ES2202287T3 - Compuestos de marcaje. - Google Patents

Abstract

Un compuesto que comprende una porción específica de célula marcada y una porción citotóxica, caracterizado porque la segunda porción citotóxica es una caspasa constitutivamente activa o tiene esencialmente la misma actividad inductora de apoptosis como dicha caspasa, sin necesidad de activación por otros componentes de la cascada apoptótica.

Description

Compuestos de marcaje.

La presente invención se refiere a compuestos, algunos de los cuales pueden indirectamente ser combinaciones citotóxicas de compuestos que tienen una alta avidez para, y pueden ser direccionados hacia, células seleccionadas.

Antecedentes

Se ha propuesto el direccionamiento específico a células de compuestos que son directamente o indirectamente citotóxicos como una manera de combatir enfermedades, como el cáncer. Bagshawe y sus colaboradores han revelado (Bagshawe (1987) Br. J. Cancer 56, 531, Bagshawe et al (1988) Br. J. Cancer 58, 700, WO 88/07378) compuestos conjugados que comprenden un anticuerpo, o una de sus partes, y una enzima, siendo el anticuerpo específico a los antígenos de células tumorales y la enzima que actúa para convertir un pro fármaco inocuo en un compuesto citotóxico. Los compuestos citotóxicos fueron agentes alquilantes, por ejemplo, una mostaza del ácido benzoico liberada del ácido para-N-bis(2-cloroetil)aminobenzoíl glutámico por la acción de la enzima CPG2 de Pseudomonas sp.

Epenetos y colaboradores han revelado un sistema alternativo que usa diferentes profármacos (documento WO 91/11201). Los compuestos citotóxicos fueron monosacáridos o disacáridos cianogénicos, como el compuesto de la planta amigdalina que libera cianuro por acción de una glucosidasa y una hidroxinitril liasa.

En un sistema alternativo adicional, se ha revelado el uso de conjugados anticuerpo-enzima que contienen la enzima fosfatasa alcalina en combinación con el profármaco etoposido 4'-fosafato o 7-(2-aminoetilfosfato)mitomicina o su combinación (EP 0 302 473, Senter et. al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4842).

El documento WO-A-92 08 495 describe los conjugados TNF, IL-2, Limfotoxina y GM- CSF que inducen la apoptosis.

Rybak y colaboradores han revelado (Rybak et al (1991) J. Biol. Chem. 266, 21202, WO 91/16069) el potencial citotóxico de una ribonucleasa monomérica pancreática cuando se inyectó directamente a Xenopus oocitos y el potencial citotóxico de la RNasa monomérica acoplada a transferina humana o anticuerpos dirigidos contra el receptor de transferina. Las proteínas híbridas de RNasa monomérica fueron citotóxicas para células de eritroleucemia humanas in vitro.

Otros enfoques son la aplicación in vivo de anticuerpos conjugados de estreptavidinaa seguida, después de un período apropiado, por biotina radiactiva (Hnatowich et al (1988) J. Nucl. Med. 29, 1428-1434), o la inyección de mAb biotinilada seguida por estreptavidina radiactiva (Paganelli et al (1990) Int. J. Cancer 45, 1184-1189). Se condujo un estudio piloto de radioinmunolocalisación en células de carcinomas pulmonares no pequeños con resultados alentadores (Kalofonos et al (1990) J. Nucl. Med. 31, 1791-1796).

Aparte de estos ejemplos, es bastante más común ver anticuerpos biotinilados y conjugados estreptavidina-enzima, los que se usan en ensayos de inmunosorsorción de enzima ligada.

Estos sistemas anteriores han usado conjugados relativamente grandes de anticuerpo-enzima, anticuerpo-estreptavidina o anticuerpo-biotina y pueden comprender porciones, cuyo origen no son mamíferos las que son altamente los inmunoreactivas.

Se ha demostrado una rápida penetración (Yokota et al (1992) Cancer Res. 52, 3402-3408) y un balance rápido (Colcher et al (1990) J. Natl. Cancer Inst. 82, 1191-1197) para fragmentos de cadena simple de anticuerpos de Fv (ScFv).

Al usar los reactivos específicos a células, anteriormente mencionados, en una situación terapéuticamente adecuada, uno de los requisitos que se necesita reunir es que el reactivo específico a células se aumente a un nivel lo suficientemente mayor en la célula marcada que en otras células. Un requisito adicional es que el reactivo directa o indirectamente citotóxico se haga llegar a la célula marcada, y se prefiere que dicho reactivo citotóxico sea de alta potencia.

Nosotros ahora hemos ideado sistemas mejorados, por lo menos, algunos de los cuales hacen uso de nuevos agentes, potentes e indirectamente citotóxicos.

Sumario de invención

Un primer aspecto de la invención proporciona un compuesto que comprende una porción específica de célula marcada y una porción citotóxica, caracterizado porque la porción citotóxica es constitutivamente una caspasa activa o tiene esencialmente la misma actividad de inducción de apoptosis como dicha caspasa.

Apoptosis, o "muerte celular programada", es una forma altamente organizada y evolutivamente conservada de muerte celular, en la que las células se destruyen deliberadamente. A diferencia de la necrosis, en donde a menudo la célula se mata como resultado de ataque químico o tóxico, durante la apoptosis la célula se desmantela intencionalmente de una manera sistemática, llegando a la producción de fragmentos subcelulares empaquetados en forma de membrana ("cuerpos apoptóticos").

La apoptosis es crítica a la salud de los organismos multicelulares ya que no se piensa que las células de mamíferos sean inmortales. Por ejemplo, el proceso es vital para esculpir el sistema nervioso durante el desarrollo y mantener el funcionamiento normal del sistema inmunológico. La disfunción de los mecanismos apoptóticos puede llegar a enfermar. Por ejemplo, cuando hay demasiado poca apoptosis, pueden ocurrir cáncer o enfermedad autoinmunológica, cuando hay demasiada apoptosis, pueden ocurrir daños por infarto o neurodegeneración (véase la revisión hecha por Reed (1999) J. Clin. Oncol. 17, 2941-2953, Wolf & Green (1999) J. Biol. Chem. 274, 20049-20052).

La cascada señalizadora que produce la apoptosis es compleja y diversa. En la superficie celular existen "Receptores de Muerte" (por ejemplo, receptores Fas o PRUEBA) que, cuando se activan, transmiten una señal de activación que produce los eventos apoptóticos (Ashkenazi & Dixit (1998) Science 281, 1305-1.308). Además, ataques que dañen el ADN, como la radiación UV o Rayos X, fármacos quimioterapéuticos e infección viral, pueden ser detectados por la célula y activar la muerte celular si la reparación fuese impracticable (Benjamin, Hiebsch & Jones (1998) Mol. Pharmacol. 53, 446-450).

Los estudios iniciales en el nematodo, Caenorhabditis elegans, reveló tres genes esenciales para la apoptosis, CED-3 y CED-4 (que promueven la apoptosis), y CED-9 (que inhibe la apoptosis). El CED-3 codifica una proteasa aspartato productora de cisteína ("caspasa"), que se activa por el CED-4 y se inactiva por el CED-9. Posteriormente a estos estudios iniciales, se han descubierto los correspondientes a los mamíferos para la mayoría de los genes del C. elegans, incluso un intervalo de caspasas relacionado con el CED-3.

En el centro de la ejecución de apoptosis se encuentra una cascada proteolítica que involucra a la familia de proteasas de la caspasa. Cada paso proteolítico es irreversible, llegando a la activación final de varios eventos que producen las características morfológicas de apoptosis (Reed (1999) J. Clin. Oncol. 17, 2941-295, Wolf & Green (1999) J. Biol. Chem. 274, 20049-20052).

Durante la ejecución de la apoptosis, las caspasas iniciadoras activan las caspasas efectoras que a su vez activan muchos eventos aguas abajo que finalmente llevan a la muerte celular apoptótica (Reed (1999) J. Clin. Oncol. 17, 2941-295, Wolf & Green (1999) J. Biol. Chem. 274, 20049-20052). Se cree que los primeros objetivos que serían escindidos son las proteínas proapoptóticas (por ejemplo, otras caspasas), lo que amplifica la señal para la muerte celular y reduce la actividad de proteínas antiapoptóticas (tales como Bcl-2/XL, Bid), reduciendo así la inhibición de la apoptosis. A medida que progresa la apoptosis, se producen componentes como CAD (por las siglas de su expresión inglesa, Caspase Activated Deoxyribonuclease) (Enari, Sakahira, Yokoyama et. al. (1998) Nature 391, 43-50), gelsolina, PAK2, MEKKI y PKCd, los que contribuyen directamente al fenotipo de apoptosis induciendo la fragmentación de ADN cromosomático y la ruptura del citoesqueleto. Las caspasas también escinden las proteínas estructurales como laminas, actina, queratinas, fodrina, Gas2, NuMa y SAF-UN, promoviendo la ruptura nuclear y descomposición del citoesqueleto. Otros sustratos para la escisión de la caspasa incluyen las proteínas homeostáticas como ADN-PKcs, PARP, U1-70KDa y los factores de transcripción, que están implicados en la prevención de la reparación celular y síntesis macromolecular.

Estos eventos desconectan esencialmente la célula, quitan el contacto con las células vecinas, reorganizan el interior para la ruptura y envían señales al sistema inmunológico de que la célula está marcada para fagocitosis después de su ruptura en los cuerpos apoptóticos.

La caspasa CED-3 original se relaciona con la enzima conversiva interleuquina- BIRF de mamíferos, denominada caspasa-1 o ICE. Esto llevó al descubrimiento de otras enzimas homólogas, algunas de las cuales están íntimamente envueltas en la cascada apoptótica. Todos estos homólogos son proenzimas de 30-50 kDa que se activan para formar heterodímeros que por sí mismos dimerizan para formar tetrámeros (Wilson, Black, Thomson et. al. (1994) Nature 370, 270-274, Rotonda, Nicholson, Fazil et. al. (1996) Nat. Struct. Biol. 3, 619-25). Los homólogos de la caspasa todos reconocen una secuencia de péptido 4-aminoácido y se escinden después del ácido aspártico (véase más abajo) (Thornberry, Rano, Peterson et. al. (1997) J. Biol. Chem. 272, 17907-17911).

Las caspasas inicialmente existen en forma de proenzimas inactivas que se expresan constitutivamente en las células vivientes y se regulan de una manera compleja, permitiéndoles que se active una senda rápida que produzca la destrucción celular. La interrelación entre las actividades de varias caspasas en esta senda apoptótica es compleja. Generalmente, las caspasas iniciadoras son activadas, llegando a su vez a la activación de caspasas efectoras (Tabla 1), que median los eventos destructivos (Reed (1999) J. Clin. Oncol. 17, 2941-2953, Wolf & Green (1999) J. Biol. Chem. 274, 20049-20052). La caspasa-8 iniciadora se activa por medio de receptores de muerte, mientras que la caspasa-9 iniciadora se activa por agentes citotóxicos. La caspasa-8 activa las caspasa-3 y -7, mientras que la caspasa-3 puede activar la caspasa-6. Las caspasa-3 y -6 van a efectuar los eventos apoptóticos nucleares. La caspasa-9 también activa las caspasas -3 y -7. Una vez activadas, las caspasa-3 y -7 (y posiblemente la -6), representan un compromiso irreversible para la muerte celular. En contraposición, la activación de caspasas de iniciación se puede bloquear todavía por los eventos antiapoptóticos. El papel de otras caspasas, como las caspasas -2, -4, -10 y -13 se entiende claramente.

