ES2202368T3 - Hibridos vectoriales retrovirales y su uso para la transferencia genica. - Google Patents
Hibridos vectoriales retrovirales y su uso para la transferencia genica.Info
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Abstract
DEFECTOS DE REPLICACION DE HIBRIDOS VECTORIALES RETROVIRALES, QUE SE CARACTERIZAN PORQUE CONTIENEN A) EN LA REGION PRINCIPAL COMO REGION U5 Y/O EL LUGAR PRIMARIO DE UNION DE TRNA, LA REGION U5 Y/O EL LUGAR PRIMARIO DE UNION DE TRNA DE MESV, Y B) COMO REGIONES U3 Y R EN 3{SUP,''}-LTR, LAS REGIONES U3 Y R DE UN VIRUS DE LA LEUCEMIA MURINA DE FRIEND F-MULV); SON ESPECIALMENTE INDICADOS PARA UNA TRANSFERENCIA GENICA EFECTIVA EN CELULAS HEMATOPOYETICAS.
Description
Híbridos vectoriales retrovirales y su uso para
la transferencia génica.
La invención se refiere a híbridos vectoriales
retrovirales y a su uso para la transferencia génica, en particular
para la transferencia génica en células madre hematopoyéticas
(ES).
Los vectores retrovirales deficientes en su
replicación son en la actualidad el estándar en las aplicaciones de
transferencia génica y de terapia genética en las células del
sistema formador de sangre humano (A.D. Miller (1992) (1), R.C.
Mulligan (1993) (2), R. Vile y S.J. Russell (1994) (3)). Sus
principales ventajas son las siguientes:
- -
- la infección da lugar a una integración estable del vector y de las secuencias de ADN transmitidas por él en el genoma hospedador de células mitóticamente activas
- -
- el número de integraciones en el genoma hospedador puede controlarse por medio de las condiciones de infección
- -
- los aspectos referentes a la seguridad de la transferencia génica retroviral se han investigado a fondo; no se han observado hasta ahora complicaciones en el gran número de aplicaciones en el ser humano.
La ventaja de los vectores retrovirales citada
con mayor frecuencia, es decir la alta eficacia de transferencia
génica, es cierta para la aplicación del sistema formador de sangre
sólo en parte. Los vectores convencionales, basados en el "Moloney
murine sarcoma virus" (MoMuSV) permiten infectar preferentemente
sólo células precursoras tardías, formadoras de sangre en estado de
maduración, presentando un 30 a un 95% de dichas células
precursoras, transducidas con estos vectores, ninguna expresión o
una expresión insuficiente de los genes transferidos (4) debido a
los mecanismos primarios de "silencing"; además, tras un tiempo
de permanencia prolongado in vivo, en un alto porcentaje de
las células que exprimen inicialmente, la expresión génica
controlada retroviralmente se encuentra disminuida hasta ser
inoperante como resultado del "silencing" secundario (Palmer et
al. (1991) (5), Brenner et al. (1993) (6).
Se ha hallado que, a pesar de la integración de
los virus, la expresión del provirus integrado se encuentra
bloqueada también en células embrionales, tales como células
embrionales de carcinoma (derivados mieloides (no linfáticos) de
células madre hematopoyéticas).
Por Stocking et al. (1993) (21) se conocen
mutaciones y derivados de MoMuSV que permiten mejorar la expresión
génica retroviral en células de este tipo. Los híbridos de este tipo
se obtienen por medio de mutación puntual en los LTR, en particular
en la región U3. Por ejemplo, por medio de una mutación puntual en
-345 de MoMuLV, puede reducirse la unión del represor de
ECF-1. Igualmente ventajosa es una mutación puntual
que crea un sitio de unión para SP-1 (por ejemplo
mutación puntual en -166 (S. McKnight y R. Tijan (1986) (16)).
También es ventajoso crear mutaciones fuera de las áreas LTR. Se ha
hallado que una región de 18 bp que sigue directamente al
5'-LTR corriente abajo constituye un elemento de
regulación negativo (NRE, elemento de unión de "silencer"). Una
mutación puntual en este elemento permite mejorar la transcripción
retroviral (virus embrional murina de células madre, MESV; M. Grez
et al. (1990) (22)).
El uso de un "Harvey murine sarcoma virus"
(Ha-MuSV) modificado, cuyas regiones U3 en ambos LTR
se han reemplazado por regiones complementarias del "Friend murine
leukemia virus" (F-MuLV), fue descrito por Velu
et al. (1991) (42) como un vector retroviral eficaz. Este constructo
presenta ya una tasa de expresión mejorada en células madre
hematopoyéticas, en comparación con Ha-MuSV sin
modificar.
El objetivo de la invención es proporcionar
híbridos vectoriales retrovirales que permitan mejorar aún más la
expresión génica retroviral, en particular en células madre
hematopoyéticas y sus derivados mieloides (no linfáticos).
La invención se refiere a un híbrido vectorial
retroviral, caracterizado porque contiene,
- a)
- como región U5 y "tRNA primer binding site" en la región "leader", la región U5 y el "tRNA primer binding site" de MESV y
- b)
- como región U3 y regiones R en 3'-LTR, las regiones U3 y R procedentes de un "Friend murine leukemia virus" (F-MuLV) o del "myeloproliferative sarcoma virus" (MPSV).
También es preferido que los híbridos vectoriales
según la invención contengan, como 3'-LTR, el LTR
procedente de un "Friend murine leukemia virus"
(F-MuLV) y por consiguiente, aparte de las regiones
U3 y R procedentes de MESV, también la región U5 procedente de
F-MuLV.
Los híbridos vectoriales pueden ser deficientes
en su replicación o competentes en su replicación. Por un vector
deficiente en su replicación se entiende un vector que no contiene
funciones de gen retrovirales (gag, env, pol) y, debido a esto, no
es capaz de formar partículas de virus independientemente. Sin
embargo, normalmente el virus contiene una función "packaging"
(psi). Con el fin de formar partículas retrovirales infecciosas, una
línea "packaging" que contiene las funciones de gen gag, env y
pol de forma estable (como episoma o integradas en el genoma), se
transfecta con el vector ADN deficiente en su replicación según la
invención. Se forman transcriptos ARN, los cuales se empaquetan en
partículas de virus debido a las funciones gag y env. Dichas
partículas de virus son deficientes en su replicación, puesto que el
genoma de ARN contenido en ellas no lleva funciones de gen
retrovirales.
Los híbridos vectoriales retrovirales, capaces de
replicación, contienen adicionalmente las regiones de gen gag, pol y
env. Dichas regiones de gen pueden proceder de cualquier retrovirus.
Sólo la región env puede seleccionarse según la célula a infectar.
Sin embargo, los métodos de este tipo son conocidos por los expertos
en la materia. De esta manera, pueden prepararse retrovirus
ecótropos, xenótropos, anfótropos o polítropos, capaces de
replicación.
Informaciones más detalladas sobre esto y sobre
la preparación de vectores, partículas de virus y células ayudadores
se han descrito en M. Kriegler, Gene Transfer and Expression, A
Laboratory Manual, W.H. Freeman & Co. Nueva York (1990),
47-55 y 161-164 (31), expresamente
incorporado en la presente memoria de patente por referencia.
