ES2202300T3 - Metodo de regulacion de las actividades enzimaticas por gases nobles. - Google Patents

Metodo de regulacion de las actividades enzimaticas por gases nobles.

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ES2202300T3 ES92401470T ES92401470T ES2202300T3 ES 2202300 T3 ES2202300 T3 ES 2202300T3 ES 92401470 T ES92401470 T ES 92401470T ES 92401470 T ES92401470 T ES 92401470T ES 2202300 T3 ES2202300 T3 ES 2202300T3
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Abstract

UN METODO PARA REGULAR LA ACTIVIDAD ENZIMATICA, QUE IMPLICA PONER EN CONTACTO UNO O MAS ENZIMAS CON UN GAS QUE CONTIENE UNO O MAS GASES NOBLES O SUS MEZCLAS.

Description

Método de regulación de las actividades enzimáticas por gases nobles.
Antecedentes de la invención Campo de la invención
La presente invención se refiere a un método de regulación de las actividades enzimáticas por gases nobles.
Descripción de los antecedentes
La capacidad de los gases nobles helio (He), neón (Ne), argón (Ar), kriptón (Kr), xenón (Xe) y radón (Ra) para entrar en combinación química con otros átomos es extremadamente limitada. Por regla general, solamente kriptón, xenón y radón han sido inducidos a reaccionar con otros átomos, tales como flúor y oxígeno, y los compuestos así formados son explosivamente inestables. Véase Advanced Inorganic Chemistry, por F.A. Cotton y G. Wilkinson
(Wiley, 3ª edición). No obstante, si bien los gases nobles son por lo general químicamente inertes, se sabe que el xenón exhibe ciertos efectos fisiológicos, tales como anestesia. Otros efectos fisiológicos han sido observados también con otros gases inertes tales como nitrógeno, que, por ejemplo, se sabe causa narcosis cuando se utiliza a presión elevada en el buceo de altura.
Se ha consignado en el documento U.S. 3.183.171 otorgado a Schreiner que el argón y otros gases inertes pueden influir en la velocidad de crecimiento de los hongos, y se sabe que el argón mejora la conservación del pescado o los mariscos. Documentos U.S. 4.946.326, otorgado a Schvester, JP 52105232, JP 80002271 y JP 77027699. No obstante, la carencia fundamental de comprensión de estas observaciones hace obviamente que sea difícil, si no imposible, interpretar dichos resultados. Además, el significado de tales observaciones se ve oscurecido ulteriormente por el hecho de que en estos estudios se utilizaron mezclas de muchos gases, con inclusión de oxígeno. Adicionalmente, algunos de estos estudios se realizaron a presiones hiperbáricas y a temperaturas glaciales. A tan altas presiones, es probable que los resultados observados fueran causados por el deterioro causado por la presión a los componentes celulares y a las enzimas propiamente dichas.
Por ejemplo, desde 1964 a 1966, Schreiner documentó los efectos fisiológicos de los gases inertes particularmente en relación con efectos anestésicos y en estudios relacionados con el desarrollo de atmósferas de contención adecuadas para buceo de altura, submarinos y naves espaciales. Los resultados de este estudio se resumen en tres informes, titulados todos ellos: "Technical Report. The Physiological Effects of Argon, Helium and the Rare Gases", preparado para la Oficina de Investigación Naval, Department of the Navy. Contract Nonr 4115 (00), NR: 102- 597. Se publicaron tres sumarios y resúmenes posteriores de este estudio.
Uno de los resúmenes, "Inert Gas Interactions and Effects on Enzymatically Active Proteins", Fed. Proc. 26:650 (1967), reafirma la observación de que los gases nobles y otros gases inertes producen efectos fisiológicos a presiones parciales elevadas en animales intactos (narcosis) y en sistemas celulares de microbios y mamíferos (inhibición del crecimiento).
Un segundo resumen, "A Possible Molecular Mechanism for the Biological Activity of Chemically Inert Gases" en: Intern. Congr. Physiol. Sci., 23^{rd}, Tokyo, reafirma la observación de que los gases inertes exhiben actividad biológica a diversos niveles de organización celular a altas presiones.
Asimismo, un sumario de los efectos biológicos generales de los gases nobles fue publicado por Schreiner, en el cual se reafirman los principales resultados de su investigación previa. "General Biological Effects of the Helium-Xenon Series of Elements", Fed. Proc. 27:872-878 (1968).
No obstante, en 1969, Behnke et al refutaron las conclusiones principales de Schreiner. Behnke et al llegaron a la conclusión de que los efectos comunicados previamente por Schreiner son irreproducibles y son únicamente el resultado de la presión hidrostática, es decir, que no puede demostrarse efecto alguno de los gases nobles sobre las enzimas. "Enzyme-Catalyzed Reactions as Influenced by Inert Gases at High Pressures". J. Food Sci. 34:370-375.
En esencia, los estudios de Schreiner estaban basados en la hipótesis de que los gases químicamente inertes compiten con las moléculas de oxígeno por los sitios celulares, y que el desplazamiento del oxígeno depende de la relación de concentraciones de oxígeno a gas inerte. Esta hipótesis no fue nunca demostrada, dado que los efectos máximos observados (únicamente se observaron efectos inhibidores) se observaron con óxido nitroso y se encontró que eran independientes de la presión parcial de oxígeno. Además, la inhibición observada era solamente 1,9% de inhibición por cada atmósfera de óxido nitroso añadido.
Para refutar el trabajo previo de Schreiner, Behnke et al enseñaron independientemente el efecto de las presiones hidrostáticas altas sobre las enzimas, e intentaron reproducir los resultados obtenidos por Schreiner. Behnke et al encontraron que el aumento de la presión gaseosa de nitrógeno o argón más allá de la necesaria para observar una ligera inhibición de quimotripsina, invertasa y tirosinasa no causaba efecto adicional alguno en la inhibición, en contraste directo con el descubrimiento de Schreiner.
Los descubrimientos de Behnke et al pueden explicarse por simple inhibición hidrostática inicial, que se libera después de la estabilización de la presión. Claramente, los descubrimientos no pueden explicarse por la interdependencia química O_{2}/gas inerte como había sido propuesto por Schreiner. Behnke et al llegaron a la conclusión de que los gases inertes a presión elevada inhiben la tirosinasa en sistemas no fluidos (a saber, en gelatina) por disminución de la disponibilidad de oxígeno, más bien que por alteración física de la enzima. Esta conclusión está en contrate directo con los hallazgos de Schreiner.
Además de la refutación por Behnke et al, los resultados considerados per Schreiner son difíciles, si no imposibles, de interpretar también por otras razones.
En primer lugar, todos los análisis se realizaron a presión muy alta, y no fueron controlados por los efectos de la presión hidrostática.
En segundo lugar, en muchos casos, no se observó diferencia significativa alguna entre los diversos gases nobles, ni entre los gases nobles y el nitrógeno.
En tercer lugar, el conocimiento del modo de acción e inhibición de las enzimas era muy pobre en la fecha de estos estudios, como lo era la pureza de las enzimas utilizadas. Es imposible tener la certeza de que no estaban presentes actividades perturbadoras de las enzimas o que las medidas se realizaron con un grado de resolución suficiente para clasificar los diferentes gases en cuanto a eficacia. Adicionalmente, cualquier modo específico de acción pudo explicarse únicamente como una hipótesis no comprobable.
En cuarto lugar, no se controlaron las diferencias de solubilidad entre los diversos gases, ni se consideraron en el resultado.
En quinto lugar, todos los ensayos se realizaron utilizando presiones elevadas de gases inertes superpuestas a 1 atmósfera de aire, proporcionando con ello un control inadecuado de la tensión de oxígeno.
En sexto lugar, todos los efectos de los gases consignados son únicamente inhibiciones.
En séptimo lugar, no todos los procedimientos incluidos en el trabajo han sido descritos detalladamente, y pueden no haber sido controlados experimentalmente. Adicionalmente, las prolongadas demoras después de la iniciación de la reacción enzimática impidieron seguir el curso total de la reacción, con pérdida resultante de las velocidades de cambio legibles máximas.
En octavo lugar, los campos de datos consignados tienen una variabilidad alta basada en un pequeño número de observaciones, lo cual excluye un valor significativo.
En noveno lugar, los niveles de inhibición observados son muy pequeños incluso a presiones elevadas.
En décimo lugar, los estudios relativos a una dependencia de la concentración enzimática no consignan cifras significativas utilizables.
En undécimo lugar, todos los informes de potencial inhibidor de los gases inertes a bajas presiones, es decir,
< 2 atm, se postulan basándose en líneas extrapoladas partir de medidas a alta presión, no en datos reales.
Finalmente, merece ser reiterado que los resultados de Behnke et al contradicen claramente los expuestos por Schreiner en varios aspectos cruciales, principalmente que los efectos de la presión elevada son pequeños y que los efectos hidrostáticos, que no fueron controlados por Schreiner, son la causa primaria de las conclusiones incorrectas deducidas ce dichos estudios.
Adicionalmente, aunque fue comunicado por Sandhoff et al, FEBS Letters, vol. 62, n°. 3 (marzo, 1976) que xenón, óxido nitroso y halotano mejoran la actividad de la sialidasa constituida por partículas, estos resultados son cuestionables debido a las enzimas altamente impuras utilizadas en este estudio y son debidos probablemente a la presencia de oxidasas inhibidoras en las partículas.
Para resumir las patentes y publicaciones anteriores y mencionar otras relacionadas con ellas, se indica lo siguiente.
Behnke et al (1969), exponen que las reacciones catalizadas por enzimas se ven influenciadas por los gases inertes a altas presiones. J. Food Sc. 34: 370-375.
Schreiner et al (1967), describen interacciones y efectos de los gases inertes sobre proteínas enzimáticamente activas. Resumen No. 2209. Fed. Proc. 26:650.
Schreiner, H.R.1964, Technical Report, describe los efectos fisiológicos de argón, helio y los gases raros. Contract Nonr 4115 (00), NR: 102-597. Oficina de Investigación Naval, Washington, D.C.
\newpage
Schreiner, H.R.1965, Technical Report, describe los efectos fisiológicos de argón, helio y los gases raros. Contract Nonr 4115 (00), NR: 102-597. Oficina de Investigación Naval, Washington, D.C.
Schreiner, H.R.1966, Technical Report, describe los efectos fisiológicos de argón, helio y los gases raros. Contract Nonr 4115 (00), NR: 102-597. Oficina de Investigación Naval, Washington, D.C.
Es muy importante que en ninguno de los estudios anteriores se llegó a la conclusión empírica de que los gases de tratamiento hubieran interaccionado con los sitios activos de las enzimas.
No obstante, se sabe actualmente que las actividades enzimáticas pueden ser inhibidas de diversas maneras. Por ejemplo, muchas enzimas pueden ser inhibidas por venenos específicos que pueden estar relacionados estructuralmente con sus sustratos normales. Alternativamente, se conocen muchos reactivos diferentes que son desactivadores específicos de enzimas diana. Estos reactivos causan generalmente modificación química en el sitio activo de la enzima para inducir pérdida de la actividad catalítica, desactivación irreversible dirigida a los sitios activos o marcación por afinidad. Véase Enzymatic Reaction Mechanisms por C. Walsh (W.H. Freeman & Co., 1979). Alternativamente, se sabe que ciertas secuencias multi-enzimáticas están reguladas por enzimas particulares conocidas como enzimas reguladoras o alostéricas. Véase Bioenergetics, por A.L. Leninger (Benjamin/Cummings Publishing Co., 1973).
No obstante, sería sumamente ventajoso que pudiera alcanzarse un método mucho más sencillo para regular las actividades enzimáticas de una manera predecible y controlable. Además, sería sumamente ventajoso que pudiera encontrarse un medio para inhibir o aumentar selectivamente las actividades enzimáticas de una manera predecible y controlable.
La referencia FEES Letters, vol. 62, No. 3, 1976, páginas 284-287, describe el efecto de diversos gases sobre la sialidasa de cerebro de ternero fijada a membranas. La referencia expone los efectos de los gases xenón, óxido nitroso, hidrógeno, neón, nitrógeno, o helio tal como se miden por suplemento de aire con ellos a presiones comprendidas entre 2,5 y 30 atmósferas (250 a 3.000 kiloPascales).
La referencia Aviation, Space, and Environmental Medicine, vol. 48, No. 1, 1977, páginas 40-43, describe el efecto de la presión incrementada de oxígeno, nitrógeno y helio sobre la actividad de la Na-K-Mg-ATPasa de cerebro de vacuno. Esta referencia describe que los efectos del helio son atribuibles usualmente a la presión y que las desviaciones del helio por oxígeno y nitrógeno tienen que ser debidas a sus propiedades químicas y físicas específicas.
Sumario de la invención
De acuerdo con ello, es un objeto de la presente invención proporcionar un método para regular las actividades enzimáticas de una manera simple y directa.
Es también un objeto de la presente invención proporcionar un método para regular las actividades enzimáticas sin utilizar reactivos que están diseñados estructuralmente para desactivar enzimas diana.
Es también un objeto de la presente invención proporcionar un método para regular las actividades enzimáticas sin utilizar venenos de las enzimas que estén relacionados estructuralmente con los sustratos enzimáticos normales.
Adicionalmente, es un objeto de la presente invención proporcionar un método para cambiar las concentraciones relativas óptimas enzima-sustrato y modificar las condiciones óptimas de reacción en relación con los parámetros físicos.
Los objetos anteriores y otros que resultarán más claros a la vista de la descripción que sigue, se alcanzan por un método para regular las actividades enzimáticas que implica poner en contacto una o más enzimas con un gas que comprende uno o más gases nobles.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 ilustra el espectro de absorción de la tirosinasa.
La Figura 2 ilustra el espectro de absorción de L-tirosina.
La Figura 3 ilustra el espectro de absorción de tirosinasa y L-tirosina corregido por ensayo en blanco con
L-tirosina.
La Figura 4 ilustra una superposición de los resultados de reacciones realizadas con concentraciones variables de tirosinasa, que muestra una dependencia lineal directa de primer orden de la concentración de tirosinasa.
La Figura 5 demuestra la inhibición de la tirosinasa por el xenón para concentraciones p/p iguales.
La Figura 6 demuestra una inhibición muy grande de la tirosinasa por el xenón a 26°C.
La Figura 7 ilustra que, a 15°C, el argón inhibe ligeramente el equilibrio de la reacción tirosinasa-L-tirosina; el xenón tiene un efecto inhibidor pequeño pero significativo, y el neón y el kriptón exhiben un gran efecto inhibidor.
La Figura 8 ilustra los efectos inhibidores de xenón, kriptón, neón y argón sobre la reacción tirosinasa-L-tirosina a 20°C.
La Figura 9 ilustra que el oxígeno no tiene efecto intensificador alguno sobre la reacción tirosinasa-L-tirosina a 20°C.
La Figura 10 ilustra el efecto inhibidor de neón, argón, kriptón y xenón sobre la reacción tirosinasa-L-tirosina a 25°C.
La Figura 11 ilustra que el oxígeno no tiene efecto intensificador alguno sobre la reacción tirosinasa-L-tirosina a 25°C.
La Figura 12 ilustra el efecto inhibidor de neón, argón kriptón y xenón sobre la reacción tirosinasa-L-tirosina a 30°C.
La Figura 13 ilustra que el oxígeno no tiene efecto intensificador alguno sobre la reacción tirosinasa-L-tirosina a 30°C.
La Figura 14 ilustra una operación estándar en aire a diversas temperaturas, y demuestra que los cambios de velocidad son atribuibles directamente a diferencias de solubilidad del oxígeno.
La Figura 15 ilustra el efecto inhibidor del neón sobre la reacción tirosinasa-L-tirosina, que es claramente dependiente de la temperatura.
La Figura 16 ilustra la relación directa inversa (negativa) entre la capacidad del kriptón para inhibir la tirosinasa y la temperatura.
La Figura 17 ilustra la inhibición del equilibrio tirosinasa-L-tirosina. con xenón, que interacciona inversamente con la temperatura.
La Figura 18 ilustra que, a 20°C, el oxígeno no intensifica la reacción tirosinasa-L-tirosina, en tanto que argón, xenón y neón inhiben todos ellos espectacularmente la reacción. El kriptón tiene un efecto inhibidor menor que el nitrógeno.
La Figura 19 ilustra que, a 25°C, argón y nitrógeno inhiben la tirosinasa-L-tirosina en menor grado que los gases nobles, y el oxígeno intensifica la reacción.
La Figura 20 ilustra que, a 30°C el oxígeno ya no intensifica la reacción tirosinasa-L-tirosina debido a su menor solubilidad.
La Figura 21 ilustra la inhibición de la reacción tirosinasa-L-tirosina por el neón a diversas temperaturas, y muestra una transición entre 20°C y 25°C.
La Figura 22 ilustra la inhibición de la reacción tirosinasa-L-tirosina por el argón a diversas temperaturas.
La Figura 23 ilustra la inhibición de la reacción tirosinasa-L-tirosina por el kriptón a diversas temperaturas.
La Figura 24 ilustra la inhibición de la reacción tirosinasa-L-tirosina por el xenón a diversas temperaturas.
La Figura 25 ilustra la inhibición de la reacción tirosinasa-L-tirosina exclusivamente por un mecanismo de solubilidad que implica el desplazamiento de oxígeno de la solución.
La Figura 26 ilustra la inhibición de la actividad de la tirosinasa por el nitrógeno.
La Figura 27 ilustra la gran diferencia en la actividad del xenón entre 20°C y 25°C.
La Figura 28 ilustra la inhibición de la glucosaoxidasa por kriptón, xenón, argón, nitrógeno y neón.
La Figura 29 ilustra la inhibición de la \alpha-glutamiltranspeptidasa por kriptón, xenón, argón y una mezcla de kriptón y xenón.
La Figura 30 ilustra la inhibición de la aspartatoaminotransferasa por kriptón, xenón, argón y una mezcla de kriptón y xenón.
La Figura 31 ilustra la intensificación de la \alpha-D- glucosidasa por nitrógeno, neón y oxígeno.
La Figura 32 ilustra la intensificación de la fenilalanina-amoniaco-liasa por neón, oxígeno y nitrógeno.
La Figura 33 ilustra la intensificación de la citratosintasa por xenón y kriptón, y la inhibición de la misma por el argón.
La Figura 34 ilustra la intensificación de la fosfoglucosa-isomerasa por xenón, kriptón, argón y una mezcla de kriptón y xenón a 10°C.
La Figura 35 ilustra la intensificación de la fosfo-glucosa-isomerasa por neón y nitrógeno, y la inhibición de la misma por el oxígeno a 25°C.
La Figura 36 ilustra la intensificación de la S-acetil-CoA-sintetasa por el kriptón y una mezcla de kriptón y xenón a 25°C.
La Figura 37 ilustra el efecto inhibidor de aire y nitrógeno sobre la \beta-glucosidasa a 100 atm de presión a 25°C.
La Figura 38 ilustra el efecto inhibidor del aire y el nitrógeno sobre la \beta-glucosidasa a 30 atm de presión.
La Figura 39 ilustra el efecto inhibidor de aire, xenón y nitrógeno sobre la tirosinasa a 30 atm de presión.
La Figura 40 ilustra el efecto inhibidor de aire, xenón y nitrógeno sobre la tirosinasa a 100 atm de presión.
La Figura 41 ilustra que las concentraciones enzima sustrato influyen en los resultados de la intensificación/inhibi-
ción por los gases nobles.
La Figura 42 ilustra los diferentes efectos de xenón y neón, respectivamente en la intensificación y posterior inhibición de la lactato-deshidrogenasa a 10°C, por ejemplo.
La Figura 43 ilustra que, incluso a 60°C, los gases nobles exhiben efectos intensificadores o inhibidores sobre las enzimas.
La Figura 44 ilustra el efecto del xenón en la intensificación de la \beta-glucosidasa en forma inmovilizada.
La Figura 45 ilustra curvas de potencia-absorbancia uv/vis para \beta-glucosidasa en el aire a cinco concentraciones de sustrato diferentes.
La Figura 46 ilustra curvas de potencia-absorbancia uv/vis para \beta-glucosidasa en xenón a cinco concentraciones de sustrato diferentes.
