ES2201764T3 - Procedimiento in vitro para el reconocimiento y diagnostico de sindromes coronarios agudos. - Google Patents

Abstract

Procedimiento in vitro para el reconocimiento y diagnóstico de síndromes coronarios agudos, en especial del infarto de miocardio agudo, caracterizado porque el contenido de colina, derivados de la colina y/o derivados del trimetilamonio, seleccionados de entre el grupo que consta de fosforilcolina, plasmalógenos y lisoplasmenilcolina, se determina en muestras de líquidos corporales o muestras de partes del cuerpo.

Description

Procedimiento in vitro para el reconocimiento y diagnostico de síndromes coronarios agudos.

La invención se refiere a un procedimiento in vitro para el reconocimiento y diagnóstico de síndromes coronarios agudos, en especial del infarto de miocardio agudo (AMI), en seres humanos.

Los síndromes coronarios agudos comprenden los cuadros clínicos del infarto de miocardio agudo (AMI) y de la angina de pecho inestable, los cuales son definidos por la clasificación del AMI de la OMS y la clasificación Braunwald de la angina de pecho inestable (Gillum R.F. et al. 1984, Am Heart J 108; 150- 158; Braunwald E. et al. 1994, Circulation 90: 613-622). Los síndromes coronarios agudos representan un complejo de enfermedad frecuente y amenazante para la vida, en el cual el diagnóstico y terapia tempranos y seguros pueden ser decisivos para la supervivencia del paciente. Esto se cumple en especial para el infarto de miocardio agudo, en el cual el retardo del diagnóstico y terapia correctos tiene consecuencias determinantes para el paciente. Métodos conocidos de diagnóstico del infarto de miocardio son el electrocardiograma y la determinación de diferentes marcadores de laboratorio. El electrocardiograma y los marcadores de laboratorio hasta ahora conocidos tienen una sensibilidad muy reducida en la fase temprana del infarto de miocardio agudo como para poder establecer el diagnóstico en la mayoría de los pacientes. De este modo la sensibilidad de variaciones del ECG típicas del infarto (elevaciones del ST) se encuentra en 46% (Rude, R.E. et al. 1983, Am J Cardiol 52:936-942). La sensibilidad de los marcadores de laboratorio creatinquinasa actividad-(CK), actividad CK-MB, masa-CK-MB, de las isoformas CK- MB, de mioglobina y troponinas cardíacas se encuentra, en las primeras 2 horas después del inicio del dolor, entre 11-29% (Mair, J. et al. 1994, Mitteilungen der Deutschen Gesellschaft für Klinische Chemie 25: 1-6). La utilidad diagnóstica limitada de los procedimientos conocidos en la fase temprana del infarto de miocardio agudo causa una serie de problemas clínicos como el peligro de diagnósticos erróneos, la realización de terapias no indicadas y el retardo de terapias salvadoras de la vida.

En el caso de la angina de pecho inestable, los pacientes de riesgo pueden ser reconocidos con una fiabilidad relativa mediante la determinación de las troponinas cardíacas, si bien la cinética de liberación lenta condiciona aquí, sin embargo, que en la fase temprana se puedan dar también diagnósticos negativos falsos. Esto es problemático debido a que los pacientes pueden tener un pronóstico igual de malo que los pacientes con AMI y necesitan una terapia antiisquémica rápida y selectiva. Por ello existe una notable demanda de procedimientos que permitan un reconocimiento fiable y temprano de los síndromes coronarios agudos, en especial del infarto de miocardio agudo.

La invención se plantea por ello el problema de proporcionar un método que permita el reconocimiento temprano de síndromes coronarios agudos y por consiguiente mejore el diagnóstico y terapia de los pacientes enfermos.

Este problema se resuelve según un procedimiento con las características de la reivindicación 1. En el procedimiento, según la invención, para el reconocimiento de síndromes coronarios agudos, en especial del infarto de miocardio agudo, se determina y evalúa el contenido en colina, derivados de la colina y/o derivados del trimetilamonio, elegidos del grupo que consta de fosforilcolina, plasmalógenos y lisoplasmenilcolina, en líquidos corporales o partes del cuerpo, que han sido tomados de un paciente.

La colina, los derivados de la colina y/o los derivados del trimetilamonio, elegidos del grupo que consta de fosforilcolina, plasmalógenos y lisoplasmenilcolina, son moléculas del metabolismo de lípidos y se designan a continuación de forma resumida como "CCTD". Las CCTD tiene las siguientes fórmulas químicas:

1

2

3

R1 y R2 representan determinados sustituyentes químicos que caracterizan el grupo de sustancias que comprende fosforilcolina, plasmalógenos y lisoplasmenilcolina. Los plasmalógenos y la lisoplasmenilcolina contienen en esta porción de la molécula un grupo alquenilo.

La fórmula 1 muestra la colina [2-hidroxietil]trimetilamonio representada con su contraión. La fórmula 2 muestra la fórmula química general para derivados de la colina y la fórmula 3 representa la fórmula general para derivados de trimetilamonio como fosforilcolina y plasmalógenos como plasmenilcolina y lisoplasmenilcolina. La carga negativa se puede encontrar en la misma molécula o en un contraión. La mayor parte de las CCTD son o bien componentes de fosfolípidos, que representan piezas constructivas de membranas biológicas o están estrechamente ligados con el metabolismo de los fosfolípidos. Las células del músculo cardíaco son especialmente ricas en plasmenilcolinas, que representan fosfolípidos que contienen colina, que poseen un grupo alquenilo característico en la molécula. Las plasmenilcolinas son además componentes de membranas de mitocondrias, que suponen una parte significativa de la masa del miocardio. La activación de diferentes fosfolipasas miocardiales en la fase temprana del infarto de miocardio agudo así como las perturbaciones del metabolismo de los lípidos en caso de isquemia de miocardio severa conducen, según los resultados de la solicitante, a una liberación marcada de colina, derivados de la colina y los derivados del trimetilamonio químicamente emparentados, como fosforilcolina, plasmalógenos y lisoplasmenilcolina, y causan un aumento de la concentración de las CCTD en determinados líquidos corporales y partes del cuerpo. No se sabe en qué medida están implicados elementos no miocitarios, incluidas las células del endotelio y las células musculares del vaso lisas. El parentesco químico de la colina, los derivados de la colina y los derivados del trimetilamonio, elegidos del grupo que consta de fosforilcolina, plasmalógenos y lisoplasmenilcolina, y su comportamiento de igual tipo en procesos patofisiológicos, es decir, la liberación muy temprana fuera del corazón por la destrucción isquémica de membrana, sirve de fundamento para la consideración de forma resumida como CCTD.

Las posibles diferencias de las distintas CCTD pasan a segundo plano ante el hecho común decisivo de una liberación miocardial muy rápida en caso de síndromes coronarios agudos, ya que este hecho común es decisivo para la característica, esencial para la invención, del procedimiento en el diagnóstico temprano en las primeras horas tras el inicio del dolor.

El aprovechamiento diagnóstico de la liberación de colina, derivados de colina y derivados de trimetilamonio, elegidos del grupo que consta de fosforilcolina, plasmalógenos y lisoplasmenilcolina, para el reconocimiento de síndromes coronarios agudos y del infarto de miocardio agudo en seres humanos no se ha descrito hasta ahora. Se conoce, únicamente, que en disposiciones de ensayo experimentales en la fase temprana de la izquemia de miocardio se ha observado una elevación de los lisofosfoglicéridos (p. ej. lisofosfatidilcolina) en el miocardio así como en el efluvio venoso y linfático (Corr P.B. et al. 1987, J Mol Cell Cardiol 19: 34-53; Snyder D.W. 1981, Am J Physiol 241: H700-H707; Akita H. et al. 1986, J Clin Invest 78: 271-280). Al mismo tiempo no se utilizó en ninguna publicación un procedimiento para la evaluación del contenido de colina, derivados de colina y derivados de trimetilamonio, elegidos del grupo que consta de fosforilcolina, plasmalógenos y lisoplasmenilcolina, en líquidos corporales para el diagnóstico de un síndrome coronario agudo o de un infarto de miocardio agudo en seres humanos. El trasfondo de las publicaciones mencionadas es más bien la observación de que la acil-lisofosfatidilcolina tiene evidentemente efectos proarrítmicos y que los medicamentos que tienen un efecto antilisofosfatidilcolina pueden ser, posiblemente, tratamientos que tengan sentido.