Para los fines de la invención, por proteínas
"silencer" se entienden proteínas nucleares, celulares
(procedentes por ejemplo de la célula mutada), por ejemplo de
células madre hematopoyéticas, las cuales se unen preferentemente a
los primeros 450 bp, preferentemente los primeros 18 bp, de MoMuLV
que siguen directamente al 5'-LTR e inhiben la
transcripción retroviral por interacción con las secuencias
cis-reguladoras del provirus.
Por la región "leader" del MESV, se entiende
la suma de secuencias constituidas por el "repeat" (R) corto
directo terminal, la región U5 y la secuencia que sigue directamente
al 5'-LTR de MESV, que contiene no sólo el "tRNA
primer binding site" sino también la región "packaging"
(\Psi). Como máximo, la región "leader" puede componerse de
la secuencia completa contenida en el virus desde R hasta el inicio
de translación. Sin embargo, preferentemente se utilizará una región
"leader" acortada, constituida, aparte de R y U5,
preferentemente por aproximadamente las primeras 450 bases corriente
abajo del término de la región 5'-LTR. Se prefiere
también que exclusivamente o sustancialmente la región U5 y el
"tRNA primer binding site" procedan de MESV y las demás partes
de la secuencia "leader" de MoMuLV o MoMuSV. Un área MESV
adecuada se ha representado en las figuras (Figs.
1-5) de KpnI (aproximadamente 550) a BaII
(aproximadamente 729).
La región "leader" de MESV corresponde a la
región "leader" de MoMuLV o MoMuSV (secuencia de U3, U5 y R de
MoMuLV y PCMV, véase (22) y (23), en la que se han incorporado
mutaciones puntuales, que sirven para disminuir o impedir la unión
de proteínas "silencer". La región "leader" de MESV
contiene, a diferencia de MoMuLV y PCMV, 5 mutaciones puntuales en
la región 18 bp, que sigue directamente al 5'-LTR
(C. Stocking et al. (1993) (21). Esto reduce drásticamente la
capacidad de unión inhibitoria de proteínas nucleares procedentes de
células infectadas, mejorando la expresión de un gen contenido en el
híbrido vectorial (R. Petersen et al., Mol. Cell. Biol. 11 (1991)
1213-1221 (8). En lugar de estas mutaciones
puntuales, para disminuir o impedir la unión inhibitoria de
proteínas "silencer" por ejemplo a la región "leader" son
aptas también otras (por lo menos una) mutaciones puntuales en la
región "leader" (preferentemente dentro de las primeras 450
bases corriente abajo del término de la región
5'-LTR, y de forma particularmente preferida en la
región de 18 bp). Por ello, para los fines de la invención, por una
región "leader" de MESV se entiende, aparte de la secuencia
citada anteriormente y descrita en SEC ID Nº:1, también una
secuencia que corresponde sustancialmente a dicha sección de SEC ID
Nº:1, contiene un sitio de unión t-ARN y una función
psi. y se ha modificado por medio de mutaciones puntuales de tal
forma que la unión inhibitoria de proteínas "silencer"
procedentes de células previstas para la transfección queda
disminuida o impedida.
Para controlar si una mutación puntual es apta
para impedir la unión de proteínas "silencer" con la región
"leader", es habitual preparar un plásmido que contiene un LTR,
la región "leader" a controlar y un gen indicador,
preferentemente el gen CAT. Las células a controlar se transfectan
con este plásmido, y la actividad CAT se determina después de
preferentemente 48 horas (transfección transitoria). Si se detecta
claramente una actividad CAT, la mutación puntual es apta para
impedir la unión de la proteína "silencer" en estas células (P.
Artelt et al. (1991) (32)).
Los experimentos de transfección transitoria
demuestran que las secuencias cis-reguladoras están
localizadas en la secuencia "leader" de MoMuSV, presentando
dichas secuencias un efecto inhibidor sobre la expresión génica, en
particular en las células tempranas, multipotentes, mieloides
("silencing" primario). La sustitución de esta área por
secuencias "leader" del virus embrional murina de células madre
[MESV (22)] elimina por completo el efecto inhibidor en células
madre mieloides. La secuencia "leader" de MESV tiene su origen
en el retrovirus endógeno del ratón dl-587rev (23) y
se introdujo en MESV para eliminar el "silencing" observado en
el "leader" de MoMuSV en células madre embrionales. El factor
decisivo para la eliminación del "silencing" son mutaciones del
"primer binding site" retroviral (PBS), situado directamente en
3' del 5'-LTR (22).
Los retrovirus del grupo F-MuLV
son conocidos por los expertos en la materia y se han descrito por
ejemplo en D. Linnemeyer et al. (1981) (7), J. Friel et al.
(1990) (9), S.P. Clark y T.W. Mak (1982) (10), L.
Wolff et al. (1985) (11), R.K. Bestwick et al. (1984)
(12), W. Koch et al. (1984) (13) y A. Adachi et al.
(1984) (14). Una vista general se encuentra en W. Ostertag et
al. (1987) (15). Preferentemente, se utilizan los
3'-LTR del virus de histiosarcoma maligno (MHSV)
(9), SFFVp Lilly-Steeves (10), SFFVa
(11), Rauscher SFFV (12), F-MuLV c157
(13) y Friend-mink cell focus forming virus
(F-MCFV FrNx (14), F-MCFV
pFM548 (13)).
Según la invención, las secuencias
3'-LTR aptas del vector ARN genómico son aquellas
que presentan en la región U3 una homología de secuencia de alto
grado con las áreas 3'-LTR de la familia de virus
Friend citada anteriormente. La secuencia LTR de SFFVp se ha
descrito en SEC ID Nº:1 (nucleótidos 1707-2283).
Las ventajas según la invención se muestran en
transfecciones transitorias de constructos de genes "reporter"
en un gran número de líneas representativas del ser humano y del
ratón. Sorprendentemente, se ha hallado que las secuencias U3 de
retrovirus del ratón de la familia de los "Friend murine leukemia
virus" (F-MuLV) en combinación con secuencias
"leader" (preferentemente "tRNA primer binding site") de
MESV permiten una expresión génica particularmente eficaz en las
células madre y precursoras mieloides. El incremento de la expresión
génica conseguido por medio de los híbridos vectoriales según la
invención en comparación con MoMuSV es más de una potencia de diez.
Esto es el caso no sólo de las células precursoras relativamente
tardías de granulocitos, macrófagos y eritrocitos, sino también de
precursores tempranos, multipotentes y también de células madre
mieloides. Los híbridos vectoriales según la invención permiten una
expresión génica eficaz, en particular en las células mieloides, no
maduras, multipotentes, en las que MoMuSV-LTR
presenta un "silencing" primario marcado. La actividad también
es alta en el sistema linfático y en fibroblastos.
