajan et al.，Bioconj．Chem.，2:102-110(1991)。材料を、ＰＤ −１０使い捨てカラム上で精製し、純度を、デキストラン（可動相として水）の分析に適した分析用バイオセプ（Biosep）−ＳＥＣ−Ｓ４０００（カリフォルニア州，トーランス（Torrance）のフェノメネックス（Phenomenex））サイズ排除カラムで評価する。屈折率検出と同様に放射活性を用いる。純度を９０％未満であると評価される場合、可能な限り小さな放射性ヨウ素不純物の排除するのは、セントリコン（Centricon）３０微量濃縮機（マサチューセッツ州，ダンバーズ（Danvers）のアミコン（Amicon））によって達成される。定量的ホウ素測定は、ビオチニル化デキストラン−ホウ素化合物を特徴づけ、動物実験でのホウ素化合物の様々な回数の投与後、腫瘍中のインビボでのホウ素消費を測定するために行う。サブ−ｐｐｍレベルのホウ素を測定するのに敏感なプロンプト−γ法を用いて、動物組織でホウ素測定を行う。Fairchild et al.， Cancer Res.，50:4860-4865(1990)。三段階プレターゲッティング法の有効性：上で記述されたＳＡｃ−ＭＮ１４接合体を、ヒト結腸癌腫異種移植インビボの生物分布測定に使用した。接合体を循環する隙間を含む第二段階を、ガラクトシル化抗イディオタイプの第二の抗体またはガラクトース−ＨＳＡ−ビオチン複合体のいずれかを使用することによって達成した。第三段階について、上で記載されたビオチニダーゼ耐性構造特性を含むＩｎ−１１１で標識されたビオチン化合物を使用した。素晴らしい腫瘍対非腫瘍比が、表２で見られる通り、Ｉｎ−１１１の生物分布について得られた。表２は、ほとんど全ての接合体が、第二段階のクリアリング剤（洗浄剤）を用いることによって循環から取除いたという事実を反映する。表２ＳＡｖ−ＭＮ１４を用いたプレターゲッティング、ガラクトース−ＨＳＡ−ビオチン洗浄剤を用いた循環接合体の除去、および第三段階のビオチン化合物の投与の後のＧＷ３９罹患ヌードマウスでのＩｎ−１１１で標識されたビオチン化合物の生物分布（％ＩＤ／ｇ、ｎ＝３）。第一段階の剤を循環から取除くことは、血液中の非複合性接合体によって立証される。正常な器官での低レベルは、その接合体のビオチン−認識部位の不在に影響する。上述の通りデキストラン−ボロカプテート部分を取込む第三段階の化合物は、この非ホウ素化化合物によって示されるものと同様の腫瘍：非腫瘍比に達する。ＩＩＩ．腫瘍細胞に対するホウ素原子をターゲッティングする方法以下の実施例は、本発明にしたがって二段階のプレターゲッティング法を例示する。２つの段階は以下の通りである。段階１：上で記載されたＳＡｖ−ＭＮ１４接合体を、癌患者に投与し、腫瘍部位に局在化させる。段階２：上で記載されたビオチニル化デキストラン−ボロカプテート化合物を投与し、その化合物上のビオチン部位と、段階１での腫瘍部位に局在化されたストレプトアビジン部位との間のアフィニティーのために腫瘍部位に局在化する。いったん、ホウ素が腫瘍部位に局在化した場合、腫瘍細胞の療法を有効にする従来のＢＮＣＴにしたがって照射できる。以下の実施例は、本発明にしたがって三段階のプレターゲッティング法を例示する。その三段階は、以下の通りである。段階１：上で記載されたＳＡｖ−ＭＮ１４接合体を、癌患者に投与し、腫瘍部位に局在化させる。段階２：循環する接合体を、上で記載されたガラクトース−ＨＳＡ−ビオチン化合物を用いて取除く。ビオチン−ＳＡｖ複合化は、肝臓中のアシアログリコタンパク受容体によって、ガラクトース−付随錯体（ｇａｌ−ＨＳＡ−ビオチン− ＳＡｖ−ＭＮ１４）を循環から迅速に排除することになる。Ong et al.，Cancer Res.，51:619-26(1991)。代替的に、ガラクトシル化抗イディオタイプの抗体をクリアリング剤として使用できる。段階３：上で記載されたデキストラン−ボロカプテート化合物を投与し、その化合物上のビオチン部位と、段階１での腫瘍部位に局在化されたストレプトアビジン部位との間のアフィニティーのために腫瘍部位に局在化する。