ES2297831T3 - Vectores retroviricos que presentan una tasa de recombinacion reducida. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBEN CONSTRUCCIONES DE VECTOR RETROVIRAL QUE TIENEN UN 5'' LTR, UN EMPLAZAMIENTO DE UNION TARN, UNA SEÑAL DE EMPAQUETAMIENTO, UNA O MAS SECUENCIAS HETEROLOGAS, UN ORIGEN DE UNA SEGUNDA SINTESIS DE CEPA Y UN 3'' LTR, EN DONDE LA CONSTRUCCION DE VECTOR CARECE DE LAS SECUENCIAS DE CODIFICACION GAG/POL O ENV RETROVIRALES. ADEMAS, SE DESCRIBEN LAS CINTAS DE EXPRESION GAG/POL, Y ENV EN DONDE LAS CINTAS DE EXPRESION CARECEN DE UNA SECUENCIA CONSECUTIVA DE MAS DE 8 NUCLEOTIDOS EN COMUN. LAS CONSTRUCCIONES RETROVIRALES ARRIBA DESCRITAS, LAS CINTAS DE EXPRESION GAG/POL Y ENV PUEDEN UTILIZARSE PARA CONSTRUIR LINEAS CELULARES PRODUCTORAS QUE EVITAN LA FORMACION DE UN VIRUS COMPETENTE DE REPLICACION.

Description

Vectores retrovíricos que presentan una tasa de recombinación reducida.

Campo técnico

La presente invención se refiere de manera general a vectores retrovíricos para su utilización en la transferencia génica, y más específicamente, a vectores retrovíricos que se construyen de tal manera que se excluye la formación, mediante recombinación, de virus competentes para la replicación.

Antecedentes de la invención

Los retrovirus son virus ARN que pueden replicarse e integrarse en el genoma de una célula huésped mediante un intermediario del ADN. Este intermediario del ADN, o provirus, puede integrarse establemente en el ADN celular del huésped. Se sabe que los retrovirus son responsables de una amplia variedad de enfermedades tanto en el hombre como en los animales, que incluyen, por ejemplo, el SIDA y una amplia variedad de cánceres.

Aunque los retrovirus pueden provocar enfermedades, tienen asimismo diversas propiedades que los llevan a ser considerados como una de las técnicas más prometedoras para la terapia génica de las enfermedades. Estas propiedades incluyen: (1) entrada eficiente del material genético (genoma vectorial) en las células; (2) un proceso eficiente activo de entrada en el núcleo celular diana; (3) niveles relativamente altos de expresión génica; (4) efectos patológicos mínimos sobre las células diana; (5) el potencial para hacer blanco en subtipos celulares particulares mediante el control de la unión vector-célula diana y el control tisular específico de la expresión génica. Al utilizar un retrovirus para la terapia génica, puede incorporarse al retrovirus, en lugar del ARN retrovírico normal, un gen extraño de interés. Cuando el retrovirus inyecta su ARN en una célula, el gen extraño se introduce también en la célula, y puede entonces integrarse en el ADN celular del huésped como si fuera el mismo retrovirus. La expresión de este gen extraño dentro del huésped da lugar a la expresión de la proteína extraña por la célula huésped.

La mayoría de los sistemas vectores de retrovirus que se han desarrollado para la terapia génica están basados en los retrovirus murinos. Brevemente, estos retrovirus existen en dos formas, como provirus integrados en un ADN celular del huésped, o como viriones libres. La forma virión del virus contiene las proteínas estructurales y enzimáticas del retrovirus (que incluyen la transcriptasa inversa), dos copias de ARN del genoma vírico, y partes de la membrana plasmática celular en las cuales está incrustada la glicoproteína de la envuelta vírica. El genoma está organizado en cuatro regiones principales: la Repetición Terminal Larga (LTR) y los genes gag, pol y env. La LTR puede encontrarse en ambos extremos del genoma provírico, es un compuesto de los extremos 5' y 3' del genoma ARN, y contiene elementos actuantes cis que son necesarios para la iniciación y finalización de la transcripción. Los tres genes gag, pol y env están localizados entre las LTR terminales. Los genes gag y pol codifican, respectivamente, las estructuras víricas internas y las proteínas enzimáticas (tal como la integrasa). El gen env codifica la glicoproteína de la envuelta (denominada gp70 y p15e), que confiere infectividad y especificidad del virus para un conjunto de huéspedes, así como el péptido "R" de función indeterminada.

Una consideración importante para utilizar los retrovirus en la terapia génica es la disponibilidad de retrovirus "seguros". Se han desarrollado progenies celulares de empaquetamiento y progenies celulares productoras de vectores para cumplir con esta característica. Brevemente, esta metodología emplea la utilización de dos componentes, un vector retrovírico y una progenie celular de empaquetamiento (PCL). El vector retrovírico contiene repeticiones terminales largas (LTR), el ADN extraño que va a transferirse y la secuencia de empaquetamiento (\Psi). Este vector retrovírico no se reproducirá él mismo, debido a que los genes que codifican las proteínas estructurales y de la envuelta, no se encuentran en el interior del genoma vectorial. La PCL contiene genes que codifican las proteínas gag, pol y env proteínas, pero no contiene la señal "\Psi" de empaquetamiento. De este modo, una PCL puede sólo formar, por sí misma, partículas viriónicas vacías. Dentro del procedimiento general, el vector retrovírico se introduce en la PCL, creando de esta forma una progenie celular productora de vectores (VCL). Esta VCL da lugar a partículas viriónicas que sólo contienen el genoma (extraño) del vector retrovírico, y que por tanto, se ha considerado previamente un vector retrovírico "sano" para utilización terapéutica.

Sin embargo, existen diversas deficiencias en la utilización habitual de VCL. Una cuestión implica a la generación de "virus vivos" (es decir, retrovirus de replicación competentes, RCR) por VCL. Brevemente, RCR puede producirse en células productoras convencionales cuando; (1) el genoma vectorial y los genomas auxiliadores se recombinan entre sí; (2) el genoma vectorial o el genoma auxiliador se recombinan con elementos retrovíricos endógenos crípticos homólogos en la célula productora; o (3) elementos retrovíricos crípticos endógenos se reactivan (por ejemplo, retrovirus xenotrópicos en células murinas).

Otra consideración es la propensión de las VCL basadas en ratones para empaquetar elementos endógenos de tipo retrovírico (que pueden contener secuencias génicas oncogénicas) con una eficiencia próxima a la que empaquetan el vector retrovírico deseado. Dichos elementos, a causa de su estructura de tipo retrovírico, son transmitidos a la célula diana para ser tratados con frecuencias que establecen un paralelismo con la transferencia de la secuencia vectorial retrovírica deseada.

\newpage

Una tercera consideración es la capacidad para preparar suficientes partículas vectoriales retrovíricas a una concentración apropiada para: (1) tratar un gran número de células (por ejemplo, 10^{8}-10^{10}); y (2) preparar partículas vectoriales con un coste comercialmente viable.

Para construir PCL más seguras, los investigadores han generado deleciones de las 5' LTR y partes de las 3' LTR de los elementos auxiliadores (véase Miller y Buttimore, Mol. Cell. Biol. 6:2895-2902, 1986). Cuando dichas células se utilizan, son necesarios dos eventos recombinantes para formar el genoma de tipo salvaje competente para la replicación. Sin embargo, resultados de varios laboratorios han indicado que, incluso cuando están presentes varias deleciones, pueden generarse todavía RCR (véase Bosselmann et al, Mol. Cell Biol. 7:1797-1806, 1987; Danos y Mulligan, Proc. Natl. Acad, Sci, USA 81:6460-6464, 1988). Además, progenies celulares que se construyeron conteniendo deleciones LTR 3' y 5' no se han demostrado útiles, ya que producen títulos relativamente bajos (Dougherty et al., J. Virol. 63:3209-3212, 1989).

Uno de los enfoques más recientes para construir progenies celulares de empaquetamiento más seguras implica la utilización de partes complementarias de elementos víricos auxiliares, divididos entre dos plásmidos separados, uno conteniendo gag y pol y el otro conteniendo env (véase Markowitz et al., J. Virol. 62:1120-1124; y Markowitz et al, Virology 167:600-606, 1988). Un beneficio de este doble sistema plasmídico es que son necesarios tres eventos recombinatorios para generar un genoma competente para la replicación. Sin embargo, estos vectores plasmídicos dobles han sufrido asimismo el inconveniente de incluir partes de los LTR retrovíricos, pudiendo todavía producir virus infecciosos.

La presente invención supera las dificultades de la recombinación y de los bajos títulos que se asocian con muchas de las anteriores progenies celulares de empaquetamiento, proporcionando otras ventajas relacionadas.

Sumario de la invención

Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un constructo de un vector retrovírico que comprende un 5' LTR, un sitio de unión ARNt, una señal de empaquetamiento, una o más secuencias heterólogas, un origen de síntesis de una segunda cadena de ADN y un 3' LTR, en el que dicho constructo vectorial contiene menos de 20 nucleótidos consecutivos que se encuentran en los genes gag/pol y env, en el que a dicho vector le falta una extendida señal de replicación, y en el que dichas secuencias heterólogas se seleccionan de entre el grupo constituido por un gen que codifica una proteína citotóxica, una secuencia antisentido, una secuencia que codifica una molécula inmune accesoria, una secuencia que codifica un producto génico en el que dicho producto génico es seleccionado de entre el grupo constituido por HSVTK y VZVTK, una secuencia que codifica una proteína terapéutica que puede prevenir, inhibir, estabilizar o invertir un efecto genético heredado o no, y una secuencia que codifica una parte inmunogénica de un virus seleccionado de entre el grupo constituido por HBV, HCV, EBV, FeLV, FlV y HIV.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un casete de expresión de gag/pol, que comprende un promotor unido operativamente a un gen gag/pol, y una secuencia de poliadenilación, en la que el extremo 5' terminal de dicho gen gag/pol se ha modificado para contener por lo menos 25 codones que son degenerados para gag.

Considerada brevemente, la presente invención proporciona composiciones y procedimientos para la construcción de progenies celulares de empaquetamiento que excluyen la formación de RCR mediante recombinación homóloga. Incluidos en un aspecto de la invención, se proporcionan constructos vectoriales retrovíricos recombinantes (RETROVECTOR^{TM}) que comprenden un 5' LTR, un sitio de unión ARNt, una señal de empaquetamiento, una o más secuencias heterólogas, un origen de síntesis de una segunda cadena de ADN, y un 3' LTR, en el que a dicho constructo vectorial retrovírico le faltan las secuencias codificantes de gag/pol y env, en el que dicha señal de empaquetamiento no constituye una señal de empaquetamiento extendida, y en el que dichas secuencias heterólogas se seleccionan de entre el grupo constituido por un gen que codifica una proteína citotóxica, una secuencia antisentido y una secuencia que codifica una molécula inmune accesoria. Incluidos en una forma de realización preferida, a los constructos vectoriales retrovíricos les falta una secuencia codificante env corriente arriba del 5' LTR. Los constructores vectoriales retrovíricos de la presente invención pueden construirse a partir de uno o más retrovirus que incluyen, por ejemplo, una amplia variedad de virus anfotrópicos, ecotrópicos, xenotrópicos y politrópicos (véanse, por ejemplo, las Figuras 17A, B y C).

Como se ha indicado anteriormente, los constructos vectoriales retrovíricos de la presente invención incluyen una o más secuencias heterólogas. Incluida en determinadas formas de realización de la invención, la secuencia heteróloga es por lo menos de x kb de longitud, en la que x es seleccionado de entre el grupo constituido por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, y 8. Incluidas en una forma de realización, la secuencia heteróloga es un gen que codifica una proteína citotóxica, tal como por ejemplo, ricina, abrina, la toxina diftérica, la toxina colérica, gelonina, hierba carmín, proteína antivírica, tritina, toxina shigélica, y la exotoxina A de Pseudomonas. Incluida en otras formas de realización la secuencia heteróloga puede ser una secuencia antisentido, o una molécula inmune accesoria. Ejemplos representativos de moléculas inmunes accesorias incluyen IL-1, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-13 e IL-14. Moléculas inmunes accesorias particularmente preferidas pueden seleccionarse de entre el grupo constituido por IL-2,IL-12, IL-15 e interferón gamma, o el grupo formado por ICAM-1, ICAM-2, \beta-microglobina, LFA3, moléculas HLA de tipo I y de tipo II.

\newpage

Incluida en otras formas de realización de la invención, la secuencia heteróloga puede codificar un producto génico que activa un compuesto con una pequeña o ninguna toxicidad a un producto tóxico. Ejemplos representativos de dichos productos génicos incluyen timidin-quinasas de tipo I tales como HSVTK y VZVTK. Incluida en otra forma de realización, la secuencia heteróloga puede ser una ribozima. Incluida, todavía, en otras formas de realización, la secuencia heteróloga es un gen de reemplazamiento, que codifica proteínas tales como el Factor VIII, ADA, HPRT, CF y el Receptor LDL. Incluida en otras formas de realización, la secuencia heteróloga codifica una parte inmunogénica de un virus seleccionado de entre el grupo constituido por HBV, HCV, HPV, EBV, FeLV, FlV e HIV.