La invención se refiere a un procedimiento para la determinación de colina, derivados de colina y derivados de trimetilamonio, como fosforilcolina, plasmalógenos y lisoplasmenilcolina, y/o determinados productos de reacción para el diagnóstico temprano de síndromes coronarios agudos. Al mismo tiempo hay que diferenciar entre las diacil-fosfatidilcolinas, que no es según la invención, y las plasmenilcolinas, según la invención. De igual manera hay que diferenciar las lisofosfatidilcolinas con un grupo acilo en la molécula, que no son según la invención, de las lisoplasmenilcolinas con un grupo alquenilo en la molécula. Procedimientos de determinación inespecíficos que no permiten la diferenciación de las sustancias según la invención de otros fosfolípidos o sus componentes, no presentan las características del procedimiento según la invención, que son esenciales para el diagnóstico temprano de síndromes coronarios agudos, y no se pueden igualar, por ello, con el procedimiento.

De este modo, los procedimientos de determinación inespecíficos de la totalidad del grupo de fosfolípidos del plasma, suero o la sangre entera o lisofosfatidilcolinas no presentan las características del procedimiento según la invención durante el diagnóstico temprano de síndromes coronarios agudos. Estos procedimientos de fosfolípidos inespecíficos descritos en la literatura miden en la sangre, esencialmente, fosfolípidos hepáticos que, precisamente, no contienen las plasmenilcolinas y lisoplasmenilcolinas según la invención sino, en una gran parte, fosfolípidos de colina sin grupo alquenilo, p. ej. diacil-fosfatidilcolina. Dado que estos procedimientos de determinación que no son según la invención no miden, precisamente, específicamente las sustancias que son liberadas por el corazón a la sangre durante síndromes coronarios agudos, no poseen tampoco las características del procedimiento según la invención. Con el procedimiento de determinación de fosfolípidos que no es según la invención no se miden de este modo, durante el infarto de miocardio, ni variaciones significativas o incluso reducciones de concentración lo que pone de manifiesto que estos procedimientos no detectan en la sangre una liberación de sustancias desde el corazón con un correspondiente aumento de la concentración. Durante la determinación de la totalidad del grupo de lisolecitinas se mide con frecuencia, por ejemplo, durante el infarto de miocardio agudo, un descenso de la concentración dado que en el marco de la fase aguda inespecífica se produce una reacción hacia una formación reducida de diferentes acil-lisofosfatidilcolinas mediante una reducción de la actividad de la lecitin-colesterol-acil-transferasa (LCAT). Por lo tanto, las mediciones con procedimientos de determinación inespecíficos de fosfolípidos conducen con frecuencia incluso a resultados y conclusiones opuestos que no son verdaderos para el procedimiento según la invención.

Al mismo tiempo el procedimiento según la invención se puede llevar a cabo con diferentes técnicas analíticas mientras las sustancias según la invención se puedan determinar de manera suficientemente específica. Así es posible, p. ej., una espectroscopía de RMN tras ultrafiltración centrífuga preanalítica de la muestra y retirada de diacil-fosfatidilcolinas ligadas a proteínas, difícilmente solubles. Asimismo, se pueden utilizar técnicas de determinación cromatográficas, bioquímicas o inmulogógicas u otros métodos. Al mismo tiempo se puede llevar a cabo el procedimiento analítico sobre la base de métodos de determinación publicados como, p. ej., métodos bioquímicos o enzimáticos (Takayama, M. et al. 1977, Clin Chim Acta 79: 93-98), cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) (Brouwers, J.F.H. et al. 1998, J Lipid Res 39: 344-353; Potter, P. et al. 1983, J Neurochem 41: 188-194) así como cromatografía de gases y/o espectroscopía de masas (Myher, J.J. et al. 1989, Lipids 24: 396- 407; Pomfret, A. et al. 1989, Anal Biochem 180: 85) o métodos inmunológicos (Smal, M.A. et al. 1991, Lipids 26: 1130-1135; Baldo, B.A. et al. 1991, Lipids 26: 1136-1139). Olsson ha publicado visiones generales sobre la analítica de fosfolípidos (Olsson, N.U. et al.). Se hace referencia a estas publicaciones.

En los métodos bioquímicos según la invención se generan, por ejemplo mediante la adición de reactivos (p. ej. enzimas), reacciones químicas o productos de reacción los cuales posibilitan entonces la detección y medición de la totalidad del grupo, de un subgrupo o subespecie de las CCTD (ver ejemplos de aplicación).

En los métodos inmunológicos según la invención se generan, por ejemplo mediante el empleo de reactivos inmunológicos (p. ej. anticuerpos), por regla general en combinación con otros reactivos químicos y/o inmunológicos, reacciones o productos de reacción los cuales posibilitan entonces la detección y medición de la totalidad del grupo, de un subgrupo o subespecie de las CCTD (ver ejemplos de aplicación).

En los métodos cromatográficos según la invención se lleva a cabo, por ejemplo después de la preparación de la muestra, una transferencia de materia mediante el reparto entre una fase en reposo (estacionaria) y una fase en movimiento (móvil) con afirmaciones cualitativas y cuantitativas correspondientes respecto de las CCTD (ver ejemplos de aplicación).

Para cada procedimiento analítico de CCTD y sus productos de reacción debería tenerse en cuenta que algunas CCTD pueden formar capas individuales, capas dobles, membranas, micelas y/o vesículas, y que estos fenómenos pueden ser significativos para la analítica.

Dependiendo de la técnica de determinación elegida son posibles, en el procedimiento, afirmaciones cuantitativas sobre grupos concretos determinados o sobre la totalidad del grupo de las sustancias según la invención. Las publicaciones mencionadas son incluidas, haciendo referencia a ellas, en la presente solicitud.

Durante la liberación cardíaca de CCTD en el marco de la destrucción de membrana isquémica de células del músculo cardíaco son importantes determinadas fosfolipasas activadas. Estas fosfolipasas disocian fosfolípidos de tal manera que además de las CCTD se generan también productos de reacción sencillos que, si bien no llevan ningún grupo trimetilamonio, son sin embargo igualmente liberadas. Dado que estos productos de reacción sencillos del CCTD son parte de un mecanismo de liberación común, el procedimiento es también posible mediante la determinación de este tipo de productos de reacción sencillos. Además de la fosfolipasa A_{2}, que eleva entre otras la liberación de la lisoplasmenilcolina mencionada, hay otras enzimas importantes de este grupo, las fosfolipasas C y D, las cuales atacan el enlace éster entre el grupo hidroxi en el átomo 3-sn-C del glicerol y la fosforilcolina (fosfolipasa C) o el enlace entre el grupo fosforilo del glicerolfosfato 1,2-sustituido y a la colina esterificada con el grupo fosforilo fosfolipasa D). Los productos de reacción de la actividad de estas dos fosfolipasas actuando sobre plasmalógenos son, por consiguiente, glicerol sustituido 1-O-alq-1'-enil-2 (mediante fosfolipasa C) o glicerolfosfato sustituido 1-O-alq-1'-enil-2 (por fosfolipasa D). Los productos de reacción se liberan junto con colina o fosforilcolina, cuando las fosfolipasas mencionadas actúan sobre plasmenilcolina. Por consiguiente el procedimiento según la invención para el diagnóstico temprano de síndromes coronarios agudos puede llevarse a cabo mediante la determinación de colina, derivados de colina y/o derivados de trimetilamonio, elegidos del grupo que consta de fosforilcolina, plasmalógenos y lisoplasmenilcolina, y/o sus productos de reacción, elegidos del grupo que comprende glicerol sustituido 1-O-alq-1'-enil-2 y glicerolfosfato sustituido 1-O-alq-1'-enil-2.