Se prefiere en particular un isolado temprano del
"spleen focus forming virus",inductor de policitemia (SFFVp
(7)), cuya secuencia LTR se ha descrito en SEC ID Nº:1 (bp
2654-3230), así como el virus de histiosarcoma
maligno (MHSV (9), LTR SEC ID Nº:4, bp
1707-2324). En la región U3 de estos virus existe
una homología de secuencia de alto grado con otros representantes de
la familia de los virus Friend, tales como SFFVp
Lilly-Steeves (10), SFFVa (11),
Rauscher SFFV (12), F-MuLV c157 (13) y
Friend-mink cell focus forming virus
[F-MCFV FrNx (14), F-MCFV
pFM548 (13)]. Estos y otros retrovirus relacionados con
Friend presentan un modelo de expresión similar al de SFFVp y MHSV,
debido a la homología de secuencia de las regiones U3.
Para el incremento marcado, en comparación con
MoMuSV, de la expresión génica en las células madre y precursoras
mieloides, conseguido por medio de los vectores según la invención
es particularmente ventajosa la presencia de mutaciones en la región
"enhancer" de U3 [situadas a 340 a 140 nucleótidos 5' del
inicio de transcripción (10)]. Es importante la duplicación
parcial del denominado elemento "direct-repeat"
en SFFVp (similar a F-MCFV FrNx) y MHSV. Es posible
que aquí estén situados sitios de unión para los factores de
transcripción, que aseguran una expresión génica eficaz en las
células mieloides.
Directamente en 5' del "direct repeat",
SFFVp y MHSV así como Friend MCFV llevan un sitio de unión para el
factor de transcripción Sp1 (16). Sp1 es capaz de múltiples
interacciones con los factores de transcripción que lo rodean, los
cuales normalmente dan lugar a un incremento sustancial de la
expresión génica. En los derivados de MoMuSV, el
"myeloproliferative sarcoma virus" (MPSV (17),
(18)) y el MPSV pasado por células PCC4 (PCMV (19)),
la presencia de un sitio de unión Sp1 en la región U3 es además
necesaria para anular el "silencing" del
MoMuSV-LTR en las células madre embrionales
(20) así como probablemente también en las células madre de
la sangre (21). Al sitio de unión Sp1 de SFFVp, MHSV así como
a los virus Friend MCF podría corresponder también una función
análoga.
En otra forma de realización de la invención, los
híbridos vectoriales retrovirales pueden contener, como las regiones
U3 y R en 3'-LTR, las regiones U3 y R procedentes de
MPSV. MPSV se distingue de MoMuSV y MoMuLV por mutaciones puntuales
en el LTR (21). Allí el A(-381) se ha eliminado por deleción
y se han realizado los intercambios siguientes: C->T, -345;
T->A, -326; T->A, -249 y A->C, -166 (numeración según
(21)). En este caso, el híbrido vectorial retroviral contiene
en la región "leader", como región U5 y "tRNA primer binding
site", la región U5 y el "tRNA primer binding site" de MESV.
Se ha hallado que híbridos vectoriales MPSV/MESV de este tipo
(denominados de aquí en adelante también MPEV) presentan ventajas
sustanciales frente a los vectores basados en MoMuLV y tienen gran
importancia para un gran número de aplicaciones en la terapia génica
somática.
En 5'-LTR, puede utilizarse
cualquier región U3 y R, puesto que tras la integración del virus,
el U3 se copia en la célula de destino, tras terminarse el ciclo de
vida retroviral, en la posición 5'-LTR, impulsando
la expresión génica. Las regiones U3 y R en 3'-LTR
proceden por ejemplo de derivados de MoMuLV o MoMuSV, tales como por
ejemplo MPSV, PCMV y MESV. Los 5'-LTR igualmente
aptos son los de F-MuLV.
Tras la transducción retroviral de células madre
y precursoras mieloides, los híbridos vectoriales según la invención
presentan una alta expresión específica del tejido. Por tanto,
dichos vectores tienen el potencial de incrementar sustancialmente
la eficacia de transferencia génica en células madre y precursoras
mieloides en comparación con los vectores MoMuSV. Los vectores según
la invención presentan además el potencial de estar sujetos a los
procesos de "silencing" en las células mieloides en un grado
sustancialmente menor que los vectores MoMuSV. La alta y
posiblemente persistente expresión génica de dichos vectores en
células mieloides puede servir de base para aplicar con éxito muchos
protocolos de transferencia génica en el sistema formador de sangre
en el ser humano. La estructura de los constructos descritos en los
ejemplos es tal que los cADN transferidos por el vector pueden ser
reemplazados sin problemas con otros genes.
La especificidad de tejido de la expresión es
apta para anular el "silencing" primario en el sistema
mieloide, observado en los vectores MoMuSV convencionales. Esto da
lugar a un aumento sustancial de las tasas de transferencia génica
funcionales en las células mieloides. Puesto que en la mayoría de
las aplicaciones de transferencia/terapia génica en el sistema
mieloide es deseable una alta tasa de transferencia génica
funcional, este aspecto de los constructos según la invención
constituye una ventaja generalmente aprovechable.
En el sistema mieloide del ratón, se sometieron
las regiones U3 relacionadas con el virus de Friend a una selección
también con respecto a la persistencia de la expresión génica in
vivo. En estos vectores, se observa un "silencing"
secundario en un grado mucho menor que en los vectores MoMuSV. La
exclusión de las secuencias "leader" inhibitorias por reemplazo
con secuencias MESV será otra ventaja respecto a esto. Esto tiene
importancia para todas las aplicaciones de transferencia/terapia
génica en las que es deseable una expresión de larga duración
(posiblemente durante toda la vida) de las secuencias transferidas
retroviralmente en el sistema mieloide (estudios de marcaje génico,
corrección de defectos metabólicos).
A tal fin, los híbridos vectoriales según la
invención pueden contener por lo menos un gen heterólogo para el
virus y que puede exprimirse en células eucariotas. Genes de este
tipo incluyen por ejemplo el gen de "multiple drug resistance"
(gen MDR), un gen de resistencia a los antibióticos, tal como el gen
neo^{R}, el gen LNGFR, el gen de cerebrosida o el gen herpes
simplex TK. En una forma de realización preferida, también es
posible que el híbrido vectorial contenga varios, preferentemente
dos o tres virus heterólogos. Para facilitar una expresión de dichos
genes separados, es ventajoso insertar, antes del segundo o tercer
gen, un promotor, un "splicing site" (preferentemente de SF7Vp)
o un "internal ribosomal entry site" (IRES, preferentemente de
poliovirus (L.R. Ghattas et al. (1991) (26)).
Otro requisito importante de vectores
retrovirales, previstos para ser utilizados para la transferencia
génica en células mieloides, es la generación de altos títulos de
virus en líneas de empaquetado fibroblastoidas. La actividad de las
regiones U3 relacionadas con Friend en líneas de empaquetado de
retrovirus fibroblásticos es en cualquier caso suficiente, en caso
de los constructos ejemplares citados a continuación, para generar
los títulos necesarios de 10^{5} a 10^{6} partículas
retrovirales transmisores de vectores/ml de sobrenadante del cultivo
de células.
