ES2202310T3 - Metodos y materiales para la preparacion de dominios variables de anticuerpos modificados y sus usos terapeuticos. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBEN METODOS PARA IDENTIFICAR LOS RESIDUOS AMINOACIDOS DE UN CAMPO VARIABLE DE ANTICUERPO QUE PUEDE ESTAR MODIFICADO SIN DISMINUIR LA AFINIDAD NATIVA DEL CAMPO PARA ANTIGENO MIENTRAS QUE REDUCE SU INMUNOGENECIDAD RESPECTO DE UNA ESPECIE HETEROLOGA Y PARA PREPARAR CAMPOS VARIABLES DE ANTICUERPO MODIFICADO QUE SON UTILES PARA LA ADMINISTRACION A ESPECIES HETEROLOGAS. TAMBIEN SE DESCRIBEN LAS REGIONES VARIABLES DE ANTICUERPO PREPARADAS POR ESTOS METODOS DE LA INVENCION.

Description

Métodos y materiales para la preparación de dominios variables de anticuerpos modificados y sus usos terapéuticos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere de forma general a métodos para preparar un dominio variable de un anticuerpo modificado, mediante la determinación de los residuos de aminoácidos del dominio variable del anticuerpo que se pueden modificar sin disminuir la afinidad nativa del dominio para el antígeno mientras que se reduce su inmunogenicidad con respecto a una especie heteróloga; a métodos de preparación y uso de los dominios variables de un anticuerpo que tienen modificaciones en los residuos identificados, que son útiles para la administración a especies heterólogas; y a las regiones variables modificadas de este modo. Más particularmente, la invención se refiere a la preparación de dominios variables de anticuerpos de ratón modificados, que se modifican para la administración a los seres humanos, a los propios dominios variables de los anticuerpos resultantes, y al uso de tales anticuerpos "humanizados" en el tratamiento de enfermedades en los seres humanos.

Antecedentes

La aplicación de los anticuerpos monoclonales de ratón sin modificar en la terapia humana, es problemática por tres razones. En primer lugar, se provoca en el cuerpo humano una respuesta inmunitaria frente a los anticuerpos de ratón. En segundo lugar, los anticuerpos tienen una semivida reducida en el sistema circulatorio humano. En tercer lugar, los dominios efectores de los anticuerpos de ratón no pueden activar de forma eficiente el sistema inmunitario humano.

Hay tres métodos que han intentado eliminar los problemas mencionados. Junghans et al., Cancer Res., 50, 1495-1502 (1990) y otras publicaciones describen la utilización de técnicas de ingeniería genética para ligar el DNA que codifica las regiones variables murinas con el DNA que codifica las regiones constantes humanas, creando estructuras artificiales que cuando se expresan generan un anticuerpo híbrido ratón/humano.

También por técnicas de ingeniería genética, se puede insertar la información genética de las regiones hipervariables murinas determinantes de complementariedad (las CDR), en lugar del DNA que codifica las CDR de un anticuerpo monoclonal humano, para generar una estructura artificial que codifica un anticuerpo humano con las CDR murinas. Esta técnica es conocida como "injerto de CDR". Véase, por ejemplo, Jones et al., Nature, 321, 522-525 (1986); Junghans et al., cita anterior.

El análisis de la estructura proteínica se puede usar para "volver a añadir" residuos murinos, de nuevo por ingeniería genética, a las regiones variables de primera generación generadas por injerto de CDR con el fin de restaurar la pérdida de capacidad de unión al antígeno. Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 10029-10033 (1989); Co, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 2869-2873 (1991) describen versiones de este método. Los tres métodos anteriores son técnicas para "humanizar" anticuerpos monoclonales de ratón.

Padla, E. (1991) Mol. Immun. 28, No. 4/5, pp 489-498 propone reducir la inmunogenicidad de los dominios variables de los anticuerpos alogénicos, a la vez que se conservan las propiedades de unión al ligando, reduciendo su antigenicidad por medio del reemplazamiento de los residuos expuestos de las regiones marco que difieren de los que se encuentran usualmente en los anticuerpos hospedantes.

El documento WO 89/06968 es una solicitud PCT anterior del solicitante de esta invención. Este documento describe un método y una composición terapéutica para el tratamiento de enfermedades autoinmunes por medio de la administración de una inmunotoxina anti-células T que comprende un agente citotóxico conjugado con una inmunoglobulina anti-células T. Esta publicación no se ocupa de la modificación de anticuerpos para reducir la inmunogenicidad mientras que, al mismo tiempo, se mantiene la máxima afinidad.

Como resultado de la humanización de los anticuerpos monoclonales de ratón, la actividad específica de unión de los anticuerpos humanizados resultantes se puede disminuir o incluso eliminar completamente. Por ejemplo, en Queen et al., cita anterior, se indica que la afinidad de unión del anticuerpo modificado descrito, se reduce dos veces; y en Jones et al., cita anterior, se indica que se reduce de dos a tres veces. Otros informes describen el orden de magnitud de las reducciones de la afinidad de unión. Véase, por ejemplo, Tempest et al., Bio/Technology, 9, 226-271 (1991); Verhoeyen et al., Science, 239, 1534-1536 (1988).

Un sistema para diferenciar entre los diferentes subconjuntos de células T, basado en los antígenos de superficie celular, es el sistema de los grupos de diferenciación (de aquí en adelante denominado "sistema CD"). El sistema CD representa la nomenclatura estándar para los marcadores moleculares de las moléculas de diferenciación de los leucocitos. Véase Leukocyte Typing III White Cell Differentiation Antigens (Michael, ed. Oxford Press 1987).

Los llamados marcadores (o antígenos) de "células pan T" son aquellos marcadores que aparecen sobre las células T en general y que no son específicos para ningún subconjunto particular de células T. Los marcadores de células pan T incluyen CD2, CD3, CD5, CD6, y CD7. El antígeno del grupo CD5, por ejemplo, es uno de los marcadores pan T presentes en aproximadamente 85-100% de los linfocitos T maduros humanos y en una mayoría de los timocitos humanos. El CD5 está presente también en un subconjunto, aproximadamente 20%, de las células B. Estudios extensos usando citometría de flujo, tinción con inmunoperoxidasa, y lisis de eritrocitos han demostrado que normalmente este antígeno no está presente en las células progenitoras hematopoyéticas ni en ningún otro tejido humano normal adulto o fetal con la excepción de la subpoblación de células B mencionada antes.

Información adicional relacionada con el marcador CD5 se encuentra en McMichael and Gotch, en Leukocyte Typing III White Cell Differentiation Antigens (Michael, ed. Oxford Press 1987). La molécula de CD5 ha sido descrita también en la bibliografía como reactiva con las inmunoglobulinas. Véase, por ejemplo, Kernan et al., J. Immunol., 33: 137-146 (1984).

Existen informes de tentativas de tratamiento de pacientes con artritis reumatoide con anticuerpos monoclonales frente a CD4. Véase Horneff et al., Arthritis and Rheumatism 34: 2, 129-140 (February 1991); Goldberg et al., Arthritis and Rheumatism Abstract D115, 39: S153 (September 1990); Goldberg, Journal of Autoimmunity, 4: 617-630 (1991); Choy et al., Scand. J. Immunol. 36. 291-298 (1992).

Existen informes de tentativas de tratamiento de enfermedades autoinmunes, particularmente artritis reumatoide, con un anticuerpo monoclonal anti-CD5. Véase Kirkham et al., British Journal of Rheumatology 30; 459-463 (1991); Kirkham et al., British Journal of Rheumatology 30; 88 (1991); Kirkham et al., Journal of Rheumatology 19; 1348-1352 (1992). Hay también un informe de una tentativa para tratar la esclerosis múltiple con un anticuerpo anti-T12. Hafler et al., Neurology 36: 777-784 (1986).

Como se demuestra por lo anterior, existe la necesidad en la técnica de un método para preparar dominios variables de anticuerpos mediante la identificación de residuos en los dominios de la región variable monoclonal de ratón que se pueden modificar sin disminuir la afinidad nativa de los dominios para el antígeno mientras que se reduce su inmunogenicidad con respecto a una especie heteróloga, para uso en el tratamiento de enfermedades.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona métodos para preparar un dominio variable de un anticuerpo modificado, útil para la administración a seres humanos, mediante la determinación de los aminoácidos de un dominio variable de un anticuerpo dado que se pueden modificar sin disminuir la afinidad nativa del dominio para el antígeno mientras que se reduce su inmunogenicidad con respecto a una especie heteróloga.

Según la presente invención, se proporciona un método para preparar un dominio variable de un anticuerpo modificado que comprende:

(a) realizar un alineamiento por homología y una asignación de las posiciones de los aminoácidos de una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de un primer dominio variable de un anticuerpo a ser modificado y realizar un alineamiento por homología y una asignación de las posiciones de los aminoácidos de una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de un primer dominio variable de un anticuerpo a ser modificado;

(b) identificar el riesgo asignado a los aminoácidos de la cadena ligera según el gráfico de posición/riesgo

1

e identificar el riesgo asignado a la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada según el gráfico de posición/riesgo

2

(c) cambiar los residuos de aminoácidos de dicho primer dominio variable del anticuerpo en las posiciones con un riesgo asignado ( ), ( ) o ( ) y ( ) hasta un residuo de aminoácidos de la posición correspondiente en una secuencia de aminoácidos de un segundo dominio variable del anticuerpo; y

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(d) producir un dominio variable de un anticuerpo modificado que tiene dichos residuos de aminoácidos cambiados, el cual es capaz de unirse al antígeno, sin disminuir la afinidad nativa del dominio para el antígeno mientras que se reduce su inmunogenicidad con respecto a una especie heteróloga.

Se puede usar otro grupo de secuencias, tales como las de las figuras 1A y 1B, para determinar un alineamiento a partir del cual los expertos pueden determinar los cambios apropiados a realizar.

La presente invención proporciona un método adicional en el que la pluralidad de las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras y pesadas humanas se selecciona de las secuencias consenso humanas de las figuras 5A y 5B.

En general, se puede usar la ingeniería genética humana según los métodos anteriores para tratar diferentes enfermedades frente a las cuales generalmente pueden ser eficaces los anticuerpos monoclonales. Sin embargo, los anticuerpos humanizados tienen la ventaja adicional de reducir la respuesta inmunogénica en el paciente tratado.

La presente invención describe también productos y composiciones farmacéuticas útiles en el tratamiento de una miríada de enfermedades humanas. En particular, los productos preparados por los métodos mencionados antes, incluyen un dominio variable monoclonal de ratón H65 modificado. Adicionalmente, se proporcionan secuencias de DNA que codifican el dominio variable H65 modificado.

Los dominios variables de anticuerpos modificados que son productos de los métodos de la presente invención se pueden usar, entre otros, como componentes de diferentes moléculas de inmunoglobulinas tales como los dominios Fab, Fab', y F(ab')_{2}, anticuerpos de cadena simple y dominios variables Fv o dominios variables simples.

Las moléculas de inmunoglobulinas que comprenden dominios variables modificados según la invención son particularmente adecuadas para administración terapéutica a los humanos, por sí mismas o, por ejemplo, como componentes de inmunoconjugados tales como los descritos en la solicitud de patente de Estados Unidos de la misma propiedad y también en tramitación, Nº de serie 07/787.567 presentada el 4 de noviembre de 1991.

La presente invención proporciona también métodos para el tratamiento de enfermedades autoinmunes, en los que los modelos animales son predictivos de la eficacia del tratamiento en humanos. Finalmente, la presente invención incluye composiciones farmacéuticas que contienen los anticuerpos humanizados según la invención.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A y 1B son alineamientos de las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada, respectivamente, de cuatro dominios variables de un anticuerpo humano [HYH (complejo HYHEL-Fab 10-Lisosima), MCPC (complejo IgA Fab MCPC603-fosfocolina), NEWM (Ig Fab' NEW) y KOL (IgG1 KOL)] por criterios de homología de las secuencias y homología estructural;

La Figura 2 es una representación esquemática de las relaciones estructurales entre los residuos de aminoácidos de la cadena ligera del dominio variable;

La Figura 3 es una representación esquemática de las relaciones estructurales entre los residuos de aminoácidos de la cadena pesada del dominio variable;

La Figura 4 es una representación esquemática de un dominio variable de un anticuerpo;

Las figuras 5A y 5B son alineamientos de las secuencias consenso de aminoácidos para los subgrupos de cadenas ligeras [hK1 (subgrupo 1 de la cadena ligera kappa humana), hK3 (subgrupo 3 de la cadena ligera kappa humana), hK2 (subgrupo 2 de la cadena ligera kappa humana), hL1 (subgrupo 1 de la cadena ligera lambda humana), hL2 (subgrupo 2 de la cadena ligera lambda humana), HL3 (subgrupo 3 de la cadena ligera lambda humana), hL6 (subgrupo 6 de la cadena ligera lambda humana), hK4 (subgrupo 4 de la cadena ligera kappa humana), hL4 (subgrupo 4 de la cadena ligera lambda humana), y hL5 (subgrupo 5 de la cadena ligera lambda humana)] y de cadenas pesadas [hH3 (subgrupo 3 de la cadena pesada humana), hH1 (subgrupo 1 de la cadena pesada humana) y hH2 (subgrupo 2 de la cadena pesada humana)], respectivamente, de los dominios variables de un anticuerpo humano;

Las figuras 6A y 6B son alineamientos de la secuencia consenso de la cadena ligera humana hK1 con las secuencias de la cadena ligera real (h65) y de la cadena ligera modificada (prop) de bajo riesgo del dominio variable del anticuerpo monoclonal de ratón H65 y de la secuencia consenso de la cadena pesada humana hH3 con las secuencias de la cadena pesada real (h65) y de la cadena pesada modificada (prop) del dominio variable del anticuerpo monoclonal de ratón H65, respectivamente;

Las figuras 7A y 7B son listados de las secuencias nucleotídicas de los oligonucleótidos utilizados en la construcción de los genes que codifican las regiones V/J modificadas de las cadenas ligera y pesada del dominio variable del anticuerpo monoclonal de ratón H65;

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Las figuras 8A y 8B son listados de las secuencias nucleotídicas de los genes que codifican las regiones V/J modificadas de las cadenas ligera y pesada, respectivamente, del dominio variable del anticuerpo monoclonal de ratón H65;

La Figura 9 es un gráfico de los resultados de un ensayo de unión competitiva que muestra que el dominio variable modificado del anticuerpo H65 por un método según la invención retiene la capacidad de unión al antígeno de la región variable natural del anticuerpo H65;

Las figuras 10A y 10B son alineamientos de la secuencia consenso de la cadena ligera humana hK1 y de la secuencia consenso de la cadena pesada hH1 con las secuencias de las cadenas ligera y pesada, respectivamente, del dominio variable del anticuerpo EU humano, anticuerpo TAC humano, anticuerpo TAC murino modificado según la presente invención (prop) y anticuerpo TAC murino modificado según un método diferente (Que);

La Figura 11 es un gráfico de la unión de He3 IgG a CD5 encontrada en Molt-4M, que demuestra que tal unión es similar a la de cH65 IgG;

La Figura 12 es un gráfico que muestra los efectos de la administración de anti-Lyt-1 sobre la gravedad de la artritis inducida por colágeno en ratones DBA/1J;

Las figuras 13A y 13B son representaciones de la recogida de células T humanas en el bazo y en la sangre, respectivamente, de ratones PBMC/SCID después de tratamiento con MoAb H65;

Las figuras 14A y 14B son representaciones esquemáticas de la recogida de células T humanas en el bazo y en la sangre, respectivamente, de ratones PBMC/SCID después de tratamiento con fragmento F(ab')_{2} basado en H65;

La Figura 15 es un gráfico que muestra los efectos del MoAb OX19 sobre la gravedad de la artritis inducida por colágeno en ratas DR BB; y

Las figuras 16A y 16B son alineamientos de la secuencia consenso de la cadena ligera humana hK1 con las secuencias de la cadena ligera real (h65) y de la cadena ligera modificada (prop) de bajo y moderado riesgo del dominio variable del anticuerpo monoclonal de ratón H65 y de la secuencia consenso de la cadena pesada humana hH3 con las secuencias de la cadena pesada real (h65) y de la cadena pesada modificada (prop) del dominio variable del anticuerpo monoclonal de ratón H65, respectivamente.

Descripción detallada

Los métodos según la presente invención incluyen: (1) identificación de los residuos de aminoácidos del dominio variable de un anticuerpo que se pueden modificar sin disminuir la afinidad nativa del dominio para el antígeno mientras que se reduce su inmunogenicidad con respecto a una especie heteróloga; (2) la preparación de dominios variables de anticuerpos que tienen modificaciones en los residuos identificados, los cuales son útiles para la administración a especies heterólogas; y (3) el uso de los anticuerpos humanizados de la invención en el tratamiento de enfermedades autoinmunes en humanos. Los métodos de la invención se basan en un modelo del dominio variable de un anticuerpo descrito aquí que predice la implicación de cada aminoácido en la estructura del dominio.

A diferencia de otros métodos de humanización de anticuerpos que son partidarios de reemplazar las regiones marco clásicas del anticuerpo completas por las de un anticuerpo humano, los métodos descritos aquí introducen residuos humanos dentro del dominio variable de un anticuerpo solamente en las posiciones que no son críticas para la actividad de unión al antígeno y que probablemente deben ser expuestas a factores que estimulan la inmunogenicidad. Los presentes métodos están diseñados para retener la suficiente estructura interna natural del dominio variable de tal forma que la capacidad de unión al antígeno del dominio modificado no se disminuye en comparación con el dominio natural.

