JPH05328968A - 希ガスによる酵素活性の調節方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】酵素を希ガスと接触させることにより、酵素の
活性を調節する。活性を調節する酵素としては、オキシ
ドレダクタ−ゼ、ヒドロラ−ゼ、リア−ゼ、トランスフ
ェラ−ゼ、イソメラ−ゼ、リガ−ゼが対象となり、単独
であっても、２種以上の混合物であってもよい。希ガス
としては、ネオン、アルゴン、クリプトン、キセノンが
用いられ、１種単独であっても、２種以上の混合物であ
っても、希ガス以外のガスとの混合物であってもよい。
使用する希ガス、温度を変えることにより酵素活性の抑
制、増強を調節することができる。 【効果】単純かつ簡便に酵素活性の調節ができる。ま
た、酵素毎に特別に設計された試薬もしくは酵素の基質
と構造的に関連性を有する酵素毒を用意する必要もな
い。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の分野】この発明は、希ガスによって酵素活性を
調節する方法に関する。

【０００２】

【背景の説明】希ガスであるヘリウム（Ｈｅ）、ネオン
（Ｎｅ）、アルゴン（Ａｒ）、クリプトン（Ｋｒ）、キ
セノン（Ｘｅ）およびラドン（Ｒａ）の、他の原子との
化学結合に参加する能力は非常に限られたものである。
一般に、クリプトン、キセノンおよびラドンのみがフッ
素および酸素のような他の原子と反応するが、それによ
り形成された化合物は爆発的に不安定である。 F.A.Cot
ton および G.Wilkinsonによる Advanced Inorganic Ch
emistry （ Wiley、第３版）を参照。しかしながら、一
般に希ガスは化学的に不活性ではあるものの、キセノン
が、麻酔のような生理学的効果を現わすことが知られて
いる。他の生理学的効果も、窒素のような他の不活性ガ
スについて観察されており、窒素は、例えば、深海ダイ
ビングにおいて非常に高い圧力の下で用いられる場合に
は昏睡状態を引き起こすことが知られている。

【０００３】Schreiner に対する米国特許第 3,183,171
号には、アルゴンおよび他の不活性ガスが真菌の成長速
度に影響を与え得ること、およびアルゴンが魚および海
産物の保存性を改善することが報告されている。Schves
ter に対する米国特許第 4,946,326号、JP 52105232 、
JP 80002271 、JP 77027699 。しかしながら、これらの
観察に対する根本的な理解の欠如が、それらの結果の解
釈を、不可能ではないとしたならば、困難にしているこ
とは明らかである。その上、これらの研究に、酸素を含
む多くのガスの混合物が用いられたという事実が、その
ような観察の意義を不明瞭なものにしている。さらに、
これらの研究の幾つかは、高圧および凍結温度で行なわ
れている。そのような高圧では、観察された結果が、細
胞成分および酵素自身の圧力損傷によるものであったこ
とが考えられる。

【０００４】例えば、Schreiner は、1964ないし1966年
に、深海ダイビング、潜水艦および航空宇宙機のための
適切な閉じ込め大気の開発に関する研究における不活性
ガスの、特に麻酔効果に関する生理学的効果を文書にし
ている。この研究の結果は、３本の報告にまとめられて
おり、それぞれ、海軍省海軍研究所（the office ofNav
al Research, Department of the Navy）に宛てて作成
された「技術報告．アルゴン、ヘリウムおよび希ガス類
の生理学的効果」との題目がつけられている。Contract
Nonr 4115（00）、NR： 102-597。この研究の最後の３
本の概要および要約は、公開された。

【０００５】要約の１つである「不活性ガス相互作用お
よび酵素的に活性なタンパク質に対する効果」 Fed.Pro
c.26：650 （1967）では、局部的な昇圧で、希ガスおよ
び他の不活性ガスが、生来のままの動物（昏睡状態）お
よび微生物並びに哺乳動物細胞系（成長阻害）において
生理学的効果を生じるという観察を改めて記述してい
る。

【０００６】第２の要約である「化学的に不活性なガス
の生物学的活性についての可能な分子機構」In：Inter
n. Congr. Physiol.Sci. 、23rd、Tokyo では、種々の
レベルの細胞性器官で、高圧で、不活性ガスが生物学的
活性を示すという観察を改めて記述している。

【０００７】また、希ガスの一般的な生物学的効果の概
要が Schreinerにより公開されており、その中では、彼
の初期の研究の主要な結果が再録されている。「ヘリウ
ム−キセノン系元素の一般的な生物学的効果」 Fed. Pr
oc. 27：872-878 （1986）。

【０００８】しかしながら、1969年、Behnkeらが Schre
inerの主要な結論に反駁した。Behnkeらは、Schreiner
によって初期に報告された効果は再現性がなく、静水圧
力からそれ単独で起こる、すなわち、酵素に対する希ガ
スの効果は見られないと結論付けた。「高圧での、不活
性ガスによる影響を受けた酵素- 触媒反応」 J. FoodSc
i. 34：370-375 。

【０００９】基本的に、Schreiner の研究は、化学的に
不活性なガスは細胞部位に対して酸素分子と競合し、酸
素置換は不活性ガス濃度に対する酸素の割合に依存する
という仮説に基づいていた。この仮説は、亜酸化窒素を
用いて観察される、最も重大な観測された効果としては
いまだ示されておらず（抑制効果のみが観察されてい
る）、酸素分圧から独立していることが見出された。そ
の上、観測された抑制は、亜酸化窒素添加大気当りわず
か 1.9％であった。

【００１０】Schreiner の初期の研究に反駁するため
に、Behnkeらは、酵素に対する静水圧力の効果を独立に
試験し、Schreiner によって得られた結果を再現しよう
と試みた。Behnkeらは、キモトリプシン、インベルタ−
ゼおよびチロシナ−ゼのわずかな抑制が観察されるのに
必要な圧力を越えて窒素またはアルゴンのガス圧を上昇
させても、Schreiner の発見とは正反対に、抑圧のさら
なる増加は起こらないことを見出した。

【００１１】Behnkeらの発見は、圧力が安定する際に解
放される単純な初期静水抑制（initial hydrostatic in
hibition）によって説明することができる。明らかに、
この発見は、Schreiner によって提唱された化学的なＯ
₂ ／不活性ガス相互依存では説明することができない。
Behnkeらは、高圧不活性ガスは、酵素を物理的に変える
ことによるよりも、酸素利用率を減少させることによ
り、非流体（すなわち、ゼラチン）系においてチロシナ
−ゼを抑制すると結論付けた。この結論は、Schreiner
の発見と真っ向から対立する。

【００１２】Behnkeらの反駁に加えて、Schreiner によ
って報告された結果は、同様に他の理由により、不可能
というわけではないのであれば、説明が困難である。

【００１３】第１に、全ての分析は非常に高い圧力で行
われており、静水圧効果の制御が行なわれていない。

【００１４】第２に、多くの場合、種々の希ガスの間に
も、また希ガスと窒素との間にも重要な差異は見出され
ていない。

【００１５】第３に、酵素の純度が用いられたように、
これらの研究時においては、作用および抑制の酵素モ−
ドについての知識は非常に貧しいものであった。酵素活
性を混乱させることがなく、または異なるガスの有効性
を評価するに十分な程度の解像性で測定が行なわれたこ
とが確実であるとすることは不可能である。さらに、作
用のどのモ−ドも、無試験の仮説としてしか説明するこ
とができない。

【００１６】第４に、種々のガスの間の溶解度の相違は
制御されておらず、結果において考慮もされていない。

【００１７】第５に、全ての試験は、１気圧の空気に加
えて高圧の不活性ガスを用いて行なわれており、酸素圧
力の制御が不十分である。

【００１８】第６に、報告されたガスの効果は全て抑制
のみである。

【００１９】第７に、作業の全ての手順が十分に記述さ
れていないだけではなく、実験的に制御されていない可
能性がある。さらに、酵素反応開始後の長い遅滞がそれ
に続く反応の全工程を妨げ、その結果、最も高い可読性
の変化率の損失を招いている。

【００２０】第８に、報告されたデ−タの範囲は少数の
観察に基づく高い可変性を有しており、このため重要性
が排除されている。

【００２１】第９に、観察された抑制のレベルは、高圧
においてさえ非常に小さい。

【００２２】第10に、酵素濃度への依存を報告する研究
では、有意な使用に耐える図面が報告されていない。

【００２３】第11に、低圧、すなわち＜２気圧での不活
性ガスの抑制能力の研究は、全て、実際のデ−タではな
く、高圧での測定から補外されたラインに基づいて主張
されている。

【００２４】最後に、これは繰り返す価値のあることで
あるが、Behnkeらの結果は、幾つかの決定的な点におい
て、Schreiner によって報告された結果を明らかに否定
する。その主たるものは、高圧効果が小さく、Schreine
r によっては制御されていない静水効果がそれらの研究
における間違った結論の主な原因となっている点であ
る。

【００２５】加えて、キセノン、亜酸化窒素およびハロ
タンが微粒子シアリダ−ゼの活性を増強することがSand
hoffらにより、FEBS Letters、62巻、 3号（1976年 3
月）に報告されてはいるが、これらの結果は、この研究
に用いられた酵素の純度が非常に低いために疑問であ
り、おそらく粒子中のオキシダ−ゼの抑制によるもので
あろう。

【００２６】以下は、上記特許および刊行物をまとめ、
およびそれらに関連する他のものに言及するために示す
ものである。

【００２７】Behnkeら（1969）は、酵素触媒反応は高圧
で不活性ガスにより影響を受けることを開示する。J. F
ood. Sci. 34：370-375 。

【００２８】Schreiner ら（1967）は、酵素的に活性な
タンパク質に対する不活性ガスの相互作用および効果を
記述している。Abstract No.2209. Fed. Proc. 26 ：65
0 。

【００２９】Schreiner, H.R. 1964、技術報告（Techni
cal Report）には、アルゴン、ヘリウムおよび希ガスの
生理学的効果が記述されている。Contract Nonr 4115
（00）、NR：102-597 。海軍研究所、ワシントン D.C. Schreiner, H.R. 1965、技術報告（Technical Report）
には、アルゴン、ヘリウムおよび希ガスの生理学的効果
が記述されている。Contract Nonr 4115（00）、NR：10
2-597 。海軍研究所、ワシントン D.C. Schreiner, H.R. 1966、技術報告（Technical Report）
には、アルゴン、ヘリウムおよび希ガスの生理学的効果
が記述されている。Contract Nonr 4115（00）、NR：10
2-597 。海軍研究所、ワシントン D.C. 上述の研究は、いずれも、処理ガスが酵素活性部位と相
互作用することを示す、実験に基づく結論ではないこと
は重要である。

【００３０】それにもかかわらず、現時点では、酵素活
性が幾つかの方法で抑制されることが知られている。例
えば、多くの酵素は、それらの通常の基質と構造的に関
連する特定の毒によって抑制されることがある。代わり
に、多くの異なる試薬が、標的酵素の特定の不活性化剤
であることが知られている。一般に、これらの試薬は、
酵素の活性部位に化学修飾を施して触媒活性の損失、活
性部位指向性の非可逆的不活性化または親和性標識を誘
発する。C.Walsh による「酵素反応機構（Enzymatic Re
action Mechanisms ）」（W.H. Freeman＆Co., 1979 ）
を参照。代わりに、特定の多酵素配列（multi-enzyme s
equence ）が、調節またはアロステリック酵素として知
られている酵素によって調節されることが知られてい
る。A.L. Leninger 、Bioenergetics （Benjamin／Cumm
ings Publishing Co. 、1973）を参照。 しかしなが
ら、酵素活性の調節へのより簡単なアプロ−チが予測可
能かつ制御可能な方法でなされたならば、非常に好都合
であろう。さらに、酵素活性を、予測可能かつ制御可能
な方法で選択的に抑制もしくは増強する手段が見出され
たならば、非常に好都合であろう。

【００３１】

【発明の概要】したがって、この発明は、単純かつ簡便
な方式で酵素活性を調節する方法を提供することを目的
とする。

【００３２】また、この発明は、標的酵素を不活性化す
るよう構造的に設計された試薬を用いることなく、酵素
活性を調節する方法を提供することをも目的とする。

【００３３】また、この発明は、通常の酵素基質と構造
的に関連する酵素毒（enzyme poisons）を用いることな
く、酵素活性を調節する方法を提供することをも目的と
する。

【００３４】さらに、この発明は、最適相対酵素基質濃
度を移行させる方法を提供し、物理パラメ−タに関して
最適の反応条件を修飾することを目的とする。

【００３５】上述の目的および以下の記述からより明確
になるであろう事項は、１種もしくはそれ以上の酵素を
１種もしくはそれ以上の希ガスを含有するガスと接触さ
せることを必要とする酵素活性の調節方法により与えら
れる。

【００３６】

【好ましい態様の詳細な説明】この発明によると、驚く
べきことに、１種もしくはそれ以上の酵素を１種もしく
はそれ以上の希ガスを含むガスと接触させることによ
り、制御された予測可能な方式で酵素活性を調節できる
ことが見出された。さらに驚くべきことに、希ガスは、
低圧でさえ、かつ広い温度範囲にわたって、酵素に対す
る有意の効果を有することが見出された。

【００３７】実際、この発明は、幾つかの理由により全
く驚くべきものである。第１に、この発明によると、酵
素の調節を低圧で行なうことが可能である。しかしなが
ら、より高い圧力を用いることもできる。第２に、例え
ば、窒素、酸素、二酸化炭素、一酸化炭素および亜酸化
窒素のような他のガスを含む希ガスの混合物を用いて優
れた結果を得ることも可能である。一般に、この発明に
おける希ガスに加えてガス混合物中にいかなるガスを用
いることもできる。しかしながら、最も典型的には、そ
のような他のガスには酸素、窒素および二酸化炭素が含
まれる。

【００３８】ここで用いられる「希ガス」という用語
は、ヘリウム、ネオン、アルゴン、クリプトン、キセノ
ンまたはラドンの群からのいかなるガスをも意味するも
のである。しかしながら、一般に、ネオン、クリプトン
またはキセノンを用いることが好ましい。これは、単
に、ヘリウムの溶解度が低く、かつ適用系からの逸脱速
度が大きく、およびラドンは放射活性を有し危険である
ためである。

【００３９】この発明によると、単一の純粋な希ガスを
用いることができ、また希ガスの混合物を用いることも
できる。例えば、全ガス容量を基にした容量％でＫｒ約
90％およびＸｅ10％の組成を有する、安価な製造プラン
ト分離流ガス（offstream gas ）を用いることが好都合
である。しかしながら、例えば、１種もしくはそれ以上
の希ガスと、窒素、六フッ化硫黄、酸化炭素（carbon o
xygen ）もしくは酸素のような他のガスとの混合物を用
いることもできる。

【００４０】この発明によると、酵素活性に対する１種
もしくはそれ以上の希ガスの効果は、水溶液もしくは有
機溶液、分散液、懸濁液またはゲルのような他のタイプ
のマトリックス中で観察されることが見出された。さら
に、調節された酵素は、支持体に結合されても結合され
なくてもよい。希ガスそれ自体は、溶液中にあっても、
大気中にあっても、あるいは結合されていてもよい。

【００４１】この発明は、Joint Commission on Bioche
mical Nomenclature of the International Union of B
iochemistry and International Union of Pure and Ap
plied Chemistry によって分類された６種の酵素クラス
の全てを表わす酵素群が、低い圧力においてさえ、純粋
な希ガスもしくはそれらの混合物または他のガスとの混
合物とさせ接触させることにより、それらの活性が再現
可能に増強もしくは抑制されるという基本的な発見に基
づくものである。

【００４２】この発明によると、この発明のガスおよび
ガス混合物は、酵素活性に対する速度論的および熱力学
的制御の両方に作用する。すなわち、いまや酵素反応の
速度および収量の両者を制御することが可能になったの
である。

【００４３】反応混合物におけるこの発明のガスおよび
ガス混合物の溶解度はガスおよびガス混合物の測定され
る効果に影響を及ぼすが、溶解度が効果を全て決定する
わけではない。効果は、大きくは分極率、イオン性（io
nicity）、ファン・デル・ワ−ルス力および原子半径の
ような分子効果によるものである。一般に、この発明に
よると、温度を上昇させることは、溶解度を減少させる
ために利用可能なガスを制限し、効果を減少させる。し
かしながら、この効果の減少は、昇温に伴う分極の増加
によって相殺される。このため、約30℃以上の温度で、
ガスおよびガス混合物の増大した分極率は、ガスおよび
ガス混合物の効果として、溶解度特性よりも著しい影響
を有する。

【００４４】一般に、標準温度および圧力（ＳＴＰ）よ
り上で希ガスおよび希ガス混合物のモル濃度を増加させ
ることにより、酵素に対する観測される効果は増大す
る。さらに、効果はガス分子と酵素との相互作用に基づ
くように思われ、これは他のガスの添加とは独立してお
り、しかし他のガスの添加により改善され強化され得る
ものである。特に、希ガスの混合物は純粋な希ガスと同
様の方式で振るまい、数種のガスの混合物は単一の希ガ
スを用いて観測された効果を模倣し、反対にし、または
改良する。

【００４５】加えて、この発明によると、特定の希ガス
もしくはそれらの混合物が酵素活性を温度の関数として
抑制または増強し得ることが見出された。

【００４６】さらにまた、この発明によると、一般に、
ｐＨ、温度、圧力、［Ｅ］および［Ｓ］の適当な条件の
下で、全ての酵素がこの発明による各希ガスにより特異
的に抑制され得ることが見出された。

【００４７】この発明は、酵素が用いられるいかなる用
途における酵素活性の調節にも用いることができる。例
えば、この発明は、ペニシリンのような抗生物質の生
産；エタノ−ルおよび酢酸の生産；診断キットの製造；
ビ−ル、ワインおよびチ−ズのような発酵生成物の製
造；および大規模な酵素的変換一般に有利に用いること
ができる。

【００４８】上述のように、この発明は酵素の活性の調
節に有利に用いることができるものであって、酵素は６
種の識別された酵素カテゴリ−のいずれからのものであ
ってもよい。以下の例は説明のために示すものであり、
限定することを意図するものではない。

【００４９】特に、この発明は、例えば、デヒドロゲナ
−ゼ、オキシダ−ゼ、ペルオキシダ−ゼ、ヒドロキシダ
−ゼおよびオキシゲナ−ゼを含むオキシドレダクタ−ゼ
の調節に有利に用いることができる。オキシドレダクタ
−ゼの例としては、特に、チロシナ−ゼ、グルコ−スオ
キシダ−ゼ、アセトインデヒドロゲナ−ゼ、タウリンデ
ヒドロゲナ−ゼ、オクトパインデヒドロゲナ−ゼ、アゾ
ベンゼンレダクタ−ゼ、アセトインドキシルオキシダ−
ゼ、ハイポタウリンデヒドロゲナ−ゼ、シュ−ドモナス
シトクロ−ムオキシダ−ゼ、3-ヒドロキシアントラニレ
−トオキシダ−ゼ、クロリドペルオキシダ−ゼ、シトク
ロ−ムＣ3 ヒドロゲナ−ゼ、メリオテ−ト 3- モノオキ
シゲナ−ゼ、ＣＤＰ-4- ケト-6- デオキシデグルコ−ス
レダクタ−ゼおよびルブレドキシンＮａＤ⁺ レダクタ−
ゼおよびクロレ−トレダクタ−ゼを挙げることができ
る。しかしながら、いかなるオキシドレダクタ−ゼ類酵
素であっても使用することができる。

【００５０】この発明によって調節し得る酵素の第２の
カテゴリ−は、トランスフェラ−ゼである。トランスフ
ェラ−ゼの例としては、特に、カルノシン N- メチルト
ランスフェラ−ゼ、3-オキソアシルアシル担体タンパク
シンセタ−ゼ、ラミナリボ−スホスホリラ−ゼ、ガラク
ト−ス 6- スルファリラ−ゼ、ジヨ−ドチロシンアミノ
トランスフェラ−ゼ、セドヘプチロキナ−ゼおよびサイ
コシンスルファロトランスフェラ−ゼ、8-グルタミルト
ランスペプチダ−ゼおよびアスパルテ−トアミノトラン
スフェラ−ゼを挙げることができる。しかしながら、い
かなるトランスフェラ−ゼであっても使用することがで
きる。

【００５１】この発明によって調節し得る酵素の第３の
カテゴリ−は、エステラ−ゼ、ホスファタ−ゼ、グリコ
シダ−ゼおよびペプチダ−ゼを含むヒドロラ−ゼであ
る。

【００５２】ヒドロラ−ゼの例としては、特に、ジヒド
ロクマリンヒドロラ−ゼ、β-D- グルコシダ−ゼ、α-
グルコシダ−ゼ、リボソホモシステイナ−ゼ、アシルム
ラミルアラニンカルボキシペプチダ−ゼ、ウレイドスク
シナ−ゼ、フロレチンヒドロラ−ゼおよび2-ハロ酸デハ
ロゲナ−ゼを挙げることができる。しかしながら、どの
ようなヒドロラ−ゼであっても用いることができる。

【００５３】この発明によって調節することができる酵
素の第４のカテゴリ−は、例えば、デカルボキシラ−
ゼ、アルドラ−ゼおよびデヒドラタ−ゼを含むリア−ゼ
である。リア−ゼの例としては、特に、フェニルアラニ
ンアンモニアリア−ゼ、クエン酸シンセタ−ゼ、メチル
グリコキシルシンセタ−ゼ、ウレイドグリコレ−トリア
−ゼ、アリインリア−ゼ、コリスメ−トシンセタ−ゼお
よびアルキル水銀リア−ゼを挙げることができる。しか
しながら、いかなるリア−ゼであっても用いることがで
きる。