Estos y otros aspectos de la presente invención resultarán evidentes haciendo referencia a la descripción detallada siguiente y los dibujos adjuntos. Además, a continuación se proporcionan referencias que describen con mayor detalle determinados procedimientos o composiciones (por ejemplo, plásmidos, etc).

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una ilustración esquemática de pKS2 + Eco57I-LTR(+).

La Figura 2 es una ilustración esquemática de pKS2 + Eco57I-LTR(-).

La Figura 3 es una ilustración esquemática de pKS2+LTR-EcoRI.

La Figura 4 es una ilustración esquemática de pR1.

La Figura 5 es una ilustración esquemática de pR2.

La Figura 6 es una ilustración esquemática de pKT I.

La Figura 7 es una ilustración esquemática de pRI-HIVenv.

La Figura 8 es una ilustración esquemática de pR2-HIVenv.

La Figura 9 es una secuencia "preoscilante" representativa para un MoMLV gag/pol (véase también SEC ID n^{os} 11 y 12).

La Figura 10 es una secuencia "oscilante" representativa para un MoMLV gag/pol (véase también SEC ID n^{os} 9 y 10).

La Figura 11 es una ilustración esquemática de pHCMV-PA.

La Figura 12 es una ilustración esquemática de pCMV gag/pol.

La Figura 13 es una ilustración esquemática de pCMVgpSma.

La Figura 14 es una ilustración esquemática de pCVMgp-X.

La Figura 15 es una ilustración esquemática de pCMV env-X.

La Figura 16 es una ilustración esquemática de pRgpneo.

Las Figuras 17A, B y C comprenden una tabla que muestra diversos retrovirus que pueden utilizarse para construir los constructos vectoriales retrovíricos, los casetes de expresión gag/pol y los casetes de expresión env de la presente invención.

La Figura 18 es una ilustración esquemática de pCM Envam-Eag-X-less.

La Figura 19A es una ilustración diagramática de un constructo gag-"oscilante". La Figura 19B es una ilustración diagramática de un constructo gag "normal".

Descripción detallada de la invención

Antes de exponer la invención, puede ayudar a su comprensión, en primer lugar, dar a conocer definiciones de determinados términos que se utilizarán en adelante.

"Constructo vectorial retrovírico" se refiere a un ensamblaje que, dentro de las formas de realización preferidas de la invención, puede dirigir la expresión de una secuencia o secuencias o gen o genes de interés. Brevemente, el constructo vectorial retrovírico debe incluir un 5' LTR, un sitio de unión ARNt, una señal de empaquetamiento, una o más secuencias heterólogas, un origen de síntesis de una segunda cadena de ADN y un 3' LTR. En el interior del constructo vectorial, pueden incluirse una amplia variedad de secuencias heterólogas, que incluyen, por ejemplo, secuencias que codifican una proteína (por ejemplo, proteína citotóxica, antígeno asociado a enfermedad, molécula inmune accesoria, o gen de reemplazamiento), o que son útiles como una molécula en sí misma (por ejemplo, como una ribozima o secuencia antisentido). Alternativamente, la secuencia heteróloga puede ser únicamente una secuencia "de relleno", que tiene un tamaño suficiente para permitir la producción de partículas víricas que contienen el genoma de ARN. Preferentemente, la secuencia heteróloga es por lo menos de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 kB de longitud.

El constructo vectorial retrovírico puede incluir, asimismo, promotores/potenciadores transcripcionales o un elemento o elementos que defina o definan un locus, u otros elementos que controlan la expresión génica mediante corte y enganche alternativo, exportación del ARN nuclear, modificación postraduccional del mensajero, o modificaciones postranscripcionales de las proteínas. Opcionalmente, el constructo vectorial retrovírico puede también incluir marcadores seleccionables tales como Neo, TK, higromicina, fleomicina, histidinol, o DHFR, así como uno o más sitios específicos de restricción y una secuencia de finalización de la traducción.

"Casete de expresión" se refiere a un ensamblaje que puede dirigir la expresión de la secuencia o secuencias o del gen o genes de interés. El casete de expresión debe incluir un promotor que, cuando es transcrito, está unido operativamente a la secuencia o secuencias o gen o genes de interés, así como a una secuencia de poliadenilación. Incluidas en las formas de realización preferidas de la invención, tanto el promotor como la secuencia de poliadenilación se originan en una fuente que es heteróloga para los elementos auxiliadores (es decir, gag/pol y env). El casete de expresión de la presente invención pueden utilizarse para expresar un gen gag/pol o un gen env. Además, los casetes de expresión pueden también utilizarse para expresar una o más secuencias heterólogas de un casete de expresión gag/pol y/o env, o de un casete de expresión totalmente distinto.

Incluidas en las formas de realización preferidas de la invención, los casetes de expresión que se describen en la presente memoria puede contenerse en un constructo plasmídico. Además de los componentes del casete de expresión, el constructo plasmídico puede incluir asimismo un origen de replicación bacteriano, uno o más marcadores seleccionables, una señal que permite al constructo plasmídico existir como ADN monocatenario (por ejemplo, un origen de replicación M13), un sitio múltiple de clonación, y un origen "mamífero" de replicación (por ejemplo, un origen SV40 o adenovírico de replicación).

Preparación de constructos vectoriales retrovíricos, casetes de expresión gag/pol y casetes de expresión de env

Como se ha indicado anteriormente, la presente invención proporciona composiciones y procedimientos para la construcción de (progenies) celulares de empaquetamiento que excluyen la formación de virus competentes para la replicación mediante la recombinación homóloga. Las secciones siguientes describen la preparación de constructos vectoriales retrovíricos, de casetes de expresión gag/pol y de casetes de expresión de env.

1. Construcción de constructos vectoriales retrovíricos

Incluidos en un aspecto de la presente invención, se proporcionan constructos vectoriales retrovíricos que comprenden un 5' LTR, un sitio de unión ARNt, una señal de empaquetamiento, una o más secuencias heterólogas, un origen de síntesis de una segunda cadena de ADN y un 3' LTR, en los que faltan las secuencias codificante gag/pol o env. Brevemente, las Repeticiones Terminales Largas ("LTR") se subdividen en tres elementos, denominados U5, R y U3. Estos elementos contienen diversas señales que son responsables de la actividad biológica de un retrovirus, que incluyen, por ejemplo, elementos promotores y potenciadores que están localizados en el interior de U3. Los LTR pueden identificarse fácilmente en el provirus debido a su duplicación precisa en cada extremo del genoma.

El sitio de unión ARNt y el origen de la síntesis de una segunda cadena de ADN son importantes asimismo para que un retrovirus sea biológicamente activo, pudiéndose ser identificado fácilmente por un experto en la materia Por ejemplo, el ARNt se une a un sitio de unión retrovírico del ARNt mediante el emparejamiento de bases Watson-Crick, y se lleva a cabo con el genoma retrovírico en una partícula viral. El ARNt se utiliza entonces como un cebador para la síntesis del ADN mediante la transcriptasa inversa. El sitio de unión ARNt puede identificarse fácilmente basándose en su localización justamente corriente abajo del 5' LTR. De manera similar, el origen de la síntesis de la segunda cadena del ADN es, como su nombre indica, importante para la síntesis de la segunda cadena del ADN de un retrovirus. Esta región, a la que se hace asimismo referencia como el tracto poli-purínico, se localiza justamente corriente arriba de 3' LTR.

Además de los LTR 5' y 3', un sitio de unión ARNt, y un origen de síntesis de la segunda cadena de ADN, los constructos vectoriales retrovíricos de la presente invención comprenden también una señal de empaquetamiento, así como una o más secuencias heterólogas, cada una de las cuales se expone con mayor detalle a continuación.

Los constructos vectoriales retrovíricos de la presente invención pueden construirse fácilmente a partir de una amplia variedad de retrovirus, que incluyen, por ejemplo, los retrovirus tipo B, C y D, así como espumavirus y lentivirus (véase RNA Tumor Viruses, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985). En resumen, los virus se clasifican a menudo según su morfología tal como se aprecia bajo el microscopio electrónico. Los retrovirus de tipo "B" parecen tener un núcleo excéntrico, mientras que el tipo "C" de retrovirus presentan un núcleo central. Los retrovirus de tipo "D" tienen una morfología intermedia entre los tipos B y C. Los ejemplos representativos de retrovirus apropiados incluyen los que se muestran en las Figuras 17A, B y C (véase RNA Tumor Viruses en las páginas 2 a 7), así como diversos retrovirus xenotrópicos (por ejemplo., NZB-X1, NZB-X2 y NZB_{9-1} (véase O'Neill et al., J. Vir. 53:100-106, 1985)) y los retrovirus politrópicos (por ejemplo, MCF y MCF-MLV (véase Kelly et al., J. Vir 45(1) 291-298, 1983)). Dichos retrovirus puede obtenerse fácilmente a partir de depósitos o colecciones tales como la American Type Culture Collection ("ATCC", Rockville, Maryland), o aislarse de fuentes conocidas utilizando las técnicas habitualmente disponibles.

Los retrovirus particularmente preferidos para la preparación o construcción de constructos vectoriales retrovíricos de la presente invención incluyen los retrovirus seleccionados de entre el grupo constituido por el Virus de la Leucosis Aviar, Virus de la leucemia Bovina, Virus de la leucemia Murina, Virus inductor de foco celular del visón, Virus del Sarcoma Murino, Virus de la reticuloendoteliosis, Virus de la Leucemia del Gibón, Virus Mason Pfizer del Mono, y Virus del Sarcoma de Rous. Los Virus de la leucemia Murina particularmente preferidos incluyen 4070A y 1504A (Hartley y Rowe, J. Virol. 19:19-25, 1976), Abelson (ATCC nº VR-999), Friend (ATCC nºVR-245), Graffi, Gross (ATCC nºVR-590), Kirsten, Harvey Sarcoma Virus y Rauscher (ATCC nº VR-998), y Virus Moloney de la Leucemia Nurina (ATCC nº VR-190). Los virus del sarcoma de Rous particularmente preferidos incluyen Bratislava, títulos altos de Bryan, (por ejemplo, ATCC n^{os} VR-334, VR-657,VR-726, VR-659, y VR-728), Bryan estándar, Carr-Ziber, Engelbreth-Holm, Harris, Prague, (por ejemplo, ATCC n^{os} VR-772, y 45033), y Schmidt-Ruppin (por ejemplo, ATCC n^{os} VR-724, VR-725. VR-354).

Cualquiera de los retrovirus anteriores puede utilizarse fácilmente para ensamblar o construir constructos vectoriales retrovíricos, (progenies) celulares de empaquetamiento, o células productoras de la presente invención, dando lugar a la exposición que se proporciona en la presente memoria, y las técnicas estándar de recombinación (por ejemplo, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Kunkle, PNAS 82:488, 1985). Además, incluidas en determinadas formas de realización de la invención, partes del constructo vectorial retrovírico pueden derivarse de un Virus de Sarcoma Murino, un sitio de unión ARNt de un Virus del Sarcoma de Rous, una señal de empaquetamiento de un Virus de la Leucemia Murina, y un origen de síntesis de la segunda cadena de un Virus de la Leukosis Aviar. De modo similar, partes de una progenie celular de empaquetamiento pueden derivarse de diversos virus (por ejemplo, puede construirse un casete de expresión gag/pol a partir de un Virus Moloney de la Leucemia Murina, y un casete de expresión de env de un virus Mason Pfizer del mono).

Tal como se ha indicado anteriormente, se proporcionan, incluidos en varios aspectos de la presente invención, constructos vectoriales retrovíricos que tienen señales de empaquetamiento, y en los que faltan secuencias codificantes gag/pol y env. Utilizada dentro del contexto de la presente invención, se entenderá que una señal de empaquetamiento se referirá a la secuencia nucleótida que no es necesaria para la síntesis, procesamiento o traducción del ARN vírico, o para el ensamblaje de los viriones, pero que se requiere en (forma) cis para la encapsidación del ARN genómico (véase Mann et al., Cell 33:153-159, 1983; RNA Tumor Viruses, segunda edición supra). Además, tal como se utiliza en la presente memoria, la frase "en los que faltan secuencias codificantes gag/pol y env" deberá entenderse para referirse a retrovectores que contienen menos de 20, preferentemente menos de 15, más preferentemente menos de 10, y muy preferentemente menos de 8 nucleótidos consecutivos, que se encuentran en los genes gag/pol o env, y en particular, en el interior de los casetes de expresión gag/pol o env que se utilizan para construir las progenies celulares de empaquetamiento para la construcción del vector retrovírico. Los ejemplos representativos de dichos constructos vectoriales retrovíricos se exponen con mayor detalle en el Ejemplo 1.

Como ilustración, incluida en una forma de realización de la invención, la construcción de constructos vectoriales retrovíricos a los que carezcan de las secuencias gag/pol puede llevarse a cabo preparando constructos vectoriales retrovíricos que carezcan una extendida señal de empaquetamiento. Tal como se utiliza en la presente invención, la frase "extendida señal de empaquetamiento" se refiere a una secuencia de nucleótidos más allá de la mínima secuencia nuclear que es necesaria para el empaquetamiento, lo que permite un aumento del título vírico debido a la potenciación del empaquetamiento. Como ejemplo, para el Virus de la Leucemia Murina MoMLV, la señal mínima nuclear de empaquetamiento es codificada por la secuencia de aproximadamente 144 nucleótidos de SEC ID nº 1 (contando desde el sitio 5' LTR en cabeza), hasta el sitio Pst I (nucleótido 567 de SEC ID nº1). La señal extendida de empaquetamiento de MoMLV incluye la secuencia más allá del nucleótido 567 hasta el comienzo del gen gag/pol (nucleótido 621) y más allá del nucleótido 1040. De este modo, incluida en esta forma de realización, los constructos vectoriales retrovíricos a los que les falta la señal extendida de empaquetamiento, pueden construirse a partir de MoMLV suprimiendo o truncando la señal de empaquetamiento corriente abajo del nucleótido 567.