Para desarrollar el modelo del dominio variable de un anticuerpo, se utilizan los datos obtenidos del análisis de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables del anticuerpo usando el programa de modelado molecular tri-dimensional MacImdad (Molecular Applications Group, Stanford, California), junto con los datos obtenidos de estudios teóricos previos sobre la estructura de la región hipervariable, y los datos obtenidos de las estructuras cristalinas de los dominios variables de anticuerpos, HYH (complejo HYHEL-Fab 10-lisosima, estructura de Brookhaven "3HFM"), MCPC (complejo IgA Fab MCPC603-fosfocolina, estructura de Brookhaven "2MCP"), NEWM (Ig Fab' NEW, estructura de Brookhaven "3FAB") y KOL (IgG1 KOL, estructura de Brookhaven "2IG2"), procedentes de la base de datos Brookhaven (Brookhaven National Laboratory, Upton, New York).

Las figuras 1A y 1B proporcionan las secuencias de los cuatro dominios variables de anticuerpos que han sido cristalizados. Se muestran las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada de HYH (SEQ ID Nos. 1 y 5, respectivamente), MCPC (SEQ ID Nos. 2 y 6, respectivamente), NEWM (SEQ ID Nos. 3 y 7, respectivamente) y KOL (SEQ ID Nos. 4 y 8, respectivamente), en las que los signos de admiración "!" en la secuencia de la cadena ligera de MCPC en la posición 30x, en la secuencia de la cadena pesada de MCPC en las posiciones 52x y 98x, en la cadena ligera de NEWM en la posición 30x, en la cadena ligera de KOL en la posición 93x, y en la secuencia de la cadena pesada de KOL en la posición 98x, representan las secuencias de aminoácidos NSGNQK (SEQ ID No. 9), NKG (SEQ ID No. 10), GST (SEQ ID No. 11), AG, SL y HGFCSSASC (SEQ ID No. 12), respectivamente que son variaciones en la longitud de las secuencias del bucle hipervariable entre los diferentes anticuerpos. Las figuras 2 y 3 comprenden representaciones de la estructura de las cadenas ligera y pesada, respectivamente, en las que cada cadena se presenta "sin plegar" en una estructura de hoja beta plana de modo que las interacciones entre los residuos son más fáciles de visualizar. Las hebras de las cadenas polipeptídicas plegadas se representan como líneas verticales gruesas, conectadas por ocho bucles de giro beta. Tres de los bucles se identifican como bucles de unión al antígeno o CDR, uno es accesorio a los bucles, y los cuatro restantes en el "fondo" del dominio variable no están implicados en la unión al antígeno. Los terminales amino y carboxi del dominio variable se simbolizan por pequeños puntos negros en los extremos de las cadenas polipeptídicas. Cada posición de aminoácido se representa o por un círculo, o por un triángulo o por un cuadrado. El enlace disulfuro covalente entre las dos cisteínas en las posiciones 23 y 88 de la cadena ligera y el enlace disulfuro covalente entre las posiciones 22 y 92 de la cadena pesada se muestran cada uno como una línea horizontal gruesa. Todos los residuos de cada cadena se muestran en el mapa, incluyendo los residuos de unión al antígeno y los residuos marco. Las posiciones de los aminoácidos se numeran de acuerdo con Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fourth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health (1987), con la excepción de las señaladas con una "x" minúscula que son variaciones en la longitud de los bucles hipervariables que Kabat ha numerado como "a,b,c,d...". Las líneas sólidas inclinadas (ya sean sencillas o dobles) que conectan los pares de residuos que son adyacentes en el espacio tri-dimensional pero no en la secuencia lineal, representan uno o dos enlaces de hidrógeno entre los nitrógenos del grupo amino y los oxígenos del grupo carbonilo mutuamente alineados en las secuencias principales de los residuos.

El análisis de cada posición de aminoácido para determinar si la posición influye en la unión al antígeno y/o es inmunogénica se basó en la información de las figuras 1A, 1B, 2 y 3, así como en la información estructural adicional de la región variable de los siguientes párrafos.

La estructura básica del dominio variable de un anticuerpo está fuertemente conservada. El dominio variable está compuesto de una cadena ligera (o subunidad) y una cadena pesada (o subunidad), que son estructuralmente homólogas una a otra y que se relacionan por un pseudo-eje de simetría rotacional de doble plegado. En la "parte superior" del dominio variable, la región más lejana del dominio constante, hay seis bucles de unión al antígeno que están construidos sobre una región marco estructural más grande. El dominio variable es funcionalmente distinto del dominio constante, estando conectado solamente por dos cadenas muy flexibles y girando sobre ambas articulaciones de "rótula" formadas por cinco aminoácidos en las cadenas pesada y ligera.

Cada subunidad, ligera o pesada, se parece a una estructura "sandwich", compuesta de dos capas de láminas beta antiparalelas plegadas con un giro de hélice en el espacio tridimensional. Cada cadena de aminoácidos se pliega sobre sí misma repetidamente para crear nueve hebras distintas. Tres y media de estas hebras forman la capa "exterior" de la lámina beta de cada subunidad y las otras cinco y media forman la capa "interior". Las diferentes hebras de cada capa están ampliamente unidas con hidrógeno una a otra. Las dos capas de la lámina beta dentro de la subunidad se mantienen juntas por un único enlace disulfuro covalente y por numerosas interacciones hidrófobas internas. Las secuencias implicadas en la unión de las hebras de las subunidades se llaman en conjunto secuencias "marco".

Ciertos aminoácidos, ya sea en las secuencias que se unen al antígeno o ya sea en las secuencias marco, no se unen realmente al antígeno pero son críticos para determinar la conformación espacial de aquellos residuos que se unen. Cada bucle de unión al antígeno requiere una "plataforma" de residuos ocultos formada apropiadamente, que proporciona una superficie sobre la cual se pliega el bucle. Uno o más de los residuos del bucle estarán a menudo ocultos en la plataforma como un "ancla" que restringe la entropía conformacional del bucle y que determina la orientación precisa de las cadenas laterales que contactan con el antígeno. De este modo, las formas de los residuos que construyen la plataforma contribuyen a la forma final del bucle que se une al antígeno y a su afinidad para antígenos específicos.

Existen cadenas laterales de aminoácidos en diferentes medios químicos dentro de las subunidades. Algunos residuos están expuestos al disolvente en la superficie exterior accesible mientras que otros residuos están ocultos en interacciones hidrófobas dentro de una subunidad. Gran parte del dominio variable de la inmunoglobulina está construido a partir de láminas beta antiparalelas plegadas que crean superficies anfipáticas, de tal modo que la superficie "interior" es hidrófoba y la superficie "exterior" es hidrófila. La parte exterior se expone al disolvente, y por tanto se expone también al entorno humoral cuando el dominio está en el sistema circulatorio de un animal. Las cadenas laterales de aminoácidos que están completamente expuestas al disolvente y que no interactúan físicamente con otros residuos en el dominio variable es probable que sean inmunogénicas y es improbable que tengan alguna importancia estructural dentro de la molécula de inmunoglobulina. Una representación muy esquemática del dominio variable se muestra en la Figura 4, en la que las líneas gruesas representan enlaces peptídicos y los círculos sombreados indican cadenas laterales de aminoácidos.

Las dos subunidades de los dominios variables de anticuerpos se adhieren una con otra por medio de una región interfacial hidrófoba que se extiende a lo largo del interior de la capa de la lámina beta desde el borde del dominio variable con el dominio constante hasta los bucles de unión al antígeno. Las cadenas laterales de aminoácidos de ambas subunidades interactúan para formar una estructura "espinapez" de tres capas. Algunos de estos residuos interfaciales son componentes del bucle de unión al antígeno, y por tanto tienen un efecto directo sobre la afinidad de unión. Cada residuo de la región interfacial es estructuralmente importante debido a que la conformación de las regiones de unión está muy influida por los cambios en la conformación de la región interfacial.

Los datos anteriores y la información sobre la estructura de los dominios variables de un anticuerpo ayudan en la determinación de si un particular aminoácido de cualquier dominio variable es probable que influya o no sobre la unión al antígeno o sobre la inmunogenicidad. La determinación para cada posición de aminoácido se representa por un par de símbolos (por ejemplo, + y +, en las líneas marcadas como "unir" y "ocultar", respectivamente) en las figuras 1A, 1B, (y también en las figuras 5A, 5B, 6A, 6B, 10A y 10B). En cada uno de estos pares, el primer símbolo se refiere a la unión al antígeno, mientras que el segundo símbolo se refiere a la inmunogenicidad y estructura marco. Las tablas 1, 2 y 3, que siguen, indican la importancia de los símbolos y los posibles apareamientos.

TABLA 1 Primer símbolo del par (unión al ligando)

+	Poca o ninguna influencia directa sobre los bucles de unión al antígeno, bajo riesgo si se sustituye.
o	Indirectamente implicado en la estructura del bucle de unión al antígeno, moderado riesgo si se cambia.
-	Directamente implicado en la conformación del bucle de unión al antígeno o en el contacto con el
	antígeno, alto riesgo si se modifica.

TABLA 2 Segundo símbolo del par (inmunogenicidad y estructura)

+	Muy accesible al disolvente, alta inmunogenicidad, bajo riesgo si se sustituye.
o	Parcialmente oculto, moderada inmunogenicidad, moderado riesgo si se altera.
-	Completamente oculto en el núcleo hidrófobo de la subunidad, baja inmunogenicidad, alto
	riesgo si se cambia.
=	Completamente oculto en la región interfacial entre subunidades, baja inmunogenicidad,
	alto riesgo si se modifica.

TABLA 3 Significado de los pares

++	Bajo riesgo	Muy accesible al disolvente y alta inmunogenicidad, pero poco o ningún
		efecto sobre la unión específica al antígeno.
o+, +o, oo	Moderado riesgo	Ligera inmunogenicidad o implicación indirecta con la unión al antígeno.
Cualquiera	Alto riesgo	Oculto dentro del núcleo de la subunidad/región interfacial o fuertemente
de - o =		implicado en la unión al antígeno, pero poco o ningún potencial
		inmunogénico.

Los apareamientos mostrados en las figuras indican que el hacer las modificaciones ratón-a-hombre en las posiciones que tienen un par de símbolos de bajo riesgo (++) (esto es, un símbolo en la línea de "unir" y un símbolo en la línea de "ocultar" correspondientes a una posición) da como resultado una importante reducción de la inmunogenicidad terapéutica con pocas posibilidades de afectar a la afinidad de unión. En el extremo opuesto del espectro, el modificar las posiciones que tienen un par de símbolos de alto riesgo (- -) puede degradar o abolir la actividad de unión con poca o ninguna reducción real de la inmunogenicidad terapéutica. Hay 73 posiciones de bajo riesgo en el dominio variable (38 en la cadena ligera y 35 en la cadena pesada) que están indicadas por círculos en las líneas marcadas como "riesgo" en las figuras 1A, 1B, 5A, 5B, 6A, 6B, 10A y 10B. Hay 29 posiciones de moderado riesgo en el dominio variable (12 en la cadena ligera y 17 en la cadena pesada) que están indicadas por los triángulos en las líneas marcadas como "riesgo" en las figuras 1A, 1B, 5A, 5B, 6A, 6B, 10A y 10B.

Los resultados del análisis anterior se pueden aplicar a las secuencias consenso para los diferentes subgrupos de los dominios variables del anticuerpo porque las características estructurales que ellas representan están altamente conservadas, incluso entre diferentes especies. Las figuras 5A y 5B, indican por tanto y alinean las secuencias consenso (derivadas de Kabat et al., cita anterior) de los subgrupos de cadenas ligeras (hK1, SEQ ID NO: 13; hK3, SEQ ID NO: 14; hK2, SEQ ID NO: 15; hL1, SEQ ID NO: 16; hL2, SEQ ID NO: 17; hL3, SEQ ID NO: 18; hL6, SEQ ID NO: 19; hK4, SEQ ID NO: 20; hL4, SEQ ID NO: 21; y hL5, SEQ ID NO: 22) y de cadenas pesadas (hH3, SEQ ID NO: 23; hH1, SEQ ID NO: 24; y hH2, SEQ ID NO: 25) de los dominios variables del anticuerpo, representando los apareamientos las características estructurales de cada posición de aminoácidos, en las que las secuencias consenso para los subgrupos hL6, hK4, hL4, hL5 y hH2 se derivan de menos de veinte secuencias reales de las cadenas ligera y pesada.

En las secuencias consenso indicadas en las figuras 5A y 5B, las designaciones de los aminoácidos en letras mayúsculas indican que el aminoácido está presente en esa localización desde aproximadamente el 90% hasta aproximadamente el 100% de las secuencias humanas conocidas (excluyendo los fragmentos pequeños incompletos) de ese subgrupo (esto es, la localización está "altamente conservada"); mientras que las designaciones de los aminoácidos en letras minúsculas indican que el aminoácido está presente en esa localización desde aproximadamente el 50% hasta aproximadamente el 90% de las secuencias humanas conocidas de ese subgrupo (esto es, la localización está "moderadamente conservada"). Una "x" minúscula indica una conservación en menos de aproximadamente el 50% de las secuencias conocidas de ese subgrupo (esto es, una posición "pobremente conservada").

La información presentada en las figuras 5A y 5B sobre la relación de un aminoácido particular en una secuencia de un dominio variable de un anticuerpo con la estructura y capacidad de unión al antígeno del dominio es suficiente para determinar si un aminoácido es o no modificable. No se requieren estudios estructurales adicionales, tales como aquellos en los que se basan las figuras 5A y 5B.

Por tanto, según la presente invención, se pueden usar las figuras 5A y 5B para preparar, por ejemplo, un dominio variable de un anticuerpo de ratón modificado que retiene la afinidad del dominio natural para el antígeno a la vez que presenta una inmunogenicidad reducida en los seres humanos, por medio de las siguientes etapas. Las secuencias de aminoácidos tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada del dominio variable de ratón se determinan en primer lugar por métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, por la degradación de Edman o por la secuenciación de un cDNA que codifica el dominio variable). Seguidamente, las secuencias consenso indicadas en las figuras 5A y 5B para las regiones variables de un anticuerpo humano se examinan para identificar tanto una secuencia consenso de cadena ligera como una secuencia consenso de cadena pesada que son las más homólogas con las secuencias de la particular subunidad de ratón que se deben modificar. Las secuencias de ratón se alinean con las secuencias consenso humanas basándose en la homología ya sea visualmente o usando un programa de ordenador disponible comercialmente tal como el paquete PCGENE (Intellegenetics, Mountain View, California).

Las figuras 5A y 5B se usan otra vez después para identificar todas las posiciones de "bajo riesgo" o de "moderado riesgo" en las cuales la secuencia de ratón difiere significativamente de la secuencia consenso humana elegida. Los residuos de aminoácidos de ratón en estas posiciones de bajo riesgo y de moderado riesgo son candidatos para la modificación. Si la secuencia consenso humana está fuertemente conservada en una posición dada de bajo riesgo o de moderado riesgo, el residuo humano puede reemplazar al correspondiente residuo de ratón. Si la secuencia consenso humana está pobremente conservada en una posición dada de bajo riesgo o de moderado riesgo, el residuo de ratón se retiene en esa posición. Si la secuencia consenso humana está moderadamente conservada en una posición específica, el residuo de ratón se reemplaza normalmente con un residuo humano, a menos que el residuo de ratón aparezca en esa posición en al menos una de las secuencias (por ejemplo, en Kabat et al., cita anterior) sobre las que se basa la secuencia consenso humana. Si el residuo de ratón aparece en esa posición en una secuencia humana, entonces el residuo de ratón puede ser retenido.

Otros criterios pueden ser importantes para la determinación de qué residuos identificados de una región variable deben ser modificados. Por ejemplo, puesto que la cadena lateral de la prolina está conectada tanto a su \alpha-carbono como a su nitrógeno peptídico, la libre rotación está restringida alrededor del enlace carbono-nitrógeno (el ángulo \baro de Ramachandran). Por tanto, siempre que hay una prolina en una secuencia, la forma de la cadena principal está distorsionada y esa distorsión puede influir sobre otros residuos implicados en la unión al antígeno. La presencia o ausencia de un residuo de prolina en cualquier punto de la secuencia de aminoácidos es una característica estructuralmente importante. Si la secuencia de ratón contiene una prolina en una cierta localización, es probable que su presencia sea necesaria para una conformación apropiada de la cadena principal y del marco y la prolina es preferiblemente retenida. Si la secuencia de ratón no contiene una prolina en una localización en la que la secuencia consenso humana tiene una, es probable que la introducción de una prolina en la secuencia de ratón pueda afectar a la conformación apropiada de la secuencia, por lo que el residuo de ratón es preferiblemente retenido. Cuando una prolina en una particular posición que incluye la prolina, se cambia de ratón a humana, tal cambio se considera que es al menos de moderado riesgo incluso si dicha posición pudiera ser por lo demás de bajo riesgo.

Similarmente, las inserciones y deleciones en una secuencia de ratón, con relación a un marco consenso humano, normalmente se conservan intactas. Si la secuencia de ratón tiene una alteración en la longitud y espacio de la cadena principal de la región variable, es probable que la alteración sea necesaria para proporcionar una superficie para un plegamiento apropiado de los bucles de unión al antígeno. Preferiblemente se retiene la alteración en una versión modificada de la secuencia.