いったん、ホウ素が腫瘍部位に局在化した場合、腫瘍細胞の療法を有効にする従来のＢＮＣＴにしたがって照射できる。以下の実施例は、本発明にしたがって好ましい方法を例示する。その方法は、１．上で記載されたＳＡｖ−ＭＮ１４接合体を、癌患者に投与し、腫瘍部位に局在化させる。２．上で記載されたガラクトース−ＨＳＡ−ビオチン複合体または抗イディオタイプの抗体のようなクリアリング剤を投与して、非局在化接合体を循環から取除く。３．検出可能な標識で標識されるビオチニル化デキストラン−ボロカプテート化合物を投与し、、その化合物上のビオチン部位と、段階１での腫瘍部位に局在化されたストレプトアビジン部位との間のアフィニティーのため、この化合物を腫瘍部位に局在化させる。４．ビオチニル化デキストラン−ボロカプテート化合物上の検出可能な標識を検出して、ホウ素含有化合物が、腫瘍細胞に局在したこと、および非局在化ホウ素含有化合物が循環から排除されることを確認する。５．腫瘍部位に局在化されたホウ素原子を照射し、それにより腫瘍細胞のＢＮＣＴを効果的にする。当業者にとって、本発明の方法及び組成物に対して種々の修飾および変更が加えられることは明らかである。したがって、本発明は、請求項およびそれらの同等物の範囲内に及ぶ場合、本発明のいくつかの修飾および変更をもカバーするものである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年８月２１日（１９９８．８．２１）【補正内容】請求の範囲（補正）１．（Ａ）腫瘍細胞によって産生されるか、あるいは腫瘍細胞に関連しており、腫瘍細胞に存在する抗原に選択的に結合する抗体または抗原結合性抗体フラグメントと、特異性のある結合対の第一の構成物との接合体を含むターゲッティング組成物を患者に投与し、該接合体を腫瘍細胞に局在化させるステップと、（Ｂ）所望により、該患者にクリアリング組成物を投与し、該クリアリング組成物に、循環血液中から非局在化ターゲッティング組成物を除去するステップと、（Ｃ）該結合対の相補的な構成物およびホウ素原子を含む接合体を含むホウ素化合物を前記患者に投与し、該ホウ素化合物を該腫瘍細胞に局在化させるステップと、を含んでなる、ホウ素原子を患者の腫瘍細胞にターゲッティングする方法。２．前記結合対の前記第一の構成物がストレプトアビジンを含み、前記結合対の前記相補的構成物がビオチンを含む、請求項１に記載の方法。３．前記結合対の前記第一の構成物が一本鎖オリゴヌクレオチドであり、前記結合対の前記相補的構成物が相補的一本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。４．前記結合対の前記第一の構成物が酵素であり、前記結合対の前記相補的構成物が前記酵素のための基質である請求項１に記載の方法。５．前記結合対の前記第一の構成物が酵素基質であり、前記結合対の前記相補的構成物が前記基質のための対応する酵素である、請求項１に記載の方法。６．前記結合対の前記第一の構成物が二本鎖オリゴヌクレオチドであり、前記結合対の前記相補的構成物が挿入剤(intercalating agent)である請求項１に記載の方法。７．前記抗体または抗体フラグメントが、モノクローナル抗体またはそのフラグメントを結合する抗原である請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。８．前記モノクローナル抗体が、クラスＩＩＩ抗ＣＥＡ抗体である請求項７に記載の方法。９．前記ホウ素化合物が約１２００から約１５００個のホウ素原子により誘導されたデキストランに接合したビオチンを含む、請求項２に記載の方法。１０．前記デキストランがナトリウムボロカプテート（Ｎａ₂Ｂ₁₂Ｈ₁₁ＳＨ）により誘導されている、請求項９に記載の方法。１１．前記ビオチンが、人工のＤ−アミノ酸にペプチド結合により結合したビオチン部分を含むビオチニダーゼ耐性ビオチン類似体を含む、請求項２に記載の方法。