La Figura 47 ilustra las transformaciones lineales de la tasa de regresión de la curva de potencia de primer orden para las reacciones de \beta-glucosidasa-aire gasificadas.
La Figura 48 ilustra las transformaciones lineales de la tasa de regresión de la curva de potencia de primer orden para las reacciones de \beta-glucosidasa-xenón gasificadas.
Las Figuras 49 y 50 ilustran las linealizaciones de la regresión por aproximación de la velocidad de primer orden para todos los gases estudiados en esta operación.
Las Figuras 51 y 52 ilustran datos de los primeros 160 segundos de un experimento individual con tirosinasa expresados como curvas de potencia para gasificación con aire y posteriormente con xenón.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
De acuerdo con la presente invención, se ha descubierto sorprendentemente ahora que las actividades enzimáticas pueden regularse de una manera controlada y predecible poniendo en contacto una o más enzimas con un gas que contiene uno o más gases nobles. De modo totalmente sorprendente, se ha descubierto que los gases nobles tienen efectos significativos sobre las enzimas incluso a presión baja, y en un amplio intervalo de temperatura.
La presente invención es, de hecho, totalmente sorprendente, por varias razones. En primer lugar, de acuerdo con la presente invención, la regulación de las actividades enzimáticas puede efectuarse a presiones bajas. No obstante, pueden utilizarse presiones más altas. En segundo lugar, pueden obtenerse también resultados excelentes con mezclas de gases nobles, con inclusión de otros gases tales como nitrógeno, oxígeno, dióxido de carbono, monóxido de carbono y óxido nitroso, por ejemplo. En general, puede utilizarse cualquier gas en las mezclas gaseosas además de los presentes gases nobles. No obstante, muy típicamente tales otros gases incluyen oxígeno, nitrógeno y dióxido de carbono.
Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "gas noble" significa cualquier gas del grupo de helio, neón, argón, kriptón, xenón o radón. No obstante, se prefiere generalmente la utilización de neón, argón, kriptón o xenón simplemente porque el helio tiene una solubilidad baja y una tasa elevada de desviación de los sistemas de aplicación, y el radón es peligrosamente radiactivo.
De acuerdo con la presente invención, puede utilizarse un gas noble simple y puro, o pueden utilizarse mezclas de gases nobles. Por ejemplo, es ventajoso utilizar gases residuales económicos de plantas de producción, que tienen una composición de aproximadamente 90% Kr y 10% Xe, en volumen basado en el volumen total de gas. No obstante, pueden utilizarse mezclas de uno o más gases nobles con otros gases, tales como nitrógeno, hexafluoruro de azufre, óxido de carbono u oxígeno, por ejemplo.
De acuerdo con la presente invención, se ha descubierto que los efectos de uno o más gases nobles sobre la actividad enzimática se observan en soluciones, dispersiones o suspensiones acuosas u orgánicas o en otros tipos de matrices, tales como geles. Adicionalmente, las enzimas reguladas pueden estar fijadas o no fijadas a soportes. Los gases nobles propiamente dichos pueden encontrarse en solución, en la atmósfera o en una forma combinada.
La presente invención está basada en el descubrimiento fundamental de que enzimas que representan la totalidad de las seis clases de enzimas, tal como han sido clasificadas por la Comisión Conjunta Sobre Nomenclatura Bioquímica de la Unión Internacional de Bioquímica y la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada, son intensificadas o inhibidas de manera reproducible en su actividad por puesta en contacto incluso a bajas presiones con gases nobles puros o en mezclas de los mismos, o incluso en mezclas con otros gases.
De acuerdo con la presente invención, se ha descubierto que los gases y mezclas gaseosas de la presente invención pueden efectuar un control tanto cinético como termodinámico sobre la actividad enzimática. Es decir, es posible ahora controlar tanto la velocidad como el rendimiento de una reacción enzimática.
Aunque la solubilidad de los presentes gases y mezclas de gases en las mezclas de reacción influye en el efecto medido de los gases y mezclas gaseosas, la solubilidad no determina totalmente el efecto. El efecto es debido en gran parte a efectos moleculares tales como polarizabilidad, ionicidad, fuerzas de Van der Waals y radios atómicos. Por regla general, de acuerdo con la presente invención, el aumento de temperatura limitará el gas disponible, debido a solubilidad decreciente, y reducirá los efectos. No obstante, esta disminución en el efecto se ve contrarrestada por un aumento en la polarizabilidad con la temperatura creciente. Así, a temperaturas de aproximadamente 30°C y mayores, la polarizabilidad incrementada de los gases y mezclas gaseosas tiene una influencia más acusada en cuanto al efecto de los gases y mezclas de gases que las características de solubilidad.
Por lo general, al aumentar la concentración molar del gas noble o de las mezclas de gases nobles por encima de la temperatura y presión estándar (STP), el efecto observado sobre la enzima se incrementa. Adicionalmente, los efectos parecen estar basados en la interacción de las moléculas gaseosas con las enzimas, el cual es independiente de la adición de otros gases, pero puede mejorarse o potenciarse por la misma. En particular, las mezclas de gases nobles se comportan de la misma manera que los gases nobles puros, y se ha encontrado que las mezclas de varios gases imitan, invierten o mejoran los efectos observados con un solo gas noble.
Adicionalmente, de acuerdo con la presente invención, se ha descubierto que un gas noble particular o mezclas de los mismos puede (n) inhibir o intensificar la actividad enzimática frente a la temperatura.
Adicionalmente, de acuerdo con la presente invención se ha descubierto que, en general, en las condiciones apropiadas de pH, temperatura, presión, [E] y [S], todas las enzimas pueden ser inhibidas específicamente por cada uno de los gases nobles de la presente invención.
La presente invención se puede utilizar para regular las actividades enzimáticas en cualquier aplicación en la que se utilicen enzimas. Por ejemplo, la presente invención puede utilizarse ventajosamente en la producción de antibióticos, tales como penicilina; en la producción de etanol y ácido acético; en la fabricación de estuches de diagnóstico; en la fabricación de productos de fermentación, tales como cerveza, vino y queso; y en las conversiones enzimáticas en gran escala en general.
Como se ha indicado anteriormente, la presente invención puede utilizarse ventajosamente en la regulación de las actividades de enzimas de cualquiera de las seis categorías de enzimas reconocidas. Los ejemplos proporcionados más adelante en esta memoria son ilustrativos y no tienen por objeto ser limitantes.
En particular, la presente invención puede utilizarse ventajosamente en la regulación de las oxidorreductasas, que incluyen, por ejemplo, deshidrogenasas, oxidasas, per-oxidasas, hidroxilasas y oxigenasas. Ejemplos específicos de oxidorreductasas son tirosinasa, glucosaoxidasa, acetoin-deshidrogenasa, taurina-deshidrogenasa, octopina-deshidrogenasa, azobenceno-reductasa, acetoindoxil-oxidasa, hipotaurina-deshidrogenasa, pseudomonascitocromo-oxidasa, 3-hidroxiantranilato-oxidasa, cloruro-peroxidasa, citocromo-C3-hidrogenasa, meliotato-3-monooxigenasa, CDP-4-ceto-6-desoxi-desglucosa-reductasa y rubredoxin-NaD^{+}-reductasa y clorato-reductasa, por ejemplo. No obstante, puede utilizarse cualquier enzima que sea una oxidorreductasa.
Una segunda categoría de enzimas que pueden ser reguladas de acuerdo con la presente invención son las transferasas. Ejemplos específicos de transferasas son carnosina-N-metil-transferasa, 3-oxoacil proteína portadora de acilo-sintasa, laminarribosa-fosforilasa, galactosa-6-sulfuril-asa, diyodo-tirosina-aminotransferasa, sedoheptiloquinasa y psicosina-sulfurotransferasa, 8-glutamil-transpeptidasa y aspartato-aminotransferasa, por ejemplo. No obstante, puede utilizarse cualquier transferasa.
Una tercera categoría de enzimas que pueden ser reguladas de acuerdo con la presente invención son las hidrolasas, que incluyen esteraras, fosfatasas, glicosidasas y peptidasas, por ejemplo.
Ejemplos específicos de hidrolasas son dihidrocumarina-hidrolasa, \beta-D-glucosidasa, \alpha-glucosidasa, ribosohomocisteinasa, acilmuramilalanina-carboxipeptidasa, ureido-succinasa, floretin-hidrolasa y 2-haloacido-deshalogenasa, por ejemplo. No obstante puede utilizarse cualquier hidrolasa.
Una cuarta categoría de enzimas que pueden ser reguladas de acuerdo con la presente invención son las liasas, que incluyen descarboxilasas, aldolasas y deshidratasas, por ejemplo. Ejemplos específicos de liasas son fenilalanina-amoniaco-liasa, citrato-sintetasa, metil-glioxil-sintasa., ureidoglicolato-liasa, aliinliasa, corismato-sirtasa y alquil-mercurio-liasa, por ejemplo. No obstante, puede utilizarse cualquier liasa.
Una quinta categoría de enzimas que pueden ser reguladas de acuerdo con la presente invención son las isomerasas, con inclusión de racemasas, epimerasas, cis-transisomerasas, oxidorreductasas intramoleculares y transferasas intramoleculares, por ejemplo. Ejemplos específicos que se pueden mencionar son glucosa-fosfato-isomerasa, UDP-arabinosa-4-epimerasa, maleil-acetoacetato-isomerasa, corismato-mutasa y muconato-cicloisomerasa, por ejemplo. No obstante, puede utilizarse cualquier isomerasa.
Una sexta categoría de enzimas que pueden ser reguladas de acuerdo con la presente invención son las ligasas, las cuales incluyen aminoácido-RNA-ligasas, ácido-tiol-ligasas, amida-sintetasas, péptido-sintetasas y cicloligasas, por ejemplo. Puede hacerse mención específica de acetilcolina-ligasa, seril-2-RNA-sintetasa, carnosinasintetasa y metil-crotonil-CoA-carboxilasa, por ejemplo. No obstante, puede utilizarse cualquier ligasa.
Aunque la presente invención proporciona generalmente un método para regular las actividades enzimáticas, la misma proporciona también varios métodos específicos adicionales.
En primer lugar, la presente invención proporciona también un método de intensificación de las actividades enzimáticas por puesta en contacto de una o más enzimas con un gas que contiene uno o más gases nobles o mezclas de los mismos.
En segundo lugar, la presente invención proporciona también un método de inhibición de las actividades enzimáticas por puesta en contacto de una o más enzimas con un gas que contiene uno o más gases nobles o mezclas de los mismos.
En tercer lugar, la presente invención proporciona un método de desplazamiento del pH y/o la temperatura óptimos de una o más enzimas por puesta en contacto de una o más enzimas con un gas que contiene uno o más gases nobles o mezclas de los mismos.
En cuarto lugar, la presente invención proporciona un método particular para regular las actividades enzimáticas de las oxidorreductasas por puesta en contacto de una o más enzimas oxidorreductasa con un gas que contiene uno o más gases nobles o mezclas de los mismos.
En quinto lugar, la presente invención proporciona también un método para la regulación específica de la actividad enzimática de las hidrolasas por puesta en contacto de una o más enzimas hidrolasa con un gas que contiene uno o más gases nobles o mezclas de los mismos.
En sexto lugar, la presente invención proporciona también un método para la regulación específica de la actividad enzimática de las liasas por puesta en contacto de una o más enzimas liasa con un gas que contiene uno o más gases nobles o mezclas de los mismos.
En séptimo lugar, la presente invención proporciona también un método para la regulación específica de la actividad enzimática de las isomerasas por puesta en contacto de una o más enzimas isomerasa con un gas que contiene uno o más gases nobles o mezclas de los mismos.
En octavo lugar, la presente invención proporciona también un método la regulación específica de la actividad enzimática de las ligasas por puesta en contacto de una o más enzimas liasa con un gas que contiene uno o más gases nobles o mezclas de los mismos.
En noveno lugar, la presente invención proporciona también un método para la regulación específica de la actividad enzimática de las transferasas por puesta en contacto de una o más enzimas transferasa con un gas que contiene uno o más gases nobles o mezclas de los mismos.
En décimo lugar, la presente invención proporciona también un método para cambiar la concentración óptima relativa enzima-sustrato por puesta en contacto de una o más enzimas con un gas que contiene uno o más gases nobles o mezclas de los mismos.
En undécimo lugar, la presente invención proporciona también un método pafa regular selectivamente una enzima en una mezcla de dos o más enzimas.
Es muy importante que los ejemplos de enzimas enumerados anteriormente de cada una de las seis categorías generales de enzimas son meramente ilustrativos, y no tienen por objeto ser limitantes. De acuerdo con la presente invención, puede ser regulada cualquier enzima utilizando los presentes gases y mezclas de gases. Por ejemplo, cualquiera de las enzimas descritas en Enzymes por M. Dixon y E.C. Webb, Tercera Edición (Academic Press) pueden ser reguladas de acuerdo con la presente invención.
Por regla general, como se ha indicado anteriormente, el gas que contiene uno o más gases nobles puede ser un gas noble individual puro o una mezcla de gases nobles. El gas puede ser también una mezcla de uno o más gases nobles con otros gases como se ha mencionado anteriormente.
Las enzimas pueden encontrarse en cualquier forma. Por ejemplo, la enzima regulada puede encontrarse en solución acuosa, solución de base acuosa o solución orgánica. La enzima puede encontrarse también en otras matrices, por ejemplo en un gel. Asimismo, la enzima puede encontrarse en forma no combinada o combinada, e incluso en forma combinada en células, o en células vivas, tales como plantas y otros tejidos.
En la utilización de la presente invención para regular las enzimas combinadas, por ejemplo, la presente invención puede utilizarse en numerosos tipos de aplicaciones. Por ejemplo, las enzimas combinadas pueden encontrarse en uso en reactores discontinuos, reactores de depósito agitado con flujo continuo, reactores de columna, tales como un reactor de lecho de relleno, o incluso reactores de lecho fluidizado.
Adicionalmente, el uso de enzimas combinadas en células es ventajoso en aquellos casos en que el coste de la extracción y purificación de las enzimas es prohibitivo, o donde la enzima es inestable cuando se separa de su entorno nativo. Por ejemplo, se puede preparar L-citrulina utilizando células inmovilizadas de Pseudomonas putida, y se puede preparar ácido urocánico utilizando células inmovilizadas de Achromobacter liquidium.
Además, la presente invención puede utilizarse también para regular la actividad enzimática en conjunción con electrodos enzimáticos, tales como un electrodo utilizado para medir glucosa utilizando glucosa-oxidasa.
La presente invención se puede utilizar ventajosamente siempre que se desee la regulación de la actividad enzimática de una manera controlable y predecible.
Con objeto de describir adicionalmente la presente invención, se expondrá a continuación cada una de las seis clases básicas ce enzimas con mayor detalle.
I. Oxidorreductasas
Generalmente, las enzimas oxidorreductasa son fuertemente inhibidas por los gases nobles. No obstante, el grado de inhibición varía de un gas noble a otro, y de una mezcla de gases nobles a otra.
El xenón exhibe el efecto máximo sobre la velocidad de las reacciones de las oxidorreductasas y deprime el equilibrio final de las reacciones. Los otros gases nobles inhiben todos ellos las velocidad de reacción y deprimen el equilibrio final de la reacción en menor grado, dependiendo de su solubilidad y sus propiedades moleculares. El kriptón tiene un efecto algo menor que el xenón, y el argón es muy activo a temperaturas bajas. Así, de acuerdo con la presente invención, pueden utilizarse diferentes mezclas gaseosas para optimizar la actividad de las oxidorreductasas dependiendo de si se utiliza la temperatura ambiente o temperaturas refrigeradas.
Utilizando uno o más gases nobles o mezclas de los mismos, se obtienen inhibiciones variables de las oxidorreductasas dependiendo del gas o mezcla de gases precisos, del sustrato, de la temperatura y de la presión del gas.
II. Transferasas
Por lo general, las enzimas transferasa son inhibidas generalmente. Por ejemplo, las aminotransferasas son inhibidas y las transpeptidasas son inhibidas por los gases nobles o mezclas de los mismos.
Generalmente, el kriptón exhibe el máximo efecto inhibidor con cierta variación dependiendo de la subclase de transferasa que se someta al mismo. En contraste, el neón exhibe el mínimo efecto inhibidor o intensificador dependiendo de la subclase de transferasa utilizada.
III. Hidrolasas
Generalmente todas las hidrolasas son fuertemente intensificadas por los gases nobles o mezclas de los mismos.
En particular, el xenón exhibe el efecto intensificador máximo, mientras que el kriptón exhibe dicho efecto en grado mínimo.
No obstante, si se desea, las hidrolasas pueden ser también inhibidas.
IV. Liasas
En general, las enzimas liasa son fuerte o moderadamente intensificadas por los gases nobles o mezclas de los mismos. No obstante, algunos gases inhiben la actividad enzimática de las liasas en condiciones subóptimas.
El xenón exhibe el efecto intensificador máximo, mientras que el argón exhibe dicho efecto en grado mínimo.
V. Isomerasas
En general, las enzimas isomerasa son fuerte o moderadamente intensificadas por los gases nobles o mezclas de los mismos.
No obstante, el argón y las mezclas que contienen el mismo pueden ser inducidos a inhibir la actividad enzimática a temperaturas irás altas.
VI. Ligasas (sintetasas)
En general, las enzimas ligasa son fuertemente intensificadas por los gases nobles o mezclas de los mismos.
Con objeto de esclarecer el protocolo utilizado en la medida del efecto de uno o más gases nobles sobre la actividad enzimática de acuerdo con la presente invención, se proporciona la descripción siguiente de un protocolo experimental típico e ilustrativo.
Protocolo general Preparación de la solución
Se preparan soluciones optimizadas p/v por dilución de la enzima (unidades/ml) y el sustrato (\mug/ml) en tampón apropiado (pH y molaridad optimizados para las enzimas). Las soluciones se utilizan para experimentos con gases inmediatamente a fin de evitar pérdida de actividad. Pueden emplearse diversas concentraciones de enzima y sustrato e inhibidores. Los parámetros físicos se modifican en caso requerido.
Equipo espectrofotométrico
Las operaciones experimentales se realizan con un espectrofotómetro Perkin Elmer Lambda 6 UV/VIS, controlado por temperatura, conectado a un ordenador personal IBM PS/2 30. El ordenador IBM está cargado con dos paquetes de soporte lógico (PECSS o UVDM para registrar y visualizar los espectros, ENZFITTER modificado y Grafit para realizar los estudios cinéticos).
Espectros de campo total
La adquisición de los espectros de campo total de las especies de enzimas y sustratos, así como las mezclas de reacción completadas, permite la determinación de una longitud de onda adecuada para seguir la reacción enzimática (longitud de onda correspondiente al pico de absorbancia principal), en una base de tiempo real. Las especies absorbentes se miden y se corrigen por ensayo en blanco. Pueden utilizarse diversos sustratos cromógenos, y en ciertas circunstancias, las reacciones cromógenas pueden acoplarse a la reacción enzimática objeto del estudio.
Series de dilución
Se realizan series de dilución para encontrar la relación óptima enzima/sustrato para la realización de los experimentos con gases. Las reacciones se efectúan en condiciones óptimas, a continuación con campos de sustrato super- y subóptimos, y finalmente con diversos inhibidores.
Preparación de las cubetas selladas con silicona
Cubetas acrílicas o de cuarzo de 1 cm de camino de luz se tapan con sellador de caucho de silicona. La silicona se deja curar durante 48 horas a fin de obtener cubetas de cierre hermético a los gases. Las cubetas se purgan con aire para eliminar cualesquiera contaminantes químicos gaseosos tal como se mide por GC/MS, y se ensayan en cuanto a fugas.
Preparación de las muestras
Las cubetas se llenan con 2 ml de solución de sustrato por medio de una jeringuilla hermética a los gases. Los viales de suero herméticos a los gases se llenan con enzima y disolvente. Se hace borbotear sucesivamente una cantidad suficiente de gas en las cubetas y los viales de suero, con espera de 1 hora entre inyecciones para maximizar la equilibración del gas. Todas las jeringuillas y los espacios muertos se purgan antes del llenado con el gas apropiado. La cantidad de gas utilizada se ha dosificado de modo que sea suficiente para saturar la solución requerida.