TABLA 1

			Peso molecular de	Secuencia
Nombre	Nombre	Tipo de caspasa	(KDa) subunidades	preferente de
	alternativo		grandes/pequeñas	tetrapéptido
Caspasa-1^{1}	ICE/Ced	Procesadora de Citokina	20/10	(W/Y/F)-E H-D
Caspasa-2^{2}		Iniciadora	20/12	D-X-X-D
Caspasa-3^{3}	CPP-32	Efectora / Ejecutora	17/12	D-E-X-D
Caspasa-4^{4}		Procesadora de Citoquina	20/10	(W/Y/F)-E H-D
Caspasa-5^{5}		Procesadora de Citoquina	20/10	(W/Y/F)-E H-D
Caspasa-6^{6}	Mch-2	Efectora / Ejecutora	18/11	(V/T/I)-E-X-D
Caspasa-7^{7}	CMH-1	Efectora / ejecutora	20/12	D-E-X-D
Caspasa-8^{8}		Iniciadora	18/11	(L/V/D)-E-X-D
Caspasa-9^{9}	Mch6	Iniciadora	17/10	(I/V/L)-E-H-D
Caspasa-10^{10}		Iniciadora	17/12	Desconocida
Caspasa-11^{11}		Procesadora de Citoquina	20/10	Desconocida
Caspasa-12^{12}		Procesadora de Citoquina	20/10	Desconocida
Caspasa-13^{13}		Procesadora de Citoquina	20/10	Desconocida
Caspasa-14^{14}		Procesadora de Citoquina	20/10	Desconocida

Guía a la tabla 1

1

Thornberry et. al. (1992) Nature 356:766-774

2

Li et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:21010-75

3

Alnemri et al. (1996) Cell 87:171

4

Kamada et al. (1997) Oncogene 15:285-90

5

Kamada et al. (1997) Cell Death and Differentiation 4(6):473-478

6

LeBlanc et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:23426-36D

7

Marcelli et al. (1998) Cancer Res. 58:76-83

8

Scaffidi et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:26953-8

9

Srinivasula et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:27099-106

10

Ng et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:10301-8

11

Wang et al. (1998) Cell 92:501-95

12

Nakagawa et al. (2000) Nature 403:98-103

13

Humke et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:15702-7

14

Hu et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:29648-53

La Tabla 1 muestra las propiedades de varias caspasas conocidas.

Todos las caspasas comparten una estructura común. La pro-enzima de la caspasa contiene un pro-dominio N-terminal, una subunidad grande que contiene el sitio activo de cisteína (dentro de un motivo de QACXG conservado) y una subunidad pequeña que también aporta residuos al sitio activo de la inter-subunidad (Wilson, Black, Thomson et. al. (1994) Nature 370, 270-274, Rotonda, Nicholson, Fazil et al. (1996) Nat. Struct. Biol. 3, 619-625, Thornberry, Rano, Peterson et al. (1997) J. Biol. Chem. 272, 17907-17911). En auto-activación o activación por otras caspasas, el pro-dominio está escindido en un residuo aspartato y un enlazante del interdominio está escindido en uno o dos residuos aspartato, por consiguiente convierte la enzima de cadena simple en un heterodímero enzimáticamente activo (que comprende una subunidad grande y una subunidad pequeña). El heterodímero puede dimerisarse seguidamente en un tetrámero.

Cada sitio activo de caspasa tiene un "bolsillo S1" conservado positivamente cargado, para ligar el residuo de aspartato "Pl" negativamente cargado en el péptido del sustrato. Así, todas las caspasas escinden solamente después de los residuos aspartato. Sin embargo, los miembros de la familia de las caspasas exhiben diferentes especificidades de los sustratos peptídicos tetraméricos (véase La Tabla 1).

Las caspasas aguas arriba (o iniciadoras), por ejemplo las caspasas-2, -8, -9 y -10, tienen un prodominio grande, que se piensa que está involucrado en el reclutamiento de tales caspasas por "receptores de muerte" (véase Cohen, 1997, Biochem. 326:1-16, Kischkel et al., 1995, EMBO J., 14:5579-5588). La asociación de los receptores de iniciación con los complejos de muerte tiene lugar en estas enzimas atrayéndose entre sí a proximidad íntima lo que se piensa que facilita su activación por un proceso autocatalítico (Yang et al., 1988, Mol. Cell. 1:319-325, Muzio et al., 1998, J., Biol. Chem. 273:2926-2930).

En contraposición, las caspasas efectoras como la caspasa-3, -6 y -7 tienen prodominios más cortos y no se reclutan por los receptores de muerte. Como resultado, estas caspasas permanecen inactivas hasta ser activadas directamente por la caspasas iniciadoras por medio de la escisión proteolítica (Fernández-Alnemri et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 93:7464-7469, el Srinivasula et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 93:13706-13711). Una vez activadas, las caspasas efectoras desmantelan los componentes estructurales y reguladores importantes de la célula rápidamente, llevando al fenotipo apoptótico característico observado en células que sufren la apoptosis (Nicholson y Thornberry, 1997, Trends Biochem. Sci. 257:299-306). Por "una caspasa activa constitutivamente" nosotros incluimos una proteína o péptido que exhibe una actividad de proteasa para aspartato productor de cisteína lo suficiente como para inducir la apoptosis, es decir una caspasa en una forma activada. Alternativamente, la caspasa activa constitutivamente puede comprender un precursor de tal caspasa activa que puede auto-catalizar su conversión espontáneamente a caspasa activa.

Se apreciará que la porción citotóxica comprende una caspasa activa constitutivamente, o que tiene esencialmente la misma actividad de inducción de apoptosis como dichas caspasas, que puede actuar en cualquier punto de la cascada apoptótica de eventos (como se ha descrito anteriormente). Por ejemplo, la porción citotóxica puede comprender una variante activa constitutivamente de una caspasa efectora, como las caspasa-3, caspasa-6 o caspasa-7, que directamente activa los eventos apoptóticos aguas abajo. Alternativamente, la porción citotóxica puede comprender una variante activa constitutivamente de una caspasa iniciadora, como las caspasa-2, caspasa-8, caspasa 9 o caspasa-10, que actúa en las caspasas efectoras para inducir la apoptosis.

Cuando la porción citotóxica es una variante de una caspasa que se encuentra naturalmente, dicha variante es constitutivamente activa de forma tal que es espontáneamente activa sin necesidad de activación por otros componentes de la cascada apoptótica.

Se describen ejemplos de caspasas que se encuentran naturalmente en la Tabla 1. Por "una variante" nosotros incluimos porciones citotóxicas que comprenden una caspasa que se encuentra naturalmente en la que ha habido inserciones de aminoácido, eliminaciones o sustituciones, sean conservativas o no conservativas, de forma tal que los cambios obvian la necesidad de procesar el precursor de la caspasa natural, y que no reducen esencialmente la actividad de inducción de apoptosis de la variante comparada a la actividad de inducción de apoptosis de la caspasa que se encuentra naturalmente activada. Por ejemplo, la variante puede haber aumentado la actividad de inducción de apoptosis comparada con la actividad de inducción de apoptosis de la caspasa que se encuentra naturalmente.

Tales variantes se pueden confeccionar usando métodos de ingeniería de proteínas y mutagénesis direccionada, normalmente conocidos en la técnica (por ejemplo la patente de los EE.UU. 4.302.386).

Ejemplos de caspasas activas constitutivamente se describen en Srinivasula et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:10107-10111. Dichas caspasas son variantes de las caspasas-3 y -6 que se encuentran naturalmente, en las que las subunidades pequeñas y grandes se recolocan usando técnicas recombinantes. Específicamente, las posiciones de las subunidades se invierten de modo tal que el término C de la subunidad grande y el término N de la subunidad pequeña son libres, mientras los términos N de la subunidad grande y los términos C de la subunidad pequeña están físicamente vinculados. Esta reestructuración de las subunidades permite formar un sitio activo por el plegado espontáneo e interdigitación del término C libre de la subunidad grande y los términos N de la subunidad pequeña. En contraposición, en el precursor de la caspasa que se encuentra naturalmente, estas terminaciones son contiguas e incapaces de formar un sitio activo hasta liberarse por escisión del polipéptido precursor.

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Preferentemente, la porción citotóxica es una caspasa efectora activa constitutivamente o tiene esencialmente la misma actividad de inducción de apoptosis como dicha caspasa.

Más preferentemente, la porción citotóxica es una caspasa efectora activa constitutivamente seleccionada entre el grupo que consiste de caspasa-3, caspasa-6 y caspasa-7, o tiene esencialmente la misma actividad de inducción de apoptosis de dicha caspasa.

Se apreciará que la porción citotóxica puede comprender un fragmento de una caspasa activa constitutivamente, en la que el fragmento comprende por lo menos la porción activa catalíticamente de dicha caspasa activa constitutivamente. Así, la porción citotóxica puede comprender un péptido o fragmento de proteína que esencialmente retiene la actividad de inducción de apoptosis de una caspasa activa constitutivamente, por ejemplo, la porción citotóxica puede comprender el sitio activo de la caspasa activa constitutivamente.

Ventajosamente, la porción citotóxica es de origen mamífero, preferentemente humano. El uso de dichas proteínas de mamífero como porción directa o indirectamente citotóxica del compuesto de la invención es ventajoso ya que tales compuestos son menos probables de dar lugar a reacciones inmunes indeseables.

Preferentemente, la porción citotóxica del compuesto de la invención es capaz de oligomerización, por ejemplo, dimerización. La unión de la porción específica de la célula marcada con una porción citotóxica capaz de oligomerización proporciona un método para incrementar el número de sitios ligantes con la célula marcada. Por ejemplo, si la porción de la célula-específica marcada se une a una porción capaz de formar un dímero entonces el número de sitios ligantes a las células específicas marcadas es dos, si la porción específica de la célula marcada se une a una porción capaz de formar un tetrámero entonces el número de sitios ligantes de la célula específica marcada es cuatro. El número de sitios ligantes a la célula específica marcada es mayor que uno y los compuestos pueden por consiguiente tener una avidez mayor por la célula marcada que compuestos que sólo tienen un sitio ligante a la célula específica marcada.

Es preferible para la porción citotóxica del compuesto de la invención capaz de oligomerizar no contenga enlaces disulfuro intercadena ni intracadena, para ser bien caracterizada, para no ser tóxica, ser estable, ser dócil a la preparación en una forma conveniente para el uso preclínico o clínico, o estar en el uso preclínico o clínico, y para que los monómeros de la subunidad tengan una afinidad alta por cada otro, ésto es que contengan una o más subunidades de sitios ligantes.

Las personas experimentadas apreciarán que la actividad de la caspasa puede detectarse y/o medirse por una o más de las siguientes pruebas:

(i) Ensayos basados en la hidrólisis de sustratos D-E-V-D de tipo analógico que se escinden para dar un producto cuantificable por métodos colorimétricos (tales ensayos proporcionaran valores para las constantes de velocidad de ligamiento y catalizadoras, Km y kcat, respectivamente) (por ejemplo, véase Gurtu et al., 1997, Anal. Biochem. 251:98-102);

(ii) Ensayos que involucran la observación fisiológica de apoptosis celular, por ejemplo, usando la microscopía de video de tiempo transcurrido, en el que la apoptosis se caracteriza por la ampolladura de la membrana y encogimiento de la célula (por ejemplo, véase Loke et al., 1999, Eur. J. Inmunol. 29:1793-802, Weisser et al., 1998, Citometry 31:20-28, Ohta et al., 1998, Brain Tumor Pathol. 15:19-21),

(iii) Ensayo para los productos de apoptosis, como el ensayo TÚNEL, en el que se miden la cantidad de ADN degradado o los anticuerpos contra los sustratos degradados de escisión apoptótica (por ejemplo PARP) (Vakkala et al., 1999, Br. J. Cancer 81:592-599, Namura et al., 1998, J., Neurosci. 18:3659-3668).