Incluidos en otras formas de realización de la invención, se proporcionan constructos vectoriales retrovíricos en los que la señal de empaquetamiento que se extiende a, o se solapa la secuencia retrovírica gag/pol, se suprime o se trunca. Por ejemplo, en el caso representativo de MoMLV, la señal de empaquetamiento se suprime o se trunca corriente abajo del comienzo del gen gag/pol (nucleótido 621 de SEC ID nº:1). Incluida en las formas de realización preferidas de la invención, la señal de empaquetamiento finaliza en los nucleótidos 570, 575, 580, 585, 590, 595, 600, 610, 615 ó 617 de SEC ID nº 1.

Incluidos en otros aspectos de la invención, se proporcionan constructos vectoriales retrovíricos que incluyen señales de empaquetamiento que se extienden más allá del comienzo del gen gag/pol (por ejemplo, para MoMLV, más allá del nucleótido 621 de SEC ID nº 1). Cuando dichos constructos vectoriales retrovíricos se utilizan, se prefiere utilizar progenies celulares de empaquetamiento para la producción de partículas víricas recombinantes en las que el extremo 5' del gen gag/pol en un casete de expresión gag/pol se ha modificado para contener codones que están degenerados para gag. Dichos casetes de expresión gag/pol se describen más detalladamente a continuación en la Sección 2 y en el Ejemplo 3.

Incluidos en otros aspectos de la presente invención, se proporcionan constructos vectoriales retrovíricos que comprenden un 5' LTR, un sitio de unión ARNt, una señal de empaquetamiento, un origen de síntesis de una segunda cadena de ADN y un 3' LTR, en los que el constructo plasmídico retrovírico no contiene una secuencia ácido nucleica corriente arriba del 5' LTR''. Tal como se utiliza en el contexto de la presente invención, la frase "no contiene una secuencia ácido nucleica retrovírica corriente arriba del 5' LTR", debe ser entendida como que el constructo plasmídico retroviral contiene menos de 20, preferentemente menos de 15, más preferentemente menos de 10 y muy preferentemente menos de 8 nucleótidos consecutivos encontrados en un retrovirus, y más específicamente, en un retrovirus que presenta homología con el constructo vectorial retrovírico, corriente arriba de y/o contiguo al LTR5'. Incluidos en formas de realización preferidas, los constructos plasmídicos retrovíricos no contienen una secuencia codificante env (tal como se considera a continuación) corriente arriba del 5' LTR. Una forma particularmente preferida de dichos constructos plasmídicos retrovíricos se da a conocer con mayor detalle en el Ejemplo 1.

Incluidos en otro aspecto de la presente invención, se proporcionan constructos plasmídicos retrovíricos que comprenden un 5'LTR, un sitio de unión ARNt, una señal de empaquetamiento, un origen de síntesis de la segunda cadena de ADN y un 3' LTR, donde el constructo plasmídico retrovírico no contiene una secuencia señal de empaquetamiento retrovírico corriente abajo del 3' LTR. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "secuencia de señal de empaquetamiento" debe entenderse como una secuencia que es suficiente para permitir el empaquetamiento del genoma de ARN. En el ejemplo representativo de dichos constructos vectoriales retrovíricos se da a conocer a continuación, con mayor detalle, en el Ejemplo 1.

2. Construcción de casetes de expresión gag/pol

Diversos casetes de expresión gag/pol, en combinación con los constructos vectoriales retrovíricos y los casetes de expresión de env de la presente invención, pueden permitir la construcción de progenies celulares de empaquetamiento y de progenies celulares productoras que excluyan la formación del virus competente para la replicación. Brevemente, los genes retrovíricos gag/pol contienen una región gag que codifica diversas proteínas estructurales que conforman la matriz nuclear y la nucleocápside, y una región pol que contiene genes que codifican (1) una proteasa para el procesamiento de las proteínas gag/pol y env. (2) una polimerasa transcriptasa inversa, (3) una ARNasa H, y (4) una integrasa, que es necesaria para la integración del provector retrovírico en el genoma del huésped. Aunque, para construir los casetes de expresión gag/pol, pueden utilizarse los genes retrovíricos gag/pol, se pueden utilizar asimismo otros distintos genes no retrovíricos (y no víricos) para construir el casete de expresión gag/pol. Por ejemplo, un gen que codifica la ARNasa H retrovírica puede reemplazarse con genes que codifican la ARNasa H bacteriana (por ejemplo, E. coli o Thermus thermophilus). De modo similar, un gen de la integrasa retrovírica puede ser reemplazado por otros genes con función similar (por ejemplo, la integrasa retrotransposónica TY3 de las levaduras).

Los casetes de expresión de gag/pol pueden comprender un promotor unido operativamente a un gen gag/pol, y una secuencia de poliadenilación, en la que el gen gag/pol ha sido modificado para contener codones que están degenerados para gag. Brevemente, tal como se ha indicado anteriormente, en los retrovirus de tipo salvaje, la señal prolongada de empaquetamiento del retrovirus se solapa con secuencias que codifican gag y pol. De este modo, para eliminar el potencial de entrecruzamiento entre el constructo vectorial retrovírico y el casete de expresión gag/pol, así como para eliminar la posibilidad de coencapsidación del casete de expresión gag/pol y el virus competente para la replicación o los constructos vectores retrovíricos, deben ser eliminadas las secuencias que se solapan. La eliminación de dicho solapamiento puede llevarse a cabo modificando el gen gag/pol (y más específicamente, regiones que se solapan con el constructo vectorial retrovírico, tal como la señal extendida de empaquetamiento) para contener codones que están degenerados (es decir, "preoscilantes") para gag. En particular, pueden seleccionarse codones que codifiquen la proteína gag/pol biológicamente activa (es decir, capaz de producir una partícula retrovírica competente), en combinación con un elemento env de expresión y un genoma ARN), faltando en dicha partícula cualquier secuencia de una señal de empaquetamiento, incluyendo, en particular, una secuencia extendida de señal de empaquetamiento. Tal como se utiliza en la presente memoria, la frase "faltando en dicha partícula cualquier secuencia de señal de empaquetamiento" debe entenderse como que el casete de expresión gag/pol contiene menos de 20, preferentemente menos de 15, más preferentemente menos de 10, y muy preferentemente menos de 8 nucleótidos consecutivos que son idénticos a una secuencia encontrada en una señal de empaquetamiento retrovírico (es decir, en el caso de MoMLV, que se extiende hasta y a través el sitio XhoI en el nucleótido número 1561). Un ejemplo particularmente preferido de dichos codones modificados que están degenerados para gag, se muestra en la Figura 10 y en el Ejemplo 3. En particular, por lo menos los codones gag 25, 50, 75, 100, 125 o 135 pueden ser modificados o "bamboleados" a partir de la secuencia gag original en el interior de los casetes de expresión gag/pol.

Además de eliminar el solapamiento entre el constructo vectorial retrovírico y el gen gag/pol, se prefiere asimismo eliminar cualquier solapamiento potencial entre el gen gag/pol y el gen env, para eliminar la posibilidad de recombinación homóloga. Esto puede llevarse a cabo, por lo menos, de dos formas principales: (1) suprimiendo una parte del gen gag/pol que codifique la proteína integrasa, y en particular, la parte del gen que codifica la proteína integrasa que se solapa con la secuencia codificante de env, o (2) seleccionado codones que estén degenerados para la integrasa y/o env.

De este modo, pueden proporcionarse los casetes de expresión gag/pol que comprenden un promotor unido operativamente a un gen gag/pol, y una secuencia o señal de poliadenilación, en la que un extremo terminal 3' del gen se ha suprimido sin afectar la actividad biológica de la integrasa. (La actividad biológica de la integrasa puede determinarse fácilmente detectando un evento de integración, bien mediante análisis del ADN o mediante la expresión de un gen transducido; véase Roth et al., J. Vir. 65 (4):2141-2145, 1991). Como ejemplo, en el virus MoMLV de la leucemia Murina (SEC ID nº1), el gen gag/pol es codificado por los nucleótidos 621 a 5834. Dentro de la secuencia, la proteína integrasa es codificada por los nucleótidos 4610 a 5834. Una parte de la secuencia gag/pol que codifica la integrasa, codifica también env (que empieza en el nucleótido 5776). De esta forma, el extremo terminal 3' del gen gag/pol puede suprimirse o truncarse para evitar el entrecruzamiento en el gen env, sin afectar a la actividad biológica de la integrasa. El gen gag/pol puede ser eliminado en cualquier nucleótido corriente abajo del extremo (3') a partir del comienzo de la secuencia codificante de la integrasa, y preferentemente antes del principio de la secuencia del gen env. La secuencia que codifica gag/pol puede ser una secuencia MoMLV, y el gen gag/pol puede ser eliminado en cualquier nucleótido entre los nucleótidos 4610 y 5576 (de SEC ID nº:1), incluyendo, por ejemplo, a los nucleótidos 5575, 5770, 5765, 5760, 5755, 5750.

El casete de expresión gag/pol puede contener secuencias que codifiquen gag/pol (y que incluyen la integrasa), aunque le falte cualquier secuencia que se encuentre en un gen env. La frase "aunque le falte cualquier secuencia que se encuentre en un gen env" debe entenderse como que el casete de expresión gag/pol no contiene por lo menos 20, preferentemente por lo menos 15, más preferentemente por lo menos 10, y muy preferentemente menos de 8 nucleótidos consecutivos que sean idénticos a una secuencia env, y que preferentemente se encuentran en un casete de expresión de env que se utilizará conjuntamente con el casete de expresión gag/pol para formar una célula de empaquetamiento. Dichos casetes de expresión pueden prepararse fácilmente seleccionando codones que estén degenerados para la integrasa, y que no codifiquen a la env biológicamente activa. (Véase Morgenstern y Land, Nuc. Acids Res, 18:3587-3596 1990).

El casete de expresión gag/pol puede contener un promotor heterólogo, y/o una secuencia de poliadenilación. Tal como se utiliza en la presente memoria, promotores heterólogos o secuencias de poliadenilación se refieren a promotores o secuencias de poliadenilación que tienen un origen distinto del cual se deriva el gen gag/pol (y preferentemente el gen env y el constructo vectorial retrovírico). Ejemplos representativos de promotores apropiados incluyen el promotor temprano inmediato ("CMV IE") del Cytomegalovirus, el promotor Timidín Quinasa ("HSVTK") del Virus del Herpes Simple, el promotor ("RSV") del Virus del Sarcoma de Rous, el promotor tardío del Adenovirus y el promotor del SV40. Ejemplos representativos de señales de poliadenilación apropiadas incluyen la señal tardía de poliadenilación del SV40 y señal temprana de poliadenilación del SV40.

Los casetes de expresión gag/pol tales como los que se han descrito anteriormente, no pueden coencapsidarse junto con un virus competente para la replicación. Un procedimiento representativo para determinar la coencapsidación se expone a continuación en el Ejemplo 8.

3. Construcción de los casetes de expresión de env

Pueden proporcionarse casetes de expresión de env que, en combinación con los casets de expresión gag/pol y los constructos vectoriales retrovíricos descritos anteriormente, excluyen la formación de virus competentes para la replicación mediante recombinación homóloga, así como para conferir una especificidad particular de la partícula vectorial resultante (por ejemplo, anfotrópica, ecotrópica, xenotrópica o politrópica; véase la Figura 17, así como lo expuesto anteriormente). Brevemente, en un retrovirus de tipo salvaje, el gen env codifica dos proteínas principales, la glicoproteína de superficie "SU" y la proteína transmembranosa "TM", que son traducidas como una poliproteína, y separadas, por tanto, de la fragmentación proteolítica. Ejemplos representativos de las proteínas SU y TM son la proteína gp120 y gp41 en el HIV, y de la proteína gp70 y p15e en MoMLV. En algunos retrovirus, una tercera proteína denominada el "péptido R" de función indeterminada, se expresa a partir a partir del gen env y separada de la poliproteína mediante fragmentación proteolítica. En el Virus MoMLV de la Leucemia Murina, el péptido R se denomina "p2".

Una amplia variedad de casetes de expresión de env puede construirse con la exposición que se ha proporcionado en la presente memoria, y que se ha utilizado para excluir la recombinación homóloga. Pueden proporcionarse casetes de expresión de env que comprenden un promotor unido operativamente a un gen env, en el que no más de 6, 8, 10, 15 o 20 nucleótidos retrovíricos seguidos se incluyen corriente arriba (5') de, y/o contiguos a dichos gen env. Pueden proporcionarse casetes de expresión env que comprenden un promotor operativamente unido a un gen env, en el que el casete de expresión de env no contiene una secuencia seguida de más de 20, preferentemente menos de 15, más preferentemente menos de 10, y más preferentemente menos de 8 o 6 nucleótidos consecutivos, que se encuentran en un gen gag/pol, y en particular, en un casete de expresión gag/pol que será utilizado junto con el casete de expresión env para crear una progenie celular de empaquetamiento.