Por ello, la invención se refiere también a un
procedimiento para la preparación de una célula eucariota de
transducción retroviral que contiene un gen exógeno, con la
exclusión de células madre embrionales humanas, caracterizado porque
se transduce la célula eucariota con un virus vectorial retroviral,
deficiente en su replicación, el cual contiene en su genoma
- a)
- en la región "leader", como la región U5 y el "tRNA primer binding site", la región U5 y el "tRNA primer binding site" de MESV,
- b)
- como las regiones U3 y R en 3'-LTR, las regiones U3 y R procedentes de un "Friend murine leukemia virus" (F-MuLV) o "myeloproliferative sarcoma virus" (MPSV) y
- c)
- el gen exógeno citado.
Preferentemente, el 3'-LTR
utilizado es el LTR de F-MuLV, el cual contiene en
este caso las regiones U3 y R citadas.
La invención se refiere también a células
eucariotas de transducción, a través de las cuales se dispone que la
célula eucariota se transduce con un defecto de replicación,
vectovirus retroviral, el cual contiene en su genoma
- a)
- en la región "leader", como la región U5 y el "tRNA primer binding site", la región U5 y el "tRNA primer binding site" de MESV,
- b)
- como las regiones U3 y R en 3'-LTR, las regiones U3 y R procedentes de un "Friend murine leukemia virus" (F-MuLV) o "myeloproliferative sarcoma virus" (MPSV).
Opcionalmente, este vector contiene uno o varios
(hasta tres) genes exógenos que pueden exprimirse en la célula
eucariota. Preferentemente, las células eucariotas utilizadas son
células de mamíferos, preferentemente células hematopoyéticas, en
particular células madre hematopoyéticas.
Por un gen activo exógeno se entiende un gen que
se introduce en la célula desde fuera y se exprime (es activo) en
esta célula tras su integración en el genoma. El gen exógeno puede
ser un gen no contenido en el genoma celular (por ejemplo un gen
resistente a los antibióticos, tales como neo^{R}, receptor LNGFR
(D. Johnson et al. (1986) (33)), el gen de cerebrosidasa o el gen
herpes simplex TK) o un gen contenido en el genoma, pero no
exprimido allí o exprimido de forma insuficiente, tal como el
"multiple drug resistance (MDR) gene".
La invención se refiere también a una partícula
de virus deficiente en su replicación, infecciosa, que contiene,
como genoma, un ARN retroviral, en la que el genoma contiene una
región "leader" procedente de MESV que contiene una función
"packaging" y un sitio de unión t-ARN, un gen
que puede exprimirse en una célula eucariota, es heterólogo para el
virus y contiene, por el término 3', U3 y R procedentes de un
"Friend murine leukemia virus" (F-MuLV), pero
no contiene secuencias gag, env y pol activas.
Además, la invención se refiere a un
procedimiento para la preparación de una partícula de virus
deficiente en su replicación, infecciosa, por transfección de una
célula ayudadora eucariota que contiene las funciones ayudadoras
gag, env y pol con un híbrido vectorial que contiene, como región
"leader", la región "leader" de MESV y, como
3'-LTR, el LTR procedente de un "Friend murine
leukemia virus" (F-MuLV) o un
"myeloproliferative sarcoma virus" (MPSV), producción de ARN
correspondiente al ADN del híbrido vectorial como genoma viral en la
célula (por ejemplo por medio de polimerasas celulares), empaquetado
del ARN citado en envolturas de virus vacías, deficientes en su
replicación y formadas en la célula, y aislamiento de las partículas
de virus infecciosas que contienen el genoma viral citado.
La invención se refiere también al uso de un
híbrido vectorial deficiente en su replicación, retroviral, según la
invención, que contiene en la región "leader", como la región
U5 y el "tRNA primer binding site", la región U5 y el "tRNA
primer binding site" de MESV y, como las regiones U3 y R en
3'-LTR, las regiones U3 y R procedentes de un
"Friend murine leukemia virus" (F-MuLV) o de un
"myeloproliferative sarcoma virus" (MPSV), para la preparación
de un medicamento para la terapia génica ex vivo o in
vivo.
I. Todos los métodos de transferencia/terapia
génica somática en los que células madre y precursoras mieloides
representan la población de destino para vectores retrovirales.
Los protocolos individuales integrarán en los
vectores cADN que cada uno es diferente de los otros. Ejemplos de
los mismos incluyen
- -
- Estudios de marcaje génico (1): genes marcadores capaces de selección, tales como neoR o "nerve growth factor receptor" acortado se transmiten para seguir el destino de la población celular marcada en el organismo, tomando la enfermedad/terapia examinada en cada caso como requisito. En comparación con los vectores Moloney que transmiten neoR, los vectores neoR, es decir pSF1N y pMH1N, que transmiten neoR bajo control del SFFVp U3 o MHSV U3 ("leader" MESV), muestran un incremento sustancial de la tasa de transferencia génica funcional en el sistema modelo de la línea de células madre del ratón FDCPmix. Son aptos para la transferencia de neoR a células madre mieloides humanas.
- -
- Protección de la médula ósea contra los efectos secundarios de una quimioterapia de alta dosis (28): se transfieren genes proveedores de resistencia a la quimioterapia, tales como MDR1 o transferasas de alquilo. Una alta tasa de transferencia y expresión a través de los vectores optimizados, relacionados con el virus de Friend impiden los efectos secundarios mielosupresivos y, dado el caso, también la inducción de segundos tumores ocasionada por la quimioterapia.
- -
- Corrección de las enfermedades metabólicas: en las enfermedades hereditarias monogénicas, la transferencia génica retroviral introduce copias intactas de los genes defectuosos en las células madre mieloides. Posibles aplicaciones incluyen las enfermedades hereditarias cuyo defecto genético produce efectos en el sistema mieloide (enfermedades de almacenamiento, tal como el síndrome de Hurler; M. Gaucher (29)):
II. Clonación de retrovirus competentes en su
replicación y relacionados con Friend
Los virus según la invención, debido a su
espectro de hospedadores ampliado hacia las células madre y
precursoras tempranas, mieloides, son aptos en particular para la
mutagénesis de inserción en dichas células. La mutagénesis de
inserción permite clonar genes que desempeñan una función importante
en la regulación de crecimiento fisiológica del sistema
mieloide.
El principio de utilizar retrovirus como
mutagenes de inserción ya ha sido descrito varias veces (Reseña:
Kung et al. (1991) (34)). Los retrovirus se integran en el
genoma de forma no específica de la secuencia del ADN, lo cual
activa o desactiva los genes. Los retrovirus capaces de replicación
infectan los tejidos con una eficacia muy alta y por tanto son
capaces de aumentar la probabilidad de que la integración produzca
mutaciones. Mutaciones de este tipo pueden dar lugar de nuevo a una
degeneración de las células mutadas, es decir pueden producir
tumores.