Por porción "marcada de célula específica" denominamos la porción del compuesto que comprende uno o más sitios ligantes que reconocen y se ligan a las entidades en la célula marcada. En contacto con la célula marcada, la porción específica de célula marcada es internalizada junto con la porción citotóxica. Tal internalización produce que la porción citotóxica se entregue al citosol celular, donde tiene acceso a los numerosos sustratos de la caspasa que están envueltos en la cascada apoptótica.

Las entidades reconocidas por la porción específica de célula marcada se expresan predominantemente, y preferentemente exclusivamente, en dicha célula marcada. La porción específica de célula marcada puede contener uno o más sitios ligantes para entidades diferentes expresadas en el mismo tipo de célula marcada, o uno o más sitios ligantes para entidades diferentes expresadas en dos o más tipos de células marcadas diferentes.

Preferentemente, la porción específica de célula marcada reconoce con alta avidez la célula marcada.

Por "avidez alta" denominamos el que la porción específica de célula marcada reconoce la célula marcada con una constante de ligamiento de por lo menos Kd = 10^{-6} M, preferentemente por lo menos Kd = 10^{-9} M, adecuadamente Kd = 10^{-10} M, más adecuadamente Kd = 10^{-11} M, todavía más adecuadamente Kd inmóvil = 10^{-12} M, y más preferentemente Kd = 10^{-15} M o incluso Kd = 10^{-18} M.

La entidad que es reconocida puede ser cualquier entidad conveniente que se exprese por células tumorales, células infectadas viralmente, microorganismos patogénicos, células introducidas como parte de terapia genética o incluso las células normales del cuerpo que, por cualquier razón, uno desea designar, pero que no se expresa, o por lo menos no con tal frecuencia, en las células que uno no desea designar. La entidad que es reconocida a menudo será, un antígeno. Los ejemplos de antígenos incluyen aquellos relacionados en la Tabla 2.

TABLA 2 1. Antígenos tumorales asociados

Antígeno	Anticuerpo	Usos actuales
Antígeno Carcino-embrionario	C46 (Amersham)85A12	Imaginería y Terapia de
	(Unipath)	Tumores del colon / recto
Fosfatasa Placental Alcalina	H17E2 (ICRF, Travers \textamp	Imaginería y Terapia de
	Bodmer)	cánceres testicular y ováricos
Carcinoma nudoso	NR-LU-10 (NeoRx Corporation)	Imaginería y Terapia de varios
		carcinomas incl. células de
		pequeño cáncer pulmonar
Polimórfico de la Mucina epitelial	HMFG1 (Taylor Papadimitriou	Imaginería y Terapia de cáncer
(glóbulo de grasa de leche	ICRF) (Antisoma plc)	ovárico, efusiones pleurales,
humana)		pulmón \textamp otros cánceres comunes
proteína del núcleo mucina de	SM-3(IgG1)^{1}	Diagnóstico Imaginería y Terapia
leche humano		de cáncer del pecho
Gonadotropina Coriónica \beta-	W14	Direccionamiento de enzima
humana		(CPG2) al coriocarcinoma
		xenograft humano en ratones
		desnudos. (Searle et al (1981) Br.
		J. Cancer 44, 137-144)
Un Hidrato de carbono en	L6 (IgG2a)^{2}	Direccionamiento de fosfatasa
Carcinomas Humanos		alcalina. (Senter et al (1988)
		Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85,
		4842-4846)
Antígeno CD20 en Linfoma B	IF5 (IgG2a)^{3}	Direccionamiento de fosfatasa
(normal y neoplásico)		alcalina (Senter et al Proc. (1988)
		Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85, 4842-4846)
1 Burchell et al (1987) Cancer Res. 47, 5476-5482
2 Hellstrom et al (1986) Cancer Res. 46, 3917-3923
3 Clarke et al (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.. 82, 1766-1770,

Otros antígenos incluyen la alfafoetoproteina, Ca-125, el antígeno específico a la próstata y miembros de la familia del receptor de factores del crecimiento epidérmico, a saber EGFR, erbB2 (por ejemplo, el anticuerpo de Herceptin), erb B3 y erb B4.

2. Antígenos celulares inmunes

Antígeno	Anticuerpo	Usos Actuales
Antígeno Superficial (CD22) de	RFB4 (Janossy, Royal Free	Terapia de Inmunotoxina del
B-linfocito	Hospital)	Linfoma Celular B
Antígeno superficial del Linfocito	H65 (Bodmer Knowles ICRF.	Inmunotoxina en el tratamiento
Nudoso T, CD5	Licenciado a Xoma Corp., USA)	del injerto agudo respecto al
		anfitrión de la enfermedad, Artritis
		Reumatoide.

3. Antígenos agentes infecciosos relacionados

Antígeno	Anticuerpo	Usos Actuales
Antígeno Superficial de la	Anti HBs Ag	Inmunotoxina contra el
hepatitis B		Hepatoma

En una realización preferente, la porción específica de la célula marcada reconoce y se liga selectivamente a un antígeno de tumor celular.

Ventajosamente, la porción específica de la célula marcada es un anticuerpo o su fragmento ligante de antígeno.

Convenientemente, la porción específica de la célula marcada comprende dos o más sitios ligantes para la célula marcada, en los que la porción específica de la célula marcada es un anticuerpo, o su fragmento bivalente. Dicha porción específica de la célula marcada puede tener respectivos "brazos" que reconocen la misma entidad como entre sí mismas o que reconocen entidades diferentes.

En una realización de los compuestos de la invención, la porción específica de la célula marcada tiene dos "brazos" que reconocen las moléculas diferentes en la misma célula marcada, en la que las moléculas en la misma célula marcada no se confinan a ese tipo de célula pero puede ocurrir en otros tipos de células. Por ejemplo, un "brazo" de la porción específica de la célula marcada puede reconocer moléculas de los tipos de células I, II y III, mientras que el otro `brazo' puede reconocer moléculas de los tipos de célula I, IV y V. Así un compuesto de la invención que comprende como tal una porción específica de la célula marcada tendrá la especificidad mayor para células del tipo I comparadas con células del tipo II, III y IV. Este aspecto de la invención es particularmente útil, tanto como han sido muy pocas las moléculas de células específicas completamente marcadas reveladas, considerando que las moléculas que aparecen en pocos tipos de células y que son útiles en este aspecto del la invención son bien conocidas. Tales moléculas normalmente son antígenos de la superficie de la célula por lo que son conocidos los anticuerpos de reactivos cruzados. Se dan ejemplos de tales moléculas en la Tabla 3.

TABLA 3

\hskip1cm El antígeno \hskip1cm

La célula-tipo \hskip1cm

El anticuerpo

Antígeno Superficial	Antígeno Superficial	Antígeno Superficial
CD9	Células de Pre-B monocitos,	MM2/57 (IgG2b, ratón)
	plaquetas.
CALLA	Células linfoides de progenitor,	B-E3 (IgG2a, ratón)
	granulocitos.
CD13	Monocitos mieloides,	B-F10 (IgG1, ratón)
	granulocitos
CD24	Célula B, granulocitos	ALB-9 (IgG1, ratón)
CD61	Plaquetas, megacariocitos	PM 6/13 (IgG1, ratón)

Los anticuerpos descritos en La Tabla 3 están generalmente disponibles en Serotec, Oxford, OX5 1BR, UK.

Anticuerpos monoclonales que ligarán a muchos de los antígenos relacionados en la Tabla 2 ya son conocidos, pero en cualquier caso, con las técnicas de hoy respecto a la tecnología de anticuerpos monoclonales, pueden prepararse los anticuerpos a la mayoría de los antígenos. La porción específica a antígeno puede ser un anticuerpo entero, una parte de un anticuerpo (por ejemplo un fragmento Fab o F(ab')_{2}, un fragmento de anticuerpo sintético (por ejemplo un fragmento Fv de una sola cadena [ScFv]), o un péptido / péptido mimético o similar. Anticuerpos monoclonales convenientes a los antígenos seleccionados pueden ser preparados por las técnicas conocidas, por ejemplo aquellas reveladas en "Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988) y en "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", J G R Hurrell (CRC Press, 1982) y "Antibody Engineering, A Practical Approach", McCafferty, J., et. al. Ed. (IRL Pres, 1996).

Las variables fuerte (V_{H}) y ligera (V_{L}) de los dominios de los anticuerpos están involucradas en el reconocimiento de antígenos, un primer hecho reconocido por los experimentos tempranos de digestión de proteasa. Ulteriores confirmaciones se encontraron por la "humanización" de anticuerpos de roedores. Dominios inconstantes del origen de los roedores pueden fundirse a dominios constantes del origen humano de forma tal que el anticuerpo resultante retiene la especificidad antigénica del anticuerpo emparentado del roedor (Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 81, 6851-6855).

Esa especificidad antigénica se confiere por los dominios inconstantes y es independiente de los dominios constantes, es conocida de experimentos que involucran la expresión bacteriana de fragmentos de anticuerpo, todos los que contienen uno o más dominios inconstantes. Estas moléculas incluyen Fab-como moléculas (Better et al (1988) Science 240, 1041), Fv molecules (Skerra et al (1988) Science 240, 1038), moléculas Fv ligadas por disulfuros (Young et al., 1995, FEBS Lett. 377:135-139), moléculas Fv de cadenas simples (ScFv) donde los dominios compañeros V_{H} y V_{L} están enlazados por medio de un oligopéptido flexible (Bird et al (1988) Science 242, 423, Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879) y los anticuerpos de dominio simple (dAbs) comprenden V dominios aislados (Ward et al (1989) Nature 341, 544). Una revisión general de las técnicas involucradas en la síntesis de fragmentos de anticuerpos que retienen sus sitios ligantes específicos se encuentra en Winter & Milstein (1991) Nature 349, 293-299.

Por "moléculas ScFv" denominamos las moléculas, en las que los dominios compañeros V_{H} y V_{L} están vinculados por medio de un oligopéptido flexible.

Los anticuerpos de Quiméricos son discutidos por Neuberger et al (1988, 8th International Biotechnology Symposium Part 2, 792-799).

Los anticuerpos no humanos adecuadamente preparados se pueden "humanizar" por las vías conocidas, por ejemplo insertando las regiones de CDR de anticuerpos de ratón en el armazón de anticuerpos humanos.

Las ventajas de usar fragmentos de anticuerpos, en lugar de los anticuerpos enteros, son varias. El tamaño menor de los fragmentos permite un balance rápido, y puede llevar a mejorar las proporciones no tumorales. Fab, Fv, ScFv, disulfuro Fv y los fragmentos de anticuerpo dAb pueden todos expresarse en, y secretarse de, bacterias, como E. coli, o sistemas de expresión de eucariótico como levaduras o sistemas de mamíferos, permitiendo así la producción fácil de grandes cantidades de dichos fragmentos.

Los anticuerpos enteros, y los fragmentos de F(ab')_{2} son "bivalentes." Por "bivalente" expresamos que dichos anticuerpos y fragmentos F(ab)_{2} tienen dos sitios que combinan los antígenos. En contraposición, Fab, Fv, ScFv, disulfuro Fv y los fragmentos dAb son monovalentes, teniendo sólo un antígeno que combina el sitio.

Algunos de los varios compuestos de la invención se ilustran en forma esquemática en la Figura 1. Claro, la porción citotóxica puede formar oligómeros de orden superior que aquellos ilustrados, por ejemplo trímeros, tetrámeros, pentámeros, hexámeros.