Los residuos que participan en la región interfacial entre las cadenas ligera y pesada de un dominio variable se dejan también preferiblemente intactos en una versión modificada. Todos ellos se designan como de alto riesgo, con símbolos = en las líneas "ocultar" de las figuras 1, 5, 6, 10. Las cadenas laterales de la región interfacial se ocultan profundamente dentro de la estructura, de forma que es improbable que produzcan una respuesta terapéutica inmunogénica en una especie heteróloga.

Una vez que ha sido diseñada una secuencia modificada, se sintetizan los DNA que codifican el dominio variable completo [por medio de la síntesis de oligonucleótidos como se describe por ejemplo, en Sinha et al., Nucleic Acids Res., 12, 4539-4557 (1984)], se ensamblan [por medio de PCR como se describe por ejemplo, en Innis, Ed., PCR Protocols, Academic Press (1990) y también en Better et al., J. Biol. Chem. 267, 16712-16118 (1992)], se clonan y se expresan [por procedimientos estándar como se describe por ejemplo, en Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1989) y también en Robinson et al., Hum. Antibod. Hybridomas, 2, 84-93 (1991)] y finalmente se ensayan en cuanto a su actividad específica de unión al antígeno [por medio de un ensayo de competición, como se describe, por ejemplo, en Harlow et al., Eds. Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1988) y Munson et al., Anal. Biochem., 107, 220-239 (1980)].

El tratamiento de ciertas enfermedades autoinmunes con conjugados de inmunotoxina se describe en la solicitud de patente de Estados Unidos también en tramitación, comúnmente cedida, No. de serie 07/759.297 presentada el 13 de septiembre de 1991, y en Bernhard et al., "Materials Comprising and Methods of Preparation and Use for Ribosome-Inactivating Proteins", una solicitud de patente de Estados Unidos presentada el 9 de diciembre de 1992, que se incorporan aquí como referencia. Una inmunoglobulina tal como una inmunoglobulina anti-células T se puede conjugar con una molécula citotóxica. La molécula citotóxica a la que se conjuga la inmunoglobulina puede ser cualquiera de una serie de toxinas tales como lectina A o una cadena de ricina A. La solicitud 297 indicada antes describe también el uso de un anticuerpo anti-CD5 conjugado con una cadena de ricina A que proporciona una inmunotoxina anti-células T.

Una descripción general de diferentes enfermedades autoinmunes se encuentra en The Autoimmune Diseases (Rose & Mackey, eds 1985). Las enfermedades autoinmunes se pueden caracterizar, entre otros, por una regulación inmunológica anormal que da como resultado una actividad excesiva de las células B y una actividad de las células T disminuida, aumentada o inapropiada. Tal actividad alterada de las células T puede dar como resultado la producción excesiva de autoanticuerpos. Aunque las enfermedades autoinmunes son complejas y diversas en sus manifestaciones, tienen la característica común de un sistema inmunitario alterado. El agotamiento terapéutico de las células T circulantes por medio de la administración de una inmunoglobulina anti-células pan T mejora el curso clínico y el pronóstico de los pacientes con enfermedades autoinmunes. Para la terapia con anticuerpos anti-CD5, el agotamiento adicional de las células CD5 B puede tener un efecto beneficioso adicional puesto que las células CD5 B han sido implicadas en algunas enfermedades autoinmunes.

Una vez preparados, los anticuerpos humanizados son útiles después en el tratamiento de las enfermedades autoinmunes. A este respecto, un anticuerpo monoclonal anti-CD5, se presenta como un ejemplo de una realización preferida de la invención. Un ejemplo de una inmunoglobulina anti-células pan T es un anticuerpo de CD5 que es principalmente reactivo con un antígeno de superficie de las células T maduras, pero es reactivo también con el 10-20% de las células B maduras. Los datos clínicos obtenidos usando la inmunoglobulina anti-células pan T en modelos de enfermedades autoinmunes en animales no humanos son predictivos de los efectos del uso de tales inmunoglobulinas como terapia frente a las enfermedades autoinmunes humanas.

Para el propósito de la presente invención, una inmunoglobulina, tal como un anticuerpo, es "reactiva" con un antígeno o "se une a" un antígeno si interactúa con el antígeno o forma un complejo antígeno-inmunoglobulina. El antígeno es generalmente una proteína o marcador de superficie único. Un marcador muy preferido es el grupo de antígenos CD5.

La inmunoglobulina anti-células pan T se puede obtener de una serie de fuentes. Dicha inmunoglobulina es reactiva con la mayor parte de las células T maduras o con ambas, las células T y los subconjuntos de otras células linfoides, tales como las células B o las células agresoras naturales (NK). La inmunoglobulina puede ser sintética o recombinante, incluyendo las inmunoglobulinas preparadas por ingeniería genética tales como las inmunoglobulinas quiméricas, anticuerpos humanizados, anticuerpos híbridos, o derivados de cualquiera de estos.

Las inmunoglobulinas, anticuerpos o péptidos quiméricos están constituidos por porciones fusionadas de diferentes especies como un producto de DNA quimérico. El DNA quimérico es DNA recombinante que contiene material genético de más de una especie de mamíferos. Las inmunoglobulinas quiméricas incluyen una porción que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de una secuencia correspondiente, u homóloga con ella, de una inmunoglobulina, anticuerpo o péptido derivada de una primera fuente génica mientras que el segmento restante de la cadena o cadenas es homólogo con las correspondientes secuencias de otra fuente génica. Por ejemplo, un péptido anticuerpo quimérico puede comprender una cadena pesada del anticuerpo con una región variable murina y una región constante humana. Las dos fuentes génicas implican típicamente a dos especies, pero ocasionalmente pueden implicar a diferentes fuentes de una especie.

Las inmunoglobulinas, anticuerpos o péptidos quiméricos se producen típicamente usando técnicas recombinantes moleculares y/o celulares. Típicamente, los anticuerpos quiméricos tienen regiones variables tanto de cadena ligera como de cadena pesada que imitan las regiones variables de los anticuerpos derivados de una especie de mamífero, mientras que las porciones constantes son homólogas con las secuencias de anticuerpos derivados de una segunda especie diferente de mamífero.

La definición de anticuerpo quimérico, sin embargo, no se limita a este ejemplo. Un anticuerpo quimérico es cualquier anticuerpo en el que una cualquiera o las dos cadenas pesada o ligera están compuestas de combinaciones de secuencias que imitan las secuencias de anticuerpos de diferentes fuentes prescindiendo de si estas fuentes son de clases diferentes, con diferentes respuestas a antígenos, o de diferentes especies de origen, y sin tener en cuenta si el punto de la fusión está o no en el límite de las regiones variable/constante.

Los términos "humanizada" "tipo humano" o "convertida en humana" se refieren a una inmunoglobulina en la que las regiones constantes tienen al menos una homología de aproximadamente 80% o mayor con la inmunoglobulina humana, y en la que alguno de los residuos aminoácidos de la región variable no humana (esto es murina) puede ser modificado para contener residuos aminoácidos de origen humano.

Los anticuerpos humanizados se pueden denominar anticuerpos "remodelados". La manipulación de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) es un medio de fabricar anticuerpos humanizados. Véase por ejemplo, Jones et al. Replacing the Complementarity-Determining Regions in a Human Antibody With Those From a Mouse, Nature 321: 522-525 (1988); Riechmann, et al., Reshaping Human Antibodies For Therapy, Nature 332, 323-327 (1988). Como un artículo de revisión en relación con los anticuerpos quiméricos y humanizados, véase Winter and Milstein, Man-Made Antibodies, Nature 349, 293-299 (1991).

Preferiblemente, las inmunoglobulinas de la presente invención son anticuerpos monoclonales (de aquí en adelante denominados "MoAbs") del isotipo IgM o IgG de origen murino, humano o de otro mamífero. Lo más preferiblemente, el MoAb es reactivo con el antígeno CD5 encontrado tanto en las células T como en las células B. Se pueden preparar MoAbs de otras especies animales usando marcadores análogos de mamíferos no humanos.

Una variedad de métodos para producir MoAbs son conocidos en la técnica. Véase por ejemplo, Goding, Monoclonal Antibodies; Principles and Practice (2d. Ed. Academic Press 1986), que se incorpora aquí como referencia. Formas menos preferidas de inmunoglobulinas se pueden producir por métodos bien conocidos para los expertos en la técnica, tales como purificación cromatográfica de los sueros policlonales para producir poblaciones de anticuerpos sustancialmente monoespecíficos.

Los anticuerpos monoclonales dirigidos específicamente frente al antígeno humano CD5 se pueden obtener usando combinaciones de inmunógenos y antígenos de cribado que tienen solamente antígeno CD5 humano en común o por un ensayo de cribado diseñado para que sea específico solamente para los anticuerpos monoclonales anti-CD5. Por ejemplo, la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos frente a CD5 se puede realizar por 1) inmunización con células T humanas que expresan el antígeno CD5 seguida por el cribado de los hibridomas resultantes en cuanto a su reactividad frente a una línea celular no humana transfectada con CD5 humano (construida de una manera similar a la descrita en Nishimura, et al., Eur. J. Immunol., 18: 747-753 (1988)); 2) inmunización con una línea celular no humana transfectada con CD5 humano seguida por el cribado de los hibridomas resultantes en cuanto a su reactividad frente a una línea de células T humanas que expresan el antígeno CD5; 3) inmunización con líneas celulares humanas o no humanas que expresan CD5 humano seguida por el cribado de los hibridomas resultantes en cuanto a su capacidad para bloquear la reactividad de los anticuerpos monoclonales anti-CD5 existentes con una línea de células T humanas; 4) inmunización con líneas celulares humanas o no humanas que expresan CD5 humano seguida por el cribado de los hibridomas resultantes en cuanto a su reactividad con el antígeno CD5 nativo purificado o recombinante; o 5) inmunización con un derivado recombinante del antígeno CD5 humano seguida por el cribado de los hibridomas resultantes en cuanto a su reactividad frente a una línea de células T humanas que expresan CD5.

Un anticuerpo monoclonal preferido para uso en esta invención se produce mediante la línea de células hibridomas XMMLY-H65 (H65) depositada ante la American Type Culture Collection en Rockville, Maryland (A.T.C.C.) que recibió el No. de acceso HB9286. Un anticuerpo preferido se prepara como se describe aquí usando las formas humanizadas del anticuerpo murino H65.

La generación de los MoAb humanos frente a un antígeno humano es conocida también en la técnica. Véase por ejemplo, Koda and Glassy, Hum. Antibod. Hybridomas, 1(1) 15-22 (1990). La generación de tales MoAb puede ser difícil con los métodos convencionales. Por tanto, puede ser deseable modificar las regiones de unión al antígeno de los anticuerpos no humanos, por ejemplo, las regiones F(ab')_{2} o las regiones hipervariables hasta regiones constantes humanas (Fc) o regiones marco mediante técnicas de DNA recombinante para producir moléculas sustancialmente humanas usando métodos generales de modificación descritos, por ejemplo, en el documento U.S. 4.816.397; y en las publicaciones EP 173.494 y 239.400, que se incorporan aquí como referencia.

Alternativamente, se pueden aislar las secuencias de DNA que codifican un MoAb humano o porciones del mismo que se unen específicamente a las células T humanas, mediante el cribado de una genoteca de DNA procedente de células B humanas según los protocolos generales indicados por Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989), Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991) que se incorporan aquí como referencia, y después clonando y amplificando las secuencias que codifican el anticuerpo (o el fragmento de unión) de la especificidad deseada.

En adición a las inmunoglobulinas descritas específicamente aquí, se pueden diseñar y preparar fácilmente otras inmunoglobulinas modificadas "sustancialmente homólogas" utilizando diferentes métodos de DNA recombinante conocidos por los expertos en la técnica. Las modificaciones de los genes de la inmunoglobulina se pueden realizar fácilmente por una variedad de técnicas bien conocidas, tales como la mutagénesis dirigida a un sitio. Véase Gillman and Smith, Gene 8: 81-97 (1979); Roberts, et al., Nature 328: 731-734 (1987), que se incorporan aquí ambas como referencia. También, las modificaciones que afectan a la afinidad de unión del anticuerpo se pueden seleccionar usando el protocolo general indicado por McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990), que se incorpora aquí como referencia.

En la presente invención, una inmunoglobulina, anticuerpo o péptido es específico para una célula T si se une o es capaz de unirse a las células T como se determina por los ensayos estándar anticuerpo-antígeno o ligando-receptor. Ejemplos de tales ensayos incluyen ensayos competitivos, ensayos de inmunocitoquímica, ensayos de saturación o inmunoensayos estándar tales como ELISA, RIA y ensayos de citometría de flujo. Esta definición de especificidad se aplica también a las cadenas únicas pesadas y/o ligeras, a las CDR, a las proteínas de fusión, o a los fragmentos de cadenas pesadas y/o ligeras, que se unen a las células T solos o que son capaces de unirse a las células T si se incorporan apropiadamente a la conformación de la inmunoglobulina con regiones variables complementarias y regiones constantes según sea apropiado.

En algunos ensayos de competición, la capacidad de una inmunoglobulina, anticuerpo o fragmento peptídico para unirse a un antígeno se determina mediante la detección de la capacidad de la inmunoglobulina, anticuerpo o péptido para competir con la unión de un compuesto del que se sabe que se une al antígeno. Se conocen numerosos tipos de ensayos competitivos y se discuten aquí. Alternativamente, se pueden usar también los ensayos que miden la unión de un compuesto de ensayo en ausencia de un inhibidor. Por ejemplo, la capacidad de una molécula u otro compuesto para unirse a las células T se puede detectar marcando la molécula de interés directamente, o dicha molécula puede estar sin marcar y ser detectada indirectamente usando diferentes formatos de ensayo sandwich. Se conocen numerosos tipos de ensayos de unión tales como los ensayos de unión competitivos. Véase por ejemplo, las patentes de Estados Unidos Números 3.376.110, 4.016.043; Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, N. Y. (1988), que se incorporan aquí como referencia.

También están disponibles ensayos para medir la unión de un compuesto de ensayo a un componente solo en lugar de usar un ensayo de competición. Por ejemplo, se pueden usar inmunoglobulinas para identificar la presencia de un marcador de las células T. Se pueden usar procedimientos estándar para ensayos de anticuerpos monoclonales, tales como ELISA, (véase Harlow and Lane, cita anterior). Para una revisión de los diferentes sistemas que producen señales que se pueden usar, véase la patente de Estados Unidos Número 4.391.904, que se incorpora aquí como referencia.

Otros formatos de ensayos pueden incluir la detección de la presencia o ausencia de diferentes cambios fisiológicos o químicos que resultan de una interacción antígeno-anticuerpo. Véase Receptor-Effector Coupling - A Practical Approach, (Hulme, ed., IRL Press, Oxford 1990), que se incorpora aquí como referencia.

Los anticuerpos humanizados de la presente invención pueden ser administrados a pacientes que tienen una enfermedad con marcadores celulares que se dirigen a un objetivo. Tales enfermedades incluyen, pero sin limitarse a ellas, las enfermedades autoinmunes tales como lupus (incluyendo lupus eritematoso sistémico y nefritis por lupus), enfermedades esclerodérmicas (incluyendo liquen escleroso, morfea y liquen plano), artritis reumatoide y las espondilartropatías, tiroiditis, pénfigo vulgar, diabetes mellitus tipo 1, esclerosis sistémica progresiva, anemia aplásica, miastenia grave, miositis incluyendo polimiositis y dermatomiositis, enfermedad de Sjogren, enfermedad vascular del colágeno, poliarteritis, enfermedad inflamatoria del intestino (incluyendo la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa), esclerosis múltiple, psoriasis y cirrosis biliar primaria; enfermedades causadas por infecciones víricas; enfermedades causadas por infecciones fúngicas; enfermedades causadas por parásitos; y similares.

Las inmunoglobulinas, anticuerpos o péptidos según la invención se pueden administrar a un paciente ya sea individualmente o en una mezcla que contiene dos o más anticuerpos, otros agentes terapéuticos, composiciones o similares, incluyendo pero sin limitarse a ellos, agentes inmunodepresores, potenciadores y agentes que alivian los efectos secundarios. De particular interés son los agentes inmunodepresores útiles para reducir las reacciones alérgicas u otras reacciones no deseadas de un paciente. Los agentes inmunodepresores incluyen prednisona, prednisolona, dexametasona, ciclofosfamida, ciclosporina, 6-mercaptopurina, metotrexato, azatioprina y gammaglobulina. Todos estos agentes se administran en intervalos de dosis eficaces generalmente aceptados tales como los descritos en el Physician's Desk Reference, 41st ed. (1987). En adición a los agentes inmunodepresores, otros compuestos tales como un inhibidor de la angiogénesis se pueden administrar con la inmunoglobulina anti-pan T. Véase Peacock, et al., Arthritis and Rheum, 35 (Suppl.), Abstract, for ACR meeting No. B141 (Sept. 1992).

En una realización preferida de la presente invención, las inmunoglobulinas anti-células pan T pueden ser formuladas en diferentes preparaciones tales como formas inyectables y tópicas. Las formulaciones parenterales son preferidas para uso en la invención, la más preferida es la administración intramuscular (i.m.) o intravenosa (i.v.). Las formulaciones que contienen cantidades terapéuticamente eficaces de anticuerpos anti-células pan T son o soluciones líquidas estériles, suspensiones líquidas estériles o versiones liofilizadas y opcionalmente contienen estabilizantes o excipientes. Las composiciones liofilizadas se reconstituyen con diluyentes adecuados por ejemplo, agua para inyección, solución salina, glicina al 0,3% y similares, a un nivel desde aproximadamente 0,01 mg/kg de peso corporal del paciente hasta aproximadamente 10 mg o más por kg de peso corporal del paciente.