En muchos experimentos in vivo con ratones
(normalmente con ratones neonatos, puesto que todavía no disponen de
un sistema inmune de funcionamiento eficiente y por tanto son muy
sensibles a los retrovirus), con el fin de identificar los genes
reguladores, se infectan los ratones con retrovirus y, tras un
periodo latente de aproximadamente 3 meses, pueden descubrirse y
examinarse tumores específicos (en función del tipo de virus). Los
análisis de los puntos de integración clonal, retroviral revelan
genes cuya activación o desactivación puede dar lugar a células de
fenotipo cambiado o degenerado. Esto facilita descubrir un gran
número de una amplia gama de tipos de gen, tales como genes para
ligandos, receptores, transductores de señales y factores de
transcripción. Es significante que exista una alta correlación entre
el tipo de tumor encontrado, producido por virus determinados, y el
gen activado/desactivado (por ejemplo en la eritroleucemia, inducida
por el Friend-MuLV, aproximadamente un 80% de los
tumores presentan eventos de integración en el locus
Fli-1 y una activación transcripcional del factor de
transcripción del gen PU-1. Ha sido posible
identificar los oncogenes interactivos, infectando ratones
transgénicos con expresión ecotropa de un oncogen (por ejemplo
myc) y observando la tumorgénesis. Tras un periodo latente
mucho más corto, se formaron tumores por mutaciones secundarios
("Second Hit", por ejemplo en el gen
pim-1).
No obstante, los constructos retrovirales previos
han permitido identificar sólo una parte de genes posibles. La gama
de genes que puede encontrarse con este enfoque de
activación/desactivación y el cambio fenotípico resultante de la
célula, depende en gran medida de la especificidad de los retrovirus
utilizados para determinados tipos de células. Así, los retrovirus
utilizados hasta ahora sólo muestran una infecciosidad muy baja en
las células madre hematopoyéticas y embrionales (ver Reseña:
Stocking et al. (1993) (21)). Esto se debe a varias causas;
en primer lugar a los elementos de control de transcripción en los
LTR retrovirales (Stocking et al. (1985) (18)), pero en
segundo lugar también a las interacciones de proteína entre
proteínas celulares y virales, necesarias para la replicación del
virus.
Los retrovirus competentes en su replicación
producen nuevas células productoras de retrovirus por infección, lo
cual da lugar a una infección completa de toda la población celular
y, con una probabilidad mucho mayor, a la formación de mutaciones.
Una eficacia similar puede conseguirse sólo por medio de un
cocultivo complicado y requiriendo mucho tiempo de la línea de
empaquetado de retrovirus con la línea de destino.
Los virus competentes en su replicación y
relacionados con Friend pueden utilizarse también para la producción
de mutantes "forced passage", los cuales presentan una mejora
adicional de la infectabilidad de células madre de sangre. Las
mutaciones en proteínas estructurales retrovirales de estos virus
pueden utilizarse para la producción de líneas de empaquetado
optimizadas para la transferencia génica en células mieloides. Las
mutaciones en secuencias cis-reguladoras de estos
virus pueden utilizarse para la optimización ulterior de vectores
retrovirales para la transferencia génica de células madre de
sangre.
La invención se refiere también a retrovirus
ecotropos, xenotropos, amfitropos o politropos, capaces de
replicación y provistos de los elementos reguladores (región
"leader") de MESV, combinados con regiones U3 y R en el
3'-LTR, las regiones U3 y R procedentes de un
"Friend murine leukemia virus" (F-MuLV), que,
debido a esto, son capaces de infectar células precursoras murinas
(in vivo e in vitro) o humanas (in vitro) con
mayor eficacia y de iniciar mutaciones. Preferentemente, el
3'-LTR contenido en los retrovirus es el LTR de
F-MuLV.
La combinación de los dos componentes produce
constructos de mutagénesis de inserción retrovirales de una nueva
calidad, que permiten identificar nuevos genes, no detectables por
medio de retrovirus capaces de replicación, convencionales. Pueden
generarse con título muy alto y dan lugar a una tasa de infección de
casi un 100%, puesto que cada célula infestada se convierte en una
célula productora de nuevos virus. En ellos, puede ser eliminado por
deleción el gen de resistencia a neomicina, que se utiliza en los
vectores retrovirales para la selección. Esto da lugar a una
transcripción más alta de los promotores LTR, puesto que neo^{R}
funciona como "silencer" (Artelt et al. (1991) (32)), y por
tanto a una mejor tasa de inserción.
Los retrovirus según la invención permiten
infectar células madre hematopoyéticas tanto murinas como humanas
in vitro con alta eficacia y generar, por inserción en el
genoma, mutantes (activación o desactivación de genes). Por tanto,
también para las preparaciones in vivo es de esperar que los
virus según la invención infecten células hematopoyéticas tempranas
con mayor eficacia y activen o desactiven genes por integración en
el genoma.
Una activación de genes puede tener lugar de
varias maneras. Así, una integración corriente arriba del gen puede
activar este gen bajo el control transcripcional del promotor
3'-LTR. También es posible desactivar los sitios de
unión de elementos de control negativos, lo cual puede dar lugar a
una activación de gen. Sin embargo, existen también varios ejemplos
(Kung et al. (1991) (34)) que demuestran que el promotor
5'-LTR puede activar un gen, una vez que se haya
realizado la inserción, directamente por lectura o bien por medio de
su efecto de "enhancer" incluso muchas bases corriente arriba o
incluso dentro de un "intron".
Sin embargo, una integración dentro de un gen en
la región correspondiente de promotor/"enhancer" puede dar
lugar a una desactivación del gen correspondiente.
Si la regulación de la célula afecta a genes
importantes, es posible que las células degeneren, es decir, pueden
formase tumores. Por tanto, los virus según la invención permiten
encontrar genes, por ejemplo genes que están involucrados en la
regulación de células madre hematopoyéticas, que son distintos de
los encontrados con los virus convencionales, los cuales presentan
una capacidad de replicación nula o muy mala en dichos tipos de
células.
Los virus competentes en su replicación, según la
invención, pueden utilizarse in vitro por ejemplo de la
manera siguiente:
Líneas promieloides, dependientes de factores, se
hicieron independientes de factores por mutagénesis de inserción
retroviral, es decir, el gen del factor de crecimiento se activó por
integración retroviral. La infección con retrovirus se efectuó por
cocultivo de la línea de destino con líneas de empaquetado
productoras del vector MPSV. Esta preparación in vitro puede
realizarse con más eficacia utilizando los constructos según la
invención. Además, con la ayuda de los virus según la invención, es
posible realizar las investigaciones citadas anteriormente con
células madre hematopoyéticas murinas o humanas.
Otra aplicación posible es la de experimentos que
tienen por objetivo preparar mejores líneas de empaquetado de virus
vectoriales, por ejemplo para la terapia génica, que sean capaces de
producir los virus en células precursoras con una eficacia de
infección más alta. En dichas células, existen varios bloques que
interfieren en la infección/replicación retroviral. El uso de los
constructos según la invención presenta la ventaja, frente al tipo
salvaje MoMuLV ó AM4070 capaz de replicación, de que los bloques
transcripcionales ya han sido eliminados. Por tanto, las mejoras en
la eficacia de infección se deben a mutaciones adecuadas en las
proteínas virales.
\newpage
Otra aplicación posible de los constructos según
la invención radica en la producción de ratones "knock out" por
activación de inserción de uno o varios genes en células madre
embrionales murinas.
Los ejemplos, dibujos y protocolos de secuencia
siguientes sirven para ilustrar más la invención.