La entidad reconocida puede o no ser antigénica pero puede reconocerse y selectivamente enlazarse de alguna otra manera. Por ejemplo, puede ser un receptor de la superficie celular característico como el receptor para la hormona estimulante de los melanocitos (MSH) que se expresa en el alto número de células de melanoma. Alternativamente, la entidad puede ser una entidad que es inducida en las células marcadas, por ejemplo los receptores del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en la angiogénesis. La porción específica de la célula puede ser entonces un compuesto o una parte que específicamente liga a la entidad en un sentido no inmune, por ejemplo como un sustrato o su análogo para una enzima de la superficie celular o como un mensajero.

Preferentemente, la elevada avidez de la porción específica de célula marcada comprende dos o más sitios ligantes diferentes para la célula marcada.

Los sitios ligantes diferentes para la célula marcada pueden o no ser dos o más anticuerpos diferentes, o sus fragmentos, que se dirigen a entidades diferentes expresadas en la célula marcada. Alternativamente, los sitios ligantes diferentes para la célula marcada pueden reconocer y selectivamente ligar la célula en algún otro sentido, no inmune.

Una ulterior alternativa es que uno o más de los sitios ligantes sea un anticuerpo, o una de sus partes, y que uno o más de los sitios ligantes para que la célula marcada reconozca y selectivamente se ligue con la célula en algún otro sentido, no inmune.

Un compuesto que tiene sitios ligantes para dos o más entidades de la célula específica marcada puede ser más específico para ligar dicha célula marcada, y un compuesto que tiene más de uno de sus sitios ligantes diferentes puede ligar a la célula marcada con mayor avidez. Combinando dos o más sitios ligantes, que pueden ser de especificidad alta pero afinidad baja, será posible generar en el compuesto de la invención una afinidad superior por la célula marcada aunque reteniendo la especificidad de los sitios ligantes.

Muchas moléculas específicas a las células marcadas son conocidas, como aquellos revelados en la Tabla 2, que no se unen directamente o indirectamente a una porción citotóxica adicional, pero que pueden ser no obstante útiles dirigiendo a agentes citotóxicos a una célula marcada.

Así, un aspecto adicional de la invención proporciona un compuesto que comprende una porción mediadora y una porción citotóxica caracterizado porque la porción citotóxica es una caspasa activa constitutivamente o que tiene esencialmente la misma actividad de inducción de apoptosis que dicha caspasa. La porción citotóxica puede comprender cualquiera de las porciones citotóxicas descritas antes respecto a los compuestos del primer aspecto de la invención.

Por "porción mediadora" denominamos la porción del compuesto que reconoce una molécula específica a la célula marcada y media la internalización de la porción citostática al citosol de la célula marcada. La molécula específica a la célula marcada puede ser un compuesto según el primer aspecto de la presente invención, o puede ser una molécula específica a la célula marcada conocida en la técnica, o puede ser un derivado suyo capaz de reconocimiento por la porción mediadora.

En el caso de molécula específica a célula marcada nativa que comprende anticuerpos, dicha molécula específica a célula marcada puede reconocerse por el mediador a través de su porción de Fc.

El mediador puede reconocer la molécula específica a célula marcada nativa, pero es preferible para el mediador reconocer un derivado de dicha molécula.

Dicho derivado puede hacerse uniendo un resto, como una molécula pequeña, por ejemplo un hapteno, a dicha molécula. El mediador, por ejemplo un anticuerpo o fragmento del mismo, puede reconocer entonces dicho hapteno o alguna otra parte derivada de la molécula específica a célula marcada.

La ventaja al usar este método es que el mismo resto (por ejemplo, hapteno) puede unirse a todos los tipos de moléculas específicas a las células marcadas, y entonces sólo un compuesto, comprende un mediador que reconoce dicho resto y una porción citotóxica, puede usarse para entregar el agente citotóxico a la célula marcada.

En una realización de la invención el mediador comprende un anticuerpo de HMFG-1 o fragmento ligante del propio antígeno (por ejemplo el scFv), y el resto reconocido por dicho anticuerpo HMFG-1 es el hapteno, el péptido central de la mucina polimórfica epitelial (PEM, por las siglas de su expresión inglesa, Polymorphic Epithelial Mucin). La molécula específica a célula marcada es un anticuerpo adicional que comprende dicho hapteno, y específicamente comprende un péptido de secuencia APDTR dentro del tándem de veinte aminoácidos repite el producto genético muc-1 que es el antígeno determinante de PEM reconocido por los anticuerpos HMFG-1. Los anticuerpos HMFG-1 se revelan en EP 483 961 A.

Antes de que tales moléculas puedan considerarse como candidatas convenientes, hay un requisito de que se demuestre la especificidad celular y un requisito adicional de que esta especificidad se muestre para sólo ser conferida por combinación de la interacción del anticuerpo inicialmente marcado con el marcador, y la interacción del segundo paso reactivo (en este caso el anticuerpo de HMFG-1) con el anticuerpo primario. Con este fin, el anticuerpo primario necesita ser reconocido específicamente por el mediador, y por consiguiente requiere modificaciones estables que lo distinguirán de los anticuerpos nativos. La derivación múltiple del anticuerpo primario con un hapteno cumple esta demanda, y tiene la ventaja adicional de ampliación, proporcionando una serie de objetivos secundarios al mediador.

Claro, pueden usarse otros mediadores como Fab, F(ab')_{2}, dAbs, scFv, Fv enlazado por disulfuro u otros fragmentos de anticuerpos. Es más, el mediador también puede reconocer el resto en un sentido no inmune, como en el reconocimiento de la biotina - estreptavidina. Se prefiere si el resto reconocido es una molécula pequeña, pero el resto también puede ser un polipéptido, péptido, oligosacárido o análogos. En un aspecto preferente de los primeros y segundos aspectos de la invención, el compuesto es un compuesto de fusión que comprende una porción específica de célula marcada, o porción mediadora, y una porción citotóxica caracterizada por que la porción citotóxica es una caspasa activa constitutivamente o tiene esencialmente la misma actividad de inducción de apoptosis de dicha caspasa.

Por "compuesto de fusión" nosotros incluimos un compuesto que comprenda una o más porciones distintas funcionalmente, en el que las porciones distintas están contenidas dentro de una sola cadena de polipéptido producida por técnicas recombinantes de ADN.

Alternativamente, la célula específica diseñada, o la porción mediadora, y la porción citotóxica del compuesto de la invención son restos separados enlazados juntos por cualquiera de las maneras convencionales de reticular polipéptidos, como los descritos en general en O'Sullivan et al. Anal. Biochem. (1979) 100, 100-108. Por ejemplo, la porción del anticuerpo puede enriquecerse con los grupos tiol y la porción de la enzima reaccionada con un agente bifuncional capaz de reaccionar con esos grupos tiol, por ejemplo el éster N-hidroxisuccinimida del ácido yodoacético (NHIA) o el propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditio) (SPDP). Los enlaces amida y tioéter, por ejemplo, logrados con el éster de m-maleimidobenzoíl-N-hidroxisuccinimida son generalmente más estables in vivo que los enlaces disulfuro.

Un tercer aspecto de la invención proporciona una molécula del ácido nucleico aislada que codifica un compuesto según el primer o segundo aspecto de la invención, o una porción específica de célula marcada, porción mediadora o porciones citotóxicas de éstas.

Por "molécula de ácido nucleico" nosotros incluimos ADN, cDNA y las moléculas de mRNA.

Un cuarto aspecto de la presente invención proporciona un método de hacer un compuesto según el primer o segundo aspecto de la invención, dicho método comprende expresar una o más moléculas de ácido nucleico según el tercer aspecto de la invención en una célula anfitrión y aislando el compuesto de origen.

Es preferible que las dos porciones del compuesto de la invención se produzcan como un compuesto de fusión por las técnicas recombinantes de ADN, con las que una longitud de ADN comprende regiones respectivas que codifican entre si las dos porciones del compuesto de la invención, adyacentes o separadas por una región que codifica un péptido vinculante que no destruye las propiedades deseadas del compuesto. Los beneficios de hacer el compuesto de la invención usando las técnicas recombinantes de ADN ofrecen muchas posibilidades. Primeramente, habilita un grado alto de precisión con que pueden unirse las dos porciones del compuesto. Secundariamente, la construcción de compuestos que son "heterooligoméricos" puede controlarse por la expresión recombinante de diferentes moléculas de ADN que codifican cada uno de los tipos diferentes de subunidades del "heterooligómero" en la misma célula anfitrión.

Por "heterooligómero" denominamos esos compuestos en los que dos o más porciones diferentes de la célula específica se unen a la misma o a subunidades diferentes que son capaces de oligomerización. La expresión, en la misma célula anfitrión de dos compuestos, de A y B, cada uno con diferentes porciones de células específicas marcadas pero con una segunda porción común capaz de oligomerización, producirá una población mixta de compuestos. Por ejemplo, si la segunda porción común es capaz de dimerización, se producirán tres compuestos potenciales: A2, AB y B2, en una proporción de 1:2:1, respectivamente.

La separación del compuesto deseado con cada una de las diferentes porciones específicas de células, esto es AB, puede lograrse por cromatografía de afinidad de dos pasos.

La aplicación de la mezcla de compuestos a una columna de afinidad específica para A resultará en el ligamento de A2 y AB. Estos compuestos son eluídos de esta primera columna, y entonces aplicados a una columna de afinidad específica para B. Esto resultará en AB, pero no A2, ligándose a la columna. Finalmente, el producto deseado AB, puede ser eluído.

Claro, el orden en que las columnas de afinidad se usan no es importante.

El mismo principio de separar esos compuestos con dos o más sitios ligantes diferentes puede aplicarse a la purificación de los compuestos deseados de las mezclas de otros heterooligómeros.

Plausiblemente, las dos porciones del compuesto se pueden solapar totalmente o en parte.

El ADN se expresa entonces en un anfitrión conveniente para producir un polipéptido que comprende el compuesto de la invención. Así, el ADN que codifica el polipéptido que constituye el compuesto de la invención puede usarse de acuerdo con las técnicas conocidas, apropiadamente modificado en vista de los conocimientos contenidos aquí, para construir un vector de expresión, que se usa entonces para transformar una apropiada célula anfitrión para la expresión y producción del polipéptido de la invención. Tales técnicas incluyen aquellas reveladas en las patentes de los EE.UU. Nº. 4,440,859 concedida el 3 de abril de 1984 a Rutter et al.; 4.530.901 concedida el 23 de julio de 1985 a Weissman; 4.582.800 concedida el 15 de abril de 1986 a Crowl; 4.677.063 concedida el 30 de junio de 1987 a Mark et al. 4.678.751 concedida el 7 de julio de 1987 a Goeddel; 4.704.362 concedida el 3 de noviembre de 1987 a Itakura et al. 4.710.463, concedida el 1º de diciembre de 1987 a Murray, 4.757.006 concedida el 12 de julio de 1988 a Toole, jr., et al. 4.766.075 concedida el 23 de agosto de 1988 a Goeddel et al y 4.810.648 concedida el 7 de marzo de 1989 a Stalker.

El ADN que codifica el polipéptido que constituye el compuesto de la invención puede unirse a una variedad amplia de otras secuencias de ADN por la introducción en un anfitrión apropiado. El acompañante del ADN dependerá de la naturaleza del anfitrión, la manera de la introducción del ADN en el anfitrión, y si se desea el mantenimiento o la integración del episoma. Generalmente, el ADN se inserta en un vector de expresión, como un plásmido, en la orientación apropiada y el marco de lectura correcto para la expresión. Si es necesario, el ADN puede enlazarse al transcripcional apropiado y control regulador translacional de las secuencias de nucleótido reconocidas por el anfitrión deseado, aunque tales controles están generalmente disponibles en el vector de expresión. El vector se introduce entonces en el anfitrión a través de las técnicas normales. Generalmente, no todos los anfitriones se transformarán por el vector. Por consiguiente, será necesario seleccionarlos para las células anfitrionas transformadas. Una técnica de selección involucra la incorporación en la expresión del vector de una secuencia de ADN, con cualquier elemento necesario de control, que lo codifica para un rasgo seleccionable en la célula transformada, como la resistencia antibiótica. Alternativamente, el gen para dicho rasgo seleccionable puede ser otro vector que se usa para cotransformar la célula anfitrión deseada.