Controles
Se controlan todos los parámetros causantes de interferencia posibles, con inclusión de T, P, otros gases, fugas de aire, materiales, variación en la calidad del gas y de los reactivos, y pH. Se realizan repeticiones hasta que se alcanzan valores significativos.
Impulso de tiempo espectrofotométrico, velocidad de reacción, y análisis cinéticos
Se saturan las cubetas y los viales de suero con gas 40 minutos antes de la operación. Se utiliza una jeringuilla llena de gas para recuperar 0,5 ml de solución de enzima a fin de evitar el contacto con el aire. Las inyecciones de enzima de 0,5 ml con la jeringuilla se realizan simultáneamente a fin de obtener un tiempo de partida común para las muestras. Se hacen pasar 7 gases (aire, O_{2}, N_{2}, Ne, Ar, Kr, Xe) a diversas temperaturas en cada caso (desde 0 a 60°). Se registran los cambios en la velocidad o el equilibrio final de la reacción frente al aire ambiente. Se efectúa también una comparación con adición de oxígeno, y con desoxigenación. Se preparan también algunas muestras a presión.
El protocolo experimental completo
En un experimento completo, se hace reaccionar una enzima a pH y concentración de sal tampón óptimos con 5 concentraciones de sustrato en solución con gas noble a 1 atm (solución saturada), a 10% y 50% de la saturación, y a 1,5 y 2 atm y al menos una presión mucho mayor, y con un equivalente de oxígeno complementario hasta 10%, 20%, y 50% del gas total y a 1 y 2 atm de presión total, para cada temperatura desde 0 a 65°C en incrementos de 5°, utilizando N_{2}, O_{2}, Ar, Ne, Kr, Xe, aire y ocasionalmente otros gases, y utilizando mezclas de tipo decil de los gases anteriores, además de la enzima se expone a presiones muy altas en un control hidrostático. Se realizan también controles después de la evacuación de la solución llevándola a vacío. La reacción se observa colorimétricamente en un espectrofotómetro de barrido en tiempo real, y las señales se tratan matemáticamente para obtener las diferencias de velocidad y rendimiento. Los números de muestras son constantes y suficientes para asegurar la significación de los resultados. Todos los parámetros se controlan y miden independientemente, y ocasionalmente se llevan a cabo experimentos más complejos.
Se obtienen los datos en la forma de gráficas de formación de producto en tiempo real (curvas de velocidad estándar), una para cada cubeta de muestra, las cuales se superponen conforme al procedimiento estándar para dar una superposición por cada 6-12 experimentos de cubeta. Se añade como apéndice una superposición de este tipo. Se producen también las tablas de puntos de datos x-y que permiten construir estas curvas más todos los parámetros de la máquina. Estos datos pueden transformarse ulteriormente para calcular diferencias entre curvas, diferencias entre rendimientos, diferencias entre velocidades, u otras comparaciones lógicas. Éstas se calculan utilizando varios programas de soporte lógico separados que utilizan expresiones matemáticas ordinarias simples o complejas, ajuste de curvas por regresión lineal o no lineal, transformaciones logarítmicas normales, cálculos de velocidades enzimáticas (Michaelis-Menten, Eadie-Hofstee, Lineweaver-Burk), y análisis multivariantes dependientes del tiempo.
Con objeto de describir más completamente la presente invención, se hará referencia ahora a ciertos ejemplos que se proporcionan exclusivamente para fines de ilustración, y que no tienen por objeto ser limitantes.
Clase I. Oxidorreductasas (EC1) Ejemplo 1 Tirosinasa
a 25°C y condiciones de reacción óptimas, saturación simple de la solución con gas
Gas noble o mezcla Efecto
Xe -73% (inhibición)
Kr -73%
Ar -60%
Ne -46,7%
Mezcla 90:10 Xe:Kr -50%
Ar:Xe 99:1 -70%
Ejemplo 2 Glucosa-oxidasa
Gas noble o mezcla Efecto
Xe -91,6% (inhibición)
Kr -92,7%
Ar -85,8%
Ne -61,7%
Máximos por clase:
Xe -95% (inhibición)
Kr -91%
Ar -91%
Ne -85%
En particular, los resultados anteriores son dependientes de la temperatura y la concentración de sustrato.
Clase II. Transferasas (EC2) Ejemplo 3 Gamma-Glutamil-transpeptidasa
Gas noble o mezcla Efecto
Xe -7% (inhibición)
Kr -8%
Ar -5%
Ne -3%
Ejemplo 4 Aspartato-aminotransferasa
Gas noble o mezcla Efecto
Xe -17% (inhibición)
Kr -82%
Ar -17%
Ne -12%
Clase III. Hidrolasas (EC3) Ejemplo 5 Beta-D-Glucosidasa
Gas noble o mezcla Efecto
Xe +40% (intensificación)
Kr +14%
Ar +16%
Mezcla 90:10 Xe:Kr +18%
Los resultados anteriores son dependientes de la temperatura, la concentración de sustrato, y el tipo de sustrato. Con la adición de diferentes sustratos en competencia, se obtuvieron intensificaciones de hasta 200% utilizando xenón.
Clase IV. Liasas (EC4) Ejemplo 6
Los resultados son variables con la temperatura y el valor [E/S]. Para la reacción del complejo citratosintetasa:
35°C 25°C 10°C
Xe +32 0 +18
Kr +32 +6 +37
90:10 0 +16 -32
Ar -15 -10 +25
Ne -14 +9 +11
N_{2} -17 -25 -6
Ejemplo 7
Para la fenilalanina-amoniaco-liasa con concentración de enzima optimizada:
Xe +18 +3 +5
Kr +7 +4 +4
90:10 +5 +2 +1
Ar +6 +1 +3
Ne --2 +6 -6
N_{2} +19 0 +6
Ejemplo 8
Para fenilalanina-amoniaco-liasa con concentración subóptima de enzima:
Xe +14 +8 +11
Kr +3 +18 +14
90:10 +5 +8 +6
Ar -1 +1 +6,5
Ne +15 0 +6
N_{2} 0 0 +12
Clase V. Isomerasas (EC5) Ejemplo 9 Triosafosfato-isomerasa, 10°C
Gas noble o mezcla Efecto
Xe +24% (intensificación)
Kr +12%
Ar +8% (pero-37% de inhibición a 25°C)
Ne +4%
90:10 Xe:Kr +6,3%
Ejemplo 10 Fosfoglucosa-isomerasa
Gas noble o mezcla Efecto
Xe +186% (-61% en condiciones de esfuerzo)
Kr +206,4%
Ar +232,5%
Ne +107% (-45% en condiciones de esfuerzo)
Condiciones de esfuerzo se refiere a condiciones de concentración o temperatura del sustrato no óptimas.
Clase VI. Ligasas (sintetasas) (EC6)
Estas enzimas son intensificadas pero en grado muy variable; específicas de sitio extremadamente activo.
Intensificación máxima observada frente a la inhibición máxima observada (dependiendo de la temperatura).
Ejemplo 11 Acetil-S-CoA-sintetasa
En una secuencia de reacción compleja acoplada con inclusión de enzimas hidrolíticas:
Xe +18,3%/-25,0%
Kr +16,1/-34,6%
Ar +67,7%/+34,6%
Ne +2,3%/-21,9%
90/10 +16,1%/-38,5%
N_{2} +31,2%/-39,5%
Ejemplo 12
Como una reacción aislada:
Xe +15,4%/-39,5%
Kr +5,0%/-52,6%
Ar +75,4%/-27,6%
90/10 +5,0%/-57,9%
N_{2} +35,7%/-118,7%
En general, a temperaturas más altas se produce inhibición. A temperaturas bajas, se produce intensificación. El nitrógeno tiene usualmente un efecto mucho menor que los gases nobles excepto a temperaturas superóptimas. Los autores de la invención han observado que los gases nobles intensifican esta reacción para rendimientos y velocidades óptimos en condiciones que eran en caso contrario subóptimas para la reacción. Se están encontrando resultados mixtos en condiciones óptimas, lo cual depende del gas utilizado.
La presente invención se describirá adicionalmente a continuación haciendo referencia a ejemplos ulteriores que se proporcionan para propósitos de ilustración y no tienen por objeto ser limitantes.
Reacción catalizada por tirosinasa
La tirosinasa (monofenol, dihidroxifenilalanina: oxígeno-oxidorreductasa; EC 1.14.18.1) es una monofenol- monooxigenasa que cataliza la reacción de orto-difenoles a ortoquinonas.
La tirosinasa es importante en la coloración tostada de los frutos y la pudrición de los productos alimenticios.
Protocolo experimental 1. Preparación de la solución
Se preparan soluciones al 10% p/v por dilución de la enzima (unidades/ml) y el sustrato (\mug/ml) en tampón de fosfato de sodio (pH 6,85, pH optimizado para las enzimas). Las soluciones se guardan en el frigortfico (0-5°C) y se utilizan para experimentos con gases en el transcurso de 2 ó 3 días a fin de evitar la pérdida de actividad.
2. Equipo espectrofotométrico
Las operaciones experimentales se realizan con un espectrofotómetro Perkin-Elmer Lambda 6 UV/VIS conectado a un ordenador personal IBM PS/2 30. El ordenador IBM está cargado con dos paquetes de soporte lógico (PECSS para registrar y visualizar los espectros, ENZFITTER para realizar los estudios cinéticos).
3. Espectros de campo total
La adquisición de los espectros de campo total de E, S, y E+S permite la determinación de una longitud de onda adecuada para seguir la reacción enzimática (longitud de onda correspondiente al pico de absorbancia principal).
4. Series de dilución
Se realizan series de dilución de E frente a S, y S frente a E, para encontrar la relación [E/S] óptima para proceder con los experimentos de gases. De acuerdo con las lecturas de absorbancia, se elige la mejor de las dos muestras en blanco (tampón + E o tampón + S).
5. Preparación de las cubetas selladas con silicona
Se tapan cubetas acrílicas desechables de 1 cm de paso de luz con sellador de caucho de silicona transparente. La silicona se deja curar durante 48 horas a fin de obtener cubetas herméticas a los gases.
6. Preparación de las muestras de ejecución
Se llenan las cubetas acrílicas con 2 ml de solución sustrato por medio de una jeringuilla hermética a los gases. Se llenan con la enzima viales de suero herméticos a los gases. Se borbotean consecutivamente 3 x 10 cm^{3} de gas en las cubetas y los viales de suero, con espera de una hora entre inyecciones. Esto representa un desplazamiento de 10 x de volumen muerto mientras se maximiza la equilibración de gas. Todas las jeringuillas y los espacios muertos se purgan antes dé llenado con el gas apropiado. Después de la tercera inyección de 10 cc, las cubetas y los viales de suero se dejan durante una noche bajo dos jeringuillas de 10 cc llenas con el gas apropiado en el frigorífico a 0-5°C.
7. Controles
Se controlan todos los parámetros posibles causantes de interferencia, con inclusión de T, P, otro gas, fugas de aire, materiales, variación en la calidad del gas y los reactivos, y pH. Se realizan repeticiones hasta alcanzar valores significativos.
8. Operaciones espectrofotométricas
Las cubetas y los viales de suero se llenan con 10 cc de gas 40 min antes de la operación. Se utiliza una jeringuilla hermética a los gases para recuperar 0,5 ml de solución enzimática a fin de evitar el contacto con el aire. Las inyecciones de 0,5 ml de enzima con la jeringuilla se realizan simultáneamente para obtener un tiempo inicial común to para las muestras. Se hacen pasar 7 gases (aire, O_{2}, N_{2}, Ne, Ar, Kr, Xe) a 5 temperaturas cada uno (15°C, 20°C, 25°C, 30°C, 35°C). Se registran los cambios en la velocidad o el equilibrio final de la reacción frente al aire ambiente.
2. Reactivos
Tirosinasa (Sigma Chemical Co., St Louis, MO):
\bullet
Catálogo No. T-7755 (lote 48 F-9610)
\bullet
Monofenol-monooxigenasa; polifenol-ox idasa; catecol-oxidasa; monofenol, dihidroxifenil-alanina: oxigeno-oxidorreductasa; (EC 1.14.18.1)
\bullet
de champiñón
\bullet
25.000 unidades
12 mg de sólidos
\bullet
2.200 unidades/mg de sólidos (actividad de tirosinasa)
\bullet
Definición de la unidad de tirosinasa: una unidad causará un aumento en A_{280} de 0,001 por min a pH 6,5 a 25°C, utilizando como sustrato L-tirosina. Volumen de reacción de 3 ml (camino de luz 1 cm)
\bullet
Se guarda desecada por debajo de 0°C
L-tirosina (Sigma Chemical Co., St Louis, MO):
\bullet
Catálogo No. T-3754 (lote 48F-0833)
\bullet
L-3-[4-hidroxifenil]alanina
\bullet
Base libre (pfs cristalina)
\bullet
Anhidra, peso molecular 181,2
\bullet
Se guarda a la temperatura ambiente (25°C)
Fosfato de sodio monobásico (E K Industries, Addison, IL)
\bullet
Catálogo No. 8680
\bullet
NaH_{2}PO_{4} \cdot H_{2}O
\bullet
Cristales de reactivo
\bullet
FW 137,99
Fosfato de sodio dibásico (E K Industries, Addison, IL)
\bullet
Catálogo No. 8720
\bullet
Na_{2}HPO_{4}
\bullet
Anhidro
\bullet
FW 141,96
Agua desionizada, H_{2}0 (Barnstead NANOpure II)
3. Preparación de las soluciones
Tampón de fosfato de sodio, pH 6,85 (25°C):
\bullet
138 g NaH_{2}PO_{4} \bullet H_{2}0
\bullet
142 g Na_{2}HPO_{4}
\bullet
en 20 l de H_{2}O desionizada
\bullet
Se guarda a la temperatura ambiente (25°C) en una bombona de plástico
Solución de tirosinasa (100 \mug/ml; 208 unidades/ml; 2,08 unidades/\mug):
\bullet
10% p/v en tampón de fosfato de Na
\bullet
Se mezcla varias veces por inversión para disolver el contenido
\bullet
Se guarda en el frigorífico [0-5°C] en un frasco de HDPE de 125 ml envuelto en papel de aluminio (para evitar la degradación por la luz)
Solución de L-tirosina (100 \mug/ml):
\bullet
10% p/v en tampón de fosfato de Na
\bullet
Agitación magnética (25°C, 30 min)
\bullet
Se guarda en frigorífico [0-5°C] en un frasco de vidrio ámbar de 250 ml
4. Atmósferas gaseosas
Aire (ambiente)
Argón (Alphagaz, grado investigación)
Kriptón (Alphagaz grado investigación, pureza mínima 99,995% [ppm])
Neón (Alphagaz, grado investigación, pureza mínima 99,999% [ppm])
Nitrógeno (Alphagaz, grado investigación, pureza mínima 99,9995% [ppm])
Oxígeno (Alphagaz, grado investigación, pureza mínima 99,997% [ppm])
Xenón (Alphagaz, grado investigación, pureza mínima 99,995% [ppm])
5. Instrumentos y materiales 5.1. Instrumentos
Espectrofotómetro Perkin-Elmer Lambda 6 UV/VIS (espectrofotómetro de banda estrecha) equipado con receptáculos de 5 celdas termoeléctricos de transporte automático (5 x 5 Sample and Reference Cell Holder, modelo C 005-0515)
Interfaz Accessory Perkin-Elmer Lambda (modelo C 691-0000)
Controlador Digital Perkin-Elmer (modelo C 570- 0701)
Programador de Temperatura Perkin-Elmer (modelo C 570-0710)
Ordenador personal IBM PS/2 30
Impresora Epson EX 800
Soporte lógico:
\bullet
IBM DOS (Disk Operating System Version 3.30, Boca Raton, FL)
\bullet
PECSS (Perkin-Elmer Computerized Spectroscopy Software, Norwalk, CT)
\bullet
ENZFITTER (Programa de Análisis de Datos por Regresión No Lineal, Elsevier-BIOSOFT, Cambridge, Reino Unido)
\bullet
PIZAZZ PLUS (Print Enhancement Software, APTEC, Pepperell, MA)
Balanza Mettler AE100:
\bullet
Intervalo de pesada: 0...109 g
\bullet
Precisión: 0,1 mg
Sistema de desionización de cartuchos Barnstead NANOpure II, Tokyo Rikakikai Co. Micro Tubing Pump MP-3 (para las celdas Perkin-Elmer enfriadas con agua).
5.2. Materiales
Matraces aforados de 100 y 200 ml
Cubetas Acrílicas FISHERbrand (tipo estándar/metacrilato/grado UV/desechables): cubetas cuadradas de camino de luz 1 cm, capaces de contener 3 ml de solución
Sellador de caucho de silicona 100% (transparente)
Viales de suero con tapón de caucho de 3 ml
Pipetas serológicas desechables de 1 ml divididas en 1/100 ml
Jeringuillas de tuberculina desechables de 1 cc divididas en 1/100 cc
Jeringuillas desechables de 10 cc en 1/5 cc
Agujas desechables 20 G ½''
6. Desarrollo de la técnica 6.1. Observaciones iniciales
Se ejecutaron barridos de campo total (900-190 nm) con tirosinasa, L-tirosina, y los productos finales de la reacción enzimática.
\newpage
6.1.1. Disposición experimental
PARAM: Absorbancia
Rendija 1 nm
Velocidad de barrido 1.500 nm/min
Tiempo de respuesta 1 s
Autoguardado: sí
AZERO: Corrección por ruido de fondo (900-190 nm)
BARRIDO: Intervalo de datos 1,0 nm
Temperatura: ambiente (26°C), programador de temperatura desconectado
6.1.2. Barridos de campo total
Barrido [900-190 nm] de tirosinasa (fig. 1):
Muestra: 2,5 ml de tirosinasa (100 \mug/ml)
Blanco: 2,5 ml de tampón de fosfato de sodio
Nombre de archivo: T 775501.SP
Barrido: (900-190 nm) de L-tirosina (fig. 2):
Muestra: 2,5 ml de L-tirosina (100 \mug/ml)
Blanco: 2,5 ml de tampón de fosfato de sodio
Nombre de archivo: T 375401.SP
Barrido: [900-190 nm] de los productos finales (fig. 3-4):
Muestra: 2 ml de L-tirosina (100 \mug/ml)
+ 0,5 ml de tirosinasa (100 \mug/ml) después de un tiempo de reacción de 20 minutos
Blanco: 2 ml de L-tirosina (100 \mug/ml)
+ 0,5 ml de tampón de fosfato de Na
Nombre de archivo: TCEB0081.SP
6.1.3. Determinación de los picos de absorbancia principales
Para este propósito, se utilizó el cursor de gráficos (tecla Home).
Tirosinasa: Absorbancia máxima a 275 nm (proteína)
L-tirosina: Absorbancia máxima a 275 nm
Productos de reacción finales: Absorbancia máxima a 480 nm y 305 nm.
6.1.4. Determinación de una longitud de onda adecuada para seguir la reacción
La superposición de los tres espectros de campo total (Fig. 5) sugiere la observación óptima de oxidorreducción enzimática de L-tirosina a 480 ó 305 nm.
6.1.5. Determinación de una relación [E]/[S] apropiada
T-3754 T-7775 Tampón de [E]
(100 \mug/ml) (100 \mug/ml) Fosfato de Na Final
(ml) (ml) (ml) (100 \mug/ml)
Muestra 5 2 0,1 0,4 20
Muestra 4 2 0,2 0,3 40
Muestra 3 2 0,3 0,2 60
Muestra 2 2 0,4 0,1 80
Muestra 1 2 0,5 0,0 100
Los impulsos de tiempo se ejecutaron utilizando el comando programador de celdas (CPRG), que registra los datos de impulso de tiempo (TDrive) de hasta 5 celdas simultáneamente.