Típicamente, las composiciones farmacéuticas que contienen inmunoglobulinas anti-células pan T se administran en una dosis terapéuticamente eficaz en un intervalo desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal del animal tratado. Un intervalo de dosis preferido del anticuerpo anti-células pan T es desde aproximadamente 0,05 mg/kg hasta aproximadamente 2 mg/kg de peso corporal del animal tratado. La dosis de inmunoglobulina se administra en un único día o en varios días mediante perfusión intravenosa diaria. Por ejemplo, para un paciente de 70 kg de peso, una dosis preferida es desde aproximadamente 0,7 mg hasta aproximadamente 700 mg al día. Una dosis más preferida es desde aproximadamente 3,5 mg hasta aproximadamente 140 mg al día.

Las inmunoglobulinas anti-células pan T se pueden administrar sistémicamente por inyección, intramuscularmente, subcutáneamente, intratecalmente, intraperitonealmente, en los espacios vasculares, o en las articulaciones (por ejemplo inyección intraarticular a una dosis mayor que aproximadamente 1 \mug/cm^{3} (\mug/cc) de fluido articular/día). La dosis dependerá de las propiedades de la inmunoglobulina anti-células pan T empleada, por ejemplo, de su actividad y semivida biológica, de la concentración de anticuerpos anti-células pan T en la formulación, del sitio y velocidad de la dosificación, de la tolerancia clínica del paciente involucrado, de la enfermedad autoinmune que sufre el paciente y similares, así como del conocimiento del profesional asistente.

La inmunoglobulina anti-células pan T de la presente invención, se puede administrar en solución. El pH de la solución debe estar en el intervalo desde aproximadamente pH 5,0 hasta aproximadamente 9,5, preferiblemente pH 6,5 a 7,5. La inmunoglobulina anti-células pan T o sus derivados deben estar en una solución que tiene un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como fosfato, tris(hidroximetil)aminometano-HCl, o citrato y similares. Las concentraciones de tampón deben estar en el intervalo desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 100 mM. Una solución que contiene inmunoglobulina anti-células pan T puede contener también una sal, tal como cloruro de sodio o cloruro de potasio en una concentración desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 150 mM. Se puede incluir también una cantidad eficaz de un agente estabilizante tal como albúmina, una globulina, un detergente, una gelatina, una protamina, o una sal de protamina y se puede añadir a una solución que contiene inmunoglobulina anti-células pan T o a la composición a partir de la cual se prepara la solución. La administración sistémica de inmunoglobulina anti-células pan T se realiza tipicamente cada dos o tres días o una vez a la semana si se usa una forma quimérica o humanizada. Alternativamente, es útil la administración diaria. Usualmente la administración es o por inyección intramuscular o por perfusión intravascular.

Alternativamente, la inmunoglobulina anti-células pan T se formula para preparaciones tópicas para terapia local incluyendo una concentración terapéuticamente eficaz de inmunoglobulina anti-células pan T en un vehículo dermatológico. Las preparaciones tópicas pueden ser útiles para tratar lesiones de la piel tales como psoriasis y dermatitis asociada con lupus. La cantidad de inmunoglobulina anti-células pan T a ser administrada y la concentración de inmunoglobulina anti-células pan T para las formulaciones tópicas, dependerá del vehículo seleccionado, de la condición clínica del paciente, de la toxicidad sistémica y de la estabilidad de la inmunoglobulina anti-células pan T en la formulación. Por tanto, el médico empleará necesariamente la preparación apropiada que contiene la concentración apropiada de inmunoglobulina anti-células pan T en la formulación, así como la cantidad de formulación administrada dependiendo de la experiencia clínica con el paciente en cuestión o con pacientes similares.

La concentración de inmunoglobulina anti-células pan T en las formulaciones tópicas está en el intervalo desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 25 mg/ml. Típicamente, la concentración de inmunoglobulina anti-células pan T en las formulaciones tópicas está en el intervalo desde aproximadamente 1 mg/ml hasta aproximadamente 20 mg/ml. Se pueden usar dispersiones sólidas de inmunoglobulina anti-células pan T así como preparaciones solubilizadas. Por tanto, la concentración exacta a ser usada en el vehículo puede estar sujeta a una manipulación experimental discreta con el fin de optimizar la respuesta terapéutica. Concentraciones mayores que aproximadamente 10 mg de inmunoglobulina anti-células pan T por 100 gramos de vehículo pueden ser útiles con vehículos en hidrogel al 1% p/p en el tratamiento de la inflamación de la piel. Vehículos adecuados, además de los geles, son las emulsiones aceite en agua o agua en aceite usando aceites minerales, vaselinas y similares.

Opcionalmente la inmunoglobulina anti-células pan T se puede administrar tópicamente mediante el uso de un sistema terapéutico transdérmico (Barry, Dermatological Formulations, p. 181 (1983)). Aunque dichos sistemas de administración tópica han sido diseñados principalmente para la administración transdérmica de fármacos de bajo peso molecular, por definición son capaces de liberación percutánea. Dichos sistemas se pueden adaptar fácilmente a la administración de una inmunoglobulina anti-células pan T o sus derivados y de proteínas terapéuticas asociadas mediante la selección apropiada de la membrana microporosa que controla la velocidad.

Se pueden emplear preparaciones de inmunoglobulina anti-células pan T ya sea para liberación sistémica o local y pueden contener excipientes como se ha descrito anteriormente para la administración parenteral y otros excipientes usados en una preparación tópica tales como co-disolventes, tensioactivos, aceites, humectantes, emolientes, conservantes, estabilizantes y antioxidantes. Se puede usar cualquier tampón farmacológicamente aceptable, por ejemplo, tampones de tris o de fosfato.

La administración puede ser también intranasal o por otras vías no parenterales. La inmunoglobulina anti-células pan T se puede administrar también por medio de microesferas, liposomas u otros sistemas de liberación con micropartículas colocados en ciertos tejidos incluyendo la sangre.

La inmunoglobulina anti-células pan T se puede administrar también por medio de aerosoles para conseguir una liberación localizada en los pulmones. Esto se lleva a cabo preparando un aerosol acuoso o una preparación liposomial. Se puede usar una suspensión no acuosa (por ejemplo, con propelente fluorocarbonado). En la preparación de aerosoles se usan preferiblemente nebulizadores sónicos. Los nebulizadores sónicos minimizan la exposición del anticuerpo anti-células pan T o sus derivados al cizallamiento, que podría dar como resultado la degradación de la inmunoglobulina anti-células pan T.

Ordinariamente un aerosol acuoso se prepara formulando una solución o suspensión acuosa de inmunoglobulina anti-células pan T junto con excipientes y estabilizantes convencionales farmacéuticamente aceptables. Los excipientes y estabilizantes variarán dependiendo de los requerimientos de la particular inmunoglobulina anti-células pan T, pero típicamente incluyen tensioactivos no iónicos (Tweens (marca de fábrica), Pluronics, o polietilenglicol), proteínas inocuas tales como seroalbúmina, ésteres de sorbitano, ácido oleico, lecitina, aminoácidos tales como glicina, tampones, sales, azúcares, o alcoholes de azúcares. Las formulaciones son estériles. Los aerosoles generalmente se pueden preparar a partir de soluciones isotónicas.

Cada uno de los métodos anteriores se ilustran por medio de los siguientes ejemplos, que no se pretende que limiten la invención. Todas las referencias citadas aquí se incorporan como referencia.

Ejemplos Ejemplo 1 A. Identificación de residuos de bajo riesgo en un dominio variable de ratón

Se utilizó un método de la presente invención para preparar los dominios variables de un anticuerpo modificados mediante la identificación de los residuos de bajo riesgo en el dominio variable de un anticuerpo monoclonal de ratón, denominado H65, que pueden ser modificados sin que disminuya la afinidad nativa del dominio para el antígeno mientras que se sigue reduciendo la inmunogenicidad con respecto a los humanos.

Las cadenas ligera y pesada del dominio variable de H65 se determinaron hasta la más cercana semejanza con las secuencias consenso del subgrupo 1 ("hK1") de las cadenas kappa humanas y del subgrupo 3 ("hK3") de las cadenas pesadas humanas, respectivamente. Los segmentos V/J de H65 de las secuencias de las cadenas ligera y pesada se alinean con las dos secuencias consenso del subgrupo humano de las figuras 6A y 6B. Las secuencias de H65 están también contenidas en las SEQ ID Nos. 26 y 28.

En las figuras 6A y 6B, las letras mayúsculas y minúsculas indican el grado de conservación en cualquier posición dada. Por ejemplo, una "A" indica que la alanina está presente en esa posición desde aproximadamente el 90% hasta aproximadamente el 100% de las secuencias humanas conocidas de ese subgrupo (excluyendo los fragmentos pequeños, incompletos); mientras que una "a" indica que la alanina está presente solamente desde aproximadamente 50% hasta aproximadamente 90% del tiempo en esa posición en las secuencias humanas conocidas de ese subgrupo. Una letra minúscula "x" indica la conservación del aminoácido en esa posición menos de aproximadamente 50% del tiempo.

La línea marcada "unir" muestra qué residuos afectan directamente (-) o no afectan directamente (+) a la unión de los bucles CDR con el antígeno. La línea "ocultar" indica los residuos expuestos (+), ocultos (-) o interfaciales (=). En cualquiera de las líneas "unir" y "ocultar", un "0" indica un residuo de significación intermedia en términos de unión al antígeno o colocación del residuo, respectivamente.

Las figuras 6A y 6B revelan que las secuencias de H65 de ratón difieren de las secuencias consenso humanas con las que están alineadas en un total de 94 posiciones. Sesenta y nueve de estas diferencias tienen lugar en las posiciones de moderado riesgo (15 posiciones) o en las posiciones de alto riesgo (54 posiciones) lo que sugiere que el residuo de ratón en esa posición puede ser importante para la función del anticuerpo. La línea "M/H" de la Figura 6 indica específicamente qué posiciones difieren entre los dos pares de secuencias alineadas. Basándose en las consideraciones del nivel de riesgo y del grado de conservación del residuo humano en cada posición presentadas en los párrafos anteriores, estos residuos de las secuencias de H65 designados como M o m en la línea M/H se identifican como residuos a ser mantenidos como "ratón" en una secuencia humanizada, mientras que los designados como H o h se identifican como residuos a ser cambiados a "humanos".

Veinticinco diferencias aparecen en las posiciones de bajo riesgo en las cuales difieren las secuencias humanas y de ratón. En trece de estas posiciones (designadas como "H" sobre las líneas M/H de la Figura 6) el residuo de ratón se alinea con un aminoácido consenso humano que está muy conservado. Por tanto, el residuo de ratón en esa posición se identifica como uno que debe ser cambiado a residuo humano conservado.

En cuatro posiciones de bajo riesgo (designadas "m") en las cuales difieren las secuencias humanas y de ratón, el residuo de ratón se alinea con un aminoácido consenso humano que está moderadamente conservado. Sin embargo, puesto que el residuo de ratón se encuentra en esa posición en otras secuencias reales de anticuerpos humanos (en las secuencias de Kabat de proteínas de interés inmunológico), las posiciones se identifican como unas a ser mantenidas como "ratón". En siete posiciones de bajo riesgo (designadas "h"), el residuo de ratón se alinea con un aminoácido consenso humano que está moderadamente conservado pero el residuo de ratón no se encuentra en esa posición en una secuencia real de anticuerpo humano en el libro de Kabat. Por tanto, estas posiciones se identifican como a ser cambiadas a "humanas".

En una posición de bajo riesgo (designada "m") en la cual difieren las secuencias humanas y de ratón, el residuo de ratón se alinea con un aminoácido consenso humano que está pobremente conservado. Por tanto, esa posición se identifica como una a ser mantenida como "ratón".

Las líneas "prop" de la Figura 6 indican las secuencias de las cadenas ligera y pesada del dominio variable del anticuerpo H65 en las cuales los residuos identificados por los métodos de la presente invención como los que pueden ser modificados sin disminuir la afinidad nativa del dominio variable de H65 para CD5, se cambian a residuos humanos. Por tanto, las líneas "prop" de las figuras 6A y 6B indican las secuencias de los aminoácidos de la cadenas humanizadas, ligera (SEQ ID NO: 27) y pesada (SEQ ID NO: 29), del dominio variable del anticuerpo H65.

Ejemplo 2 A. Síntesis de los segmentos V/J de las cadenas ligera y pesada de H65

Basándose en las secuencias de aminoácidos humanizados de bajo riesgo de los segmentos V/J de las cadenas ligera y pesada del dominio variable del anticuerpo H65 descritas en el Ejemplo 1, se sintetizaron genes sintéticos de los segmentos V/J de las cadenas ligera y pesada de H65. Las secuencias de aminoácidos, humanizadas, se tradujeron de forma inversa con el paquete de software PCGENE (Intelligenetics, Mountain View, California). Los codones de aminoácidos para cada posición se eligieron que fueran idénticos al codón de ratón en las posiciones en las que se mantenía el residuo de aminoácidos de ratón, o que eran concordantes tan estrechamente como era posible con un codón de un gen de anticuerpo nativo basándose en las secuencias génicas publicadas por Kabat et al., cita anterior. Para la expresión del anticuerpo humanizado completo en células de mamíferos, se incluyeron como parte de los genes humanizados, polinucleótidos que codifican las secuencias líder nativas de ratón. Cada gen, pesado o ligero, se ensambló a partir de seis oligonucleótidos que se solapan, y se amplificó por PCR. Se sintetizó cada oligonucleótido con un sintetizador de DNA Cyclone modelo 8400 (Milligen/Biosearch, Burlington, Massachusetts). Se introdujeron sitios de restricción en los segmentos de DNA amplificados para clonar los genes del anticuerpo (pesados o ligeros) dentro de los vectores de expresión finales. Se introdujo un sitio de restricción SalI en cada región V hacia arriba del codón de iniciación, ATG. Se introdujo un sitio de restricción BstEII en el extremo 3' de la región J de la cadena pesada, mientras que se introdujo un sitio de restricción HindIII en el extremo 3' de la región J de la cadena ligera.

B. Construcción del gen que codifica la región variable humanizada de la cadena pesada de H65

Los segmentos V y J humanizados de la cadena pesada se ensamblaron a partir de seis oligonucleótidos, HUH-G1, HUH-G2, HUH-G3, HUH-G4, HUH-G5 y HUH-G6, cuyas secuencias están contenidas en la Figura 7B y en las SEQ ID Números 36 a 41 respectivamente. Se amplificaron los oligonucleótidos con los cebadores de la PCR H65G-2S y H65-G2 (SEQ ID Números 42 y 43, respectivamente). Los oligonucleótidos con una longitud mayor que 50 bp se purificaron sobre un gel de poliacrilamida al 15% en presencia de urea al 25%. La extensión de la hebra de DNA y la amplificación del DNA se llevó a cabo con una Taq-polimerasa y el kit GeneAmp usado según instrucciones del fabricante (Perkin-Elmer Cetus, Germany). Los oligonucleótidos que contienen el gen sintético del anticuerpo humanizado se mezclaron en pares (HUH-G1 + HUH-G2, HUH-G3 + HUH-G4, y HUH-G5 + HUH-G6) en reacciones de 100 \mul con 1 \mug de cada DNA, 2,5 U de Taq-polimerasa, KCl 50 mM, TRIS-Cl 10 mM pH 8,3, MgCl_{2} 1,5 mM, y una concentración 200 \muM de cada dNTP. Se incubó el tubo en un Coy TempCycler durante 1 minuto a 94ºC, durante 2 minutos a 55ºC y durante 20 minutos a 72ºC. Una porción de cada producto de reacción (40 \mul) se mezcló en pares (HUH-G1,2 + HUH-G3,4; HUH-G3,4 + HUH-G5,6), se añadieron 2,5 U de Taq y se volvieron a incubar los tubos a 94ºC durante 1 minuto, a 55ºC durante 2 minutos y a 72ºC durante 20 minutos. El gen de la cadena pesada se ensambló después mezclando una cantidad igual del producto de reacción HUH-G1,2,3,4 con el producto de reacción HUH-G3,4,5,6 y llevando el volumen hasta 100 \mul conteniendo 2,5 U de Taq, KCl 50 mM, TRIS-Cl 10 mM pH 8,3, MgCl_{2} 1,5 mM, una concentración 200 \muM de cada dNTP, y 0,5 \mug de cada cebador de amplificación H65G-2S y H65-G2. Se cubrió la reacción con aceite mineral y para la amplificación se usó el siguiente perfil de ciclo: desnaturalización a 94ºC durante 1 minuto, alineamiento a 55ºC durante 2 minutos y extensión del cebador a 72ºC durante 3 minutos. La extensión del cebador se realizó durante 30 ciclos. La secuencia de DNA de la región V/J ensamblada está contenida en la Figura 8A y en la SEQ ID NO: 46. La región V/J ensamblada se cortó con SalI y BstEII, se purificó por electroforesis sobre un gel de agarosa, y se ensambló en un vector de expresión de cadena pesada, pING4612, que es similar al descrito para la expresión de la cadena pesada por Robinson et al., Hum. Antib. Hybridomas, 2, 84 (1991) y descrito en detalle en la solicitud de patente de Estados Unidos Nº de Serie 07/659.409, del mismo propietario, también en tramitación, presentada el 6 de septiembre de 1989, que se incorpora aquí como referencia.