１２．前記ホウ素化合物が検出可能な放射性アイソトープで放射性標識される請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。１３．前記ホウ素化合物が化合物の分子１個当たり約１〜３個のビオチン部分を含む請求項２に記載の方法。１４．ステップ（Ｂ）の前記追加のクリアリング剤が投与される請求項１に記載の方法。１５．ステップ（Ｃ）の前記ホウ素化合物が、ステップ（Ｂ）の前記クリアリング剤が投与された後約２から約２４時間以内に投与される請求項１４に記載の方法。１６．前記クリアリング剤がヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびビオチンのガラクトシル化接合体を含む請求項１４または１５に記載の方法。１７．前記クリアリング剤が抗イディオタイプ性抗体を含む、請求項１４または１５に記載の方法。１８．前記抗イディオタイプ性抗体がガラクトシル化される請求項１７に記載の方法。１９．前記クリアリング組成物が、ステップ（Ａ）の前記ターゲッティング組成物が投与された後、約４８時間から約２４０時間以内に投与される請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。２０．ステップ（Ｂ）の前記クリアリング剤が投与されず、ステップ（Ｃ）の前記ホウ素化合物が、ステップ（Ａ）の前記ターゲッティング組成物が投与された後、約５日から約２０日以内に投与される請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。２１．投与される前記抗体の分子１個当たり約６０００個のホウ素原子が前記腫瘍細胞に局在化されている、請求項１に記載の方法。２２．（Ａ）腫瘍細胞によって産生されるか、または腫瘍細胞に関連し、該腫瘍細胞に存在する抗原に選択的に結合する抗体または抗原結合性抗体フラグメントと、ある特異性のある結合対の第一の構成物との接合体を含むターゲッティング組成物を投与し、該ターゲッティング組成物を該腫瘍細胞に局在化させるステップと、（Ｂ）所望により、該患者にクリアリング組成物を投与し、該クリアリング組成物に、循環血液中から非局在化ターゲッティング組成物を除去させるステップと、（Ｃ）該結合対の相補的な構成物およびホウ素原子を含む接合体を含むホウ素化合物を該患者に投与し、該ホウ素化合物を該腫瘍細胞に局在化させるステップと、（Ｄ）該腫瘍細胞に局在化された該ホウ素化合物のホウ素原子を放射線照射して、該腫瘍細胞のＢＮＣＴを効果的にするステップとを含んでなる、患者の腫瘍細胞のホウ素中性子捕獲治療法（ＢＮＣＴ）。２３．さらに、前記ホウ素化合物の前記検出可能な放射性アイソトープを検出し、それにより前記ホウ素化合物の所在を決定するステップを含む請求項１２に記載の方法。２４．前記ホウ素化合物が検出可能な放射性アイソトープで放射性標識され、前記ホウ素原子に放射線照射する前に、さらに、前記ホウ素化合物の前記検出可能な放射性アイソトープを検出し、それにより前記ホウ素化合物の所在を決定するステップを含む請求項２３に記載の方法。２５．（ｉ）一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、酵素、酵素基質、およびビオチンから構成される群から選択される特定の結合対の構成物と、ここでビオチンはペプチド結合により人工のＤ−アミノ酸に結合したビオチン部分を含むビオチニダーゼ耐性ビオチン類似体として提供されるものであり、（ii）ホウ素原子との接合体を含むホウ素化合物を含むことを特徴とする、腫瘍細胞にボロン原子をターゲッティングする組成物を含むヒト用の無菌の注射可能な組成物。２６．前記結合対の前記構成物が、ビオチンである請求項２５に記載の組成物。２７．約１２００から約１５００個のホウ素原子で誘導されたビオチンとデキストランとの接合体を含む請求項２６に記載の組成物。２８．