【００５４】この発明によって調節することができる酵
素の第５のカテゴリ−は、例えば、ラセマ−ゼ、エピメ
ラ−ゼ、シス- トランスイソメラ−ゼ、分子内オキシド
レダクタ−ゼおよび分子内トランスフェラ−ゼを含むイ
ソメラ−ゼである。言及し得る例としては、特に、グル
コ−スホスフェ−トイソメラ−ゼ、ＵＤＰアラビノ−ス
4- エピメラ−ゼ、マレイルアセトアセテ−トイソメラ
−ゼ、コリスメ−トムタ−ゼおよびムコネ−トシクロイ
ソメラ−ゼを挙げることができる。しかしながら、いか
なるイソメラ−ゼであっても用いることができる。

【００５５】この発明によって調節することができる酵
素の第６のカテゴリ−は、例えば、アミノ酸- ＲＮＡリ
ガ−ゼ、酸- チオ−ルリガ−ゼ、アミドシンセタ−ゼ、
ペプチドシンセタ−ゼおよびシクロリガ−ゼを含むリガ
−ゼである。特に、アセチルコリンシンセタ−ゼ、セリ
ル-2- ＲＮＡシンセタ−ゼ、カルノシンシンセタ−ゼお
よびメチルクロトニルＣｏＡカルボキシラ−ゼを挙げる
ことができる。しかしながら、いかなるリガ−ゼであっ
ても用いることができる。

【００５６】この発明は、一般に、酵素活性の調節方法
を提供するものであるが、さらに幾つかの特定の方法を
も提供する。

【００５７】第１に、この発明は、１種もしくはそれ以
上の酵素を１種もしくはそれ以上の希ガスまたはそれら
の混合物を含むガスと接触させることによる酵素活性の
増強方法をも提供する。

【００５８】第２に、この発明は、１種もしくはそれ以
上の酵素を１種もしくはそれ以上の希ガスまたはそれら
の混合物を含むガスと接触させることによる酵素活性の
抑制方法をも提供する。

【００５９】第３に、この発明は、１種もしくはそれ以
上の酵素を１種もしくはそれ以上の希ガスまたはそれら
の混合物を含むガスと接触させることによる、１種もし
くはそれ以上の酵素の最適ｐＨおよび／または温度を移
行させる方法を提供する。

【００６０】第４に、この発明は、１種もしくはそれ以
上のオキシドレダクタ−ゼ類酵素を１種もしくはそれ以
上の希ガスまたはそれらの混合物を含むガスと接触させ
ることによる、オキシドレダクタ−ゼの酵素活性を調節
する特定の方法を提供する。

【００６１】第５に、この発明は、１種もしくはそれ以
上のヒドロラ−ゼ類酵素を１種もしくはそれ以上の希ガ
スまたはそれらの混合物を含むガスと接触させることに
よる、ヒドロラ−ゼの酵素活性を調節する特定の方法を
も提供する。

【００６２】第６に、この発明は、１種もしくはそれ以
上のリア−ゼ類酵素を１種もしくはそれ以上の希ガスま
たはそれらの混合物を含むガスと接触させることによ
る、リア−ゼの酵素活性を調節する特定の方法をも提供
する。

【００６３】第７に、この発明は、１種もしくはそれ以
上のイソメラ−ゼ類酵素を１種もしくはそれ以上の希ガ
スまたはそれらの混合物を含むガスと接触させることに
よる、イソメラ−ゼの酵素活性を調節する特定の方法を
も提供する。

【００６４】第８に、この発明は、１種もしくはそれ以
上のリガ−ゼ類酵素を１種もしくはそれ以上の希ガスま
たはそれらの混合物を含むガスと接触させることによ
る、リガーゼの酵素活性を調節する特定の方法をも提供
する。

【００６５】第９に、この発明は、１種もしくはそれ以
上のトランスフェラ−ゼ類酵素を１種もしくはそれ以上
の希ガスまたはそれらの混合物を含むガスと接触させる
ことによる、トランスフェラ−ゼの酵素活性を調節する
特定の方法をも提供する。

【００６６】第10に、この発明は、１種もしくはそれ以
上の酵素を１種もしくはそれ以上の希ガスまたはそれら
の混合物を含むガスと接触させることによる、最適相対
酵素- 基質濃度を変化させる方法をも提供する。

【００６７】第11に、この発明は、２種もしくはそれ以
上の酵素の混合物における１種の酵素を選択的に調節す
る方法をも提供する。

【００６８】これは重要なことであるが、６種の一般的
な酵素のカテゴリ−の各々から上に列挙した酵素の例
は、単に説明のために挙げたものであり、限定を意図す
るものではない。この発明に従うと、この発明によるガ
スおよびガス混合物を用いて、いかなる酵素であっても
調節することができる。例えば、M. Dixonおよび E.C.W
ebb による「酵素（Enzymes ）」第３版（Academic Pre
ss）に記載されるいかなる酵素であっても、この発明に
よって調節することができる。

【００６９】上述のように、一般に、１種もしくはそれ
以上の希ガスを含むガスは、単一で純粋な希ガスであっ
ても、または希ガスの混合物であってもよい。また、こ
のガスは、１種もしくはそれ以上の希ガスと上述の他の
ガスとの混合物であってもよい。

【００７０】酵素はいかなる形態であってもよい。例え
ば、調節された酵素は、水溶液、水系もしくは有機溶液
中にあってもよい。酵素は、ゲルのような他のマトリッ
クス中にあってもよい。また、酵素は非結合もしくは結
合形態であってもよく、植物および他の組織のような細
胞もしくは生細胞中の結合形態であってさえよい。

【００７１】例えば、結合酵素の調節にこの発明を用い
る場合には、多くのタイプの用途に用いることができ
る。例えば、結合酵素は、バッチリアクタ−、連続フロ
−撹拌タンクリアクタ−、充填床リアクタ−のようなカ
ラムリアクタ−、または流動床リアクタ−にさえ用いる
ことができる。

【００７２】さらに、酵素抽出および精製のコストが禁
止的であり、またはその本来の環境から除去するときに
酵素が不安定である場合には、細胞内での結合酵素の使
用は好都合である。例えば、Ｌ−シトルリンはシュ−ド
モナス・プチダ（Pseudomonas putida）の固定細胞を用
いて調製することができ、ウロカニン酸はアクロモバク
タ・リキジウム（Achromobacter liquidium ）の固定細
胞を用いて調製することができる。

【００７３】さらに、この発明は、グルコ−スオキシダ
−ゼを用いるグルコ−スの測定に用いられる電極のよう
な酵素電極に伴う酵素活性の調節にも用いることができ
る。

【００７４】この発明は、制御可能かつ予測可能な方式
での酵素活性の調節が望ましい場合に有利に用いること
ができる。

【００７５】この発明をさらに記述するために、酵素の
６種の基本的なクラスの各々をより詳細に記載する。 Ｉ．オキシドレダクタ−ゼ 一般に、オキシドレダクタ−ゼ類酵素は希ガスによって
強く抑制される。しかしながら、抑制の量は１種の希ガ
スから他に、および１種の希ガス混合物から他に変化す
る。

【００７６】キセノンは、オキシドレドクタ−ゼ反応の
速度に対して最も高い効果を示し、反応の最終平衡を低
下させる。他の希ガスは、全て、それらの溶解度および
分子特性の両者に依存して、より軽い程度に反応速度を
抑制し、かつ反応の最終平衡を低下させる。クリプトン
は、キセノンよりもいくらか軽い効果を有し、アルゴン
は低温で非常に活性である。したがって、この発明に従
い、周囲温度もしくは冷却温度のいずれを用いるかに依
存して、オキシドレダクタ−ゼ活性を最適化するために
異なるガス混合物を用いることができる。

【００７７】１種もしくはそれ以上の希ガスまたはそれ
らの混合物を用いることにより、用いられる適格なガス
もしくは混合物、基質、温度およびガス圧に依存して、
種々のオキシドレダクタ−ゼ抑制が得られる。 II．トランスフェラ−ゼ 一般に、トランスフェラ−ゼ類酵素は抑制される。例え
ば、希ガスもしくはそれらの混合物により、アミノトラ
ンスフェラ−ゼは抑制され、トランスペプチダ−ゼは抑
制される。

【００７８】一般に、クリプトンは最も高い抑制または
効果を示すが、トランスフェラ−ゼのサブクラスに依存
するいくらかの変動を伴う。反対に、ネオンは、用いら
れるトランスフェラ−ゼのサブクラスに依存して、最も
低い抑制および増強効果の両者を示す。 III ．ヒドロラ−ゼ 一般に、全てのヒドロラ−ゼ類は、希ガスもしくはそれ
らの混合物によって強く増強される。

【００７９】クリプトンが最も低い増強効果を示すのに
対して、キセノンが最も高い増強効果を示すことは注目
される。

【００８０】しかしながら、所望であれば、ヒドロラ−
ゼも抑制することができる。 IV．リア−ゼ 一般に、リア−ゼ類酵素は、希ガスまたはそれらの混合
物により強くもしくは穏やかに増強される。しかしなが
ら、いくつかのガスは、次善の条件の下ではリア−ゼ酵
素活性を抑制する。

【００８１】アルゴンが最も低い増強効果を示すのに対
して、キセノンは最も高い増強効果を示す。 Ｖ．イソメラ−ゼ 一般に、イソメラ−ゼ類酵素は、希ガスまたはそれらの
混合物により強くまたは穏やかに増強される。

【００８２】しかしながら、アルゴンおよびそれを含有
する混合物は、高温では誘発されて酵素活性を抑制し得
る。 VI．リガ−ゼ（シンセタ−ゼ） 一般に、リガ−ゼ類酵素は、希ガスまたはそれらの混合
物により強く増強される。

【００８３】この発明による、１種もしくはそれ以上の
希ガスの酵素活性に対する効果を測定する際に用いられ
るプロトコルを明確にするために、以下に典型的かつ例
示的な実験プロトコルを記述する。 一般的なプロトコル 溶液の調製： 酵素（ユニット／ｍｌ）および基質（μ
ｇ／ｍｌ）を適当な緩衝液（酵素の最適ｐＨおよびモル
濃度）中に希釈することにより最適Ｗ／Ｖ溶液を調製す
る。この溶液は、活性の損失を避けるために、直ちにガ
ス実験に用いられる。種々の酵素および基質濃度並びに
阻害剤を用いることができる。物理パラメ−タは要求に
応じて変化する。

【００８４】分光分析装置： 実験は、温度制御され、
ＩＢＭ ＰＳ／２ ３０パ−ソナル・コンピュ−タに接
続されたパ−キン・エルマ−・ラムダ６ＵＶ／ＶＩＳ分
光分析器を用いて実行する。ＩＢＭには２種のソフトウ
ェア・パッケ−ジ（スペクトルの記録および観察のため
のＰＥＣＳＳまたはＵＶＤＭ、速度論的研究のための改
良ＥＮＺＦＩＴＴＥＲおよびＧｒａｆｉｔ）をロ−ドす
る。

【００８５】全域スペクトル： 最終反応混合物の他
に、酵素および基質種の全域スペクトルを取ることによ
り、酵素反応をリアルタイムで追跡するのに適切な波長
を決定することができる（主吸収ピ−クに相当する波
長）。吸収剤種は測定してブランクとする。種々の色原
体物質を用いることができ、特定の環境下では、色原体
反応を研究する酵素反応と一緒にすることができる。

【００８６】希釈系列： ガス実験を進行させるための
最適酵素／基質比を見出すために、希釈系列を実行す
る。反応を最適条件で実行し、次いで最適範囲を超え
（superoptimal）、かつ下回る（suboptimal）範囲の基
質で行ない、その後、種々の抑制剤で行なう。

【００８７】シリコ−ン密封キュベットの調製： 1 ｃ
ｍの光透過性のアクリル製もしくは水晶製キュベットを
シリコ−ンラバ−・シ−ラ−で塞ぐ。このシリコ−ン
を、気密キュベットを得るために、48時間硬化させる。
キュベットを空気でパ−ジしてＧＣ／ＭＳで測定される
化学的なガス汚染物質を除去し、漏れの試験を行なう。

【００８８】試料の調製： 気密シリンジを用いて、キ
ュベットに基質溶液 2ｍｌを充填する。気密血清バイア
ルを酵素および溶媒で充填する。このキュベットおよび
血清バイアル中で、注入の間隔を 1時間あけて十分なガ
スを連続的に泡立て、ガスの平衡を最大にする。適切な
ガスを充填する前に、全てのシリンジおよびデッド・ス
ペ−スをパ−ジする。使用するガスの量は、必要とする
溶液を飽和するに十分な量であることを測定する。

【００８９】コントロ−ル： Ｔ、Ｐ、他のガス、空気
の漏れ、材料、ガスの変性および試薬の品質、ｐＨを含
む、妨害となる可能性のある全てのパラメ−タを制御す
る。意味を持つまで繰り返しを行なう。

【００９０】分光分析タイム・ドライブ、反応速度、お
よび速度論的分析： 実行の40分前に、キュベットおよ
び血清バイアルをガスで飽和させる。空気との接触を避
けるために、ガス充填シリンジを用いて酵素溶液 0.5ｍ
ｌを回収する。酵素 0.5ｍｌをシリンジで同時に注入し
て、試料に共通の開始時間を生じせしめる。７種のガス
（空気、Ｏ₂ 、Ｎ₂ 、Ｎｅ、Ａｒ、Ｋｒ、Ｘｅ）を、種
々の温度（ 0ないし60℃）で実行する。大気に対する反
応の速度または最終平衡における変化を記録する。添加
した酸素、および脱酸素化との比較も行なう。いくつか
の試料は加圧下で調製する。 完全な実験プロトコル 完全な実験においては、最適ｐＨおよび緩衝塩濃度の酵
素を、溶液中において5倍濃度の塩基、 1気圧（飽和溶
液）、10％および50％飽和、並びに 1.5および2気圧お
よび少なくとも１つのより高い圧力の希ガス、並びに 1
および 2気圧で全ガスの10％、20％および50％に相当す
る追加の酸素と反応させる。このときの各々の温度は 0
ないし65℃で 5℃ずつ上昇し、Ｎ₂ 、Ｏ₂ 、Ａｒ、Ｎ
ｅ、Ｋｒ、Ｘｅ、空気および特別な場合には他のガスを
用い、並びに上述のガスのデシル混合物を用い、加え
て、酵素を静水制御下で非常に高い圧力にさらす。コン
トロ−ルも、減圧により溶液を排除した後実行する。反
応は、走査分光分析器において、リアルタイムに熱量測
定により監視し、その信号を数学的に処理して速度およ
び収量の差異を得る。試料数は一定であり、結果の有意
性を確実にするに十分なものである。全てのパラメ−タ
は独立に制御および測定され、時折より複雑な実験が行
なわれる。

【００９１】デ−タは、各試料キュベットについて１つ
のリアルタイム生成物形成プロット（標準速度曲線）の
形で得られる。これは、標準の手順で上書き（オ−バ−
レイ）され、各 6ないし12のキュベット実験について１
つのオ−バ−レイをなしている。そのようなオ−バ−レ
イを添付する。これらの曲線および全ての機器パタメ−
タを構築するＸ−Ｙデ−タ・ポイント表も作成する。こ
れらのデ−タをさらに変形して、曲線間の差異、収量間
の差異、速度間の差異、もしくは他の論理的な比較を計
算してもよい。これらは、いくつかの独立したソフトウ
ェア・プログラムを用いて計算する。これらのプログラ
ムは、単純もしくは複雑な普通の数学的表現、線形もし
くは非線形回帰曲線近似、log-標準変換、酵素的速度の
計算（Michaelis-Menten、Eadie-Hofstee 、Lineweaver
-Burk ）、および多変量解析を利用している。

【００９２】この発明をより完全に記述するために、以
下の例を参照するが、これらの例は単に説明のために提
示されたものであり、限定を意図するものではない。 クラスＩ．オキシドレダクタ−ゼ（ＥＣ１） 例 １ チロシナ−ゼ；25℃および最適反応条件、ガスを用いた溶液の単純飽和： 希ガスもしくは混合物 効果 −−−−−−−−−− −−−−−−− Ｘｅ -73％（抑制） Ｋｒ -73％ Ａｒ -60％ Ｎｅ -46.7％ 90：10 Xe：Kr混合物 -50％ Ar：Xe 99：1 -70％ 例 ２ グルコ−スオキシダ−ゼ： 希ガスもしくは混合物 効果 −−−−−−−−−− −−−−−−− Ｘｅ -91.6％（抑制） Ｋｒ -92.7％ Ａｒ -85.8％ Ｎｅ -61.7％ クラスの最大： Ｘｅ -95％（抑制） Ｋｒ -91％ Ａｒ -91％ Ｎｅ -85％ 上記結果は、特に温度および基質濃度に依存する。 クラスII．トランスフェラ−ゼ（ＥＣ２） 例 ３ γ- グルタミルトランスペプチタ−ゼ： 希ガスもしくは混合物 効果 −−−−−−−−−− −−−−−−− Ｘｅ -7 ％（抑制） Ｋｒ -8 ％ Ａｒ -5 ％ Ｎｅ -3 ％ 例 ４ アスパルテ−トアミノトランスフェラ−ゼ： 希ガスもしくは混合物 効果 −−−−−−−−−− −−−−−−− Ｘｅ -17％（抑制） Ｋｒ -82％ Ａｒ -17％ Ｎｅ -12％ クラスIII ．ヒドロラ−ゼ（ＥＣ３） 例 ５ β-D- グルコシダ−ゼ： 希ガスもしくは混合物 効果 −−−−−−−−−− −−−−−−− Ｘｅ +40％（増強） Ｋｒ +14％ Ａｒ +16％ 90：10 Xe：Kr混合物 +18 上記結果は、温度、基質濃度、および基質のタイプに依
存する。異なる競合基質を添加すると、キセノンを用い
て、 200％までの増強が得られた。 クラスIV．リア−ゼ（ＥＣ４） 例 ６ 結果は、温度および［Ｅ／Ｓ］に従って変化し得る。

【００９３】クエン酸シンセタ−ゼ複合反応に対して： 35℃ 25℃ 10℃ −− −− −− Ｘｅ +32 0 +18 Ｋｒ +32 + 6 +37 90：10 0 +16 -32 Ａｒ -15 -10 +25 Ｎｅ -14 + 9 +11 Ｎ₂ -17 -25 - 6 例 ７ 最適酵素濃度のフェニルアラニンアンモニアリア−ゼに
対して： Ｘｅ +18 + 3 + 5 Ｋｒ + 7 + 4 + 4 90：10 + 5 + 2 + 1 Ａｒ + 6 + 1 + 3 Ｎｅ - 2 + 6 - 6 Ｎ₂ +19 0 + 6 例 ８ 次善の酵素濃度のフェニルアラニンアンモニアリア−ゼ
に対して： Ｘｅ +14 + 8 +11 Ｋｒ + 3 +18 +14 90：10 + 5 + 8 + 6 Ａｒ - 1 + 1 + 6.5 Ｎｅ +15 0 + 6 Ｎ₂ 0 0 +12 クラスＶ．イソメラ−ゼ（ＥＣ５） 例 ９ トリオ−スホスフェ−トイソメラ−ゼ、10℃： 希ガスもしくは混合物 効果 −−−−−−−−−− −−−−−−− Ｘｅ +24％（増強） Ｋｒ +12％ Ａｒ + 8％（しかし、25℃では -37％抑制） Ｎｅ + 4％ 90：10 Xe：Kr + 6.3％ 例 １０ ホスホグルコ−スイソメラ−ゼ： 希ガスもしくは混合物 効果 −−−−−−−−−− −−−−−−− Ｘｅ +186 ％（ -16％ストレス） Ｋｒ +206.4 ％ Ａｒ +232.5 ％ Ｎｅ +107 ％（ -45％ストレス） 「ストレス」は、非最適基質濃度または温度の条件を示
す。 クラスVI．リガ−ゼ（シンセタ−ゼ）（ＥＣ６） これらの酵素は増強されるが変動が大きく、非常に活性
部位特異性である。

【００９４】観測最大増強 対 観測最大抑制（温度依
存性）： 例 １１ アセチルＳ- ＣｏＡシンセタ−ゼ 加水分解酵素を含む、一緒になった複合反応列におい
て： Ｘｅ +18.3％／ -25.0％ Ｋｒ +16.1％／ -34.6％ Ａｒ +67.7％／ +34.6％ Ｎｅ + 2.3％／ -21.9％ 90／10 +16.1％／ -38.5％ Ｎ₂ +31.2％／ -39.5％ 例 １２ 単独の反応として： Ｘｅ +15.4％／ -39.5％ Ｋｒ + 5.0％／ -52.6％ Ａｒ +75.4％／ -27.6％ 90／10 + 5.0％／ -57.9％ Ｎ₂ +35.7％／ -118.7 ％ 一般に、高温では抑制が起こる。低温では増強が起こ
る。窒素は、最適温度を越える温度以外では、通常希ガ
スよりも効果が非常に小さい。我々は、希ガスは、反応
にとって他の点では次善である条件の下で、この反応を
最適の収量および速度の方向に増強していると見てい
る。我々は、混合ガスは、使用するガスに依存する最適
条件の下で起こると考えている。

【００９５】さらに例を参照してこの発明を説明する
が、以下の例は説明を目的とするものであって、限定す
ることを意図するものではない。 チロシナ−ゼ触媒反応：チロシナ−ゼ（モノフェノ−
ル、ジヒドロキシフェニルアラニン：酸素オキシドレダ
クタ−ゼ；ＥＣ 1.14.18.1）は、オルトジフェノ−ルか
らオルトキノンへの反応を触媒するモノフェノ−ルモノ
オキシゲナ−ゼである。