Longitud de onda 480 nm: superposición (fig. 6) 45 puntos, intervalos de 60 s \rightarrow ejecución 45 min
TCEB0091.SP [enz.] = 100 \mug/ml Celda 1
TCEB0092.SP [enz.] = 80 \mug/ml Celda 2
TCEB0093.SP [enz.] = 60 \mug/ml Celda 3
TCEB0094.SP [enz.] = 40 \mug/ml Celda 4
Longitud de onda 305 nm: superposición (fig. 7) 60 puntos, intervalos de 60 s \rightarrow ejecución 1 h
TCEB0101.SP [enz.] = 100 \mug/ml Celda 1
TCEB0102.SP [enz.] = 80 \mug/ml Celda 2
TCEB0103.SP [enz.] = 60 \mug/ml Celda 3
TCEB0104.SP [enz.] = 40 \mug/ml Celda 4
TCEB0105.SP [enz.] = 20 \mug/ml Celda 5
Conclusión
Las condiciones óptimas son [E]/[S] (100 \mug/ml)/(100 \mug/ml), observándose los cambios de absorbancia a 305 nm.
6.2. Experimentos preliminares 6.2.1. Preparación de muestras y referencias
Muestras saturadas con xenón (véase procedimiento de toma de muestras)
Muestras de aire: Cubetas acrílicas llenas con 2 ml de sustrato T-3754 con una pipeta de 1 ml, y tapadas con cápsula de plástico. Este procedimiento se cambió ulteriormente del uso de cápsulas de plástico a la utilización de cubetas cerradas herméticamente con silicona.
No se encontró diferencia significativa alguna.
Referencias (muestras en blanco): cubetas acrílicas tapadas con cápsula de plástico.
\bullet
B1: 2 ml T-3754 (100 \mug/ml) + 0,5 ml tampón Fos. Na
\bullet
B2: 2 ml tampón Fos. Na + 0,5 ml T-7755 (100 \mug/ml).
\newpage
6.2.2. Impulsos de tiempo a 305 nm
Blanco B1:
\bullet
Muestra de AIRE: nombre de archivo = TCEB0114.SP
\bullet
Muestra de XENÓN: nombre de archivo = TCEB0115.SP
Blanco B2:
\bullet
Muestra de AIRE: nombre de archivo = TCEB0116.SP
\bullet
Muestra de XENÓN: nombre de archivo = TCEB0117.SP
Se encuentra que la muestra en blanco de L-tirosina (B1) deprime las lecturas de absorbancia, por lo que se utiliza con preferencia el experimento con la muestra en blanco de tirosinasa (B2).
Estos cuatro impulsos de tiempo exhiben una curva de inhibición óptima para xenón. Con las últimas operaciones (6.3.7. y 7.2.) la solución de L-tirosina ha decaído con el tiempo, lo que induce a un empobrecimiento en la lectura de absorbancia.
6.3. Desarrollo de la técnica 6.3.1. Paso 1: Preparación de las cubetas selladas con silicona
Cubetas acrílicas desechables se tapan con sellador de caucho de silicona transparente. La silicona se deja secar durante 24 horas. Después de 24 horas, se tienen cubetas acrílicas herméticas a los gases. Estas se ensayaron para borboteo bajo agua.
6.3.2. Paso 2: Procedimiento de toma de muestras de sustrato
Se llenan cubetas acrílicas selladas con silicona con 2 ml de sustrato por medio de una jeringuilla de 1 cc (dividida en 1/100 cc).
Para lograr una toma de muestras exacta, la jeringuilla se golpea y se desaloja el aire (que interfiere con el volumen de la solución sustrato).
Las cubetas llenas se guardan en el frigorífico (0-5°C).
El blanco B1 (2 ml de T-3754 + 0,5 ml de tampón de fosfato de Na) se prepara en una cubeta con cápsula de plástico. Esto se cambió posteriormente al uso de cubetas selladas con silicona.
6.3.3. Paso 3: Procedimiento de toma de muestras de enzima
Se llenan viales de suero con 2 ml de enzima por medio de una pipeta de 1 ml (dividida en 1/100 ml), se tapan con un tapón de caucho y se cierran herméticamente con una chapa de aluminio de bordes fruncidos. Los viales de suero son herméticos a los gases.
Los viales de suero llenos se guardan en el frigorífico (0-5°C).
6.3.4. Paso 4: procedimiento de saturación de gas (ARGÓN, KRIPTÓN, NEÓN, OXÍGENO, XENÓN)
Se borbotean consecutivamente 3 x 10 cc de gas en las cubetas selladas con silicona y los viales de suero (T-3754, T-7755), cor. una pausa de 1 hora entre inyecciones. Esto representa un desplazamiento de 10x de volumen muerto mientras se maximiza la equilibración de gas.
Todas las jeringuillas y los espacios muertos se purgan antes del llenado con el gas apropiado. Después de la tercera inyección de 10 cc, las cubetas selladas con silicona y los viales de suero se dejan durante una noche bajo dos jeringuillas de 10 cc llenas con el gas apropiado en el frigorífico a 0-5°C.
6.3.5. Nota
Las muestras de aire (tanto enzima como sustrato) no experimentan borboteo alguno. La cubeta acrílica se tapa con una cápsula regular de vinilo (no hermética a los gases). Este procedimiento se cambió posteriormente al uso de cubetas selladas con silicona. Las comparaciones múltiples con los tratamientos sellados con borboteo de aire no muestran diferencia alguna entre los dos métodos.
6.3.6. Paso 5: Operaciones espectrofotométricas
a. Las cubetas selladas con silicona, los viales de suero y las cubetas con cápsula de plástico se retiran del frigorífico. Este procedimiento se cambia ulteriormente (véase 7.1.5.)
b. Las cubetas selladas con silicona y los viales de suero se llenan con 10 cc de gas y se dejan a la temperatura ambiente (26°C) bajo dos jeringuillas de 10 cc.
c. Las cubetas se ponen en el soporte de celdas y se dejan equilibrar en temperatura con el soporte de celdas durante 10 min.
d. Se llena una jeringuilla de 1 cc con el gas apropiado y se utiliza para recuperar 0,5 ml de solución de enzima de un vial de suero, a fin de evitar la introducción de aire en el vial mientras se toma la muestra de la enzima.
e. Operación:
Las inyecciones secuenciales de enzima de 0,5 ml con la jeringuilla en las cubetas se realizan lo más rápidamente posible desde la celda 5 a la celda 1 (retardo x = 2 s). Este procedimiento se cambia ulteriormente a inyección simultánea.
6.3.7. Operaciones espectrofotométricas: Impulsos de tiempo a 305 nm
60 puntos, intervalos de 60s \rightarrow 1 h de ejecución
Operación 1
T1 = 15°C (T_{S} = T_{R} = 15,1°C)
Nombre de archivo Gas No. de Celda
B1T1G2.SP Neón Celda 2
B1T1G3.SP Argón Celda 3
B1T1G4.SP Kriptón Celda 4
B1T1G5.SP Xenón Celda 5
Operación 2
T1 = 15°C (T_{S} = T_{R} = 15,1°C)
Nombre de archivo Gas No. de Celda
B1T1G6.SP Aire Celda 1
B1T1G7.SP Oxígeno Celda 2
Operación 3
T2 = 20°C (T_{S} = T_{R} = 20°C)
Nombre de archivo Gas No. de Celda
B1T2G1.SP Aire Celda 1
B1T2G2.SP Neón Celda 2
B1T2G3.SP Argón Celda 3
B1T2G4.SP Kriptón Celda 4
B1T2G5.SP Xenón Celda 5
Operación 4
T2 = 20°C (T_{S} = T_{R} = 20°C)
Nombre de archivo Gas No. de Celda
B2T2G6.SP Oxígeno Celda 1
Operación 5
T3 = 25°C (T_{S} = T_{R} = 24,9°C)
Nombre de archivo Gas No. de Celda
B1T3G1.SP Aire Celda 1
B1T3G2.SP Neón Celda 2
B1T3G3.SP Argón Celda 3
B1T3G4.SP Kriptón Celda 4
B1T3G5.SP Xenón Celda 5
Operación 6
T3 = 25°C (T_{S} = T_{R} = 24,9°C)
Nombre de archivo Gas No. de Celda
B1T3G6.SP Oxígeno Celda 1
Operación 7
T4 = 30°C (T_{S} = T_{R} = 29,9°C)
Nombre de archivo Gas No. de Celda
B1T4G1.SP Aire Celda 1
B1T4G2.SP Neón Celda 2
B1T4G3.SP Argón Celda 3
B1T4G4.SP Kriptón Celda 4
B1T4G5.SP Xenón Celda 5
Operación 8
T4 = 30°C (T_{S} = T_{R} = 29,9°C)
Nombre de archivo Gas No. de Celda
B1T4G6.SP Oxígeno Celda 1
Operación 9
T5 = 35°C (T_{S} = T_{R} = 34,9°C)
Nombre de archivo Gas No. de Celda
B1T5G1.SP Aire Celda 1
B1T5G2.SP Neón Celda 2
B1T5G3.SP Argón Celda 3
B1T5G4.SP Kriptón Celda 4
B1T5G5.SP Xenón Celda 5
Operación 10
T5 = 35°C (T_{s} = T_{R} = 34,9°C)
Nombre de archivo Gas No. de Celda
B1T5G6.SP Oxígeno Celda 1
7.3. Resultados gráficos
Superposición de impulsos de tiempo/temperatura - páginas adjuntas
Superposición de impulsos de tiempo/gas - páginas adjuntas
7. Procedimiento final 7.1. Protocolo experimental final 7.1.1. Paso 1: Preparación de las cubetas selladas con silicona
Lo mismo que en 6.3.1., excepto que la silicona se deja curar durante 48 horas a fin de eliminar los vapores de ácido acético, que podrían interferir con la inhibición de la enzima. Esto se confirma por ensayo.
7.1.2. Paso 2: Procedimiento de toma de muestras de sustrato
Lo mismo que en 6.3.2.
La muestra en blanco B2 (2 ml de tampón de fosfato de Na + 0,5 ml de T-7755) se prepara de acuerdo con el mismo procedimiento (en una cubeta sellada con silicona) pero no sufre el paso de saturación con gas (7.1.4.).
Las comprobaciones de control no muestran absorbancia alguna por ninguno de los gases dentro del campo de absorbancia de trabajo.
7.1.3. Paso 3: Procedimiento de toma de muestras de enzima
Lo mismo que en 6.3.3.
7.1.4. Paso 4: Procedimiento de saturación con gas (AIRE, ARGÓN, KRIPTÓN, NEÓN, NITRÓGENO, OXÍGENO, XENÓN)
Se borbotean 3 x 10 cc de gas en las cubetas selladas con silicona y los viales de suero (T-3754, T-7755), con un intervalo de 20 min (a 0-5°C) entre cada inyección de gas.
Después de la tercera inyección de 10 cc, las cubetas y los viales de suero se dejan durante una noche bajo dos jeringuillas de 10 cc llenas con el gas apropiado en el frigorífico a 0-5°C.
7.1.5. Paso 5: Operaciones espectrofotométricas
a. Las cubetas selladas con silicona se retiran del frigorífico 40 min antes de la operación experimental, se llenan con 10 cc de gas y se dejan a la temperatura ambiente (26°C) bajo dos jeringuillas de 10 cc.
b. Los viales de suero se retiran del frigorífico 25 min antes de la operación experimental, se llenan con 10 cc de gas y se ponen de nuevo en el frigorífico bajo dos jeringuillas de 10 cc.
c. 15 min antes de la operación, se retiran las jeringuillas de 10 cc (y las agujas) de las cubetas selladas con silicona. Se ponen las cubetas en el soporte de celdas y se dejan equilibrar en temperatura con el soporte de las celdas durante 10 min.
d. 5 min antes de la operación, se llena una jeringuilla de 1 cc con el gas y se utiliza para recuperar 0,5 ml de solución de enzima en los viales de suero, con objeto de evitar la introducción de aire en el vial mientras se toma la muestra de la enzima.
e. Operación:
Las cubetas selladas con silicona se retiran rápidamente del soporte de celdas y se golpean ligeramente para suprimir las burbujas de gas que puedan formarse mientras las cubetas se están calentando (esto ocurre especialmente a 30 y 35°C), y se ponen de nuevo en el soporte de celdas.
Se realizan simultáneamente inyecciones con las jeringuillas de 0,5 ml de enzima para lograr un tiempo inicial común to para las muestras.
\newpage
7.2. Operaciones espectrofotométricas: Impulsos de tiempo a 305 nm
200 puntos, intervalos de 18s \rightarrow 1 h de operación
7.2.1. Operación 1: T1 = 15°C (T_{S} = T_{R} = 15,1°C)
Nombre de archivo Gas No. de Celda
B2T1Gl.SP Aire Celda 1
B2T1G2.SP Neón Celda 2
B2T1G3.SP Argón Celda 3
B2T1G4.SP Kriptón Celda 4
B2T1G5.SP Xenón Celda 5
7.2.2. Operación 2: T1 = 15°C (T_{S} = T_{R} = 15,1°C)
Nombre de archivo Gas No. de Celda
B2T1G6.SP Aire Celda 1
B2T1G7.SP Oxígeno Celda 2
B2T1G8.SP Nitrógeno Celda 3
7.2.3. Operación 3: T2 = 20°C (T_{s} = T_{R} = 19,9°C)
Nombre de archivo Gas No. de Celda
B2T2G1.SP Aire Celda 1
B2T2G2.SP Neón Celda 2
B2T2G3.SP Argón Celda 3
B2T2G4.SP Kriptón Celda 4
B2T2G5.SP Xenón Celda 5
7.2.4. Operación 4: T2 = 20°C (T_{S} = T_{R} = 19,9°C)
Nombre de archivo Gas No. de Celda
B2T2G6.SP Aire Celda 1
B2T2G7.SP Oxígeno Celda 2
B2T2G8.SP Nitrógeno Celda 3
7.2.5. Operación 5: T3 = 25°C (T_{S} = T_{R} = 24,9°C)
Nombre de archivo Gas No. de Celda
B2T3G1.SP Aire Celda 1
B2T3G2.SP Neón Celda 2
B2T3G3.SP Argón Celda 3
B2T3G4.SP Kriptón Celda 4
B2T3G5.SP Xenón Celda 5
7.2.6. Operación 6: T3 = 25°C (T_{S} = T_{R} = 24,9°C)
Nombre de archivo Cas No. de Celda
B2T3G6.SP Aire Celda 1
B2T3G7.SP Oxígeno Celda 2
B2T3G8.SP Nitrógeno Celda 3
7.2.7. Operación 7: T4 = 30°C (T_{S} = T_{R} = 29,9°C)
Nombre de archivo Gas No. de Celda
B2T4G1.SP Aire Celda 1
B2T4G2.SP Neón Celda 2
B2T4G3.SP Argón Celda 3
B2T4G4.SP Kriptón Celda 4
B2T4G5.SP Xenón Celda 5
7.2.8. Operación 8: T4 = 30°C (T_{S} = T_{R} = 29,9°C)
Nombre de archivo Gas No. de Celda
B2T4G7.SP Aire Celda 2
B2T4G8.SP Oxígeno Celda 3
B2T4G9.SP Nitrógeno Celda 4
7.2.9. Operación 9: T5 = 35°C (T_{s} = T_{R} = 34,9°C)
Nombre de archivo Gas No. de Celda
B2T5G1.SP Aire Celda 1
B2T5G2.SP Neón Celda 2
B2T5G3.SP Argón Celda 3
B2T5G4.SP Kriptón Celda 4
B2T5G5.SP Xenón Celda 5
7.2.9. Operación 10: T5 = 35°C (T_{S} = T_{R} = 34,9°C)
Nombre de archivo Gas No. de Celda
B2T5G6.SP Aire Celda 1
B2T5G7.SP Oxígeno Celda 2
B2T5G8.SP Nitrógeno Celda 3
7.3. Resultados gráficos
Superposición de impulsos de tiempo/temperatura - páginas adjuntas
Superposición de impulsos de tiempo/gas - páginas adjuntas
7.4. Cinética enzimática: ENZFITTER
A partir de los resultados anteriores obtenidos por la reacción de tirosinasa-L-tirosina, pueden extraerse las conclusiones siguientes.
El xenón inhibe significativamente la velocidad y deprime el equilibrio final de la reacción tirosinasa-L-tirosina. Además, los otros gases nobles inhiben todos ellos la velocidad y deprimen el equilibrio final de la reacción en menor grado, dependiendo tanto de su solubilidad como de sus propiedades moleculares. El Kriptón tiene generalmente un efecto similar pero menor que el xenón, mientras que el argón es sorprendentemente activo a bajas temperaturas.
Adicionalmente, los efectos del empobrecimiento en oxígeno pueden controlarse por el uso de nitrógeno. Cuando se compara con el argón, se encuentra que el nitrógeno carece de la capacidad física para interaccionar con los sitios activos. Se encuentra que el argón es más activo con relación al nitrógeno. Esto parece ser cierto también para otras clases de enzimas.
Dado que las diferencias en solubilidad pueden explicar solamente una parte de las inhibiciones observadas, tienen que ocurrir interacciones de sitios activos o cambios de conformación inducidos de las proteínas.
A continuación se incluyen en esta memoria experimentos cinéticos.
Experimentos a alta presión
Se condujeron experimentos en celdas de presión presurizadas con gas de ensayo adicional después que la solución estaba ya saturada, a 2 atmósferas o a 3 atmósferas en tiempo real, o después de presurización en una probeta de
1 litro durante 1 hora o 24 horas a 30,6 atmósferas y a 100 atmósferas.
Se utilizaron los procedimientos experimentales siguientes.
Protocolo: Efectos de la presión elevada sobre las enzimas.
Teoría: Se introducen enzimas a presiones elevadas y se determina esa actividad. Las presiones elevadas
deberían inhibir la actividad de las enzimas.
Enzima: Tirosinasa (SIGMA No. T-7755)
(Monofenol-monooxigenasa; polifenol-oxidasa; catecol-oxidasa; monofenol, dihidroxifenilala-
nina: oxígeno-oxidorreductasa; EC 1.14.18.1)
De champiñón
Definición de la unidad de tirosinasa:
Una unidad causará un aumento en A_{280} de 0,001 por min a pH 6,5 a 25°C en 3 ml de mezcla de
reacción que contiene L-tirosina.
Actividad de tirosinasa: 3870 U/mg de sólidos
7,1 mg sólidos \rightarrow 27440 Unidades
Se guarda desecada por debajo de 0°C
Sustrato: L-tirosina (SIGMA No. T-3754)
L-3-[4-Hidroxifenil]alanina
Base libre (pfs) cristalina
P.Mol. anhidro 181,2
Se guarda a la temperatura ambiente (25°C)
Enzima: \beta-D-glucosidasa (SIGMA No. G-4511)
(Emulsina; \beta-D-glucosido-glucohidrolasa, EC 3.2.1.21)
De almendras
Definición de la unidad:
Una unidad liberará 1,0 \mumol de glucosa a partir de salicina por min a pH 5,0 a 37°C.
Actividad: 22 U/mg sólidos
12 mg sólidos \rightarrow 264 unidades
Se guarda desecada a 0-5°C
Lote# 49F-4021
Sustrato: p-Nitrofenil-\beta-D-glucopiranosido (SIGMA No. N-7006)
Cristalino
Contiene 2,4% de disolvente
P. Mol. anhidro 301,3
Se guarda desecado por debajo de 0°C
Lote# 129F-5057
Prueba 1: 4/10/91 - 4/11/91
Gases: 1. Aire
2. N_{2}
Presiones: 1. 30,6 ATM (450 psi)
2. 100,0 atm (1470 psi)
Controles: Control A: Enzima no presurizada y no introducida en la botella de gas.