Pueden proporcionarse casetes de expresión de env que comprenden un promotor operativamente unido a un gen env y una secuencia de poliadenilación, en la que se ha eliminado un extremo terminal 3' del gen env sin afectar a la actividad biológica de env. Tal como se utiliza en la presente memoria, la frase "actividad biológica de env" se refiere a la capacidad de que la proteína de la envuelta se exprese en la superficie de un virus o partícula viral, y que permita la infección exitosa de una célula huésped. Un procedimiento práctico para evaluar la actividad biológica es transfectar de forma transitoria el casete de expresión env en una célula que contiene un casete de expresión funcional gag/pol determinada previamente, y un constructo vectorial retrovírico que expresa un marcador seleccionable. Un casete de expresión env biológicamente funcional permitirá que las partículas producidas en la célula transfectada, transmita el marcador seleccionable a una célula sensible ingenua, de modo que se vuelva resistente a la selección del fármaco marcador. El extremo terminal 3' del gen env puede eliminarse o truncarse de modo que no se produce un péptido R completo mediante el casete de expresión. En el ejemplo representativo de MoMLV, la secuencia que codifica el péptido R (que empieza en el nucleótido 7734) se suprime, se trunca, o, por ejemplo, se finaliza insertando un codon de detención en los nucleótidos 7740, 7745, 7747, 7750, 7755, 7760, 7765, 7770, 7775, 7780, o cualquier otro nucleótido entre ellos.

Pueden proporcionarse casetes de expresión env que contengan un promotor heterólogo, y/o una secuencia heteróloga de poliadenilación. Tal como se utiliza en la presente memoria, los promotores heterólogos o las secuencias de poliadenilación se refieren a promotores heterólogos o secuencias de poliadenilación que tienen un origen distinto del cual se deriva el gen gag/pol (y preferentemente el gen env y el constructo vectorial retrovírico). Ejemplos representativos de promotores apropiados incluyen el promotor CMV IE, el promotor HSVTK, el promotor RSV, el promotor tardío principal del Adenovirus y el promotor del SV40. Ejemplos representativos de señales de poliadenilación apropiadas incluyen la señal tardía de poliadenilación del SV40 y la señal temprana de poliadenilación del SV40.

Secuencias heterólogas

Tal como se ha indicado anteriormente, los constructos vectoriales retrovíricos, los casetes de expresión gag/pol, y los casetes de expresión env que se describen en la presente memoria, pueden contener (y expresar) una o más secuencias heterólogas. Dentro del contexto de la presente invención, pueden utilizarse una amplia variedad de secuencias heterólogas, que incluyen, por ejemplo, genes citotóxicos, secuencias antisentido, secuencias que codifican productos génicos que activan un compuesto que no presenta o presenta poca citotoxicidad (es decir, un "profármaco") a un producto tóxico, secuencias que codifican partes inmunogénicas de antígenos asociados a enfermedades y secuencias que codifican moléculas inmunes accesorias. Ejemplos representativos de genes citotóxicos incluyen los genes que codifican proteínas tales como la ricina, (Lamb et al., Eur. J. Biochem. 148:265-270, 1985), abrina, (Wood et al, Eur. J. Biochem, 196: 723-732, 1991; Evensen et al., J. of Biol. Chem. 266: 6848-6852, 1991; Collins et al., J. of Biol., Chem. 265:8665-8669, 1990; Chen et al., Fed of Eur. Biochem Soc, 309:115-118, 1992), la toxina diftérica (Tweten et al., J Biol. Chem, 260:10392-10394, 1985), la toxina colérica (Mekalanos et al., Nature 306:551-557, 1983); Sanchez-Holmgren, PNAS 86: 481-485, 1989), gelonina (Stirpe et al., J. Biol. Chem. 255:6947-6953,1980), hierba carmín (Irvin, Pharmac. Ther.21: 371-387, 1983), la proteína antivírica, Barbieri et al., Biochem J. 203:55-59, 1982; Irvin et al., Arch. Biochem. & Biophys. 200: 418-425, 1980; Irvin, Arch. Biochem. & Biophys. 169:522-528, 1975), tritina, toxina shigella (Calderwood et al., PNAS 84: 4364-4368, 1987; Jackson et al., Microb. Path. 2:147-153, 1987) y la exotoxina A de Pseudomonas (Carroll y Collier, J. Biol. Chem. 262: 8707-8711, 1987).

Incluido en otras formas de realización de la invención, el ARN antisentido puede utilizarse como un gen citotóxico para inducir una potente respuesta restringida de tipo 1. Brevemente, además del ARN de unión y evitando de este modo la traducción de un ARNm específico, niveles altos de secuencias antisentido específicas pueden utilizarse para inducir un aumento de la expresión de interferones (incluyendo el interferón gamma), debido a la formación de grandes cantidades de ARN bicatenario. El aumento de la expresión del interferón gamma, a su vez, repercute en la expresión de los antígenos MHC de tipo 1. A este respecto, la utilización de secuencias antisentido preferidas incluyen ARN actina, ARN miosina, y ARN histona, Es particularmente preferido el ARN antisentido que está desemparejado con el ARN actina.

Incluidas en otras formas de realización de la invención, se proporcionan secuencias antisentido que inhiben, por ejemplo, el desarrollo de células tumorales, la replicación viral, o una enfermedad genética, evitando la síntesis celular de proteínas críticas necesarias para el crecimiento celular. Ejemplos de dichas secuencias incluyen la timidín quinasa antisentido, la dihidrofolato reductasa antisentido (Maher y Dolnick, Arch. Biochem. & Biophys. 253:214-220, 1987; Bzik et al., PNAS 84:8360-8364, 1987), el HER2 antisentido (Coussens et al, Science 230:1132-1139, 1985), ABL antisentido (Fainstein et al., Oncogene 4:1477-1481, 1989), Myc antisentido (Stanton et al., Nature 310: 423-425, 1984), y ras antisentido, así como secuencias antisentido que bloquean cualquiera de las enzimas en la vía biosintética de los nucleótidos.

Incluidos en otros aspectos de la invención, se proporcionan los constructos vectoriales retrovíricos que dirigen la expresión de un producto génico que activa un compuesto con una pequeña toxicidad o sin ella (es decir "un profármaco") a un producto tóxico. Ejemplos representativos de dichos productos génicos incluyen la timidín quinasa del virus de la Varicella zoster (VZVTK), la timidín quinasa del virus del Herpes simple (HSVTK) (Field et al., J. Gen. Virol. 49: 115-124, 1980; Munir et al., Protein Engineering 7(1):83-89, 1994; Black y Loeb, Biochem 32(43):11618-11626, 1993), la guanina fosforibosil transferasa de E. coli (véase la solicitud de patente US nº de serie 08/155.944, titulada "Compositions and Methods for Utilizing Conditionally Lethal Genes", registrada el 18 de noviembre de 1993; véanse también la WO 93/10218 titulada "Vectors Including Foreign Genes and Negative Selection Markers", la WO 93/01281 titulada "Cytosine Deaminase Negative Selection System for Gene Transfer Techniques and Therapies", la WO 93/08843 titulada "Trapped Cells and Use Thereof as a Drug", la WO 93-08844 titulada "Transformant Cells for the Prophylaxis or Treatment of Diseases Caused by Viruses, Particularly Pathogenic Retroviruses", y la WO-90/07936 titulada "Recombinant Therapies for Infection and Hyperproliferative Disorders" Incluidos en las formas de realización preferidas de la invención, los constructores vectoriales retrovíricos dirigen la expresión de un producto génico que activa un compuesto con poca toxicidad o sin ella a un producto tóxico en presencia de un agente patogénico, afectando por lo tanto la terapia localizada para el agente patógeno (véase WO 94/13304).

\newpage

Incluidos en una forma de realización de la invención, se proporcionan constructos vectoriales retrovíricos que dirigen la expresión de un gen HSVTK corriente abajo, y bajo el control transcripcional de un promotor de HIV (del que se sabe es transcripcionalmente silencioso, excepto cuando es activado por la proteína HIV tat). Brevemente, la expresión del producto génico tat en las células humanas infectadas con el HIV y que transportan el constructo vectorial, provoca un aumento en la producción de HSVTK. Las células (in vitro o in vivo) se exponen entonces a un fármaco tal como ganciclovir, aciclovir o sus análogos (FIAU, FIAC, DHPG). Se sabe que dichos fármacos son fosforilados por HSVTK (pero no por la timidin quinasa celular) a sus correspondientes formas nucleótidas activas trifosfatadas. El aciclovir y los trifosfatos FIAU inhiben las polimerasas celulares en general, conduciendo a la destrucción específica de las células que expresan HSVTK en ratones transgénicos (véase Borrelli et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7572, 1988). Las células que contienen el vector recombinante y que expresan la proteína tat de HIV son eliminadas selectivamente por la presencia de una dosis específica de estos fármacos.

Incluidos en otros aspectos de la presente invención, los constructos vectoriales retrovíricos de la presente invención pueden dirigir asimismo la expresión de una o más secuencias que codifican partes inmunogénicas de antígenos asociados con enfermedades. Tal como se utiliza en el contexto de la presente invención, los antígenos se consideran "asociados con enfermedades", si están asociados con que una célula (u organismo) enferme, o lo están con un estado de enfermedad en general, pero no son esenciales o no son necesarios para que la célula enferme. Además, se considera que los antígenos son "inmunogénicos" si pueden, bajo condiciones apropiadas, provocar una respuesta inmune (mediada celular o humoralmente). Las "partes" inmunogénicas pueden ser de tamaño variable, pero tienen preferentemente por lo menos 9 aminoácidos de longitud y pueden incluir el antígeno entero.

Incluidos en el alcance de la presente invención, se considera una amplia variedad de antígenos "asociados con una patología", que incluyen, por ejemplo, formas inmunogénicas no tumorigénicas de componentes celulares alterados que están normalmente asociados con células tumorales (véase WO-93/10814). Ejemplos representativos de componentes celulares alterados que están asociados normalmente con células tumorales incluyen ras* (donde "*" indica una referencia a antígenos que han sido alterados para no ser tumorigénicos), p53*, Rb*, proteínas alteradas codificadas por el gen del tumor de Wilms, ubiquitina *, mucina, proteína codificada por los genes DCC, APC y MCC, así como receptores o estructuras de tipo receptor tales como neu, receptores de la hormona tiroidea, receptor del Factor de Crecimiento Derivado de las Plaquetas ("PDGF"), receptor insulínico, receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico ("EGF") y el receptor del Factor de Estimulación Colonial ("CSF").

Debe asimismo apreciarse que antígenos "asociados a enfermedades" incluye la totalidad o partes de varios patógenos virales o eucarióticos o procarióticos. Ejemplos representativos de patógenos virales incluyen el Virus de la Hepatitis B ("HBV") y el Virus de la Hepatitis C ("HCV", véase WO 93/15207), el Virus del Papiloma Humano ("HPV", véase WO 92/05248, WO 90/10459; EPO 133,123), Virus de Epstein-Barr ("EBV" véase EPO 173.254; JP 1.128.788; y las patentes US nº 4.939.088 y nº 5.173.414), el Virus de la Leucemia Felina ("FeLV"; véase WO 93/09070, EPO 377.842; WO 90/08832; WO 93/09238). El Virus de la Inmunodeficiencia Felina ("FIV", patente US nº 5.037.753; WO 92/15684; WO 90/13573; y JP 4.126.085), HTLV I y II y el Virus de la Inmunodeficiencia Humana ("HIV\cdot", véase WO 93/02805).

Los constructos vectoriales retrovíricos, los casetes de expresión de gag/pol y los casetes de expresión de env que se han descrito anteriormente pueden dirigir también la expresión de una o más moléculas inmunes accesorias. Tal como se utiliza en la presente memoria, la frase "moléculas inmunes accesorias" se refiere a moléculas que pueden bien aumentar o disminuir el reconocimiento, presentación o activación de una respuesta inmune (mediada celular o humoralmente). Ejemplos representativos de moléculas inmunes accesorias incluyen el interferón \alpha, el interferón \beta, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7 (patente US nº 4.965.195), IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 (Wolf et al., J. Immun. 46:3074, 1991; Gubler et al., PNAS 88:4143, 1991, WO 90/05147; EPO 433.827), IL-13 (WO 94/04680), IL-14, IL-15, GM-CSF, M-CSF-1, G-CSF, CD3 (Krissanen et al., Immunogenetics 26:258-266, 1987), CD8, ICAM-1 (Simmons et al., Nature 331:624-627, 1988), ICAM-2 (Singer, Science 225:1671,1992), \beta-microglobulina (Parnes et al., PNAS 78:2253-2257, 1981), LFA-1 (Altmann et al., Nature 338:521, 1989), LFA3 (Wallner et al., J. Exp. Med. 166(4):923-932, 1987, moléculas HLA de tipo I, moléculas HLA de tipo II, B7 (Freeman et al., J. Immun. 143:2714, 1989), y B7-2. Incluido en una forma de realización preferida, el gen heterólogo codifica el interferón gamma.