C. Construcción del gen que codifica la región variable humanizada de la cadena ligera de H65

Los segmentos V y J humanizados de la cadena ligera se ensamblaron también a partir de seis oligonucleótidos, \oblongH65K-1, HUH-K1, HUH-K2, HUH-K3, HUH-K4, y HUH-K5, cuyas secuencias están contenidas en la Figura 7 y en las SEQ ID Números 30 a 35, respectivamente. Se amplificaron los oligonucleótidos con los cebadores de la PCR H65K-2S y JK1-HindIII (SEQ ID Números 44 y 45, respectivamente). Los oligonucleótidos que contienen el gen sintético del anticuerpo humanizado se mezclaron en pares (\oblongH65K-K1 + HUH-K1, HUH-K2 + HUH-K3, y HUH-K4 + HUH-K5) y se cultivaron como se ha descrito antes para la cadena pesada. Una porción de cada producto de reacción (40 \mul) se mezcló en pares (\oblongH65K-1/HUH-K1 + HUH-K2,3; HUH-K2,3 + HUH-K4,5) y se trató como antes. El gen de la cadena ligera se ensambló después amplificando el gen de longitud completa con los cebadores de la PCR H65K-2S y JK1-HindIII como se ha indicado antes para la cadena pesada. La secuencia de DNA de la región V/J ensamblada está contenida en la Figura 8B y en la SEQ ID NO: 47. La región V/J ensamblada se cortó con SalI y HindIII, se purificó por electroforesis sobre un gel de agarosa, y se ensambló en un vector de expresión de la cadena ligera del anticuerpo, pING4614, similar a los descritos para la expresión de la cadena ligera por Robinson et al., cita anterior y por la solicitud de patente de Estados Unidos Nº 07/659.409, cita anterior.

D. Expresión transitoria de H65 IgG humanizado

Los vectores de expresión que contienen las secuencias de la cadena ligera y de la cadena pesada del H65 humanizado bajo el control del promotor LTR del virus de la leucemia Abelson (descrito por Robinson et al., cita anterior y por la solicitud de patente de Estados Unidos Nº 07/659.409, cita anterior) y las regiones 3' no traducidas gamma-1 humana (para la cadena pesada) y kappa de ratón (para la cadena ligera) se transfectaron por lipofección a una cepa CHO-K1 que expresa el antígeno SV40 T. Después del tratamiento con el reactivo de lipofección (Bethesda Research Labs, Gaithersburg, Maryland) más DNA durante 5 horas a 37ºC, se añadió medio F12 de Ham conteniendo suero fetal bovino (FBS, concentración final de FBS = 10%) y se incubaron las células durante 48 horas más. Después de este periodo de incubación, se separó el medio suplementado con FBS y se reemplazó con medio libre de suero (HB-CHO) (Irvine Scientific, Irvine, California) y se incubaron las células durante 7 días más. Como un testigo, se transfectaron también las células CHO-K1 con la cadena ligera y la cadena pesada de H65 quimérico (constituida cada una por segmentos V/J de ratón sin modificar fusionados con un segmento C humano) en vectores de expresión similares a los descritos antes. Después de la incubación, se recogieron los sobrenadantes y se ensayaron por ELISA en cuanto a la presencia de IgG segregada. Todos los sobrenadantes contenían aproximadamente 0,03-0,06 \mug/ml de IgG.

Ejemplo 3

El anticuerpo H65 modificado de acuerdo con los métodos de la presente invención se ensayó para determinar si mantenía la afinidad nativa para el antígeno. Se comparó su capacidad de unión con la de un anticuerpo H65 quimérico (constituido por la cadena ligera y la cadena pesada del H65 quimérico descritas en el Ejemplo 2) que tiene la misma afinidad para CD5 que el anticuerpo de ratón H65 no modificado.

A. Preparación de H65 IgG humanizado y quimérico para unión competitiva

El H65 humanizado (hH65) y el H65 IgG quimérico (cH65) procedentes de las transfecciones transitorias descritas antes se concentraron desde 4 ml hasta un volumen final de 100 \mul por centrifugación usando un Centricon 30 (Amicon, Amicon Division of W.R. Grace and Co., Beverley, Massachusetts) a 4ºC. Ambos concentrados, de hH65 y de cH65, se lavaron entonces una vez con 1,0 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,2 y se volvieron a concentrar hasta aproximadamente 100 \mul. Como un testigo, se concentró de manera similar el medio de cultivo HB-CHO solo (CM) o el medio suplementado con cH65 purificado (CM + cH65). Las concentraciones finales de hH65 y cH65 se determinaron por ELISA (anti- kappa humano para pre-recubrimiento, anti-gamma humano marcado con peroxidasa para detección) usando IgG quimérica como estándar.

B. Radiomarcado de cH65 IgG

Se yodaron 20 \mug de cH65 IgG purificado (1 mCi de Na^{125}I, Amersham, Arlington Heights, Illinois) usando perlas de lactoperoxidasa (Enzymobeads, BioRad Laboratories, Richmond, California) en PBS. Se dejó que se llevara a cabo la yodación durante 45 minutos a 23ºC. Se purificó el ^{125}I-cH65 IgG del ^{125}I no unido, mediante filtración en gel usando una columna de Sephadex G-25-80. Se determinó la concentración y la actividad específica midiendo las cuentas precipitadas por TCA antes y después de la purificación.

C. Unión competitiva de hH65 para cH65 IgG

Las células Molt4-M, que expresan CD5 en su superficie, se extendieron en placas con fondo en V con 96 pocillos a una densidad de 3 x 10^{5} células por pocillo y se sedimentaron por centrifugación. Se decantó el medio, y se añadieron a cada pocillo 100 \mul de cH65 IgG purificado a concentraciones finales de 200 nM a 0,0017 nM (diluido en 3 veces) en "BHD" [DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbecco) + BSA al 1% + Hepes 10 mM, pH 7,2] (BHD), seguido por 100 \mul de ^{125}I-cH65 IgG (concentración final = 0,1 nM) en BHD. Para las determinaciones de un único punto, se añadieron a los pocillos 50-100 \mul de los concentrados de Centricon® como sigue: hH65 (concentración final = 0,54 nM), cH65 (concentración final = 0,22 nM), CM + cH65 IgG purificado (concentración final = 30 nM) y CM solo. Estos fueron seguidos por la adición de ^{125}I-cH65 IgG (concentración final = 0,1 nM). Se dejó que se llevara a cabo la unión durante 5 horas a 4ºC. Al final de las 5 horas, se terminó la unión mediante tres lavados con BHD enfriado con hielo usando la centrifugación para sedimentar las células. Se determinó la radiactividad solubilizando el ^{125}I-cH65 IgG unido, con NaOH 1 N y contando en un Beckman Gamma 8000 (Beckman Instruments, Fullerton, California).

El cH65 IgG purificado desplazó efectivamente de la unión al ^{125}I-cH65 IgG con una ED_{50} de aproximadamente 1,0 nM como se muestra en la Figura 9, en la que los círculos abiertos indican cH65, los cuadrados sombreados indican hH65 y los triángulos sombreados indican CM + cH65 purificado. El hH65 fue tan efectivo en desplazar a ^{125}I-cH65 IgG como lo fueron el cH65 purificado y CM + cH65 IgG purificado, a sus concentraciones respectivas. No se observó ninguna competición con CM como se esperaba. Estos resultados demuestran que los cambios de bajo riesgo hechos a lo largo de la modificación del hH65 no disminuyeron la afinidad de unión de este anticuerpo para el antígeno CD5.

Ejemplo 4

El método de la presente invención para preparar los dominios variables de anticuerpos modificados mediante la identificación de los aminoácidos modificables se aplicó a las secuencias del dominio variable del anticuerpo anti-TAC [SEQ ID Nos. 49 (cadena ligera) y 53 (cadena pesada)] y la secuencia modificada resultante se comparó con las secuencias del anticuerpo anti-TAC humanizado [SEQ ID Nos. 51 (cadena ligera) y 55 (cadena pesada)] descritas en Queen et al., cita anterior.

Los resultados se muestran en las figuras 10A y 10B. La secuencia modificada según la presente invención [SEQ ID Nos. 50 (cadena ligera) y 54 (cadena pesada)] se muestra en las líneas marcadas "prop" y la secuencia humanizada de Queen se muestra en las líneas marcadas "Que". Las modificaciones de las secuencias humanizadas de Queen se basaron en la secuencia del anticuerpo EU humano [SEQ ID Nos. 48 (cadena ligera) y 52 (cadena pesada)]. La comparación revela muchas diferencias entre la secuencia propuesta generada por los métodos de la presente invención y la secuencia humanizada de Queen. Las diferencias que son las que más probablemente afecten a la actividad de unión de sus anticuerpos humanizados están en las posiciones 4 (L en lugar de M), 15 (P en lugar de V), 36 (F en lugar de Y), 47 (W en lugar de L), 71 (Y en lugar de F) y 80 (A en lugar de P) de la cadena ligera, así como la posición 69 (L en lugar de I) de la cadena pesada.

Ejemplo 5 Los anticuerpos activos modificados se pueden hacer evolucionar hacia humanos

Si es deseable humanizar un dominio variable de un anticuerpo más allá de los cambios identificados antes, adicionalmente, se pueden hacer cambios de más alto riesgo para transformar el dominio.

Los residuos de más alto riesgo se pueden cambiar en una ronda de mutagénesis subsiguiente a los cambios de bajo riesgo, en grupos más pequeños, de forma que las mutaciones perjudiciales puedan ser rápidamente identificadas y corregidas antes de que se suprima la actividad de unión. (Los cambios de bajo riesgo se pueden hacer todos de una vez, con poco temor de suprimir la actividad).

Por ejemplo, debido a que en el modelo tridimensional de cada subunidad, el marco 1 y el marco 3 (F1 y F3 en las figuras 2 y 3) forman bucles semi-independientes sobre la superficie de la subunidad, las mutaciones de moderado o alto riesgo se pueden dividir por tanto en cuatro grupos (constituidos por F1 y F3 en la subunidad ligera y F1 y F3 en la subunidad pesada). Se pueden hacer cuatro construcciones diferentes, conteniendo cada una mutaciones "humanas" de más alto riesgo en una sola región marco, quedando las otras tres regiones marco completamente "de ratón", y se pueden ensayar en cuanto a su actividad. Esta técnica evita el dilema surgido de otros métodos de humanización en los que se hacen todos los cambios de más alto riesgo de una vez, haciendo difícil determinar cuál de los muchos cambios de aminoácidos es responsable de afectar a la actividad de unión al antígeno. La creación de anticuerpos según la invención que tienen cambios de moderado riesgo se describe a continuación.

Ejemplo 6 Identificación de residuos de moderado riesgo en el dominio variable de ratón

Las secuencias consenso humanas en las que los residuos de moderado riesgo se convierten de residuos de ratón a residuos humanos, se representan en las figuras 16A y 16B como líneas marcadas como hK1 (esto es, subgrupo 1 de la cadena kappa humana) y hH3 (esto es, subgrupo 3 de la cadena pesada humana). Los símbolos en esta figura, para la conservación y para el riesgo se usan de acuerdo con las figuras 6A y 6B.

En la línea marcada con "mod", un punto (.) representa un residuo que puede ser mutado de "ratón" a "humano" en moderado riesgo. Hay 29 de tales posiciones de moderado riesgo.

El residuo de ratón coincide con el residuo consenso humano más del 50% del tiempo en 131 posiciones (102 posiciones coinciden 90%-100% y 29 posiciones coinciden de 50% a 90%). Estas posiciones no fueron cambiadas.

Las líneas marcadas M/H en las figuras 16A y 16B indican las 91 posiciones que difieren significativamente entre las secuencias de ratón y las humanas (esto es, en las que las secuencias humanas tienen el residuo de ratón menos del 50% del tiempo). Las posiciones de moderado riesgo, designadas m en la línea M/H, se mantuvieron como "ratón"; mientras que las designadas H o h se cambiaron a humanas. Las 25 posiciones de bajo riesgo que ya eran semejantes a humanas o que fueron humanizadas previamente (como se ha descrito antes en el Ejemplo 1) se designan " ^ " en la línea M/H. Finalmente, las 54 posiciones de alto riesgo en las que los residuos de ratón y humanos no coinciden, se designan M y se mantienen como "ratón".

Aparecen quince diferencias en las posiciones de moderado riesgo en las que difieren las secuencias de ratón y humanas. En diez de estas posiciones (designadas "H" en las líneas M/H de la Figura 6) el residuo de ratón se alinea con un aminoácido consenso humano que está altamente conservado. Por tanto, el residuo de ratón en dicha posición se identifica como uno a ser cambiado en residuo humano conservado.

En las posiciones de moderado riesgo (designadas "m") en las que difieren las secuencias de ratón y humanas, el residuo de ratón se alinea con un aminoácido consenso humano que está moderadamente conservado. Sin embargo, puesto que el residuo de ratón se encuentra en esa posición en otras secuencias reales de anticuerpos humanos (en las secuencias de Kabat de proteínas de interés inmunológico), las posiciones se identifican como unas a ser mantenidas como "ratón". Aunque no hay tales posiciones en esta secuencia particular, tales posiciones pueden estar en otros anticuerpos.

En cuatro posiciones de moderado riesgo (designadas "h"), el residuo de ratón se alinea con un aminoácido consenso humano que está moderadamente conservado pero el residuo de ratón no se encuentra en esa posición en una secuencia de anticuerpo humano real según Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, cita anterior. Por tanto, esa posición se identifica como una a ser cambiada a "humana".

En una posición de moderado riesgo (designada "m"), en la que difieren las secuencias de ratón y humanas, el residuo de ratón se alinea con un aminoácido consenso humano que está pobremente conservado. Por tanto, esa posición se identifica como una a ser mantenida como "ratón".

La cadena pesada de H65 humanizado que contiene los residuos de moderado riesgo se ensambló mediante una estrategia similar a la usada para los residuos de bajo riesgo. El vector de expresión de moderado riesgo se ensambló a partir de vectores intermedios. Las seis secuencias de oligonucleótidos (oligos) descritas en la Figura 7B y marcadas como HUH-G11, HUH-G12, HUH-G3, HUH-G4, HUH-G5 y HUH-G6 (las secuencias de HUH-G11 y HUH-G12 se indican en las SEQ ID Nos. 56 y 57) se ensamblaron por la PCR. Los oligonucleótidos que contienen el gen sintético del anticuerpo humanizado se mezclaron en pares (HUH-G11 + HUH-G12, HUH-G3 + HUH-G4, y HUH-G5 + HUH-G6) en una reacción de 100 \mul con 1 \mug de cada DNA y se completaron como se ha descrito antes. Una porción de cada producto de reacción se mezcló en pares (HUH-G11,12 + HUH-G3,4; HUH-G3, 4 + HUH-G5,6), se añadieron 2,5 U de Taq y las muestras se volvieron a incubar como se ha descrito antes. La región J se ensambló mezclando cantidades iguales del producto de reacción HUH-G11,12,3,4 con el producto HUH-G3,4,5,6, seguido por la PCR con 0,5 \mug de los cebadores H65G-2S y H65-G2 como se ha descrito antes. El producto de reacción se cortó con SalI y BstEII, y se clonó en el vector de expresión similar al descrito para la cadena pesada por Robinson et al., Hum. Antib. Hybridomas, 2: 84 (1991), generando pING4617. Este plásmido se secuenció con Sequenase (USB, Cleveland) revelando que dos residuos estaban alterados (un G-A en la posición 288 y un A-T en la posición 312, numeradas desde el principio de la secuencia líder). La región variable correcta se restableció por sustitución de esta región desde pING4612, generando la secuencia de la región V esperada en pING4619.

Se construyó un vector intermedio que contiene los otros cambios de moderado riesgo por ensamblaje por la PCR de los oligos HUH-G13, HUH-G14, HUH-G15, y HUH-G16 (Figura 7A y SEQ ID Nos: 58-61). Los oligos HUH-G13 + HUH-G14 y HUH-G15 + HUH-G16 se mezclaron y se completaron con polimerasa Vent (New England Biotabs) en una reacción que contiene KCl 10 mM, TRIS 20 mM pH 8,8, (NH_{4})_{2}SO_{2} 10 mM, MgSO_{4} 2 mM, Triton X-100 (marca comercial) al 0,1%, 100 ng/ml de BSA, una concentración 200 \muM de cada dNTP, y 2 unidades de polimerasa Vent en un volumen total de 100 \mul. La mezcla de reacción se incubó a 94ºC durante 1 minuto, seguido por 2 minutos a 50ºC y 20 minutos a 72ºC. Los productos de reacción (40 \mul) se mezclaron y amplificaron con los oligonucleótidos H65-G13 y H65-G2 con polimerasa Vent en la misma solución tampón de reacción y se amplificaron durante 25 ciclos con desnaturalización a 94ºC durante 1 minuto, alineamiento a 50ºC durante 2 minutos y polimerización a 72ºC durante 3 minutos. El producto de la reacción se trató con polimerasa T4 y después se digirió con AccI. El fragmento de 274 pares de bases (bp) se purificó sobre un gel de agarosa y se ligó junto con el fragmento de 141 bp de SalI a AccI desde pING4619 a pUC18 cortado con SalI y SmaI para generar pING4620. El pING4620 contiene la secuencia señal completa, la región V, y la región J de la cadena pesada de moderado riesgo de H65.

El vector de expresión final para la cadena pesada de moderado riesgo de H65, pING4621, se ensambló clonando el fragmento de SalI a BstEII a partir de pING4620 en el mismo vector de expresión descrito antes.

