ES2202432T3 - Factor de crecimiento endotelial vascular b. - Google Patents
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Abstract
SE DESCRIBEN POLIPEPTIDOS VEGF FACTORES DEL CRECIMIENTO QUE POSEEN LA PROPIEDAD DE ESTIMULAR LA MITOSIS Y LA PROLIFERACION DE CELULAS ENDOTELIALES VASCULARES, SECUENCIAS DE ADN QUE CODIFICAN PARA ESTOS POLIPEPTIDOS, COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE LOS CONTIENEN, Y ANTICUERPOS QUE REACCIONAN CON ELLOS. LOS POLIPEPTIDOS VEGF ES PARA ESTIMULAR LA ANGIOGENESIS ASI COMO EN APLICACIONES DE DIAGNOSTICO.
Description
Factor de crecimiento endotelial vascular B.
La angiogénesis, o proliferación de nuevos
capilares a partir de vasos sanguíneos preexistentes, es un
procedimiento fundamental necesario para el crecimiento y el
desarrollo normales de los tejidos. Es un prerrequisito para el
desarrollo y la diferenciación del árbol vascular, así como para
una amplia diversidad de procedimientos fisiológicos fundamentales
que incluyen la embriogénesis, el crecimiento somático, la
reparación y la regeneración de los tejidos y órganos, el
crecimiento cíclico del cuerpo lúteo y del endometrio, y el
desarrollo y la diferenciación del sistema nervioso. En el sistema
reproductor femenino, se produce angiogénesis en el folículo durante
su desarrollo, en el cuerpo lúteo después de la ovulación y en la
placenta para establecer y mantener la gestación. También se
produce angiogénesis como parte de los procedimientos de reparación
corporales, por ejemplo, en la curación de heridas y fracturas. La
angiogénesis es también un factor en el crecimiento tumoral, puesto
que un tumor debe estimular continuadamente el crecimiento de
nuevos vasos sanguíneos capilares para poder crecer.
Los vasos sanguíneos capilares consisten en
células endoteliales y en pericitos. Estos dos tipos celulares
llevan toda la información genética necesaria para formar
conductos, ramificaciones y redes capilares enteras. Hay moléculas
angiogénicas específicas que pueden iniciar este procedimiento. A la
vista de la importancia fisiológica de la angiogénesis, se han
dedicado muchos esfuerzos al aislamiento, caracterización y
purificación de factores que pueden estimular la angiogénesis.
Varios polipéptidos que estimulan la angiogénesis se han purificado
y caracterizado en cuanto a sus propiedades moleculares,
bioquímicas y biológicas. Para revisiones de tales reguladores de
la angiogénesis, véanse Klagsbrun y col., "Regulators of
Angiogenesis", Ann. Rev. Physiol.,
53:217-39 (1991); y Folkman y col.,
"Angiogenesis", J. Biol. Chem.,
267:10931-934 (1992). Resultados recientes han
implicado varias tirosina quinasas de receptores endoteliales (RTK)
en el establecimiento y el mantenimiento del sistema vascular.
Uno de esos factores de crecimiento, que es
altamente específico como mitógeno para las células endoteliales
vasculares, se denomina factor de crecimiento endotelial vascular
(VEGF). Véanse Ferrara y col., "The Vascular Endothelial Growth
Factor Family of Polypeptides", J. Cellular Biochem.,
47:211-218 (1991); Connolly, "Vascular
Permeability Factor: A Unique Regulator of Blood Vessel
Function", J. Cellular Biochem.,
47:219-223 (1991). El VEGF es una potente proteína
vasoactiva que ha sido detectada en medios acondicionados por
varias líneas celulares, incluidas células foliculares pituitarias
bovinas. El VEGF es un dímero catiónico glicosilado de
46-48 kD formado por dos subunidades de 24 kD. Se
inactiva por agentes reductores de sulfhidrilos, es resistente al
pH ácido y al calentamiento, y se une a la heparina inmovilizada. Al
VEGF se le denomina a veces factor de permeabilidad vascular (VPF)
porque aumenta la pérdida de fluidos desde los vasos sanguíneos
tras su inyección intradérmica. También se le ha designado con el
nombre de vasculotropina.
Se han detectado cuatro especies moleculares
distintas de VEGF. La especie de 165 aminoácidos tiene un peso
molecular de aproximadamente 46 kD y es la forma molecular
predominante que se encuentra en células y tejidos normales. También
se conocen una forma menos abundante, más corta, con una deleción
de 44 aminoácidos entre las posiciones 116 y 159 (VEGF_{121}), una
forma más larga con una inserción de 24 residuos altamente básicos
en la posición 116 (VEGF_{189}), y otra forma más larga con una
inserción de 41 aminoácidos (VEGF_{206}), que incluye la inserción
de 24 aminoácidos encontrada en el VEGF_{189}. El VEGF_{121} y
el VEGF_{165} son proteínas solubles. El VEGF_{189} y el
VEGF_{206} parecen estar mayoritariamente asociados a las células.
Todas las isoformas del VEGF son biológicamente activas. Por
ejemplo, cada una de las especies cuando se aplica por vía
intradérmica es capaz de inducir la extravasación de azul de
Evans.
Las distintas especies de VEGF están codificadas
por el mismo gen y se producen como consecuencia del ayuste
alternativo del ARN mensajero. Está conclusión está avalada por el
análisis por técnica de hibridación tipo Southern del ADN genómico
humano que muestra que el patrón de restricción es idéntico, que se
use una sonda para VEGF_{165} o que se use una que contiene la
inserción en VEGF_{206}. El análisis de clones genómicos en la
región del ayuste de ARNm putativo muestra también una estructura
intrón/exón coherente con un ayuste alternativo.
Las distintas isoformas del VEGF tienen
propiedades químicas distintas que pueden regular la liberación
celular, la compartimentalización, biodisponibilidad y puede que
modulen también las propiedades de señalización de los factores de
crecimiento.