Control B: Enzima no presurizada pero introducida en la botella de gas
1. Control para gas 1 (Aire).
Control C: Enzima no presurizada pero introducida en la botella de gas
2. Control para gas 2 (N_{2}).
Preparación de la solución: 4/10/91
Solución A: Tampón de fosfato de sodio, pH 6,6 a 25°C
1 l de agua desionizada
141,96 x 0,2 x 187,5 x 1/1000 = 5,3 g Na_{2}HPO_{4}
119,96 x 0,2 x 312,5 x 1/1000 = 7,5 g NaH_{2}PO_{4}
pH ensayado: 6,502
Solución B: Solución de tirosinasa en tampón de fosfato de Na (228 U/ml)
14,2 mg de T-7755 diluidos a 240 ml de tampón de fosfato de Na, pH 6,6 a 25°C
Solución C: 50 \mug/ml de solución de L-tirosina en tampón de fosfato de Na
10 mg de T-3754 diluidos a 200 ml de tampón de fosfato de sodio, pH 6,6 a 25°C
Solución D: Tampón de fosfato de sodio, pH 6,8 a 25°C:
2 l de agua desionizada
2 x 141,96 x 0,2 x 245 x 1/1000 = 13,91 g de Na_{2}HPO_{4}
2 x 119,96 x 0,2 x 255 x 1/1000 = 12,20 g NaH_{2}PO_{4}
pH ensayado: 6,719
Solución E: 100 \mug/ml de solución de \beta-D-glucopiranosido en tampón de fosfato de Na
25 mg de N-7006 diluido a 250 ml de tampón de fosfato de sodio, pH 6,8 a 25°C
Solución F: Solución de \beta-D-glucosidasa en tampón de fosfato de sodio, pH 6,8 (25°C)
(2,18 Unidades/ml)
24 mg de G-4511 diluidos a 242 ml en tampón de fosfato de sodio pH 6,8 a 25°C
Método: Tirosinasa: 4/11/91
Se pone una parte alícuota de 100 ml de solución de enzima en cada una de 2 botellas de gas desechables. Se agita la enzima en cada botella mediante sacudidas durante varios minutos y se retira luego una muestra de 5 ml para Control B y Control C
Se devuelven las botellas al almacén, gasificando con el gas apropiado; se lleva lentamente la presión hasta 30,6 atm. Se deja sedimentar a la presión requerida durante 60 minutos. Se despresuriza lentamente hasta 2 psi (0,14 kg/cm^{2}) antes de llevar al laboratorio.
Se transfieren aproximadamente 10 ml de la enzima de cada botella mientras se mantiene la misma en atmósfera gaseosa a vasos de precipitados separados y se realiza inmediatamente una operación TDrive/CPRG sobre la mezcla enzima/sustrato.
Enzima 1, Gas 1, Presión 1, Repetición 1
Enzima 1, Gas 2, Presión 1, Repetición 1
Se llevan de nuevo las botellas al almacén y se represuriza a 100 atm con el gas apropiado.
Se deja sedimentar a la presión requerida durante 60 minutos.
Se despresuriza lentamente a 2 psi (0,14 kg/cm^{2}) antes de llevar al laboratorio.
Se transfieren aproximadamente 10 ml de la enzima de cada botella mientras se mantiene la misma en atmósfera gaseosa a vasos de precipitados separados y se realiza inmediatamente una operación TDrive/CPRG sobre la mezcla enzima/sustrato.
Enzima 1, Gas 1, Presión 2, Repetición 1
Enzima 1, Gas 2, Presión 2, Repetición 1 
\newpage
\beta-Glucosidasa:
Se lavan las botellas con cantidades abundantes de H_{2}0 desionizada. Se lavan luego las botellas con la segunda solución de enzima (glucosidasa). Se pone una parte alícuota de 25 ml de solución de enzima en cada una de dos botellas de gas desechables. Se agita mediante sacudidas la enzima en cada botella durante varios minutos y se retira luego una muestra de 5 ml para Control B y Control C.
Se devuelven las botellas al almacén, gasificando con el gas apropiado; se lleva lentamente la presión hasta 30,6 atm. Se deja sedimentar a la presión requerida durante 60 minutos. Se despresuriza lentamente a 2 psi (0,14 kg/cm^{2}) antes de llevar al laboratorio.
Se transfieren aproximadamente 10 ml de la enzima de cada botella mientras se mantiene la misma bajo atmósfera gaseosa a vasos de precipitados separados y se realiza inmediatamente una operación TDrive/CPRG sobre la mezcla enzima/sustrato.
Enzima 2, Gas 1, Presión 1, Repetición 1
Enzima 2, Gas 2, Presión 1, Repetición 1
Se llevan de nuevo las botellas al almacén y se represuriza a 100 atm con el gas apropiado. Se deja sedimentar a la presión requerida durante 60 minutos. Se despresuriza lentamente a 2 psi (0,14 kg/cm^{2}) antes de llevar al laboratorio.
Se transfieren aproximadamente 10 ml de la enzima de cada botella mientras se mantiene la misma en atmósfera gaseosa a vasos de precipitados separados y se realiza una operación TDrive/CPRG inmediatamente sobre la mezcla enzima/sustrato.
Enzima 2, Gas 1, Presión 2, Repetición 1
Enzima 2, Gas 2, Presión 2, Repetición 1
Estudio del espectro: 25°C
Cubetas: 34 mínimo
PARAM: rendija 1
velocidad 1500
Asave Y
Aprint N
CPRG: Tirosinasa:
305 nm
80 pts \rightarrow 20 min OPERACIÓN
16s int
Y_{min} = 0,0
Y_{max} = 2,0
\beta-Glucosidasa:
400 nm
40 pts \rightarrow 10 min OPERACIÓN
16s int
Y_{min} = 0,0
Y_{max} = 1,5
Blancos: Tirosinasa: 2 ml Sol. A + 0,5 ml Soln B
\beta-Glucosidasa: 2 ml Soln E + 0,5 ml Soln D
Muestra: Tirosinasa: 2 ml Soln C + 0,5 ml Soln B
\beta-Glucosidasa: 2 ml Soln E + 0,5 ml Soln F
Transportador de celdas:
Celda 1: Control A
Celda 2: Control B
Celda 3: Control C
Celda 4: Gas 1 (aire)
Celda 5: Gas 2 (N_{2})
Archivos: Tirosinasa:
X1P1G1C1...5.SP \rightarrow X1P1G1C1...5.SP se redenominaron X1P1E1C1...5.SP por DOS
X1P2E1C1...5.SP \rightarrow ...5.SP comenzó con una abs mayor, por lo que los autores golpearon
ligeramente las burbujas de gas y realizaron un barrido de campo total de las cinco celdas:
\hskip10mm Barrido de campo total 900-190 nm:
\hskip10mm Archivos: X1SCAN1...5.SP
- - - - - - - - - - - - - - - - -
10 ARCHIVOS:
\beta-glucosidasa
X2P1E2C1...5.SP
X2P2E2C1...5.SP
- - - - - - - - - - - - - - - - -
10 ARCHIVOS:
Prueba 2: 4/15/91
En esta prueba se realizarán únicamente ensayos a presión de tirosinasa.
Gases: 1. Aire
2. N_{2}
Presiones: 1. 30,6 atm (450 psi)
2. 100,0 atm (1470 psi)
Controles: Control A: la enzima no se presurizó y no se puso en la botella de gas.
Control B: la enzima no se presurizó, pero se puso en la botella de gas 1.
Control para gas 1 (aire).
Control C: la enzima no se presurizó, pero se puso en la botella de gas 2.
Control para gas 2 (N_{2}).
Preparación de la solución: 4/10/91
Soln A: Tampón de fosfato de sodio, pH 6,6 a 25°C
1 l de agua desionizada
141,96 x 0,2 x 187,5 x 1/1000 = 5,3 g Na_{2}HPO_{4}
119,96 x 0,2 x 312,5 x 1/1000 = 7,5 g NaH_{2}PO_{4}
pH ensayado: 6,502
Soln B: Solución de tirosinasa en tampón de fosfato de Na (228 U/ml)
14,2 mg de T-7755 diluidos a 240 ml en tampón de fosfato de Na, pH 6,6 a 25°C
Soln C: 50 \mug/ml de solución de L-tirosina en tampón de fosfato de Na
10 mg de E-3754 diluidos a 200 ml en tampón de fosfato de sodio, pH 6,6 a 25°C.
Método: Tirosinasa:
Se pone una parte alícuota de 25 ml de solución de enzima en cada una de dos botellas de gas desechables. Se agita mediante sacudidas la enzima en cada botella durante varios minutos y se retira luego una muestra de 5 ml para Control B y Control C.
Se devuelven las botellas al almacén, gasificando con el gas apropiado. Se retira el gas del espcio de cabeza/residual por presurización y despresurización de la botella de gas varias veces. Se lleva lentamente la presión hasta 30,6 atm. Se deja sedimentar a la presión requerida durante 60 minutos. Se despresuriza lentamente a 40 psi (2,8 kg/cm^{2}) antes de llevar al laboratorio.
Se transfieren aproximadamente 5 ml de la enzima de cada botella mientras se mantiene la misma en atmósfera gaseosa a vasos de precipitados separados y se ejecuta una operación TDrive/CPRG inmediatamente sobre la mezcla enzima/sustrato.
Enzima 1, Gas 1, Presión 1, Repetición 2
Enzima 1, Gas 2, Presión 1, Repetición 2
Enzima 1, Gas 2, Presión 2, Repetición 2
Estudio del espectro: 25°C
Cubetas: 10 mínimo
PARAM: rendija 1
velocidad 1500
Asave Y
Aprint N
CPRG: Tirosinasa:
305 nm
80 pts \rightarrow 20 min OPERACIÓN
16s int
Y_{min} = 0,0
Y_{max} = 2,0
Blancos: Tirosinasa: 2 ml Soln A + 0,5 ml Soln B
Muestra: Tirosinasa: 2 ml Soln C + 0,5 ml Soln B
Se ensaya para comprobar si la Soln C es utilizable todavía:
TDrive: 305 nm, 80 pts, 16s int.
\hskip10mm S = 2,0 ml C + 0,5 ml B
\hskip10mm R = 2,0 ml A + 0,5 ml D
Archivos: TYTRL1.SP
Transportador de celdas:
\hskip10mm Operación 1: 100 atm
Celda 1: Control A
Celda 2: Control B
Celda 3: Control C
Celda 4: Gas 1 (aire)
Celda 5: Gas 2 (N_{2})
\hskip10mm Operación 2: 30 atm
Celda 1: Control A
Celda 2: Control B
Celda 3: Control C
Celda 4: Gas 1 (aire)
Celda 5: Gas 2 (N_{2})
Archivos: Tirosinasa:
X7P2E1C1...5.SP
X7P1E1C1...5.SP
- - - - - - - - - - - - - - - - -
10 ARCHIVOS:
Prueba 3: 4/24/91 (preparación de la solución y presurización inicial),
4/25/91, 4/26/91
En esta prueba se realizarán únicamente ensayos a presión de tirosinasa.
Gases: 1. Aire
2. N_{2}
3. Xe: 1 atm/N_{2} hasta la presión
Presiones: 1. 30,6 atm (450 psi)
2. 100,0 atm (1470 psi)
Controles: Control A: la enzima no se presurizó y no se puso en la botella de gas.
Preparación de la solución: 4/24/91
Solución A: Tampón de fosfato de sodio, pH 6,8 a 25°C
2 l agua desionizada
2 x 141,96 x 0,2 x 245 x 1/1000 = 13,91 g Na_{2}HPO_{4}
2 x 119,96 x 0,2 x 255 x 1/1000 = 12,20 g NaH_{2}PO_{4}
pH ensayado: 6,740
Solución B: Solución de tirosinasa en tampón de fosfato de Na (228 U/ml)
14,2 mg T-7755 diluidos a 240 ml en tampón de fosfato de pH 6,8 a 25°C
Solución C: 50 µg/ml solución de L-tirosina en tampón de fosfato de Na
10 mg T-3754 diluidos a 200 ml en tampón de fosfato de sodio pH 6,8 a 25°C
Método: Tirosinasa:
4/24/91 Preparación de las botellas:
las botellas (3) se llevaron a vacío, y se inyectaron luego con 50 cc de H_{2}O desionizada y se pusie-
ron a presión:
\hskip10mm Botella 1 con aire
\hskip10mm Botella 2 con N_{2}
\hskip10mm Botella 3 con N_{2}
hasta 60 psi (4,22 kg/cm^{2}), se agitaron mediante sacudidas, se invirtieron y se liberó la presión para expulsar el líquido de las botellas. Se repitió este proceso con 50 cc de tampón de fosfato de sodio. Las botellas se presurizaron tres veces como se describe arriba para eliminar totalmente el líquido de las botellas.
Inyección de enzima: Las botellas se pusieron de nuevo a vacío y se inyectaron con 60 cc de solución de tirosinasa utilizando el vacío para succionar la enzima en la botella. Las botellas se presurizaron como se ha descrito anteriormente. Se liberó la presión de las botellas y se represurizaron 10 veces las botellas para eliminar O_{2} de las botellas.
Presurización final: Las botellas 1 (aire) y 2 (N_{2}) se presurizaron con el gas correspondiente a 30,6 atm. La botella 3 se presurizó hasta 1 atm con Xe y se presurizó luego hasta 30,6 atm con N_{2} para conservar el Xe.
Programa de tiempos: Las botellas se presurizaron a 30 atm a las 1:00 pm el 4/24/91. Debido al hecho de que el 4/25/91 los espectrofotómetros se estaban utilizando a 5°C para un experimento diferente, se tomó la decisión de tomar las muestras de las botellas al final del día cuando estaba disponible el espectrofotómetro para llevarlo a 25°C. La toma de muestras tuvo lugar 28 horas después de la presurización. Se realizó inmediatamente una operación espectro/gas sobre estas muestras.
\newpage
4/25/91 Represurización: Las botellas se represurizaron a las 6:00 pm el 4/25/91 a 100 atm. Estas botellas
se muestrearán a las 2:00 pm el 4/26/91 (20 horas después de la presurización).
Estudio del espectro: 4/25/91, 25°C
Cubetas: 10 mínimo
PARAM: rendija 1
velocidad 1500
Asave Y
Aprint N
CPRG: Tirosinasa:
305 nm
80 pts \rightarrow 20 min OPERACIÓN
16s int
Y_{min} = 0,0
Y_{max} = 2,0
Blancos: Tirosinasa: 2 ml Soln A + 0,5 ML Soln B
Muestra: Tirosinasa: 2 ml Soln C + 0,5 ml Soln B
Transportador de celdas:
\hskip10mm Operación 1: 30 atm
Celda 1: Control A
Celda 2: Gas 1 (aire)
Celda 3: Gas 2 (N_{2})
Celda 4: Gas 3 (Xe: 1 atm/N_{2}: 29 atm)
Archivos: Tirosinasa:
Y30G1...4.SP
- - - - - - - - - - - - - - - - -
4 ARCHIVOS:
Estudio del espectro: 4/26/91, 25°C
Cubetas: 10 mínimo
PARAM: rendija 1
velocidad 1500
Asave Y
Aprint N
CPRG: Tirosinasa:
305 nm
80 pts \rightarrow 25 min OPERACIÓN
16s int
Y_{min} = 0,0
Y_{max} = 2,0
Blancos: Tirosinasa: 2 ml Soln A + 0,5 ml Soln B
Muestra: Tirosinasa: 2 ml Soln C + 0,5 ml Soln B
Transportador de celdas:
\hskip10mm Operación 1: 100 atm
Celda 1: Control A
Celda 2: Gas 1 (aire)
Celda 3: Gas 2 (N_{2})
Celda 4: Gas 3 (Xe: 1 atm/N_{2}: 29 atm)
Archivos: Tirosinasa:
Y100G1...4.SP
- - - - - - - - - - - - - - - - -
4 ARCHIVOS:
Protocolo: Efectos de la Presión sobre las Enzimas.
Enzima: Tirosinasa (SIGMA No. T-7755)
(Monofenol-monooxigenasa; polifenol-oxidasa; catecol-oxidasa; monofenol, dihidroxifenilala-
nina: oxígeno-oxidorreductasa; EC 1.14.18.1)
De champiñón
Definición de la unidad de tirosinasa:
Una unidad causará un aumento en A_{280}ç de 0,001 por min a pH 6,5 a 25°C en 3 ml de mezcla de
reacción que contiene L-tirosina.
Actividad de tirosinasa: 3870 U/mg sólidos
7,1 mg sólidos \rightarrow 27440 Unidades
Se guarda desecada por debajo de 0°C
Sustrato: L-tirosina (SIGMA No. T-3754)
L-3-[4-hidroxifenil]alanina
Base libre (pfs) cristalina
P. Mol. anhidra 181,2
Se guarda a la temperatura ambiente (25°C)
Enzima: \beta-D-Glucosidasa (SIGMA No. G-4511)
(Emulsina; \beta-D-glucosido-glucohidrolasa, EC 3.2.1.21)
De almendras
Definición de la unidad:
Una unidad liberará 1,0 \mumol de glucosa a partir de salicina por min a pH 5,0 a 37°C.
Actividad: 22 U/mg sólidos
12 mg sólidos \rightarrow 264 Unidades
Se guarda desecada a 0-5°C
Sustrato: p-Nitrofenil-\beta-D-glucopiranosido (SIGMA No. N-7006)
Cristalino
Contiene 2,4% de disolvente
P. Mol. anhidro 301,3
Se guarda desecado por debajo de 0°C
Prueba 1:
Gases: 1. Aire
2. N_{2}
3. Ar
4. 0_{2}
Presiones: 1. 2 atm (30 psi)
Preparación de la solución: 4/29/91
Prep.: 4/26/91
Soln A: Tampón de fosfato de sodio pH 6,8 a 25°C
2 l agua desionizada
2 x 141,96 x 0,2 x 245 x 1/1000 = 13,91 g Na_{2}HPO_{4}
2 x 119,96 x 0,2 x 255 x 1/1000 = 12,20 g NaH_{2}PO_{4}
pH ensayado:
Soln B: Solución de tirosinasa en tampón de fosfato de Na (228 U/ml)
14,2 mg T-7755 diluido a 240 ml en tampón de fosfato de Na, pH 6,8 a 25°C
Soln C: 50 \mug/ml solución de L-tirosina en tampón de fosfato de Na
10 mg T-3754 diluido a 200 ml en tampón de fosfato de Na, pH 6,8 a 25°C.
Soln E: 100 \mug/ml solución de \beta-D-glucopiranosido en tampón de fosfato de Na
25 mg N-7006 diluido a 250 ml en tampón de fosfato de Na, pH 6,8 a 25°C
Soln F: Solución de \beta-D-glucosidasa en tampón de fosfato de Na de pH 6,8 (25°C)
(2,18 unidades/ml)
24 mg G-4511 diluido a 242 ml en tampón de fosfato de Na, pH 6,8 a 25°C
Método: Los transportadores de celdas se retiraron de los espectrofotómetros y se instalaron las celdas fijas.
Se prepararon cubetas acrílicas instalando primeramente un tampón de silicona azul, agujas y cubriendo luego con silicona los extremos superiores y los laterales de las cubetas con silicona general para todo uso.
Se dejó que se curaran éstas durante 48 horas antes de utilizarlas. Cuando se hubo curado la silicona, las cubetas se golpearon suavemente en posición vertical y se cerraron luego alrededor del tapón con cinta de embalaje.
Prep. de la muestra: 4/29/91
Las cubetas se llenaron para los experimentos a 2 atm con ambas enzimas. Cada cubeta se gasificó 10 x 10 cc con el gas apropiado y se refrigeró durante 15 minutos antes de la realización del ensayo.
Se llenaron viales de suero con 5 cc de la enzima correspondiente y se gasificaron con 10 x 10 cc del gas apropiado antes de la ejecución del ensayo.
Los espectrofotómetros se dispusieron de modo que pudiera suministrarse un flujo continuo de cada gas a cada espectro en todo momento. Se instaló un manómetro de 100 psi_{max} (7,03 kg/cm^{2}) para leer la presión de la cubeta y se instalaron dos válvulas todo/nada a fin de que la celda de referencia pudiera presurizarse durante la segunda réplica. Se instaló una válvula esférica entre la línea botella/sala y el manómetro de tal modo que el caudal de gas pudiera controlarse directamente en los espectrofotómetros. Se dispuso una válvula de retención en cada línea para asegurar que una contrapresión no pudiera causar contaminación de las líneas de sala o las botellas de gas. Las cubetas retenían las dos agujas durante toda la operación. Una de las agujas estaba fijada a la línea de gas mientras que la segunda se utilizó para introducción de la enzima y se taponó posteriormente. Debido a la naturaleza voluminosa del montaje, fue imposible utilizar las puertas instaladas de los espectrofotómetros, por lo que se retiraron las mismas. Se preparó una cubierta de fieltro negro de 4 capas de espesor para cada espectro a fin de minimizar la cantidad de luz que entraba en el sistema.