Ejemplo 7 A. Ensamblaje de la cadena ligera de moderado riesgo

Los segmentos V y J humanizados de moderado riesgo de la cadena ligera se ensamblaron a partir de seis oligonucleótidos, \oblongH65K-1, HUH-K7, HUH-K6, HUH-K8, HUH-K4 y HUH-K5. Las secuencias de HUH-K7, HUH-K6 y HUH-K8, se indican en las SEQ ID Nos. 62 a 64 y en las figuras 7 y 7A, respectivamente. Se amplificaron los oligonucleótidos con los cebadores de la PCR H65K-2S y JK1-HindIII. Los oligonucleótidos que contienen el gen sintético del anticuerpo humanizado se mezclaron en pares (\oblongH65-K1 + HUH-K7, HUH-K6 + HUH-K4 + HUH-K5) y se incubaron con polimerasa Vent como se ha descrito para la cadena pesada de moderado riesgo. Una porción de cada producto de reacción (40 \mul) se mezcló en pares (\oblongH65H-K1/HUH-K7 + HUH-K6,8; HUH-K6,8 + HUH-K4,5) y se completó como antes. El gen de la cadena ligera se ensambló después amplificando el gen de longitud completa con los cebadores de la PCR H65K-2S y JK1-HindIII con polimerasa Vent durante 25 ciclos como se ha indicado antes. La región V/J ensamblada se cortó con SalI y BstEII, se purificó por electroforesis sobre un gel de agarosa, y se ensambló en un vector de expresión de la cadena ligera del anticuerpo, pING4630.

B. Transfección estable de las células linfoides de ratón para la producción del anticuerpo He3

La línea celular Sp2/0 (American Type Culture Collection # CRL1581) se cultivó en medio de Eagle modificado por Dulbecco más 4,5 g/l de glucosa (DMEM, Gibco) más suero fetal bovino al 10%. Los medios se suplementaron con glutamina/penicilina/estreptomicina (Irvine Scientific, Irvine, California).

Se usó el método de electroporación de Potter, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:7161 (1984). Después de la transfección, se dejó que se recuperaran las células en DMEM completo durante 24-48 horas, y después de sembraron de 10.000 a 50.000 células por pocillo en placas de cultivo de 96 pocillos en presencia de un medio selectivo. La selección con histidinol (Sigma) se hizo a 1,71 \mug/ml, y con ácido micofenólico (Calbiochem) se hizo a 6 \mug/ml más 0,25 mg/ml de xantina (Sigma). La técnica de electroporación dio una frecuencia de transfección de 1-10 x 10^{-5} para las células Sp2/0.

El plásmido de expresión de la cadena ligera de He3, pING4630, se linealizó por digestión con la endonucleasa de restricción PvuI y se transfectó a células Sp2/0, dando clones resistentes al ácido micofenólico que se cribaron para la síntesis de la cadena ligera. Los 4 mejores transfectantes que producen la cadena ligera después de terminar el crecimiento, se reunieron en 2 grupos de 2 transfectantes/grupo y cada grupo se transfectó con el plásmido de expresión de la cadena pesada de He3, pING4621, que había sido linealizado con PvuI. Después de la selección con histidinol, el clon que produce la mayor parte de la cadena ligera más la cadena pesada, Sp2/0-4630 + 4621 clon C1718, segregó el anticuerpo a aproximadamente 22 \mug/ml en presencia de 10^{-7} en dexametasona en un cultivo sobrecrecido en un frasco T25. Este transfectoma ha sido depositado ante la American Type Culture Collection, 1230 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852 el 1 de diciembre de 1992 como ATCC HB 11206.

C. Purificación del anticuerpo He3 segregado en cultivo de tejido

Se hacen crecer las células Sp2/0-4630 + 4621 en medio de cultivo HB101 (Hana Biologics) + suero fetal bovino al 1%, suplementado con HEPES 10 mM, 1x de glutamina/penicilina/estreptomicina (Irvine Scientific #9316). El medio gastado se centrifuga a aproximadamente 5.000 x g durante 20 minutos. El nivel de anticuerpo se mide por ELISA. Aproximadamente 200 ml de sobrenadante de cultivo celular se carga sobre una columna con 2 ml de proteína A (Sigma Chemicals), equilibrada con PBS (tampón de NaCl 0,15 M, fosfato de sodio 5 mM, fosfato de potasio 1 mM, pH 7,2). El anticuerpo He3 se eluye con una etapa de gradiente de pH (pH 5,5, 4,5 y 2,5). Una fracción que contiene el anticuerpo He3 (9% de rendimiento) pero no el anticuerpo bovino, se neutraliza con Tris 1 M pH 8,5, y después se concentra 10 veces por medio de Centrium 30 (Amicon), se diluye 10 veces con PBS, se reconcentra 10 veces por medio de Centrium 30 (Amicon), se diluye 10 veces con PBS, y finalmente se reconcentra 10 veces. El anticuerpo se conservó en alícuotas de 0,25 ml a -20ºC.

D. Medidas de la afinidad de He3 IgG para CD5

La afinidad del He3 para CD5 se determinó usando células Molt-4M, que expresan CD5 sobre su superficie y H65 IgG quimérico marcado con ^{125}I en un ensayo competitivo de unión.

Para este ensayo, se yodaron 20 \mug de H65 IgG quimérico (cH65 IgG) por exposición a 100 \mul de perlas inmovilizadas de lactoperoxidasa-glucosa-oxidasa (Enzymobeads, BioRad), 100 \mul de PBS, 1,0 mCi de ^{125}I (Amersham, IMS30), 50 \mul de b-D-glucosa 55 mM durante 45 minutos a 23ºC. Se sofocó la reacción por la adición de 20 \mul de metabisulfito de sodio 105 mM y yoduro de potasio 120 mM seguido por centrifugación durante 1 minuto hasta que se sedimentaron las perlas. Se purificó el ^{125}I-cH65 IgG por filtración en gel usando 7 ml de Sephadex G25, usando PBS (NaCl 137 mM, KH_{2}PO_{4} 1,47 mM, Na_{2}HPO_{4} 8,1 mM, KCl 2,68 mM a pH 7,2-7,4) más BSA al 0,1%. Se determinaron la recuperación de ^{125}I-cH65 IgG y la actividad específica por precipitación con TCA.

La unión competitiva se realizó como sigue: 100 \mul de células Molt4-M se lavaron dos veces con tampón de unión DHB enfriado en hielo (medio de Eagle modificado por Dulbecco (Gibco, 320-1265PJ), BSA al 1,0% y Hepes 10 mM, pH 7,2-7,4). Se resuspendieron las células en el mismo tampón, se extendieron en placas con 96 pocillos de fondo en V (Costar) a una densidad de 3 x 10^{5} células por pocillo y se sedimentaron a 4ºC por centrifugación durante 5 min a 1.000 rpm usando un rotor Beckman JS 4,2; se añadieron entonces a cada pocillo 50 \mul de ^{125}I-cH65 IgG 0,1 nM concentrado al doble en DHB y se pusieron a competir con 50 \mul de cH65 IgG concentrado al doble o con el anticuerpo humanizado en DHB en concentraciones finales de anticuerpo de 100 nM a 0,0017 nM. El anticuerpo humanizado se obtuvo de los sobrenadantes del cultivo de Sp2/0 clon C1718 que expresa el He3 IgG. La concentración del anticuerpo en los sobrenadantes se estableció por ELISA usando un anticuerpo quimérico como estándar. Se dejó que se llevara a cabo la unión a 4ºC durante 5 horas y se terminó lavando las células tres veces con 200 \mul de tampón de unión DHB por centrifugación durante 5 min a 1.000 rpm. Todos los tampones y operaciones se llevaron a cabo a 4ºC. Se determinó la radiactividad solubilizando las células en 100 \mul de NaOH 1,0 M y contando en un contador gamma automático Cobra II (Packard). Los datos de los experimentos de unión se analizaron por el programa de ajuste de la curva por los mínimos cuadrados ponderados no lineales, MacLigand, una versión de Macintosh del programa de ordenador "Ligand" de Munson, Analyt. Biochem., 107: 220 (1980). Se usaron criterios estadísticos objetivos (prueba F, principio de suma de cuadrados extra) para evaluar la corrección del ajuste y para discriminar entre modelos. La unión no específica se trató como un parámetro sujeto a error y se ajustó simultáneamente con otros parámetros.

Los resultados del ensayo competitivo de unión se dan en la Fig. 11. Estos resultados demuestran que los cambios de moderado riesgo hechos en He3 IgG dan como resultado un anticuerpo con una afinidad más alta que la forma quimérica ratón-humana de este anticuerpo (cH65) para su objetivo CD5. En este caso particular, los cambios de moderado riesgo parece que aumentan ligeramente la afinidad, pero se puede esperar una disminución en la mayoría de los casos.

Ejemplo 8 Preparación de la inmunoglobulina anti-células pan T en XMMLY-H65

El anticuerpo monoclonal murino producido por la línea celular XMMLY-H65 (MoAbH65) es reactivo con el antígeno CD5 humano. La línea celular XMMLY-H65 fue depositada ante la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852 y recibió el No. de acceso HB9286.

El MoAb H65 fue producido después de la inmunización de ratones BALB/c con la línea HSB-2 de células T humanas originalmente aislada de un paciente con leucemia linfocítica aguda de células T. Adams, et al., Can. Res. 28: 1121 (1968). La línea de células de mieloma murino P3 7 NS/1-Ag-1-4 de Kohler et al., Ernr. J. Immunol. 6: 292 (1976) se fusionó con las células del bazo procedentes de un ratón inmunizado por la técnica de Galfre et al., Nature 266: 550 (1977). Se encontró que una de las colonias híbridas resultantes segregaba un MoAb que reconoce un antígeno de los linfocitos pan T con un peso molecular de 67 kD, expresado sobre aproximadamente el 95% de los linfocitos T periféricos [Knowles, Leukocyte Typing II, 1, (E. Reinherz, et al., eds. Springer Verlag (1986)]. Este antígeno no está presente en la superficie de ninguna otra célula hematopoyética, y el propio anticuerpo ha sido ensayado en cuanto a su unión con una gran serie de tejidos humanos normales y se ha encontrado que es negativo para todas las células excepto para los linfocitos T y una subpoblación de linfocitos B.

La línea celular híbrida que produce el anticuerpo H65 fue clonada dos veces por dilución limitante y se hizo crecer como tumores ascíticos en ratones BALB/c.

El MoAb H65 se purificó desde la ascitis de ratón por una modificación del método de Ey et al., Immunochem. 15: 429 (1978). Brevemente, la ascitis de ratón descongelada se filtró para separar los materiales lipídicos y se diluyó con 2 a 3 volúmenes de NaPO_{4} 0,14 M, pH 8,0, antes de su aplicación sobre una columna de sefarosa con proteína A inmovilizada, de tamaño apropiado. Los materiales no unidos se separaron de la columna lavando con NaPO_{4} 0,14 M, pH 8,0, hasta que no se observó ningún cambio adicional en la absorbancia a 280 nm. Se realizaron entonces una serie de lavados de la columna con citrato de sodio 0,1 M (pH 6,0, pH 5,0, pH 4,0, y pH 3,0) para eluir el anticuerpo unido.

Se reunieron las fracciones pico, se ajustaron a pH 7,0 con Tris-base saturado, y se concentraron usando una cubeta agitada con membrana Amicon YM10 (Amicon, Lexington, New York). Después se dializó una solución del anticuerpo frente a solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,0, y se almacenó congelada a -70ºC.

El MoAb H65 es de la subclase IgG_{1}, como se determina por doble difusión en agar con el uso de antisueros específicos de la subclase (Miles-Yeda, Ltd. Rehovot, Israel). Las características serológicas de este anticuerpo y las características bioquímicas del antígeno gp67 (esto es, CD5) se examinaron durante el First International Workshop on Human Leukocyte Differentiation Antigens (Paris, 1982). Se encontró que el MoAb H65 (grupo de trabajo número. T34) y otros nueve MoAbs tenían el mismo patrón serológico y que inmunoprecipitaban el antígeno gp67. Knowles, Reinhers, et al., Leukocyte Typing II, 2: 259-288 (Springer Verlag (1986). En otros estudios, se ha demostrado que el MoAb H65 bloquea la unión de anti-Leu-1 conjugado con FITC (Beckton Dickson, Mountain View, CA) sobre las células gp67+, lo que indica que ambos anticuerpos reconocen el mismo epítopo sobre la molécula gp67 o determinantes que están localizados en una configuración tal como para que resulte un bloqueo por impedimento estérico.

Ejemplo 9 El uso de Lyt-1 en el tratamiento profiláctico de la artritis inducida por colágeno en ratones DBA/IJ

La artritis inducida por colágeno (CIA) es un modelo de artritis reumatoide humana ampliamente utilizado. La CIA se caracteriza por una artritis poliarticular crónica que se puede inducir en roedores y en primates por inmunización con colágeno Tipo II nativo, homólogo o heterólogo. La artritis resultante se parece a la artritis reumatoide porque tiene secuelas histopatológicas similares, respuestas inmunitarias celulares y humorales similares y una asociación restringida con haplotipos específicos del principal complejo de histocompatibilidad (MHC).

El colágeno Tipo II nativo, heterólogo, emulsionado con el adyuvante completo de Freund induce una reacción autoinmune semejante a la artritis en los ratones DBA/IJ después de una única inyección intradérmica en la cola. Los ratones se obtuvieron de Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine. Inicialmente, la artritis se manifiesta como una ligera hinchazón de uno o más dedos en la cuarta semana post-inmunización. La fase crónica de la CIA empeora continuamente a lo largo de las 8 semanas siguientes ya que la artritis progresa desde los dedos hasta las restantes articulaciones periféricas y finalmente acaba con anquilosis de las articulaciones involucradas. La histopatología de la CIA se caracteriza por la infiltración de linfocitos del espacio articular, la expresión sinovial de MHC clase II y la formación de pannus. No todas las articulaciones están involucradas en cada ratón, por lo que hay un espectro de gravedad artrítica. En un grupo de diez o más ratones, la gravedad artrítica global se desarrolla en forma lineal a lo largo de 10-12 semanas.

Se usó el modelo CIA para ensayar la eficacia potencial de un anticuerpo monoclonal dirigido frente al antígeno de superficie de las células pan T, Lyt-1, el equivalente murino de CD5. Se administró el anticuerpo a los ratones antes de la inmunización con colágeno Tipo II. Los ratones DBA/I normales fueron tratados también con una única inyección i.v. de 0,4 mg/kg de anti-Lyt-1 y fueron sacrificados después de 72 horas para análisis FACS y para ensayos de proliferación in vitro sobre las células del bazo y de los nódulos linfáticos. Cualquier eficacia de este anticuerpo podría indicar un método beneficioso dirigido hacia las células T en la artritis reumatoide a través del antígeno de superficie CD5.

Efectos del anti-Lyt-1 sobre las células del bazo y de los nódulos linfáticos de ratones DBA/IJ

El anticuerpo 53-7.313 es un anticuerpo monoclonal IgG_{2a} de rata (No. de acceso en ATCC TIB 104) reactivo con todos los alelos del antígeno de diferenciación de los linfocitos de ratón, Lyt-1. El anticuerpo IND_{1} es una IgG1 de ratón, anticuerpo anti-melanoma humano usado como un control negativo (Xoma Corp., Berkeley, CA). Todos los demás anticuerpos se obtuvieron de Pharmingen Inc. (San Diego, CA) como conjugados directos para cuantificación en un instrumento Becton-Dickinson FACScan.

Se administró a ratones DBA/IJ machos, de 6-8 semanas de edad, una dosis intravenosa única o de solución salina tamponada con fosfato, o de IND1 o de anti-Lyt-1 a través de la vena caudal a 0,4 mg/kg en 0,1 ml de solución salina tamponada con fosfato. Se sacrificaron los ratones para análisis tres días después de la administración. Se prepararon suspensiones individuales de las células de los bazos y de los nódulos linfáticos periféricos por procedimientos estándar y se tiñeron 1 x 10^{6} células con los respectivos anticuerpos para el análisis de separación de células activadas por fluorescencia (FACS). Se realizaron también ensayos de proliferación para proporcionar una segunda medida del agotamiento de las células T. Las células (1 x 10^{5}/pocillo) fueron estimuladas con concanavalina A, interleuquina-2 (IL-2), IL-2 y H57.597 (un anticuerpo receptor de las células pan \alpha, \beta T) o con las enterotoxinas estafilocócicas A y B. Se cultivaron las células durante un total de 72 horas y se cuantificó la proliferación mediante la adición de ^{3}H-metiltimidina durante las últimas 24 horas. Después de 72 horas, se recogieron las células con un sistema de recolección y contaje Inotech INB-384, que recoge las células sobre filtros de fibra de vidrio con subsiguiente detección de las partículas beta proporcionales al gas. Los resultados se expresan generalmente como la media de pocillos triplicados \pm SEM en las tablas 5 y 6.

A. Análisis FACS de las células de los nódulos linfáticos y del bazo

Las células de los nódulos linfáticos (LNC) y las células del bazo (SPC) de cada grupo de tratamiento (n = 3/grupo) se analizaron por análisis FACS para la expresión en porcentaje del receptor de las células \alpha, \beta T (\alpha, \betaTCR), CD3, CD4, CD5, y CD8. Los resultados se presentan en la Tabla 4.

En la Tabla 4, la significación estadística se determinó por análisis de varianza seguido por la nueva prueba post-hoc de rango múltiple de Duncan. Estos datos indican que la administración de anticuerpo anti-Lyt-1 da como resultado una reducción significativa de los linfocitos T periféricos en el punto de tiempo de 72 horas. Los resultados no se podrían explicar por el anticuerpo circulante residual ya que también otros marcadores de las células T (CD3, etc.) se reducen en una proporción similar.