El análisis de la secuencia nucleotídica del gen
del VEGF indica que el VEGF es un miembro de la familia del factor
de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF). El VEGF y el PlGF
son ligandos para dos RTK endoteliales, flt-1
(receptor 1 para el VEGF, VEGFR1) y flk-1/KDR
(receptor 2 para el VEGF, VEGFR2). La secuencia de aminoácidos del
VEGF exhibe aproximadamente 20% de homología respecto a las
secuencias de las cadenas A y B del PDGF, así como una conservación
total de los ocho residuos de cisteína que se encuentran en ambas
cadenas del PDGF maduro. El VEGF_{165}, el VEGF_{189} y el
VEGF_{206} contienen también ocho residuos de cisteína adicionales
dentro de la región carboxi terminal. La secuencia amino terminal
del VEGF está precedida de 26 aminoácidos que corresponden a una
secuencia señal típica. La proteína madura se genera directamente
después de la escisión de la secuencia señal sin ninguna
prosecuencia intermedia. La existencia de un sitio de glicosilación
potencial en Asn^{74} concuerda con otras pruebas de que la VEGF
es una glicoproteína, pero se ha informado de que el polipéptido
existe tanto como especie glicosilada como desglicosilada.
Como otras citoquinas, el VEGF puede tener
efectos varios que dependen del contexto biológico específico en el
que se encuentra. El VEGF y sus receptores de alta afinidad
flt-1 y KDR/flk-1 son necesarios
para la formación y el mantenimiento del sistema vascular así como
para la angiogénesis tanto fisiológica como patológica. El VEGF es
un potente mitógeno de las células endoteliales y contribuye
directamente a la inducción de la angiogénesis in vivo al
estimular el crecimiento de las células endoteliales durante el
desarrollo embrionario normal, la curación de las heridas, y la
regeneración y reorganización de los tejidos. El VEGF está implicado
también en procedimientos patológicos tales como el crecimiento y la
metástasis de tumores sólidos y de trastornos retinianos inducidos
por isquemia. Una propiedad muy llamativa del VEGF es su
especificidad. Es mitógeno in vitro a 1 ng/ml para las
células endoteliales de los capilares y de la vena umbilical
humana, pero no para las células de la corteza adrenal, las células
epiteliales de la córnea o del cristalino, las células de músculo
liso vasculares, las células endoteliales de la córnea, las células
de la granulosa, los queratinocitos, los fibroblastos
BHK-21, las células 3T3, los fibroblastos
embrionarios de rata, los fibroblastos de la placenta humana y las
células de sarcoma humano. La especificidad para células diana del
VEGF se encuentra por tanto restringida a las células endoteliales
vasculares. El VEGF puede desencadenar la secuencia completa de
acontecimientos que llevan a la angiogénesis y estimula la
angiogénesis in vivo en la córnea y en un modelo de injerto
óseo en curación. Es capaz de estimular la proliferación de células
endoteliales aisladas a partir de vasos tanto pequeños como
grandes. La expresión de ARNm del VEGF está temporalmente y
espacialmente relacionada con la proliferación fisiológica de vasos
sanguíneos capilares en el cuerpo lúteo del ovario o en el cerebro
en desarrollo. La expresión del VEGF se desencadena por la hipoxia
de modo que la proliferación de células endoteliales y la
angiogénesis parecen estar particularmente estimuladas en regiones
isquémicas. La VEGF es también un potente quimioatrayente para los
monocitos. Además, el VEGF induce el activador del plasminógeno y
el inhibidor del activador del plasminógeno en las células
endoteliales.
Las células tumorales liberan moléculas
angiogénicas tales como el VEGF, y se ha mostrado que anticuerpos
monoclonales contra el VEGF inhiben el crecimiento de ciertos tipos
de tumores tales como el rabdomiosarcoma. Véase Kim y col.,
"Inhibition of Vascular Endothelial Growth
Factor-Induced Angiogenesis Suppresses Tumor Growth
in vivo", Nature, 362:841-844
(1993). Esto sugiere que el bloqueo de la acción del VEGF es de
potencial importancia terapéutica para el tratamiento de tumores en
general, y de tumores agresivos, altamente vascularizados, en
particular.
Es un objeto de la invención proporcionar un
nuevo factor de crecimiento que tiene la propiedad de estimular la
proliferación de las células endoteliales.
Otro objeto de la invención es proporcionar
secuencias de ADN aisladas que codifican un nuevo factor de
crecimiento que estimula la proliferación de las células
endoteliales.
Es también un objeto de la invención proporcionar
nuevos productos que pueden ser útiles en aplicaciones diagnósticas
y/o terapéuticas.
Estos y otros objetos se alcanzan de acuerdo con
la presente invención al proporcionar un ADN aislado que codifica
una proteína que exhibe la siguiente secuencia de aminoácidos
característica (SEC ID Nº:16):
Pro-Xaa-Cys-Val-Xaa-Xaa-Xaa-Arg-Cys-Xaa-Gly-Cys-Cys
y que tiene la propiedad de estimular la
proliferación de las células endoteliales o células mesodérmicas,
escogiéndose el ADN a partir del grupo que consiste en el ADN de
las figuras 1 y 2 (SEC ID Nº:1), el ADN de la figura 3 (SEC ID
Nº:4), el ADN de la figura 5 (SEC ID Nº:6), el ADN de la figura 7
(SEC ID Nº:8), el ADN de la figura 10 (SEC ID Nº:10), el ADN de la
figura 12 (SEC ID Nº:12), el ADN de la figura 14 (SEC ID Nº:14), y
ADN que hibridan en condiciones restrictivas con por lo menos una
de las secuencias de ADN
anteriores.