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Además de la actividad aumentada de fosfolipasas otros procesos pueden ser causantes de la elevación de las CCTD y de sus productos de reacción: reducida descomposición y/o síntesis aumentada de CCTD y sus productos de reacción (con variaciones correspondientes de los enzimas responsables de ello) y la liberación de compartimentos celulares y membranas por otros factores (factores mecánicos, hinchamiento celular y otros fenómenos del daño miocitario).

La invención se explica sobre la base de los siguientes ejemplos de realización.

la Fig. 1 muestra un espectro ^{1}H-RMN de una muestra de sangre de un paciente;

la Fig. 2 muestra secciones ampliadas de espectros análogos a la Figura 1 para un paciente con infarto de miocardio agudo (A) y para un paciente sin infarto de miocardio agudo (B). En pacientes con infarto de miocardio agudo se pueden observar aumentos del área de singlete-N^{+}(CH_{3})_{3} de las CCTD.

la Fig. 3 muestra los datos para el valor diagnóstico de CCTD para el diagnóstico de un infarto de miocardio agudo durante la totalidad del intervalo de comprobación;

la Fig. 4 muestra los datos para el valor diagnóstico de CCTD para el diagnóstico de un infarto de miocardio agudo en una fase temprana del AMI (0 a 6 horas);

la Fig. 5. muestra los datos para el valor diagnóstico de CCTD para el diagnóstico de un infarto de miocardio agudo en una fase temprana del AMI (0 a 3 horas);

la Fig. 6 muestra los datos para el valor diagnóstico de CCTD para el diagnóstico de un infarto de miocardio agudo en una fase tardía del AMI (7 a 35 horas);

Elección y toma de una muestra adecuada de un líquido corporal

Para la realización del procedimiento es necesaria la toma de una muestra de un líquido corporal. Al mismo tiempo el valor diagnóstico del procedimiento depende del líquido corporal elegido. La realización del procedimiento es posible, por ejemplo, mediante la investigación de muestras de sangre o muestras de sangre preparadas como plasma, suero o sangre entera. Además de las muestras de sangre, se pueden investigar para el procedimiento también otros líquidos corporales como, p. ej. orina. Las CCTD son filtradas, en una parte determinada, glomerularmente y aparecen por ello en parte también en la orina. Aquí hay que contar sin embargo, en comparación con las investigaciones en muestras de sangre, con un retardo temporal en las variaciones de la concentración, lo que representa una desventaja para la utilización de orina. Además la orina no se puede obtener en cualquier caso de forma tan poco complicada y rápida como la sangre, lo que representa asimismo una desventaja. Ventajoso en el caso de utilización de muestras de orina es el hecho de que con frecuencia se dispone de cantidades de muestra frecuentemente mayores y que, mediante la medición de una concentración en una muestra de orina, que se ha generado a lo largo de un intervalo de tiempo mayor, se pueden detectar también procesos patológicos durante un intervalo de tiempo mayor. Sin embargo, por los motivos mencionados, tiene sentido para llevar a cabo el procedimiento la utilización de muestras de sangre o muestras de sangre preparadas. La determinación en otras partes del cuerpo y líquidos corporales, como muestras de tejido, linfas o sangre capilar puede tener sentido. Durante la obtención de la muestra deberían tenerse en cuenta más puntos. Debería excluirse el suministro exógeno de grandes cantidades de colina, derivados de la colina o derivados de trimetilamonio antes de la obtención de la muestra. Además, para el reconocimiento temprano de síndromes coronarios agudos, la obtención de la muestra debería tener lugar tan pronto como sea posible y, en su caso, repetirse periódicamente.

Determinación de las CCTD en la muestra de líquido corporal

El procedimiento de diagnóstico o evaluación según la invención es ampliamente independiente del método de determinación, mientras exista una especificidad suficiente para sustancias individuales, de un subgrupo, o todas las sustancias que se pueden determinar según la invención. Las sustancias determinadas según la invención son la colina, derivados de colina y/o derivados de trimetilamonio, elegidos del grupo que consta de fosforilcolina, plasmalógenos y lisoplasmenilcolina, así como determinados productos de reacción sencillos de las CCTD, elegidos del grupo que comprende glicerol sustituido 1-O-alq-1'-enil-2 y glicerolfosfato sustituido 1-O-alq-1'-enil-2. Como ejemplo de realización se escogió la espectroscopía ^{1}H-RMN, que se puede utilizar como procedimiento de medición primario también para la validación. Además de métodos de resonancia magnética nuclear (RMN) se pueden utilizar también métodos bioquímicos, enzimáticos, inmunológicos, clínico-químicos, cromatográficos, de espectroscopía de masas, electroquímicos, fotométricos y otros métodos, mientras se puedan determinar, con elevada selectividad CCTD liberadas cardialmente (o sus productos de reacción sencillos) en pacientes con sospecha de síndromes coronarios agudos.

Los métodos clínico-químicos y otros así como tests rápidos para la determinación de las CCTD deberían ser comprobados y validados, antes de su utilización, en cuanto a su calidad analítica. Para la aplicación para el diagnóstico de síndromes coronarios agudos deberían utilizarse, a ser posible, únicamente aquellos métodos que se demuestren, en comparación con la espectroscopía ^{1}H-RMN, diagnósticamente como ampliamente equivalentes o superiores. Las realizaciones metódicas mencionadas a continuación representan ejemplos; es decir, que se pueden utilizar productos químicos, soluciones, reactivos y aparatos cualitativa o cuantitativamente diferentes, cuando con ello se obtengan resultados comparables. Fundamentalmente basta para la realización del procedimiento con la utilización de un método de medición válido para CCTD y un líquido corporal válido.

Ejemplo de realización

Determinación de las CCTD mediante espectroscopía ^{1}H-RMN Preparación de las muestras

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obtención de 10 ml de sangre

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preparación de la muestra de sangre dependiendo del material de la muestra elegido (suero, plasma o sangre entera)

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ultrafiltración centrífuga de 4 ml de material de la muestra a través de un filtro 10-kD (p. ej. Ultrafree-4 B 10; Millipore)

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pipeteado de 600 \mul de ultrafiltrado en un tubito de RMN de 5 mm (p. ej. 527-PP-7, Willmad, Buena, USA)

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pipeteado de 100 \mul de una solución 3,5-mM-d_{4}-TSP-D_{2}O como estándar de concentración sobre un volumen de muestra de 700 \mul (TSP = sal neutra de sodio del ácido trimetil-sililpropiónico)

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medición del pH en el tubito de RMN de 5 mm (p. ej. 3-mm-Minitrode, Hamilton) inmediatamente pre- o postanalítica

Espectroscopía ^{1}H-RMN de alta resolución

Los espectros de espectroscopía ^{1}H-RMN son captados por ejemplo en un espectrómetro de 600 MHz (p. ej. Bruker AMX 600) bajo las siguientes condiciones:

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técnica Single-Pulse

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supresión del agua con la técnica de saturación previa

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30-90º de impulso RF

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5-15 segundos de tiempo de repetición del impulso

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64-128 escáneres por muestra

Los desplazamientos ^{1}H-químicos se refieren internamente a TSP_{i}. La caracterización de grupos CH-, CH_{2}- y CH_{3}- así como de otros grupos portadores de protones de sustancias conocidas se llevan a cabo sobre la base de datos de ^{1}H-Shift publicados. Además se pueden asignar resonancias de protones, en investigaciones independientes, mediante adición de sustancias depuradas. La determinación de la concentración de sustancias individuales se lleva a cabo mediante determinación de la integral de las resonancias de protones correspondientes y del estándar de concentración del TSPi teniendo en cuenta el número de protones en cada caso y el factor de dilución. Al mismo tiempo la evaluación cuantitativa de los espectros se lleva acabo de acuerdo con la fórmula siguiente:

(fórmula 4)C_{M} = F_{d} \frac{C_{TSP}A_{M}N_{TSP}}{A_{TSP}N_{M}}

C_{M}	=	concentración de metabolitos (M)
C_{TSP}	=	concentración del estándar de concentración
A_{M}	=	integral bajo el Peak of Interest (M)
A_{TSP}	=	integral del estándar de concentración
F_{d}	=	factor de dilución por adición del estándar de concentración
N_{M}	=	número de protones-M
N_{TSP}	=	número de protones del estándar de concentración.