TABLA 4 Análisis FACS de ratones DBA/IJ tratados con anti-Lyt-1

Tratamiento	tipo de célula	\alpha, \betaTCR	CD3	CD4	CD8	CD5
PBS	LNC	80,2 \pm 2,2%	79,8 \pm 1,6%	58,7 \pm 1,4%	19,4 \pm 2,6%	80,0 \pm 0,6%
IND1	LNC	82,5 \pm 1,3%	82,6 \pm 1,9%	60,9 \pm 2,0%	21,1 \pm 1,5%	78,5 \pm 1,2%
\alphaLyt-1	LNC	*62,7 \pm 5,8%	*62,4 \pm 1,0%	*42,0 \pm 1,9%	21,1 \pm 0,2%	*56,0 \pm 2,6%
PBS	SPC	18,0 \pm 2,8%	25,0 \pm 0,1%	16,5 \pm 2,1%	4,10 \pm 0,5%	23,1 \pm 0,1%
IND1	SPC	19,3 \pm 1,6%	22,8 \pm 1,4%	13,9 \pm 0,8%	4,20 \pm 0,3%	20,8 \pm 1,5%
\alphaLyt-1	SPC	14,0 \pm 0,3%	*13,8 \pm 0,4%	*8,07 \pm 0,3%	*2,40 \pm 0,1%	*11,0 \pm 0,1%

B. Efectos de la administración de anti-Lyt-1 sobre el análisis de proliferación

Los ensayos de proliferación in vitro se realizaron sobre ratones de cada grupo de tratamiento (n = 3/grupo) en respuesta a la concanavalina A, IL-2, IL-2 + H57, enterotoxinas estafilocócicas A y B (SEA y SEB). Los resultados se presentan en la Tabla 5.

Globalmente, estos datos indican que hay una reducción observable y funcional de los linfocitos T periféricos de los ratones DBA/IJ 72 horas después de una dosis única intravenosa (0,4 mg/kg) de anticuerpo anti-Lyt-1.

TABLA 5 Análisis de proliferación de ratones DBA/IJ tratados con anti-Lyt-1

Tratamiento	Concanavalina A	IL-2	IL-2 + H57	SEA	SEB
IND1	26547 \pm 3501	1181 \pm 234	11341 \pm 1663	12324 \pm1968	8747 \pm 2025
\alphaLyt-1	*11561 \pm 4375	*593 \pm 274	*4090 \pm 2383	*5568 \pm 2576	*1138 \pm 350

C. Efectos del anti-Lyt-1 sobre la artritis inducida por colágeno en ratones DBA/IJ a. Materiales y métodos

Se administraron a ratones DBA/IJ machos, de 6-8 semanas de edad los anticuerpos 53-7.313 (anti-Lyt-1), IND1 (anti-melanoma) o solución salina tamponada con fosfato (PBS) en dos dosis intravenosas (0,4 mg/kg) 48 horas aparte del comienzo, cuatro días antes de la inmunización con 100 \mug de colágeno Tipo II bovino emulsionado con un volumen igual de adyuvante completo de Freund hasta un volumen final de inyección de 100 \mul. Cada grupo de dosis constaba de diez ratones. Se hizo seguimiento de los ratones semanalmente empezando el día 21 después de la inmunización. Se hicieron puntuaciones de los ratones individuales en cuanto a la gravedad de la artritis graduando cada pata en una escala de 0 a 2. Una puntuación de 1 indicó una hinchazón en hasta dos dedos y una puntuación de 2 indicó una hinchazón en más de dos dedos hasta la implicación total de la pata y anquilosis de la articulación grande en los últimos puntos de tiempo. Un ratón individual podría tener una puntuación máxima de gravedad artrítica de 8. Se vigilaron los ratones hasta el día 80 después de la inmunización con colágeno y después se sacrificaron por luxación cervical. Los resultados se expresan como la puntuación artrítica media para cada grupo de dosis.

Los cambios de la puntuación artrítica a lo largo del estudio se muestran en la Figura 12. La conclusión global de la Figura 12 es que la administración del anticuerpo anti-Lyt-1 antes de la inmunización con colágeno causó una disminución significativa en la gravedad resultante de la artritis. En todos los grupos de tratamiento, la aparición de síntomas visibles empezó aproximadamente 30 días después de la inmunización y progresó linealmente hasta el final del estudio. El grupo de tratamiento con anti-Lyt-1 empezó a mostrar mejoría de los síntomas artríticos el día 48 y nunca desarrolló artritis en la misma extensión que los otros dos grupos. El comienzo de la artritis no se retrasó significativamente por el tratamiento con anti-Lyt-1.

Se determinó la significación estadística por un análisis de varianza de medidas repetidas con una variable entre sujetos (tratamiento con anticuerpo). Fue necesario un análisis de medidas repetidas puesto que cada ratón fue comprobado continuamente a lo largo de la duración del estudio. Por tanto, las puntuaciones artríticas en días consecutivos no se pueden considerar como observaciones independientes contribuyendo a los grados globales de libertad en la prueba F para diferencias significativas entre grupos. Un análisis de medidas repetidas usa los grados de libertad del número de individuos por grupo en lugar del número de observaciones. Un análisis de varianza típico entre sujetos puede ser inapropiado y puede indicar una significación falsa entre los grupos de tratamiento. Se hizo una comparación de medios en el tratamiento por día después de la inmunización para determinar la significación del tratamiento con anti-Lyt-1 en relación a los grupos testigos con PBS y IND1.

En conclusión, la administración intravenosa de un anticuerpo monoclonal de rata reactivo frente al equivalente de CD5 en el ratón, Lyt-1, es capaz de disminuir significativamente los linfocitos T en el bazo y en los nódulos linfáticos periféricos después de una única dosis de 0,4 mg/kg. Esta disminución de las células T es el mecanismo probable para la disminución significativa (p < 0,01) de la gravedad artrítica observada con la misma dosis de anti-Lyt-1 antes de la inmunización con colágeno Tipo II.

Ejemplo 10 Reducción de las células T humanas de ratones SCID por tratamiento con MoAb H65

Los ratones con inmunodeficiencia combinada grave (CB.17 scid/scid; SCID) mantienen células linfoides humanas durante varios meses después del transplante de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC). Tales ratones quiméricos, denominados ratones PBMC/SCID, tienen células humanas funcionales, como se muestra por la presencia de Ig humana en su suero. Los ratones PBMC/SCID mantienen células T humanas en tejidos tales como el bazo y la sangre. Las células T humanas presentes en los ratones PBMC/SCID son predominantemente de un fenotipo maduro y expresan antígenos de células T, incluyendo CD3, CD5, CD7, y CD4 o CD8. En adición, la mayor parte de las células T parece que son células con memoria activada, a juzgar por la expresión de HLA-DR y CD45RO. Estas células T trasplantadas parece que son funcionales puesto que (a) pueden proporcionar ayuda a las células B para producir anticuerpos frente al toxoide tetánico, (b) producen receptores solubles de la interleuquina-2 (sIL-2R) que se pueden detectar en el plasma, y (c) proliferan en respuesta a los anticuerpos monoclonales mitogénicos anti-CD3 humano suplementados con IL-2 in vitro.

Debido a la presencia de células T y B humanas, los ratones PBMC/SCID ofrecen un sistema modelo in vivo en el que se puede evaluar la eficacia de los fármacos anti-células T humanas, tales como el MoAb H65, una IgGI de ratón dirigida frente al CD5 humano.

Los ratones SCID se obtuvieron de Taconic, Germantown, NY, y a las 6 a 7 semanas de edad fueron inyectados intraperitonealmente (i.p.) con 200 mg/kg de ciclofosfamida para asegurar el transplante de PBMC humanas. Dos días más tarde, fueron inyectados i.p., con 25 a 40 x 10^{6} PBMC humanas, aisladas por centrifugación por gradiente de densidad en Ficoll-Hypaque a partir de muestras de linfaféresis obtenidas de donantes normales (HemaCare Corporation, Sherman Oaks, CA).

A las 2 a 3 semanas después de la inyección de PBMC, se desangraron los ratones desde el seno retro-orbital y se cuantificaron los niveles de inmunoglobulina humana (Ig) y de sIL-2R humano en el plasma usando el ensayo ELISA en sandwich. Los ratones con niveles bajos o indetectables de estas proteínas humanas se eliminaron del estudio y los restantes se dividieron en los diferentes grupos de tratamiento (6 por grupo). Se administraron después a los ratones MoAb H65 (0,2 ó 0,02 mg/kg/día), fragmento F(ab')_{2} basado en H65 (2 mg/kg/día) o vehículo (solución tampón), intravenosamente (i.v.) por medio de 10 inyecciones en días consecutivos. Un día después de la última inyección, se desangraron los ratones y se recogieron los bazos. Se prepararon por métodos estándar suspensiones celulares individuales de las células sanguíneas y de los esplenocitos. Se analizaron entonces las células recogidas usando citometría de flujo para determinar los marcadores de superficie de las células T humanas.

Se tiñeron de doscientas mil a quinientas mil células con los siguientes Abs conjugados con FITC o PE (Beckton-Dickinson, Mountain View, CA): HLe-1-FITC (anti-CD45), Leu-2-FITC (anti-CD8) y Leu-3-PE (anti-CD4). Se analizaron las muestras en un FACScan usando amplificadores log. Las regiones para cuantificar las células positivas se fijaron basándose en la tinción de las células obtenidas de ratones SCID nativos. Los números absolutos de células positivas frente a antígenos humanos recuperadas de los tejidos SCID se determinaron multiplicando el porcentaje de células positivas por el número total de células recuperadas de cada muestra de tejido. El número total de leucocitos en la sangre se calculó usando un volumen teórico de sangre de 1,4 ml/ratón. Las comparaciones estadísticas entre los grupos de tratamiento se hicieron usando la prueba U de Mann-Whitney.

El número de células T humanas (células CD4 más CD8) recuperadas de los bazos y de la sangre de ratones PBMC/SCID después de tratamiento con MoAb H65 o con vehículo (testigo) se muestra en la Figura 13. De los bazos y de la sangre de los ratones tratados con 0,2 o con 0,02 mg/kg/día de MoAb H65 se recogieron números significativamente más bajos de células T en comparación con los de los ratones tratados con el vehículo. En contraste, el tratamiento con 2 mg/kg/día de un fragmento F(ab')_{2} basado en H65 no agotó de forma significativa las células T humanas de los bazos o de la sangre, ni siquiera cuando se usó una dosis de 10 a 100 veces más alta (Figura 14).

Estos resultados indican que un MoAb anti-CD5 humano agota las células T humanas en un modelo animal experimental. La capacidad de este MoAb para reducir las células T humanas de los ratones SCID es aparentemente dependiente de la porción Fc del MoAb, ya que el fragmento F(ab')_{2} fue ineficaz.

Ejemplo 11 El uso del anticuerpo monoclonal OX19 en el tratamiento profiláctico de la artritis inducida por colágeno en las ratas BB resistentes a la diabetes

La artritis inducida por colágeno (CIA) en las ratas Biobreeding resistentes a la diabetes (DR BB) es un modelo animal particularmente relevante de la artritis reumatoide humana, porque el gen RT1-D\beta de la rata DR BB codifica una secuencia nucleotídica homóloga a la del gen HLA-DR\beta humano descrito como asociado con la susceptibilidad a la artritis reumatoide. En este modelo, se administra a las ratas DR BB una única inyección intradérmica caudal de colágeno Tipo II heterólogo emulsionado con adyuvante incompleto de Freund. El desarrollo de la artritis es considerablemente más rápido que en el modelo DBA/1J CIA. El comienzo de los signos clínicos ocurre 1,5 a 2 semanas después de la inmunización con colágeno, observándose el pico de la hinchazón unos días después del comienzo. La incidencia es generalmente bastante alta (> 85% de los animales inmunizados). La hinchazón es generalmente grave, incluye toda la planta de la pata y la articulación del tobillo, y está restringida a las patas traseras. El examen histopatológico ha revelado que la artritis empieza como una sinovitis proliferativa con formación de pannus en los márgenes articulares que va seguida por una erosión bidireccional tanto de la capa exterior (no mineralizada) como de la capa interior (mineralizada) del cartílago.

Este experimento usa el modelo de rata DR BB CIA para evaluar la eficacia de un anticuerpo monoclonal (MoAb), OX19 dirigido frente al equivalente del antígeno CD5 en la rata. Se administró el anticuerpo a las ratas antes de la inmunización con colágeno Tipo II. Se trataron también ratas Sprague-Dawley normales con una única inyección i.v. de 0,5 mg/kg y se sacrificaron después de 3 horas para la evaluación de la unión de MoAb a las células T, o después de 2 días para la cuantificación de las células T en los tejidos linfoides usando la citometría de flujo.

A. Efectos del MoAb OX19 sobre las células T en tejidos linfoides de ratas Sprague-Dawley normales

El MoAb OX19 es una IgG1 de ratón dirigida frente al equivalente del antígeno CD5 en la rata, presente en las células T de rata. El hibridoma OX19 está disponible en la European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) y tiene el número ECACC No. 84112012. El MoAb H65, una IgG1 de ratón reactiva frente al CD5 humano, se usó como un control negativo que coincide con el isotipo. Los anticuerpos conjugados con fluoresceína dirigidos frente a los antígenos de superficie de las células pan T de rata (W3/13), células CD4 (W3/25) y células CD8 (OX8) se obtuvieron de Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY para cuantificación de las células T de los tejidos linfoides de rata, por citometría de flujo. La IgG1 anti-ratón de cabra conjugada con ficoeritrina (Caltag laboratories, South San Francisco, CA) se usó para detectar el MoAb OX19 unido a las células T de rata en un análisis de dos colores.

A ratas Sprague-Dawley machos (Simonsen Laboratories, Gilroy, CA), de 100 a 150 gramos, se administró una única inyección i.v. en bolus de MoAb OX19 (0,5 mg/kg) o de MoAb control (0,5 mg/kg) en solución salina tamponada de fosfato conteniendo Tween 80 (PBS/Tween) al 0,1%. Se sacrificaron los animales a las 3 horas (experimento de unión) o a los dos días (experimento de agotamiento) después de la administración. Se prepararon suspensiones individuales de células de la sangre, bazos y nódulos linfáticos por procedimientos estándar y se tiñeron 1 x 10^{6} células con los anticuerpos apropiados para análisis FACS.

a. Unión del MoAb OX19 a las células T de rata in vivo

Las células de la sangre, bazo y nódulos linfáticos de un animal en cada grupo de tratamiento se analizaron para determinar el porcentaje de células T CD4 y CD8, y el porcentaje de células T CD4 y CD8 que también se tiñen positivamente para la IgG1 de ratón (mIgG1) unida a la superficie. Los resultados se presentan en la Tabla 6. Las células T se agotaron en la sangre a las 3 horas después de la administración del MoAb OX19. Casi todas las células T que permanecieron en la sangre, y la mayor parte de las presentes en el bazo y en los nódulos linfáticos de la rata tratada con el MoAb OX19 se tiñeron también positivamente para la IgG1 de ratón unida a la superficie, lo que indica que la dosis de MoAb OX19 usada fue suficiente para saturar la mayor parte de las células T en estos órganos linfoides principales. Estos resultados proporcionan dosis útiles en aplicaciones terapéuticas.

TABLA 6 Unión del MoAb OX19 a las células T de rata in vivo

				% de células positivas
Tejido	Tratamiento	CD4	CD4/mIgG1*	CD8	CD8/mIgG1*
Sangre	MoAb H65	47,0	6,7	11,1	5,7
	OX19	8,7	96,2	4,1	70,2
Bazo	MoAb H65	23,1	14,8	4,4	20,6
	MoAb OX19	16,4	84,8	3,4	73,6
Nódulos	MoAb H65	66,9	4,2	7,4	6,5
linfáticos
	MoAb OX19	54,7	96,2	7,3	96,8
* El % de células CD4 o CD8 que son positivas también para la IgG1 de ratón

b. Efecto del tratamiento con MoAb OX19 sobre las subpoblaciones de células T en los tejidos linfoides de rata

Se analizaron las células de la sangre, del bazo y de los nódulos linfáticos de dos animales en cada grupo de tratamiento para determinar el porcentaje de células pan T, CD4 y CD8. Los resultados se presentan en la Tabla 7 como la media de los dos animales. El tratamiento con MoAb OX19 dio como resultado el agotamiento de las células T de todos los tejidos examinados en comparación con el tratamiento con el MoAb control. Estos resultados también proporcionan dosis apropiadas para ser usadas en aplicaciones terapéuticas usando los anticuerpos según la invención.

TABLA 7 Análisis FACS de tejidos de ratas tratadas con MoAb OX19

			% de células positivas
Tejido	Tratamiento	Pan-T	CD4	CD8
Sangre	MoAb H65	61,8	50,4	12,0
	MoAb OX19	47,0	37,3	8,8
Bazo	MoAb H65	36,0	25,3	7,1
	MoAb OX19	21,5	9,9	5,0
Nódulos	MoAb H65	74,5	62,7	13,1
linfáticos
	MoAb OX19	33,8	24,9	4,3

Ejemplo 12 Efecto del tratamiento con MoAb OX19 sobre el desarrollo de la artritis inducida por colágeno en ratas DR BB

Se administró a ratas DR BB/Wor machos (obtenidas de las instalaciones de cría de la Universidad de Massachusetts; 8 por grupo de tratamiento), de 6 semanas de edad, inyecciones i.v. de MoAb OX19 (0,5 mg/kg), de MoAb control (0,5 mg/kg) o de solución tampón (PBS/Tween), el día 7 y el día 4 anteriores a la inmunización en la base de la cola realizada el día 0 con 0,3 mg de colágeno Tipo II bovino emulsionado en 0,15 ml de adyuvante incompleto de Freund. Se asignaron diariamente a las ratas puntuaciones de la artritis empezando 8 días después de la inmunización con colágeno. Se graduó la gravedad en una escala de 0 a 2, indicando una puntuación de 1 una hinchazón moderada e indicando una puntuación de 2 una hinchazón grave. Un animal individual podría tener una puntuación máxima de gravedad artrítica de 4 si hubiera implicación bilateral de las patas traseras.