Mientras la cubeta alcanzaba el equilibrio térmico en el espectrofotómetro, se mantuvieron ambas agujas en la cubeta con las jeringuillas de 10 cc todavía unidas. Antes de la introducción de la enzima, se retiró una de las jeringuillas mientras la línea de gas estaba unida a la aguja. Se hizo pasar un pequeño flujo de gas a través de la línea mientras se hizo esto, a fin de asegurar que no se produjera contaminación alguna con oxígeno. Las agujas se mantuvieron por encima del nivel de líquido. Se retiró la segunda jeringuilla a fin de permitir un flujo constante a través de la cubeta. La enzima se inyectó a través de la segunda aguja utilizando una jeringuilla de 1 cc. Se tapó luego la aguja, se presurizó la cubeta y se inició la operación.
4/29/91
2 atm
Referencia no presurizada
Tirosinasa: 1. Referencia de aire no presurizada, o muestra.
2. Réplica 1 (celda de referencia no presurizada)
4 gases
Glucosidasa: 1. Referencia de aire no presurizada, o muestra.
2. Réplica 1 (celda de referencia no presurizada)
4 gases
Estudio del espectro: temperatura ambiente
Cubetas: 10
PARAM: rendija 1
velocidad 1500
Asave Y
Aprint N
TDrive: Tirosinasa: espectrofotómetro nuevo (B)
305 nm
60 pts \rightarrow 15 min OPERACION
16s int
y_{min} = 0,0
y_{max} = 1,6
\beta-Glucosidasa: espectrofotómetro antiguo (A)
400 nm
60 pts \rightarrow 15 min OPERACIÓN
16s int
Y_{min} = 0,0
Y_{max} = 2,0
Blancos: Tirosinasa: 2 ml Soln A + 0,5 ml Soln B
\beta-Glucosidasa: 2 ml Soln E + 0,5 ml Soln A
Muestra: Tirosinasa: 2 ml Soln C + 0,5 ml Soln B
\beta-Glucosidasa: 2 ml Soln E + 0,5 ml Soln F
Archivos: 4/29/91
Tirosinasa:
\hskip10mm Referencia de aire (no presurizada):
\hskip10mm 429TYTIRL.SP
\hskip10mm 2 atm (referencia no presurizada):
\hskip10mm Y4E1P1G1...7.SP
Glucosidasa:
\hskip10mm Referencia de aire (no presurizada):
\hskip10mm 429LUTR.SP
\hskip10mm 2 atm (referencia no presurizada):
\hskip10mm Y4E2P1G1...7.SP
Nota: La temperatura dentro de la celda de la muestra fijada no se mantenía constante, lo cual afecta di-
rectamente a los resultados obtenidos por los autores. Se retirarán los soportes de celdas fijas en
ambos espectrofotómetros y se reemplazarán con los transportadores de celdas.
Prueba 2: 4/30/91
Gases: 1. Aire
2. N_{2}
3. Ar
4. 0_{2}
Presiones: 1. 2 atm (30 psi)
Preparación de la muestra:
Se reutilizarán las soluciones preparadas el 4/29/91.
Método:
Los espectrofotómetros se montaron para caudal continuo de gas como se describe en la Prueba 1. Se reemplazaron los soportes de las celdas fijas con los transportadores de celdas a fin de que pudieran mantenerse una temperatura constante utilizando los Circuladores Fisher y Controladores Digitales. Se continuaron utilizando las cubiertas de fieltro negro dado que parecían proporcionar una protección adecuada contra la luz.
Se realizó para cada enzima una operación con gas no presurizado utilizando la totalidad de los cuatro gases. Cada cubeta se gasificó con 10 x 10 cc del gas correspondiente y se refrigeró durante 15 minutos. Las dos agujas utilizadas para gasificar las cubetas se retiraron cuando las cubetas se pusieron en el espectrofotómetro. La enzima se introdujo en las cubetas utilizando una jeringuilla de 1 cc con una aguja 20G11/2 unida. La aguja se introdujo en la cubeta a través del tapón de silicona pero no se sumergió en el líquido. Esto se hizo para asegurar que la introducción de la enzima en la cubeta fuera la misma que en la operación con gas presurizado.
Se llenaron viales de suero con 5 cc de la enzima correspondiente y se gasificaron con 10 x 10 cc del gas apropiado antes de la operación.
Cubetas:
Tirosinasa: Se utilizaron para esta enzima las cubetas con silicona azul, silicona general para todo uso y cinta de embalaje.
Glucosidasa: se utilizaron para esta enzima únicamente las cubetas con silicona azul.
Todas las cubetas se ensayaron a presión hasta 32 psi (2,25 kg/cm^{2}) antes de su utilización.
Estudio del espectro:
Cubetas: 26
PARAM: rendija 1
velocidad 1500
Asave Y
Aprint N
TDrive: Tirosinasa: Espectrofotómetro nuevo (B) 25°C
305 nm
60 pts \rightarrow 15 min OPERACIÓN
16s int
Y_{min} = 0,0
Y_{max} = 1,6
\beta-Glucosidasa: Espectrofotómetro antiguo (A)
35°C
400 nm
60 pts \rightarrow 15 min OPERACIÓN
16s int
Y_{min} = 0,0
Y_{max} = 2,0
Blancos: Tirosinasa: 2 ml Soln A + 0,5 Soln B
\beta-Glucosidasa: 2 ml Soln E + 0,5 ml Soln A
Muestra: Tirosinasa: 2 ml Soln C + 0,5 ml Soln B
\beta-Glucosidasa: 2 ml Soln E + 0,5 ml Soln F
Archivos: 4/30/91
Tirosinasa:
\hskip10mm Operación con gas (no presurizada):
\hskip10mm Y6E1RSG1...4.SP
\hskip10mm 2 atm (referencia no presurizada):
\hskip10mm Y6E1P1G1...4.SP
\hskip10mm 2 atm (referencia presurizada):
\hskip10mm Y7E1P1G1...4.SP
Glucosidasa:
\hskip10mm Operación con gas (no presurizada):
\hskip10mm Y6E2RSG1...4.SP
\hskip10mm 2 atm (referencia no presurizada):
\hskip10mm Y6E2P1G1...4.SP
\hskip10mm 2 atm (referencia presurizada):
\hskip10mm Y7E2P1G1...4.SP
Nota: Se ha decidido utilizar las cubetas con el taco de silicona azul para ensayos a presión futuros. La si-
licona de uso general universal adicional y la cinta de embalaje parecen disminuir la integridad del
cierre hermético a los gases que mantiene la silicona azul con la cubeta.
Prueba 3: 5/1/91
Gases: 1. Aire
2. N_{2}
3. Ar
4. 0_{2}
Presiones: 1. 3 atm (45 psi)
Preparación de la muestra:
Se reutilizarán las soluciones preparadas el 4/29/91. 
\newpage
Método:
Se utilizó para esta prueba el mismo método utilizado en la prueba 2 el 4/30/91.
Estudio del espectro:
Cubetas: 31
PARAM: rendija 1
velocidad 1500
Asave Y
Aprint N
TDrive: Tirosinasa: Espectrofotómetro nuevo (B) 25°C
305 nm
60 pts \rightarrow 15 min OPERACIÓN
16s int
Y_{min} = 0,0
Y_{max} = 1,6
\beta-Glucosidasa: Espectrofotómetro antiguo (A) 35°C
400 nm
60 pts \rightarrow 15 min OPERACIÓN
16s int
Y_{min} = 0,0
Y_{max} = 2,0
Blancos: Tirosinasa: 2 ml Soln A + 0,5 ml Soln B
\beta-Glucosidasa: 2 ml Soln E + 0,5 ml Soln A
Muestra: Tirosinasa: 2 ml Soln C + 0,5 ml Soln B
\beta-Glucosidasa: 2 ml Soln E + 0,5 ml Soln F
Archivos: 5/1/91
Tirosinasa:
\hskip10mm Operación con gas (no presurizada):
\hskip10mm Y6E1SRG1...4.SP
\hskip10mm Operación con gas (no presurizada):
\hskip10mm Y7E1SRG1...4.SP
\hskip10mm 3 atm (referencia no presurizada).
\hskip10mm Y6E1P2G1...4.SP
\hskip10mm 3 atm (referencia presurizada):
\hskip10mm Y7E1P2G1...4.SP
Glucosidasa:
\hskip10mm Operación con gas (no presurizada):
\hskip10mm Y6E2SRG1...4.SP
\hskip10mm 3 atm (referencia no presurizada):
\hskip10mm Y6E2P2G1...4.SP
\hskip10mm (NUEVO BLANCO UTILIZADO)
\hskip10mm 3 atm (referencia presurizada):
\hskip10mm Y7E2P2G1...4.SP 
\newpage
Prueba 4: 5/3/91
Gases: 5. Aire
6. Ne
7. Kr
8. Xe
Presiones: 1,2 atm (30 psi)
Preparación de la solución: 5/2/91
prep.: 4/26/91
Soln A: Tampón de fosfato de sodio pH 6,8 a 25°C
2 l agua desionizada
2 x 141,96 x 0,2 x 245 x 1/1000 = 13,91 g Na_{2}HPO_{4}
2 x 119,96 x 0,2 x 255 x 1/1000 = 12,20 g NaH_{2}PO_{4}
pH ensayado:
Soln B: Solución de tirosinasa en tampón de Fos. Na (228 U/mi)
7,1 mg T-7755 diluido a 120 ml en tampón de Fos. Na, pH 6,8 a 25°C.
Soln C: 50 pg/ml de solución de L-tirosina en tampón de Fos. Na
10 mg T-3754 diluido a 200 ml en tampón de Fos. Na, pH 6,8 a 25°C.
Soln E: 100 \mug/ml de solución de \beta-D-Glucopiranosido en tampón de Fos. Na
12 mg N-7006 diluido a 125 ml en tampón de Fos. Na, pH 6,8 a 25°C
Soln F: Solución de \beta-D-glucosidasa en tampón de Fos. Na, pH 6,8 (25°C)
(2,18 unidades/ml)
12 mg de G-4511 diluido a 121 ml en tampón de Fos. Na, pH 6,8 a 25°C.
Método:
Se utilizó para esta prueba el mismo método utilizado en la Prueba 2 y la Prueba 3, con dos excepciones. Las agujas se sumergieron en el líquido de la cubeta después que la enzima se inyectó en la cubeta y se puso una cantidad de silicona general para todo uso alrededor de las agujas para prevenir fugas de gas de la cubeta.
Estudio del espectro:
Cubetas: 20
PARAM: rendija 1
velocidad 1500
Asave Y
Aprint N
TDrive: Tirosinasa: Espectrofotómetro nuevo (B) 25°C
305 nm
40 pts \rightarrow 10 min OPERACIÓN
16s int
Y_{min} = 0,0
Y_{max} = 1,6
\beta-Glucosidasa: Espectrofotómetro antiguo (A) 35°C
400 nm
40 pts \rightarrow 10 min Operación
16s int
Y_{min} = 0,0
Y_{max} = 2,0
Blancos: Tirosinasa: 2 ml Soln A + 0,5 ml Soln B
\beta-Glucosidasa: 2 ml Soln E + 0,5 Soln A
Muestra: Tirosinasa: 2 ml Soln C + 0,5 ml Soln B
\beta-Glucosidasa: 2 ml Soln E + 0,5 ml Soln F
Archivos: 5/1/91
Se realiza TDrive para comprobar que las agujas sumergidas no plantean un problema con la absorbancia.
TDrive: 40 pts, 16 s int., 305 nm: TYRONEE1.SP
TDrive: 40 pts, 16 s int., 400 nm: GLUCNEE1.SP
Tirosinasa:
\hskip10mm Operación con gas (no presurizada):
\hskip10mm Y6E1SRG5...8.SP
\hskip10mm 2 atm (referencia no presurizada):
\hskip10mm Y6E1P1G5...8.SP
Glucosidasa:
\hskip10mm Operación con gas (no presurizada):
\hskip10mm Y6E2SRG5...8.SP
\hskip10mm 2 atm (referencia no presurizada):
\hskip10mm Y6E2P1G5...8.SP
Nota: Si las agujas penetraban en el camino de luz, se retiraban hasta por encima del nivel de líquido. Es-
to se hacía apagando las luces de la sala y manteniendo al mismo tiempo la cubierta de fieltro actu-
ando in situ en el espectrofotómetro.
Resultados
Los resultados se dan como % de inhibición de los gases con relación a 1 atmósfera de aire/inhibición relativa a 1 atmósfera después de presurización.
Para tirosinasa:
2 atm 3 atm 30,6 atm 100 atm
(24h) (1h) (-24h) (1h)
Air -7,0 / -15,4 -11,6 -37,0 -4,9 -65,8 -11,1
Xe -76,0 / -86,2 -87,0 -85,7
Kr -84,5 / -93,1
Ar -76,9 / -90,4 -55,8/-72,1
Ne -69,0 / -84,5
N_{2} -71,2 / -88,5 -72,1/-82,6 -78,8 -15,4 -84,7 -20,0
El cambio en efecto relativo es muy grande. Por ejemplo, para xenón es 75%. Esto demuestra claramente que la presión por sí sola inhibe significativamente la tirosinasa.
Para betaglucosidasa:
A 3 atm de presión, el grado de intensificación observado se modificó como sigue:
Aire 0 (intensificación) > -12,5 (inhibición)
Xe +3,1 > -15,7
Kr +2,0 > -6,2
Ar +1,0 > -13,2
Ne +1,0 > -12,5
N_{2} 0 > -5,0
Lo anterior indica claramente que las inhibiciones consignadas de las hidrolasas y otras enzimas en la técnica anterior por los gases nobles son debidas a efectos hidrostáticos.
Experimento de adición de oxígeno
La adición de oxígeno a la tirosinasa disminuyó completamente el efecto del nitrógeno. La adición de oxígeno disminuía los efectos de los gases nobles considerablemente menos, debido probablemente a que los gases nobles afectan a la enzima por las propiedades moleculares por encima y más allá del desplazamiento competitivo simple del oxígeno de la solución. Esta prueba diferencia los efectos de los gases nobles de los del nitrógeno. Asimismo, la adición de una pequeña cantidad de oxígeno intensificaba ligeramente la actividad de la tirosinasa (como era de esperar para una reacción que requiere oxígeno), pero la adición ulterior de oxígeno no tuvo efecto adicional alguno. Así pues, los informes de relación lineal estricta entre la tensión de oxígeno y la actividad enzimática son erróneos, dado que pueden describir únicamente condiciones de limitación de oxígeno.
La adición de oxígeno al aire dio un máximo de 6% de aumento en la actividad de la tirosinasa.
La adición de oxígeno hasta una cantidad saturante a una solución saturada con xenón cambiaba el efecto del xenón desde 85% de inhibición a 50% de inhibición.
La adición de oxígeno como anteriormente a una solución saturada con argón cambiaba el efecto del argón desde una inhibición de 82% a una de 12%.
La adición de oxígeno como anteriormente a una solución saturada con nitrógeno eliminaba por completo el efecto del nitrógeno desde una inhibición de 84%, dando inhibición cero.
No se observó efecto alguno en la adición de oxígeno a las reacciones de la glucosidasa, como sería de esperar para una reacción independiente del oxígeno. La adición de oxígeno no tuvo efecto alguno en la acción de ninguno de los gases nobles sobre la enzima, demostrando de nuevo que el efecto de los gases nobles sobre la enzima es dependiente de sus propiedades moleculares.
Experimento con mezclas de gases
Además de mezclas de gases nobles con nitrógeno y oxígeno, y de mezclas de Kr y Xe, se ensayaron mezclas en serie de Ar y Xe o Kr.
Resultados para tirosinasa expresada como inhibición frente a 1 control de aire:
Mezcla = % Xe en Ar % inhibido = % Kr en Ar % inhibido
0 -75 0 -75
0,1 -72
1,0 -73
5,0 -83
10,0 -81 10,0 -80
50,0 -78 50,0 -78
100,0 -86 100,0 -77
Se obtuvieron resultados similares con betaglucosidasa, observándose intensificaciones para todas las mezclas, y siendo éstas de la misma magnitud que las correspondientes a Xe, Kr o Ar dependiendo de la proximidad de la mezcla a los gases puros.
Protocolo: mezclas de gases
Teoría: La actividad enzimática cambiará con la mezcla de gases
Mezclas de gases: 1. Ar/Xe
2. Ar/Kr
1. 0,1%
2. 1,0%
3. 5,0%
4. 10,0%
5. 50,0%
Enzima: Tirosinasa (SIGMA No. T-7755)
(monofenol-monooxigenasa; polifenol-oxidasa; catecol-oxidasa; monofenol-dihidroxifenilala-
nina: oxígeno-oxidorreductasa; EC 1.14.18.1)
De champiñón
Definición de la unidad de tirosinasa:
Una unidad causará un aumento en A_{280} de 0-001 por min a pH 6,5 a 25°C en 3 ml de mezcla de
reacción que contiene L-tirosina.
Actividad de tirosinasa: 3870 U/mg sólidos
7,1 mg sólidos \rightarrow 27740 unidades
Se guarda desecada por debajo de 0°C Lote# 8OH9615
Sustrato: L-tirosina (SIGMA No. T-3754)
L-3-[4-hidroxifenil]alanina
Base libre (pfs) cristalina
P. mol. anhidra 181,2
Se guarda a la temperatura ambiente (25°C) Lote# 59F-0478
Enzima: \beta-D-glucosidasa (SIGMA No. G-4511)
(Emulsina; \beta-D-glucosido-glucohidrolasa EC 3.2.1.21)
De almendras
Definición de la unidad:
Una unidad liberará 1,0 \mumol de glucosa a partir de salicina por min a pH 5,0 a 37°C.
Actividad: 22 U/mg sólidos
12 mg sólidos \rightarrow 264 unidades
Se guarda desecada a 0-5°C
Lote# 49F-4021
Sustrato: p-Nitrafenil-\beta-D-glucopiranosido (SIGMA No. N-7006)
Cristalino
Contiene 2,4% de disolvente
P. mol. anhidro 301,3
Se guarda desecado por debajo de 0°C
Lote# 129F-5057
Preparación de la solución:
prep: 4/15/91
Soln A: Tampón de fosfato de sodio pH 6,6 a 25°C
1 l agua desionizada
141,96 x 0,2 x 187,5 x 1/1000 = 5,3 g Na_{2}HPO_{4}
119,96 x 0,2 x 312,5 x 1/1000 = 7,5 g NaH_{2}PO_{4}
prep: 4/17/91
Soln B: Solución de tirosinasa en tampón de fosfato de Na (228 U/ml)
14,2 mg T-7755 diluido a 240 ml en tampón de fosfato de Na, pH 6,6 a 25°C
prep: 4/17/91
Soln C: Solución de 50 µg/ml L-tirosina en tampón de fosfato de Na
10 mg T-3754 diluido a 200 ml en tampón de fosfato de Na, pH 6,6 a 25°C.
prep: 4/10/91
Soln D: Tampón de fosfato de sodio pH 6,8 a 25°C:
2 l agua desionizada
2 x 141,96 x 0,2 x 245 x 1/1000 = 13,91 g Na_{2}HPO_{4}
2 x 119,96 x 0,2 x 255 x 1/1000 = 12,20 g NaH_{2}PO_{4}
prep: 4/15/91
Soln E: Solución de 100 \mug/ml \beta-D-glucopiranosido en tampón de fosfato de Na
25 mg N-7006 diluido a 250 ml en tampón de fosfato de Na, pH 6,8 a 25°C
prep: 4/17/91
Soln F: Solución de \beta-D-glucosidasa en tampón de fosfato de Na, pH 6,8 (25°C)
(2,18 Unidades/ml)
24 mg G-4511 diluido a 242 ml en tampón de fosfato de Na, pH 6,8 a 25°C.
Método 4/17/91:
Se preparan las soluciones, se purgan las cubetas con aire después de asegurarse de que son herméticas a los gases, se llenan las cubetas y se refrigeran, se preparan viales de suero y se preparan viales de gas.