La sistemática fue validada y correlacionada con un coeficiente de correlación de r = 0.998 para la determinación de sustancias de bajo peso molecular por la solicitante. La Fig. 1 muestra un espectro ^{1}H-RMN de un paciente. El singlete típico del grupo N^{+} (CH_{3})_{3} de colina, derivados de colina y derivados de trimetilamonio se puede demostrar en el espectro ^{1}H-RMN, por regla general, en la zona comprendida entre 2,5-4,5 ppm. Son posibles variaciones de las resonancias de protones mediante diferentes influencias preanalíticas, como por ejemplo mediante el pH, que pueden conducir, teóricamente, a desplazamientos, descomposiciones y superposiciones y que por ello deben ser tenidas en cuenta durante la evaluación. Tiene sentido determinar con precisión los desplazamientos químicos de las resonancias de protones CCTD para las condiciones de investigación elegidas de la analítica RMN en series de investigación separadas. El singlete N^{+} (CH_{3})_{3} es adecuado en especial para la cuantificación porque representa nueve protones equivalentes. En la Fig. 2 está representado un singlete N^{+} (CH_{3})_{3} con el diagnóstico típico en el caso de infarto de miocardio agudo. La concentración de CCTD se determina según el método mencionado más arriba. La espectroscopía de RMN ofrece la posibilidad de determinar, p. ej. mediante variación de la analítica y evaluación, el grupo total, un subgrupo o subespecie de CCTD, mientras que métodos inmunológicos o bioquímicos según la invención determinan con frecuencia un subgrupo o subespecie de CCTD. Otros ejemplos de realización del procedimiento según la invención son posibles mediante el empleo de otros métodos de determinación de CCTD distintos a la espectroscopía de RMN. En métodos bioquímicos según la invención se generan, por ejemplo mediante la adición de reactivos (p. ej. enzimas), reacciones químicas o productos de reacción los cuales permiten entonces la detección y medición de la totalidad del grupo de un subgrupo o subespecie de las CCTD. Una realización de este tipo del procedimiento según la invención puede llevarse a cabo p. ej. mediante una modificación del método publicado por Takayama (Takayama, M. et al., 1977, Clin. Chim. Acta 79:93-98). La determinación de colina tiene lugar, al mismo tiempo, a través de una oxidación de colina mediante una colinaoxidasa, donde como productos de reacción resultan betaína y peróxido de hidrógeno (H_{2}O_{2}). La formación de peróxido de hidrógeno (H_{2}O_{2}) es demostrada por una reacción cromática p. ej. mediante un acoplamiento de 4-aminoantiporina y fenol en presencia de peroxidasa, y la concentración se averigua, contra una prueba ciega, mediante la medición de la absorción a 500 nm en un espectrofotómetro UV calibrado.

Un procedimiento similar, pero no según la invención, se puede utilizar también para la determinación de la totalidad del grupo de fosfolípidos de colina, donde con la utilización de una fosfolipasa D inespecífica sin intercalar otro procedimiento de separación el método no presenta la características esenciales de la invención, dado que se mide también el gran grupo de diacil-fosfolípidos que no son según la invención. La especificidad de la fosfolipasa utilizada en la analítica o la existencia de un procedimiento de separación intercalado decide sobre la especificidad o el tipo de las sustancias analizadas. Si se utiliza una fosfolipasa D inespecífica y no se intercala ningún procedimiento de separación adicional, entonces se mide la totalidad del grupo inespecífico de fosfolípidos de colina, de manera que las características del procedimiento esenciales de la invención no se satisfacen. Si se utiliza una fosfolipasa D específica o una lisofosfolipasa D específica, con una especificidad de substrato para las plamenilcolinas y/o lisoplasmenilcolinas según la invención, es posible una realización según la invención del procedimiento, dado que la sustancias según la invención son medidas entonces de manera específica. La utilización de estas fosfolipasas o lisofosfolipasas específicas para plasmalógenos para la analítica de CCTD no se ha publicado hasta ahora, en especial no en la utilización diagnóstica según la invención para síndromes coronarios agudos. Si antes de la utilización de fosfolipasas se prepara la muestra de manera especial (p. ej. mediante procedimientos de separación cromatográficos, filtración o procedimientos de enriquecimiento) de forma que se hayan retirado fosfolípidos que no son según la invención, en especial diacil-fosfolípidos, que proceden del hígado, entonces la especificidad de substrato de la fosfolipasa o lisofosfolipasa utilizada no juega ya evidentemente un papel tan destacado y la especificidad del procedimiento es determinada por los procedimientos de separación intercalados. La supresión de estas fosfolipasas o lisofosfolipasas conduce, en el desarrollo de la analítica arriba mencionada, a la determinación de colina, lo que representa en la utilización durante el diagnóstico de síndromes coronarios agudos asimismo una realización del procedimiento según la invención. La determinación de colina se puede llevar a cabo también mediante una reacción de precipitación sencilla con fotometría a continuación, donde en cada caso en estas realizaciones sencillas debería comprobarse con precisión la especificidad del método para sustancias según la invención. En la determinación bioquímica según la invención de colina y otras CCTD en la sangre entera puede llevarse a cabo, antes de la determinación cuantitativa, una hemólisis de los eritrocitos, p. ej. mediante saponinas.

En métodos inmunológicos según la invención se generan, por ejemplo mediante la utilización de reactivos inmunológicos (p. ej. anticuerpos), por regla general en combinación con otros reactivos químicos y/o inmunológicos, reacciones o productos de reacción que hacen posible entonces la detección y medición de la totalidad del grupo, de un subgrupo o subespecie de las CCTD. La realización de estos métodos inmunológicos según la invención se puede llevar a cabo basándose en la sistemática publicada por Smal y Baldo (Smal, M.A. et al. 1991, Lipids 26:1130-1135; Baldo, B.A. et al. 1991. Lipids 26: 1136-1139). Se hace referencia a estas publicaciones. Para ello se fabrica, para el desarrollo de un procedimiento de test inmunológico según la invención, en el primer paso, un gen inmune CCTD. Se transforman CCTD sintetizados o altamente depurados en análogos CCTD estables y se ligan a proteínas (p. ej. albúmina sérica bovina metilada). Después son inmunizados animales (p. ej. conejos u ovejas) con el conjugado de proteína CCTD y los anticuerpos de anti-CCTD formados son aislados y depurados, p. ej. mediante la utilización de una cromatografía de afinidad. La especificidad de los anticuerpos para las CCTD y/o un subgrupo o subespecies de las CCTD debería ser correspondientemente comprobada. Los anticuerpos de anti-CCTD pueden ser utilizados, finalmente, con diferentes técnicas inmunológicas para el diagnóstico cuantitativo.

Cuando se utiliza un ensayo radioinmune concurren antígenos marcados radioactivamente (p. ej. ^{125}I-CCTD) con el antígeno de la muestra (CCTD de la muestra) alrededor de una cantidad de anticuerpos de anti-CCTD presente deficitariamente en la carga de muestra. El desplazamiento de las CCTD marcadas radioactivamente de los anticuerpos de anti-CCTD está en relación cuantitativa con la concentración de CCTD en la muestra la cual se puede determinar tras el establecimiento de una curva estándar y, p. ej., tras la precipitación de CCTD radioactivo ligado a anticuerpos.

Según un principio similar se puede llevar a cabo un inmunoensayo de luminiscencia química CCTD (CCTD-CELIA) para la determinación de CCTD. Las CCTD y el antígeno marcado con luminol compiten por una cantidad limitada de anticuerpos ligados a fase sólida. La señal luminosa medible es inversamente proporcional a la concentración de CCTD en la muestra del paciente.