【００９６】チロシナ−ゼは、果物のブロ−イング（br
owing ）および食料品の腐敗に重要である。 実験プロトコル １）溶液調製：リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ6.85、酵
素に最適なｐＨ）において、酵素（ユニット／ｍｌ）お
よび基質（μｇ／ｍｌ）を希釈して10％Ｗ／Ｖ溶液を調
製する。この溶液を冷蔵庫（ 0 - 5℃）に保存し、活性
の損失を避けるために 2、 3日以内にガス実験に使用す
る。

【００９７】２）分光分析装置：実験は、ＩＢＭ ＰＳ
／２ ３０パ−ソナル・コンピュ−タに接続されたパ−
キン・エルマ−・ラムダ６ＵＶ／ＶＩＳ分光分析器を用
いて実行する。このＩＢＭ機には、２種のソフトウェア
・パッケ−ジ（スペクトルを記録および観察するための
ＰＥＣＳＳ、速度論的研究のためのＥＮＺＦＩＴＴＥ
Ｒ）がロ−ドされている。

【００９８】３）全域スペクトル：Ｅ、Ｓ、およびＥ＋
Ｓの全域スペクトルをとることにより、酵素反応を追跡
するのに適した波長を決定することができる（主吸収ピ
−クに相当する波長）。

【００９９】４）希釈系列：ガス実験の進行に最適な
［Ｅ］／［Ｓ］比を見出すために、希釈系列Ｅ対Ｓ、お
よびＳ対Ｅを実行する。吸光度の読取りに従い、２つの
ブランク（緩衝液＋Ｅもしくは緩衝液＋Ｓ）のうちの最
良のものを選ぶ。

【０１００】５）シリコ−ン密封キュベットの作製：ア
クリル製ディスポ−ザブル・キュベット（ 1ｃｍ、光透
過性）を透明シリコ−ン・ラバ−・シ−ラ−で塞ぐ。気
密キュベットを得るために、このシリコ−ンを48時間硬
化させる。

【０１０１】６）実行試料の調製：アクリル製キュベッ
トに、気密シリンジを用いて、基質溶液 2ｍｌを充填す
る。気密血清バイアルに酵素を充填する。キュベットお
よびバイアル内で、注入の間隔を 1時間あけて、3 ×10
ｃｃのガスを連続的に泡立てる。これは、ガスの平衡を
最大にしつつ死容積の10×置換を行なうことを意味す
る。適切なガスを充填する前に、全てのシリンジおよび
デッド・スペ−スをパ−ジする。 3回目の10ｃｃ注入の
後、キュベットおよびバイアルを、 2本のシリンジに適
切なガスを充填した状態で、 0-5℃の冷蔵庫内に一晩放
置する。

【０１０２】７）コントロ−ル：Ｔ、Ｐ、他のガス、空
気漏れ、材料、ガスの変性および試薬の品質、ｐＨを含
む妨げとなる可能性のある全てのパタメ−タを制御す
る。意味を有するまで繰り返しを行なう。

【０１０３】８）分光分析の実行：実行の前40分に、キ
ュベットおよびバイアルを10ｃｃのガスで充填する。空
気との接触を避けるために、ガス充填シリンジを用いて
酵素溶液 0.5ｍｌを補う。共通の開始時間ｔ₀ を生じせ
しめるために、酵素 0.5ｍｌをシリンジで試料に同時に
注入する。７種のガス（空気、Ｏ₂ 、Ｎ₂ 、Ｎｅ、Ａ
ｒ、Ｋｒ、Ｘｅ）を、各々５種の温度（15℃、20℃、25
℃、30℃、35℃）で実行する。対大気との反応の速度お
よび最終平衡における変化を記録する。 ２．試薬 チロシナ−ゼ（Sigma Chemical Co.、St Louis、MO）： ・カタログ No. T-7755 （ロット 48F-9610 ） ・モノフェノ−ルモノオキシゲナ−ゼ；ポリフェノ−ル
オキシダ−ゼ；カテコ−ルオキシダ−ゼ；モノフェノ−
ルジヒドロキシフェニルアラニン：酸素オキシドレダク
タ−ゼ；ＥＣ 1.14.18.1） ・マッシュル−ム起源 ・25,000ユニット 12ｍｇ固形 2,200 ユニット／ｍｇ（チロシナ−ゼ活性） ・チロシナ−ゼ・ユニット定義： 1ユニットは、L-チロ
シンを用いて、ｐＨ6.5、25℃で、 1分当りＡ₂₈₀ を 0.
001増加させる。反応容積 3ｍｌ。

【０１０４】（ 1ｃｍ、光透過性） ・乾燥状態、 0℃未満で保存 L-チロシン（Sigma Chemical Co.、St Louis、MO）： ・カタログ No. T-3754 （ロット 48F-0833 ） ・L-3-［4-ヒドロキシフェニル］アラニン ・遊離塩基（pfs ）結晶性 ・無水の分子量 181.2 ・室温（25℃）で保存 一塩基性リン酸ナトリウム（E K Industries、 Addiso
n、IL） ・カタログ No.8680 ・ＮａＨ₂ ＰＯ₄ ・Ｈ₂ Ｏ ・試薬結晶 ・ＦＷ 137.99 二塩基性リン酸ナトリウム（E K Industries、 Addiso
n、IL） ・カタログ No.8720 ・Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ ・無水 ・ＦＷ 141.96 脱イオン水 Ｈ₂ Ｏ（Barnstead NANOpure IL ） ３．溶液調製： リン酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ6.85（25℃）： ・ 138ｇ ＮａＨ₂ ＰＯ₄ ・Ｈ₂ Ｏ ・ 142ｇ Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ ・20リットル 脱イオン水（Ｄ．Ｉ．Ｈ₂ Ｏ） ・プラスチック・カ−ボイ中で、室温（25℃）で保存 チロシン溶液（ 100μｇ／ｍｌ； 208ユニット／ｍｌ；
2.08ユニット／μｇ）： ・リン酸Ｎａ緩衝液中に10％Ｗ／Ｖ ・反転により数回混合して内容物を溶解 ・アルミニウムホイルに包まれた 125ｍｌ ＨＤＰＥボ
トル中で、冷蔵庫［ 0-5℃］内に保存（光分解を避ける
ため） L-チロシン溶液（ 100μｇ／ｍｌ）： ・リン酸Ｎａ緩衝液中に10％Ｗ／Ｖ ・マグネチック・スタ−ラで撹拌（25℃、30分間） ・ 250ｍｌアンバ−ガラスボトル中で、冷蔵庫［ 0-5
℃］内に保存 ４．ガス雰囲気： 空気（大気） アルゴン（Alphagaz、研究グレ−ド（research grad
e）） クリプトン（Alphagaz、研究グレ−ド、最小純度 99.99
5 ％［ppm ］） ネオン（Alphagaz、研究グレ−ド、最小純度 99.999 ％
［ppm ］） 窒素（Alphagaz、研究グレ−ド、最小純度 99.9995％
［ppm ］） 酸素（Alphagaz、研究グレ−ド、最小純度 99.997 ％
［ppm ］） キセノン（Alphagaz、研究グレ−ド、最小純度 99.995
％［ppm ］） ５．機器および機材： 5.1. 機器： 自動移送熱電5-セルホルダ（ 5×5 試料および参照セル
ホルダ、モデルＣ005-0515）を備えたパ−キン・エルマ
−・ラムダ ６ ＵＶ／ＶＩＳ分光分析器（狭バンド幅
分光分析器） パ−キン・エルマ−・ラムダ・アクセサリ・インタ−フ
ェイス（モデルＣ691-0000） パ−キン・エルマ−・デジタル・コントロ−ラ（モデル
Ｃ 570-0701 ） パ−キン・エルマ−温度プログラマ（モデルＣ 570-071
0 ） ＩＢＭ ＰＳ／２ ３０ パ−ソナル・コンピュ−タ エプソン ＥＸ800 プリンタ ソフトウェア： ・ＩＢＭ ＤＯＳ（ディスク・オペレ−ティング・シス
テム・バ−ジョン3.30、Boca Raton、FL） ・ＰＥＣＳＳ（パ−キン・エルマ−・コンピュ−タライ
ズド・スペクトロスコピ・ソフトウェア、Norwalk 、C
T） ・ＥＮＺＦＩＴＴＥＲ（非線形回帰デ−タ分析プログラ
ム、Elsevier-BIOSOFT、Cambridge 、UK） ・ＰＩＺＡＺＺ ＰＬＵＳ（プリント拡張ソフトウェ
ア、APTEC 、Pepperell 、MA） メトラ− ＡＥ100 はかり： ・計量範囲： 0〜 109ｇ ・可読性： 0.1ｇ バ−ンステッド（Barnstead ） NANOpure II カ−トリ
ッジ脱イオン・システム ト−キョ−・リカキカイ社 マイクロ・チュ−ビング・
ポンプＭＰ-3（パ−キン・エルマ−水冷セル用） 5.2. 機材 100、 200ｍｌメスフラスコ ＦＩＳＨＥＲブランドのアクリル製キュベット（標準タ
イプ／メタクリレ−ト／ＵＶグレ−ド／使い捨て）： 1
ｃｍ 光透過性、溶液 3ｍｌ保持可能な角型キュベット 100％シリコン・ラバ−・シ−ラ−（透明） 3ｍｌゴム栓付血清バイアル 1／100 ｍｌ目盛の 1ｍｌ（1 ml in 1/100 ml）使い捨
て血清用ピペット 1／100 ｃｃ目盛の 1ｍｌ使い捨てツベルクリン・シリ
ンジ 1／5 ｃｃ目盛の10ｃｃ使い捨てシリンジ 20Ｇ １ 1/2”使い捨て針 ６．技法の開発 6.1. 初期観測 チロシナ−ゼ、L-チロシンおよび酵素反応の最終生成物
を用いて全域走査（ 900-190ｎｍ）を実行した。 6.1.1. 実験の設定： パラメ−タ（PARAM ）：吸光度 スリット 1ｎｍ 走査速度 1,500 ｎｍ／分 応答時間 1 秒 オ−トセ−ブ 有 ＡＺＥＲＯ：バックグランド補正（ 900-190ｎｍ） 走査：デ−タ間隔 1.0ｎｍ 温度：周囲温度（26℃）、温度プログラマ OFF 6.1.2. 全域走査 チロシナ−ゼの［ 900-190ｎｍ］走査（図１）： 試料＝チロシナ−ゼ（ 100μｇ／ｍｌ）2.5 ｍｌ ブランク＝リン酸ナトリウム緩衝液 2.5ｍｌ ファイル名：Ｔ775501．ＳＰ L-チロシンの［ 900-190ｎｍ］走査（図２）： 試料＝L-チロシン（ 100μｇ／ｍｌ） 2.5ｍｌ ブランク＝リン酸ナトリウム緩衝液 2.5ｍｌ ファイル名：Ｔ375401．ＳＰ 最終生成物の［ 900-190ｎｍ］走査（図３〜４）： 試料＝L-チロシン（ 100μｇ／ｍｌ） 2ｍｌ ＋チロシナ−ゼ（ 100μｇ／ｍｌ） 0.5ｍｌ 20分の反応時間の後 ブランク＝L-チロシン（ 100μｇ／ｍｌ） 2ｍｌ ＋リン酸ナトリウム緩衝液 0.5ｍｌ ファイル名：ＴＣＥＢ0081．ＳＰ 6.1.3. 主吸収ピ−クの決定：この目的のために、グラ
フィック・カ−ソル（Homeキ−）を用いた。

【０１０５】チロシナ−ゼ： 275ｎｍに吸収ピ−ク（タ
ンパク） L-チロシン： 275ｎｍに吸収ピ−ク 反応の最終生成物： 480ｎｍおよび 305ｎｍに吸収ピ−
ク 6.1.4. 反応の追跡に適した波長の決定 ３つの全域スペクトルのオ−バ−レイ（図５）から、 4
80または 305ｎｍのいずれかにおいて、L-チロシンの酵
素的酸化還元の観測を最適に行ない得ることが示唆され
る。 6.1.5. 適切な［Ｅ］／［Ｓ］比の決定： T-3754 T-7755 リン酸Na 最終［Ｅ］ （ 100 ug/ml） （ 100 ug/ml） 緩衝液 （ 100 ug/ml） （ｍｌ） （ｍｌ） （ｍｌ） −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 試料５ 2 0.1 0.4 20 試料４ 2 0.2 0.3 40 試料３ 2 0.3 0.2 60 試料２ 2 0.4 0.1 80 試料１ 2 0.5 0.0 100 時間駆動（timedrive ）は、セル・プログラマ（ＣＰＲ
Ｇ）の命令を用いて実行した。この命令は、セル 5個ま
での時間駆動デ−タを同時に記録する。

【０１０６】波長 480ｎｍ：オ−バ−レイ（図６） 45点、60秒間隔−−−→45分間実行 ＴＣＥＢ0091．ＳＰ ［enz.］＝ 100μｇ／ｍｌ セル１ ＴＣＥＢ0092．ＳＰ ［enz.］＝ 80μｇ／ｍｌ セル２ ＴＣＥＢ0093．ＳＰ ［enz.］＝ 60μｇ／ｍｌ セル３ ＴＣＥＢ0094．ＳＰ ［enz.］＝ 40μｇ／ｍｌ セル４ 波長 305ｎｍ：オ−バ−レイ（図７） 60点、60秒間隔−−−→ 1時間実行 ＴＣＥＢ0101．ＳＰ ［enz.］＝ 100μｇ／ｍｌ セル１ ＴＣＥＢ0102．ＳＰ ［enz.］＝ 80μｇ／ｍｌ セル２ ＴＣＥＢ0103．ＳＰ ［enz.］＝ 60μｇ／ｍｌ セル３ ＴＣＥＢ0104．ＳＰ ［enz.］＝ 40μｇ／ｍｌ セル４ ＴＣＥＢ0105．ＳＰ ［enz.］＝ 20μｇ／ｍｌ セル５ 結論：最適条件は、［Ｅ］／［Ｓ］（ 100μｇ／ｍｌ）
／（ 100μｇ／ｍｌ）で、吸光度の変化を 305ｎｍで観
測するものである。 6.2. 予備実験 6.2.1. 試料および参照の調製： キセノン飽和試料（サンプリング手順を参照） 空気試料： 1ｍｌピペットを用いて、アクリル製キュベ
ットを 2ｍｌの基質T-3754で充填し、プラスチックキャ
ップで蓋をする。この手順は、後に、プラスチックキャ
ップの使用からシリコ−ン密封キュベットの使用に変わ
った。大きな差異は見出せなかった。

【０１０７】参照（ブランク）：プラスチックキャップ
で蓋をしたアクリル製キュベット ・B1： 2ｍｌ T-3754 （ 100μｇ／ｍｌ）＋ 0.5ｍｌリ
ン酸Ｎａ緩衝液 ・B2： 2ｍｌリン酸Ｎａ緩衝液＋ 0.5ｍｌ T-7755 （ 1
00μｇ／ｍｌ） 6.2.2. 305ｎｍでの時間駆動 ブランクＢ１： ・空気試料：ファイル名＝ＴＣＥＢ0114．ＳＰ ・キセノン試料：ファイル名＝ＴＣＥＢ0115．ＳＰ ブランクＢ２： ・空気試料：ファイル名＝ＴＣＥＢ0116．ＳＰ ・キセノン試料：ファイル名＝ＴＣＥＢ0117．ＳＰ L-チロシン・ブランク（Ｂ１）は吸光度の読取値を下げ
ることが見出される。このため、チロシナ−ゼ・ブラン
クを用いる実験（Ｂ２）を優位に用いる。

【０１０８】これら４つの時間駆動は、キセノンに対し
て最適な抑制曲線を示す。後記の実行（6.3.7.および
7.2. ）に関しては、L-チロシン溶液は時間と共に減衰
し、これが吸光度の読取値の減損を引き起こす。 6.3. 技法の開発： 6.3.1. 工程１：シリコ−ン密封キュベットの作製 アクリル製の使い捨てキュベットを透明シリコン・ラバ
−・シ−ラ−で塞ぐ。シリコ−ンは24時間乾燥させる。
24時間後、気密アクリル製キュベットが得られる。これ
らは、水中で泡立ちについて試験する。 6.3.2. 工程２：基質サンプリング手順 シリコ−ン密封アクリル製キュベットに、 1ｃｃシリン
ジ（ 1／100 ｃｃ目盛）を用いて、基質 2ｍｌを充填す
る。

【０１０９】正確にサンプリングするために、シリンジ
をタップして空気を除去する（これは、基質溶液容積の
妨げとなる）。

【０１１０】充填したキュベットを冷蔵庫（0-5 ℃）内
に保存する。

【０１１１】ブランクＢ１（ 2ｍｌ T-3754 ＋ 0.5ｍｌ
リン酸ナトリウム緩衝液）を、プラスチックで栓をした
キュベット中に調製する。これは、後に、シリコ−ン密
封キュベットの使用に変更になる。 6.3.3. 工程３：酵素サンプリング手順 血清バイアルに、 1ｍｌピペット（ 1／100 ｍｌ目盛）
を用いて、酵素 2ｍｌを充填し、ゴム栓で蓋をし、アル
ミニウム・キャップでクリンプシ−ル（crimp-sealed）
する。血清バイアルは気密になる。

【０１１２】充填した血清バイアルを冷蔵庫（ 0-5℃）
内に保存する。 6.3.4. 工程４：ガス飽和手順（アルゴン、クリプト
ン、ネオン、酸素、キセノン） 注入の間隔を 1時間あけて、シリコ−ン密封キュベット
および血清バイアル（T-3754、T-7755）中で、 3×10ｃ
ｃのガスを連続的に泡立てる。これは、ガスの平衡を最
大にしながら死容積を10×置換することを意味する。

【０１１３】適正なガスを充填する前に、全てのシリン
ジおよびデッド・スペ−スをパ−ジする。 3回目の10ｃ
ｃの注入の後、シリコ−ン密封キュベットおよび血清バ
イアルを、 2本の10ｃｃシリンジに適正なガスを充填し
た状態で、 0-5℃の冷蔵庫内に一晩放置する。 6.3.5. 注：空気試料（酵素および基質の両者）にはい
かなる泡立ても行なわない。アクリル製キュベットは正
規のビニルキャップ（非気密性）で塞がれている。この
手順は、後に、シリコ−ン密封キュベットの使用に変更
される。密封した上での空気泡立て処理との多数の比較
では、２つの方法の間に差異は見られない。 6.3.6. 工程５：分光分析の実行 ａ．シリコ−ン密封キュベット、血清バイアルおよびプ
ラスチックのキャップをしたキュベットを冷蔵庫から取
り出す。この手順は、後に変更される（7.1.5.参照）。

【０１１４】ｂ．シリコ−ン密封キュベットおよび血清
バイアルにガス10ｃｃを充填し、 2本の10ｃｃシリンジ
の下で、室温（26℃）で放置した。

【０１１５】ｃ．キュベットをセルホルダに置き、10分
間、セルホルダと温度を平衡にする。

【０１１６】ｄ． 1ｃｃシリンジに適正なガスを充填
し、血清バイアルから酵素 0.5ｍｌを回収するのに用い
る。これは、酵素のサンプリングの間にバイアル中に空
気が混入することを防ぐためである。