Incluidos en los aspectos preferidos de la presente invención, los constructos vectoriales retrovíricos descritos en la presente memoria pueden dirigir la expresión de más de una secuencia heteróloga. Dichas secuencias múltiples pueden controlarse mediante un único promotor, o preferentemente, mediante promotores secundarios adicionales (por ejemplo, Sitios Internos de Unión Ribosómica o "IRBS"). Incluidos en formas de realización preferidas de la invención, los constructos vectoriales retrovíricos dirigen la expresión de secuencias heterólogas que actúan sinérgicamente. Por ejemplo, incluidos en una forma de realización, se proporcionan constructos retrovíricos que dirigen la expresión de una molécula tal como IL-15, IL-12, IL-2, interferón gamma, u otras molécula que actúe para aumentar la presentación mediada por células en la vía T_{H}1, junto con una parte inmunogénica de un antígeno asociado con una enfermedad. En dichas formas de realización, la presentación inmune y el procesamiento del antígeno asociado con la enfermedad aumentarán debido a la presencia de la molécula inmune accesoria.

Incluidos en otros aspectos de la invención, se proporcionan constructos vectoriales retrovíricos que dirigen la expresión de una o más secuencias heterólogas que codifican genes de "reemplazamiento". Tal como se utiliza en la presente memoria, deberá entenderse que el término "genes de reemplazamiento" se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína terapéutica que puede evitar, inhibir, estabilizar o invertir un defecto génico heredado o no. Ejemplos representativos de dichos defectos génicos incluyen trastornos en el metabolismo, regulación inmune, regulación hormonal, y función enzimática o estructural asociada a la membrana. Ejemplos representativos de enfermedades causadas por dichos defectos, incluyen la Fibrosis cística ("CF"; véase Dorin et al., Nature 326:614), enfermedad de Parkinson, deficiencia de Adenosina desaminasa ("ADA"; Hahma et al., J. Bact. 173:3663-3672, 1991), trastornos de la \beta-globina, hemofilia A & B (deficiencias en el Factor VIII, véase Wood et al., Nature 312:330, 1984), enfermedad de Gaucher, diabetes, formas de artritis gotosa y enfermedad de Lesch-Nylan (debida a deficiencias "HPRT"; véase Jolly et al., PNAS 80:477-481, 1983) y Hipercolesterolemia Familiar (mutaciones del Receptor de LDL; véase Yamamoto et al., Cell 39:27-38 (1984).

Las secuencias que codifican los genes heterólogos descritos anteriormente pueden obtenerse fácilmente a partir de diversos orígenes. Por ejemplo, los plásmidos que contienen secuencias que codifican moléculas inmunes accesorias pueden obtenerse a partir de un depósito tal como la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Maryland), o a partir de fuentes comerciales tal como la British Bio-Technology Limited (Cowley, Oxford, Inglaterra). Secuencias de origen representativo que codifican las moléculas inmunes accesorias a las que anteriormente se ha hecho referencia, incluyen la BBG 12 (que contiene el gen GM-CSF que codifica la proteína madura de 127 aminoácidos), la BBG 6 (que contiene secuencias que codifican el interferón gamma), la ATCC nº 39656 (que contiene secuencias que codifican TNF), la ATCC nº 20663 (que contiene secuencias que codifican el interferón alfa), las ATCC n^{os} 31902, 31902 y 39517 (que contienen secuencias que codifican el interferón beta), la ATCC nº 67024 (que contiene una secuencia que codifica la interleuquina-1), las ATCC n^{os} 39405, 39452, 39516, 39626 y 69673, (que contienen secuencias que codifican la interleuquina 2), las ATCC n^{os} 59399, 59398, y 37326 (que contienen secuencias que codifican el interferón-3), la ATCC nº 57592 (que contiene secuencias que codifican la interleuquina-4), las ATCC n^{os} 59394 y 59395 (que contienen secuencias que codifican la interleuquina-5) y la ATCC nº 67153 (que contiene secuencias que codifican la interleuquina-6). Resulta evidente para el experto en la materia que se pueden utilizar la secuencia completa de la proteína, o una parte suya apropiada que codifique la parte biológicamente activa de la proteína.

Alternativamente, secuencias ADNc conocidas que codifican genes citotóxicos u otros genes heterólogos pueden obtenerse a partir de células que expresan o contienen dichas secuencias. Brevemente, incluido en una forma de realización, el ARNm de una célula que expresa el gen de interés, es transcrito a la inversa con la transcriptasa inversa utilizando cebadores oligo dT o al azar. El ADNc monocatenario puede entonces amplificarse mediante PCR (veánse las patentes US nº 4.683,202, nº 4.683.195 y nº 4.800.159. Véase también PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, Erlich, editor., Stockton Press, 1989), que utiliza cebadores oligonucleótidos complementarios a secuencias en cada lado de las secuencias deseadas. En particular, un ADN bicatenario es desnaturalizado calentando en presencia de la polimerasa Taq térmicamente estable, cebadores de la secuencia específica del ADN, ATP, CTP, GTP y TTP. EL ADN bicatenario se produce cuando la síntesis finaliza. Este ciclo puede repetirse muchas veces, dando lugar a una amplificación factorial del ADN deseado.

Las secuencias que codifican los genes anteriormente descritos pueden asimismo sintetizarse, por ejemplo, con un sintetizador de ADN de Apple Biosystems INc (por ejemplo, el sintetizador de ADN,ABI, modelo 392 (Foster City, California)).

Preparación de progenies celulares de empaquetamiento retroviral, y generación de partículas víricas recombinantes

Tal como se ha indicado anteriormente, los casetes de expresión gag/pol y los casetes de expresión env pueden utilizarse para generar partículas vectoriales retrovíricas competentes para la transducción, introduciéndolas en una progenie celular parental apropiada para crear una progenie celular de empaquetamiento, seguido por la introducción de un constructo vectorial retrovírico, para crear una progenie celular productora (véase WO 92/05266). Dichas progenies celulares de empaquetamiento, después de la introducción de un constructo vectorial de tipo N2 (Armentano et al.,J. of Vir. 61(5):1647-1650, 1987), producen un título superior a 10^{5} cfu/ml, y preferentemente superior a un título más alto que 10, 20, 50, o 100 veces que las células similares PA317 transducidas (Miller y Buttimore, Mol. and Cell. Biol. 6(8):2895-2902, 1986).

Pueden proporcionarse procedimientos para crear progenies celulares de empaquetamiento, que comprenden las etapas que consisten en (a) introducir un casete de expresión gag/pol en una célula animal, (b) seleccionar una célula que contenga un casete de expresión gag/pol que exprese niveles altos de gag/pol, (c) introducir un casete de expresión env en la célula seleccionada, (d) seleccionar una célula que exprese altos niveles de env, creando, por tanto, la célula de empaquetamiento. Pueden proporcionarse procedimientos para crear progenies celulares de empaquetamiento, que comprenden las etapas que consisten en: (a) introducir un casete de expresión env en una célula animal, (b) seleccionar una célula que contenga un casete de expresión gag/pol que exprese niveles altos de env, (c) introducir un casete de expresión gag/pol en la célula seleccionada, y (d) seleccionar una célula que exprese altos niveles de gag/pol, creando, por tanto, la célula de empaquetamiento. Tal como se utiliza en la presente memoria, debe entenderse que "altos" niveles de gag/pol o env se refiere a células de empaquetamiento que produzcan por lo menos z veces más proteínas gag/pol o env que las células PA317, donde z es seleccionada de entre el grupo constituido por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10.

Para preparar células de empaquetamiento pueden utilizarse una amplia variedad de células animales, que incluyen por ejemplo células humanas, de macacos, de perros, de ratas y de ratones. progenies celulares particularmente preferidas para utilizar en la preparación de progenies celulares de empaquetamiento, son aquéllas en las que faltan secuencias genómicas que son homólogas para el constructo vectorial retrovírico, casetes de expresión env/pol o casetes de expresión env que vayan a utilizarse. Los procedimientos para determinar la homología pueden llevarse fácilmente a cabo, mediante, por ejemplo, análisis de hibridización (Véase Martin et al., PNAS 78:4892-4896, 1981, véase también WO 92/05266).

Los casetes de expresión pueden introducirse en las células mediante numerosas técnicas, que incluyen, por ejemplo, la transfección mediante varios procedimientos físicos, tales como electroporación, DEAE dextrano, lipofección (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:7413-7417, 1989), inyección directa de ADN (Acsadi et al., Nature 352:815-818, 1991); bombardeo con microproyectiles (Williams et al., PNAS 88:2726-2730, 1991), liposomas de diversos tipos (véase por ejemplo, Wang et al, PNAS 84: 7851-7855, 1987); CaPO_{4} (Dubensky et al., PNAS 81:7529-7533, 1984), ligando del ADN (Wu et al., J. of Biol. Chem 264:16985-16987, 1989), administración sólo de ácidos nucleicos (WO 90/11092), o administración del ADN unido al adenovirus inactivo (Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3: 147-154, 1992).

Las líneas celulares productoras (denominadas asimismo líneas productoras de vectores o "VCL") pueden ser a continuación fácilmente preparadas introduciendo un constructo vectorial retrovírico como se ha descrito anteriormente, en una línea celular de empaquetamiento. Las líneas celulares productoras pueden proporcionarse comprediendo un casete de expresión gag/pol, un casete de expresión env, y un constructo vectorial retrovírico, en las que el casete de expresión gag/pol, el casete de expresión env y el constructo vectorial retrovírico carecen de una secuencia consecutiva de más de 20, preferentemente 15, más preferentemente 10, y todavía más preferentemente 10 u 8 nucleótidos en común.

Composiciones farmacéuticas

Pueden proporcionarse composiciones farmacéuticas, que comprenden una partícula vírica recombinante tal como se ha descrito anteriormente, en combinación con un transportador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones farmacéuticas pueden prepararse como una solución líquida, o en forma sólida (por ejemplo, liofilizada), que se suspende en una solución antes de la administración. Además, la composición puede prepararse con transportadores o diluyentes apropiados para administración tópica, inyección o administración oral, nasal, vaginal, sublingual, inhalante o rectal.

Los transportadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones utilizadas. Los ejemplos representativos de transportadores o diluyentes para soluciones inyectables incluyen agua, soluciones salinas isotónicas que son tamponadas preferentemente a un pH fisiológico (tal como solución salina tamponada con fosfato o solución salina tamponada Tris), manitol, dextrosa, glicerol, y etanol, así como polipéptidos o proteínas tales como la albúmina sérica humana. Una composición particularmente preferida comprende un constructo vectorial retrovírico o una partícula vírica recombinante en 10 mg/ml de manitol, 1 mg/ml HSA, 20 mM Tris, pH 7,2, y 150 mM NaCl. En este caso, ya que el vector recombinante representa aproximadamente 1 mg de material, puede representar menos del 1% del material de alto peso molecular, y menos del 1/10.0000 del material total (incluyendo el agua). Esta composición es estable a -70ºC durante seis meses por lo menos.

Las composiciones farmacéuticas pueden incluir asimismo adicionalmente factores que estimulan la división celular, y por tanto, la absorción e incorporación de un vector retrovírico recombinante. Los ejemplos representativos incluyen la Hormona Estimulante de los Melanocitos (MSH) para los melanomas, o el factor de crecimiento epidérmico para las mamas u otros carcinomas epiteliales.

Procedimientos y composiciones particularmente preferidos para preservar los virus recombinantes, se describen en las solicitudes US (de patente) tituladas "Methods for Preserving Recombinant Viruses" (véase WO 94/11414).

Procedimientos de administración

Pueden proporcionarse procedimientos para inhibir o destruir agentes patogénicos en un animal de sangre caliente, que comprende la administración a un animal de sangre caliente de una partícula vírica recombinante tal como se ha descrito anteriormente, de tal forma que el agente patogénico se inhiba o destruya. Las partículas víricas recombinantes pueden administrarse in vivo, o ex vivo. Las vías representativas para la administración in vivo incluyen las intradérmicas ("i.d"), intracraneales ("i.c"), intraperitoneales ("i.p."), intratecales ("i.t"), intravenosas ("i.v"), subcutáneas ("s.c"), intramuscular ("i.m") o incluso, directamente en un tumor.

Alternativamente, los genes citotóxicos, secuencias antisentido, productos génicos, constructos vectoriales retrovíricos o partículas virales pueden administrarse también a un animal de sangre caliente mediante diversos procedimientos. Los ejemplos representativos incluyen la transfección mediante varios procedimientos físicos, tales como la lipofección (Felgner et al., proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417, 1989), la inyección directa del ADN (Acsadi et al., Nature 352:815-818, 1991); el bombardeo con microproyectiles (Williams et al., PNAS 88:2726-2730, 1991), liposomas de diversos tipos (véase por ejemplo, Wang et al, PNAS 84: 7851-7855, 1987); CaPO_{4} (Dubensky et al., PNAS 81:7529-7533, 1984), ligando del ADN (Wu et al., J. of Biol. Chem 264:16985-16987, 1989), administración sólo de ácidos nucleicos (WO 90/11092), o administración del ADN unido al adenovirus inactivo (Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3: 147-154, 1992).