Células anfitrión que se han transformado por la recombinación del ADN de la invención son entonces cultivado durante un tiempo suficiente y bajo condiciones apropiadas conocidas a los expertos en la técnica en vista de los conocimientos revelados aquí para permitir la expresión del polipéptido que puede entonces recuperarse.

Muchos sistemas de expresión son conocidos, incluso las bacterias (por ejemplo E. coli y Bacillus subtilis), levaduras (por ejemplo el Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris), hongos filamentosos (por ejemplo, Aspergillus), células de plantas, células animales (por ejemplo COS-1, COS-7, CHO, NIH 3T3, NSO y células BHK) y células de insectos (por ejemplo Drosophila, células SF9).

Aquellos vectores que incluyen una réplica como una réplica procariótica también pueden incluir un promotor apropiado como un promotor procariótico capaz de dirigir la expresión (transcripción y traslación) de los genes en una célula anfitrión bacteriana, como E. coli, transformada con esto.

Un promotor es un elemento de control de expresión formado por una secuencia de ADN que permite que ocurra el ligamiento de polimerasa ARN y la transcripción. Las secuencias de promotor compatibles con ejemplares de anfitriones bacterianos se proporcionan típicamente en vectores de plásmidos que contienen sitios restrictivos convenientes para la inserción de un segmento de ADN de la presente invención. Los plásmidos de vectores de procariótica típicos son pUC18, pUC19, pBR322 y pBR329 (disponible de Biorad Laboratories, Richmond, CA, EE.UU.), pTrc99A y pKK223-3 (disponible de Pharmacia Piscataway, NJ, EE.UU.) y el sistema pET (el promotor T7, Novagen Ltd).

Un plásmido de vector de célula de mamífero típico es pS V_{L} disponible de Pharmacia, Piscataway, NJ, EE.UU. Este vector usa el promotor tardío SV40 para manejar la expresión de genes clonados, el nivel más alto de expresión que se encuentra en las células productoras de antígeno T, como las células de COS-1.

Un ejemplo de un vector de expresión de mamífero inducible es el pMSG, también disponible de Pharmacia. Este vector usa el promotor de glucocorticoide inducible del largo término repetido del virus tumoral del mamífero ratón para manejar la expresión del gen clonado.

Los vectores de plásmido de levadura útiles son pRS403-406 y pRS413-416 y son generalmente disponibles de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EE.UU. Los Plásmidos pRS403, pRS404, pRS405 y pRS406 son plásmidos integrantes de levaduras (YIps) e incorporan los marcadores seleccionables de levadura his3, trpl, leu2 y ura3. Los plásmidos pRS413-416 son plásmidos centrómeros de levadura (YCps).

Vectores útiles adicionales para la transformación de células de levadura, como Pichia, incluyen los 2lc del plásmido pYX243 (disponible de R & D Systems Limited) y las series de vectores de integración pPICZ (disponible de Invitrogen).

Se ha desarrollado una variedad de métodos para enlazar operativamente ADN a los vectores por medio de término cohesivo complementario. Por ejemplo, pueden agregarse los tractos homopoliméricos complementarios al segmento de ADN a ser insertado al vector ADN. El vector y el segmento de ADN son unidos entonces por enlaces de hidrógeno entre las partes posteriores homopoliméricas complementarias para formar las moléculas de ADN recombinante.

Enlazantes sintéticos que contienen uno o más sitios restrictivos proporcionan un método alternativo de unir el segmento de ADN a los vectores. El segmento de ADN, generado por digestión restrictiva de endonucleasa como se describió anteriormente, se trata con la polimerasa T4 ADN bacteriófaga o la polimerasa E. coli ADN, enzimas que eliminan la protusión, los término de 3'-hebra simple con su actividad 3'-5'-exonucleolítica, y rellena los sitios
3'-terminales con sus actividades polimerizantes.

La combinación de estas actividades por consiguiente genera segmentos de ADN con terminaciones embotadas. Los segmentos con terminaciones embotadas se incuban entonces con un exceso molar grande de moléculas del enlazante en presencia de una enzima que puede catalizar la ligazón de las moléculas de ADN con terminaciones embotadas, como la ligasa T4 ADN bacteriófaga. Así, los productos de la reacción son segmentos de ADN portadores de secuencias del vinculante polimérico y sus terminaciones. Estos segmentos de ADN son entonces escindidos con la enzima restrictiva apropiada y ligados a un vector de expresión que ha sido escindido con una enzima que produce el término compatible con aquellos del segmento de ADN.

Enlazantes sintéticos que contienen una variedad de sitios de endonucleasa de restricción están comercialmente disponibles de varias fuentes que incluyen International Biotechnologies Inc, New Haven, CN, EE.UU. Una manera deseable de modificar el ADN que codifica el polipéptido de la invención es usar la reacción en cadena de la polimerasa como ha sido revelado por Saild et al (1988) Science 239, 487-491.

En este método el ADN a ser amplificado enzimáticamente se flanquea por dos cebadores oligonucleótidos específicos que se incorporan en el ADN amplificado. Dichos cebadores específicos pueden contener sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción que pueden usarse para duplicar vectores de expresión usando los métodos conocidos en la técnica.

Los géneros ejemplares de levadura contemplados para ser útiles en la práctica de la presente invención son Pichia, Saccharomyces, Kluyveromyces, Cándida, Torulopsis, Hansenula, Schizosaccharomyces, Citeronryces, Pachysolen, Debaromyces, Metschunikowia, Rhodosporidium, Leucosporidium, Botryoascus, Sporidiobolus, Endomycopsis, y análogos. Los géneros preferentes son aquellos seleccionados del grupo que consta de Pichia, Saccharomyces, Kluyverornyces, Yarrowia y Hansenula. Los ejemplos de Saccharomyces son cerevisiae de Saccharomyces, italicus de Saccharomyces y rouxii de Saccharomyces. Los ejemplos de Kluyveronryces son fragilis de Kluyveromyces y Kluyveroinyces lactis. Los ejemplos de Hansenula son polimorfa de Hansenula, Hansenula anomala de y Hansenula capsulata. La Yarrowia lipolitica es un ejemplo de una conveniente especie de Yarrowia.

Los métodos para la transformación de S. cerevisiae generalmente se muestran en EP 251 744, EP 258 067 y
WO 90/01063, todos los cuales están incorporados aquí como referencia.

Los promotores convenientes para S. cerevisiae incluyen aquellos asociados con el gen PGK1, los genes GALL o GALIO, CYCI, PHOS, TRP1, ADH1, ADH2, los genes para la dehidrogenasa de gliceraldehido-3-fosfato, hexoquinasa, piruvato de decarboxilasa, fosfofructoquinasa, isomerasa de triose fosfato, isomerasa de fosfoglucosa, glucoquinasa, factor de acoplamiento de ferromona, promotor PRBI, promotor GUT2, y los promotores híbridos que involucran híbridos de partes de regiones reguladoras 5' con partes de regiones reguladoras 5' de otros promotores o con los sitios de activación "aguas arriba" (ej. el promotor de EP-A-258 067).

La señal de terminación de transcripción es preferentemente la secuencia de flanco 3' de un gen eucariótico que contiene las señales apropiadas para la terminación de la transcripción y poliadenilación. Convenientes secuencias de flanco 3' pueden, por ejemplo, ser aquellas del gen naturalmente unido a la secuencia de control de expresión usada, es decir puede corresponder al promotor. Alternativamente, ellos pueden ser diferentes en cuyo caso se prefiere la señal de terminación del gen AHDI de la S. cerevisiae.

La presente invención también se refiere a una célula anfitrión transformada con una estructura de vector de polinucleótido de la presente invención. La célula anfitrión puede ser procariótica o eucariótica. Las células bacterianas se prefieren a las células anfitrionas procarióticas y típicamente son una estirpe de E. coli como tal, por ejemplo, las estirpes de E. coli DH5 disponible de Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, EE.UU., y RR1 disponible de American Type Culture Collection (ATCC) of Rockville, MD, USA (No ATCC 31343). Las células anfitrionas eucarióticas preferentes incluyen levadura y células de mamífero, preferentemente células de vertebrados como las de ratón, rata, mono o la línea celular fibroblástica humana. Las células anfitrionas preferentes incluyen las células del ovario de la marmota china (CHO) disponible de la ATCC como CCL61, las células NIH de embrión de ratón suizo NIH/3T3 disponible de ATCC como CRL 1658 y las células COS-1 derivadas de riñón de mono disponible de ATCC como CRL 1650 o células WS0.

La transformación de células anfitrionas apropiadas con una estructura de ADN de la presente invención es cumplida por métodos bien conocidos que típicamente dependen del tipo de vector usado. Con respecto a la transformación de células anfitrionas procarióticas, véase, por ejemplo, Cohen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 69: 2110 (1972), y Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989). La transformación de células de levadura se describe en Sherman et al, Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1986). El método de Beggs, Nature, 275: 104-109 (1978) también es útil. Con respecto a las células vertebradas, reactivos útiles en transfectar tales células, por ejemplo el fosfato de calcio y DEAE dextrana o formulaciones de liposoma, están disponibles de Stratagene Cloning Systems, or Life Technologies Inc, Gaithersburg, MD 20877, EE.UU..

Las células con éxito transformadas, es decir células que contienen una estructura de ADN de la presente invención, puede identificarse por técnicas bien conocidas. Por ejemplo, pueden desarrollarse células que son el resultado de la introducción de una expresión estructural de la presente invención para producir el polipéptido de la invención. Las células pueden cosecharse y alisarse y su contenido de ADN examinado para su determinación usando un método como el descrito por Southern, J. Mol. Biol., 98: 503 (1975) or Berent et al, Biotech., 3: 208 (1985). Alternativamente, la presencia de la proteína en el sobrenadante puede descubrirse usando anticuerpos como los descritos más abajo. Además de ensayar directamente para la presencia de ADN recombinante, la transformación exitosa puede confirmarse por los métodos inmunológicos bien conocidos cuando el ADN recombinante es capaz de dirigir la expresión de la proteína. Por ejemplo, las células transformadas con éxito con un vector de expresión producen proteínas que despliegan la antigenicidad apropiada. Las muestras de células sospechosas de transformarse se cosechan y analizan por la proteína usando los anticuerpos convenientes.

Así, además de las células anfitrionas transformadas, la presente invención también contempla un cultivo de esas células, preferentemente un cultivo monoclonal (clonación homogénea), o un cultivo derivada de un cultivo monoclonal, en un medio nutriente. Preferentemente, el cultivo también contiene la proteína.

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Los medios nutrientes útiles para cultivar las células anfitrionas transformadas son bien conocidos en la técnica y puede obtenerse de varias fuentes comerciales.

Un quinto aspecto de la invención mantiene un vector para la expresión de un compuesto según el primer o segundo aspecto de la invención, o una porción específica de célula marcada, porción mediadora o sus porciones citotóxicas, que dicho vector comprende una molécula del ácido nucleico según el cuarto aspecto de la invención.

Un sexto aspecto de la invención proporciona una célula anfitrión que comprende una molécula de ácido nucleico según el cuarto aspecto de la invención o un vector según el quinto aspecto de la invención.