【０１１７】ｅ．実行：キュベットへの逐次的な酵素の
0.5ｍｌシリンジ注入を、セル５ないしセル１に可能な
かぎり素早く行なう（遅延Ｘ＝ 2秒）。この手順は、後
に、同時注入に変更される。 6.3.7. 分光分析の実行： 305ｎｍでの時間駆動 60点、60秒間隔−−−−→ 1時間実行 実行１： Ｔ1 ＝15℃（Ｔ_S ＝Ｔ_R ＝15.1℃） ファイル名 ガス セル No. −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Ｂ１Ｔ１Ｇ２．ＳＰ ネオン セル２ Ｂ１Ｔ１Ｇ３．ＳＰ アルゴン セル３ Ｂ１Ｔ１Ｇ４．ＳＰ クリプトン セル４ Ｂ１Ｔ１Ｇ５．ＳＰ キセノン セル５ 実行２： Ｔ1 ＝15℃（Ｔ_S ＝Ｔ_R ＝15.1℃） ファイル名 ガス セル No. −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Ｂ１Ｔ１Ｇ６．ＳＰ 空気 セル１ Ｂ１Ｔ１Ｇ７．ＳＰ 酸素 セル２ 実行３： Ｔ2 ＝20℃（Ｔ_S ＝Ｔ_R ＝20℃） ファイル名 ガス セル No. −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Ｂ１Ｔ２Ｇ１．ＳＰ 空気 セル１ Ｂ１Ｔ２Ｇ２．ＳＰ ネオン セル２ Ｂ１Ｔ２Ｇ３．ＳＰ アルゴン セル３ Ｂ１Ｔ２Ｇ４．ＳＰ クリプトン セル４ Ｂ１Ｔ２Ｇ５．ＳＰ キセノン セル５ 実行４： Ｔ2 ＝20℃（Ｔ_S ＝Ｔ_R ＝20℃） ファイル名 ガス セル No. −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Ｂ２Ｔ２Ｇ６．ＳＰ 酸素 セル１ 実行５： Ｔ3 ＝25℃（Ｔ_S ＝Ｔ_R ＝24.9℃） ファイル名 ガス セル No. −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Ｂ１Ｔ３Ｇ１．ＳＰ 空気 セル１ Ｂ１Ｔ３Ｇ２．ＳＰ ネオン セル２ Ｂ１Ｔ３Ｇ３．ＳＰ アルゴン セル３ Ｂ１Ｔ３Ｇ４．ＳＰ クリプトン セル４ Ｂ１Ｔ３Ｇ５．ＳＰ キセノン セル５ 実行６： Ｔ3 ＝25℃（Ｔ_S ＝Ｔ_R ＝24.9℃） ファイル名 ガス セル No. −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Ｂ１Ｔ３Ｇ６．ＳＰ 酸素 セル１ 実行７： Ｔ4 ＝30℃（Ｔ_S ＝Ｔ_R ＝29.9℃） ファイル名 ガス セル No. −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Ｂ１Ｔ４Ｇ１．ＳＰ 空気 セル１ Ｂ１Ｔ４Ｇ２．ＳＰ ネオン セル２ Ｂ１Ｔ４Ｇ３．ＳＰ アルゴン セル３ Ｂ１Ｔ４Ｇ４．ＳＰ クリプトン セル４ Ｂ１Ｔ４Ｇ５．ＳＰ キセノン セル５ 実行８： Ｔ4 ＝30℃（Ｔ_S ＝Ｔ_R ＝29.9℃） ファイル名 ガス セル No. −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Ｂ１Ｔ４Ｇ６．ＳＰ 酸素 セル１ 実行９： Ｔ5 ＝35℃（Ｔ_S ＝Ｔ_R ＝34.9℃） ファイル名 ガス セル No. −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Ｂ１Ｔ５Ｇ１．ＳＰ 空気 セル１ Ｂ１Ｔ５Ｇ２．ＳＰ ネオン セル２ Ｂ１Ｔ５Ｇ３．ＳＰ アルゴン セル３ Ｂ１Ｔ５Ｇ４．ＳＰ クリプトン セル４ Ｂ１Ｔ５Ｇ５．ＳＰ キセノン セル５ 実行１０： Ｔ5 ＝35℃（Ｔ_S ＝Ｔ_R ＝34.9℃） ファイル名 ガス セル No. −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Ｂ１Ｔ５Ｇ６．ＳＰ 酸素 セル１ 7.3. 結果の図示 時間駆動オ−バ−レイ／温度 − 添付 時間駆動オ−バ−レイ／ガス − 添付 ７．最終手順： 7.1. 最終実験プロトコル： 7.1.1. 工程１：シリコ−ン密封キュベットの作製 酵素抑制を妨げ得る酢酸蒸気を除去するために、シリコ
−ンを48時間硬化させる以外は、6.3.1.と同じである。
これは、検定により確認される。 7.1.2. 工程２：基質サンプリング手順 6.3.2.と同じ。

【０１１８】ガス飽和工程（7.1.4.）を行なわないこと
以外は（シリコ−ン密封キュベット内で）同様の手順に
従い、ブランクＢ２（リン酸ナトリウム緩衝液 2ｍｌ＋
T-7755 0.5ｍｌ）を調製する。

【０１１９】コントロ−ルのチェックでは、作業吸収領
域内にはいかなるガスの吸収も見出されない。 7.1.3. 工程３：酵素サンプリング手順 6.3.3.と同様。 7.1.4. 工程４：ガス飽和手順（空気、アルゴン、クリ
プトン、ネオン、窒素、酸素、キセノン） 3×10ｃｃのガスを、各ガス注入の間隔を20分（ 0-5℃
で）あけて、シリコ−ン密封キュベットおよび血清バイ
アル（T-3754、T-7755）内で泡立てる。

【０１２０】３回目の10ｃｃ注入の後、キュベットおよ
び血清バイアルを、２本の10ｃｃシリンジに適正なガス
を充填した状態で、 0-5℃の冷蔵庫内に一晩放置する。 7.1.5. 工程５：分光分析の実行 ａ．実験の実行の40分前に、シリコ−ン密封キュベット
を冷蔵庫から取り出し、２本の10ｃｃシリンジの下で、
ガス10ｃｃを充填して室温（26℃）に放置する。

【０１２１】ｂ．実験の実行の25分前に、血清バイアル
を冷蔵庫から取り出し、２本の10ｃｃシリンジの下で、
ガス10ｃｃを充填して冷蔵庫に戻す。

【０１２２】ｃ．実行の15分前に、シリコ−ン密封キュ
ベットから10ｃｃシリンジ（および針）を取り除く。こ
のキュベットをセルホルダに置き、10分間でセルホルダ
と温度平衡にする。

【０１２３】ｄ．実行の 5分前に、 1ｃｃシリンジにガ
スを充填し、血清バイアル内の酵素溶液 0.5ｍｌを回収
する。これは、酵素のサンプリングの間にバイアル内に
空気が混入することを防ぐためである。

【０１２４】ｅ．実行：シリコ−ン密封キュベットをセ
ルホルダから手短に取り外し、タップしてキュベットを
ウォ−ミンアップしている間に形成され得る気泡（これ
は特に30および35℃で真実である）を静め、セルホルダ
に戻す。

【０１２５】酵素の 0.5ｍｌシリンジ注入を同時に行な
い、試料に共通の開始時間ｔ₀ を生じせしめる。 7.2. 分光分析の実行： 305ｎｍでの時間駆動 200点、18秒間隔−−−−→ 1時間実行 7.2.1. 実行１：Ｔ1 ＝15℃（Ｔ_S ＝Ｔ_R ＝15.1℃） ファイル名 ガス セル No. −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Ｂ２Ｔ１Ｇ１．ＳＰ 空気 セル１ Ｂ２Ｔ１Ｇ２．ＳＰ ネオン セル２ Ｂ２Ｔ１Ｇ３．ＳＰ アルゴン セル３ Ｂ２Ｔ１Ｇ４．ＳＰ クリプトン セル４ Ｂ２Ｔ１Ｇ５．ＳＰ キセノン セル５ 7.2.2. 実行２：Ｔ1 ＝15℃（Ｔ_S ＝Ｔ_R ＝15.1℃） ファイル名 ガス セル No. −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Ｂ２Ｔ１Ｇ６．ＳＰ 空気 セル１ Ｂ２Ｔ１Ｇ７．ＳＰ 酸素 セル２ Ｂ２Ｔ１Ｇ８．ＳＰ 窒素 セル３ 7.2.3. 実行３：Ｔ2 ＝20℃（Ｔ_S ＝Ｔ_R ＝19.9℃） ファイル名 ガス セル No. −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Ｂ２Ｔ２Ｇ１．ＳＰ 空気 セル１ Ｂ２Ｔ２Ｇ２．ＳＰ ネオン セル２ Ｂ２Ｔ２Ｇ３．ＳＰ アルゴン セル３ Ｂ２Ｔ２Ｇ４．ＳＰ クリプトン セル４ Ｂ２Ｔ２Ｇ５．ＳＰ キセノン セル５ 7.2.4. 実行４：Ｔ2 ＝20℃（Ｔ_S ＝Ｔ_R ＝19.9℃） ファイル名 ガス セル No. −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Ｂ２Ｔ２Ｇ６．ＳＰ 空気 セル１ Ｂ２Ｔ２Ｇ７．ＳＰ 酸素 セル２ Ｂ２Ｔ２Ｇ８．ＳＰ 窒素 セル３ 7.2.5. 実行５：Ｔ3 ＝25℃（Ｔ_S ＝Ｔ_R ＝24.9℃） ファイル名 ガス セル No. −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Ｂ２Ｔ３Ｇ１．ＳＰ 空気 セル１ Ｂ２Ｔ３Ｇ２．ＳＰ ネオン セル２ Ｂ２Ｔ３Ｇ３．ＳＰ アルゴン セル３ Ｂ２Ｔ３Ｇ４．ＳＰ クリプトン セル４ Ｂ２Ｔ３Ｇ５．ＳＰ キセノン セル５ 7.2.6. 実行６：Ｔ3 ＝25℃（Ｔ_S ＝Ｔ_R ＝24.9℃） ファイル名 ガス セル No. −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Ｂ２Ｔ３Ｇ６．ＳＰ 空気 セル１ Ｂ２Ｔ３Ｇ７．ＳＰ 酸素 セル２ Ｂ２Ｔ３Ｇ８．ＳＰ 窒素 セル３ 7.2.7. 実行７：Ｔ4 ＝30℃（Ｔ_S ＝Ｔ_R ＝29.9℃） ファイル名 ガス セル No. −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Ｂ２Ｔ４Ｇ１．ＳＰ 空気 セル１ Ｂ２Ｔ４Ｇ２．ＳＰ ネオン セル２ Ｂ２Ｔ４Ｇ３．ＳＰ アルゴン セル３ Ｂ２Ｔ４Ｇ４．ＳＰ クリプトン セル４ Ｂ２Ｔ４Ｇ５．ＳＰ キセノン セル５ 7.2.8. 実行８：Ｔ4 ＝30℃（Ｔ_S ＝Ｔ_R ＝29.9℃） ファイル名 ガス セル No. −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Ｂ２Ｔ４Ｇ６．ＳＰ 空気 セル１ Ｂ２Ｔ４Ｇ７．ＳＰ 酸素 セル２ Ｂ２Ｔ４Ｇ８．ＳＰ 窒素 セル３ 7.2.9. 実行９：Ｔ5 ＝35℃（Ｔ_S ＝Ｔ_R ＝34.9℃） ファイル名 ガス セル No. −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Ｂ２Ｔ５Ｇ１．ＳＰ 空気 セル１ Ｂ２Ｔ５Ｇ２．ＳＰ ネオン セル２ Ｂ２Ｔ５Ｇ３．ＳＰ アルゴン セル３ Ｂ２Ｔ５Ｇ４．ＳＰ クリプトン セル４ Ｂ２Ｔ５Ｇ５．ＳＰ キセノン セル５ 7.2.8. 実行１０：Ｔ5 ＝35℃（Ｔ_S ＝Ｔ_R ＝34.9℃） ファイル名 ガス セル No. −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Ｂ２Ｔ５Ｇ６．ＳＰ 空気 セル１ Ｂ２Ｔ５Ｇ７．ＳＰ 酸素 セル２ Ｂ２Ｔ５Ｇ８．ＳＰ 窒素 セル３ 7.3. 結果の図示： 時間駆動オ−バ−レイ／温度 − 添付 時間駆動オ−バ−レイ／ガス − 添付 7.4 酵素速度論：エンズフィッタ−(ENZFITTER) チロシナーゼ-L- チロシン反応から得られた結果から、
次の結論が導かれる。

【０１２６】キセノンは、著しく、チロシナーゼ-L- チ
ロシン反応の速度を阻害し、最終平衡を下降させる。さ
らに、その他の希ガスは、全て、それらの溶解性および
分子特性の両方に従って、より少ない程度で、この反応
の速度を阻害し、最終平衡を下降させる。クリプトン
は、通常、キセノンと同様でより少ない効果を有し、一
方、アルゴンは、驚くべきことに低温で活性である。

【０１２７】さらに、酸素消耗の効果は、窒素を使用す
ることにより制御できる。アルゴンと比較した場合に、
窒素は、活性部位相互作用のための物理的能力が損なわ
れることがわかる。アルゴンは、窒素と比較してより活
性であることは明らかである。このことは、その他の酵
素にも当てはまることも同様に明らかである。

【０１２８】溶解性の差としてだけ、観察された阻害の
割合、活性部位相互作用または誘導されたたんぱく質の
構造変化が起こることを説明できる。

【０１２９】酵素速度論は、以下に含まれている。

【０１３０】高圧試験：試験は、２気圧または３気圧で
リアルタイムに既に溶液に飽和させた後、または、１リ
ットルシリンダ中で１時間〜２４時間３０．６気圧およ
び１００気圧で加圧した後に、試験ガスの添加により加
圧された圧力セル中で行われた。

【０１３１】次の試験手順を用いた。 プロトコル： 酵素に置ける高圧の効果 理 論： 酵素を高圧に誘導し、それらの活性を
決定する。高圧は酵素の活性を阻害するはずである。 酵 素： チロシナーゼ (SIGMA No.T-7755) （モノフェノール モノオキシゲナーゼ；ポリフェノ−
ルオキシダ−ゼ；カテコール オキシダーゼ；モノフェ
ノール，ジヒドロシキフェニルアラニン；オキシゲン
オキシドリダクタ−ゼ；EC 1.14.18.1） マッシュルーム由来 チロシナーゼ単位の定義：１単位は、ｐＨ６．５、２５
℃でＬ−チロシンを含有する３ｍＬ反応混合物中Ａ₂₈₀
において１分あたり０．００１の増加を起こす。

【０１３２】チロシナーゼ活性：３８７０Ｕ／ｍｇ固体 ７．１ｍｇ固体 ＝＝＞ ２７，４４０単位 ０℃以下で乾燥貯蔵する。 基 質： Ｌ−チロシン (SIGMA No.T-3754) Ｌ−３−［４−ヒドロキシフェニル］アラニン 遊離塩基(pfs) 結晶 無水物分子量 181.2 室温 (25℃) で貯蔵する。 酵 素： β−Ｄ−グルコシダーゼ (SIGMA No.G
-4511) （乳剤；β−Ｄ−グルコシド グルコヒドロラ−ゼEC
3.2.1.21) アーモンド由来 単位の定義：１単位は、 pH5.0, 37℃で１分あたりサリ
シンからグルコ−ス1.0 μmoleを遊離させる。

【０１３３】活性： 22U/mg固体 12 mg 固体 ==> 264 単位 ０〜５℃で乾燥貯蔵する。

【０１３４】ロット番号 49F-4021 基 質： ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコ
ピラノサイド(SIGMA No.N-7006) 結晶 2.4%含有溶液 無水物分子量 301.3 ０℃以下で乾燥貯蔵する。

【０１３５】ロット番号 129F-5057 試 験１： 4/10/91 - 4/11/91 ガ ス： １．空気 ２．Ｎ₂ 圧 力： １．30.6 atm (450 psi) ２．100.0 atm (1470 psi) コントロール： コントロールＡ：酵素は加圧せずガス
シリンダ中に配置しない。

【０１３６】コントロールＢ：酵素は加圧せずガスシリ
ンダ１に配置する。

【０１３７】ガス１（空気）のためのコントロール コントロールＣ：酵素は加圧せずガスシリンダ２に配置
する。

【０１３８】ガス２（Ｎ₂ ）のためのコントロール 溶液の調製： 4/10/91 溶液Ａ： リン酸ナトリウム緩衝液（25℃でpH6.6 ） 脱イオン水１Ｌ 141.96 x 0.2 x 187.5 x 1/1000 = Na₂ HPO₄ 5.3g 119.96 x 0.2 x 312.5 x 1/1000 = Na₂ HPO₄ 7.5g 試験したpH： 6.502 溶液Ｂ：チロシナーゼ リン酸ナトリウム緩衝溶液(228
U/ml)T-7755 14.2mg をリンナトリウム酸緩衝液240mL
（25℃でpH6.6 ）に希釈した。

【０１３９】溶液Ｃ：Ｌ−チロシン リン酸ナトリウム
緩衝溶液（50μg/ml） T-3754 10mg を、リン酸ナトリウム緩衝液200ml （25℃
でpH6.6 ）に希釈した。

【０１４０】溶液Ｄ： リン酸ナトリウム緩衝液（25℃
でpH6.8 ） 脱イオン水２Ｌ 2 x 141.96 x 0.2 x 245 x 1/1000 = Na₂ HPO₄ 13.91
g 2 x 119.96 x 0.2 x 245 x 1/1000= Na ₂ HPO₄ 12.20
g 試験したpH： 6.719 溶液Ｅ：β−Ｄ−グルコピラノサイド リン酸ナトリウ
ム緩衝溶液（ 100μg/mL） N-7006 25mg を、リン酸ナトリウム緩衝液250ml （25℃
でpH6.8 ）に希釈した。

【０１４１】溶液Ｆ：β−Ｄ−グルコシダーゼ リン酸
ナトリウム緩衝溶液 pH 6.8 (25℃)( 2.18 単位/ml ） G-4511 24mg を、リン酸ナトリウム緩衝液242ml （25℃
でpH6.8 ）に希釈した。 方 法： チロシナーゼ： 4/11/91 酵素溶液の試料100ml を、２つの使い捨てガスシリンダ
に夫々入れる。夫々のシリンダ中の酵素を数分間振とう
し、次いで、コントロールＢおよびコントロールＣのた
めに試料５mlを取る。

【０１４２】シリンダをドックに移し、適当なガスを注
入し、30.6atm までゆっくりと加圧する。所望の圧力で
６０分間放置する。実験室中に運ぶ前に、2psiにゆっく
りと減圧する。

【０１４３】ガス中に保ちながら、酵素約10mlを各シリ
ンダから別々のビーカーに移し、直ちに、酵素／基質混
合液においてTDrive/CPRG を行う。

【０１４４】酵素１、ガス１、圧力１、繰り返し１ 酵素１、ガス２、圧力１、繰り返し１ シリンダをドックに戻し、適当なガスを用いて100atmま
で再び加圧する。所望の圧力で６０分間放置する。実験
室中に運ぶ前に、2psiにゆっくりと減圧する。

【０１４５】ガス中に保ちながら、酵素約10mlを各シリ
ンダから別々のビーカーに移し、直ちに酵素／基質混合
液においてTDrive/CPRGを行う。

【０１４６】酵素１、ガス１、圧力２、繰り返し１ 酵素１、ガス２、圧力２、繰り返し１ β−グルコシダーゼ：豊富な量の脱イオン水(D.I.H₂ O)
でシリンダを濯ぐ。次いで、シリンダを第２の酵素溶液
（グルコシダーゼ）で濯ぐ。酵素溶液の試料100ml を、
２つの使い捨てガスシリンダに夫々入れる。

【０１４７】夫々のシリンダ中の酵素を数分間振とう
し、次いで、コントロールＢおよびコントロールＣのた
めに試料５mlを取る。

【０１４８】シリンダをドックに移し、適当なガスを注
入し、30.6atm までゆっくりと加圧する。所望の圧力で
６０分間放置する。実験室中に運ぶ前に、2psiにゆっく
りと減圧する。

【０１４９】ガス中に保ちながら、酵素約10mlを各シリ
ンダから別々のビーカーに移し、直ちに、酵素／基質混
合液においてTDrive/CPRG を行う。

【０１５０】酵素２、ガス１、圧力１、繰り返し１ 酵素２、ガス２、圧力１、繰り返し１ シリンダをドックに戻し、適当なガスを用いて100atmま
で再び加圧する。所望の圧力で６０分間放置する。実験
室中に運ぶ前に、2psiにゆっくりと減圧する。

【０１５１】ガス中に保ちながら、酵素約10mlを各シリ
ンダから別々のビーカーに移し、直ちに酵素／基質混合
液においてTDrive/CPRGを行う。

【０１５２】酵素２、ガス１、圧力２、繰り返し１ 酵素２、ガス２、圧力２、繰り返し１ スペクトル試験：25℃ キュベット： 最少 34 PARAM ： スリット１ スピード 1500 Asave Y Aprint N CPRG： チロシナーゼ： 305 nm 80 Pts ==> 20 分間実行 16s int ｙ_min = 0.0 ｙ_max = 2.0 β−グルコシダーゼ： 400 nm 40 Pts ==> 10 分間実行 16s int ｙ_min = 0.0 ｙ_max = 1.5 ブランク： チロシナーゼ： 溶液Ａ 2mL ＋
溶液Ｂ 0.5mL β−グルコシダーゼ： 溶液Ｅ 2mL ＋ 溶液Ｄ 0.5
mL 試 料： チロシナーゼ： 溶液Ｃ 2mL ＋
溶液Ｂ 0.5mL β−グルコシダーゼ： 溶液Ｅ 2mL ＋ 溶液Ｆ 0.5
mL セル搬送体： セル１： コントロールＡ セル２： コントロールＢ セル３： コントロ−ルＣ セル４： ガス１（空気） セル５： ガス２（Ｎ₂ ） ファイル： チロシナーゼ： X1P1G1C1...5.SP ====> DOS でX1P1G1C1...5.SP をX1
P1E1C1...5.SP に名称を変える。

【０１５３】X1P2E1C1...5.SP ====> 気泡を叩き出
し、全ての５つのセルで全範囲のスキャンを行うため
に、...5.SP をより高い吸光度 (abs)で開始した。： 全範囲スキャン 900〜190nm ： ファイル：X1SCAN1...5.SP ------------------ １０ファイル： β−グルコシダーゼ： X2P1E2C1...5.SP X2P2E2C1...5.SP ------------------ １０ファイル： 試 験２： 4/15/91 本試験では、チロシナーゼの圧力試験だけを行う。 ガ ス： １．空気 ２．Ｎ₂ 圧 力： １．30.6 atm (450 psi) ２．100.0 atm (1470 psi) コントロール： コントロールＡ：酵素は加圧せずガス
シリンダ中に配置しない。

【０１５４】コントロールＢ：酵素は加圧せずガスシリ
ンダ１に配置する。

【０１５５】ガス１（空気）のためのコントロール コントロールＣ：酵素は加圧せずガスシリンダ２に配置
する。

【０１５６】ガス２（Ｎ₂ ）のためのコントロール 溶液の調製： 4/10/91 溶液Ａ： リン酸ナトリウム緩衝液（25℃でpH6.6 ） 脱イオン水１Ｌ 141.96 x 0.2 x 187.5 x 1/1000 = Na₂ HPO₄ 5.3g 119.96 x 0.2 x 312.5 x 1/1000 = Na₂ HPO₄ 7.5g 試験したpH： 6.502 溶液Ｂ：チロシナーゼ リン酸ナトリウム緩衝溶液(228
U/ml)T-7755 14.2mg をリンナトリウム酸緩衝液240mL
（25℃でpH6.6 ）に希釈した。