\newpage

Las partículas retrovíricas (o los constructos retrovíricos solos) pueden utilizarse para tratar directamente los agentes patogénicos tales como un tumor. Las partículas retrovíricas o los constructos vectoriales retrovíricos que se han descrito anteriormente pueden administrarse directamente a un tumor, por ejemplo, mediante la inyección directa en diversas localizaciones diferentes en el interior de la masa tumoral. Alternativamente, las arterias que irrigan un tumor pueden identificarse e inyectarse el vector en dicha arteria, para suministrar directamente el vector al tumor. Un tumor que tiene un centro necrótico puede aspirarse, e inyectarse directamente el vector en el centro tumoral entonces vacío. El constructo vectorial retrovírico puede administrarse directamente a la superficie tumoral, aplicando, por ejemplo, una composición farmacéutica tópica que contenga el constructo vectorial retrovírico, o preferentemente, una partícula retrovírica recombinante.

Pueden proporcionarse procedimientos para inhibir el crecimiento de un tumor seleccionado en un animal de sangre caliente, que comprenden las etapas que consiten en (a) extraer células tumorales asociadas con el tumor seleccionado de un animal de sangre caliente, (b) infectar las células extraídas con un constructo vectorial retrovírico que dirija la expresión de, por lo menos, un agente antitumoral, y (c) suministrar las células infectadas a un animal de sangre caliente, de forma que el crecimiento del tumor seleccionado sea inhibido por respuestas inmunes generadas contra las células tumorales génicamente modificadas. La "inhibición del crecimiento de un tumor seleccionado" se refiere a: (1) la inhibición directa de una división celular tumoral, o (2) la lisis celular tumoral mediada por las células inmunes, o a ambas, lo que conduce a una supresión de la expresión neta de las células tumorales. La inhibición del crecimiento tumoral mediante cualquiera de estos dos mecanismos puede determinarse fácilmente por un experto en la materia, basándose en diversos procedimientos bien conocidos (véase la patente US nº de serie 08/032.846). Ejemplos de compuestos o moléculas que actúen como agentes antitumorales incluyen las moléculas inmunes accesorias, los genes citotóxicos, y/o las secuencias antisentido, tal como se ha considerado anteriormente (véase también la patente US nº de serie 08/032.846).

Las células pueden ser extraídas a partir de diversas localizaciones que incluyen, por ejemplo, un tumor seleccionado. Además, un constructo vectorial puede insertarse en células no tumorigénicas, que incluyen, por ejemplo, células de la piel, (fibroblastos dérmicos), o de la sangre (por ejemplo, leucocitos sanguíneos periféricos). Si se desea, pueden extraerse también específicamente de la sangre fracciones particulares de células tales como un subconjunto de células T o células troncales (véase, por ejemplo, la PCT WO 91/16116, una aplicación que se titula "Immunoselection Device and Method". Los constructos vectoriales pueden construirse, entonces, con las células extraídas utilizando cualquiera de las técnicas descritas anteriormente, seguido por el regreso de las células al animal de sangre caliente, preferentemente a las proximidades o al interior del tumor. Después de la extracción de las células tumorales de un animal de sangre caliente, puede generarse una única suspensión celular mediante, por ejemplo, el rompimiento físico o la digestión proteolítica. Además, puede aumentarse la división de las células añadiendo diversos factores tales como el factor estimulante melanocítico para melanomas o el factor de crecimiento epidérmico para los carcinomas mamarios, para potenciar la absorción, la integración genómica y la expresión del vector vírico recombinante.

Debe entenderse que las células extraídas no sólo pueden ser devueltas al mismo animal, sino que pueden asimismo ser utilizadas para inhibir el crecimiento de las células tumorales seleccionadas en otro animal alogénico. En tal caso, se prefiere generalmente tener animales histocompatiblemente emparejados (aunque no siempre, véase, por ejemplo, Yamamoto et al., "Efficacy of Experimental FIV Vaccines", 1ª conferencia internacional de investigadores de FIV, University of California en Davis, septiembre de 1991).

Los procedimientos descritos anteriormente pueden comprender además las etapas de vaciamiento de los fibroblastos o de otras células tumorales no contaminantes después de la extracción de las células tumorales de un animal de sangre caliente, y/o la etapa de inactivación de las células, por ejemplo, mediante irradiación.

Tal como se ha considerado anteriormente, pueden administrarse varios agentes antitumorales a la vez o secuencialmente, para inhibir el crecimiento de un tumor seleccionado según los procedimientos de la presente invención. Por ejemplo, un agente antitumoral tal como \gamma-IFN puede coadministrarse o administrarse secuencialmente a un animal de sangre caliente junto con otros agentes antitumorales tales como IL-2 o IL-12, para inhibir o destruir un agente patogénico. Dicha composición terapéutica puede administrarse directamente utilizando un único constructo vectorial que dirige la expresión de por lo menos dos agentes antitumorales o que se expresan a partir de constructos vectoriales independientes. Alternativamente, puede administrarse un agente antitumoral por ejemplo, \gamma-IFN) utilizando un constructo vectorial, aunque otros agentes antitumorales (por ejemplo, IL-2) se administran directamente (por ejemplo, intravenosamente, como una composición farmacéutica).

Pueden administrarse al paciente constructos vectoriales retrovíricos que suministran y expresan tanto un gen \gamma-IFN como otro gen que codifica IL-2. En dichos constructos, un gen puede expresarse a partir del retrovector LTR y el otro puede utilizar un promotor transcripcional adicional encontrado entre los LTR, o puede expresarse como un ARNm policistrónico, utilizando posiblemente un sitio de unión ribosómico interno. Después de una transferencia génica in vivo, el sistema inmune del paciente es activado debido a la expresión de \gamma-IFN. La infiltración del tumor moribundo con células inflamatorias, a su vez, aumenta la presentación inmune y mejora además la respuesta inmune del paciente contra el tumor.

Pueden proporcionarse procedimientos para generar una respuesta inmune contra una parte inmunogénica de un antígeno, para evitar o tratar una enfermedad (véanse, por ejemplo, las patentes US nº de serie 08/104.424, nº 08/102.132; nº 07/948.358; nº 07/965.084), para suprimir el rechazo del injerto (véanse las patentes US nº de serie 08/116.827), para suprimir una respuesta inmune (véanse las patentes US nº de serie 08/116.828, y para suprimir una respuesta autoinmune (véase la patente US nº de serie 08/116.983).

Como se apreciará por el experto en la materia, a partir de la exposición proporcionada en la presente memoria, cualquiera de los constructos vectoriales retrovíricos que se han descrito en la presente memoria pueden suministrarse no sólo como una partícula vírica recombinante, sino como vectores directos ácido nucleicos directos. Dichos vectores pueden suministrarse utilizando cualquier procedimiento físico apropiado de transferencia génica, incluyendo, por ejemplo, los que se han considerado anteriormente.

Los ejemplos siguientes se proporcionan con fines ilustrativos, y no limitativos.

Ejemplo 1 Construcción de estructuras retrovirales A. Preparación de un constructo vectorial retrovírico que no contiene una secuencia extensa de empaquetamiento (\Psi)

Este ejemplo describe la construcción de un constructo vectorial retrovírico utilizando mutagénesis puntual específica. Incluido en este ejemplo, se prepara un constructo vectorial retrovírico MoMLV en el que la señal "\Psi" de empaquetamiento del retrovector finaliza en el par de bases 617 de SEC ID nº:1, eliminándose, por lo tanto, el comienzo ATG de gag. De este modo, no puede tener lugar ningún entrecruzamiento entre el constructo vectorial retrovírico y el casete de expresión gag/pol que se describe a continuación en el Ejemplo 3.

En resumen, pMLV-K (Miller, J. Virol 49:214-222, 1984, un clon infeccioso derivado de pMLV-1 Shinnick et al., Nature 293:543-548, 1981), se digiere con Eco571, aislándose un fragmento de 1,9 kb. (Eco671 lleva a cabo la fragmentación corriente arriba del 3' LTR, eliminando por tanto todos los segmentos codificantes env del constructo vectorial retrovírico). El fragmento se redondea entonces en su extremo con T4 polimerasa (New England Biolabs) y la totalidad de los cuatro desoxinucleótidos, y es clonado en el sitio EcoRV del fagémido pBluescript II KS+ (Stratagene, San Diego, California). Este procedimiento da lugar a dos constructos, denominados pKS2+Eco571-LTR(+) (Figura 1) y pKS2+Eco571-LTR(-) (Figura 2), que se rastrean mediante análisis de restricción. Cuando el fagémido monocatenario (+) se genera, se aísla la secuencia MoMLV con sentido.

Se crea entonces un nuevo sitio EcoRI en el constructo pKS2+Eco57l-LTR(+) para eliminar el codon ATG de iniciación de gag. En particular, se crea un sitio EcoRI utilizando el procedimiento de mutagénesis monocatenaria de Kunkle (PNAS 82:488,1985). pKS2 + Eco571-LTR(+) es un pBluescript^{TM} II+ fagémido (Strategene, San Diego, California), que contiene un fragmento Eco571 de pMLV-K. Incluye MoMLV LTR y la secuencia por debajo hasta el par de bases 1378. Cuando se genera el fagémido monocatenario, se aísla la secuencia con sentido de MoMLV. Se crea el oligonucleótido 5'-GGT AAC AGT CTG GCC CGA ATT CTC AGA CAA ATA CAG (SEC ID nº:2) y se utiliza para generar un sitio EcoRI en los pares de bases 617-622. Este constructo se denomina pKS2+LTR-EcoRI (Figura 3).

B. Sustitución de codones sin sentido en la Secuencia Extendida de Empaquetamiento (\Psi)+

Este ejemplo describe la modificación de la señal extendida de empaquetamiento (\Psi) mediante mutagénesis puntual específica. En particular, la modificación sustituirá a un codon de detención, TAA, en el sitio ATG de inicio normal de gag (posición 631-633 de SEC ID nº:1), y a un codon adicional TAG de detención en posición 637-639 de SEC ID nº:1.

Brevemente, un fragmento Eco571-EcoRI (que comprende los pares de bases 7770 a 1040 aproximadamente de MoMLV) de pN2 (Amentano et al., J. Virol. 81:1647-1650, 1987) es clonado en primer lugar en pBluescript ll KS + fagémido en los sitios SacII y EcoRI (compatibles). Utilizando el fago auxiliador M13K07 (Stratagene, San Diego, California) se genera el fagémido monocatenario que contiene la secuencia antisentido MoMLV. El oligonucleótido 5'-CTG TAT TTG TCT GAG AAT TAA GGC TAG ACT GTT ACC AC (SEC ID nº:3) es sintetizado, utilizándose según el procedimiento de Kunkle tal como se ha descrito anteriormente, para modificar la secuencia en el interior de la región \Psi para codificar los codones de detención en los nucleótidos 631-633 y 637-639.

C. Eliminación de la secuencia de empaquetamiento retrovírico corriente abajo del 3' LTR

La secuencia de empaquetamiento retrovírico que se encuentra corriente abajo del 3' LTR se suprime esencialmente tal como se describe a continuación. Brevemente, pKS2+Eco571-LTR(-) (Figura 2), es digerida con BalI y HincII y es relegada excluyendo el ADN BalI a HincII que contiene la región de empaquetamiento de MoMLV.

D. Construcción de estructuras vectoriales

Los constructos preparados en los apartados anteriores A y C, o alternativamente en B y C, se combinan con un vector plasmídico tal como se describe a continuación, para crear una estructura retrovírica que contiene en cis todos los elementos requeridos, y excluyendo todas las secuencias de 8 ácidos nucleicos o más contenidas en la parte retrovírica de los elementos de expresión gag-pol y env (véanse los Ejemplos 3 y 4).

1.

Las partes A y C se combinan de la forma siguiente: El producto de A se digiere con NheI y EcoRI, aislándose un fragmento de 1034 pares de bases que contiene el LTR y la región \Psi mínima. El fragmento se une al producto de la parte C en los únicos sitios de restricción (compatibles) SpeI y EcoRI. El constructo resultante se denomina pR1 (Figura 4).

2.

Las partes B y C se combinan de la forma siguiente: El producto de B se digiere con NheI y EcoRI, aislándose un fragmento de 1456 pares de bases que contiene el LTR y la región modificada \Psi+. El fragmento se une al producto de C en los únicos sitios de restricción (compatibles) SpeI y EcoRI. El constructo resultante se denomina pR2 (Figura 5).

Ejemplo 2 Inserción de un gen a de interés en PR1 y PR2

Este ejemplo describe la inserción de un gen de interés, gp120, gp41 y rev, junto con un marcador seleccionable, en pR1 o pR2. Brevemente, la secuencia codificante gp120, gp41 y rev se obtiene del constructo pKT1 (Figura 6; véase también Chada et al., J. Vir. 67:3409-3417, 1993); debe considerarse que se hace referencia a este vector como N2lllBenv. En particular, pKT1 es digerido en primer lugar en el sitio único AsulI (posición 5959). Los extremos se vuelven romos, y un engarce XhoI se une a este sitio. (New England Biolabs). El constructo se digiere entonces con XhoI, y se aísla un fragmento de 4314 pares de bases que contiene la envuelta del HIV (gp120 y gp41), rev, el promotor temprano de SV40 y los genes de resistencia g418.