Preferentemente, la célula anfitriona es una célula bacteriana o una célula de levadura. Un séptimo aspecto de la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto según el primer o segundo aspecto de la invención y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Los compuestos y composiciones de la invención se administran de cualquier manera conveniente, normalmente vía parental, por ejemplo intravenosa, intraperitoneal o, preferentemente (para el cáncer de vejiga), intravesical (es decir en la vejiga), en la norma estéril, formulaciones no pirogénicas de diluyentes y portadores, por ejemplo la solución salina isotónica (cuando se administró intravenosamente).

Un octavo aspecto de la invención proporciona un compuesto según el primer o segundo aspecto de la invención o una composición según el séptimo aspecto de la invención para su uso en medicina.

Pueden usarse los compuestos y composiciones de la invención para tratar a un paciente con cualquier enfermedad que involucra una disfunción de una población de células, dichos compuestos y composiciones direccionan selectivamente y destruyen dicha población de células en el paciente. Por ejemplo, dichos compuestos y composiciones pueden usarse en el tratamiento de cáncer, por ejemplo cáncer del pecho, ovarios, pulmón, estómago, intestinos, sangre, etc. Así, anticuerpos de antígeno de células antitumorales pueden usarse para entregar una porción citotóxica con actividad de inducción de apoptosis de caspasa a una célula tumoral. Se usan anticuerpos que son internalizados en contacto con el antígeno designado de forma tal que la porción citotóxica entra en el citosol de la célula tumoral donde puede activarse fuera de una cascada apoptótica. En principio, los compuestos y composiciones de la invención pueden usarse para tratar cualquier mamífero, incluso animales domésticos como perros y gatos y los animales importantes agrícolamente como vacas, caballos, ovejas y cerdos.

Preferentemente, el paciente es humano.

Un aspecto adicional de la invención proporciona el uso de un compuesto según el primer o segundo aspecto de la invención en la preparación de un medicamento para tratar una enfermedad asociada con la disfunción de una población de células.

Preferentemente, el medicamento es para tratar el cáncer.

Todavía otro aspecto de la invención proporciona un método de tratar un paciente que tiene células marcadas para ser destruidas, dicho método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto o composición de la invención a dicho paciente.

Preferentemente el paciente tiene cáncer.

La invención se describirá ahora en detalle con referencia a las siguientes figuras y ejemplos:

La Figura 1 muestra los ejemplos esquemáticos de varios tipos de compuestos de la invención.

La Figura 2 muestra un diagrama esquemático que muestra la construcción del gen que expresa la proteína de fusión HMFG 1 Fab-Caspasa. Los pasos de A a G se describen en el texto más abajo. La nota que la estructura final pET20HMFGLSCasp3 contiene el casete de expresión VL -CL en el sitio Bpul102 I. Una estructura alternativa, faltando la señal de secreción pel B para la expresión del citosol se construye de la misma manera, usando como vector de arranque pET21b, y la copia final se denomina pET21HMFGLSCasp3.

La Figura 3 muestra la secuencia del nucleótido continuo de la estructura que cuando se expresa en E. coli, congregará para formar una proteína de fusión HIV[FGI Fab/Caspasa 3. La columna vertebral del vector es pET20b. La secuencia se lee como sigue:

La señal de secreción Pel B (subrayado) 1-66, el dominio VH (cursivas) 67-420, el dominio CHI 421-714, el péptido vinculante (subrayado) 715-759, la caspasa-3/CPP-32 reestructurada (cursivas) 760-1277, el vinculante y la secuencia Tag Polihistidina (subrayado) 1278-1320. El promotor adicional T7, y el sitio ligante de ribosoma 1321-1461, la señal de secreción (subrayado) Pel B 1462-1527, el dominio VL 1462-1869, el dominio CL 1870-2193.

Los sitios de restricción referidos en la Figura 2 se presentan en negrita en la Figura 3.

La Figura 4 muestra un diagrama esquemático que presenta la construcción del vector de expresión
(pET20scFvCasp3) de la proteína de fusión reestructurada-Caspasa 3 scFv. Los pasos A a E se describen en el texto. Una estructura alternativa, faltando la señal de secreción pel B para la expresión del citosol se construye de la misma manera, usando como vector de arranque pET21b, y la copia final se llama pET2lscFvSCasp3. Se muestran las secuencias laterales del aminoácido.

La Figura 5 muestra el nucleótido continuo y la secuencia del aminoácido del gen de fusión que expresado en
E. coli, producirá la proteína de fusión caspasa 3 reestructurada scFv. La columna vertebral del vector es pET20b. La secuencia se lee como sigue: el fin de pel B del vector pET20b (1-8), scFv (9-731), vinculante (732-752), la caspasa reestructurada (753-1652), Su etiqueta (1653 1673).

La Figura 6 muestra la expresión BL21(DE3)pLysS en E. coli de la proteína de fusión caspasa 3 reestructurada scFv del vector pET20scFvcasp3. P = pelet celular, SN = sobrenadante bacterial, M = marcadores de peso molecular. El curso del tiempo es de 0 a 16 h. La flecha indica la posición de la proteína caspasa 3 scFv-reestructurada.

La Figura 7 muestra el ensayo ELISA en pura CEA de la proteína de fusión caspasa 3 scFv y scFv-reestructurada, desarrollada con el anticuerpo anti-HIS (Qiagen). La concentración de partida de las proteínas fue de 1 \mug/ml en PBS.

La Figura 8 muestra el ensayo de escisión PARP de la proteína de fusión caspasa 3 scFv y scFv-reestructurada un lisato celular de células SKOV3 que contienen la longitud completa PARP se incuba con las proteínas testadas para
1 h a 37ºC. La longitud completa (la flecha A, 130 KDa) y los escindidos PARP (la flecha B, 85 KDa) se detectan por Western Mancha. Las líneas son como siguen: (1) lisato celular, no tratado, (2) lisato celular tratado con la proteína de fusión caspasa scFv-reestructurada, (3) lisato celular tratado sólo con scFv, (4) lisato celular tratado con la caspasa pura. Como anticuerpo detector el anti-PARD (Santa Cruz biochemicals Ltd).

La Figura 9 muestra la citotóxicidad de 7 proteínas de fusión scFv-caspasa 3 seleccionadas y la anti-CEA scFv sola. Se agregaron cincuenta y diez microlitros de sobrenadante bacteriano concentrado a LS174T durante 48 hr. Se substrajeron los valores de fondo para las células no tratadas para dar el valor real del lisato celular medido por el equipo Citotox-96.

Ejemplos (A) Expresión de caspasas constitutivamente activas Construcción de una molécula de ácido nucleico que codifica una caspasa constitutivamente activa

La amplificación de PCR se usa para producir una estructura de ADN que codifica una caspasa-3 constitutivamente activa, en las que el orden de las subunidades pequeñas y grandes se invierten, como se describe en Srinivasula et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:10107-10111.

Generación de expresiones precursoras cDNAs de Caspasa-3 y Caspasa-6 constitutivamente activas

DNA complementarios (cDNA) que codifican a los precursores de las caspasa-3 y caspasa-6 constitutivamente activas se generan por PCR. Se amplificaron las subunidades grandes y pequeñas de la caspasa-3 con los siguientes cebadores, usando el ADN de la caspasa-3 como plantilla:

Cebador delantero de subunidad grande de la Caspasa-3:

ATGGAGAACACTGAAAACTCAG

Cebador inverso grande de la Caspasa-3:

GTCATCATCAACACCTCAGTCT

Cebador delantero de subunidad pequeña de la Caspasa-3:

GGATCCATGATTGAGACAGACAGTGG

Cebador inverso pequeño de la Caspasa-3:

ATCAACTTCATCGTGATAAAAATAGAGTTC

Los productos PCR de la caspasa-3 se clonan separadamente en el sitio Sma1 de pBluescript KS+. La subunidad pequeña se corta entonces desde el vector KS+ con Bam H1 y se inserta en el sitio Bam H1 del segundo vector KS+, que contiene la subunidad grande. Esto pone la subunidad pequeña dentro del marco de la subunidad grande.

El precursor de la caspasa-6 constitutivamente activa se amplifica y se copia en el vector KS^{+} de una manera similar. Los siguientes cebadores de PCR se usan con la caspasa-6-His6 como plantilla:

Cebador delantero de subunidad grande de la Caspasa-6:

ATGAGCTCGGCCTCGGGG

Cebador inverso de subunidad grande de la Caspasa-6:

TTAATCTACTACATCCAAAGG

Cebador delantero subunidad pequeña de la Caspasa-6:

GGATCCATGGTAGAAATAGATGCAGCCTCCGTTTAC

Cebador inverso de subunidad pequeña de la Caspasa-6:

ATCAATTTCAACGTGGTGGTGGTGGTGGTGC

Para expresar la caspasa constitutivamente activa en las bacterias (BL21-DE3), sus cDNAs se cortan con Bam H1/Xho1 y son subclonadas en el vector de expresión bacteriano pET28a dentro del marco de la His6-T7-tag de este vector.

Expresión de caspasas constitutivamente activa en células de mamíferos y ensayo de apoptosis

Para expresar la caspasa constitutivamente activa en células de mamíferos y ensayar su actividad apoptótica, éstas se amplifican con el cebador T7-tag y los cebadores inversos de las subunidades grandes que usan las estructuras pET28a como plantilla, y se subclonan en el vector de expresión doble de mamífero pRSC-LacZ (véase MacFarlane et al., 1997, J., Biol. Chem. 272:25417-25420). Este vector permite la expresión de LacZ bajo el promotor del virus del sarcoma de Rous y la prueba ADN bajo el promotor del citomegalovirus. También permite la transcripción in vitro de la prueba cDNA del T7-promotor.

Para ensayar la apoptosis, las células MCF-7 o 293 son transfectadas con la estructura pRSC-LacZ en la presencia o ausencia de inhibidores de apoptosis diferentes. Las células se manchan con B-galactosidasa 30 h después de la transfección y se examinan las señales morfológicas de apoptosis. El porcentaje de células apoptóticas rodeadas de azul comparadas con las células totalmente azules da una medida de la apoptosis.

Traslación in vitro de caspasas

Las caspasas son trasladadas in vitro en presencia de metionina [^{35}S] en el lisato de reticulocitos de conejo con un equipo (Promega) de TNT de polimerasa-pareada T7-ARN, usando las estructuras pRSC-LacZ o pET28a como plantilla según las recomendaciones del fabricante.

(B) Construcción y producción de una proteína de fusión recombinante porción HMFG1 Fab / Caspasa 3

1. (a) El gen de la Caspasa-3 se usa como plantilla para amplificar (por PCR) el subgen de la subunidad pequeña usando los cebadores CASP3SMFW de y CASP3SMBK (véase la Tabla 4) que contienen los sitios de restricción laterales Bam H I y Sal I (Fig. 2, reacción A).

(b) El gen de la Caspasa-3 se usa como plantilla para amplificar (por PCR) el subgen de la subunidad grande usando los cebadores CASP3LGFW y CASP3LGBK (véase la Tabla 4) que contienen los sitios de restricción laterales Nco I y Bam H I (Fig. 2, reacción B).