前記デキストランが、ナトリウム・ボロカプテート（Ｎａ₂Ｂ₁₂Ｈ₁₁ＳＨ）で誘導される請求項２７に記載の組成物。２９．前記ホウ素化合物が、検出可能な標識で放射性標識される請求項２５に記載の組成物。３０．ホウ素原子を患者の腫瘍細胞にターゲッティングする方法での用途に適するキットであって、別々の容器に、（Ａ）（ｉ）一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、酵素、酵素基質、ビオチンおよびアビジンから構成される群から選択される特定の結合対の第一の構成物と、ここで該ビオチンは、ペプチド結合を介して人工のＤ−アミノ酸に結合したビオチン部分を含むビオチニダーゼ耐性ビオチン類似体として提供されるものであり、（ｉｉ）該腫瘍細胞によって産生されるか、または該腫瘍細胞に関連し、該腫瘍細胞に存在する抗原に選択的に結合する抗体または抗原結合性抗体フラグメントとを含むターゲッティング組成物の注射可能な滅菌製剤と、（Ｂ）所望により、クリアリング組成物と、（Ｃ）（ｉ）それぞれ、一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、該酵素のための酵素基質、該酵素基質のための酵素、アビジンおよびビオチンから構成される群から選択される該結合対の相補的構成物と、ここで、該ビオチンはペプチド結合により人工のＤ−アミノ酸に結合したビオチン部分を含むビオチニダーゼ耐性ビオチン類似体として提供されるものであり、（ｉｉ）複数のホウ素原子を含む１つまたはそれ以上の付加体(addend)とを含む接合体を含んでなるホウ素化合物とを含んでなるキット。３１．前記クリアリング組成物を含む請求項３０に記載のキット。３２．前記クリアリング組成物が抗イディオタイプの抗体を含む、請求項３１のキット。３３．ホウ素原子を患者の腫瘍細胞にターゲッティングする方法での用途に適するキットであって、別々の容器に、（Ａ）（ｉ）特異性のある結合対の第一の構成物および（ｉｉ）抗体または抗原結合性抗体フラグメントを含むターゲッティング組成物の注射可能な滅菌製剤と、ここで該抗体または抗体フラグメントは、該腫瘍細胞によって産生されるか、または該腫瘍細胞に関連した抗原に選択的に結合し、該腫瘍細胞に存在する抗原に選択的に結合するものであり、（Ｂ）クリアリング組成物と、（Ｃ）（ｉ）該結合対の相補的構成物および（ｉｉ）複数のホウ素原子を含む１つまたはそれ以上の付加体(addend)を含む接合体を含むホウ素化合物とを含むキット。３４．前記クリアリング組成物が抗イディオタイプの抗体を含む、請求項３３に記載のキット。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．（Ａ）腫瘍細胞によって産生される抗原または腫瘍細胞に関連した抗原に選択的に結合する抗体と、結合対の第一の構成物との接合体を含むターゲッティング組成物を患者に投与し、該接合体を腫瘍細胞に局在化させるステップと、（Ｂ）所望により、該患者にクリアリング組成物を投与し、該クリアリング組成物により循環血液中から非局在化接合体を除去するステップと、（Ｃ）該結合対の相補的な構成物およびホウ素原子を含む接合体を含むホウ素含有化合物を該患者に投与し、該ホウ素含有化合物を該腫瘍細胞に局在化させるステップとを含んでなる、ホウ素原子を患者の腫瘍細胞にターゲッティングする方法。２．前記結合対の前記第一の構成物がストレプトアビジンを含み、前記結合対の前記第二の構成物がビオチンを含む請求項１に記載の方法。３．前記結合対の前記第一の構成物が一本鎖オリゴヌクレオチドであり、前記結合対の前記相補的構成物が相補的一本鎖オリゴヌクレオチドである請求項１に記載の方法。４．前記結合対の前記第一の構成物が酵素であり、前記結合対の前記相補的構成物が前記酵素のための基質である請求項１に記載の方法。５．前記結合対の前記第一の構成物が酵素基質であり、前記結合対の前記相補的構成物が対応する酵素である請求項１に記載の方法。６．