De acuerdo con otros aspectos de la invención,
los objetos se consiguen también al proporcionar una proteína que
exhiba la siguiente secuencia de aminoácidos característica
Pro-Xaa-Cys-Val-Xaa-Xaa-Xaa-Arg-Cys-Xaa-Gly-Cys-Cys
(SEC ID Nº:16) y que tiene la propiedad de
estimular la proliferación de las células endoteliales o células
mesodérmicas, proteína que comprende una secuencia de aminoácidos
que corresponde sustancialmente a una secuencia de aminoácidos
escogida a partir del grupo que está formado por la secuencia de
aminoácidos de la figura 1 (SEC ID Nº:2), la secuencia de
aminoácidos de la figura 2 (SEC ID Nº:3), la secuencia de
aminoácidos de la figura 4 (SEC ID Nº:5), la secuencia de
aminoácidos de la figura 6 (SEC ID Nº:7), la secuencia de
aminoácidos de la figura 8 (SEC ID Nº:9), la secuencia de
aminoácidos de la figura 11 (SEC ID Nº:11), la secuencia de
aminoácidos de la figura 13 (SEC ID Nº:13), y la secuencia de
aminoácidos de la figura 15(SEC ID Nº:15).
En aspectos adicionales de la invención, los
objetos se alcanzan al proporcionar preparaciones farmacéuticas que
comprenden tales proteínas; y al proporcionar anticuerpos que
reaccionan con o reconocen a tales proteínas.
El novedoso factor de crecimiento de la presente
invención, denominado en lo sucesivo factor de crecimiento
endotelial vascular B o VEGF-B, tiene estrechas
similitudes estructurales con el VEGF y el factor de crecimiento de
la placenta (PlGF). Todas las formas del VEGF-B
contienen la secuencia de aminoácidos característica
Pro-Xaa-Cys-Val-Xaa-Xaa-Xaa-Arg-Cys-Xaa-Gly-Cys-Cys
(SEC ID Nº:16) (en la que Xaa representa un
residuo variable), que es una marca de identificación de la familia
PDGF/VEGF de factores de crecimiento. Esta secuencia de aminoácidos
característica se puede encontrar en los aminoácidos 70 a 82 en las
figuras 4, 6, 8, 11, 13 y 15.
Las aplicaciones clínicas de la invención
incluyen aplicaciones diagnósticas, aceleración de la angiogénesis
en la curación de heridas, e inhibición de la angiogénesis. La
cuantificación del VEGF-B en muestras de biopsias de
cánceres puede ser útil como indicador del futuro riesgo de
metástasis. La aplicación tópica de preparaciones de
VEGF-B a heridas crónicas puede acelerar la
angiogénesis y la curación de las heridas. El
VEGF-B se puede usar de una manera análoga al
VEGF.
De acuerdo con otros aspectos aún de la
invención, los objetos se alcanzan al proporcionar procedimientos
de diagnóstico/pronóstico típicamente en forma de kits de pruebas.
Por ejemplo, en una realización de la invención se proporciona un
kit de pruebas de diagnóstico/pronóstico que comprende anticuerpos
contra el nuevo factor de crecimiento de la invención y medios para
detectar, y más preferiblemente valorar, la unión entre los
anticuerpos y el nuevo factor de crecimiento de la invención. En una
realización preferida del procedimiento de diagnóstico/pronóstico
según la invención, bien el anticuerpo o bien el nuevo factor de
crecimiento está marcado, y bien el anticuerpo o bien el factor de
crecimiento está unido a un sustrato, de modo que la interacción
factor de crecimiento-anticuerpo se puede comprobar
mediante la determinación de la cantidad de marcador unido al
sustrato después de la unión entre el anticuerpo y el factor de
crecimiento. En una realización particularmente preferida de la
invención, el procedimiento de diagnóstico/pronóstico se puede
proporcionar como un kit de ELISA convencional.
En otra realización alternativa, el procedimiento
de diagnóstico/pronóstico puede comprender procedimientos de PCR
para establecer la estructura de la secuencia genómica del gen del
VEGF-B de un sujeto de prueba y comparar esta
estructura de secuencia con la que se describe en esta solicitud
para detectar cualquier anormalidad, con vistas a determinar si una
aberración cualquiera en la expresión del VEGF-B
está relacionada con un estado de enfermedad determinado.
Otro aspecto más de la invención concierne a un
anticuerpo que reconoce el VEGF-B y que está
adecuadamente marcado.
Otro aspecto de la invención trata del suministro
de una composición farmacéutica que comprende bien la proteína
VEGF-B o anticuerpos contra la misma. Las
composiciones que comprenden a la proteína VEGF-B
pueden además comprender opcionalmente bien el VEGF o bien la
heparina o ambos.
Según un aspecto más de la invención, se
proporciona la fabricación de un medicamento que comprende la
proteína VEGF-B y heparina para tratar estados
caracterizados por la carencia de, o la reducción en,
angiogénesis.
En otro aspecto, la invención trata de un dímero
proteico que comprende a la proteína VEGF-B, en
particular un dímero unido por disulfuros. Los dímeros proteicos de
la invención incluyen tanto a homodímeros de la proteína
VEGF-B como a heterodímeros de
VEGF-B y VEGF.
Según otro aspecto más de la invención, se
proporciona un procedimiento para facilitar la liberación de VEGF
y/o VEGF-B a partir de una célula que comprende la
exposición de una célula que expresa uno o ambos de los factores de
crecimiento a la heparina.
Otro aspecto de la invención implica proporcionar
un vector que comprende una secuencia nucleotídica antisentido que
es complementaria de por lo menos una parte de las secuencias de
ADN que se describen en la presente invención que codifican el
nuevo factor de crecimiento de la invención que estimula la
proliferación de las células endoteliales. Según otro aspecto más
de la invención se puede usar un vector semejante que comprende una
secuencia antisentido para inhibir, o como mínimo atenuar, la
expresión del VEGF-B. El uso de un vector de este
tipo para inhibir la expresión de VEGF-B está
favorecido en los casos en los que la expresión de
VEGF-B está asociada con una enfermedad tal como en
los casos en los que tumores producen VEGF-B para
asegurar la angiogénesis. La transformación de tales células
tumorales con un vector que contiene una secuencia nucleotídica
antisentido eliminaría o retrasaría la angiogénesis y así inhibiría
o retrasaría el crecimiento del tumor.