Además la determinación inmunológica de las CCTD se puede llevar a cabo también mediante un ensayo inmunológico de polarización-fluorescencia de CCTD. Aquí compiten una cantidad definida de CCTD marcados con fluoróforo con el de la muestra de CCTD por una cantidad existente deficitariamente de anticuerpos de anti-CCTD correspondientes. Se registra la influencia de las CCTD marcadas con fluoróforo tras el enlace de anticuerpos. Para la medición se utiliza la técnica de fluorescencia-polarización, en la cual se mide la variación del ángulo de la radiación de fluorescencia polarizada, que emite el fluoróforo tras excitación. Si existen las CCTD marcadas con fluoróforo en los anticuerpos, pueden girar poco, pero bien de forma libre, en el intervalo de tiempo entre la absorción y la emisión de la radiación. La polarización es grande (variación del ángulo de la radiación emitida pequeña) para una concentración de CCTD baja y pequeña (variación del ángulo grande) para una concentración de CCTD alta.

La determinación inmumológica de CCTD según la invención puede llevarse a cabo asimismo como ensayo tipo sándwich, cuando las CCTD que se desean determinar, o subgrupos o subespecies de CCTD, presentan al menos dos epitopos diferentes o se deja transformar, mediante una reacción específica, en una sustancia con al menos dos epitopos diferentes. En este caso es posible llevar a cabo un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas de CCTD (CCTD-ELISA). El anticuerpo de anti-CCTD está acoplado a una fase sólida, p. ej. una depresión de placa microtiter, partícula magnética, perlas de plástico o a una pared de un tubito. Si se añade la muestra correspondientemente preparada, las CCTD de la muestra enlazan con los anticuerpos. La cantidad de antígeno CCTD enlazada se averigua mediante la adición de un anticuerpo secundario marcado, que enlaza con el antígeno CCTD con la formación de un sándwich. Cuanto mayor sea la concentración de las CCTD enlazadas, tanto mayor es la cantidad enlazada en el sándwich, p. ej. mediante un anticuerpo secundario marcado con enzima. Para una banda de concentración de CCTD determinada existe una relación lineal entre la concentración de CCTD y la actividad del enzima.

Un procedimiento de determinación según la invención similar es el inmunoensayo de micropartículas de enzimas de CCTD (CCTD-MEIA) en el cual el anticuerpo de anti-CCTD está ligado a microperlitas. En un primer paso la muestra es incubada con las microperlitas de anticuerpo, entonces se añade un anticuerpo secundario marcado con fosfatasa alcalina (AP). Se produce la formación de un sándwich en la microperlita. En otro paso se pipetea una parte de la mezcla de reacción sobre una matriz de fibra de vidrio, la cual tiene una elevada afinidad con las microperlitas y que las enlaza. Tras lavar la matriz de fibra de vidrio con solución de substrato y la retirada de anticuerpo secundario marcado con AP no enlazado se puede el AP enlazado como sándwich a las microperlitas disociar, p. ej. del substrato metil-umberiferil-fosfato, el grupo fosfato. La fluorescencia del metil-umbeliferón se mide con luz incidente para 448 nm. Las técnicas sándwich son inadecuadas para moléculas pequeñas con únicamente un epitopo y sólo se pueden utilizar con las CCTD que están elegidas de un grupo de CCTD con al menos dos epitopos o con las CCTD que se dejan transformar, mediante una reacción química específica, en moléculas análogas con al menos 2 epitopos.

Se pueden llevar a cabo otras variantes y especificaciones de las determinación de CCTD inmunológica. Entre ellas cuentan determinación de antígenos inmunológicas directas, determinaciones como complejos inmunes solubles, determinaciones de antígenos indirectas, otras determinaciones de antígeno o anticuerpos mediante marcado del compañero de reacción, ensayos de unión de ligandos y otros inmunoensayos heterogénos y homogéneos. En el marco de la determinación de CCTD inmunológica se pueden utilizar técnicas de separación tales como la adsorción, la precipitación, la precipitación inmune y/o el principio de fases sólidas así como diferentes técnicas de marcado, como Label radiactivo (p, ej. ^{125}I), Label enzimático (p. ej. fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano, glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa), Label de fluorescencia y Label de luminiscencia (p. ej. quimioluminiscencia, bioluminiscencia). El criterio decisivo es la determinación específica de CCTD o su subgrupo o subespecie de CCTD o de los productos de reacción mencionados y la utilización para el diagnóstico de síndromes coronarios agudos.

En los métodos cromatográficos según la invención para la determinación de las CCTD se lleva a cabo, por ejemplo tras la preparación de la muestra, una transferencia de materia mediante el reparto entre una fase en reposo (estacionaria) y una en movimiento (móvil) con afirmaciones cualitativas y cuantitativas correspondientes respecto de las CCTD. La determinación según la invención de CCTD se puede llevar a cabo al mismo tiempo sobre la base del método de Brouwers (Brouwers, J.F.H. et al., 1998, J Lipid Res 39: 344-353). Tras la preparación de la muestra y extracción del lípido se separan, en primer lugar, fostatidilcolinas y otros lípidos. Esto se puede llevar a cabo mediante cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) p. ej. como HPLC de fases normales (NP-HPLC). Tras las correspondiente separación y recogida de los eluatos se lleva a cabo una cromatografía de fases inversas (RP-HPLC), por ejemplo con acetonitrilo, metanol y trietilamina como disolvente. Como sistema detector es adecuada una Light-Scattering-Detection. Mediante la investigación de soluciones estándar en combinación con determinaciones de fósforo se pueden elaborar curvas de calibración de manera que sea posible una determinación cuantitativa de las CCTD y en especial también la determinación de ciertas subespecies de CCTD.

Los métodos de determinación cromatográficos e inmunológicos tienen, al mismo tiempo la ventaja, en comparación con el método de RMN, de determinar de manera específica p. ej. una subespecie determinada de plamenilcolina, con un grupo alquenilo definido en la posición sn-1 y un grupo acilo determinado en la posición sn-2, o diferenciarla de otras moléculas similares y aumentar con ello la especificidad de órgano del procedimiento.

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Para el especialista en la materia es evidente que además de los métodos mencionados más arriba se pueden utilizar asimismo procedimientos de determinación similares para la determinación según la invención de productos de reacción de CCTD.

Para la determinación de subespecies de CCTD según la invención son especialmente adecuadas moléculas en las cuales permanece pequeño el número de resultados del test falsamente positivos durante el diagnóstico de síndromes coronarios agudos. Entre otras subespecies son importantes las siguientes subespecies de CCTD, incluidos sus productos de reacción, y se pueden determinar individualmente o en combinación arbitraria para la realización según la invención del procedimiento: 16:0-20:3 plasmenilcolina; 16:0-18:3 plasmenilcolina; 17:0-18:2 plasmenilcolina; 15:0-18:2 plasmenilcolina; 17:0-18:1 plasmenilcolina; 17:0-18:3 plasmenilcolina; 16:0-17:1 plasmenilcolina; 14:0-18:2 plasmenilcolina; 15:0-18:1 plasmenilcolina; 16:0 lisoplasmenilcolina; 17:0 lisoplasmenilcolina; 15:0 lisoplasmenilcolina; 14:0 lisoplasmenilcolina y los productos de reacción 16:0(alq-1-enil)-20:3 glicerol, 16:0(alq-1-enil)-18:3 glicerol, 17:0(alq-1-enil)-18:2 glicerol, 15:0(alq-1-enil)-18:2 glicerol, 17:0(alq-1-enil)-18:1 glicerol, 17:0(alq-1-enil)-18:3 glicerol, 16:0(alq-1-enil)-17:1 glicerol, 14:0(alq-1-enil)-18:2 glicerol, 15:0(alq-1-enil)-18:1 glicerol, 16:0(alq-1-enil)-20:3 glicerolfosfato, 16:0(alq-1-enil)-18:3 glicerolfosfato, 17:0(alq-1-enil)-18:2 glicerolfosfato, 15:0(alq-1-enil)-18:2 glicerolfosfato, 17:0(alq-1-enil)-18:1 glicerolfosfato, 17:0(alq-1-enil)-18:3 glicerolfosfato, 16:0(alq-1-enil)-17:1 glicerolfosfato, 14:0(alq-1-enil)-18:2 glicerolfosfato y 15:0(alq-1-enil)-18:1 glicerolfosfato. Para el procedimiento según la invención se pueden elegir otras subespecies de CCTD y productos de reacción siempre que con su determinación se satisfagan las características según la invención.