【０１５７】溶液Ｃ：Ｌ−チロシン リン酸ナトリウム
緩衝溶液（50μg/ml） T-3754 10mg を、リン酸ナトリウム緩衝液200ml （25℃
でpH6.6 ）に希釈した。 方 法： チロシナーゼ：酵素溶液の試料25ml
を、２つの使い捨てガスシリンダに夫々入れる。夫々の
シリンダ中の酵素を数分間振とうし、次いで、コントロ
ールＢおよびコントロールＣのために試料５mlを取る。

【０１５８】シリンダをドックに移し、適当なガスを注
入する。ヘッドスペース／残渣のガスを加圧することに
より取り除き、ガスシリンダを数回減圧する。30.6atm
までゆっくりと加圧する。所望の圧力で６０分間放置す
る。実験室中に運ぶ前に、40psi にゆっくりと減圧す
る。

【０１５９】ガス中に保ちながら、酵素約5ml を各シリ
ンダから別々のビーカーに移し、直ちに、酵素／基質混
合液においてTDrive/CPRGを行う。 酵素１、ガス１、
圧力１、繰り返し２ 酵素１、ガス２、圧力１、繰り返し２ 酵素１、ガス２、圧力２、繰り返し２ スペクトル試験：25℃ キュベット： 最少 10 PARAM ： スリット１ スピード 1500 Asave Y Aprint N CPRG： チロシナーゼ： 305 nm 80 Pts ==> 20 分間実行 16s int ｙ_min = 0.0 ｙ_max = 2.0 ブランク： チロシナーゼ： 溶液Ａ 2mL ＋
溶液Ｂ 0.5mL 試 料： チロシナーゼ： 溶液Ｃ 2mL ＋
溶液Ｂ 0.5mL 溶液Ｃがまだ使用可能である場合には観察を試みる。

【０１６０】TDrive： 305nm, 80pts, 16 s int S = Ｃ 2.0ml ＋ Ｂ 0.5ml R = Ａ 2.0ml ＋ Ｄ 0.5ml ファイル： TYTRL1.SP セル搬送体： 実行 (RUN)１： 100atm セル１： コントロールＡ セル２： コントロールＢ セル３： コントロ−ルＣ セル４： ガス１（空気） セル５： ガス２（Ｎ₂ ） 実行 (RUN)２： 30atm セル１： コントロールＡ セル２： コントロールＢ セル３： コントロ−ルＣ セル４： ガス１（空気） セル５： ガス２（Ｎ₂ ） 試 験３： 4/24/91 （溶液の調製および最初の加
圧） 4/25/91,4/26/91 本試験では、チロシナーゼの圧力試験だけを行う。 ガ ス： １．空気 ２．Ｎ₂ ３．Ｘｅ：１ atm/N₂ に加圧 圧 力： １．30.6 atm (450 psi) ２．100.0 atm (1470 psi) コントロール： コントロールＡ：酵素は加圧せずガス
シリンダ中に配置しない。 溶液の調製： 4/24/91 溶液Ａ： リン酸ナトリウム緩衝液（25℃でpH6.8 ） 脱イオン水２Ｌ 2 x 141.96 x 0.2 x 245 x 1/1000 = Na₂ HPO₄ 13.91
g 2 x 119.96 x 0.2 x 255 x 1/1000= Na ₂ HPO₄ 12.20
g 試験したpH： 6.740 溶液Ｂ：チロシナーゼ リン酸ナトリウム緩衝溶液(228
U/ml)T-7755 14.2mg をリンナトリウム酸緩衝液240mL
（25℃でpH6.8 ）に希釈した。

【０１６１】溶液Ｃ：Ｌ−チロシン リン酸ナトリウム
緩衝溶液（50μg/ml） T-3754 10mg を、リン酸ナトリウム緩衝液200ml （25℃
でpH6.8 ）に希釈した。 方 法： チロシナーゼ： 4/24/91 シリンダの作製：シリンダ（３つ）を
減圧下に置き、次いで、脱イオン水50ccを注入し、加圧
下に置いた。：シリンダ１は空気で、シリンダ２は窒素
で、シリンダ３は窒素で、60psi に加圧し、振とうし、
上側を下に向け、圧力を解放してシリンダから液体を流
出させた。この手順をリン酸ナトリウム緩衝液50ccで繰
り返した。これらのシリンダを、上述のように３回加圧
して、シリンダから液体を全て除去した。

【０１６２】酵素の注入：シリンダを再び減圧下に置
き、減圧を利用してシリンダに酵素を吸い込ませて、酵
素をチロシン溶液60ccを注入した。シリンダの圧力を解
放し、シリンダを再び10回加圧してシリンダからＯ₂ を
除去した。

【０１６３】最終加圧：シリンダ１（空気）および２
（Ｎ₂ ）を対応するガスで30.6atm まで加圧した。シリ
ンダ３をＸｅで１atm まで加圧し、次いでＮ₂ で30.6at
m まで加圧し、Ｘｅを保護した。

【０１６４】タイムテーブル：シリンダを4/24/91 のpm
1:00 に30atm に加圧した。4/25/91 に分光光度計を異
なる試験のために５℃で使用したために、この分光光度
計が２５℃に置いて使用できる場合にはその日の終りに
シリンダを試験することを決定した。

【０１６５】試料の採取は、加圧後２８時間で行われ
た。スペクトル／ガスの実行は、直ちに、これらの試料
について行われた。

【０１６６】4/25/91 再加圧：4/25/91 pm 6:0
0 に、シリンダを100atmに再び加圧した。これらのシリ
ンダを、4/26/91 pm 2:00 に試験する（加圧後20時
間）。 スペクトル試験： 4/25/91 25 ℃ キュベット： 最少 10 PARAM ： スリット１ スピード 1500 Asave Y Aprint N CPRG： チロシナーゼ： 305 nm 80 Pts ==> 20 分間実行 16s int ｙ_min = 0.0 ｙ_max = 2.0 ブランク： チロシナーゼ： 溶液Ａ 2mL ＋
溶液Ｂ 0.5mL 試 料： チロシナーゼ： 溶液Ｃ 2mL ＋
溶液Ｂ 0.5mL セル搬送体： 実行１： 30atm セル１： コントロールＡ セル２： ガス１（空気） セル３： ガス２（Ｎ₂ ） セル４： ガス３（Ｘｅ：1atm/N₂ ：29 atm） スペクトル試験： 4/26/91 25 ℃ キュベット： 最少 10 PARAM ： スリット１ スピード 1500 Asave Y Aprint N CPRG： チロシナーゼ： 305 nm 80 Pts ==> 20 分間実行 16s int ｙ_min = 0.0 ｙ_max = 2.0 ブランク： チロシナーゼ： 溶液Ａ 2mL ＋
溶液Ｂ 0.5mL 試 料： チロシナーゼ： 溶液Ｃ 2mL ＋
溶液Ｂ 0.5mL セル搬送体： 実行１： 100atm セル１： コントロールＡ セル２： ガス１（空気） セル３： ガス２（Ｎ₂ ） セル４： ガス３（Ｘｅ：1atm/N₂ ：29 atm） プロトコル： 酵素に置ける加圧の効果 酵 素： チロシナーゼ (SIGMA No.T-7755) （モノフェノール モノオキシゲナーゼ；ポリフェノ−
ルオキシダ−ゼ；カテコール オキシダーゼ；モノフェ
ノール，ジヒドロシキフェニルアラニン；オキシゲン
オキシドリダクタ−ゼ；EC 1.14.18.1） マッシュルーム由来 チロシナーゼ単位の定義：１単位は、ｐＨ６．５、２５
℃でＬ−チロシンを含有する３ｍＬ反応混合物中Ａ₂₈₀
において１分あたり０．００１の増加を起こす。

【０１６７】チロシナーゼ活性：３８７０Ｕ／ｍｇ固体 ７．１ｍｇ固体 ＝＝＞ ２７，４４０単位 ０℃以下で乾燥貯蔵する。 基 質： Ｌ−チロシン (SIGMA No.T-3754) Ｌ−３−［４−ヒドロキシフェニル］アラニン 遊離塩基(pfs) 結晶 無水物分子量 181.2 室温 (25℃) で貯蔵する。 酵 素： β−Ｄ−グルコシダーゼ (SIGMA No.G
-4511) （乳剤；β−Ｄ−グルコシド グルコヒドロラ−ゼEC
3.2.1.21) アーモンド由来 単位の定義：１単位は、 pH5.0, 37℃で１分あたりサリ
シンからグルコ−ス1.0 μmoleを遊離させる。

【０１６８】活性： 22U/mg固体 12 mg 固体 ==> 264 単位 ０〜５℃で乾燥貯蔵する。 基 質： ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコ
ピラノサイド (SIGMA No.N-7006) 結晶 2.4%含有溶液 無水物分子量 301.3 ０℃以下で乾燥貯蔵する。

【０１６２】試 験１： ガ ス： １．空気 ２．Ｎ₂ ３．空気 ４．Ｏ₂ 圧 力： １．2 atm (30psi) 溶液の調製： 4/29/91 調製：4/26/91 溶液Ａ： リン酸ナトリウム緩衝液
（25℃でpH6.8 ） 脱イオン水２Ｌ 2 x 141.96 x 0.2 x 245 x 1/1000 = Na₂ HPO₄ 13.91
g 2 x 119.96 x 0.2 x 255 x 1/1000= Na ₂ HPO₄ 12.20
g 試験したpH： 溶液Ｂ：チロシナーゼ リン酸ナトリウム緩衝溶液(228
U/ml) T-7755 14.2mg をリンナトリウム酸緩衝液240mL （25℃
でpH6.8 ）に希釈した。

【０１６３】溶液Ｃ：Ｌ−チロシン リン酸ナトリウム
緩衝溶液（50μg/ml） T-3754 10mg を、リン酸ナトリウム緩衝液200ml （25℃
でpH6.8 ）に希釈した。

【０１６４】溶液Ｅ：β−Ｄ−グルコピラノサイド リ
ン酸ナトリウム緩衝溶液（ 100μg/mL） N-7006 25mg を、リン酸ナトリウム緩衝液250ml （25℃
でpH6.8 ）に希釈した。

【０１６５】溶液Ｆ：β−Ｄ−グルコシダーゼ リン酸
ナトリウム緩衝溶液 pH 6.8 (25℃)( 2.18 単位/ml ） G-4511 24mg を、リン酸ナトリウム緩衝液242ml （25℃
でpH6.8 ）に希釈した。 方 法： セル搬送体を分光光度計から取り外
し、固定されたセルを取り付けた。

【０１６６】アクリルキュベットを、まず、青いシリコ
ンフプラグ、針を取り付け、次いで、通常の全ての提案
されているシリコンを用いてキュベットの頭頂部及ぶ側
面部を被覆する (siliconing)ことにより作製した。こ
れらを使用前４８時間放置して硬化ささせた。シリコン
が硬化した場合に、キュベットを、垂直に次いでプラグ
の周囲にストラピングテープでくくった。

【０１６７】試料の調製：4/29/91 キュベットを、２気圧試験のために両方の酵素で満たし
た。

【０１６８】各キュベットに、適当なガス10 x 10cc を
注入し、実行する前１５分間冷凍した。

【０１６９】血清用バイアルを、対応する酵素 5ccで満
たし、実行する前に適当なガス10 x 10cc を注入した、
分光光度計を各ガスの連続流を全ての時間において各ス
ペクトルに供給できるように設定した。100 psi_max ゲ
ージを取り付けてキュベット圧力を示し、開閉弁を取り
付けて、２番目の繰り返しの間に参照セルを加圧するこ
とを可能にした。ボール弁をシリンダ／ハウスラインと
ゲージの間に取り付け、ガス流を、分光光度計において
直接制御できるようにした。チェック弁を各ラインに配
置し、バック圧力がハウスラインまたはガスシリンダの
汚染を起こさないことを保証した。キュベットは全部の
実行の間、２つの針を保持した。これらの針の一つは、
ガスラインに取り付けられ、一方、２番目の針は、酵素
を誘導し、その後塞ぐために使用された。組立部品がか
さばっているために、分光光度計の取り付けられたドア
は使用できないので取り外した。４層薄膜ブラックフェ
ルトカバ−を各スペクトルのために作製し、システムに
入る光量を最小にした。

【０１７０】キュベットが分光光度計の中の温度が平衡
になる間、両方の針は、まだ取付けられている10ccシリ
ンジと共に、キュベットに残された。酵素を誘導するよ
りも前に、ガスラインを針に取り付けると同時にシリン
ジの一つを取り外した。これにより、少量のガス流がラ
インを通過すると同時に酸素の汚損がないことが保証さ
れた。針は、液面の上に残されていた。２番目のシリン
ジを取り外して、キュベットを通るガス流を一定にし
た。

【０１７１】酵素は、１ccシリンジを用いて、２番目の
針を通して注入された。この針は、その後に塞がれ、キ
ュベットは加圧され、実行が開始した。

【０１７２】4/29/91 2 atm 参照は加圧しなかった。

【０１７３】チロシナーゼ： １．空気で加圧しなかっ
た参照または試料 ２．繰り返し１（参照セルは加圧せず） ４．ガス グルコシダーゼ：１．空気で加圧しなかった参照または
試料 ２．繰り返し１（参照セルは加圧せず） ４．ガス スペクトル試験：室温 キュベット： 10 PARAM ： スリット１ スピード 1500 Asave Y Aprint N TDrive： チロシナーゼ： 新しい分光光度計
（Ｂ） 305 nm 60 Pts ==> 15 分間実行 16s int ｙ_min = 0.0 ｙ_max = 2.0 β−グルコシダーゼ：古い分光光度計（Ａ） 400 nm 60 Pts ==> 15 分間実行 16s int ｙ_min = 0.0 ｙ_max = 2.0 ブランク： チロシナーゼ： 溶液Ａ 2mL ＋
溶液Ｂ 0.5mL β−グルコシダーゼ： 溶液Ｅ 2mL ＋ 溶液Ａ 0.5
mL 試 料： チロシナーゼ： 溶液Ｃ 2mL ＋
溶液Ｂ 0.5mL β−グルコシダーゼ： 溶液Ｅ 2mL ＋ 溶液Ｆ 0.5
mL ファイル： 4/29/91 チロシナーゼ： 空気参照（加圧せず）：429TYTRL.SP 2 atm （加圧していない参照）： Y4E1P1G1...7.SP グルコシダーゼ： 空気参照（加圧せず）：429GLUTR.SP 2 atm （加圧していない参照）： Y4E2P1G1...7.SP 記 ： 固定された試料セルの内側の温度は、我々
が得た結果を直接に達成できる程度に一定に維持されな
かった。我々は、両方の分光光度計に固定されたセルホ
ルダーを取り外し、セル搬送体に取り替えるであろう。 トライアル２：４／３０／９１ ガス：１．空気 ２．窒素 ３．アルゴン ４．酸素 圧力：１． ２気圧（３０ｐｓｉ） 試料の調製：４／３０／９１に調製した溶液を使用す
る。 方 法：トライアル１で述べたように、ガスを連続的に
流すため、分光光度計を組み立てた。固定セルホルダー
の代わりにセル運搬装置を設け、フィッシャーサーキュ
レーター、およびデジタルコントローラー用いて温度を
一定に保つことができるようにした。適切に光を遮断す
る目的で、黒色のフェルトカバーを続けて使用した。

【０１７４】各酵素に対し、上記４種類のガス全てを用
いて加圧せずにガスを供給した。各キュベットを対応す
るガス１０×１０ｃｃで満たし、更に１５分間冷却し
た。これらキュベットを分光光度計内に備え、このとき
キュベットをガスで満たすのに使用した２本の針を取り
除いた。次に、２０Ｇｌｌ／２の針が装着された１ｃｃ
シリンジを用いて、前記キュベット内に酵素を導入し
た。シリンジの針は、シリコーンプラグを通してキュベ
ット内に入れたが、液中には浸さなかった。この酵素の
導入は、加圧ガスを流した場合と同様であることが確認
された。

【０１７５】血清バイアルを、操作に先立って、相応の
酵素５ｃｃで満たし、更に適切なガス１０×１０ｃｃで
満たした。 キュベット： チロシナーゼ：この酵素には、ブルーシリコーン、一般
用シリコーン、およびストラッピングテープを有するキ
ュベットを使用した。

【０１７６】グルコシダーゼ：この酵素には、ブルーシ
リコーンのみを有するキュベットを使用した。

【０１７７】全てのキュベットについて、使用前に３２
ｐｓｉまで圧力テストを行った。 分光の検討： キュベット：２６ パラメーター：スリット １ 速度 １５００ Ａｓａｖｅ Ｙ Ａｐｒｉｎｔ Ｎ ＴＤｒｉｖｅ： チロシナーゼ：新分光光度計（Ｂ）２５℃ ３０５ｎｍ ６０ｐｔｓ → １５分運転 １６秒間隔 ｙ（最小値）＝０．０ ｙ（最大値）＝１．６ β -グルコシダーゼ：旧分光光度計（Ａ）３５℃ ４００ｎｍ ６０ｐｔｓ → １５分運転 １６秒間隔 ｙ（最小値）＝０．０ ｙ（最大値）＝２．０ ブランク： チロシナーゼ ：溶液Ａ ２ｍＬ＋溶液Ｂ ０．５
ｍＬ β -グルコシダーゼ：溶液Ｅ ２ｍＬ＋溶液Ａ ０．５
ｍＬ 試料： チロシナーゼ ：溶液Ｃ ２ｍＬ＋溶液Ｂ ０．５
ｍＬ β -グルコシダーゼ：溶液Ｅ ２ｍＬ＋溶液Ｆ ０．５
ｍＬ ファイル：４／３０／９１ チロシナーゼ： ガス供給（加圧せず） ：Ｙ６Ｅ１ＲＳＧ１…４．Ｓ
Ｐ ２気圧（参考 加圧せず）：Ｙ６Ｅ１Ｐ１Ｇ１…４．Ｓ
Ｐ ２気圧（参考 加圧せず）：Ｙ７Ｅ１Ｐ１Ｇ１…４．Ｓ
Ｐ グルコシダーゼ： ガス供給（加圧せず） ：Ｙ６Ｅ２ＲＳＧ１…４．Ｓ
Ｐ ２気圧（参考 加圧せず）：Ｙ６Ｅ２Ｐ１Ｇ１…４．Ｓ
Ｐ ２気圧（参考 加圧せず）：Ｙ７Ｅ２Ｐ１Ｇ１…４．Ｓ
Ｐ 備考：発明者らは、今後の圧力テストにはブルーシリコ
ーンプラグを有するキュバレットを用いることを決定し
た。一般用シリコーンおよびストラッピングテープを用
いると、ブルーシリコーンをキュバレットを用いた場合
のガスの密閉の完全性が損なわれるようである。 トライアル３：５／１／９１ ガス：１．空気 ２．窒素 ３．アルゴン ４．酸素 圧力：１． ３気圧（４５ｐｓｉ） 試料の調製：４／２９／９１に調製した溶液を使用す
る。 方 法：４／３０／９１のトライアル２と同様の方法
で、本トライアルを行った。 分光の検討： キュベット：３１ パラメーター：スリット １ 速度 １５００ Ａｓａｖｅ Ｙ Ａｐｒｉｎｔ Ｎ ＴＤｒｉｖｅ： チロシナーゼ：新分光光度計（Ｂ）２５℃ ３０５ｎｍ ６０ｐｔｓ → １５分運転 １６秒間隔 ｙ（最小値）＝０．０ ｙ（最大値）＝１．６ β -グルコシダーゼ：旧分光光度計（Ａ）３５℃ ４００ｎｍ ６０ｐｔｓ → １５分運転 １６秒間隔 ｙ（最小値）＝０．０ ｙ（最大値）＝２．０ ブランク： チロシナーゼ ：溶液Ａ ２ｍＬ＋溶液Ｂ ０．５
ｍＬ β -グルコシダーゼ：溶液Ｅ ２ｍＬ＋溶液Ａ ０．５
ｍＬ 試料： チロシナーゼ ：溶液Ｃ ２ｍＬ＋溶液Ｂ ０．５
ｍＬ β -グルコシダーゼ：溶液Ｅ ２ｍＬ＋溶液Ｆ ０．５
ｍＬ ファイル：５／１／９１ チロシナーゼ： ガス供給（加圧せず） ：Ｙ６Ｅ１ＲＳＧ１…４．Ｓ
Ｐ ガス供給（加圧せず） ：Ｙ７Ｅ１ＲＳＧ１…４．Ｓ
Ｐ ３気圧（参考 加圧せず）：Ｙ６Ｅ１Ｐ２Ｇ１…４．Ｓ
Ｐ ３気圧（参考 加圧せず）：Ｙ７Ｅ１Ｐ２Ｇ１…４．Ｓ
Ｐ グルコシダーゼ： ガス供給（加圧せず） ：Ｙ６Ｅ２ＲＳＧ１…４．Ｓ
Ｐ ３気圧（参考 加圧せず）：Ｙ６Ｅ２Ｐ２Ｇ１…４．Ｓ
Ｐ （新しいブランクを使用） ３気圧（参考 加圧せず）：Ｙ７Ｅ２Ｐ２Ｇ１…４．Ｓ
Ｐ トライアル４：５／３／９１ ガス：５．空気 ６．ネオン ７．クリプトン ８．キセノン 圧力：１． ２気圧（３０ｐｓｉ） 溶液の調製：５／２／９１ 調製：４／２６／９１ 溶液Ａ：リン酸ナトリウム緩衝液 ｐＨ６．８，２５℃ 脱イオン水 ２Ｌ ２×１４１．９６×０．２×２４５×１／１０００＝１３．９１ｇ Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ ２×１１９．９６×０．２×２５５×１／１０００＝１２．２０ｇ ＮａＨ₂ ＰＯ₄ ｐＨ試験済： 溶液Ｂ：リン酸ナトリウム緩衝液（２２８Ｕ／ｍｌ）中
チロシアナーゼ溶液 Ｔ−７７５５ ７．１ｍｇを、ｐＨ６．８，２５℃，リ
ン酸ナトリウム緩衝液１２０ｍＬに希釈 溶液Ｃ：リン酸ナトリウム緩衝液中Ｌ- チロシン５０ｐ
ｇ／ｍＬの溶液 Ｔ−３７５４ １０ｍｇを、ｐＨ６．８，２５℃，リン
酸ナトリウム緩衝液２００ｍＬに希釈 溶液Ｅ：リン酸ナトリウム緩衝液中β- Ｄ- グルコピラ
ノサイド１００μｇ／ｍＬの溶液 Ｎ−７００６ １２．５ｍｇを、ｐＨ６．８，２５℃，
リン酸ナトリウム緩衝液１２５ｍＬに希釈 溶液Ｆ：リン酸ナトリウム緩衝液中β- Ｄ- グルコシダ
ーゼの溶液 Ｇ−４５１１ １２ｍｇを、ｐＨ６．８，２５℃，リン
酸ナトリウム緩衝液１２１ｍＬに希釈 方 法：下記の２点を除き、トライアル２および３と同
様の方法で、本トライアルを行った。即ち、酵素をキュ
バレット内に注入した後シリンジの針を液中に浸し、ま
た多量の一般的なシリコーンを前記針の周辺に配し、ガ
スがキュバレットから漏れ出るのを防止した。 分光の検討： キュベット：２０ パラメーター：スリット １ 速度 １５００ Ａｓａｖｅ Ｙ Ａｐｒｉｎｔ Ｎ ＴＤｒｉｖｅ： チロシナーゼ：新分光光度計（Ｂ）２５℃ ３０５ｎｍ ４０ｐｔｓ → １０分運転 １６秒間隔 ｙ（最小値）＝０．０ ｙ（最大値）＝１．６ β -グルコシダーゼ：旧分光光度計（Ａ）３５℃ ４００ｎｍ ４０ｐｔｓ → １０分運転 １６秒間隔 ｙ（最小値）＝０．０ ｙ（最大値）＝２．０ ブランク： チロシナーゼ ：溶液Ａ ２ｍＬ＋溶液Ｂ ０．５
ｍＬ β -グルコシダーゼ：溶液Ｅ ２ｍＬ＋溶液Ａ ０．５
ｍＬ 試料： チロシナーゼ ：溶液Ｃ ２ｍＬ＋溶液Ｂ ０．５
ｍＬ β -グルコシダーゼ：溶液Ｅ ２ｍＬ＋溶液Ｆ ０．５
ｍＬ ファイル：５／１／９１ ＴＤｒｉｖｅにより、液中に浸された針が吸収に関して
問題を引き起こさないことを調べる。