\newpage
La figura 1 presenta la secuencia nucleotídica
del clon del ADNc (parcial) de VEGF-B (SE ID Nº:1)
y la secuencia de aminoácidos del segmento de proteína (SEC ID Nº:2)
codificado por el primer marco abierto de lectura del ADNc;
La figura 2 repite la secuencia nucleotídica del
clon del ADNc (parcial) de VEGF-B (SE ID Nº:1) y la
secuencia de aminoácidos del segmento de proteína (SEC ID Nº:3)
codificado por el segundo marco abierto de lectura del ADNc;
La figura 3 presenta la secuencia nucleotídica de
la región codificante del clon de ADNc de tamaño completo del
VEGF-B_{167} de ratón (SEC ID Nº:4);
La figura 4 presenta la secuencia de aminoácidos
del VEGF-B_{167} de ratón (SEC ID Nº:5);
La figura 5 presenta la secuencia nucleotídica de
la región codificante de un clon de ADNc de
VEGF-B_{174} (SEC ID Nº:6);
La figura 6 presenta la secuencia de aminoácidos
de VEGF-B_{174} (SEC ID Nº:7);
La figura 7 presenta la secuencia nucleotídica de
un clon de ADNc de VEGF-B_{112} (SEC ID
Nº:8);
La figura 8 presenta la secuencia de aminoácidos
de VEGF-B_{112} (SEC ID Nº:9);
La figura 9 presenta una comparación de las
secuencias de aminoácidos de mVEGF-B_{167},
mVEGF_{164}, hPlGF, mPDGF A, y mPDGF B;
La figura 10 presenta la secuencia nucleotídica
de un clon del VEGF-B_{167} humano (SEC ID
Nº:10);
La figura 11 presenta la secuencia de aminoácidos
del VEGF-B_{167} humano (SEC ID Nº:11);
La figura 12 presenta la secuencia nucleotídica
del VEGF-B_{186} de ratón (SEC ID Nº:12);
La figura 13 presenta la secuencia de aminoácidos
del VEGF-B_{186} de ratón (SEC ID Nº:13);
La figura 14 presenta la secuencia nucleotídica
del VEGF-B_{186} humano (SEC ID Nº:14);
La figura 15 presenta la secuencia de aminoácidos
del VEGF-B_{186} humano (SEC ID Nº:15);
La figura 16 presenta una comparación de las
secuencias de aminoácidos de las isoformas de
VEGF-B_{167} y VEGF-B_{186}
humano y de ratón (SEC ID Nº: 5, 11, 13 y 15).
La figura 17 presenta la estructura esquemática
de los genes de VEGF-B humano y de ratón;
La figura 18 presenta un análisis de la
hidrofilicidad de las isoformas de VEGF-B_{167} y
VEGF-B_{186} de ratón;
La figura 19 presenta un análisis filogenético de
la familia VEGF/PDGF de factores de crecimiento;
La figura 20 es una diagrama que presenta la
inducción de la incorporación de [3H]timidina por el
VEGF-B, VEGF y bFGF en células endoteliales de la
vena umbilical humana (HUVEC) y células endoteliales de los
capilares bovinos (BCE);
La figura 21 es un análisis por la técnica de
hibridación de Northern de la expresión de transcritos de
VEGF-B_{186} en varios tejidos humanos y de
ratón;
La figura 22 presenta los resultados de la
inmunoprecipitación y del análisis por SDS-PAGE de
medios de cultivos celulares y de productos de lisis celular
solubilizados mediante detergentes de células Cos-1
sometidas a transfección transitoria con un ADNc de
VEGF-B de ratón;
La figura 23A presenta los resultados de la
inmunoprecipitación y del análisis por SDS-PAGE de
medios de cultivos celulares de células Cos-1
sometidas a transfección que expresan por separado el
VEGF-B_{186} de ratón y el VEGF_{165}
humano;
La figura 23B presenta los resultados de la
inmunoprecipitación y del análisis por SDS-PAGE de
medios de cultivos celulares (M) y de productos de lisis celular
solubilizados mediante detergente (L) de células
Cos-1 que coexpresan el
VEGF-B_{186} de ratón y el VEGF_{165}
humano;
La figura 23C presenta los resultados de la
inmunoprecipitación y del análisis por SDS-PAGE de
medios de cultivos celulares de células Cos-1 que
expresan el VEGF-B_{186} de ratón y el VEGF
humano, bien por separado o bien en combinación, y de células
control sometidas a un simulacro de transfección;
La figura 24 es una ilustración esquemática de la
derivación de clones indicadores con el promotor de
VEGF-B; y
La figura 25 presenta la secuencia nucleotídica
de un fragmento promotor de 1,55 kb del VEGF-B
humano (SEC ID Nº:17).
La presente invención está, por lo tanto,
orientada hacia nuevos factores de crecimiento endotelial vascular,
denominados en lo sucesivo factores de crecimiento
VEGF-B, que comparten las propiedades angiogénicas y
otras del VEGF, pero que se distribuyen y se expresan distintamente
del VEGF en los tejidos.
Los factores de crecimiento
VEGF-B son miembros de la familia de los factores
de crecimiento derivados de las plaquetas y son factores de
crecimiento que estimulan la mitosis y la proliferación de las
células endoteliales vasculares y/o células mesodérmicas. Se
producen mediante la expresión de secuencias de ADN que corresponden
a, o que se pueden hibridar en condiciones restrictivas con, una
cualquiera de las secuencias de ADN representadas en las figuras 1
y 2 (SEC ID Nº:1), la figura 3 (SEC ID Nº:4), la figura 5 (SEC ID
Nº:6), la figura 7 (SEC ID Nº:8), la figura 10 (SEC ID Nº:10), la
figura 12 (SEC ID Nº:12) o la figura 14 (SEC ID Nº:14). Se pretende
incluir dentro del alcance de la invención todas las proteínas
angiogénicas codificadas por secuencias de ADN que hibridan en
condiciones restrictivas con una cualquiera de las secuencias de
ADN anteriores. Las condiciones de hibridación adecuadas incluyen,
por ejemplo, formamida al 50%, tampón SSPE 5 x, solución de
Denhardt 5 x, SDS al 0,5% y 100 \mug/ml de ADN de esperma de
salmón a 42ºC durante la noche, seguido del lavado 2 x 30 minutos
en SSC 2 x a 55ºC.