TABLA 4 Cebadores usados en la construcción del péptido de fusión HMFGI/Caspasa-3

CASP3SMFW

5'AACTGAGGATCCCCGATGGAGAACACTGAAAAC3'

CASP3SMBK

5' AGCTAAGTCGACGTCTGTCTCAATGCCACA 3'

CASP3LGFW

5'AACTGCCATGGCGATCGATACAGACAGTGGTGTTGAT GAT 3'

CASP3LGBK

5'AGCTAAGGATCCACCATCAACTTCATCGTGATAAAAATA GA

GTTCTTT 3'

HMFG1 VHPW

5' GCATCTGACCATGGCCCAGGTGCAG 3'

TABLA 4 (Continuación)

HMFGI VHBK

5'GCGCTTACCATGGAACCGCCTCCACCAGAGCCACCTC

CGCCTGAACCGCCTCCACCAACTTTCTTGTCCACCTT 3'

HMFG1 V_{L} FW

5'TCATTCCATGGCCGACATCCAGATGACCCAG3'

HMFG1 V_{L} BK

5'CCATGGCTACTAACACTCTCCCCTGGTGAAGCT3'

HMFGNCODET,1

5' CAGCCGGCAATGGCCGACATC 3'

HMFGNCODEL2

5' GAGTGTTAGTAGCAATGGATATCGGAAATT 3'

HMFGBPUFW

5'ATATCATGCTAAGCGAAATTAATACGACTCA3'

HMFGBPUBK

5'AATAACGCTCAGCCCATTGCTACTAACACTCTCC3'

2. El producto PCR del subgen de la subunidad grande se digiere con las enzimas de restricción Nco / Bam Hl y se liga en los sitios Nco I / Bam HI del vector de expresión pET20b (Novagen, véase la Fig. 2, reacción C). El plásmido resultante se llama pET20LCasp3. Se digiere el producto PCR del subgen de la subunidad pequeña y se liga en los sitios Bam HI /Sal I del plásmido pET20LCasp3 para formar el plásmido pET20LSCasp3 (Fig. 2, reacción C). Esta estructura puede usarse para expresar la actividad de la caspasa 3 sola, en E. coli, medir la actividad y caracterizar la enzima recombinante.

3. El HMFG-1 mRNA se produce del cultivo celular del hibridoma de HMFG-1 (ICRF), usando el equipo (Qiagen) sencillo de RNAse. El HMFG-1 cDNA es hecho por la transcripción inversa del mRNA usando cebadores oligo-dT y un equipo (Qiagen) de RT-PCR. El subgen de VH -CHI de la inmunoglobulina HMFG-1 se amplifica por PCR del cDNA usando los cebadores HMFGI VHFW y HMFGI VHBK (Fig. 2, reacción D). El producto PCR se digiere con Nco I y se liga en el sitio Nco I de pET20LSCasp3 (Fig. 2, reacción E). El plásmido resultante es el pET20H VH Casp3.

4. El HMFG-1 cDNA de (4) se usa para la amplificación PCR del subgen V_{L} -CL usando los cebadores HMFGI V_{L} FW y HMFGI V_{L} BK, para producir un casete con sitios laterales Nco I. El producto de PCR se digiere con Nco I y se liga en el sitio Nco I de pET20b. Los dos sitios Nco I son eliminados por mutagénesis oligodirigida, siguiendo el protocolo del equipo (versión 2) de mutagénesis Amersham-Pharmacia, y cebadores HMFGNCODELl y HMFGNCODEL2. El plásmido resultante se usa como plantilla para amplificar el casete de expresión para duplicar el pET20VH Casp3, usando los cebadores HMFGBPUFW y HMFGBPUBK, que ponen sitios laterales Bpu1102 I (Fig. 2, reacción F). El producto PCR se digiere con Bpu1 102 I y se liga en el sitio Bpu1 102 de pET20H VH Casp3 (Fig. 2 reacción G). El plásmido resultante es un vector bicistrónico que expresa una proteína de fusión I MFG-1 Fab-Caspasa 3, llamada pET20HMFGLSCasp3.

5. Alternativamente, la proteína de fusión puede construirse siguiendo el mismo esquema (pasos 1 a 5), pero usando el vector pET21d, para la expresión citosólica. La estirpe de E. coli usada es BL2ltrxb (Novagen).

La estirpe de E. coli BL2ltrxb usada en este método alternativo no contiene el gen de polimerasa T7 ARN (es decir no es un derivado DE3). De la expresión de los vectores del tipo pET son inducidas las células por crecimiento en un medio 2TY con 100 \mug/ml de ampicillina, hasta una densidad óptica de 0,8 (a las 37ºC). Luego, el virus M13-T7pol (Invitrogen) se agrega (a una multiplicidad de infección de 5) y el cultivo se deja crecer durante 1 hora. IPTG se agrega entonces hasta una concentración final de 1 mM seguida por ampicillina adicional (a 100 \mug/ml, asumiendo que toda la ampicillina inicial ha sido degradada). La inducción es continuada durante otras 3 a 5 horas.

6. El plásmido pET20HMFGLSCasp3 se transforma en BL21(XDE3)pLysE (Novagen), usando el método químico del cloruro de calcio (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Los transformantes se recubren fuera en placas 2TYagar (Sambrook, supra) conteniendo 100 \mug/ml de ampicillina y 35 \mug/ml de cloranfenicol y se crecen durante una noche a 37ºC. Se escogen las colonias y se reagitan en un plato fresco.

7. Se escoge una sola colonia fresca y se crece en 5 ml de un medio 2TY con 100 \mug/ml de ampicillina y 35 \mug/ml de cloranfenicol durante 16'h a 37ºC. Este cultivo inicial de 5 ml se usa al inocular 1 litro del mismo medio y se crece (a 30ºC) hasta que la densidad del cultivo, medido por absorbancia a 600 nm, está entre 0,8 y 1,0. Al cultivo, se agregan 10 ml de 100 mM IPTG (filtro estéril, Sigma) y es inducida la expresión de la proteína de fusión. El cultivo continúa creciendo bajo las mismas condiciones durante 3-5 h.

8. Las células son cosechadas por centrifugación a 10,000 g, 4ºC. El sobrenadante se retiene, se concentra por ultrafiltración en una celda de Amicon con una membrana de corte de 30 kDa, a un volumen final de 10 ml. Las células enteras son resuspendidas en 50 ml de reactivo de lisato B-PER (Pierce) e incubadas por 30 min para alisar las células. Las células lisadas se centrifugan a 25,000g, 4ºC. Los sobrenadantes de ambas muestras se dializaron con la solución salina, buffer de fosfato, que contiene 2 mM MgCl_{2} y 1 M NaCl. La diálisis involucra 5-6 cambios de 5 litros, para 3-4 h cada uno a 4ºC.

9. La proteína de fusión, la Fab-caspasa HuHMFG-1, es purificada del extracto celular o el cultivo sobrenadante por cromatografía de afinidad de metal en una columna de sepharose quelato de cobre (11) (Amersham-Pharmacia Biotech). Las muestras se agrupan y se cargan en PBS/1 M NaCl (buffer de columna) sobre aproximadamente 5 ml de resina. La columna se lava con 100 ml de buffer de columna. Luego, un gradiente de imidazol de 0-200 mM se aplica sobre un volumen total de 200 ml. La proteína de fusión debe eluir entre 80-150 mM de imidazol.

10. Los fragmentos de la columna de afinidad (véase paso 7) se analizan por 10 SDS-PAGE (Sambrook, supra) en dos geles duplicados. Para un gel, las muestras separadas se transfieren a nitrocelulosa por western (véase Harlow & Lane, 1988, Antibodies (1st ed.) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbour, New York). La presencia de la proteína de fusión es determinada por manchado de inmunización (immublotting) con caspasa-3 murina antihumana (diagnósticos de Roche) o murina anti-polihistidina (Qiagen), seguida por peroxidasa anti-ratón del caballo rábano (Harlow & Lane, supra). Las señales positivas son visualizadas por ECL (Amersham-Pharmacia Biotech). Para el segundo gel, la proteína se visualiza directamente por tinción con azul de coomasie (Sigma). Las muestras que contienen la proteína de fusión pura se agrupan y se dializan con la solución salina, buffer de fosfato 2 x 5 L, 16h a 4ºC.

11. La anterior proteína dializada se concentra por ultrafiltración a 1 mg/ml y se ensaya para determinar la actividad usando los sustratos peptídicos, específicos para la caspasa-3. Péptidos como los basados en DEVD fluorogénico (Calbiochem) pueden usarse en el buffer salino de fosfato, pH 7,4. La actividad se supervisa siguiendo el aumento en la fluorescencia y en comparación con la caspasa 3 pura recombinante humana, sea producida como se describió anteriormente o adquirida de Calbiochem. El contenido de proteína total puede medirse por el ensayo de Bradford (Sambrook, supra).

12. La actividad ligante del antígeno de la proteína de fusión es medida por ELISA, usando e células tumorales que expresan mucina (por ejemplo, la línea celular MCF-7), fijada en placas de 96 orificios con glutaraldehído (véase Harlow & Lane, supra).

(C) Valoración de la entrega de la caspasa-3 mediada por el antígeno (es decir, PEM) en el modelo del ratón

La entrega in vivo de caspasa se evalúa en ratones desnudos (criados en cautiverio en el Centre for Biomedical Studies (CBS), Imperial College, Londres). Los ratones desnudos se usan cuando tienen aproximadamente 2 semanas de edad y se han injertado hipodérmicamente tumores, creciendo durante 2 semanas (véase Deonarain et al., 1997, Protein Engin. 10, 89-98). La línea celular tumoral usada es MCF-7. La proteína de fusión HuHMFG-1 Fab Caspasa (se inyectan intravenosamente 10-100 \mug en 100 \mul vía la vena de la cola del ratón. La dosis es repetida cada 3-5 días y la regresión del tumor se evalúa trazando el volumen del tumor, usando los calibradores para medir las dimensiones del tumor en 3 dimensiones, contra el tiempo.

(D) Uso de la caspasa-3/huHI1IFG-1 Fab proteína de fusión en el tratamiento del cáncer ovárico

Pacientes diagnosticados con cáncer ovárico son tratados por inyección intravenosa de la proteína de fusión caspasa-3/huHMFG-1 Fab. Típicamente, una dosis de entre 1 a 100 mg se administrará semanalmente.

La respuesta terapéutica es medida por los procedimientos clínicos normales que son bien conocidos en la técnica, por ejemplo los métodos de radioimaginería.

(E) Construcción de un vector para expresar una proteína de fusión 3 scFv- reestructurada de una caspasa

1.

El gen de la Caspasa-3 se usa como plantilla para amplificar (por PCR) el subgen de la subunidad pequeña usando los cebadores CASP3SMFW Y CAzSP3SMBK (véase la Tabla 4) que contiene los sitios laterales de restricción Bam H I y Sal I los (Fig. 4, reacción A).

2.

El gen de la Caspasa-3 se usa como plantilla para amplificar (por PCR) el subgen de la subunidad grande usando los cebadores CASP3LGFW Y CASP3LGBK (véase la Tabla 4) que contiene los sitios laterales de restricción Nco I y Bam I ( Fig. 4, reacción B).

3.

El producto PCR del subgen de la subunidad grande se digiere con las enzimas de restricción Nco I / Bam HI y se liga en los sitios Nco I / Bam HI del vector de expresión pET20b (Novagen, Fig. 4, reacción C). El plásmido resultante se llama pET20LCasp3. El producto PCR del subgen de la subunidad pequeña se digiere y se liga en los sitios Bam HI/ Sal I del plásmido pET20LCasp3 para formar el plásmido pET20LSCasp3 (Fig. 4, reacción C). Esta estructura puede usarse para expresar la caspasa-3 activa sola, en E. coli, para ensayar la actividad y caracterizar la enzima recombinante.

4.