Durante la realización del procedimiento de la espectroscopía de RMN se pueden incluir, además del análisis de singletes N^{+} (CH_{3})_{3}, también otras porciones de molécula en el análisis. Además la espectroscopía de RMN se puede llevar a cabo como espectroscopía de RMN mono-, bi- y polidimensional o mediante otras técnicas de investigación de espectroscopía de RMN, entre otras, también el acoplamiento, p. ej. a procedimientos cromatográficos (por ejemplo como LC-RMN).

El hecho común de las diferentes posibilidades de métodos y técnicas de determinación según la invención reside en que la especificidad del método para las CCTD es alta, de tal manera que se satisfacen las características según la invención del diagnóstico temprano de síndromes coronarios agudos. Para la determinación selectiva de CCTD liberadas de forma cardíaca con un procedimiento según la invención pueden ser al mismo tiempo importantes determinados pasos de la preparación de las muestras. Así se reduce, por ejemplo, en la sistemática descrita, mediante la ultrafiltración preanalítica, la cantidad de diacil-fosfolípidos de colina hepáticos ligados a proteína que no son según la invención, o dependiendo del filtro se eliminan también por completo, mientras que la fracción libre soluble de las CCTD liberadas de forma cardíaca, incluidos los plasmalógenos, es medida en el ultrafiltrado. Se pueden utilizar otros pasos metódicos de la depuración y/o extracción o modificación bioquímica y conducir a resultados comparables. Además el procedimiento según la invención se puede llevar a cabo de tal manera que sean analizadas una, varias o todas las subespecies moleculares de las CCTD liberadas de forma cardíaca o sus productos de reacción.

Además de la determinación de las CCTD la espectroscopía-^{1}H-RMN ofrece la posibilidad de determinar, en el mismo proceso de investigación, otros metabolitos, como creatina (singlete en 3,93 ppm) y dimetilamina (singlete en 2,727 ppm), los cuales son importantes asimismo para el diagnóstico del infarto. La combinación de la evaluación de varios metabolitos en un proceso de investigación (p. ej. CCTD, creatina y dimetilamina) se designa aquí como Pattern-Recognition (reconocimiento de muestras). Frente a la determinación aislada de la concentración de las CCTD, la evaluación mediante Pattern-Recognition Modus mejora el valor informativo diagnóstico del método para el reconocimiento de síndromes coronarios agudos.

Evaluación de los resultados de medición de CCTD

La evaluación de los resultados de medición se lleva a cabo teniendo en cuenta un valor límite. El valor límite depende del líquido corporal investigado y del método de determinación elegido y debe ser fijado mediante investigaciones correspondientes. Si el valor de medición para las CCTD es superior al valor límite, se está ante un infarto de miocardio agudo. Cuando el valor de medición es inferior al valor límite se puede excluir casi un infarto de miocardio agudo. Lo análogo es válido para el diagnóstico de la angina de pecho inestable, donde los valores límite deben ser establecidos mediante la investigación de un número suficiente de pacientes y con vistas al modo de plantear la pregunta diagnóstica. En la sistemática de la determinación de la concentración de CCTD llevada a cabo por nosotros el valor límite está, dependiendo del modo de evaluación, entre 15-40 \mumol/l. Los datos clínicos representados se refieren a la evaluación con un valor límite de 22 \mumol/l. Al mismo tiempo hay que determinar el valor límite, como se ha mencionado con anterioridad, en cada caso para la sistemática analítica elegida, el modo de evaluación y el modo preciso de plantear la pregunta y se puede encontrar, p. ej. en la determinación inmunológica o cromatográfica de subespecies de CCTD, también en otro margen de medición, p. ej. en el margen nanomolar o subnanomolar.

Durante la realización de la espectroscopía ^{1}H-RMN se puede llevar a cabo, además de la determinación aislada de la concentración de CCTD, una evaluación en Pattern-Recognition-Modus (p. ej. determinación adicional de creatina y dimetilamina). Durante la evaluación en el Pattern-Recognition-Modus se usó el aumento de CCTD o creatina, para concentraciones simultáneamente normales de dimetilamina, para el diagnóstico del AMI.

Diagnósticos en pacientes

En total se investigaron 20 pacientes y personas de prueba (8 mujeres, 12 hombres) con edades comprendidas entre 22-68 años, parcialmente de manera periódica, con un total de 44 muestras. Otras muestras fueron investigadas con modos especiales de plantear la pregunta. 10 pacientes padecieron un infarto de miocardio agudo (4 infarto de la pared anterior; 6 infarto de la pared posterior). Las muestras fueron obtenidas en intervalos diferentes 1 h - 35 h después del inicio del dolor. 60% de las muestras fueron obtenidas en las primeras 6 horas tras el inicio del dolor. Todos los pacientes con AMI fueron sometidos a angiografía coronaria (9 pac. aguda y 1 pac. en el transcurso). En 9 pacientes con AMI se llevaron a cabo una terapia de reperfusión, es decir, trombólisis, angioplastiac coronaria transluminal percutánea primaria (PTCA), trombólisis con Rescue-PTCA o operación de bypass venoso aortocoronaria aguda (ACVB-OP). En una paciente se presentó, en la angiografía coronaria llevada a cabo de manera aguda, una recanalización espontánea en el vaso del infarto y un trombo residual con una buena circulación postesteníca, de manera que ya no se llevó a cabo ninguna PTCA-primaria. En el grupo de comparación un paciente con fuertes dolores torácicos agudos fue sometido de forma aguda a angiografía coronaria, pudiendo excluirse una dolencia cardíaca coronaria. En el grupo de comparación existían diferentes enfermedades como angina de pecho inestable, angina de pecho estable, trauma del músculo esquelético, miopatía, desventajosamente embolia pulmonar, pleuritis e insuficiencia renal. En los pacientes con infarto de miocardio agudo se presentó una muestra típica de complicaciones como insuficiencia de la parte izquierda del corazón y perturbaciones del ritmo cardíaco. Un paciente con un infarto de la pared anterior entró en un shock cardiógeno de obligada reanimación, al cual sobrevivió sin embargo tras trombólisis, PTCA-agudo con implantación de Stent e implantación intraaortal de bombas de globo (IABP).

En todas las muestras se llevó a cabo una determinación de la concentración de CCTD.

La evaluación de los resultados de medición de CCTD tuvo lugar teniendo en cuenta el valor límite averiguado. Como se ha dicho con anterioridad, los valores de medición superiores al valor límite indican un infarto de miocardio agudo. En el caso de valores de medición inferiores al valor límite no existe por el contrario ningún infarto de miocardio agudo. La determinación del valor diagnóstico se llevó a cabo referido a las muestras, es decir, la evaluación del resultado de medición individual se llevó a cabo de manera independiente de los resultados de medición anteriores o posteriores del paciente. En 29 de las 30 muestras de infarto las CCTD estaban incrementadas por encima del valor límite. Y viceversa, a excepción de una muestra, las CCTD de todos los pacientes sin infarto eran inferiores al valor límite. La Fig. 3 muestra los datos del valor diagnóstico de las CCTD para el diagnóstico de un infarto de miocardio agudo para el intervalo de tiempo total de 0-35 h. La Fig. 3 muestra que las CCTD con un 96,6% tienen la mayor sensibilidad y con un 95,4% la mayor eficacia diagnóstica en comparación con todos los demás marcadores de infarto. El alto valor diagnóstico de las CCTD es también notable porque se investigaron muchos pacientes diagnósticamente difíciles, es decir, pacientes con microinfartos (4 de 10 pacientes), pacientes en las primeras horas del infarto y pacientes con trauma del músculo esquelético.