La invención está orientada también hacia un ADN
aislado y/o purificado que corresponde a, o que hibrida en
condiciones restrictivas con, una cualquiera de las secuencias de
ADN anteriores.
En un aspecto más, la invención está orientada
hacia anticuerpos contra los factores de crecimiento
VEGF-B, y en particular hacia anticuerpos
monoclonales.
Se cree que las proteínas VEGF-B
interactúan con los receptores de factores de crecimiento proteína
tirosina quinasa. Los detalles de receptores de este tipo son
conocidos en la técnica [Véase, por ejemplo, Wilks, A. F.,
"Protein Tyrosine Kinase Growth Factor Receptors and Their
Ligands in Development, Differentiation, and Cancer," Adv.
Cancer Res., 60:43-73 (1993)].
Se probaron distintos tejidos de ratón adulto
para la expresión de transcritos que corresponden al
VEGF-B por técnica de hibridación de Northern. El
tamaño del ARNm fue de 1,3-1,4 kb. Se sondeó una
transferencia de Northern de múltiples tejidos de ratón (MTN,
Clontech) con el fragmento SalI/NotI de \approx 0,9 kb procedente
de los vectores de expresión en levadura pPC67 descritos arriba.
Se marcó la sonda con ^{32}P-dCTP mediante el
uso de cebado aleatorio (actividad específica
10^{8}-10^{9} cpm/\mug de ADN). Se hibridó la
transferencia durante la noche a 42ºC mediante el uso de formamida
al 50%, tampón SSPE 5 x, solución de Denhardt 5 x, SDS al 2% y 100
\mug/ml de ADN de esperma de salmón y 1x10^{6} cpm de la sonda
marcada/ml. Se lavó la transferencia a temperatura ambiente durante
2 x 30 min en SSC 2 x que contenía SDS al 0,05% y luego durante 2 x
20 min a 52ºC en SSC 0,1 x que contenía SDS al 0,1%. A continuación,
se expuso la transferencia a -70ºC durante tres días mediante el
uso de pantallas intensificadoras. Se usó película Kodak XAR. Los
niveles de expresión relativos determinados por inspecciones
visuales de la película se enumeran en la tabla siguiente:
| Tejido | Nivel de expresión relativo |
| Corazón | +++++ |
| Cerebro | +++ |
| Bazo | (+) |
| Pulmón | ++ |
| Hígado | + |
| Músculo esquelético | ++++ |
| Tejido | Nivel de expresión relativo |
| Riñón | +++ |
| Testículo | (+) |
| +++++ = expresión muy fuerte; ++ = expresión algo débil; ++++ = expresión fuerte; + = expresión débil; | |
| +++ = expresión moderada; (+) expresión muy débil. |
Se sondeó una transferencia de Northern de
múltiples tejidos humanos (MNT) de Clontech mediante el uso del
ADNc parcial de ratón para determinar los niveles de expresión
relativos de VEGF-B en distintos tejidos humanos. El
tamaño del transcrito fue de 1,3-1,4 kb. Las
condiciones fueron idénticas a las usadas para la transferencia de
Northern para el ratón descrita arriba. Los niveles de transcripción
relativos de VEGF-B para la transferencia de
Northern para el humano se enumeran en la tabla 2 siguiente. A
efectos de comparación, la tabla 2 enumera también los datos de
niveles de expresión relativa de la bibliografía para el VEGF en
diversos sistemas de mamíferos.
| Tejidos | Niveles de expresión relativa | |||
| VEGF-B | VEGF | |||
| (transferencia de Northern) | (de la bibliografía) | |||
| humano | humano | ratón | cobaya | |
| corazón | +++++ | ++ | +++ | +++ |
| cerebro | + | + | + | |
| placenta | + | |||
| pulmón | + | ++++ | ++ | |
| hígado | (+) | ++ | (+) | + |
| músculo esquelético | ++++ | +++ | + | |
| riñón | + | ++ | + | ++ |
| páncreas | +++ | |||
| bazo | ++ | - | + | |
| timo | + | - | ||
| próstata | +++ | |||
| testículo | ++ | + | ||
| ovario | +++ | - | ||
| intestino delgado | ++ | |||
| colon | +++ | |||
| leucocitos de la | + | |||
| sangre periférica |
Por comparación de la tabla 1 y la tabla 2 se
puede ver que los niveles de expresión de los transcritos de
VEGF-B en tejido humano y de ratón son relativamente
similares encontrándose los niveles de expresión más elevados en el
corazón y el músculo esquelético. Se pueden ver diferencias
significativas en el tejido cerebral y nefrítico. También hay que
observar que los tejidos que contienen una gran proporción de
células tanto musculares como epiteliales, tales como la próstata,
el páncreas y el colon donde tienen su origen algunos de los
tumores humanos más comunes, expresan niveles relativamente elevados
de VEGF-B.
Una comparación de los niveles de expresión
relativos de VEGF y VEGF-B en tejidos humanos
muestra algunas diferencias llamativas. El VEGF se expresa algo
débilmente por el tejido cardíaco humano, pero el
VEGF-B se expresa muy fuertemente por el mismo
tejido. Por otra parte, el VEGF se expresa fuertemente por el tejido
pulmonar humano, pero el VEGF-B se expresa sólo
débilmente por el tejido pulmonar humano. En una línea similar, el
tejido hepático humano expresa el VEGF a un nivel moderado, pero el
VEGF-B se expresa sólo muy débilmente. Estos datos
demuestran que a pesar de sus similitudes generales, los efectos
del VEGF y del VEGF-B no son totalmente
idénticos.