Se digiere pR1 o pR2 en el sitio único de restricción EcoR1, se redondean los extremos, y se unen a ellos los engarces SalI (new England Biolabs). El fragmento KT1 de 4314 pares de bases se une entonces a pR1 o pR2 en los nuevos sitios SalI, determinándose la orientación correcta (véanse las Figuras 7 y 8). En ambos constructos, (pR1-HIV env y pR2-HIV env) los genes HIV se expresan a partir de MLV LTR, y los genes de resistencia G418 se expresan a partir del promotor SV40.

Ejemplo 3 Construcción de los casetes de expresión gag-pol A. Construcción de una estructura de casete de expresión, pHCMU-PA

Se crea primero un vector para formar la estructura para los casetes de expresión gag/pol y env. Brevemente, el fagémido pBluescript SK (Stratagene, San Diego, California; número de registro 52324 en GenBank, al que se hace referencia como "SK-") es digerido con SpeI y sus extremos son redondeados con Klenow. Un fragmento DraI de extremo redondeado de SV40 (Fiers et al.,"Complete nucleotide sequence of SV40 DNA", Nature 273:113-120, 1978) del DraI (2366 pares de bases) al DraI (2729 pares de bases) se inserta entonces en SK-, aislándose un constructo en el que la señal de poliadenilación tardía de SV40 se orienta de modo opuesto al gen LAcZ de SK-. Este constructo se denomina SK-SV40A.

Se aisló un promotor temprano inmediato principal del citomegalovirus humano ("HCMV-IE": Boshart et al., Cell 41: 521-530, 1985) (desde HincII, par de bases 140 pares de bases, a EagI, 814 pares de bases), después de la digestión con HincII y EagI, redondeándose en su extremo el sitio EagI. El fragmento de 674 redondeado en su extremo se unió a SK-SV40A. El constructo final, denominado pHCMV-PA, se aisló entonces (véase la Figura 1). Este constructo contiene el promotor HCMV orientado de modo opuesto al gen LacZ, y corriente arriba de la señal de poliadenilación tardía del SV40.

B. Creación de nuevos codones para el 5' Gag

Este ejemplo describe casetes de expresión gag/pol en los que faltan las secuencias no codificantes corriente arriba del comienzo gag, reduciendo por tanto la recombinación potencial entre el elemento de expresión gag/pol y la secuencia \Psi+ de un constructo vectorial retrovírico, e inhibiendo el co-empaquetamiento del elemento de expresión gag-pol junto con el retrovector, para construir dicho casete de expresión, sintetizándose 448 pares de bases del ADN con las características siguientes: 5' ATATATATATATC-GAT (sitio ClaI) ACCATG (codon de inicio, posición 621) (SEC ID nº:4), seguido por 410 pares de bases que codifican 136+ residuos aminoácidos utilizando codones alternativos (véanse Figuras 9 y 10), seguido por GGCGCC (sitio NarI) AAACCTAAAC 3' (SEC ID nº:5).

Brevemente, cada uno de los oligos 15 a 24 (que se exponen a continuación en la Tabla 1) se añaden a un tubo de reacción PCR, de forma que la concentración final para cada uno es de 1 \muM. Se añaden los oligos 25 y 26 al tubo de ensayo, de modo que la concentración final para cada uno sea de 3 \muM. Se añadieron al tubo de ensayo 1,2 \mul de un depósito de 2,5 mM de desoxinucleótido trifosfatos (dG, dA, dT dC), 5 \muL de tampón 10 X PCR (Perkin Elmer) y agua hasta un volumen final de 50 \muL. Se añadieron perlas de cera y se fundieron sobre una capa acuosa a 55ºC, enfriándose entonces hasta 22ºC. Se añadió una capa acuosa superior de la siguiente forma: 5 \muL de tampón 10XPCR, 7,5 \muL de dimetilsulfóxido, 1,5 \mul de Taq polimerasa (Perkin Elmer) y 36 \mul de agua. Se llevaron entonces a cabo cuatro ciclos de PCR, de la manera siguiente: 94ºC, 30 segundos; 56ºC, 30 segundos y 72ºC, 30 segundos. El producto PCR se conservó a -20ºC hasta el ensamblaje del casete de expresión gag/pol.

TABLA 1

\vskip1.000000\baselineskip

1

\vskip1.000000\baselineskip

C . Creación de un nuevo extremo 3' para pol

Para preparar un casete de expresión gag/pol que exprese gag/pol de longitud completa, se construye pCMPgag/pol. Brevemente, la secuencia MoMLV de Pst1 (567 pares de bases) a NheI (7847 pares debases) es clonada en los sitios Pst1-Xba1 de pUC 19 (New England Biolabs). El intermediario resultante se digiere con HindIII y XhoI, aislándose un fragmento de 1008 pares de bases que contiene la secuencia gag conductora. El mismo intermediario se digiere con XhoI y ScaI, aislándose un fragmento de 4312 pares de bases que contiene las restantes secuencias gag y pol. Los dos fragmentos aislados son entonces clonados en los sitios HindIII y SmaI de pHCMV-PA, anteriormente descritos. El constructo resultante, denominado CMV gag/pol (Figura 12) expresa los genes MoMLV gag y pol.

Para truncar el extremo 3' del gen pol encontrado en pCMV gag/pol, se aisló de pCMV gag/pol un fragmento SnaBI-XmaI de 5531 pares de bases, que contiene una parte del promotor CMV lE y la totalidad de gag-pol, excepto los 28 codones finales. Este fragmento es clonado en los sitios SnaBl y XmaI de pHCMV-PA. Este constructo expresa cinco nuevos aminoácidos en el extremo carboxilo (Ser-Lys-Asn-Tyr-Pro) (SEC ID nº:6) (pCMV gpSma).

Alternativamente, estos cinco aminoácidos pueden ser eliminados mediante digestión de pCMVgp SmaI con SmaI y añadiendo un engarce NheI (codones de finalización en tres fases) (5'-CTA GCT AGC TAG, SEC ID nº:14; New England Biolabs) en el extremo de la secuencia pol truncada. Este constructo se denomina pCMV gp Nhe. Ambos constructos eliminan un entrecruzamiento potencial entre los casetes de expresión gag/pol y env.

D. Casete de expresión Gag-Pol

Las partes B y C anteriores se combinan para proporcionar un vector de expresión que contiene un promotor CMV IE, la secuencia gag-pol que empieza a partir del nuevo sitio ClaI (seguido por ACC ATG y 412 pares de bases de una secuencia codificante gag alternativa u "oscilante") y que termina en el sitio SmaI (posición 5750 de MoMLV) seguido por una señal de poliadenilación del SV40, tal como se describe esencialmente en lo que sigue. Brevemente, el fragmento oscilante bicatenario de aproximadamente 451 pares de bases de la parte A se une al vector de clonación pCR^{TM} IITA (Invitrogen Corp.). El producto PCR oscilante contiene naturalmente un saliente 3'-A en cada extremo, permitiendo la clonación en el saliente 3'T de PCR^{TM}ll. El fragmento de oscilante ClaI-NarI de 422 pares de bases del clon pCR^{TM}ll es eliminado y ligado en los sitios ClaI (posición 679, Figura pCMV gp Sma) y Narl (posición 1585) de pCMVgp SmaI (parte B) (o pCMV gp Nhe). (El sitio Call en posición 5114 es metilado y no fragmentado con ClaI). El producto de esta unión se digiere con Narl y el fragmento MLV-K-Narl (posiciones 1035 a 1378) es insertado (SEC ID nº:1). Este constructo se denomina pCMVgp-X (Figura 14).

Ejemplo 4 Construcción de casetes de expresión ent A. Creación de un nuevo sitio de restricción 5' EagI

Comenzando con un subfragmento EagI-EcoRI de 626 pares de bases, a partir de una envuelta anfotrópica 4070A (Chattopodhyay et al., J. Vir. 39:777, 1981; registro de GenBank #MLV4070A, y #MLVENVC; SEC ID nº 12), que se clonó en un vector pBluescript II Ks+ (que contiene el codon de iniciación), se llevó a cabo la mutagénesis puntual dirigida corriente arriba del sitio de comienzo de la traducción para cambiar ACCATCCTCTGGACGGACATG ... (SEC ID nº 7; posiciones 20-40 de la secuencia #MLVENVC de Genbank) a ACCCGGCCGTGGACGGACATG ... (SEC ID nº:8) y crear un nuevo sitio EagI en posición 23. Esta modificación permite la clonación de la secuencia anfotrópica de la envuelta en un vector de expresión eliminando la secuencia 4070A corriente arriba, homóloga al elemento de expresión gag-pol tal como se describe en el Ejemplo 2A.

B. Creación de un nuevo extremo 3' para env

Se crea un nuevo extremo 3' del elemento de expresión de la envuelta finalizando la secuencia que codifica al péptido R corriente abajo del extremo de la región transmembranosa (p15E). Brevemente, el constructo pHCMV-PA, que se ha descrito anteriormente, se modifica en primer lugar mediante digestión con NotI (posición 1097), se vuelve romo y se relega para borrar el sitio EagI de solapamiento pBluescript en la misma posición. Se construyó entonces pCMV Envam-Eag-X-less mediante digestión del pHCMV-PA modificado con EagI (posición 671) y SmaI (posición 712) y uniendo dos fragmentos. El primero es un fragmento EagI-Ncol de 4070A (posiciones 1-1455) (SEC ID nº12). El segundo es un fragmento de la envuelta de MLV-K, NcoI-PvuII (posiciones 7227-7747) (SEC ID nº:12). El constructo resultante de la unión de las tres vías contiene el promotor HCMV seguido por la secuencia codificante SU (GP70) de la envuelta de 4070A, la secuencia codificante TM (p15e) de MoMLV, y la secuencia que codifica 8 residuos del péptido R. Además, este casete de expresión de la envuelta (pCMV Env am-Eag-X-less) (Figura 18) no comparte secuencia con las estructuras retrovectoriales de cruzamiento que se han descrito en el Ejemplo 1.

C. Elemento de expresión de la envuelta

Las partes A y B se combinan para completar un elemento de expresión anfotrópica que comprende el promotor CMV, 4070A SU, MoMLV TM y la señal de poliadenilación SV40 en un vector plasmídico Bluescript SK-. Este constructo se denomina pCMVenv-X (Figura 15). Brevemente, el constructo que se ha descrito en la parte A con un nuevo sitio de restricción EagI, es digerido con EagI y XhoI, aislándose un fragmento de 571 pares de bases. pCMV Envam-Eag-X-less (de la parte B) es digerido con KpmI y EagI, reservándose el fragmento de 695 pares de bases. pCMV Envam-Eag-X-less (de la parte B) es digerido con KpnI y XhoI y el fragmento de 4649 pares de bases se reserva. Estos dos fragmentos se unen conjuntamente con el EagI de 571 pares de bases al fragmento XhoI digerido a partir del constructo PCR de la parte A. pCMVenv-X no comparte secuencia con las estructuras retrovectoriales de cruzamiento ni con el elemento pCMVgp-X de expresión gag-pol.

Ejemplo 5 Ensayos funcionales para los casetes de expresión gag-pol y env

Se han desarrollado ensayos rápidos para asegurarse de que los casetes de expresión gag-pol y env son biológicamente activos. Los materiales para estos ensayos consisten en una progenie celular que se utiliza para la expresión transitoria (típicamente células 293, ATCC # CRL 1573), una progenie celular diana sensible a la infección (típicamente células HT 1080, ATCC # CCL 121) y pRgpNeo (Figura 16) o pLARNL (Emi et al., J.Virol 65:1202-1207, 1991). Los dos últimos plásmidos expresan retrovectores capaces de rescate que confieren resistencia G418 y expresan también gag-pol en el caso de RgpNeo, o env en el caso de pLARNL. Por conveniencia, la organización de RgpNeo (Figura 16) se muestra a continuación.

Para ensayar los casetes de expresión tales como pCMVgp-X con respecto a la funcionalidad de gag/pol, se co-transfectó el plásmido con pLARNL con una proporción 1:1 en las células 293. Después de 12 horas, se reemplazó el medio con medio de crecimiento normal. Después de otras 24 horas, se eliminó el sobrenadante de las células 293, se filtró a través de un filtro de 0,45 \mum, y se situó en las células diana HT 1080. Veinticuatro horas después de este tratamiento, se reemplazó el medio con medio de crecimiento que contenía 800 \mug/ml G418. Después de una semana, las colonias resistentes G418 se marcaron. La aparición positiva de colonias indica que todos los elementos son funcionales y activos en la co-transfección original. Por conveniencia, la organización de RgpNeo (Figura 16) se muestra a continuación: posición 1= extremo izquierdo de 5' LTR; Posiciones 1-6320=Secuencia MoMLV de 5' LTR al sitio de restricción Sca 1. Posiciones 6321-6675=promotor temprano de SV40. Posiciones 6676-8001= Gen de resistencia Neo desde Tn 5 (incluyendo el promotor procariótico); y Posiciones 8002-8606= origen de replicación pBR.

Ejemplo 6 Desarrollo de la progenie celular de empaquetamiento y de la progenie celular productora

Este ejemplo describe la producción de progenies celulares productoras y de empaquetamiento utilizando los constructos vectoriales retrovíricos anteriormente descritos, los casets de expresión gag/pol, y los casets de expresión env, que descartan la formación de virus competentes para la replicación.