【０１７８】ＴＤｒｉｖｅ：４０ｐｔｓ，１６秒間隔，
３０５ｎｍ：ＴＹＲＯＮＥＥ１．ＳＰ ＴＤｒｉｖｅ：４０ｐｔｓ，１６秒間隔，４００ｎｍ：
ＧＬＵＣＮＥＥ１．ＳＰ チロシナーゼ： ガス供給（加圧せず） ：Ｙ６Ｅ１ＳＲＧ５…８．Ｓ
Ｐ ２気圧（参考 加圧せず）：Ｙ６Ｅ１Ｐ１Ｇ５…８．Ｓ
Ｐ グルコシダーゼ： ガス供給（加圧せず） ：Ｙ６Ｅ２ＳＲＧ５…８．Ｓ
Ｐ ２気圧（参考 加圧せず）：Ｙ６Ｅ２Ｐ２Ｇ５…８．Ｓ
Ｐ 備考：針が光路に入った場合、液面上へ移動させた。こ
の操作は室内の光を消した状態で行われ、その間、分光
光度計の作動箇所にフェルトカバーが掛けられた。 結 果 結果を、空気１気圧に比較したガスの阻害％／加圧後の
空気１気圧に比較したガスの阻害％として示した。 チロシナーゼに関して： ２気圧 ３気圧 ３０．６気圧 １００気圧 （24時間)(１時間）（24時間)(１時間） 空気 -7.0，-15.4 -11.6 -37.0 -4.9 -65.8 -11.1 キセノン -76.0/-86.2 -87.0 -85.7 クリプトン -84.5/-93.1 アルゴン -76.9/-90.4 -55.8/-72.1 ネオン -69.0/-84.5 窒素 -71.2/-88.5 -72.1/-82.6 -78.8 -15.4 -84.7 -20.0 相対的な効果の変化が非常に大きい。例えば、キセノン
については７５％である。この結果より、圧力のみがチ
ロシアニンを顕著に阻害しているとが明らかである。 βグルコシダーデに関して：３気圧において、観察され
る増進の程度は以下の如く変化した： 空気 ０（増進） ＞ −１２．５（阻害） キセノン ＋３．１ ＞ −１５．７ クリプトン ＋２．０ ＞ −６．２ アルゴン ＋１．０ ＞ −１３．２ ネオン ＋１．０ ＞ −１２．５ 窒素 ０ ＞ −５．０ 上記の結果より明らかなように、従来技術で報告された
希ガスによるヒドロラーゼおよび他の酵素の阻害は、静
水効果によるものである。 酸素添加実験：チロシナーゼに酸素を加えることによ
り、窒素の効果が完全に低減された。一方、酸素を加え
ることによって希ガスの効果はあまり低減されなかっ
た。この理由は、希ガスが溶液からの単なる酸素の競争
的な置換に加えて、分子の特性により酵素に影響を及ぼ
しているからである。この結果より、希ガスの効果と窒
素の効果が明らかに区別される。また、酸素を少量加え
ることはチロシナーゼの活性を僅かに強めるが（酸素を
必要とする反応に対して期待されるように）、更に酸素
を加えても、付加的な効果は全く得られない。このよう
に、酸素の圧力と酵素の活性との間に完全な線形性があ
るという報告は、酸素が極限条件にある場合のみについ
て示されるものであり、全般には該当しない。

【０１７９】空気に酸素を加えることにより、チロシナ
ーゼの活性が最高６％大きくなった。

【０１８０】キセノン飽和溶液に酸素を飽和量まで加え
ると、キセノンの効果は、８５％の阻害から５０％の阻
害まで変化した。

【０１８１】アルゴン飽和溶液に対して上述したように
酸素を加えると、アルゴンの効果は８２％の阻害から１
２％の阻害まで変化する。

【０１８２】窒素飽和溶液に対して上述したように酸素
を加えると、窒素の効果は完全になくなり、８４％の阻
害から阻害０％の状態になる。

【０１８３】グルコシダーゼの反応に対して酸素を加え
た場合、酸素の独立した反応について期待されるような
効果は見られない。酸素を加えても、どの希ガスの酵素
に対する作用についても効果が得られないことは、希ガ
スの酵素に対する効果が希ガスの分子の特性に因ること
を重ねて示している。 ガス混合物の実験 希ガスと窒素および酸素の混合物に加え、クリプトンと
キセノンとの混合物、続いてアルゴンと、キセノンおよ
びクリプトンのいずれかとの混合物について、テストを
行った。

【０１８４】抑制VS．エアーコントロールとして表わさ
れるチロシナーゼに対する結果。

【０１８５】 混合物＝ＡＲ中のＸｅの％ 抑制％ ＝Ａｒ中のＫｒの％ 抑制％ ０ −７５ ０ −７５ ０．１ −７２ １．０ −７３ ５．０ −８３ １０．０ −８１ １０．０ −８０ ５０．０ −７８ ５０．０ −７８ １００．０ −８６ １００．０ −７７ 同様の結果がベータグルコシダーゼでも得られた。ここ
で、増強が全ての混合物に対して観測された。そして、
これらは、Ｘｅ、Ｋｒ、又は、Ａｒに対するのと同じ大
きさであり、混合ガスから純粋のガスまでの密接さに依
存している。

【０１８６】プロトコル；ガス混合物 理論： 酵素活性はガス混合物で変化するであろう。 ガス混合物： １． Ａｒ／Ｘｅ ２． Ａｒ／Ｋｒ ３． ０．１％ ４． １．０％ ５． ５．０％ ６． １０．０％ ７． ５０．０％ 酵素： チロシナーゼ（シグマＮｏ．Ｔ−７７５５） （モノフェノールモノオキシゲナーゼ；ポリフェノール
オキシダーゼ；カテコールキシダーゼ；オキシジンオキ
シドリダクターゼ；ＥＣ １．１４．１８．１） マッシュルームより チロシナーゼ単位の定義 １単位は、Ｌ−チロシンを含む反応混合物３ｍＬ中、２
５℃、ｐＨ６．５で１分当たり０−００１のＡ280 の増
加を起こすであろう。

【０１８７】チロシナーゼ活性：３８７０ U/mg 固体 ７．１mg 固体＝＝＞２７，４４０単位 ０℃以下で乾燥して保存した。

【０１８８】ロット＃８ＯＨ９６１５ 基質： Ｌ−チロシン（シグマＮｏ．Ｔ−３７５４） Ｌ−３−［４−ヒドロキシフェニル］アラニン フリー塩基（ｐｆｓ）結晶性 無水 分子量１８１．２ 室温（２５℃）で保存 ロット＃５９Ｆ−０４７８ 酵素： β−Ｄ−グルコシダーゼ（シグマＮｏ．Ｇ−４
５１１） エマルジン；β−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ
ＥＣ ３．２．１．２１） アーモンドより 単位の定義：１単位は３７℃、ｐＨ５で１分当たりサリ
シンから１μmol のグルコースを遊離するであろう。

【０１８９】活性：２２U/mg固体 １２mg個体＝＝＞２６４単位 ０−５℃で、乾燥して保存した。

【０１９０】ロット＃４９Ｆ−４０２１ 基質： ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシ
ド（シグマＮｏ．Ｎ−７００６） 結晶性 ２．４％の溶媒を含む 無水 分子量３０１．３ ０℃以下で保存 ロット＃１２９Ｆ−５０５７ 溶液の調製： 調製：4/15/91 溶液Ａ：リン酸ナトリウム緩衝液 ２
５℃でｐＨ６．６ １L の脱イオン化水 141.96×0.2 ×187.5 ×1/1000=5.3g Na₂ HPO ₄ 119.96×0.2 ×312.5 ×1/1000=7.5g Na₂ HPO ₄ 調製：4/17/91 溶液Ｂ：リン酸ナトリウム緩衝液のチ
ロシナーゼ溶液（２２８U/ml) １L の脱イオン化水 14.2 mg のT-7755を２４０mlのリン酸ナトリウム緩衝液
ｐＨ６．６に希釈した。 調製：4/17/91 溶液Ｃ：リン酸ナトリウム緩衝液の50
μｇ／ｍｌＬ−チロシン溶液（２２８ U/ml) 10 mg のT-3754を２５℃、ｐＨ６．６で２００mlのリン
酸ナトリウム緩衝液に希釈した。 調製：4/10/91 溶液Ｄ：リン酸ナトリウム緩衝液 ２
５℃でｐＨ６．８ ２L の脱イオン化水 2 ×141.96×0.2 ×245 ×1/1000=13.91 g Na₂ HP_O 4 2 ×119.96×0.2 ×255 ×1/1000=12.20 g Na2HPO4 調製：4/15/91 溶液Ｅ：リン酸ナトリウム緩衝液の10
0 μｇ／ｍｌβ−Ｄ−グルコピラノシド溶液 25 mg のT-7006を２５０mlのリン酸ナトリウム緩衝液ｐ
Ｈ６．８（２５℃）に希釈した。 調製：4/17/91 溶液Ｆ：リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ
６．８（２５℃）の100μｇ／ｍｌβ−Ｄ−グルコシダ
ーゼ溶液（2.18単位／ml） 24 mg のG-4511を２４２mlのリン酸ナトリウム緩衝液に
２５℃ｐＨ６．８で希釈した。 方法： 4/17/91 ：溶液を調製、キュベットがガス漏れしないこ
とを確認した後、空気でキュベットを浄化し、キュベッ
トを満たし凍結する。酵素血清バイアルを調製し、ガス
バイアルを調製する。

【０１９１】4/18/91 ：ガス混合物の調製：１２０ｃｃ
の血清バイアルがガスを供給して混合するのに用いられ
る。これらのバイアルは１気圧のアルゴンがバイアル中
に維持されるように吸引して浄化する。バイアルはこの
方法で２０秒間浄化する。バイアルは針を通して開放し
わずかな加圧下に置く。これを１２０ｃｃのアルゴンと
みなす。次にアルゴンの必要量と（Ｘｅ又はＫｒ）と混
合されるガスは３０ｃｃのシリンジと針を用いバイアル
に導入される。

【０１９２】 ％ アルゴン Ｘｅ／Ｋｒ ０．１％ １２０ｃｃ ０．２ｃｃ １．０％ １１８ｃｃ ２．４ｃｃ ５．０％ １０８ｃｃ １２ｃｃ １０％ ９６ｃｃ ２４ｃｃ ５０％ ０ｃｃ １２０ｃｃ トライアル１： 我々は、１つのバイアルのガス混合物
を用い、８×１０ｃｃのバイアル外のガスを用いて酵素
にガスを供給した。我々は第２のバイアルのガス混合物
を用い、８×１０ｃｃのバイアル外のガスを用いてキュ
ベット／基質にガスを供給した。アルゴンとキセノンを
ガスシリンダーから補給した。

【０１９３】 酵素 ガス Ａｒ Ａｒ Ｘｅ Ｘｅ ０．１％Ａｒ／Ｘｅ Ａｒ １．０％Ａｒ／Ｘｅ Ａｒ ５．０％Ａｒ／Ｘｅ Ａｒ 細胞輸送装置： ガス混合物： Ａｒ／Ｘｅ、１回反復 ラン１： 細胞１：Ａｒ 細胞２：Ｘｅ 細胞３：Ａｒ／Ｘｅ ０．１％ 細胞４：Ａｒ／Ｘｅ １．０％ 細胞５：Ａｒ／Ｘｅ ５．０％ （反復１： Ｒ１） ＰＡＲＡＭ：スリット１ スピード１５００ Ａｓａｖｅ Ｙ Ａｐｒｉｎｔ Ｎ ＣＰＲＧ： チロシナーゼ： ２５℃ ３０５ｎｍ ８０Ｐｔｓ ＝＝＝＞２０分ラン １６ｓ ｉｎｔ Ｙ_min ＝０．０ Ｙ_max ＝２．０ Ｂ−グルコシダーゼ： ３５℃ ４００ｎｍ ６０Ｐｔｓ ＝＝＝＞ １５分ラン １６ｓ ｉｎｔ Ｙ_min ＝０．０ Ｙ_max ＝１．５ ブランク： チロシナーゼ： ２ｍＬ溶液Ａ＋
０．５ｍＬ溶液Ｂ β−グルコシダーゼ： ２ｍｌ溶液Ｅ＋０．５ｍＬ溶液
Ｄ サンプル： チロシナーゼ： ２ｍｌ溶液Ｃ＋
０．５ｍｌ溶液Ｂ β−グルコシダーゼ： ２ｍｌ溶液Ｅ＋０．５ｍｌ溶液
Ｆ ファイル： チロシナーゼ：Ｘ９Ｒ１ＧｌＭ１．．．５．ＳＰ グルコシダーゼ：ＸＯＲ１Ｇ１Ｍ１．．．５．ＳＰ トライアル１の結果：我々は、チロシナーゼのラン中
に、空気が混入することを見い出した。そして、同様の
ことがグルコシダーゼの実行に対しても正しいことが推
測された。我々が１のバイアルから８×１０ｃｃのガス
混合物を補給できないことを我々は明確にした。従っ
て、我々は、ガス処理するためのキュベット当たり、２
つのバイアルのガス混合物および、キュベット／バイア
ル当たり１０×１０ｃｃを補給できる酵素当たり２つの
ガス混合物を調製することに決めた。 トライアル２：キュベット当たり２つのバイアルのガス
混合物と、酵素当たり２つのバイアルのガス混合物を用
いて第二のランにガスを供給した。次に、最後の２つの
ガス混合物（１０％と５０％）を供給し続けた。

【０１９４】ガス混合物： Ａｒ／Ｘｅ、１回反復 細胞輸送装置： ラン２： 細胞１：Ａｒ 細胞２：Ｘｅ 細胞３：Ａｒ／Ｘｅ １０．０％ 細胞４：Ａｒ／Ｘｅ ５０．０％ 細胞５：空気 （反復１： Ｒ１） ＰＡＲＡＭ：スリット１ スピード１５００ Ａｓａｖｅ Ｙ Ａｐｒｉｎｔ Ｎ ＣＰＲＧ： チロシナーゼ： ２５℃ ３０５ｎｍ ８０Ｐｔｓ ＝＝＝＞２０分ラン １６ｓ ｉｎｔ Ｙ_min ＝０．０ Ｙ_max ＝２．０ Ｂ−グルコシダーゼ： ３５℃ ４００ｎｍ ６０Ｐｔｓ ＝＝＝＞ １５分ラン １６ｓ ｉｎｔ Ｙ_min ＝０．０ Ｙ_max ＝１．５ ブランク： チロシナーゼ： ２ｍＬ溶液Ａ＋
０．５ｍＬ溶液Ｂ β−グルコシダーゼ： ２ｍｌ溶液Ｅ＋０．５ｍｌ溶液
Ｄ サンプル： チロシナーゼ： ２ｍｌ溶液Ｃ＋
０．５ｍｌ溶液Ｂ β−グルコシダーゼ： ２ｍｌ溶液Ｅ＋０．５ｍｌ溶液
Ｆ ファイル： チロシナーゼ：Ｘ９Ｒ１Ｇ１Ｍ６．．．０．ＳＰ グルコシダーゼ：ＸＯＲ１Ｇ１Ｍ６．．．０．ＳＰ トライアル２の結果：チロシナーゼは予期したような分
離を与えた。従って、我々は、新しいガスの供給法が適
当であると仮定し、この方法でガスを供給し続けた。グ
ルコシダーゼは、大きな分離を示さなかった。従って、
時間制限により、我々は、１０％から５０％のガス混合
物を特別にチロシナーゼに集中した。

【０１９５】ラン３： 細胞１：Ａｒ 細胞２：Ｘｅ 細胞３：Ａｒ／Ｘｅ １０．０％ 細胞４：Ａｒ／Ｘｅ ５０．０％ 細胞５：空気 （反復２： Ｒ２） ファイル： チロシナーゼ：Ｘ９Ｒ２Ｇ１Ｍ６．．．０．ＳＰ 上述したようにＡｒ／Ｘｅ混合物を調製し、１０％と５
０％混合物で２回の反復を行った。

【０１９６】ラン４／５： 細胞１：Ａｒ 細胞２：Ｋｒ 細胞３：Ａｒ／Ｋｒ １０．０％ 細胞４：Ａｒ／Ｋｒ ５０．０％ 細胞５：空気 （反復１、２： Ｒ１、Ｒ２） ファイル： チロシナーゼ：Ｘ９Ｒ１Ｇ２Ｍ６．．．０．ＳＰ Ｘ９Ｒ２Ｇ２Ｍ６．．．０．ＳＰ 結果：Ａｒ／Ｘｅでの結果は、我々がＡｒ／Ｋｒで得た
結果より良いように思われる。我々は１０％および５０
％を用いて両混合物の反復を続ける。時間の許すかぎ
り、我々は０．１％、１％および５％の両ガス混合物を
チロシナーゼについてのみ、このように反復すつもりで
ある。 4/19/91 ：チロシナーゼは一方の分光器でＡｒ／Ｘｅを
２反復し、他の分光器でＡｒ／Ｋｒを反復した。

【０１９７】新しい分光器： ラン１： 細胞１：Ａｒ 細胞２：Ｘｅ 細胞３：Ａｒ／Ｘｅ １０．０％ 細胞４：Ａｒ／Ｘｅ ５０．０％ 細胞５：空気 （反復３： Ｒ３） ラン２： 細胞１：Ａｒ 細胞２：Ｘｅ 細胞３：Ａｒ／Ｘｅ １０．０％ 細胞４：Ａｒ／Ｘｅ ５０．０％ 細胞５：空気 （反復４： Ｒ４） 古いスペクトル： ラン１： 細胞１：Ａｒ 細胞２：Ｘｅ 細胞３：Ａｒ／Ｘｅ １０．０％ 細胞４：Ａｒ／Ｘｅ ５０．０％ 細胞５：空気 （反復３： Ｒ３） ラン２： 細胞１：Ａｒ 細胞２：Ｘｅ 細胞３：Ａｒ／Ｘｅ １０．０％ 細胞４：Ａｒ／Ｘｅ ５０．０％ 細胞５：空気 （反復４： Ｒ４） ＰＡＲＡＭ：スリット１ スピード１５００ Ａｓａｖｅ Ｙ Ａｐｒｉｎｔ Ｎ ＣＰＲＧ： チロシナーゼ： ２５℃ ３０５ｎｍ ８０Ｐｔｓ ＝＝＝＞２０分ラン １６秒間隔 Ｙ_min ＝０．０ Ｙ_max ＝２．０ ブランク： チロシナーゼ： ２ｍＬ溶液Ａ＋
０．５ｍＬ溶液Ｂ サンプル： チロシナーゼ： ２ｍｌ溶液Ｃ＋
０．５ｍｌ溶液Ｂ ファイル： Ａｒ／Ｘｅ： Ｘ９Ｒ３Ｇ１Ｍ６．．．０．ＳＰ Ｘ９Ｒ４Ｇ１Ｍ６．．．０．ＳＰ −−−−−−−−−−−−−−− １０ファイル Ａｒ／Ｋｒ： Ｘ９Ｒ３Ｇ２Ｍ６．．．０．ＳＰ Ｘ９Ｒ４Ｇ２Ｍ６．．．０．ＳＰ −−−−−−−−−−−−−−− １０ファイル 時間の許す限り：我々は以下をランできたのみであっ
た。