La expresión de los transcritos de
VEGF-B se analizó más allá en tejidos humanos y de
ratón por técnica de hibridación de Northern y se comparó con la
expresión de los transcritos de VEGF. Se hibridaron transferencias
(Clontech) de Northern (MTN) de múltiples tejidos humanos y de
ratón con una sonda de VEGF-B de ratón marcada con
^{32}P (inserto SalI/NotI de \approx 0,9 kb del clon
pcif-2). Se analizó la expresión de VEGF con el
ADNc de VEGF_{165} marcado con ^{32}P como sonda. Las
hibridaciones se llevaron a cabo a 42ºC en formamida desionizada
al 50%, SSC 5 x pH 7,0, SDS al 1%, solución de Denhardt 5 x y 100
\mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Los filtros
se lavaron 2 x 30 min a 52ºC en SSC 2 x que contenía SDS al 0,5% y
se expusieron a una película Kodak XAR durante 2-5
días a -70ºC mediante el uso de pantallas intensificadoras. Los
análisis de hibridación in situ de los tejidos de ratón
adulto de ratones CBA y de embriones procedentes del apareamiento de
ratones CBA y NMRI se llevaron a cabo básicamente como lo han
descrito con anterioridad Korhonen y col., Blood, 80,
2548-55 (1992). Las sondas de ARN (una sonda
antisentido de 383 pb y una sonda sentido de 169 pb) se generaron a
partir de un plásmido linearizado que contenía un fragmento Sal
I/Sac I de 440 pb procedente del clon de ADNc
pcif-2. Se sintetizó ARN marcado radiactivamente
mediante el uso de las ARN polimerasas T7 y SP6 y
[^{35}S]UTP (Amersham Inc.). Se omitió la hidrólisis
alcalina de las sondas. Se usó la hematoxilina para la
contratinción. Las hibridaciones control con hebras sentido y
secciones tratadas con ARNasa A no dieron señales superiores a los
antecedentes.
En los tejidos de ratón la expresión más
abundante del transcrito de VEGF-B de 1,4 kb se
detectó en el corazón, el cerebro, el músculo esquelético y el
riñón. El transcrito principal de VEGF de 3,7 kb se expresó en el
corazón, el cerebro, el pulmón, el músculo esquelético y el riñón.
En los tejidos humanos, la expresión más abundante del transcrito
de VEGF-B de 1,4 kb y de los transcritos principales
de VEGF de 3,7 kb y 4,5 kb se detectó en el corazón, el músculo
esquelético, el páncreas y la próstata. Por lo tanto, aunque
existen claras diferencias cuantitativas, parece que el
VEGF-B y el VEGF se coexpresan en muchos tejidos
humanos y de ratón.
La expresión de los transcritos de
VEGF-B se examinó más allá por hibridación in
situ en secciones de músculo esquelético y de corazón de ratón
adulto y del embrión precoz (E 10) de ratón. En el corazón adulto,
los transcritos de VEGF-B se expresan destacadamente
en el miocardio, mientras que no se detecta señal específica en el
músculo liso arterial. En el músculo estriado adulto, los
transcritos de VEGF-B se expresan por algunas de
las fibras musculares mientras que otras parecen carecer del
transcrito. En el embrión de ratón E 10, los transcritos de
VEGF-B se detectan principalmente en el corazón en
desarrollo. El miocardio del corazón de ratón adulto tiene una señal
destacada. En el músculo estriado, la expresión de
VEGF-B se observa en subpoblaciones de fibras
musculares. Se obtuvieron igualmente fuertes señales en el corazón
en desarrollo del embrión de ratón E 10. Las demás estructuras
embrionarias expresaron niveles pequeños o no detectables de
transcritos para VEGF-B. En su conjunto, estas
pruebas indican que los transcritos de VEGF-B se
expresan principalmente en los tejidos musculares. El
VEGF-B es particularmente abundante en el músculo
cardíaco y esquelético y se coexpresa con el VEGF en estos y otros
tejidos. En las células sometidas a transfección, el
VEGF-B forma homodímeros unidos por disulfuros y
heterodímeros con el VEGF cuando se coexpresa, asociados a la
superficie celular. Se presenta un análisis por la técnica de
hibridación de Northern de la expresión de los transcritos de
VEGF-B_{186} en varios tejidos humanos y de ratón
mediante el uso de una sonda específica para la isoforma
VEGF-B_{186} en la figura 21.
La localización cromosómica del gen
VEGF-B se valoró por técnica de hibridación de tipo
Southern y análisis por la reacción en cadena de la polimerasa de
híbridos de células somáticas e hibridación in situ
fluorescente (FISH) de cromosomas metafásicos. Se encontró el gen
VEGF-B en el cromosoma 11q13, a proximidad del gen
de la ciclina D1. Es interesante el hecho de que aunque el gen de
la ciclina D1 se amplifique en varios carcinomas humanos, el gen
VEGF-B no se amplificó en varias líneas celulares de
carcinoma mamario que contenían ciclina D1 amplificada. Sin embargo,
puede que mutaciones en el gen VEGF-B estén
relacionadas con malformaciones vasculares y/o enfermedades
cardiovasculares.
A menos que se indique lo contrario, los
siguientes ejemplos usaron técnicas y procedimientos corrientes de
biología molecular como se describen en Ausubel y col., (eds.)
Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &
Sons, Nueva York (1992).