Los protocolos de secuencia muestran:
| SEC ID Nº:1 | La secuencia de pSF1 |
| SEC ID Nº:2 | La secuencia de pSF2 |
| SEC ID Nº:3 | La secuencia de pSF3 |
| SEC ID Nº:4 | La secuencia de pMH1 |
| SEC ID Nº:5 | La secuencia de pSF-MDR |
| SEC ID Nº:6 | La secuencia de pMP-MDR |
(en cada caso, se ha representado sólo la parte
proviral de las secuencias)
La Fig. 1A muestra la carta de plásmido de
pSF-MDR.
(indicación orientativa de los puntos de
restricción)
La Fig. 1B muestra la carta de plásmido de
pSF-MDR.
(indicación exacta de los puntos de
restricción)
La Fig. 2A muestra la carta de restricción de
pSF1.
La Fig. 2B muestra la carta de restricción de
pSF1N. Este vector corresponde a pSF1, en el cual se ha insertado el
gen neo^{R} en el "multiple cloning site" (MCS).
La Fig. 3A muestra la carta de restricción de
pSF2.
La Fig. 3B muestra la carta de restricción de
pSF2N, que corresponde a pSF2 tras la integración del gen
neo^{R}.
La Fig. 4A muestra la carta de restricción de
pSF3.
La Fig. 4B muestra la carta de restricción de
pSF3N, que corresponde a pSF3 tras la integración del gen
neo^{R}.
La Fig. 5A muestra la carta de restricción de
pMH1.
La Fig. 5B muestra la carta de restricción de
pMH1N, que corresponde a pMH1 tras la integración del gen
neo^{R}.
La Fig. 6 muestra es esquema de formación de
pSF-MDR1.
La Fig. 7 muestra es esquema de formación de los
vectores pSF1N, pSF2N, pSF3N y pMH1N
La Fig. 8 muestra la protección de células
mieloides por los vectores FMEV y MPEV-mdrI en
comparación con los vectores estándares MoMuLV.
Se ha indicado la frecuencia de transducción
media relativa (corregida por el título de fibroblasto y la eficacia
de clonación) Los títulos de fibroblasto variaban en menos de un
factor de tres entre los vectores distintos. A: línea
K-562, B: línea TF-1.
La Fig. 9 muestra la carta de restricción de
pMP-MDR.
\newpage
La Tabla 1 muestra las estrategias de clonación
de diferentes constructos.
Este vector se clonó a base del vector MESV R224
(base pUC 19), en el cual partes de la región env así como la región
completa U3 del 3'-LTR se reemplazaron por
secuencias SFFVp. De esta manera, se obtuvo el vector pSF5 + 3
(véase la Fig. 6). En una segunda etapa, se realizó la inserción del
cADN codificador para MDR1 (obtenido de pMDR2000XS (25)) en el
"multiple cloning site" (Not1, Xba1, BamH1, Hind3).
La espina dorsal de estos plásmidos se basa en el
vector MESV R224 en el cual se ha realizado una gran deleción entre
el punto de corte Xba1 del 5'-LTR y del punto de
corte Kpn1 en el 3'-LTR. Se introdujeron las
secuencias complementarias por medio de ligaciones de tres
fragmentos, produciendo los vectores de base pSF1, pSF2, pSF3 y pMH1
(para el esquema de formación y la estrategia de clonación, véase la
Fig. 7, Tabla 1, las secuencias se han descrito en SEC ID
Nº:1-4). Los fragmentos utilizados para la ligación
de tres fragmentos se han obtenido a partir de constructos
auxiliares (véase el esquema de formación, Fig. 6) en los que pueden
fácilmente realizarse modificaciones para una optimización ulterior
de los vectores. También son posibles una sustitución de las
regiones U3 de SFFVp o MHSV por secuencias análogas de otros
retrovirus relacionados con Friend o las modificaciones citadas
anteriormente del "leader", con el fin de optimizar el título.
Tras la inserción de neo^{R} cADN (procedente de R229), se
obtuvieron los constructos ejemplares pSF1N, pSF2N, pSF3N, pMH1N.
Los constructos ejemplares llevan "polylinker" con puntos de
corte de restricción singulares, que pueden utilizarse para el
intercambio de los genes a transferir. En dichos puntos de corte,
pueden insertarse también secuencias reguladoras para una expresión
de un segundo gen en el caso de ser necesaria, tales como el
"splice acceptor" de SFFVp o el denominado "internal ribosome
entry point" IRES (I.R. Ghattas et al. (1991) (26)).
Las regiones relacionadas con Friend, clonadas en
los constructos ejemplares como U3 y R (en el
3'-LTR) se habrán copiado, tras terminarse un ciclo
de vida retroviral, también en la posición 5'-LTR y
luego impulsan la expresión génica en las células de destino. Los
constructos ejemplares contienen todos los elementos
cis-reguladores necesarios para la transferencia
génica retroviral y la expresión génica retroviral. En estos
constructos, se han combinado las propiedades de SFFVp (o MHSV),
MESV y MoMuSV. En calidad de modificaciones relevantes para la
seguridad, se han integrado la mutación puntual del codón de inicio
para la proteína gag retroviral para dar un codón de parada (A.D.
Miller y G.J. Rosman (1990) (27)) así como la deleción de
secuencias env superfluas en pSF1N, pSF2N, pSF3N, pMH1N
(27).
| Constructo | Espina dorsal | Fragmento 1 | Fragmento 2 |
| pSFMDR | SF5+3 Sal1/Not1 | pMDRSX1 Sal1/Not1 | |
| pSF5+3 | R224\DeltaNB Xho1/Nru1 | pSFpoly Hind3 blunt end | |
| pMDR\DeltaSX1 | Bluescript KS Sal1/Sma1 | pMDR2000XS Sal1/Ssp1 | |
| pSF1N | pSF1 Not1/BamH1 | neoR Not1/BamH1 (R229) | |
| pSF2N | pSF2 Not1/BamH1 | neoR Not1/BamH1 (R229) | |
| pSF3N | pSF3 Not1/BamH1 | neoR Not1/BamH1 (R229) | |
| pMH1N | pMH1 Not1/BamH1 | neoR Not1/BamH1 (R229) | |
| pSF1 | R229\DeltaXba1/Kpn1 | pL1 Xba1/Not1 | p\DeltaenvSF Not1/Kpn1 |
| pSF2 | R229\DeltaXba1/Kpn1 | pL2 Xba1/Not1 | p\DeltaenvSF Not1/Kpn1 |
| pSF3 | R229\DeltaXba1/Kpn1 | pL3 Xba1/Not1 | p\DeltaenvSF Not1/Kpn1 |
| pMH1 | R229\DeltaXba1/Kpn1 | pL1 Xba1/Not1 | p\DeltaenvMH Not1/Kpn1 |
| Constructo | Espina dorsal | Fragmento 1 | Fragmento 2 |
| pL1 | Bluescript KS Xba1/Not1 | R224 Xba1/Not1 | |
| pL2 | pL1\DeltaBal1 | pV-MDR1 Bal1 | |
| pL3 | pL1\DeltaKpn1-Pst1 | pV-MDR1 Kpn1/Pst1 | |
| p\DeltaenvMO | Bluescript KS BamH1/Kpn1 | pV-MDR1 BamH1/Kpn1 | |
| p\DeltaenvSF | p\DeltaenvMO Nhe1/Kpn1 | pSFU3 Xba1/Kpn1 | |
| p\DeltaenvMH | p\DeltaenvSF EcoR5/Kpn1 | pBR-MHSV EcoR5/Kpn1 | |
| pSFU3 | pUC19 Hinc2 | pSFenv SfaN1/Kpn1 |
El gen "multiple drug resistance 1 (MDR 1)"
codifica para una bomba de efluvio localizada en una membrana
(P-glicoproteína) que confiere resistencia contra
una serie de citoestáticos de importancia clínica (I. Pastan et al.