Los cambios de la puntuación artrítica a lo largo del estudio se muestran en la Figura 15 y la incidencia artrítica para cada grupo de tratamiento se presenta en la Tabla 8.

Las ratas testigo (tratadas con tampón y con MoAb control) desarrollaron artritis grave, predominantemente bilateral de las patas traseras, entre los días 10 y 14 con alta incidencia (88% para ambos grupos). El tratamiento con MoAb OX19 evitó completamente el desarrollo de la artritis (0% de incidencia).

En conclusión, una dosis intravenosa de 0,5 mg/kg de un MoAb de ratón dirigido frente al equivalente de CD5 en la rata, se encontró que satura y posteriormente agota las células T de los tejidos linfoides de las ratas normales. Este agotamiento de las células T es el mecanismo probable para la inhibición completa del desarrollo de la artritis observada cuando se administró el MoAb antes de la inmunización con colágeno Tipo II en las ratas DR BB.

TABLA 8 Efecto del tratamiento con MoAb OX19 sobre la incidencia de la artritis

Tratamiento	Artritis total	Artritis total	Puntuación de "2"	Puntuación de "2"
	(1 o ambas patas)	(ambas patas)	(1 o ambas patas)	(ambas patas)
PBS/Tween	7/8 (88%)	7/8 (88%)	7/8 (88%)	5/8 (63%)
MoAb control	7/8 (88%)	4/8 (50%)	6/8 (75%)	4/8 (50%)
MoAb OX19	0/8 (0%)	0/8 (0%)	0/8 (0%)	0/8 (0%)

Ejemplo 13 Tratamiento de la artritis reumatoide

Se seleccionan pacientes que tienen artritis reumatoide (RA) para tratamiento usando un anticuerpo anti-células pan T de esta invención.

El anticuerpo anti-CD5 preparado como se ha descrito antes se administra a los pacientes en dosis de aproximadamente 0,005 a 2,0 mg/kg/día durante un periodo de 1-5 días, preferiblemente 1-2 días. Alternativamente, se puede administrar la dosis cada 2-30 días en lugar de diariamente si se usan MoAbs quiméricos y humanizados debido al aumento de su semivida. Para determinar la dosis y la pauta de dosificación óptimas, se tratan los pacientes con cada dosis y pauta en un régimen de aumento de la dosis. Se hace seguimiento de los pacientes usando varios indicios, incluyendo la hinchazón de las articulaciones y las puntuaciones del dolor a la palpación. Los resultados se muestran en la Figura 11.

Ejemplo 14 Tratamiento del SLE

El lupus eritematoso sistémico (SLE) es una enfermedad multisistémica caracterizada por inflamación y autoinmunidad. Algunas de las manifestaciones más frecuentes incluyen fatiga, anemia, fiebre, exantemas, fotosensibilidad, alopecia, artritis, pericarditis, pleuresía, vasculitis, nefritis y enfermedad del sistema nervioso central. Según los criterios revisados para la clasificación de SLE, se dice que una persona tiene SLE a fines de los estudios clínicos si cualquiera de cuatro o más de los criterios especificados antes están presentes de forma seriada o simultáneamente, durante cualquier intervalo de observación.

El anticuerpo anti-CD5 preparado como se ha descrito antes se administra a los pacientes en dosis de aproximadamente 0,005 a 2,0 mg/kg/día durante un periodo de 1-5 días, preferiblemente 1-2 días. Alternativamente, se puede administrar la dosis cada 2-30 días en lugar de diariamente si se usan MoAbs quiméricos y humanizados debido al aumento de su semivida. Para determinar la dosis y la pauta de dosificación óptimas, se tratan los pacientes con cada dosis y pauta en un régimen de aumento de la dosis.

Ejemplo 15 Tratamiento de la psoriasis

La psoriasis es una enfermedad de etiología autoinmunitaria que clásicamente se presenta como placas sobre los codos y las rodillas, aunque frecuentemente están afectadas otras áreas de la piel. También se observan frecuentemente anormalidades de las uñas y articulaciones. Puede aparecer una afección de las articulaciones particularmente inflamatoria en una forma ocasionalmente erosiva y grave.

El anticuerpo anti-CD5 preparado como se ha descrito antes se administra a los pacientes en dosis de aproximadamente 0,005 a 2,0 mg/kg/día durante un periodo de 1-5 días, preferiblemente 1-2 días. Alternativamente, se puede administrar la dosis cada 2-30 días en lugar de diariamente si se usan MoAbs quiméricos y humanizados debido al aumento de su semivida. Para determinar la dosis y la pauta de dosificación óptimas, se tratan los pacientes con cada dosis y pauta en un régimen de aumento de la dosis.

La observación clínica incluye la evaluación del estado global del paciente así como una especial atención a las placas psoriásicas. Adicionalmente, se recomienda el seguimiento de parámetros de laboratorio tales como el recuento de glóbulos blancos y el recuento diferencial. Los síntomas que pueden indicar pobre tolerancia a la terapia o complicaciones incluyen naúseas, vómitos, fatiga, exantema, fiebre, escalofríos y síncopes. Cualquier agotamiento no explicado de los glóbulos blancos distintos de los linfocitos es una indicación para discontinuar la terapia. Preferiblemente, se realiza el análisis diferencial de los linfocitos. Esto es, se debe realizar el análisis del número total de células T y células B.

Ejemplo 16 Tratamiento de la diabetes Tipo I

Hay dos tipos principales de diabetes. El Tipo I ha sido clásicamente asociado con un requerimiento de insulina exógena. El Tipo I aparece típicamente antes de la edad de 40 años y se asocia con una ausencia de secreción de insulina. El páncreas de los pacientes con diabetes Tipo I insulino-dependiente a largo plazo, carece de las células de los islotes pancreáticos. Hay grandes indicios de que la etiología de la diabetes Tipo I insulino-dependiente (IDDM) es autoinmune.

Se diagnostican los pacientes de IDDM basándose en los criterios establecidos por la American Diabetes Association. El anticuerpo anti-CD5 preparado como se ha descrito antes se administra a los pacientes en dosis de aproximadamente 0,005 a 2,0 mg/kg/día durante un periodo de 1-5 días, preferiblemente 1-2 días. Alternativamente, se puede administrar la dosis cada 2-30 días en lugar de diariamente si se usan MoAbs quiméricos y humanizados debido al aumento de su semivida. Para determinar la dosis y la pauta de dosificación óptimas, se tratan los pacientes con cada dosis y pauta en un régimen de aumento de la dosis.

Durante el estudio, se hizo seguimiento de los pacientes por parámetros clínicos y de laboratorio. Los síntomas clínicos que indican una pobre tolerancia a la terapia o complicaciones incluyen fatiga, vómitos, exantema, fiebre, escalofríos y síncopes. La evaluación del laboratorio incluyó recuento de glóbulos blancos con análisis diferencial diariamente y niveles de glucosa en sangre al menos dos veces al día.

Usando los criterios de diagnóstico predictivos del comienzo de la diabetes Tipo I, se pueden seleccionar los pacientes para un tratamiento profiláctico. Este tratamiento sigue la dosis y la pauta indicada antes para el tratamiento de la diabetes clínica insulino-dependiente.

Aunque la invención ha sido descrita en términos de ejemplos específicos y realizaciones preferidas, se entiende que los expertos en la técnica podrán pensar en variaciones y mejoras de los mismos. Por tanto, se reconoce que hay numerosas variaciones y mejoras que caen dentro del alcance de la invención que se reivindica.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: Studnicka, Gary M

\hskip3,3cm

Little II, Roger G.

\hskip3,3cm

Fishwild, Dianne M.

\hskip3,3cm

Kohn, Fred R.

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Métodos y materiales para la preparación de dominios variables de anticuerpos modificados y usos terapéuticos de los mismos.

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 64

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN POSTAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Marshall, O'Toole, Gerstein, Murray & Bicknell

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CALLE: Two First National Plaza, 20 South Clark Street

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CIUDAD:Chicago

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

ESTADO: Illinois

\vskip0.333000\baselineskip

(E)

PAÍS: USA

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 60603

\vskip0.666000\baselineskip

(v)

FORMA DE LECTURA EN ORDENADOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disco magnético flexible

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release #1,0, Versión #1,25

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA DE SOLICITUD:

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.666000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL AGENTE/APODERADO:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Gruber, Lewis S.

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 30.060

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 27129/30637

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 312/346-5750

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 312/984-9740

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TELEX: 25-3856

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO: 1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 107 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

3

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO: 2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 113 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO: 3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 103 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 111 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 113 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

7

8

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 122 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

9

10

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 117 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

11

12

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 126 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

13

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:9:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Lys Gly Asn Gln Lys}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:10:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Lys Gly}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:11:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Ser Thr}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:12:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Gly Phe Cys Ser Ser Ala Ser Cys}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:13:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 107 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

14

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:14:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 107 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

15

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:15:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 108 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

16

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:16:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 106 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

17

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:17:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 104 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:18:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 100 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

19

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:19:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 106 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

20

21

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:20:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 107 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

22

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:21:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 105 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

23

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:22:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 96 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

24

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:23:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 119 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

25

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:24:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 119 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

26

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:25:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 117 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

27

28

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:26:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 107 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

29

30

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:27:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 107 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

31

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:28:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 118 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

32

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:29:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 118 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29:

\vskip1.000000\baselineskip

33

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:30:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 98 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

AGTCGTCGAC ACGATGGACA TGAGGACCCC TGCTCAGTTT CTTGGCATCC TCCTACTCTG

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GTTTCCAGGT ATCAAATGTG ACATCCAGAT GACTCAGT

\hfill

98

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:31:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 80 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TGACTCGCCC GGCAAGTGAT AGTGACTCTG TCTCCCAGAC ATGCAGACAT GGAAGATGAG

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GACTGAGTCA TCTGGATGTC

\hfill

80

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:32:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 79 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TCACTTGCCG GGCGAGTCAG GACATTAATA GCTATTTAAG CTGGTTCCAG CAGAAACCAG

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GGAAATCTCC TAAGACCCT

\hfill

79

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:33:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 79 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GATCCACTGC CACTGAACCT TGATGGGACC CCATCTACCA ATCTGTTTGC ACGATAGATC

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

AGGGTCTTAG GAGATTTCC

\hfill

79

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:34:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 82 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GGTTCAGTGG CAGTGGATCT GGGACAGATT ATACTCTCAC CATCAGCAGC CTGCAATATG

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

AAGATTTTGG AATTTATTAT TG

\hfill

82

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:35:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 82 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GTTTGATTTC AAGCTTGGTG CCTCCACCGA ACGTCCACGG AGACTCATCA TACTGTTGAC

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

AATAATAAAT TCCAAAATCT TC

\hfill

82

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:36:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 85 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 36:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TGTCGACATC ATGGCTTGGG TGTGGACCTT GCTATTCCTG ATGGCAGCTG CCCAAAGTGC

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CCAAGCACAG ATCCAGTTGG TGCAG

\hfill

85

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:37:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 85 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 37:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

AAGGTATACC CAGAAGCTGC GCAGGAGATT CTGACGGACC CTCCAGGCTT CTTCAGGCCA

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GGTCCAGACT GCACCAACTG GATCT

\hfill

85

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:38:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 84 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 38:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GCAGCTTCTG GGTATACCTT CACAAACTAT GGAATGAACT GGGTGAAGCA GGCTCCAGGA

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

AAGGGTTTAA GGTGGATGGG CTGG

\hfill

84

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:39:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 85 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 39:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

AAAGAGAAGG TAAACCGTCC CTTGAAGTCA TCAGCATATG TTGGCTCTCC AGTGTGGGTG

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TTTATCCAGC CCATCCACCT TAAAC

\hfill

85

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:40:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 84 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 40:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GACGGTTTAC CTTCTCTTTG GACACGTCTA AGTGCACTGC CTATTTACAG ATCAACAGCC

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TCAGAGCCGA GGACACGGCT ACAT

\hfill

84

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:41:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 91 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 41:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

AGGAGACGGT GACCGTGGTC CCTTGGCCCC AGACATCGAA GTACCAGTCG TAACCCCGTC

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TTGTACAGAA ATATGTAGCC GTGTCCTCGG C

\hfill

91

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:42:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 42:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

ACTAGTGTCG ACATCATGGC TTGGGT

\hfill

26

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:43:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 43:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GAGGAGACGG TGACCGTGGT

\hfill

20

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:44:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 44:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

AGTCGTCGAC ACGATGGACA TGAGGAC

\hfill

27

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:45:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 45:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GTTTGATTTC AACGTTGGTG C

\hfill

21

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:46:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 425 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 46:

\vskip1.000000\baselineskip

35

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:47:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 401 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 47:

36

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:48:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 107 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 48:

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:49:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 106 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 49:

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:50:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 106 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 50:

\vskip1.000000\baselineskip

40

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:51:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 106 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 51:

\vskip1.000000\baselineskip

41

42

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:52:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 117 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 52:

\vskip1.000000\baselineskip

43

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:53:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 116 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 53:

\vskip1.000000\baselineskip

44

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:54:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 116 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 54:

45

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:55:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 116 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 55:

46

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:56:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 85 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 56:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TGTCGACATC ATGGCTTGGG TGTGGACCTT GCTATTCCTG ATGGCAGCT GCCCAAAGTG

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CCCAAGCAGAGATC CAGTTGGTGCA G

\hfill

82

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:57:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 86 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 57:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

AAGGTATACC CAGAAGCTGC GCAGGAGATT CTGACGGACC CTCCAGGCTT CACCAGGCCT

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CCTCCAGACT GCACCAACTG GATCTC

\hfill

86

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:58:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 84 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 58:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GCAGCTTCTG GGTATACCTT CACAAACTAT GGAATGAACT GGGTGCGCCA GGCTCCAGGA

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

AAGAATTTAG AGTGGATGGG CTGG

\hfill

84

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:59:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 85 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 59:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

AAAGAGAAGG TAAACCGTCC CTTGAAAGAA TCAGCATATG TTGGCTCTCC AGTGTGGGTG

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TTTATCCAGC CCATCCACTC TAAAC

\hfill

85

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:60:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 87 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 60:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GACGGTTTAC CTTCTCTTTG GACGATTCTA AGAACACTGC CTATTTACAG ATCAACAGCC

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TCAGAGCCGA GGACACGGCT GTGTATT

\hfill

87

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:61:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 92 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 61:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GAGGAGACGG TGACCGTGGT CCCTTGGCCC CAGACATCGA AGTACCAGTC GTAACCCCGT

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CTTGTACAGA AATACACAGC CGTGTCCTCG GC

\hfill

92

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:62:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 80 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 62:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TGACTCGCCC GGCAAGTGAT AGTGACTCTG TCTCCTACAG ATGCAGACAG GGAAGATGGA

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GACTGAGTCA TCTGGATGTC

\hfill

80

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:63:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 76 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 63:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

TCACTTGCCG GGCGAATCAG GACATTAATA GCTATTTAAG CTGGTTCCAG CAGAAACCAG

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GGAAAGCTCC TAAGACCCT

\hfill

76

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA ID NO:64:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 79 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 64:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GATCCACTGC CACTGAACCT TGATGGGACC CCAGATTCCA ATCTGTTTGC ACGATAGATC

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

AGGGTATTAG GAGCTTTC

\hfill

79

Claims (5)

1. Un método para preparar un dominio variable de un anticuerpo modificado que comprende:

(a) realizar un alineamiento por homología y una asignación de las posiciones de los aminoácidos de una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de un primer dominio variable de un anticuerpo a ser modificado y realizar un alineamiento por homología y una asignación de las posiciones de los aminoácidos de una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de un primer dominio variable de un anticuerpo a ser modificado;

(b) identificar el riesgo asignado a los aminoácidos de la cadena ligera según el gráfico de posición/riesgo

48

e identificar el riesgo asignado a la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada según el gráfico de posición/riesgo

49

(c) cambiar los residuos de aminoácidos de dicho primer dominio variable del anticuerpo en las posiciones con un riesgo asignado (\bullet), (\blacktriangle) o (\bullet) y (\blacktriangle) hasta un residuo de aminoácidos de la posición correspondiente en una secuencia de aminoácidos de un segundo dominio variable del anticuerpo; y

(d) producir un dominio variable de un anticuerpo modificado que tiene dichos residuos de aminoácidos cambiados, el cual es capaz de unirse al antígeno, sin disminuir la afinidad nativa del dominio para el antígeno mientras que se reduce su inmunogenicidad con respecto a una especie heteróloga.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de aminoácidos de dicho segundo dominio variable de un anticuerpo de la parte (c) es una secuencia consenso de la región variable de la cadena ligera o de la cadena pesada de un anticuerpo.

3. El método de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en el que dicha secuencia de aminoácidos de dicho segundo dominio variable de un anticuerpo de la parte (c) es una secuencia humana de la región variable de la cadena ligera o de la cadena pesada de un anticuerpo.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que los residuos de aminoácidos que se cambian están todos en las posiciones (\bullet).

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que los residuos de aminoácidos que se cambian están en las posiciones (\bullet) y (\blacktriangle).