Se identificó un clon de ADNc parcial que
codifica el VEGF-B de ratón de la manera siguiente:
se cribó una biblioteca de ADNc (E 14,5) procedente de ARNm poli A+
que se aisló de embriones de ratón de 14,5 días de edad [Chevray P.
y Nathans D., "Protein interaction cloning in yeast:
Identification of mammalian proteins that react with the leucine
zipper of Jun", Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
89:5789-93 (1992)] para proteínas celulares que
potencialmente podrían interactuar con la proteína de unión al ácido
retinoico celular de tipo 1 (CRABP-I) mediante el
uso de una técnica de cribado con trampa de interacción por doble
híbrido de levaduras como la describen Gyuris J., Golemis E.,
Chertkov H. y Brent R., "Cdil, a Human G1 and S Phase Protein
Phosphatase That Associates with Cdk2", Cell,
75:791-803 (1993). Esta técnica de cribado implica
una proteína de fusión que contiene un dominio de unión y de la que
se sabe que es transcripcionalmente inerte (el "cebo"); genes
indicadores que no tienen transcripción basal y a los que se une el
cebo; y una biblioteca de expresión que codifica proteínas que se
expresan como quimeras y cuyos extremos amino terminales contienen
un dominio de activación y otros restos útiles (la "presa").
La biblioteca que se cribó fue una biblioteca plasmídica de un
embrión de ratón de 14,5 días en el vector de expresión en
levaduras pPC67 que se consiguió del Dr. Pierre Chevray de la Johns
Hopkins University, School of Medicine, 725 North Wolfe St.,
Baltimore, MD 21205. Se recuperó un clon de ADNc positivo
(pcif-2) del cribado. Se secuenció el clon positivo
mediante el uso de técnicas convencionales, bien conocidas y se
encontró que codificaba una proteína altamente homóloga al VEGF y
los demás miembros de la familia PDGF de factores de crecimiento.
El inserto SalI/NotI
de \approx 0,9 kb en el plásmido pPC67 se clonó en pBluescript y se secuenció enteramente mediante el uso de cebadores de vector T7 y T3 junto con cebadores internos. El plásmido pBluescript se puede conseguir en el mercado de Stratagene Inc., Lajolla, California. Se encontró que el inserto de ADNc tenía una longitud de 886 pares de bases y que codificaba dos polipéptidos en marcos de lectura distintos que eran homólogos al extremo N-terminal y al extremo C-terminal, respectivamente, del VEGF. Este novedoso factor de crecimiento se denomina en lo sucesivo VEGF-B. El clon es parcial y carece de varios aminoácidos en la región amino terminal y de la totalidad de la secuencia señal.
de \approx 0,9 kb en el plásmido pPC67 se clonó en pBluescript y se secuenció enteramente mediante el uso de cebadores de vector T7 y T3 junto con cebadores internos. El plásmido pBluescript se puede conseguir en el mercado de Stratagene Inc., Lajolla, California. Se encontró que el inserto de ADNc tenía una longitud de 886 pares de bases y que codificaba dos polipéptidos en marcos de lectura distintos que eran homólogos al extremo N-terminal y al extremo C-terminal, respectivamente, del VEGF. Este novedoso factor de crecimiento se denomina en lo sucesivo VEGF-B. El clon es parcial y carece de varios aminoácidos en la región amino terminal y de la totalidad de la secuencia señal.
La figura 1 presenta la secuencia nucleotídica
(SEC ID Nº:1) de este clon de ADNc parcial del
VEGF-B y la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº:2)
codificada en el primer marco de lectura del mismo. La secuencia de
ADN de la figura 1 se obtuvo por secuenciación convencional de un
clon (pcif-2) en el vector de expresión en
levaduras pPC67. El clon comprendía 886 pares de bases y codificaba
una parte del VEGF-B de ratón.
La secuencia de ADNc aislada hibridará con el ADN
genómico de mamíferos, por ejemplo bien de ratón o bien humano, que
contenga el gen VEGF-B. Además de la secuencia
codificante, el ADN genómico contendrá una o más secuencias
promotoras que proporcionen y dirijan la expresión de
VEGF-B en uno o más tejidos específicos. Así, la
secuencia codificante de VEGF-B puede estar unida a
elementos promotores específicos del músculo que a su vez son
específicos para ciertos tipos de fibras musculares.
La secuencia nucleotídica se traduce en dos
marcos de lectura distintos en dos secuencias de aminoácidos
distintas. Hay un codón de terminación (TGA) dentro de la secuencia
codificante en los pares de bases 309-311. Por lo
tanto, el VEGF-B viene en diferentes variantes de
ayuste. El extremo 5' de la secuencia de ADNc clonada codifica una
proteína de 102 aminoácidos de largo con una homología considerable
respecto a los dominios N-terminales de VEGF, PlGF
y PDGF A y B. En particular, varios residuos de cisteína están
perfectamente conservados dentro de este grupo de proteínas. Además
de la secuencia nucleotídica (SEC ID Nº:1), la figura 1 representa
además la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID Nº:2) de esta
primera proteína.
La traducción del extremo
C-terminal del ADNc (pares de bases
308-475) en un marco de lectura distinto tiene como
resultado una proteína que es altamente homóloga a la parte
C-terminal de VEGF_{165}, VEGF_{189} y
VEGF_{206}. La figura 2 presenta de nuevo la secuencia
nucleotídica (SEC ID Nº:1) de la figura 1, pero esta vez incluye la
secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID Nº:3) de la segunda
proteína, que está codificada en el segundo marco de lectura y
tiene una longitud de 54 aminoácidos. Parece, por lo tanto, que el
gen VEGF-B codifica proteínas distintas mediante el
uso de ayuste alternativo del transcrito primario. Puede que la
última parte del clon, que codifica el segundo péptido, se exprese
como una proteína funcional en otros variantes de ayuste del
VEGF-B.
Las proteínas descritas anteriormente pueden
existir en asociación combinada con una secuencia
N-terminal suplementaria de aproximadamente cinco
(5) a diez (10) aminoácidos, así como una secuencia líder
suplementaria de aproximadamente veintiuno (21) a veintiocho (28)
aminoácidos. En la medida en que tales secuencias de aminoácidos
combinadas exhiben la propiedad de estimular la proliferación de las
células endoteliales y que las secuencias de ADN que codifican
tales secuencias peptídicas combinadas hibridan en condiciones
restrictivas con la secuencia de ADN de las figuras 1 y 2, se
considera expresamente que tales secuencias de aminoácidos y los ADN
que codifican las mismas están dentro del alcance de la presente
invención.