Las CCTD fueron superiores a los marcadores de infarto convencionales, en cuanto a su valor diagnóstico, en especial en la fase temprana del AMI. Todos los pacientes de infarto en el intervalo de tiempo de 0 a 6 horas después del inicio del dolor dieron CCTD positivo, mientras que únicamente un 37,5% de las muestras de pacientes tenían CK o CK-MB patológicos (ver Fig. 4). La mioglobina tuvo, en correspondencia con su rápida cinética de liberación, la segunda sensibilidad más alta con un 62,5% si bien, como es sabido, no es específica del miocardio. En las primeras 6 h únicamente un 50% de las muestras de los pacientes con AMI presentaron una concentración I/T patológica de troponina.

Las ventajas de las CCTD quedan patentes con mayor claridad cuando se contemplan únicamente las muestras de pacientes en las horas 0-3 después del inicio del dolor (Fig. 5). Mientras que los marcadores de infarto convencionales apenas poseen valor informativo en las tres primeras horas tras el inicio del dolor y tienen una eficacia diagnóstica comprendida entre 50% y 71%, las CCTD reconocen todas las muestras de infarto investigadas en las primeras 3 h tras el inicio del dolor. Otros resultados de investigación de la solicitante confirman la rápida liberación de las CCTD en caso de síndrome coronario agudo y su elevada valor informativo diagnóstico en la fase temprana tras el inicio de la sintomatología. En la fase tardía del AMI se produce una reducida reducción de la sensibilidad de las CCTD.

La Fig. 6 muestra el valor diagnóstico de las CCTD en la fase tardía del AMI. En la fase tardía del AMI la sensibilidad de las CCTD estaba en 91,6%. En una muestra se produjo un resultado del test falsamente negativo.

Un aumento de las CCTD fue en un 92,8% específico para un infarto de miocardio agudo. En una muestra existió asimismo un aumento de las CCTD, sin que existiese un infarto de miocardio agudo.

La evaluación de los espectros ^{1}H-RMN en el Pattern-Recognition-Modus (determinación simultánea de las CCTD, de sus productos de reacción, creatina y dimetilamina, así como de combinaciones adecuadas discrecionales de ellas) mejoró el valor informativo diagnóstico del método, de tal manera que en las investigaciones llevadas a cabo hasta ahora todos los infartos de miocardio pudieron ser diagnosticados o excluidos con un 100% de sensibilidad y un 100% de especificidad en cualquier instante.

Los pacientes con angina de pecho inestable tienen de forma conocida un pronóstico peor cuando en el transcurso se determinan valores aumentados de troponina cardíaca (Ohman, E.M. 1996, N Engl J Med 335: 1333-41). Se supone que estos pacientes sufren no sólo una isquemia de miocardio sino que sufren también micronecrosis de miocardio, de tal manera que no cabe excluir que estos pacientes en el futuro sean clasificados como microinfartos en nuevas clasificaciones del AMI. La rápida identificación de este tipo de pacientes es importante dado que, por regla general, debe aplicarse una terapia sin pérdida de tiempo y, en su caso, hay que llevar a cabo en caso necesario una angiografía. Las investigaciones de la solicitante demuestran que los pacientes con angina de pecho y desarrollo sin complicaciones no presentan CCTD aumentadas, por el contrario todos los pacientes con micronecrosis del miocardio presentan valores aumentados de CCTD. De acuerdo con los resultados obtenidos hasta ahora todos los pacientes con síndromes coronarios agudos, que son positivos CCTD, desarrollan, durante el transcurso, valores de troponina aumentados. Las investigaciones seriales demuestran asimismo que en pacientes con micronecrosis las CCTD eran, varias horas antes, positivas como troponina I o troponina T. Además hay que partir de que el procedimiento es asimismo de gran ayuda para el diagnóstico de isquemias severas de miocardio, p. ej. en cateterismos en coronarias o en enfermedades con participación del miocardio, p. ej. miocarditis. Los resultados de la solicitante demuestran que el procedimiento es valioso tanto en el infarto de miocardio agudo como también en la angina de pecho inestable, es decir, en general en caso de sospecha de un síndrome coronario agudo.

Dado que las CCTD liberadas son metabolizadas o modificadas mediante diferentes procesos bioquímicos aparecen, además de colina, derivados de la colina y derivados del trimetilamonio, también de manera incrementada también productos de reacción de las CCTD. Estos productos de reacción pueden ser fragmentos o ciertos metabolitos de las CCTD. Como se conoce, p. ej., para las isoenzimas-CK, la determinación simultánea de estos productos de reacción de marcadores de infarto puede ser diagnósticamente favorable. Las investigaciones de la solicitante muestran en parte de los pacientes de infarto indicaciones sobre la formación de estos productos de reacción de CCTD. La formación de los productos de reacción se debe, entre otras cosas, a la actividad incrementada de ciertas fosfolipasas. Además de la fosfolipasa A_{2}, que contribuye entre otras cosas a la liberación de la lisoplasmenilcolina mencionada, existen, como se ha mencionado al principio, otros enzimas importantes de este grupo las fosfolipasas C y D. Los productos de reacción de la actividad de esta dos fosfolipasas, actuando sobre los plasmalógenos, son, p. ej. glicerol sustituido 1-O-alq-1'-enil-2 (mediante fosfolipasa C) o glicerolfosfato sustituido 1-O-alq-1'-enil-2 (por fosfolipasa D). Estos productos de reacción son formados, junto con colina o fosforilcolina, de manera incrementada cuando, en caso de isquemia de miocardio, las fosfolipasas mencionadas actúan sobre plasmenilcolina. Por consiguiente el procedimiento es también posible mediante la demostración de los productos de reacción sencillos de las CCTD, en su caso en combinación con determinaciones de CCTD.

Desarrollo temporal de la liberación de CCTD durante el infarto de miocardio agudo

El análisis de todos los valores de medición para CCTD disponibles (con exclusión de una muestra no representativa) demostró que las CCTD dentro de 60 min. tras el inicio del dolor se hacen positivas y al parecer tienen una cinética de liberación bifásica con un máximo temprano tras 2-3 h y un segundo máximo tras 5-6 h. La comparación con otros marcadores de infarto demostró que la cinética de liberación de las CCTD, en correspondencia con el peso molecular bajo, es notablemente más rápida que la liberación de los marcadores hasta ahora conocidos, lo que explica el elevado valor diagnóstico en la fase temprana.

Otras investigaciones llevadas a cabo por la solicitante con más de 100 pacientes con dolores de pecho pudieron confirmar la superioridad del procedimiento según la invención respecto de marcadores convencionales así como las propiedades según la invención para el diagnóstico temprano de síndromes coronarios agudos.

El procedimiento para el reconocimiento del infarto de miocardio agudo y de formas severas de la angina de pecho inestable mediante la determinación y evaluación del contenido en colina, derivados de colina y/o derivados de trimetilamonio, elegidos del grupo que consta de fosforilcolina, plasmalógenos y lisoplasmenilcolina, y sus productos de reacción sencillos en fluidos corporales parece ser superior a todos los procedimientos no invasivos introducidos hasta ahora, incluida la determinación de marcadores bioquímicos conocidos, para el diagnóstico de síndromes coronarios agudos. Además del infarto de miocardio agudo pueden reconocerse, de forma más temprana mediante el procedimiento, asimismo formas severas de la angina de pecho inestable con necrosis miocitarias, las cuales en el transcurso presentan valores de troponina aumentados. Los resultados demuestran que el procedimiento es valioso tanto para el infarto de miocardio agudo como también para la angina de pecho inestable, es decir, en general en caso de sospecha de un síndrome coronario agudo. El valor especial de la invención se subraya además también porque con el procedimiento in vitro según la invención será posible, por vez primera, diagnosticar con seguridad o establecer un diagnóstico excluyente en pacientes con síndromes coronarios agudos e infarto de miocardio agudo, de manera temprana, es decir en las tres primeras horas tras el inicio del dolor. Esto no es posible, con una seguridad comparablemente alta, con ningún procedimiento in vitro publicado. La American Heart Association y el American College of Cardiology establecen que "existe una necesidad clara de mejores métodos para la rápida identificación de pacientes con infarto de miocardio agudo, que deben ser utilizables de forma tan precisa y tan temprana como sea posible" (traducido de Ryan, T.J. et al. ACC/AHA Guidelines for the Management of Patients with Acute Myocardial Infarction, 1996, J Am Coll Cardiol 28: 1328-1428, pág. 1340). Un método como éste no existe en la actualidad y, de acuerdo con los datos de los que dispone la solicitante, el procedimiento según la invención satisface exactamente las propiedades exigidas.