4/18/91:
Preparación de las mezclas de gases: se utilizaron viales de suero de 120 cc para introducir los gases. Estos viales se purgaron utilizando vacío mientras se mantenía en el vial 1 atmósfera de argón. Los viales se purgaron durante 20 segundos de este modo. Los viales se mantuvieron bajo una ligera presión que se liberó a través de una aguja. Esto se considera como 120 cc de argón. Los volúmenes necesarios de argón y el gas a mezclar con el mismo (Xe o Kr) se introdujeron luego en los viales utilizando una jeringuilla de 30 cc provista de aguja.
% Argón Xe/Kr
0,1% 120 cc 0,2 cc
1,0% 118 cc 2,4 cc
5,0% 108 cc 12 cc
10% 96 cc 24 cc
50% 0 cc 120 cc
Prueba 1
Se gasificó la enzima utilizando un vial de mezcla de gases con utilización de 8 x 10 cc de gas procedente del vial. Se gasificó la cubeta/sustrato utilizando un segundo vial de mezcla de gas con utilización de 8 x 10 cc de gas procedente del vial. Se recuperaron argón y xenón de las botellas de gas.
Se llenaron las jeringuillas de toma de muestra de enzima como sigue:
Enzima Gas
Ar Ar
Xe Xe
0,1% Ar/Xe Ar
1,0% Ar/Xe Ar
5,0% Ar/Xe Ar
Transportador de celdas:
Mezcla de gases: Ar/Xe, 1 repetición
Operación 1: Celda 1: Ar
Celda 2: Xe
Celda 3: Ar/Xe 0,1%
Celda 4: Ar/Xe 1,0%
Celda 5: Ar/Xe 5,0%
(Réplica 1: R1)
PARAM: rendija 1
velocidad 1500
Asave Y
Aprint N
CPRG: Tirosinasa: 25°C
305 nm
80 pts \rightarrow 20 min OPERACIÓN
16s int
Y_{min} = 0,0
Y_{max} = 2,0
B-Glucosidasa: 35°C
400 nm
60 pts \rightarrow 15 min OPERACIÓN
16s int
Y_{min} = 0,0
Y_{max} = 1,5
Blancos: Tirosinasa: 2 ml Soln A + 0,5 ml Soln B
B-Glucosidasa: 2 ml Soln E + 0,5 ml Soln D
Muestra: Tirosinasa: 2 ml Soln C + 0,5 ml Soln B
\beta-Glucosidasa: 2 ml Soln E + 0,5 ml Soln F
Archivos:
Tirosinasa:
X9R1G1M1...5.SP
Glucosidasa:
XOR1G1M1...5.SP
Resultados de la Prueba 1:
Se encontró que existía contaminación de aire en la operación con tirosinasa, y se supuso que ocurría lo mismo en el caso con la operación con glucosidasa. Se determinó que no era posible recuperar 8 x 10 cc de mezcla de gases de un vial. Por esta razón se decidió que debían prepararse 2 viales de mezcla de gas por cubeta para la gasificación y 2 viales de mezcla de gas por enzima, lo cual permitiría a los autores de la invención preparar 10 x 10 cc por cubeta/vial.
Operación 2:
Se gasificó la segunda operación utilizando 2 viales de mezcla de gas por cubeta y 2 viales de mezcla de gas por enzima. Se llevó a cabo luego el proceso para realizar las dos ultimas mezclas de gas (10% y 50%).
Mezcla de gases: Ar/Xe, 1 repetición
Transportador de celdas:
Operación 2: Celda 1: Ar
Celda 2: Xe
Celda 3: Ar/Xe 10,0%
Celda 4: Ar/Xe 50,0%
Celda 5: aire
(Réplica 1: R1)
PARAM: rendija 1
velocidad 1500
Asave Y
Aprint N
CPRG: Tirosinasa: 25°C
305 nm
80 pts \rightarrow 20 min OPERACIÓN
16s int
Y_{min} = 0,0
Y_{max} = 2,0
\beta-Glucosidasa: 35°C
400 nm
60 pts \rightarrow 15 min OPERACIÓN
16s int
Y_{min} = 0,0
Y_{max} = 1,5
Blancos: Tirosinasa: 2 ml Soln A + 0,5 ml Soln B
\beta-glucosidasa: 2 ml Soln E + 0,5 ml Soln D
Muestra: Tirosinasa: 2 ml Soln C + 0,5 ml Soln B
\beta-Glucosidasa: 2 ml Soln E + 0,5 ml Soln F
Archivos:
Tirosinasa:
X9R1G1M6...0.SP
Glucosidasa:
XOR1G1M6...0.SP
Resultados de la Prueba 2:
La tirosinasa daba una separación como la que podía esperarse, por lo que se supuso que el nuevo método de gasificación de los autores de la invención es apropiado y se continuará gasificando de este modo. La glucosidasa no exhibe una gran separación, por lo que, debido a limitaciones de tiempo, los autores de la invención enfocarán su atención sobre la tirosinasa, específicamente las mezclas de gas con 10% y 50%.
Operación 3: Celda 1: Ar
Celda 2: Xe
Celda 3: Ar/Xe 10,0%
Celda 4: Ar/Xe 50,0%
Celda 5: aire (réplica 2: R2)
Archivos:
Tirosinasa:
X9R2G1M6...0.SP
Se prepararon las mezclas Ar/Kr como se ha descrito anteriormente y se realizaron dos réplicas de las mezclas con 10% y 50%.
\newpage
Operación 4/5: Celda 1: Ar
Celda 2: Kr
Celda 3: Ar/Kr 10,0%
Celda 4: Ar/Kr 50,0%
Celda 5: aire
(Réplica 1, 2: R1, R2)
Archivos:
Tirosinasa:
X9R1G2M6...0.SP
X9R2G2M6...0.SP
Resultados:
Los resultados con Ar/Xe parecían mucho mejores que los resultados obtenidos con Ar/Kr. Se continuará realizando réplicas de ambas mezclas utilizando 10% y 50%. Si el tiempo lo permite se harán así réplicas de 0,1%, 1% y 5% de ambas mezclas de gas con tirosinasa únicamente.
4/19/91:
Tirosinasa 2 réplicas con Ar/Xe en un espectrofotómetro y Ar/Kr en el otro espectrofotómetro.
Espectrofotómetro nuevo:
Operación 1: Celda 1: Ar
Celda 2: Xe
Celda 3: Ar/Xe 10,0%
Celda 4: Ar/Xe 50,0%
Celda 5: Aire
(Réplica 3: R3)
Operación 2: Celda 1: Ar
Celda 2: Xe
Celda 3: Ar/Xe 10,0%
Celda 4: Ar/Xe 50,0%
Celda 5: Aire
(Réplica 4: R4)
Espectrofotómetro antiguo:
Operación 1: Celda 1: Ar
Celda 2: Kr
Celda 3: Ar/Kr 10,0%
Celda 4: Ar/Kr 50,0%
Celda 5: Aire
(Réplica 3: R3)
Operación 2: Celda 1: Ar
Celda 2: Kr
Celda 3: Ar/Kr 10,0%
Celda 4: Ar/Kr 50,0%
Celda 5: Aire
(Réplica 4: R4)
PARAM: rendija 1
velocidad 1500
Asave Y
Aprint N
CPRG: Tirosinasa: 25°C
305 nm
80 pts \rightarrow 20 min OPERACIÓN
16s int
Y_{min} = 0,0
Y_{max} = 2,0
Blancos: Tirosinasa: 2 ml Soln A + 0,5 ml Soln B
Muestra: Tirosinasa: 2 ml Soln C + 0,5 ml Soln B
Archivos: Ar/Xe:
X9R3G1M6...0.SP
X9R4G1M6...0.SP
- - - - - - - - - - - - - - - - -
10 ARCHIVOS
Ar/Kr:
X9R3G2M6...0.SP
X9R4G2M6...0.SP
- - - - - - - - - - - - - - - - -
10 ARCHIVOS
Por falta de tiempo:
Los autores de la invención pudieron únicamente realizar lo siguiente:
Espectrofotómetro nuevo:
Operación 3: Celda 1: Ar
Celda 2: Xe
Celda 3: Ar/Xe 0,1%
Celda 4: Ar/Xe 1,0%
Celda 5: Ar/Xe 5,0%
(Réplica 2: R2)
Operación 4: Celda 1: Ar
Celda 2: Xe
Celda 3: Ar/Xe 0,1%
Celda 4: Ar/Xe 1,0%
Celda 5: Ar/Xe 5,0%
(Réplica 3: R3)
Archivos: Ar/Xe:
X9R2G1M1...5.SP
X9R3G1M1...5.SP
- - - - - - - - - - - - - - - - -
10 ARCHIVOS
Así pues, la presente invención proporciona generalmente un método de regulación de la actividad enzimática por puesta en contacto de una o más enzimas con un gas que contiene uno o más gases nobles o mezclas de los mismos.
De acuerdo con la presente invención, la enzima regulada puede ser una enzima simple aislada o una o más enzimas que constituyen una mezcla. Por ejemplo, de acuerdo con la presente invención, puede regularse una mezcla de enzimas por inhibición selectiva de las actividades de una o más enzimas e intensificación selectiva de las actividades de una o más enzimas.
Adicionalmente, la actividad enzimática puede regularse de acuerdo con la presente invención en un intervalo de temperatura comprendido entre el punto de ebullición del nitrógeno líquido (aproximadamente -200°C) y aproximadamente 120°C.
De acuerdo con la presente invención, cualquier enzima puede ser regulada utilizando los presentes gases nobles. No obstante, por selección de las condiciones apropiadas de pH, temperatura, presión, [E] y [S], todas las enzimas pueden ser inhibidas específicamente por la totalidad de los gases nobles de la presente invención. Adicionalmente, está dentro de la experiencia de los técnicos la utilización de la presente exposición y de las líneas orientativas expuestas anteriormente en esta memoria para determinar los niveles óptimos de pH, temperatura, presión, [E] y [S] para cualquier sistema de enzimas particular o sistema de enzimas mixto de interés.
Las figuras de la presente memoria descriptiva se expondrán a continuación con más detalle.
La Figura 1 ilustra el espectro de absorción de 2,5 ml de tirosinasa (100 \mug/ml) frente a 2,5 ml en tampón de fosfato de sodio a pH 6,85.
La Figura 2 ilustra el espectro de absorción de 2,5 ml de L-tirosina (100 \mug/ml) frente a 2,5 ml de tampón de fosfato de sodio a pH. 6,85.
La Figura 3 ilustra el espectro de absorción de tirosinasa y L-tirosina corregido por ensayo en blanco con L-tirosina a las concentraciones y pH indicados.
La Figura 4 ilustra una superposición de los resultados de reacciones realizadas con diversas concentraciones de tirosinasa (40, 60, 80 y 100 \mug/ml), que muestra una dependencia lineal directa de primer orden de la concentración de tirosinasa.
La Figura 5 ilustra la inhibición de tirosinasa por xenón a (p/p) iguales, utilizando las concentraciones y pH indicados.
La Figura 6 ilustra una inhibición muy grande de la tirosinasa por el xenón a 26°C, y se estima que es aproximadamente (área de la curva realizada en aire = 11217 \mu xenón = 3037 \mu, total = 14254 \mu, % de área total de aire = 78,69%, xenón = 21,31, área total de xenón = 27,08% del área de aire, inhibición de la velocidad del aire por xenón: 72,92%. Esta tasa de inhibición es extraordinariamente grande con relación a otros inhibidores enzimáticos convencionales.
La Figura 7 ilustra que, a 15°C, el argón inhibe ligeramente el equilibrio de la reacción tirosinasa-L-tirosina, el xenón exhibe un efecto inhibidor pequeño pero significativo, y tanto neón como kriptón exhiben efectos intensos. El oxígeno y el aire exhiben aproximadamente el mismo efecto.
La Figura 8 ilustra que, a 20°C, el xenón inhibe la reacción tirosinasa-L-tirosina muy intensamente, en tanto que los otros gases, neón, kriptón y argón son todos ellos inhibidores eficaces.
La Figura 9 ilustra que el oxígeno tiene sólo un efecto inhibidor moderado sobre la reacción tirosinasa-L-tirosina.
La Figura 10 ilustra la potente inhibición a 20°C de la reacción tirosinasa-L-tirosina por argón, teniendo prácticamente el mismo efecto el kriptón. No obstante, los otros gases indicados son también inhibidores eficaces.
La Figura 11 ilustra que el oxígeno tiene solamente un ligero efecto inhibidor sobre la reacción tirosinasa-L-tirosina a 25°C.
La Figura 12 ilustra el efecto inhibidor de neón, argón, kriptón y xenón sobre la actividad de tirosinasa a 30°C.
La Figura 13 ilustra el efecto inhibidor del oxígeno sobre la actividad tirosinasa-L-tirosina a 30°C.
La Figura 14 ilustra una operación de reacción estándar tirosinasa-L-tirosina en aire mostrando cambios de velocidad directamente atribuibles a diferencias de solubilidad del oxígeno. Las curvas obtenidas con oxígeno en lugar de aire son idénticas.
La Figura 15 ilustra un efecto inhibidor con neón, que es dependiente de la temperatura.
La Figura 16 ilustra una relación directa inversa (negativa) entre la capacidad del kriptón para inhibir la tirosinasa y la temperatura.
La Figura 17 ilustra que el xenón inhibe el equilibrio de la reacción tirosinasa-L-tirosina mejor que otros gases, pero deprime la velocidad solamente tanto como kriptón y argón para esta reacción. Adicionalmente, la variabilidad en la forma de la curva es alta, lo cual sugiere extrañamente una interacción directa en el sitio activo con tirosinato. El xenón interacciona inversamente con la temperatura y comparte una transición dinámica de efecto entre 20°C y 25°C.
\newpage
La Figura 18 ilustra que, a 20°C, argón, xenón y neón inhiben todos ellos espectacularmente la actividad de tirosinasa, mientras que kriptón tiene un efecto menor. El nitrógeno inhibe también la reacción aceptablemente; en cambio, el oxígeno exhibe poco efecto.
La Figura 19 ilustra que, a 25°C, argón y nitrógeno inhiben en un menor nivel que los otros gases nobles, mientras que el oxígeno intensifica la reacción. La pequeña diferencia en la forma de la curva entre los pares de curvas kriptón-xenón y neón-argón es altamente significativa, debido a los efectos probablemente relativos de la exclusión de Van der Waals y la dilución con oxígeno.
La Figura 20 ilustra que, a 30°C, el oxígeno ya no intensifica la actividad de tirosinasa debido a su menor solubilidad. El xenón inhibe la reacción mucho mejor que otros gases, aunque todos ellos son eficaces.
La Figura 21 ilustra la inhibición de la actividad de tirosinasa por el neón, teniendo lugar una transición de actividad entre 20°C y 25°C.
La Figura 22 ilustra la inhibición de la actividad de tirosinasa por el argón, mostrando mejor inhibición por el argón a 20°C que el neón, pero menos inhibición a 25°C que el neón. Se considera que estas diferencias son atribuibles directamente a solubilidad/difusibilidades del oxígeno.
La Figura 23 ilustra la inhibición de la actividad de tirosinasa por el kriptón, teniendo lugar una transición de actividad entre 20°C y 25°C. Esto proporciona evidencia acusada de una interacción directa entre el gas y el sitio activo de la enzima.
La Figura 24 ilustra la existencia de al menos dos transiciones de actividad para xenón en la inhibición de la actividad de tirosinasa. Una primera transición de actividad se presenta entre 25°C y 30°C, y una segunda entre 30°C y 35°C. Puede existir una tercera transición de actividad entre 20°C y 25°C. Estas transiciones proporcionan evidencia acusada de una interacción directa entre el gas y el sitio activo de la enzima.
La Figura 25 ilustra la inhibición de la tirosinasa exclusivamente por un mecanismo de solubilidad que implica el desplazamiento de oxígeno de la solución. El aire muestra el patrón esperado de velocidad impulsado por disolución, mientras que el oxígeno satura a 30°C.
La Figura 26 ilustra la inhibición de la actividad de tirosinasa por el nitrógeno. El nitrógeno puede inhibir únicamente las enzimas por un mecanismo de solubilidad que implica el desplazamiento del oxígeno de la solución, pero es eficaz para inhibir la actividad de la tirosinasa. Se observa un máximo de transición después de 20°C. La diferencia entre las curvas de nitrógeno y las curvas de gases nobles representa la inhibición del sitio activo potencial. En la mayoría de los casos, estas diferencias son significativas para cada gas a al menos una temperatura.
La Figura 27 ilustra la gran diferencia en la actividad del xenón entre 20°C y 25°C. Esto corresponde con una temperatura óptica del sitio enzimático activo.
La Figura 28 ilustra la inhibición de la glucosaoxidasa por kriptón, xenón, argón, nitrógeno y neón.
La Figura 29 ilustra la inhibición de la \alpha-glutamil-transpeptidasa por kriptón, xenón, argón, y una mezcla de kriptón y xenón.
La Figura 30 ilustra la inhibición de la aspartato-aminotransferasa por kriptón, xenón, argón y una mezcla de kriptón y xenón.
La Figura 31 ilustra la intensificación de la \alpha-D-glucosidasa por SF_{6}, argón, nitrógeno, neón y oxígeno.
La Figura 32 ilustra la intensificación de la fenilalanina-amoniaco-liasa por neón, oxígeno y nitrógeno.
La Figura 33 ilustra la intensificación de la citrato-sintasa por xenón y kriptón y la inhibición de la misma por argón.
La Figura 34 ilustra la intensificación de la fosfoglucosa-isomerasa por xenón, kriptón, argón y una mezcla de kriptón y xenón a 10°C.
La Figura 35 ilustra la intensificación de la fosfoglucosa-isomerasa por neón y nitrógeno, y la inhibición de la misma por el oxígeno a 25°C.
La Figura 36 ilustra la intensificación de la S-acetil-CoA-sintetasa por kriptón y una mezcla de kriptón y xenón a 25°C.
La Figura 37 ilustra el efecto inhibidor de aire y nitrógeno sobre la \beta-glucosidasa a 100 atm de presión. Este efecto es simple debido al deterioro enzimático a causa de la presión elevada.
La Figura 38 ilustra el efecto inhibidor de aire y nitrógeno sobre la \beta-glucosidasa a 30 atm de presión. Este efecto es debido análogamente al deterioro enzimático por la presión elevada.
La Figura 39 ilustra el efecto inhibidor de aire, xenón y nitrógeno sobre la actividad de la tirosinasa a 30 atm de presión. El. efecto es debido al deterioro enzimático por la presión elevada.
La Figura 40 ilustra el efecto inhibidor de aire, xenón y nitrógeno sobre la tirosinasa a 100 atm de presión. Este efecto es debido al deterioro enzimático por la presión elevada.
La Figura 41 ilustra que las concentraciones enzimasustrato influyen en los resultados de la intensificación o inhibición por los gases nobles, como se ilustra con la actividad de \beta-D-glucosidasa. S1, S2 y S3 representan tres concentraciones de sustrato diferentes y crecientes. Este resultado es ventajoso, dado que significa que los procesos biotecnológicos actuales pueden modificarse para reducir el coste de enzima y/o sustrato o incluso para facilitar reacciones no posibles actualmente.
La Figura 42 ilustra los diferentes efectos de xenón y neón en, respectivamente, la intensificación y la posterior inhibición de la lactato-deshidrogenasa a 10°C, por ejemplo. Esto es ventajoso, dado que significa que una enzima dada puede ser intensificada o inhibida dependiendo del gas seleccionado.
La Figura 43 ilustra que, incluso a temperaturas altas, se observa el efecto de la presente invención. Particularmente, a 60°C, la actividad de la \alpha-glucosidasa es intensificada por argón, nitrógeno y xenón, e inhibida por kriptón. Claramente, para esta enzima, el argón es un intensificador potente a 60°C.
La Figura 44 ilustra el efecto del xenón a 25°C en la intensificación de la actividad enzimática de la \beta-glucosidasa en forma inmovilizada.