前記結合対の前記第一の構成物が二本鎖オリゴヌクレオチドであり、前記結合対の前記第二の相補的構成物が挿入剤(intercalating agent)である請求項１に記載の方法。７．前記抗体がモノクローナル抗体である請求項１に記載の方法。８．前記モノクローナル抗体が、ＭＮ−１４である請求項７に記載の方法。９．前記クリアリング剤がヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）とビオチンのガラクトシル化接合体を含む請求項１に記載の方法。１０．前記クリアリング剤が抗イディオタイプ性抗体を含む請求項１に記載の方法。１１．前記抗イディオタイプ性抗体がガラクトシル化されている請求項１０に記載の方法。１２．前記ホウ素含有化合物が、約１２００から約１５００個のホウ素原子で誘導されたデキストランに接合したビオチンを含む請求項２に記載の方法。１３．前記デキストランが、ナトリウムボロカプテートまたはＢＳＨ（Ｎａ₂ Ｂ₁₂Ｈ₁₁ＳＨ）で誘導される請求項２に記載の方法。１４．前記ビオチンが、人工のＤ−アミノ酸にペプチド結合したビオチン部分を含むビオチニダーゼ耐性ビオチン類似体を含む請求項２に記載の方法。１５．前記ホウ素含有化合物が検出可能な標識で放射性標識されている請求項１に記載の方法。１６．前記ホウ素含有化合物が、該化合物１分子当たり約１〜３個のビオチン部分を含む請求項２に記載の方法。１７．ステップ（Ｂ）の任意のクリアリング剤が投与されることを特徴とする請求項１に記載の方法。１８．ステップ（Ｃ）の前記ホウ素含有化合物が、ステップ（Ｂ）の前記クリアリング剤が投与された後、約２時間から約２４時間以内に投与される請求項１７に記載の方法。１９．ステップ（Ｃ）の前記ホウ素含有化合物が、ステップ（Ａ）の前記抗体接合体が投与された後、約４８時間から約２４０時間以内に投与される請求項１に記載の方法。２０．ステップ（Ｂ）の前記クリアリング剤が投与されず、ステップ（Ｃ）の前記ホウ素含有化合物が、ステップ（Ａ）の前記ターゲッティング組成物が投与された後、約５日から約２０日以内に投与される請求項１に記載の方法。２１．投与された抗体の分子１個当たり約６０００個以下のホウ素原子が前記腫瘍細胞に局在化される請求項１に記載の方法。２２．さらに、前記腫瘍細胞に局在した前記ホウ素化合物のホウ素原子を照射し、それにより前記腫瘍細胞のＢＮＣＴを有効にするステップを含む請求項１に記載の方法。２３．さらに、前記ホウ素含有化合物の前記検出可能な標識を検出し、それにより前記化合物の所在を決定するステップを含む請求項１５に記載の方法。２４．前記検出可能な標識が検出された後、さらに、前記腫瘍細胞に局在した前記ホウ素含有化合物のホウ素原子に放射線照射するステップを含む請求項２３に記載の方法。２５．ホウ素原子を腫瘍細胞にターゲッティングする用途のための組成物を包含し、結合対の構成物とホウ素原子との接合体を含むビオチン含有化合物を含む、ヒト用途の無菌の注射可能な組成物。２６．前記結合対の前記構成物が、ビオチンである請求項２５に記載の組成物。２７．約１２００から約１５００個のホウ素原子で誘導されたビオチンとデキストランとの接合体を含む請求項２６に記載の組成物。２８．前記ビオチンが、人工のＤ−アミノ酸にペプチド結合したビオチン部分を含むビオチニダーゼ耐性ビオチン類似体を含む請求項２６に記載の組成物。２９．前記デキストランが、ナトリウムボロカプテートまたはＢＳＨ（Ｎａ₂ Ｂ₁₂Ｈ₁₁ＳＨ）により誘導される請求項２７に記載の組成物。３０．前記ビオチン含有化合物が、検出可能な標識で放射性標識される請求項２５に記載の組成物。３１．ホウ素原子を患者の腫瘍細胞にターゲッティングする方法の用途に適するキットであって、（Ａ）該腫瘍細胞によって産生されるか、または腫瘍細胞に関連した抗原に選択的に結合する抗体と、ある結合対の第一の構成物とを含むターゲッティング組成物の無菌の注射可能な製剤と、（Ｂ）所望により、クリアリング組成物と、（Ｃ）該結合対の相補的構成物およびホウ素原子を含む接合体を含んでなるホウ素含有化合物とを含有するキット。