【０１９８】新しい分光器： ラン３： 細胞１：Ａｒ 細胞２：Ｘｅ 細胞３：Ａｒ／Ｘｅ ０．１％ 細胞４：Ａｒ／Ｘｅ １．０％ 細胞５：Ａｒ／Ｘｅ ５．０％ （反復２： Ｒ２） ラン４： 細胞１：Ａｒ 細胞２：Ｘｅ 細胞３：Ａｒ／Ｘｅ ０．１％ 細胞４：Ａｒ／Ｘｅ １．０％ 細胞５：Ａｒ／Ｘｅ ５．０％ （反復３： Ｒ３） ファイル： Ａｒ／Ｘｅ： Ｘ９Ｒ２Ｇ１Ｍ１．．．５．ＳＰ Ｘ９Ｒ３Ｇ１Ｍ１．．．５．ＳＰ −−−−−−−−−−−−−−− １０ファイル 従って、本発明は一般に、一以上の貴ガスまたはそれら
の混合物を含むガスに、一以上の酵素を接触させること
によって、酵素活性を調節する方法を提供する。

【０１９９】本発明に従えば、調節された酵素は、単一
な酵素、単離された酵素、または、複数の酵素からなる
混合物であり得る。例えば、本発明に従えば、酵素の混
合物は一以上の酵素の活性を選択的に抑制し、一以上の
酵素の活性を増強することによって調節することができ
る。

【０２００】更に、酵素の活性は、本発明に従えば、液
体窒素の沸点（約−２００℃）から約１２０℃の温度範
囲で調節することができる。

【０２０１】本発明に従えば、どの酵素もこの貴ガスを
用いて調節することができる。しかし、ｐＨ、温度、圧
力、［Ｅ］および［Ｓ］の条件を適切に選ぶことによっ
て、本発明の全ての貴ガスで全ての酵素を選択的に抑制
することができる。更に、本明細書の開示及びガイドラ
インを利用することによって、興味ある独特な酵素シス
テムまたは混合酵素システムの何に対しても、ｐＨ、温
度、圧力、［Ｅ］および［Ｓ］を最適なレベルに決定す
ることは、当業者の技術範囲である。

【０２０２】次に、この明細書の図面について、より詳
細に説明する。

【０２０３】図１は、ｐＨ６．８５での、チロシナーゼ
２．５ｍｌ（１００μｇ／ｍｌ）対リン酸ナトリウム緩
衝液２．５ｍｌの吸光スペクトルを示している。

【０２０４】図２は、ｐＨ６．８５での、Ｌ−チロシン
２．５ｍｌ（１００μｇ／ｍｌ）対リン酸ナトリウム緩
衝液２．５ｍｌの吸光スペクトルを示している。

【０２０５】図３は、指示された濃度及びｐＨでの、チ
ロシシナーゼ及びＬ−チロシンを省いたＬ−チロシンの
吸光スペクトルを示す。

【０２０６】図４は、種々の濃度のチロシナーゼ（４
０，６０，８０及び１００μｇ／μｌ）との反応ランの
結果を重ね合わせ示したもので、直接的な線型一次チロ
シナーゼ依存性を示している。

【０２０７】図５は、指示された濃度およびｐＨを用い
た、等量のキセノン（ｗ／ｗ）によるチロシナーゼの阻
害を示している。

【０２０８】図６は、２６℃でのキセノンによるチロシ
ナーゼの極めて大きい阻害を示しており、大略次のよう
に見積もられている；面積空気ラン曲線＝11217 μ，キ
セノン＝3037μ，トータル＝14254 μ，％トータル面積
空気＝78.69 ％，キセノン＝21.31 ，キセノントータル
面積＝空気面積の27.08 ％，キセノンによる空気速度の
阻害＝72.92 ％。この阻害の比率は他の通常の酵素阻害
剤に比較して著しく大きい。

【０２０９】図７は、次のことを示している。即ち、１
５℃において、アルゴンはチロシナーゼ−Ｌ−チロシン
反応の平衡を僅かに阻害するにすぎず、キセノンは小さ
いが顕著な阻害効果を示し、またネオン及びクリプトン
は強い効果を示す。酸素および空気は略同様な効果を示
す。

【０２１０】図８は、次のことを示している。即ち、２
０℃において、キセノンはチロシナーゼ−Ｌ−チロシン
反応を極めて強く阻害する一方、他のガスであるキセノ
ン及びアルゴンは全て効果的な阻害剤である。

【０２１１】図９は、酸素がチロシナーゼ−Ｌ−チロシ
ン反応に対して温和な阻害効果しかもたないことを示し
ている。

【０２１２】図１０は、２０℃における、チロシナーゼ
−Ｌ−チロシン反応のアルゴンによる強い阻害を示し、
またクリプトンも略同様の効果を有することを示してい
る。しかし、示された他のガスもまた効果的な阻害剤で
ある。

【０２１３】図１１は、酸素が、２５℃のチロシナーゼ
−Ｌ−チロシン反応に対して僅かな阻害効果しかもたな
いことを示している。

【０２１４】図１２は、３０℃でのチロシナーゼ活性に
対する、ネオン、アルゴン、クリプトン及びキセノンの
阻害効果を示している。

【０２１５】図１３は、３０℃でのチロシナーゼ活性に
対する酸素の阻害効果を示している。

【０２１６】図１４は、直接的に酸素溶解度の差に帰結
する速度変化を示す、空気中でのチロシナーゼ−Ｌ−チ
ロシン標準反応ランを示している。空気の代わりに酸素
を用いて得られる曲線は同一である。

【０２１７】図１５は、温度依存性であるネオンを用い
た阻害効果を示している。

【０２１８】図１６は、クリプトンのチロシナーゼ阻害
能力と温度との間の、直接的な逆の（負の）関係を示し
ている。

【０２１９】図１７は、キセノンが他のガスよりも良好
に、チロシナーゼ−Ｌ−チロシン反応の平行を阻害する
ことを示している。ｂｙｔはクリプトン及びアルゴンと
同様、この反応の速度のみを減少させる。更に、曲線形
状は高度に変化し、これは不思議にもチロシネートとの
直接的な活性部位相互作用を示唆する。キセノンは温度
と逆に相互作用し、２０℃と２５℃の間に効果の動的遷
移を有する。

【０２２０】図１８は、２０℃において、アルゴン、キ
セノン及びネオンが全て劇的にチロシナーゼ活性を阻害
するのに対して、クリプトンの効果は少ないことを示し
ている。窒素もまた、該反応を極めて良く阻害するが、
酸素は少ない効果しか示さない。

【０２２１】図１９は、２５℃において、アルゴン及び
窒素が他の希ガスよりも低レベルで阻害するのに対し、
酸素は反応を増大させることを示している。クリプトン
−キセノン曲線対とネオン−アルゴン曲線対との間の曲
線形状の小さな差は、相対的に良く似たファン・デル・
ワールス排斥および酸素稀釈の効果によるものである。

【０２２２】図２０は、３０℃において、酸素は溶解度
が低下するため、もはやチロシナーゼ活性を増大しない
ことを示している。他のガスも全て効果的ではあるが、
キセノンは他のガスよりも極めて良好に反応を阻害す
る。

【０２２３】図２１は、２０℃と２５℃の間で活性遷移
が起こる、ネオンによるチロシナーゼ活性の阻害を示し
ている。

【０２２４】図２２は、アルゴンによるチロシナーゼ活
性の阻害を示しており、これは２０℃におけるアルゴン
による阻害はネオンによる阻害よりも良好であるが、２
５℃での阻害はネオンよりも小さいことを示す。これら
の差は、溶解度／酸素拡散能に直接帰結すると思われ
る。

【０２２５】図２３は、２０℃と２５℃の間で活性遷移
が起こる、クリプトンによるチロシナーゼ活性の阻害を
示している。これは、ガスと酵素活性部位との間に直接
の相互作用があることの強力な証拠を与える。

【０２２６】図２４は、キセノンによるチロシナーゼ活
性の阻害において、少なくとも二つの活性遷移が存在す
ることを示している。第一の活性遷移は２５℃と３０℃
の間にあり、第二の活性遷移は３０℃と３５℃の間にあ
る。２０℃と２５℃の間に、第三の活性遷移が存在する
かもしれない。これらの遷移は、ガスと酵素活性部位都
の間に直接の相互作用が存在することの強力な証拠を提
供する。

【０２２７】図２５は、純粋に、酸素を溶液から置換す
ることを含む溶解度メカニズムによるチロシナーゼの阻
害を示している。空気は、期待された溶解（駆動された
速度パターン）を示す一方、酸素は３０℃で飽和する。

【０２２８】図２６は、窒素によるチロシナーゼ活性の
阻害を示している。窒素は、酸素を溶液から置換するこ
とを含む溶解度メカニズムによってのみ酵素を阻害する
ことができるが、チロシナーゼ活性の阻害においては効
果的である。遷移極大は２０℃の後に観察される。窒素
曲線と希ガス曲線との間の相違は、潜在的な活性部位阻
害を表している。殆どの場合において、これらの相違
は、夫々のガスについて少なくとも一つの温度で顕著で
ある。

【０２２９】図２７は、２０℃と２５℃の間のキセノン
活性における大きな相違を示している。これは、酵素活
性部位光学温度(enzyme active site optical temperat
ure)に対応している。

【０２３０】図２８は、クリプトン、キセノン、アルゴ
ン、窒素およびネオンによるグルコースオキシダーゼの
阻害を示している。

【０２３１】図２９は、クリプトン、キセノン、アルゴ
ン、並びにクリプトン及びキセノン混合物による、α−
グルタミルトランスペプチダーゼの阻害を示している。

【０２３２】図３０は、クリプトン、キセノン、アルゴ
ン、並びにクリプトン及びキセノン混合物による、アス
パルテート・アミノトランスフェラーゼの阻害を示して
いる。

【０２３３】図３１は、ＳＦ₆ 、アルゴン、窒素、ネオ
ン及び酸素によるα−Ｄ−グルコシダーゼの阻害を示し
ている。

【０２３４】図３２は、ネオン、酸素および窒素によ
る、フェニルアラニン・アンモニア−ライゼートの増強
を示している。

【０２３５】図３３は、キセノン及びクリプトンによる
サイトレートシンターゼの増強、並びにアルゴンによる
その阻害を示している。

【０２３６】図３４は、１０℃における、キセノン、ク
リプトン、アルゴン、並びにクリプトン及びキセノン混
合物によるホスホグルコースイソメラーゼの増強を示し
ている。

【０２３７】図３５は、２５℃における、ネオン及び窒
素によるホスホグルコースイソメラーゼの増強、および
酸素によるその阻害理論を示している。

【０２３８】図３６は、２５℃における、クリプトン、
並びにクリプトン及びキセノン混合物によるＳ−アセチ
ルＣｏＡシンセターゼの増強を示している。

【０２３９】図３７は、１００気圧での、β−グルコシ
ダーゼに対する空気および窒素の阻害効果を示してい
る。この効果は、単に、高圧による酵素の損傷によるも
のである。

【０２４０】図３８は、３０気圧での、β−グルコシダ
ーゼに対する空気および窒素の阻害効果を示している。
この効果は、単に、高圧による酵素の損傷によるもので
ある。

【０２４１】図３９は、３０気圧での、チロシナーゼ活
性に対する空気、キセノンおよび窒素の阻害効果を示し
ている。この効果は、高圧による酵素の損傷によるもの
である。

【０２４２】図４０は、１００気圧での、チロシナーゼ
に対する空気、キセノン及び窒素の阻害効果を示してい
る。この効果は、高圧による酵素の損傷によるものであ
る。

【０２４３】図４１は、β−Ｄ−グルコシダーゼ活性に
ついて例示したように、酵素−基質濃度が希ガスによる
増強または阻害の結果に影響することを示している。Ｓ
1 ，Ｓ2 及びＳ3 は、増大する三つの異なった基質濃度
を表している。この結果は、酵素および／または基質の
コストを低減し、或いは現在は不可能である反応に適合
するように現在のバイオ技術プロセスを変形し得ること
を意味するから、有利である。

【０２４４】図４２は、例えば１０℃においてラクテー
トデヒドロゲナーゼを増強し、次いで阻害するキセノン
及びネオンの夫々異なった効果を示している。これは、
選択されるガスに応じて、所定の酵素を増強または阻害
し得ることを意味するので、有利である。

【０２４５】図４３は、高温でも、本発明の効果が観察
されることを示している。明らかに、６０℃において、
α−グルコシダーゼ活性はアルゴン、窒素およびキセノ
ンによって増強され、クリプトンによって阻害される。
明瞭なように、この酵素に関して、アルゴンは６０℃に
おける強力な増強剤である。

【０２４６】図４４は、２５℃において、固定化形態の
β−グルコイシダーゼの酵素活性を増大させるキセノン
の効果を示している。

【０２４７】上記のように、本発明に従えば、酵素活性
は液体窒素温度（約−２００℃）の低温から約１２０℃
の広範な温度領域に亘って調節され得る。更に、使用さ
れるガスまたはガス混合物の圧力は、約１０^-8大気圧の
超高真空のような低圧から約１００大気圧までの間であ
る。しかし、もっと低い圧力または高い圧力を用いるの
が望ましいかもしれない。しかしながら、一般的には、
約１０^-3〜約３大気圧のガス圧力が用いられ、約１０-2
〜約２大気圧のガス圧力が最も普通に用いられる。

【０２４８】上記のように、本発明は選択される酵素お
よび酵素の形態に拘らず、有効である。以下の例は、固
定化酵素の酵素活性の調節における本発明の有効性を例
示するために与えられる。

【０２４９】プロトコール：固定化酵素 理論 ：遊離の又は固定化された酵素の何れに対
しても、同じガスが奏効する。

【０２５０】ガス ：１．空気 ２．キセノン 酵素 ：カルドセルム・サッカロリチクム：E.co
li中で発現されたリコンビナント（ｐｆｓ）からの β−Ｄ−グルコシダーゼ（SIGMA 社，No.G-0898 ） β−Ｄ−グルコシド・グルコヒドロラーゼ（EC 3.2.1.2
1 ） 凍結乾燥粉末 ７０℃で３８時間の半減期を有する熱安定性酵素 単位定義：１単位は、37℃且つｐＨ5.0 において、サリ
シン(salicin)から１分当り１．０μmol のグルコース
を放出する。

【０２５１】活性：４６Ｕ／ｇ固体 10.87ｇ固体→ 500単位 ０〜５℃で乾燥して保存した。

【０２５２】Ｌｏｔ＃ 50H0251 基質 ：ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピ
ラノシド (SIGMA No.N-7006) 結晶 ２．４％の溶媒を含む 無水、分子量 301.3 ０℃未満で乾燥して保存 Ｌｏｔ＃ 129F-5057 溶液調製 ： 調製 ：５／２１／９１ 溶液Ａ：リン酸ナトリウム緩衝液、２５℃でのｐＨ６．
６ １Ｔ．脱イオン水 141.96×0.2 ×187.5 ×1/1000＝ 5.3ｇ Ｎａ₂ ＨＰＯ
₄ 119.96×0.2 ×321.5 ×1/1000＝ 7.5ｇ Ｎａ₂ ＨＰＯ
₄ 調製 ：５／２１／９１ 溶液Ｂ： Na Phos. 緩衝液中の 100μｇ／mL β−Ｄ−
グルコピラノシド溶液 ２５℃、ｐＨ６．６の250mL Na Phos.緩衝液に稀釈され
た２５mg N-7007 調製 ：５／２１／９１ 溶液Ｃ１：ｐＨ６．６の Na Phos. 緩衝液中（２５℃）
中のβ−Ｄ−グルコシダーゼ溶液（2.18単位／mL） ２５℃でｐＨ６．６の Na Phos. 緩衝液 21 ml中に可溶
化された１ｇ Ｇ-0898（不溶性酵素の凍結乾燥粉末の
ために、SIGMA は、必要な量を５−１０mg固体／mLＨ₂
Ｏに懸濁させ、簡単な水和を行わせることを推奨してい
る）。

【０２５３】我々は簡単な水和（溶液が出現するまで）
を行った。

【０２５４】４００ｎｍ ８０部 → １６ｓ ｉｎｔ Ｙ_min ＝0.0 Ｙ_max ＝3.0 ブランク ：２mL溶液Ａ＋0.5 mL溶液Ｃ１ サンプル ：２mL溶液Ｂ＋0.5 mL溶液Ｃ１ ファイルズ ：Ｇ0898Ｇ1...4.ＳＰ ＊トライアル２： ５／２２／９１ セル輸送機 ：反復２回 ラン： セル１：空気 セル２：空気（反復） セル３：Ｘｅ セル４：Ｘｅ（反復） ＰＡＲＡＭ ：スリット１ 速度１５００ Ａｓａｖｅ Ｙ Ａｐｒｉｎｔ Ｎ ＣＰＲＧ ：β−グルコシダーゼ：２５℃ ４００ｎｍ １２０部 → １６ｓ ｉｎｔ Ｙ_min ＝0.0 Ｙ_max ＝1.0 ブランク ：２mL溶液Ａ＋0.5 mL溶液Ｃ２ サンプル ：２mL溶液Ｂ＋0.5 mL溶液Ｃ２ ファイルズ ：２Ｇ0898Ｇ1...4.ＳＰ 更に、本発明、及びそれにより得られた効果を例示する
ために速度論的解析を行った。

【０２５５】速度論的解析 以前に例示した吸光度曲線のデータは、収量及び速度の
両見地から、異なるガス雰囲気下での酵素活性の相違を
示している。収量は、平衡に達した後、比較曲線の差に
よって、及び正式な線形化及び計算を通して計算され
る。これらはまた速度計算にも必要である。速度の差は
商業的に入手可能なコンピュータープログラムを用いて
計算される（ＥＮＺＦＩＴＴＥＲ，ＧＲＡＦＩＴ，ＥＮ
ＺＰＡＣＫ，ＰＥＡＫＦＩＴ）。これは、初期のｕｖ／
ｖｉｓ吸光度データ曲線（これらの例においては検出力
曲線）を直線（検出力曲線の線形回帰）に変換するもの
である。これらの線は、その勾配が概算的に速度であ
り、Ｙ−切片が概算的に収量である数式として表わして
もよい。これらのデータは、ミカエリスメンテン或いは
他の標準的な生化学的相関（グラフによって或いは数学
的に表される）を引き出すために処理されてもよく、そ
こから速度及び収量を正確に引き出すことができる。

【０２５６】図４５は、５つの異なる基質濃度における
エアの下でのβ−グルコシダーゼに対するｕｖ／ｖｉｓ
吸光度検出力曲線を示している。

【０２５７】表１は、Ｖｍａｘ及びＫｍのミカエリスメ
ンテン酵素速度論的計算、及び各反応速度を示してい
る。Ｖｍａｘは限界速度、Ｋｍはミカエリスメンテン定
数である。

【０２５８】図４６及び表２は図４５及び表１と同様で
あるが、キセノンの反応に対するものを示している。キ
セノンに対するＶｍａｘ及びＫｍの方が大きいことが容
易に明らかである。

【０２５９】図４７、表３、図４８及び表４は上記エア
及びキセノンガスの反応に対する検出力曲線の速度につ
いての線形回帰一次変換を示しており、Ｘｅ／エア速度
相関が上記と同じ比率であるミカエリスメンテンデータ
に対する近似値を示している。

【０２６０】図４９、図５０及び表５はこのランで研究
されたすべてのガスに対する、同様の速度近似一次線形
回帰を示している。この場合、検出力曲線解析におい
て、キセノンのみが重要な増強を示しているが、線形化
は明らかに他のガスが反応を増強することを示してい
る。

【０２６１】図５１、表６、図５２、及び表７は、エア
及びキセノンガスに対する検出力曲線として表された１
のチロシナーゼの実験の最初の１６０秒のデータを示し
ている。線形化された速度の回帰は、キセノンがチロシ
ナーゼ活性を強力に阻害することを示しており、示され
たミカエリスメンテンの計算は、これを実証している。

【０２６２】

【表１】 残りのデータセットは、上に示したように図面にグラフ
として表されている。

【０２６３】

【表２】

【０２６４】

【表３】

【０２６５】

【表４】

【０２６６】

【表５】

【０２６７】

【表６】

【０２６８】

【表７】 このように、本発明はいずれの酵素の酵素活性も、いず
れかの形で制御する方法を提供する。更にこの制御は、
広範な温度及び示された圧力範囲に渡って生じ得るもの
である。

【０２６９】前述したように、本発明の制御された１以
上の酵素は、例えば、水溶性又は有機性溶液、固定化さ
れて、分散されて、或いはゲル等のいずれかのタイプの
有機マトリックスであってもよい。このような溶液、固
定化された酵素、分散液、或いは有機マトリックスは当
業者に既知のものである。