Como se ha indicado anteriormente, las actividades enzimáticas pueden regularse de acuerdo con la presente invención dentro de un amplio intervalo de temperatura que va desde valores tan bajos como la temperatura del nitrógeno líquido (aproximadamente -200°C) hasta aproximadamente 120°C. Adicionalmente, la presión de los gases o mezclas gaseosas utilizados(as) puede ser tan baja como un vacío ultraelevadc de aproximadamente 10^{-8} atmósferas, hasta aproximadamente 100 atmósferas. No obstante, puede ser deseable utilizar presiones todavía más bajas o incluso más altas. Generalmente, no obstante, se utilizan presiones de gas de aproximadamente 10^{-3} a aproximadamente>> 3 atmósferas, siendo utilizadas muy comúnmente presiones de gas de aproximadamente 10^{-2} a aproximadamente
2 atmósferas.
Como se ha expuesto anteriormente, la presente invención es eficaz para regular la actividad enzimática con indiferencia de la enzima seleccionada y la forma de la enzima. El ejemplo siguiente se proporciona para ilustrar la eficacia de la presente invención en la regulación de la actividad enzimática de enzimas inmovilizadas.
Protocolo: Enzimas Inmovilizadas.
Teoría: Los efectos de los gases son iguales sobre las enzimas libres o inmovilizadas.
Gases: 1. Aire
2. Xenón
Enzima: \beta-D-glucosidasa (SIGMA No. G-0898)
\beta-D-glucosido-glucohidrolasa (EC 3.2.1.21)
De Caldocellum saccharolyticum: Recombinante (pfs)
Expresada en E. coli
Polvo liofilizado
Enzima termoestable con semi-vida de 38 h a 70°C
Definición de la unidad:
Una unidad liberará 1,0 \mumol de glucosa a partir de salicina por min a pH 5,0 a 37°C.
Actividad: 46 U/g sólidos
10,87 g sólidos \rightarrow 500 Unidades
Se guarda desecada a 0-5°C
Lote# 50H0251
Sustrato: p-Nitrofenil-\beta-D-glucopiranosido (SIGMA No. N-7006)
Cristalino
Contiene 2,4% de disolvente
P. Mol. anhidro 301,3
Se guarda desecado por debajo de 0°C
Lote# 129F-5057
Preparación de la solución:
prep: 5/21/91
Soln A: Tampón de fosfato de sodio pH 6,6 a 25°C
1 T. Agua desionizada
141,96 x 0,2 x 187,5 x 1/1000 = 5,3 g Na_{2}HPO_{4}
119,96 x 0,2 x 312,5 x 1/1000 = 7,5 g NaH_{2}PO_{4}
prep: 5/21/91
Soln B: 100 µg/ml solución de \beta-D-glucopiranosido en tampón de fosfato de Na
25 mg de N-7006 diluidos a 250 ml en tampón de fosfato de Na, pH 6,6 a 25°C
prep: 5/21/91
Soln C1: Solución de \beta-D-glucosidasa en tampón de fosfato de sodio a pH 6,6 (25°C)
(2,18 Unidades/ml)
1 g de G-0898 solubilizada en 21 ml de tampón de fosfato de Na, pH 6,6 a 25°C.
(En el caso de polvos liofilizados de enzimas insolubles, SIGMA recomienda suspender la cantidad requerida a 5-10 mg sólidos/ml H_{2}O y permitir una hidratación breve).
Se permitió una hidratación breve (hasta que aparece una solución)
400 nm
80 pts \rightarrow
16s int
Y_{min} = 0 , 0
Y_{max} = 3,0
Blanco: 2 ml Soln A + 0,5 ml Soln C1
Muestra: 2 ml Soln B + 0,5 ml Soln C1
Archivos: G0898G1...4.SP
*PRUEBA 2: 5/22/91
Transportador de celdas:
2 réplicas
Operación: Celda 1: aire
Celda 2: aire (réplica)
Celda 3: Xe
Celda 4: Xe (réplica)
PARAM: rendija 1
velocidad 1500
Asave Y
Aprint N
CPRG: \beta-Glucosidasa: 25°C
400 nm
120 pts \rightarrow
16s int
Y_{min} = 0 , 0
Y_{max} = 1, 0
Blanco: 2 ml Soln A + 0,5 ml Soln C2
Muestra: 2 ml Soln B + 0,5 ml Soln C2
Archivos: 2 G0898G1...4.SP
Con objeto de ilustrar adicionalmente la presente invención y los efectos obtenidos por ella, se realizaron análisis cinéticos.
Análisis cinéticos
Los datos de las curvas de absorbancia como se han ilustrado previamente revelan diferencias en actividad enzimática bajo atmósferas gaseosas diferentes tanto en términos de rendimiento como en términos de velocidad. El rendimiento puede calcularse una vez alcanzado el equilibrio por diferenciación comparativa de las curvas, y por linealización y cálculo formales - que son también necesarios para los cálculos de velocidad. Las diferencias de velocidad se calcular utilizando programas de ordenador disponibles comercialmente (ENZFITTER, GRAFIT, ENZPACK, PEAKFIT) que transforman la curva de datos de absorbancia inicial uv/vis (en estos ejemplos, una curva de potencia) en líneas rectas (regresión lineal de la curva de potencia). Estas líneas pueden expresarse como una ecuación matemática en la cual la pendiente es aproximadamente la velocidad, y la intersección límite con el eje Y es aproximadamente el rendimiento. Estos datos pueden tratarse ulteriormente para derivar relaciones Michaelis- Menten u otras relaciones bioquímicas estándar (expresadas gráfica o matemáticamente), a partir de las cuales pueden derivarse exactamente la velocidad y el rendimiento. Los ejemplos y las figuras descritos a continuación representan estos pasos en forma ilustrativa.
La Figura 45 ilustra curvas uv/vis absorbanciapotencia para \beta-glucosidasa en aire para cinco concentraciones diferentes de sustrato.
La Tabla 1 ilustra los cálculos de cinética enzimática de Michaelis-Menten de Vmax y Km, así como las velocidades para cada reacción. Vmax es la velocidad límite, y Km es la constante de Michaelis-Menten.
La Figura 46 y la Tabla 2 ilustran lo mismo que la Figura 45 y la Tabla 1, excepto que corresponden a reacciones con xenón. Es claramente evidente que los valores Vmax y Km para xenón son mayores.
La Figura 47, Tabla 3, la Figura 48 y la Tabla 4 ilustran las transformaciones lineales de la velocidad de regresión de las curvas de potencia de primer orden para las reacciones anteriores gasificadas con aire y xenón, mostrando una aproximación a los datos de Michaelis- Menten, en los cuales la razón de velocidades Xe/Aire se encuentra en la misma relación que anteriormente.
La Figura 49, Figura 50 y Tabla 5 ilustran las mismas linealizaciones de regresión por aproximación de velocidad de primer orden para todos los gases estudiados en esta operación. En este caso, únicamente el xenón exhibía una intensificación significativa, en el análisis de la curva de potencia, pero la linealización demuestra claramente que otros gases intensificaban la reacción.
La Figura 51, Tabla 6, la Figura 52 y la Tabla 7 ilustran datos procedentes de los primeros 160 segundos de un experimento simple con tirosinasa expresado como curvas de potencia para aire, y luego para gasificación con xenón. La regresión de la velocidad linealizada demuestra que el xenón inhibe acusadamente la actividad de la tirosinasa, y los cálculos Michaelis-Menten presentados lo confirman.
TABLA 1
Gas 1: Aire
Cinética de las enzimas
Ponderación simple
Chi cuadrado reducido: 0,0000
Variable Valor Error estándar
Vmax 0,0025 0,0002
Km -3,1783 2,6341
X Y
[S] Tasas G1 Calculado
1 20,0000 0,0029 0,0029
2 40,0000 0,0028 0,0027
3 60,0000 0,0025 0,0026
4 80,0000 0,0030 0,0026
5 100,0000 0,0022 0,0026
Los conjuntos de datos siguientes se representan gráficamente en las Figuras como se ha indicado anteriormente.
TABLA 2
Gas 5: xenón
Cinética de las enzimas
Ponderación simple
Chi cuadrado reducido: 0,0000
Variable Valor Error estándar
Vmax 0,0028 0,0001
Km -2,4539 1,3570
X Y
[S] velocidades G5 Calculado
1 20,0000 0,0032 0,0032
2 40,0000 0,0029 0,0029
3 60,0000 0,0027 0,0029
4 80,0000 0,0030 0,0029
5 100,0000 0,0029 0,0028
TABLA 3
[S] = 60 microgramos/ml
Ecuación de velocidad de primer orden
Ponderación simple
Chi cuadrado reducido = 0,0002
Variable Valor Error Estándar
Límite 0,8021 0,0146
Constante de velocidad 0,0032 0,0001
TABLA 3 (continuación)
X Y
Tiempo Abs Calculado
1 0,0000 0,0471 0,0000
2 15,0000 0,0777 0,0377
3 30,0000 0,1071 0,0737
4 45,0000 0,1346 0,1080
5 60,0000 0,1626 0,1406
6 75,0000 0,1890 0,1717
7 90,0000 0,2136 0,2014
8 105,0000 0,2386 0,2296
9 120,0000 0,2623 0,2566
10 135,0000 0,2849 0,2822
11 150,0000 0,3067 0,3067
12 165,0000 0,3287 0,3300
13 180,0000 0,3485 0,3522
14 195,0000 0,3691 0,3734
15 210,0000 0,3881 0,3935
16 225,0000 0,4066 0,4128
17 240.0000 0,4244 0,4311
18 255,0000 0,4414 0,4485
19 270,0000 0,4579 0,4652
20 285,0000 0,4741 0,4810
21 300,0000 0,4897 0,4961
22 315,0000 0,5044 0,5105
23 330,0000 0,5190 0,5242
24 345,0000 0,5325 0,5373
25 360,0000 0,5448 0,5498
26 375,0000 0,5569 0,5616
27 390,0000 0,5687 0,5730
TABLA 4
[S] = 60 microgramos/ml
Ecuación de velocidad de primer orden
Ponderación simple
Chi cuadrado reducido: 0,0014
Variable Valor Error estándar
Límite 0,8382 0,0228
Constante de velocidad 0,0045 0,0003
X Y
Tiempo Abs [53] Calculado
1 0,0000 0,1261 0,0000
2 15,0000 0,1590 0,0544
3 30,0000 0,1928 0,1053
4 45,0000 0,2217 0,1529
5 60,0000 0,2514 0,1974
6 75,0000 0,2811 0,2390
7 90,0000 0,3085 0,2779
8 105,0000 0,3349 0,3143
9 120,0000 0,3608 0,3483
TABLA 4 (continuación)
X Y
Tiempo Abs [53] Calculado
10 135,0000 0,3831 0,3801
11 150,0000 0,4065 0,4099
12 165,0000 0,4300 0,4377
13 180,0000 0,4511 0,4637
14 195,0000 0,4719 0,4880
15 210,0000 0,4940 0,5108
16 225,0000 0,5112 0,5320
17 240,0000 0,5311 0,5519
18 255,0000 0,5503 0,5705
19 270,0000 0,5675 0,5879
20 285,0000 0,5842 0,6042
21 300,0000 0,6011 0,6194
22 315,0000 0,6165 0,6336
23 330,0000 0,6313 0,6469
24 345,0000 0,6460 0,6593
25 360,0000 0,6588 0,6709
26 375,0000 0,6711 0,6818
27 390,0000 0,6834 0,6919
TABLA 5
Gas 1: Aire
Ecuación de velocidad de primer orden
Ponderación simple
Chi cuadrado reducido: 0,0002
Variable Valor Error estándar
Límite 0,8021 0,0146
Constante de velocidad 0,0032 0,0001
X Y
Tiempo Abs G1 Calculado
1 0,0000 0,0471 0,0000
2 15,0000 0,0777 0,0377
3 30,0000 0,1071 0,0737
4 45,0000 0,1346 0,1080
5 60,0000 0,1626 0,1406
6 75,0000 0,1890 0,1717
7 90,0000 0,2136 0,2014
8 105,0000 0,2386 0,2296
9 120,0000 0,2623 0,2566
10 135,0000 0,2849 0,2822
11 150,0000 0,3067 0,3067
12 165,0000 0,3287 0,3300
13 180,0000 0,3485 0,3522
14 195,0000 0,3691 0,3734
15 210,0000 0,3881 0,3935
16 225,0000 0,4066 0,4128
17 240,0000 0,4244 0,4311
18 255,0000 0,4414 0,4485
TABLA 5 (contiuación)
X Y
Tiempo Abs G1 Calculado
19 270,0000 0,4579 0,4652
20 285,0000 0,4741 0,4810
21 300,0000 0,4897 0,4961
22 315,0000 0,5044 0,5105
23 330,0000 0,5190 0,5242
24 345,0000 0,5325 0,5373
25 360,0000 0,5448 0,5498
26 375,0000 0,5569 0,5616
27 390,0000 0,5687 0,5730
TABLA 6
Gas 1: Aire
Cinética de las enzimas
Ponderación simple
Chi cuadrado reducido: 0,0000
Variable Valor Error estándar
Vmax 0,0003 0,0003
Km -17,0661 3,5059
X Y
[S] Gas 1: Aire Calculado
1 10,0000 0,0018 -0,0004
2 20,0000 0,0019 0,0021
3 30,0000 0,0011 0,0007
4 40,0000 0,0018 0,0005
5 50,0000 0,0018 0,0005
TABLA 7
Gas 5: Xenón
Cinética de las enzimas
Ponderación simple
Chi cuadrado reducido: 0,0000
Variable Valor Error estándar
Vmax 0,0001 0,0003
Km -27,9623 6,3527
X Y
[S] Gas 5: Xenón Calculado
1 10,0000 0,0007 -0,0001
2 20,0000 0,0019 -0,0003
3 30,0000 0,0019 0,0017
4 40,0000 0,0019 0,0004
5 50,0000 0,0004 0,0003
Así pues, la presente invención proporciona un método de regulación de la actividad enzimática de cualquier enzima y en cualquier forma. Adicionalmente, esta regulación puede efectuarse en los extensos campos de temperatura y presión indicados. \beta
Como se ha expuesto previamente, la enzima o enzimas reguladas de la presente invención pueden encontrarse en solución acuosa u orgánica, en forma inmobilizada, en una dispersión o en cualquier tipo de matriz orgánica, tal como un gel, por ejemplo. Tales soluciones, formas inmovilizadas, dispersiones o matrices orgánicas son conocidas por los expertos en la técnica.
Adicionalmente, de acuerdo con la presente invención, una mezcla de enzimas puede regularse por inhibición de una o más enzimas contenidas en ella o por intensificación de una o más enzimas contenidas en ella. Alternativamente, es posible efectuar la regulación tanto por inhibición de una o más enzimas en la mezcla como por intensificación de una o más otras enzimas contenidas en ella.
Además, está plenamente dentro de la experiencia de los especialistas el uso de la presente exposición y las directrices expuestas anteriormente en la misma para determinar los niveles ópticos de pH, temperatura, presión, [E] y [S] para cualquier sistema de una enzima particular o sistema mixto de enzimas de interés.
Por ejemplo, para cualquier sistema de enzima o sistema mixto de enzimas de interés, las condiciones óptimas de pH, presión, temperatura, [E] y [S] pueden determinarse cuando se adquieren la enzima o enzimas, y por utilización de manuales de referencia bien conocidos. Véanse, por ejemplo, los catálogos de la Sigma Chemical Company para 1990 y 1991, así como el texto Enzymes por Dixon y Webb, 3ª edición (Wiley, 1979). A partir de este conocimiento, el experto puede determinar luego, utilizando la presente exposición, la mezcla óptima de gases, temperatura y presión para obtener los efectos deseados de acuerdo con la presente invención.
Una vez descrita la presente invención, resultará ahora evidente para una persona con experiencia ordinaria en la técnica que pueden realizarse muchos cambios y modificaciones en las realizaciones anteriores sin apartarse del espíritu y el alcance de la presente invención.

Claims (25)

1. Un método para utilizar una enzima con objeto de actuar sobre un sustrato para la misma, en el cual se intensifica la actividad enzimática, caracterizado por poner en contacto al menos una enzima seleccionada del grupo constituido por hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas, con el sustrato de la misma, y durante al menos una parte de dicha puesta en contacto, poner en contacto dicha al menos una enzima con una cantidad eficaz para mejorar dicha actividad enzimática de un gas constituido por un gas noble seleccionado del grupo constituido por xenón, argón, neón, kriptón y mezclas de los mismos, a una temperatura eficaz para intensificar dicha actividad enzimática, y a una presión de hasta 3 atmósferas (300 kPa).
2. El método de la reivindicación 1, caracterizado adicionalmente porque dicho gas es una mezcla de dichos gases nobles.
3. El método de la reivindicación 1 ó 2, caracterizado adicionalmente porque dicha al menos una enzima se encuentra en solución, en forma inmovilizada, en una dispersión o en una mezcla orgánica.
4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado adicionalmente porque dicha puesta en contacto de dicha al menos una enzima con dicho gas se efectúa a una temperatura comprendida entre la temperatura del nitrógeno líquido y 120°C.
5. El método de la reivindicación 4, caracterizado adicionalmente porque dicha temperatura es de 20°C a 60°C.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado adicionalmente porque dicha al menos una enzima se pone en contacto con dicho gas a una presión de 10^{-8} atmósferas hasta 3 atmósferas (10^{-6} hasta
300 kPa).
7. El método de la reivindicación 6, caracterizado adicionalmente porque dicha al menos una enzima se pone en contacto con dicho gas a una presión de 10^{-2} atmósferas a 2 atmósferas (1 a 200 kPa).
8. El método de la reivindicación 7, caracterizado adicionalmente porque dicha al menos una enzima se pone en contacto con dicho gas a una presión de 10^{-2} atmósferas a 2 atmósferas (1 a 200 kPa).
9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado adicionalmente porque dicha al menos una enzima se pone en contacto con dicho gas durante la totalidad de dicho contacto de dicha al menos una enzima con dicho sustrato para la misma.
10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado adicionalmente porque dicha enzima es una hidrolasa.
11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado adicionalmente porque dicha enzima es una liasa.
12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado adicionalmente porque dicha enzima es una isomerasa.
13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado adicionalmente porque dicha enzima es una ligasa.
14. Un método de regulación de la actividad enzimática, caracterizado por poner en contacto una o más enzimas con una atmósfera gaseosa que comprende uno o más gases nobles o mezclas de los mismos, en un campo de temperatura suficiente para hacer que uno o más de dichos gases nobles sufra una transición desde ser un inhibidor de la actividad enzimática a un intensificador de la actividad enzimática, o desde ser un activador de la actividad enzimática a un inhibidor de la actividad enzimática.
15. El método de la reivindicación 14, caracterizado adicionalmente porque dichas una o más enzimas se regulan haciendo que dicha atmósfera sufra una transición desde ser un intensificador de la actividad enzimática a un inhibidor de la actividad enzimática.
16. El método de la reivindicación 14 ó 15, caracterizado adicionalmente porque dichas una o más enzimas se encuentran en solución en forma inmovilizada, en una dispersión o en una matriz orgánica.
17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, caracterizado adicionalmente porque dicha regulación se efectúa a una temperatura de 20°C a 60°C.
18. El método de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, caracterizado adicionalmente porque dicha regulación se efectúa a una presión gaseosa de 10^{-3} atmósferas a 2 atmósferas (0,1 a 200 kPa).
19. El método de la reivindicación 18, caracterizado adicionalmente porque dicha regulación se efectúa a una presión de gas de 10^{-2} atmósferas a 2 atmósferas (1 a 200 kPa).
20. El método de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, caracterizado adicionalmente porque dichas una o más enzimas son oxidorreductasas.
21. El método de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, caracterizado adicionalmente porque dichas una o más enzimas son liasas.
22. El método de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, caracterizado adicionalmente porque dichas una o más enzimas son isomerasas.
23. El método de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, caracterizado adicionalmente porque dichas una o más enzimas son ligasas.
24. El método de la reivindicación 14, caracterizado adicionalmente porque dichas una o más enzimas se regulan haciendo que dicha atmósfera sufra una transición desde ser un inhibidor de la actividad enzimática a ser un in- tensificador de la actividad enzimática.
25. El método de la reivindicación 14, caracterizado adicionalmente por una mezcla de enzimas, regulándose la actividad enzimática de una o más enzimas contenidas en ella haciendo que dicha atmósfera sufra una transición desde ser un inhibidor de la actividad enzimática a ser un intensificador de la actividad enzimática.
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