El procedimiento se refiere a un diagnóstico de los cuadros clínicos claramente definidos de síndromes coronarios agudos, que comprenden la angina de pecho inestable y el infarto de miocardio agudo, que puede transcurrir como infarto de miocardio con onda Q o sin onda Q. Las investigaciones de otros cuadros clínicos, como p. ej. infarto cerebral, que en cuanto a su patomorfología y patobioquímica son en muchos aspectos diferentes, no permiten establecer analogías con respecto al procedimiento según la invención.

La realización de un procedimiento según la invención para el diagnóstico temprano de síndromes coronarios agudos es posible con diferentes métodos de determinación o técnicas, toda vez que resultados de medición equivalentes de determinadas sustancias se pueden constatar con frecuencia con métodos diferentes, que en el caso de las CCTD han sido descritos de múltiples formas en la literatura. El procedimiento comprende, además de la elección de un método de medición adecuado, la elección de un líquido corporal adecuado, la preparación de las muestras de manera adecuada para el procedimiento y los métodos, la medición específica del contenido en CCTD y/o de sus productos de reacción, elegidos del grupo que comprende glicerol sustituido 1-O-alq-1'-enil-2 y glicerolfosfato sustituido 1-O-alq-1'-enil-2, y la evaluación adecuada al procedimiento para el diagnóstico de pacientes con síndromes coronarios agudos. Dado que la liberación de las CCTD tiene lugar en otros líquidos corporales y partes del cuerpo diferentes, la utilización del procedimiento es posible también en investigaciones de otras partes del cuerpo, p. ej. muestras de tejido. Al mismo tiempo está reducido posiblemente sin embargo el valor diagnóstico en comparación con el ejemplo de utilización descrito. Dado que en el marco de la liberación de las CCTD resultan también de manera incrementada productos de reacción de las CCTD, elegidos del grupo que comprende glicerol sustituido 1-O-alq-1'-enil-2 y glicerolfosfato sustituido 1-O-alq-1'-enil-2, el procedimiento es posible con ello también mediante la demostración de este tipo de productos de reacción. Además es posible que el procedimiento sea llevado a cabo de tal manera que se hagan afirmaciones semicuantitativas o cualitativas, es decir, que p. ej. test rápidos para CCTD indiquen, mediante una reacción cromática, únicamente si hay un infarto de miocardio o no. El procedimiento se puede llevar a cabo de tal manera que se pueden observar o provocar estados o procesos los cuales son determinados por el contenido en CCTD o productos de reacción de CCTD. Además del reconocimiento de síndromes coronarios agudos el proceso ofrece esperanza sobre otras informaciones diagnósticas como tamaño del infarto, pronóstico, control de la terapia y predicción de determinadas complicaciones, riesgos y de la evolución clínica. El valor especial del procedimiento según la invención es realzado porque presenta las propiedades diagnósticas que desde hace tiempo han exigido comisiones de expertos internacionales, tales como la American Heart Association y el American College of Cardiology para procedimientos in vitro para el diagnóstico temprano de síndromes coronarios agudos.

En suma el procedimiento debe ayudar a reducir los grandes problemas del diagnóstico temprano actual de síndromes coronarios agudos y a mejorar el diagnóstico o la terapia de los pacientes que los padecen.

Las características expuestas en la descripción anterior, las reivindicaciones y el dibujo pueden ser importantes, individualmente o también en combinación discrecional, para la realización de la invención.

Claims (7)

1. Procedimiento in vitro para el reconocimiento y diagnóstico de síndromes coronarios agudos, en especial del infarto de miocardio agudo, caracterizado porque el contenido de colina, derivados de la colina y/o derivados del trimetilamonio, seleccionados de entre el grupo que consta de fosforilcolina, plasmalógenos y lisoplasmenilcolina, se determina en muestras de líquidos corporales o muestras de partes del cuerpo.

2. Procedimiento in vitro según la reivindicación 1, caracterizado porque el contenido de colina, derivados de la colina y/o derivados del trimetilamonio, seleccionados de entre el grupo que consta de fosforilcolina, plasmalógenos y lisoplasmenilcolina, se evalúa teniendo en cuenta un valor límite.

3. Procedimiento in vitro para el reconocimiento y diagnóstico de síndromes coronarios agudos, en especial del infarto de miocardio agudo, caracterizado porque el contenido de productos de reacción de colina, derivados de la colina y/o derivados del trimetilamonio, seleccionados de entre el grupo que consta de fosforilcolina, plasmalógenos y lisoplasmenilcolina, se determina en muestras de partes del cuerpo, donde los productos de reacción se seleccionan de entre el grupo que consta de glicerol sustituido en 1-O-alq-1'-enil-2 y glicerolfosfato sustituido en

\hbox{1-O-alq-1'-enil-2.}

4. Procedimiento in vitro para el reconocimiento y diagnóstico de síndromes coronarios agudos, en especial del infarto de miocardio agudo, caracterizado porque en muestras de líquidos corporales o muestras de partes del cuerpo se llevan a cabo observaciones cuantitativas, semicuantitativas o cualitativas las cuales son determinadas por el contenido en colina, derivados de la colina y/o derivados del trimetilamonio, seleccionados de entre el grupo que consta de fosforilcolina, plasmalógenos y lisoplasmenilcolina, y/o sus productos de reacción, seleccionados de entre el grupo que comprende glicerol sustituido en 1-O-alq-1'-enil-2 y glicerolfosfato sustituido en 1-O-alq-1'-enil-2.

5. Procedimiento in vitro según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque para la determinación de colina, derivados de la colina y/o derivados del trimetilamonio, seleccionados de entre el grupo que consta de fosforilcolina, plasmalógenos y lisoplasmenilcolina, y/o de sus productos de reacción, seleccionados de entre el grupo que comprende glicerol sustituido en 1-O-alq-1'-enil-2 y glicerolfosfato sustituido en 1-O-alq-1'-enil-2, se utilizan métodos de resonancia magnética nuclear (RMN), métodos enzimáticos, inmunológicos, cromatográficos, de espectroscopía de masas, electroquímicos, fotométricos o métodos en los cuales, mediante la adición de reactivos (p. ej. enzimas) se generan reacciones químicas o productos de reacción los cuales hacen posible entonces la detección y medición de la totalidad del grupo, de un subgrupo o de una subespecie de CCTD.

6. Procedimiento in vitro para el reconocimiento y detección de síndromes coronarios agudos, en especial del infarto de miocardio agudo, caracterizado porque se realiza una espectroscopía RMN de muestras de líquidos corporales y muestras de partes del cuerpo y la evaluación se lleva acabo mediante un "reconocimiento de muestras" (Pattern-Recognition) de varias sustancias, comprendiendo colina, derivados de la colina y/o derivados del trimetilamonio, elegidos del grupo que consta de fosforilcolina, plasmalógenos y lisoplasmenilcolina, los productos de reacción, seleccionados de entre el grupo que comprende glicerol sustituido en 1-O-alq-1'-enil-2 y glicerolfosfato sustituido en
1-O-alq-1'-enil-2, y creatina y dimetilamina.

7. Procedimiento in vitro según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se lleva a cabo una determinación de colina, derivados de colina y/o derivados del trimetilamonio, seleccionados de entre el grupo que consta de fosforilcolina, plasmalógenos y lisoplasmenilcolina, y/o de sus productos de reacción, seleccionados de entre el grupo que comprende glicerol sustituido en 1-O-alq-1'-enil-2 y glicerolfosfato sustituido en 1-O-alq-1'-enil-2, en una muestra de líquido corporal, siendo seleccionado el líquido corporal de entre un grupo que comprende suero, plasma, sangre entera, muestras de sangre preparadas y orina.