【０２７０】更に、本発明によれば、酵素の混合物は、
その中に含まれる１或いはそれ以上の酵素を阻害するこ
とによって、或いはその中に含まれる１或いはそれ以上
の酵素を増強することによって制御してもよい。また、
混合物中の１またはそれ以上の酵素を阻害し、かつその
中に含まれる１又はそれ以上の他の酵素を増強すること
によって制御することも可能である。

【０２７１】更に、関心のあるいずれかの特定の酵素シ
ステム或いは混合酵素システムに対して、ｐＨ、温度、
圧力、［Ｅ］及び［Ｓ］の最適なレベルを決定するため
に、上記の本開示及びガイドラインを利用することは、
当該分野においてよく知られている。

【０２７２】例えば、酵素を購入したときに、関心のあ
るいずれかの特定の酵素システム或いは混合酵素システ
ムに対して、ｐＨ、温度、圧力、［Ｅ］及び［Ｓ］の最
適な状態を、よく知られた参考マニュアルを用いること
によって確かめることができる。例えばシグマケミカル
カンパニーの１９９０及び１９９１のカタログ及び、Ｄ
ｉｘｏｎ及びＷｅｂｂによるＥｎｚｙｍｅｓ、第３版
（Ｗｉｌｅｙ、１９７９）を見てみよう。この文献か
ら、当業者は本開示を用いることにより、本発明による
所望の効果を得るために、ガスの最適混合物、温度及び
圧力を確かめることができる。

【０２７３】本発明の記載に関して、本発明の意図及び
範囲を逸脱することなく、上記例に対して多くの変化及
び変形がなされ得ることは当業者において明らかであ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】チロシナ−ゼの吸収スペクトルを示す図。

【図２】Ｌ−チロシンの吸収スペクトルを示す図。

【図３】Ｌ−チロシンをブランクとしたチロシナ−ゼお
よびＬ−チロシンの吸収スペクトルを示す図。

【図４】チロシナ−ゼの濃度を変えて行なった反応の結
果のオ−バ−レイを示す図であり、各結果は直接線形１
次チロシナ−ゼ濃度依存を示す図。

【図５】等Ｗ／Ｗでのキセノンによるチロシナ−ゼの抑
制を示す図。

【図６】26℃でのキセノンによるチロシナ−ゼの非常に
大きい抑制を示す図。

【図７】15℃でアルゴンがチロシナ−ゼ- L-チロシン反
応の平衡をわずかに抑制し、キセノンは小さくはあるが
有意の抑制効果を有し、ネオンおよびクリプトンは大き
な抑制効果を表わすことを示す図。

【図８】20℃での、チロシナ−ゼ- L-チロシン反応に対
するキセノン、クリプトン、ネオンおよびアルゴンの抑
制効果を示す図。

【図９】酸素が、20℃で、チロシナ−ゼ- L-チロシン反
応に対する増強効果を有していないことを示す図。

【図１０】25℃での、チロシナ−ゼ- L-チロシン反応に
対するネオン、アルゴン、クリプトンおよびキセノンの
抑制効果を示す図。

【図１１】酸素が、25℃で、チロシナ−ゼ- L-チロシン
反応に対する増強効果を有していないことを示す図。

【図１２】30℃での、チロシナ−ゼ- L-チロシン反応に
対するネオン、アルゴン、クリプトンおよびキセノンの
抑制効果を示す図。

【図１３】酸素が、30℃で、チロシナ−ゼ- L-チロシン
反応に対する増強効果を有していないことを示す図。

【図１４】空気中における種々の温度での標準実行を示
し、速度変化が直接酸素溶解度の差異に起因することを
示す図。

【図１５】明確な温度依存性を示す、チロシナ−ゼ- L-
チロシンに対するネオンの抑制効果を示す図。

【図１６】クリプトンのチロシナ−ゼ抑制能と温度との
間の直接的逆（否定的）関係を示す図。

【図１７】温度とは逆に相互作用する、ネオンによるチ
ロシナ−ゼ- L-チロシンの平衡の抑制を示す図。

【図１８】20℃において、アルゴン、キセノンおよびネ
オンの各々がチロシナ−ゼ- L-チロシン反応を劇的に抑
制するのに対して、酸素は反応を増強しないことを示
し、クリプトンは窒素よりも小さい抑制効果を有するこ
とを示す図。

【図１９】25℃において、アルゴンおよび窒素は希ガス
よりも少ない程度にチロシナ−ゼ- L-チロシンを抑制
し、酸素は反応を増強することを示す図。

【図２０】30℃においては、溶解度の減少のために、酸
素がもはやチロシナ−ゼ- L-チロシン反応を抑制しない
ことを示す図。

【図２１】種々の温度における、ネオンによるチロシナ
−ゼ- L-チロシン反応の抑制を示し、20℃および25℃の
間での移行を示す図。

【図２２】種々の温度における、アルゴンによるチロシ
ナ−ゼ- L-チロシン反応の抑制を示す図。

【図２３】種々の温度における、クリプトンによるチロ
シナ−ゼ- L-チロシン反応の抑制を示す図。

【図２４】種々の温度における、キセノンによるチロシ
ナ−ゼ- L-チロシン反応の抑制を示す図。

【図２５】純粋に、溶液からの酸素の除去を含む溶解度
機構によるチロシナ−ゼ- L-チロシン反応の抑制を示す
図。

【図２６】窒素によるチロシナ−ゼ活性の抑制を示す
図。

【図２７】20℃と25℃との間でのキセノン活性の大きな
差異を示す図。

【図２８】クリプトン、キセノン、アルゴン、窒素およ
びネオンによるグルコ−スオキシダ−ゼの抑制を示す
図。

【図２９】クリプトン、キセノン、アルゴンおよびケト
ンとキセノンとの混合物による、α- グルタミルトラン
スペプチタ−ゼの抑制を示す図。

【図３０】クリプトン、キセノン、アルゴンおよびクリ
プトンとキセノンとの混合物によるアスパルテ−トアミ
ノトランスフェラ−ゼの抑制を示す図。

【図３１】窒素、ネオンおよび酸素によるα-D- グルコ
シダ−ゼの増強を示す図。

【図３２】ネオン、酸素および窒素によるフェニルアラ
ニンアンモニアリア−ゼの増強を示す図。

【図３３】キセノンおよびクリプトンによるクエン酸シ
ンセタ−ゼの増強、並びにアルゴンによるそれらの抑制
を示す図。

【図３４】10℃での、キセノン、クリプトン、アルゴン
およびクリプトンとキセノンとの混合物によるホスホグ
ルコ−スイソメラ−ゼの増強を示す図。

【図３５】25℃での、ネオンおよび窒素によるホスホグ
ルコ−ズイソメラ−ゼの増強、並びに酸素によるそれら
の抑制を示す図。

【図３６】25℃での、クリプトンおよびクリプトンとキ
セノンとの混合物によるＳ- アセチルＣｏＡシンセタ−
ゼの増強を示す図。

【図３７】100気圧、25℃での、β- グルコシダ−ゼに
対する空気および窒素の抑制効果を示す図。

【図３８】30気圧における、β- グルコシダ−ゼに対す
る空気および窒素の抑制効果を示す図。

【図３９】30気圧における、β- グルコシダ−ゼに対す
る空気、キセノンおよび窒素の抑制効果を示す図。

【図４０】100気圧における、チロシナ−ゼに対する空
気、キセノンおよび窒素の抑制効果を示す図。

【図４１】酵素- 基質濃度が希ガス増強／抑制の結果に
影響を与えることを示す図。

【図４２】例えば、10℃で、各々ラクテ−トデヒドロゲ
ナ−ゼを増強し、次いで抑制する、キセノンとネオンと
の異なる効果を示す図。

【図４３】例え60℃であっても、希ガスが酵素に対する
増強もしくは抑制効果を表わすことを示す図。

【図４４】固相形態にあるβ- グルコシダ−ゼの増強に
おけるキセノンの効果を示す図。

【図４５】５種の異なる基質濃度における、空気存在下
での、β- グルコシダ−ゼに対するＵＶ／ＶＩＳ吸光度
出力曲線を示す図。

【図４６】５種の異なる基質濃度における、キセノン存
在下での、β- グルコシダ−ゼに対するＵＶ／ＶＩＳ吸
光度出力曲線を示す図。

【図４７】β- グルコシダ−ゼ -空気供給反応の１次出
力曲線回帰速度線形変換（first-order power curve re
gression rate linear transformation ）を示す図。

【図４８】β- グルコシダ−ゼ -キセノン供給反応の１
次出力曲線回帰速度線形変換を示す図。

【図４９】この実行において研究された全てのガスに対
する１次速度近似回帰線形化（first-order rate appro
ximation regression linearization ）を示す図。

【図５０】この実行において研究された全てのガスに対
する１次速度近似回帰線形化を示す図。

【図５１】空気供給に対する出力曲線として表現される
チロシナ−ゼ単一の実験における最初の 160秒のデ−タ
を示す図。

【図５２】キセノン供給に対する出力曲線として表現さ
れるチロシナ−ゼ単一の実験における最初の 160秒のデ
−タを示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 パスカル・シュベステ アメリカ合衆国、イリノイ州 60614、シ カゴ、エヌ・ララビー 1820 (72)発明者 クリスティーヌ・ボワロベール アメリカ合衆国、イリノイ州 60614、シ カゴ、エヌ・デイトン 2145

Claims (61)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 １種もしくはそれ以上の酵素を、１種も
   しくはそれ以上の希ガスまたはそれらの混合物を含むガ
   スと接触させることを包含する酵素活性の調節方法。
2. 【請求項２】 前記ガスが本質的に１種もしくはそれ以
   上の希ガスからなる請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 前記希ガスが、ネオン、アルゴン、クリ
   プトンおよびキセノンからなる群より選ばれる請求項１
   記載の方法。
4. 【請求項４】 １種の単離酵素の調節を前記ガスにより
   行なう請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】 酵素の混合物の調節を行なう請求項１記
   載の方法であって、該混合物中の１種もしくはそれ以上
   の酵素を抑制し、または該混合物中の１種もしくはそれ
   以上の酵素を増強し、または該混合物中の１種もしくは
   それ以上の酵素を抑制し、かつ１種もしくはそれ以上の
   他の酵素を増強することにより調節を行なう方法。
6. 【請求項６】 前記１種もしくはそれ以上の酵素が、溶
   液中、固相形態、分散液中または有機マトリックス中に
   ある請求項１記載の方法。
7. 【請求項７】 １種もしくはそれ以上の酵素を、１種も
   しくはそれ以上の希ガスまたはそれらの混合物を含むガ
   スと接触させることを包含する酵素活性の増強方法。
8. 【請求項８】 前記ガスが本質的に１種もしくはそれ以
   上の希ガスからなる請求項７記載の方法。
9. 【請求項９】 前記希ガスが、ネオン、アルゴン、クリ
   プトンおよびキセノンからなる群より選ばれる請求項７
   記載の方法。
10. 【請求項１０】 １種の単離酵素の調節を前記ガスによ
    り行なう請求項７記載の方法。
11. 【請求項１１】 酵素の混合物において、該混合物中の
    １種もしくはそれ以上の酵素の酵素活性が増強される請
    求項７記載の方法。
12. 【請求項１２】 １種もしくはそれ以上の酵素を、１種
    もしくはそれ以上の希ガスまたはそれらの混合物を含む
    ガスと接触させることを包含する酵素活性の抑制方法。
13. 【請求項１３】 前記ガスが本質的に１種もしくはそれ
    以上の希ガスからなる請求項１２記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記希ガスが、ネオン、アルゴン、ク
    リプトンおよびキセノンからなる群より選ばれる請求項
    １２記載の方法。
15. 【請求項１５】 １種の単離酵素を前記ガスによって抑
    制する請求項１２記載の方法。
16. 【請求項１６】 酵素の混合物において、該混合物中の
    １種もしくはそれ以上の酵素の酵素活性が抑制される請
    求項１５記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記１種もしくはそれ以上の酵素が、
    溶液中、固相形態、分散液中または有機マトリックス中
    にある請求項１５記載の方法。
18. 【請求項１８】 酵素活性を調節する方法であって、１
    種もしくはそれ以上の酵素を、１種もしくはそれ以上の
    希ガスおよびそれらの混合物を含むガスと接触させるこ
    とを包含し、前記１種もしくはそれ以上の希ガスが酵素
    活性抑制因子から酵素活性増強因子へ、または酵素活性
    増強因子から酵素活性抑制因子へ移行するに十分な温度
    範囲にわたって行なう方法。
19. 【請求項１９】 １種もしくはそれ以上のオキシドレダ
    クタ−ゼ類酵素を、１種もしくはそれ以上の希ガスまた
    はそれらの混合物を含むガスと接触させることによるオ
    キシドレダクタ−ゼ類酵素の活性を調節する方法。
20. 【請求項２０】 前記ガスが本質的に１種もしくはそれ
    以上の希ガスまたはそれらの混合物からなる請求項１９
    記載の方法。
21. 【請求項２１】 前記希ガスが、ネオン、アルゴン、ク
    リプトンおよびキセノンからなる群より選ばれる請求項
    １９記載の方法。
22. 【請求項２２】 １種の単離オキシドレダクタ−ゼ類酵
    素が前記ガスにより調節される請求項１９記載の方法。
23. 【請求項２３】 オキシドレダクタ−ゼ類酵素を含有す
    る酵素混合物の調節を行なう請求項１９記載の方法であ
    って、該オキシドレダクタ−ゼ類酵素を抑制することに
    より、該混合物中の１種もしくはそれ以上の他の酵素を
    抑制することにより、あるいは該オキシドレダクタ−ゼ
    類酵素を増強することにより調節を行なう方法。
24. 【請求項２４】 前記１種もしくはそれ以上の酵素が、
    溶液中、固相形態、分散液中、または有機マトリックス
    中にある請求項１９記載の方法。
25. 【請求項２５】 １種もしくはそれ以上のヒドロラ−ゼ
    類酵素を、１種もしくはそれ以上の希ガスまたはそれら
    の混合物を含むガスと接触させることを包含するヒドロ
    ラ−ゼ類酵素の活性を調節する方法。
26. 【請求項２６】 前記ガスが、本質的に１種もしくはそ
    れ以上の希ガスまたはそれらの混合物からなる請求項２
    ５記載の方法。
27. 【請求項２７】 前記希ガスが、ネオン、アルゴン、ク
    リプトンおよびキセノンからなる群より選ばれる請求項
    ２５記載の方法。
28. 【請求項２８】 １種の単離ヒドロラ−ゼ類酵素が前記
    ガスにより調節される請求項２５記載の方法。
29. 【請求項２９】 ヒドロラ−ゼ類酵素を含有する酵素混
    合物の調節を行なう請求項２５記載の方法であって、該
    ヒドロラ−ゼ類酵素を抑制することにより、該混合物中
    の１種もしくはそれ以上の他の酵素を抑制することによ
    り、あるいは該ヒドロラ−ゼ類酵素を増強することによ
    り調節を行なう方法。
30. 【請求項３０】 前記１種もしくはそれ以上の酵素が、
    溶液中、固相形態、分散液中、または有機マトリックス
    中にある請求項２５記載の方法。
31. 【請求項３１】 １種もしくはそれ以上のリア−ゼ類酵
    素を、１種もしくはそれ以上の希ガスまたはそれらの混
    合物を含むガスと接触させることを包含するリア−ゼ類
    酵素の活性を調節する方法。
32. 【請求項３２】 前記ガスが、本質的に１種もしくはそ
    れ以上の希ガスまたはそれらの混合物からなる請求項３
    １記載の方法。
33. 【請求項３３】 前記希ガスが、ネオン、アルゴン、ク
    リプトンおよびキセノンからなる群より選ばれる請求項
    ３１記載の方法。
34. 【請求項３４】 １種の単離リア−ゼ類酵素が前記ガス
    により調節される請求項３１記載の方法。
35. 【請求項３５】 リア−ゼ類酵素を含有する酵素混合物
    の調節を行なう請求項３１記載の方法であって、該リア
    −ゼ類酵素を抑制することにより、該混合物中の１種も
    しくはそれ以上の他の酵素を抑制することにより、ある
    いは該リア−ゼ類酵素を増強することにより調節を行な
    う方法。
36. 【請求項３６】 前記１種もしくはそれ以上の酵素が、
    溶液中、固相形態、分散液中、または有機マトリックス
    中にある請求項３１記載の方法。
37. 【請求項３７】 １種もしくはそれ以上のトランスフェ
    ラ−ゼ類酵素を、１種もしくはそれ以上の希ガスまたは
    それらの混合物を含むガスと接触させることを包含する
    トランスフェラ−ゼ類酵素の活性を調節する方法。
38. 【請求項３８】 前記ガスが、本質的に１種もしくはそ
    れ以上の希ガスまたはそれらの混合物からなる請求項３
    ７記載の方法。
39. 【請求項３９】 前記希ガスが、ネオン、アルゴン、ク
    リプトンおよびキセノンからなる群より選ばれる請求項
    ３７記載の方法。
40. 【請求項４０】 １種の単離トランスフェラ−ゼ類酵素
    が前記ガスにより調節される請求項３７記載の方法。
41. 【請求項４１】 トランスフェラ−ゼ類酵素を含有する
    酵素混合物の調節を行なう請求項３７記載の方法であっ
    て、該トランスフェラ−ゼ類酵素を抑制することによ
    り、該混合物中の１種もしくはそれ以上の他の酵素を抑
    制することにより、あるいは該トランスフェラ−ゼ類酵
    素を増強することにより調節を行なう方法。
42. 【請求項４２】 １種もしくはそれ以上のイソメラ−ゼ
    類酵素を、１種もしくはそれ以上の希ガスまたはそれら
    の混合物を含むガスと接触させることを包含するイソメ
    ラ−ゼ類酵素の活性を調節する方法。
43. 【請求項４３】 前記ガスが、本質的に１種もしくはそ
    れ以上の希ガスまたはそれらの混合物からなる請求項４
    ２記載の方法。
44. 【請求項４４】 前記希ガスが、ネオン、アルゴン、ク
    リプトンおよびキセノンからなる群より選ばれる請求項
    ４２記載の方法。
45. 【請求項４５】 １種の単離イソメラ−ゼ類酵素が前記
    ガスにより調節される請求項４２記載の方法。
46. 【請求項４６】 イソメラ−ゼ類酵素を含有する酵素混
    合物の調節を行なう請求項４２記載の方法であって、該
    イソメラ−ゼ類酵素を抑制することにより、該混合物中
    の１種もしくはそれ以上の他の酵素を抑制することによ
    り、あるいは該イソメラ−ゼ類酵素を増強することによ
    り調節を行なう方法。
47. 【請求項４７】 前記１種もしくはそれ以上の酵素が、
    溶液中、固相形態、分散液中、または有機マトリックス
    中にある請求項４２記載の方法。
48. 【請求項４８】 １種もしくはそれ以上のリガ−ゼ類酵
    素を、１種もしくはそれ以上の希ガスまたはそれらの混
    合物を含むガスと接触させることを包含するリガ−ゼ類
    酵素の活性を調節する方法。
49. 【請求項４９】 前記ガスが、本質的に１種もしくはそ
    れ以上の希ガスまたはそれらの混合物からなる請求項４
    ８記載の方法。
50. 【請求項５０】 前記希ガスが、ネオン、アルゴン、ク
    リプトンおよびキセノンからなる群より選ばれる請求項
    ４８記載の方法。
51. 【請求項５１】 １種の単離リガ−ゼ類酵素が前記ガス
    により調節される請求項４２記載の方法。
52. 【請求項５２】 リガ−ゼ類酵素を含有する酵素混合物
    の調節を行なう請求項４８記載の方法であって、該リガ
    −ゼ類酵素を抑制することにより、該混合物中の１種も
    しくはそれ以上の他の酵素を抑制することにより、ある
    いは該リガ−ゼ類酵素を増強することにより調節を行な
    う方法。
53. 【請求項５３】 酵素反応のための酵素および基質の最
    適相対濃度を移行させる方法であって、１種もしくはそ
    れ以上の酵素を、１種もしくはそれ以上の希ガスまたは
    それらの混合物を含むガスと接触させることを包含する
    方法。
54. 【請求項５４】 前記ガスが、本質的に１種もしくはそ
    れ以上の希ガスまたはそれらの混合物からなる請求項５
    ２記載の方法。
55. 【請求項５５】 前記希ガスが、ネオン、アルゴン、ク
    リプトンおよびキセノンからなる群より選ばれる請求項
    ５２記載の方法。
56. 【請求項５６】 １種もしくはそれ以上の酵素の反応速
    度を調節する方法であって、１種もしくはそれ以上の酵
    素を、１種もしくはそれ以上の希ガスまたはそれらの混
    合物を含むガスと接触させることを包含する方法。
57. 【請求項５７】 前記ガスが、本質的に１種もしくはそ
    れ以上の希ガスからなる請求項５６記載の方法。
58. 【請求項５８】 前記希ガスが、ネオン、アルゴン、ク
    リプトンおよびキセノンからなる群より選ばれる請求項
    ５６記載の方法。
59. 【請求項５９】 １種もしくはそれ以上の酵素の反応速
    度を増大させる方法であって、１種もしくはそれ以上の
    酵素を、１種もしくはそれ以上の希ガスまたはそれらの
    混合物を含むガスと接触させることを包含する方法。
60. 【請求項６０】 前記ガスが、本質的に１種もしくはそ
    れ以上の希ガスからなる請求項５９記載の方法。
61. 【請求項６１】 前記希ガスが、ネオン、アルゴン、ク
    リプトンおよびキセノンからなる群より選ばれる請求項
    ５９記載の方法。