(1988) (25)). El grado de resistencia está ligado estrechamente al
nivel de expresión de la P-glicoproteína. Si se
consiguiera hacer las células madre mieloides resistentes a los
citoestáticos por transferencia retroviral de MDR1, esto
contribuiría de forma importante a la reducción de la tasa de
efectos secundarios de una quimioterapia de tumores.
En el experimento, se infectaron células K562
(ATCC CLL243) y células TF1 (líneas progenitores mileoides, humanas)
con vectores retrovirales que exprimen MDR1 bajo el control del
SFFV-LTR (SF-MDR de virus,
procedente del constructo pSF-MDR con "leader"
MESV así como del vector híbrido de MPSV/MESV, el
pMP-MDR).
La línea TF1 se obtuvo, tal como fue descrito por
T. Kitamura et al. (1989) (30), de un paciente con
eritroleucemia. Las células se mantenían en un cultivo de un medio
RPMI (completado con un 20% de suero de ternera, 1 mM de piruvato
sódico, 4 mM de glutamina y 20 U/ml de GM-CSF
recombinante).
En una preparación idéntica, se realizó la
infección de células K562 y células TF1 con un vector
Moloney-MDR1 (V-MDR de virus,
procedente del constructo pVMDR), que se está utilizando en un
protocolo de transferencia génica clínica bajo la dirección del
profesor A. Deisseroth en el "MD Anderson Cancer Center, Houston,
Texas". Tal como puede apreciarse por la Tabla 2,
SF-MDR da lugar a un incremento de la tasa de
transferencia génica en K562 de aproximadamente 20 veces frente a
VMDR, medido por el número de colonias que crecían bajo la
aplicación de citoestáticos (LD50 de aproximadamente 10 veces más en
K562).
El incremento de la tasa de transferencia génica
en las células mieloides es un reflejo del incremento medio de la
tasa de expresión génica en las células transducidas. Esto tiene
importancia en las aplicaciones de transferencia génica, cuyo éxito
depende también del nivel de expresión génica (véase la forma de
realización ejemplificativa: protección de la médula ósea en la
quimioterapia de alta dosis). Si en el experimento descrito
anteriormente (infección de células mieloides humanas con SFMDR o
V-MDR) se colocan las células en placas de cultivo a
unas dosis muy altas de citoestáticos (LD50 aproximadamente 20 veces
más alto en caso de TF1), sólo las células infectadas con
SF-MDR son capaces de formar colonias (Tabla 2).
| Número de colonias bajo selección | ||||
| Virus | Región U3 de 3'-LTR | Leader | K562 (20 ng de colchicina) | TF1 (80 ng de colchicina) |
| SF-MDR | SFFVp | MESV | 948 +/- 98 | 13 +/- 3 |
| V-MDR | MoMuLV | MoMuSV | 38 +/- 4 | 0 |
| MP-MDR | MPSV | MESV | 410 \pm 28 | 9 \pm 3 |
Las células se infectaron con un sobrenadante
retroviral de líneas de empaquetado anfótropos. El título sobre los
fibroblastos era de aproximadamente 2x10^{4}/ml para ambos
vectores en el momento del experimento. La relación de vector/célula
de destino durante la infección era <1. 24 horas después de la
infección, se colocaron 5x10^{4} células en un medio de agar
blando que contenía colchicina. La evaluación se realizó el día 8 la
clonación en el agar. La eficiencia de clonación sin selección era
de aproximadamente un 15% para ambas líneas. Los experimentos se
llevaron a cabo por duplicado.
Para un vector cuyas regiones U3 proceden de
MoMuLV y cuyo "leader" procede de MESV se obtienen resultados
análogos a los del vector pV-MDR.
En el sistema MDR1, los constructos con un
"leader" de MESV presentan títulos ligeramente reducidos en
comparación con los vectores MoMuSV convencionales. Esto se debe
posiblemente a mutaciones en el área de "packaging" de MESV.
Los híbridos entre las secuencias de "leader" de MESV y MoMuSV
tienen el potencial de producir vectores con un título más alto,
debido a su mejor función de empaquetado en las líneas de
empaquetado retrovirales con la exclusión simultánea de secuencias
cis-inhibitorias. Esto se ha tenido en cuenta
durante la clonación de los constructos ejemplares pSF2N y
pSF3N.
Nota: Los vectores provirales se denominan por
ejemplo SF-MDR, MP-MDR, etc., para
distinguirlos de los plásmidos que les corresponden
pSF-MDR, pMP-MDR, etc.
El constructo ejemplar de un vector de
Friend/MESV anfótropo, capaz de replicación para la mutagénesis de
inserción se preparó por clonación de los genes
gag-pol-env, necesarios para la
replicación retroviral, en los vectores de Friend/MESV, pSF1 y pSF3
(véase las Figs. 2A y 4A).
A tal fin, el cartucho de gen
"gag-pol-env" que comprendía
7,2 kb y procedía de pAM (Miller et al. (1985) (35) se amplificó con
la ayuda del "Expand long template PCR Systems" (Boehringer
Mannheim, véase también W.M. Barns (1994) (36) y se incorporó en
pSF1 y pSF3.
pAM representa un constructo de fusión
constituido por el vector de MoMuLV, pMLV-K
(gag-pol hasta el punto de corte SalI) y el vector
de virus 4070A, p4070A (pol a partir del punto de corte SalI y
env^{anfótropo}). El "PCR primer" superior se colocó 60 bp
corriente arriba del codón de inicio gag (directamente contiguo al
punto de corte PstI), y el "PCR primer" inferior se colocó
directamente en el término del gen env^{anfótropo}. El amplificado
de PCR de 7,2 kb
gag-pol-env^{anfótropo} se
incorporó sin cortar, es decir con extremos no reactivos, en el
vector pSF1 y pSF3, cortados con PstI e HindIII y tratado con enzima
Klenow para eliminar las partes sobresalientes (Sambrook et al.
(1989) (37). Los vectores resultantes recibieron las denominaciones
pSF1-AM, pSF3-AM y presentan en
principio la estructura siguiente:
5'-LTR^{MESV}-PBS(-)^{MESV}-gag-pol-
env^{anfótropo}-3'-LTR^{SFFV}(pSF1-AM)
y
5'-LTR^{MESV}-PBS(-)^{MUSV}-gag-pol-env^{anfótropo}-3'-LTR^{SFFV}(pSF3-AM).