Brevemente, para constructos vectoriales retrovíricos anfotrópicos basados en MoMLV, se selecciona una progenie celular parental a la que le faltan secuencias que son homólogas para los Virus de la Leucemia Murina, tal como la progenie celular canina D-17 (ATCC nº. CCL 183). Los casets de expresión gag/pol se introducen entonces en la célula mediante electroporación, junto con un plásmido marcador seleccionable tal como DHFR (Simonsen et al., PNAS 80:2495-2499, 1983). A continuación, se seleccionan colonias resistentes, que se extienden en placas con 6 pocillos hasta dar lugar a la confluencia, y se ensayan entonces con respecto a la expresión de gag/pol mediante transferencia Western. Los clones se rastrean asimismo con respecto a la producción de altos títulos de partículas vectoriales después de la transducción con pLARNL.

Los clones con títulos más altos son sometidos a continuación a electroporación con un casete de expresión env y un plásmido marcador seleccionable tal como la higromicina (véase Gritz y Davies, Gene 25:179-188, 1983). A continuación se seleccionan colonias resistentes, que se extienden en placas con 6 pocillos hasta dar lugar a la confluencia, y se ensayan entonces con respecto a la expresión de env mediante transferencia Western. Los clones se rastrean asimismo con respecto a la producción de altos títulos de partículas vectoriales después de la transducción con un constructo vectorial retrovírico.

Las progenies de empaquetamiento resultantes pueden guardarse en nitrógeno líquido a razón de 10 x 10^{6} células por vial, en DMEM conteniendo suero bovino fetal al 10% irradiado, y DMSO al 8%. Puede llevarse a cabo un ensayo ulterior para confirmar la esterilidad y la falta de producción de virus auxiliadores. Preferentemente, deberán llevarse a cabo, para confirmar la falta de producción de virus auxiliadores, tanto un ensayo S + L- como un ensayo de rescate de marcadores en las células Mus dunni.

Para construir una progenie celular productora, el constructo vectorial retrovírico tal como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1, se somete a electroporación en una progenie celular xenotrópica de empaquetamiento preparada utilizando los procedimientos anteriormente descritos. Después de un periodo comprendido entre 24 y 48 horas, se elimina el sobrenadante de la progenie celular xenotrópica de empaquetamiento, utilizándose para transducir una segunda progenie celular de empaquetamiento, creando de este modo la progenie celular productora
final.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 7 Cocultivo del ensayo de detección de virus auxiliadores, y rescate de marcadores

Este ejemplo describe un ensayo sensible para la detección de retrovirus competentes para la replicación ("RCR"). Brevemente, 5 x 10^{5} célulasproductoras de vectores, se cocultivaron con un número idéntico de células Mus dunni (Lander y Chattopadhyay, J. Virol 52:695,1984). Las células Mus dunni son preferidas particularmente para la detección de virus auxiliadores porque son sensibles a casi todos los virus relacionados con la leucemia murina, y no contienen virus endógenos conocidos. A los tres, seis, y nueve días después del cultivo inicial, las células son divididas 1 a 10 aproximadamente, añadiéndose 5 x 10^{5} células Mus dunni recién preparadas. Quince días después del co-cultivo inicial de las células Mus dunni con las células productoras de vectores, se eliminó de los cultivos el sobrenadante, y se filtró a través de un filtro de 0,45 \mum, sometiéndose a un ensayo de rescate de marcadores.

Brevemente, el líquido del cultivo se elimina de una progenie celular MdH de ensayo (células Mus dunni que contienen pLHL (un vector retrovírico marcador de resistencia a la higromicina, véase Palmer et al., PNAS 84(4).1055-1059, 1987) y que se reemplaza con el líquido de cultivo que va a ensayarse. Se añade polibreno a una concentración final de 4 \mug/ml. En el día 2, se elimina el medio y se reemplaza con 2 ml de DMEM recién preparado que contiene suero fetal de ternera al 10%. En el día 3, se elimina el líquido del sobrenadante, se filtra, y se transfiere a las células HT1080. Se añade polibreno a una concentración final de 4 \mug/ml. En el día 4, el medio en las células HT1080 es reemplazado con DMEM que contiene suero fetal de ternera al 10% y 100 \mug/ml de higromicina. Se continua la selección desde el día 5 hasta el 20, hasta que las colonias resistentes a la higromicina pueden marcarse, y todos los controles negativos (es decir, las células MdH de prueba infectadas) mueren.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 8 Ensayo para la secuencia de encapsidación del ARN "oscilante"

Este ejemplo describe un ensayo sensible para la detección de la encapsidación del ARN a partir de constructos que contienen la secuencia gag " oscilante" o normal. Brevemente, un fragmento de ADN de un casete de expresión gag/pol "oscilante" (Ejemplo 3), que contiene el promotor CMV y la secuencia gag para el sitio XhoI (posición 1561 de MoMLV), se une a un fragmento SV40 neo-3' LTR ADN de N2 (Armentano et al, supra) de KT-3 (véase WO 91/02805 o WO 92/05266). Este constructo se muestra diagramáticamente en la Figura 19A, y no se espera que se encapside en las progenies celulares de empaquetamiento tales como DA de HX (véase WO 92/05266), porque le falta un LTR 5' y un sitio de unión al cebador.

Se lleva asimismo a cabo un segundo constructo, similar al primero, excepto en que la secuencia "oscilante" es reemplazada por una secuencia gag normal. De modo similar al primer constructo, el ARN que se transcribe a partir de este ADN no se espera que se encapside. Este constructo se muestra diagramáticamente en la Figura 19B.

Los constructos anteriores son separadamente transfectados a una progenie celular de empaquetamiento. El cultivo se ensaya entonces con respecto a la capacidad para generar un retrovector transducible resistente a G418. Ningún constructo da lugar a un vector transducible.

Los cultivos celulares que contienen los constructos anteriores se transducen entonces con el retrovector LHL (véase Ejemplo 7). Los cultivos celulares, después de selección, generarán ahora retrovectores que confieran a las células diana resistencia a la higromicina. Además, si la encapsidación es permitida mediante la interacción entre LHL ARN y las transcripciones de los constructos anteriores, se puede producir una recombinación mediada por RT que tiene como consecuencia la transferencia de la resitencia G-418 a las células diana.

A partir de lo que antecede, se apreciará que, aunque en la presente memoria se han descrito formas de realización específicas de la invención con propósitos ilustrativos, para los expertos en la materia se evidenciarán varias modificaciones sin apartarse del alcance de la invención. De acuerdo con esto, la invención no está limitada, excepto por las reivindicaciones adjuntas.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: Respess, James

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Vectores retrovíricos de cruzamiento

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 26

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DIRECCIÓN/DESTINATARIO: Seed & Berry

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 6300 Columbia Center: 701 Fifth Avenue

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Seattle

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Washington

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: USA

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CP: 98104

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE SOPORTE: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: PC compatible IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release #1.0. Versión #1.25

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FECHA DE SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

DATOS DE ABOGADO/AGENTE DE INFORMACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: McMasters. David D.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 33.963

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

REFERENCIA/NÚMERO DE DOCUMENTO/ETIQUETA: 930049.424C1

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE CONTACTO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: (206)622-4900

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FAX: (206)682-6031

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8332 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:1

3

4

5

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTAACAGTC TGGCCCGAAT TCTCAGACAA ATACAG

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGTATTTGT CTGAGAATTA AGGCTAGACT GTTACCAC

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATATATATAT ATCGATACCA TG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 16 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCGCCAAAC CTAAAC

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:6

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Lys Asn Tyr Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACCATCCTCT GGACGGACAT G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACCCGGCCGT GGACGGACAT G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 449 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 20...439

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:9

\vskip1.000000\baselineskip

8

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 140 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:10

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 420 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1...420

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:11

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 140 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:12

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2001 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:13

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAGCTAGCT AG

\hfill

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 64 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:15

\vskip1.000000\baselineskip

100

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 51 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGATTATGG GCATTTCTTT CCACGTCCTT CCAATGGCCC AGTGTGAGGG A

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 72 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:17

\vskip1.000000\baselineskip

101

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 52 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGTTCCATC CCTAGGCCAG CCAACATTGA ATGTGGGCCA CTCGGCGCTA CA

\hfill

52

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 71 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:19

\vskip1.000000\baselineskip

102

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 52 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGACAATAT AAGGAACTTG ATCGGGATGG CCGTGGGGTC CGGGGCTGAA CA

\hfill

52

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 72 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:21

\vskip1.000000\baselineskip

103

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 52 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGGAGCGCTG GGTGGGAGGG GTGGAGGTGG TTTGGGATGC ACGAATGGTT TC

\hfill

52

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 72 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:23

\vskip1.000000\baselineskip

104

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 52 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTTAGGTTT GGCGCCGAGG CTGGGGGTCA GAGCAGGGTA CAAGCTGCTC CT

\hfill

52

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATATATATAT ATCGATACC

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº:26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTTAGGTTT GGCGCCGAGG

\hfill

20

Claims (18)

1. Constructo vectorial retrovírico que comprende un 5' LTR, un sitio de unión ARNt, una señal de empaquetamiento, una o más secuencias heterólogas, un origen de la síntesis de la segunda cadena de ADN y un 3' LTR, en el que dicho constructo vectorial contiene menos de 20 nucleótidos consecutivos que se encuentran en los genes gag/pol y env, en el que dicho vector carace de una extensa señal de empaquetamiento, y en el que dichas secuencias heterólogas son seleccionadas de entre el grupo constituido por un gen que codifica una proteína citotóxica, una secuencia antisentido, una secuencia que codifica una molécula inmune accesoria, una secuencia que codifica un producto génico en el que dicho producto génico es seleccionado de entre el grupo constituido por HSVTK y VZVTK, una secuencia que codifica una proteína terapéutica que puede prevenir, inhibir, estabilizar o invertir un efecto genético heredado o no heredado, y una secuencia que codifica una parte inmunogénica de un virus seleccionado de entre el grupo constituido por HBV, HCV, EBV, FeLV, FIV e HIV.

2. Constructo vectorial retrovírico según la reivindicación 1, en el que dicho constructo contiene menos de 20 nucleótidos consecutivos que se encuentran en el gen env corriente arriba de dicho 5' LTR.

3. Constructo vectorial retrovírico según la reivindicación 1, en el que dicho constructo carece de una secuencia señal de empaquetamiento retrovírico corriente abajo de dicho 3' LTR.

4. Constructo vectorial retrovírico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho vector retrovírico es construido a partir de un retrovirus seleccionado de entre el grupo constituido por virus anfotrópicos, ecotrópicos, xenotrópicos o politrópicos.

5. Constructo vectorial retrovírico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho vector retrovírico es construido a partir de un virus de la leucemia murina.

6. Constructo vectorial retrovírico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha secuencia heteróloga tiene por lo menos x kb de longitud, en el que x es seleccionada de entre el grupo constituido por 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8.

7. Constructo vectorial retrovírico según la reivindicación 1, en el que dicha proteína citotóxica es seleccionada de entre el grupo constituido por ricina, abrina, toxina diftérica, toxina colérica, gelonina, proteína antivírica de la hierba carmín, tritina, toxina, y exotoxina A de Pseudomonas.

8. Constructo vectorial retrovírico según la reivindicación 1, en el que dicha molécula inmune accesoria es seleccionada de entre el grupo constituido por IL-1, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, Il-10, IL-11 e IL-3.

9. Constructo vectorial retrovírico según la reivindicación 1, en el que dicha molécula inmune accesoria es seleccionada de entre el grupo constituido por IL-2, IL-12, IL-15 e interferón gamma.

10. Constructo vectorial retrovírico según la reivindicación 1, en el que dicha molécula inmune accesoria es seleccionada de entre el grupo constituido por ICAM-1, ICAM-2, \beta-microglobina, LFA3, moléculas HLA de tipo I y de tipo II.

11. Constructo vectorial retrovírico según la reivindicación 6, en el que dicha secuencia heteróloga es un ribozima.

12. Constructo vectorial retrovírico según la reivindicación 1, en el que dicha proteína terapéutica es seleccionada de entre el grupo constituido por Factor VIII, ADA, HPRT, CF y el receptor LDL.

13. Casete de expresión gag/pol, que comprende un promotor unido operativamente a un gen gag/pol y una secuencia de poliadenilación, en el que el extremo terminal 5' de dicho gen gag/pol se ha modificado para contener por lo menos 25 codones que están degenerados para gag.

14. Casete de expresión gag/pol según la reivindicación 13, en el que el extremo terminal 5' de dicho gen gag/pol contiene menos de 20 nucleótidos consecutivos que son idénticos a una secuencia encontrada en una señal de empaquetamiento retrovírico.

15. Casete de expresión gag/pol según la reivindicación 13 ó 14, en el que dicho promotor es un promotor heterólogo.

16. Casete de expresión gag/pol según la reivindicación 15, en el que dicho promotor es seleccionado de entre el grupo constituido por CMV lE, el promotor HSVTK, el promotor RSV, el promotor tardío principal del Adenovirus y el promotor de SV40.

17. Casete de expresión gag/pol según la reivindicación 13 ó 14, en el que dicha secuencia de poliadenilación es una secuencia heteróloga de poliadenilación.

18. Casete de expresión gag/pol según la reivindicación 17, en el que dicha secuencia heteróloga de poliadenilación es seleccionada de entre el grupo constituido por la señalpoly A tardía de SV40 y la señalpoly A temprana SV40.