Un vector que contiene la MFE-23 scFv, pUCI19MFE (R. Begent, Royal Free Hospital, Londres) se usa como una fuente de scFv. El scFv se amplifica como un Nco I casete usando los cebadores MFENCOFOR y MFENCOBAC (véase la Tabla 5) (Fig. 4, reacción D). El gen del scFv es ligante en el sitio Nco I de la pET2OLSCasp3 para formar el vector que expresa el gen de fusión de la scFv-reestructurada caspasa 3, pET20scFvCasp3 (la Fig. 4, reacción E). La secuencia de ADN de todo el gen de fusión scFv-reestructurada caspasa 3 se describe en la Figura 5.

TABLA 5 Cebadores usados en la construcción de la proteína de fusión ScFv-reestructurada caspasa 3

MFENCOFOR

5' TATTGTTATCCATGGGGCAGGTGAAACTGCAGCAG 3'

MFENCOBAC

5' TATTGTTACTCATGGAACCTCCAGAACCTCCCTGTTGCAGCTCC AGCTT 3'

5.

Alternativamente, la proteína de fusión puede construirse siguiendo el esquema idéntico (pasos I a 4), pero usando el vector pET21d, para la expresión citosólica. La estirpe de E. coli usada es BL21trxb (Novagen) y la expresión es como se describe más abajo y se modifica como se describe en Linardou et al (2000, lnt. J. Cáncer 86, 561-569).

(F) Expresión y purificación de la scFv-reestructurada caspasa 3 proteína de fusión

1.

El plásmido pET20scFvCasp3 se transforma en la E. coli BL21 (\lambda,DE3)pLysE (Novagen), usando el método químico de cloruro de calcio (Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbour, New York). Los transformantes se recubren fuera en placas 2TYagar (Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbour, New York) conteniendo 100 \mug/ml de ampicillina y 35 \mug/ml de cloranfenicol y se crecen por una noche a 37ºC. Se escogen las colonias y se reagitan en un plato fresco.

2.

Se escoge una sola colonia fresca y se crece en un medio de 5 ml de 2TY con 100 \mug/ml de ampicillina y 35 \mug/ml de cloranfenicol durante 16 h a 37ºC. Este cultivo inicial con 5 ml se usa al inocular 1 litro del mismo medio y se crece (a 30ºC) hasta que la densidad del cultivo, medido por la absorbancia a 600 nm, está entre 0,8 y 1,0. Al cultivo, se agregan 10 ml de IPTG 100 mM (filtro estéril, Sigma) y es inducida la expresión de la proteína de fusión. El cultivo continúa creciendo bajo las mismas condiciones durante 16 h. La Figura 6 muestra una mancha western de la expresión de la proteína de la celular (P) scFv-caspasa (detectada usando el anti-His tag anticuerpo, Qiagen). Se produce en pelet celular y el sobrenadante (SN) después de 4 h y está presente en cantidades importantes (aproximadamente 1 mg/l) después de 16 h. Es el peso molecular correcto (aproximadamente 62 KDa como se predice de la secuencia de aminoácido).

3.

Las células son cosechadas por centrifugación a 10,000 g, 4ºC. El sobrenadante se retiene, se concentra por ultrafiltración en una celda Amicon con una membrana de corte de 30 kDa, a un volumen final de 10 ml. El sobrenadante concentrado se dializa con el buffer salino de fosfato que contiene 2 mM MgCl_{2} y 1 M NaCl. La diálisis involucra 5-6 cambios de 5 litros, para 3-4 h cada uno a 4ºC.

4.

La proteína de fusión de la caspasa scFv es purificada del sobrenadante del cultivo por cromatografía de afinidad de metal en una columna de sefarose por quelato de cobre (II) (Amersham-Pharmacia Biotech). Las muestras se agrupan y se cargan en el PBS / NaCl 1 M (buffer de columna) sobre aproximadamente 5 ml de resina cargada. La columna se lava con 100 ml de buffer de columna. Luego, un gradiente de 0-200 mM de imidazol es aplicada por encima a un volumen total de 200 ml.

(G) Caracterización de la scFv-reestructurada caspasa 3 proteína de fusión

1.

La anterior proteína de fusión pura de (F) se concentra por ultrafiltración a 1 mg/ml, se dializa como anteriormente y se ensaya para determinar su actividad usando los sustratos de péptidos, específicos para la caspasa-3. Péptidos como los basados en el DEVD fluorogénico (Calbiochem) pueden usarse en el búfer salino de fosfato, pH 7,4. La actividad se supervisa siguiendo el aumento en la fluorescencia y en comparación con la caspasa 3 pura recombinante humana, sea producida como se describió anteriormente o adquirida de Calbiochem. El contenido total de proteína puede medirse por el ensayo de Bradford (Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbour, New York).

2.

La actividad ligante del antígeno de la proteína de fusión fue medida por ELISA (Harlow & Lane, 1988, Antibodies. 1st ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbour, New York) usando CEA pura inmovilizada en placas de ELISA. La Figura 7 muestra algunos resultados de ELISA de dos muestras de 1 \mug/ml de proteína. Estos muestran que la proteína de fusión caspasa scFv liga exclusivamente a CEA así como a scFv.

\newpage

4.

La caspasa 3 reestructurada escindió al sustrato análogo del péptido (Ac-DEVD-AMC, Calbiochem), como lo hace la caspasa 3 tipo salvaje. Esto también ha sido nombrado por otros (Prof. N. Lemoine, ICRF, en un abajo inédito). Esto puede ser porque la caspasa reestructurada tiene sutilmente alterada la especificidad del sustrato. La caspasa-3 reestructurada es citotóxica para las células de mamíferos cuando se sobreexpresa por la entrega del gen (Prof. N. Lemoine, ICRF, en trabajo inédito), sugiriendo que la especificidad de sustrato in vivo es sencilla. De hecho esto se demuestra cuando la proteína caspasa-3 reestructurada scFv se incuba con lisatos de células humanas que contienen la ribosa poli-ADP proteína ligante (PARD), un sustrato natural para caspasa 3. La Figura 8 muestra que PARP es escindido por la proteína de fusión caspasa 3 reestructurada scFv (senda 2), como hace la caspasa 3 pura (senda 4).

(H) Citotoxicidad de caspasa scFv-reestructurada 3 proteína de fusión

Un plato de microtítulo 96 se sembró con 104 células CEA que se expresan (LS 174T) en medios DMEM complementados con 10% de suero y se dejó crecer por una noche a 37ºC en una incubadora humedecida con 5% CO_{2}. Un plato similar se sembró con una línea de célula CEA negativa (KB) y se dejó crecer bajo las mismas condiciones. Cada uno se trató bien por cuadruplicado con sobrenadante bacteriano, concentrado 5 veces después de la expresión de scFv solo o la proteína de fusión caspasa scFv. Se escogieron siete clones de caspasa scFv que tenían niveles variables de expresión de la proteína recombinante. Sólo una copia de scFv se probó como tal ya se ha caracterizado bien y se sabe que no es citotóxica para estas líneas celulares. Cincuenta microlitros o diez microlitros de muestra se agregaron a cada plato conteniendo las células marcadas en 200 \mul de medio completo. Las proteínas de fusión scFv y caspasa scFv se incubaron con las células durante 48 h y las células muertas fueron medidas usando el equipo citotox-96 (Promega). Los controles usados fueron las células no tratadas y las células no tratadas sometidas a lisis celular total. Fue observado (Figura 9) que las 2 concentraciones de scFv solo no eran citotóxicas a las células CEA positivas. Los siete clones de caspasa scFv testados fueron citotóxicos para las células LS174T a bajas (10\mul) y altas dosis (50\mul). El clon 6 fue particularmente potente mostrando aproximadamente el 75% de muerte celular en 48 h. No hubo efecto en la línea celular negativa (KB) y todos los errores estándares estuvieron por debajo del 1,5%.

Aunque CEA no internaliza eficazmente, estos resultados indican que la caspasa activa 3reestructurada, es citotóxica cuando las células tumorales son marcadas con un anticuerpo recombinante. Una persona experta apreciará por consiguiente que usando una proteína de fusión caspasa 3 reestructurada activa que liga más rápidamente marcadores internos, por ejemplo, una proteína de fusión HMFG-1, tendrá aun mayor citotóxicidad.

Claims (24)

1. Un compuesto que comprende una porción específica de célula marcada y una porción citotóxica, caracterizado porque la segunda porción citotóxica es una caspasa constitutivamente activa o tiene esencialmente la misma actividad inductora de apoptosis como dicha caspasa, sin necesidad de activación por otros componentes de la cascada apoptótica.

2. Un compuesto que comprende una porción mediadora capaz de reconocer una molécula específica a célula marcada y una segunda porción citotóxica, caracterizado porque la segunda porción citotóxica es una caspasa constitutivamente activa o tiene esencialmente la misma actividad inductora de apoptosis como dicha caspasa, sin necesidad de activación por otros componentes de la cascada apoptótica.

3. Un compuesto según la Reivindicación 1, en el que la porción específica de célula marcada reconoce y se une selectivamente a un antígeno tumoral celular.

4. Un compuesto según la Reivindicación 2, en el que la porción mediadora reconoce un compuesto según la Reivindicación 1.

5. Un compuesto según la Reivindicación 2 ó 4, en el que la molécula específica a célula marcada, reconocida por la porción mediadora es derivada.

6. Un compuesto como se reivindica en cualquier Reivindicación precedente, en el que la porción específica de célula marcada o la porción mediadora es un anticuerpo o su fragmento de antígeno ligante.

7. Un compuesto como se reivindica en cualquier Reivindicación precedente, en el que la porción específica de célula marcada se internaliza en contacto con la célula marcada.

8. Un compuesto como se reivindica en cualquier Reivindicación precedente, en el que la porción específica de célula marcada o la porción mediadora es un anticuerpo HMFG-1 o su fragmento de antígeno ligante.

9. Un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que se humaniza el anticuerpo o fragmento de antígeno ligante.

10. Un compuesto según cualquier Reivindicación precedente, en el que la porción citotóxica por lo menos es la porción catalíticamente activa de una caspasa constitutivamente activa.

11. Un compuesto según cualquier Reivindicación precedente, en el que la porción citotóxica es una caspasa efectora constitutivamente activa o tiene esencialmente la misma actividad de inducción de apoptosis como dicha caspasa, sin necesidad de activación por otros componentes de la cascada apoptótica.

12. Un compuesto según cualquier Reivindicación precedente, en el que la porción citotóxica es una caspasa-3, caspasa-6, o caspasa-7, constitutivamente activa o tiene esencialmente la misma actividad de inducción de apoptosis como dicha caspasa, sin necesidad de activación por otros componentes de la cascada apoptótica.

13. Un compuesto según cualquier Reivindicación precedente, en el que la porción citotóxica es de origen
mamífero.

14. Un compuesto según cualquier Reivindicación precedente, en el que la porción citotóxica es, constitutivamente, variante activa de una caspasa que se encuentra naturalmente.

15. Un compuesto según cualquier Reivindicación precedente, en el que la porción citotóxica es susceptible de oligomerización.

16. Un compuesto según cualquier Reivindicación precedente en el que dicho compuesto es un compuesto de fusión.

17. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.

18. Un método de hacer un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en que dicho método comprende expresar una o más moléculas de ácido nucleico según la Reivindicación 17 en una célula anfitrión y a partir de ésta aislar el compuesto.

19. Un vector para expresar en una célula anfitrión un compuesto según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 16 o una de sus porciones, en que dicho vector comprende que una o más moléculas de ácido nucleico según la Reivindicación 17.

20. Una célula anfitrión transformada con un vector según la Reivindicación 19.

21. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 y un portador o excipiente aceptable farmacéuticamente.

22. Un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 para su uso en medicina.

23. El uso de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 en preparación de un medicamento para tratar una enfermedad asociada con la disfunción de una población de células.

24. El uso según la Reivindicación 23 para tratar el cáncer.