Tras su transfección en células humanas o murinas, son capaces de
formar retrovirus competentes en su replicación (RCR), que pueden
utilizarse para la mutagénesis de inserción en células madre y
progenitoras hematopoyéticas.
En el vector MoMuLV-TAT (Hilberg,
F.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987),
5232-5236) (38)), el fragmento
NheI-KpnI es reemplazado por el fragmento LTR
correspondiente de MPSV (-416 - +31). El vector resultante se
denomina MP-CAT. Dicho plásmido puede utilizarse
como plásmido de un gen "reporter", realizándose la expresión
del gen de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) bajo el control
del fragmento LTR retroviral.
El vector de base MPSV/MESV utilizado es el
vector p50-M. Este vector contiene el
MPSV-U3 en el 3'-LTR. Es un derivado
de p5Gneo, que contiene un fragmento "leader" de dl587rev con
un tamaño de 537 bp (Grez M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87
(1990), 9202-9206) (39), Colicelli J. y Goff
S.P., J. Virol. 57 (1987) 37 - 45 (40)). Las regiones de
p5Gneo que codifican neoR-env fueron reemplazados
por un "polylinker" constituido por p Bluescript KS
(stratagenes), y el AUG de gag fue destruido por mutación puntual.
El mdr-1cADN se cortó como un fragmento SacI/SspI
del pMDR2000XS (par de bases -138 a +3878) (Chen C. et al., Cell 47
(1986) 381 - 389 (41)). Tras subclonación en p Bluescript II
KS, el cADN se aisló como un fragmento BamHI, y se insertó
p50-M. El vector así preparado se denomina
pMP-MDR. La secuencia de p-MDR,
pMP-MDR se ha representado en la Fig. 9 y en SEC ID
Nº:6.
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(39) Grez M. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 87, 9202-9206 (1990)
(40) Colicelli J. und Goff S.P.,
J. Virol. 57, 37-45 (1987)
(41) Chen C. et al, Cell 47,
381-389 (1986)
(42) Velu T.J. et al., Colloque ISERM
(Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale), Vol.
219, Transfer de Genes chez l'Homme; (ISERM (National Institute of
Health and Medical Research Colloquium), Vol. 219, Human Gene
Transfer, (1991) 273-274, ed.
Cohen-Haguenauer O. & Boiron, M.
(1) DATOS GENERALES:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: BOEHRINGER MANNHEIM GMBH
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Sandhofer Str. 116
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- LUGAR: Mannheim
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Alemania
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: D-69305
\vskip0.333000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: +49-(0)8856/60-3446
\vskip0.333000\baselineskip
- (H)
- FAX: +49-(0)8856/60-3451
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- DENOMINACIÓN DE LA INVENCIÓN: Híbridos vectoriales retrovirales y su uso para la transferencia génica
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 6
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- VERSIÓN DE LECTURA POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- SOPORTE INFORMÁTICO: Disquete
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC-compatible
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, versión #1.30B (EPA)
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: DE P 44 31 973.8
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD: 08-SEP-1994
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: DE 195 03 952.1
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD: 07-FEB-1995
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIONES REFERENTES A SEC ID Nº: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5.323 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE HEBRA: doble hebra
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: anular
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN de genoma
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIONES REFERENTES A SEC ID Nº: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5.294 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE HEBRA: doble hebra
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: anular
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN de genoma
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIONES REFERENTES A SEC ID Nº: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5.292 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE HEBRA: doble hebra
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: anular
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN de genoma
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIONES REFERENTES A SEC ID Nº:4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5.364 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE HEBRA: doble hebra
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: anular
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN de genoma
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIONES REFERENTES A SEC ID Nº: 5:
(sólo para fines de información técnica)
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6.505 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE HEBRA: doble hebra
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: anular
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN de genoma
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIONES REFERENTES A SEC ID Nº: 6:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9.318 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE HEBRA: doble hebra
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: anular
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN de genoma
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
Claims (8)
1. Híbrido vectorial retroviral,
caracterizado porque contiene,
- a)
- como región U5 y "tRNA primer binding site" en la región "leader", la región U5 y el "tRNA primer binding site" de MESV, y
- b)
- como región U3 y región R en 3'-LTR, las regiones U3 y R procedentes del "Friend murine leukemia virus" (F-MuLV) o del "myeloproliferative sarcoma virus" (MPSV).
2. Híbrido vectorial según la reivindicación 1,
caracterizado porque contiene, como el
5'-LTR, los bp 142 - 657 procedentes de la SEC ID
Nº:1 y/o, como el 3'-LTR, los bp 1707 - 2283
procedentes de la SEC ID Nº:1
3. Híbrido vectorial según la reivindicación 1,
caracterizado porque se ha seleccionado del grupo
siguiente:
- pSF1, que presenta la secuencia según la SEC ID Nº:1;
- pSF2, que presenta la secuencia según la SEC ID Nº:2;
- pSF3, que presenta la secuencia según la SEC ID Nº:3;
- pMH1, que presenta la secuencia según la SEC ID Nº:4; y
- pMP-MDR, que presenta la secuencia según la SEC ID Nº:6.
4. Procedimiento para la preparación de una
partícula de virus deficiente en su replicación, infecciosa, por
transfección de una célula ayudadora eucariota que contiene las
funciones ayudadoras gag, env y pol con un híbrido vectorial que
contiene, como región U5 y "tRNA primer binding site" en la
región "leader", la región U5 y el "tRNA primer binding
site" de MESV, y como región U3 y región R en
3'-LTR, las regiones U3 y R procedentes del
"Friend murine leukemia virus" (F-MuLV) o del
"myeloproliferative sarcoma virus" (MPSV), la producción de ARN
correspondiente al ADN del híbrido vectorial como genoma viral en la
célula, empaquetado del genoma de virus en envolturas de virus
vacías, deficientes en su replicación y formadas en la célula, y el
aislamiento de las partículas de virus infecciosas que contienen el
genoma viral citado.
5. Partícula de virus infecciosa, deficiente en
su replicación, susceptible de ser obtenida según un procedimiento
según la reivindicación 4.
6. Procedimiento para la preparación de una
célula eucariota de transducción retroviral que contiene un gen
exógeno activo, con la exclusión de células madre embrionales,
caracterizado porque se transduce la célula eucariota con un
virus vectorial retroviral, el cual contiene en su genoma
- a)
- en la región "leader", como la región U5 y el "tRNA primer binding site", la región U5 y el "tRNA primer binding site" de MESV,
- b)
- como las regiones U3 y R en 3'-LTR, las regiones U3 y R procedentes de un "Friend murine leukemia virus" (F-MuLV) o del "myeloproliferative sarcoma virus" (MPSV) y
- c)
- el gen exógeno citado.
7. Célula eucariota, transducida retroviralmente,
susceptible de ser obtenida de acuerdo con un procedimiento según la
reivindicación 6, con la exclusión de las células madre embrionales
humanas.
8. Uso de un híbrido vectorial, retroviral,
deficiente en su replicación, según las reivindicaciones 1 a 3, para
la preparación de un medicamento para la terapia génica ex
vivo o in vivo.
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| DE4431973 | 1994-09-08 | ||
| DE4431973 | 1994-09-08 | ||
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