Mediante el uso del inserto de ADNc SalI/NotI de
aproximadamente 0,9 kb del clon de ADNc previamente identificado
del ejemplo 1 como sonda, se cribó una biblioteca de ADNc en lambda
ZAP-II de corazón de ratón adulto que se consiguió
de Stratagene Inc., de La Jolla, California mediante el uso de
técnicas corrientes. Se valoró la biblioteca y se sembró en placas
según se recomienda y se prepararon filtros. Tras una
prehibridación a 42ºC en formamida al 50%, SSPE 5 x, solución de
Denhardt 5 x, SDS al 1% y 100 \mug de ADN de esperma de
salmón/ml, se hibridaron los filtros a la misma temperatura y en la
misma solución que contenía la sonda marcada radiactivamente
desnaturalizada usándose 10^{6} cpm/ml de solución de
hibridación. Se marcó la sonda mediante el uso de un kit de cebado
aleatorio (Amersham). Al cabo de 16 horas se lavaron los filtros en
SSC 2 x que contenía SDS al 0,5% durante 2 x 30 min a 52ºC. Se
expusieron los filtros durante la noche mediante el uso de
pantallas intensificadoras a -70ºC. Se volvieron a cribar los
clones positivos dos veces hasta que todas las placas en una placa
estuvieran positivas. Se subclonaron los insertos de varios clones
positivos en el plásmido pBluescript SK+ por escisión in
vivo como lo recomienda el proveedor.
Se establecieron los mapas de varios clones por
análisis con enzimas de restricción y se encontró que se dividían
en dos grupos diferentes que se caracterizaban por la longitud de
un fragmento de restricción Spe1/BamH1. El primero de estos grupos
comprendía tres de los clones para los que se estableció el mapa de
restricción que tenían cada uno un fragmento de restricción
Spe1/BamH1 de 240 pb. El otro grupo comprendía un clon que tenía un
fragmento Spe1/BamH1 de 340 pb. El análisis de este fragmento se
describe en el ejemplo 5.
Los tres clones que exhibían el fragmento de
restricción Spe1/BamH1 de 240 pb fueron entera o parcialmente
secuenciados (Sequenase 2.0, U.S. Biochemicals), y las
características de los clones se resumen de la manera siguiente:
Los análisis de las secuencias nucleotídicas
revelaron que dos de los tres clones de ADNc eran básicamente
idénticas, aunque eran de longitudes distintas, y uno tenía una
mutación. Uno de los clones era de tamaño completo y contenía un
marco abierto de lectura que codifica 188 residuos de aminoácidos
en los que los primeros 21 aminoácidos son una secuencia señal que
se puede cortar. El otro de los dos clones básicamente idénticos
terminaba en la G del codón de iniciación. Se pudo deducir por
análisis de la secuencia de clones suplementarios que la secuencia
que precede la G es ACCAT. Se encontró que los dos clones tenían la
misma secuencia nucleotídica de la región codificante, que se
representa en la figura 3 (SEC ID Nº:4). La figura omite la timina
inicial y la adenina del codón de iniciación (TAG) que no
estuvieron presentes en los clones aislados. La secuencia de
aminoácidos deducida del marco abierto de lectura de la región
codificante de ambos de estos dos clones de ADNc se presenta en la
figura 4 (SEC ID Nº:5). La proteína obtenida codificada por esta
secuencia se denomina en lo sucesivo
VEGF-B_{167}. En cada uno de los nombres de
proteínas que se usan en la presente invención, el número en
subíndice se refiere al número de aminoácidos en la proteína madura
sin la secuencia señal.
Como cabría esperar, una comparación de la
secuencia de aminoácidos codificada por estos dos clones con la
secuencia de aminoácidos parcial deducida del clon de ADNc del
ejemplo 1 mostró una similitud llamativa. Sin embargo, los dos
marcos abiertos de lectura en el clon del ejemplo 1, cada uno de
los cuales codificaban una secuencia de aminoácidos homóloga a una
porción distinta de VEGF, se encuentran ambos presentes en el mismo
marco de lectura en cada uno de estos dos clones según el ejemplo 2.
El desplazamiento del marco en el clon del ejemplo 1 está provocado
por una inserción de dos unidades adicionales de adenina que
desplazan la parte C-terminal del clon del ejemplo
1 fuera del marco. Actualmente no se entiende el motivo de esto,
pero puede que se deba a un artefacto de clonación.
La parte codificante del tercer clon tenía una
secuencia de nucleótidos idéntica a las de los dos clones
precedentes excepto una inserción de 21 pb. La figura 5 presenta la
secuencia nucleotídica de este tercer clon (SEC ID Nº:6). Para
facilitar la identificación, las 21 bases adicionales están
subrayadas en la figura. Esta inserción da origen a 7 residuos de
aminoácidos adicionales en la proteína madura. Así, la proteína
obtenida codificada por este ADNc más largo se denomina
VEGF-B_{174}. La secuencia de aminoácidos de la
proteína codificada por el ADNc de la figura 5 se representa en la
figura 6 (SEC ID Nº:7). Los siete aminoácidos adicionales están
subrayados también en la figura para la facilidad de
identificación. Los aminoácidos adicionales están insertados dentro
de la secuencia en un sitio de ayuste, y la secuenciación de clones
de ADN genómico de ratón indica que estos aminoácidos adicionales
son la consecuencia de un auténtico ayuste alternativo. Además,
basándose en lo que se sabe sobre las localizaciones de los sitios
de unión al receptor en PDGF, la inserción se produce en una
posición en la proteína que es probablemente parte de un sitio de
unión al receptor. Por lo tanto, es probable que la inserción
afecte la unión al receptor y podría ser de importancia funcional a
la hora de influir sobre la especificidad para los antagonistas y/o
receptores distintos.
Como se señaló anteriormente, este clon de ADNc
original del ejemplo 1 no era de tamaño completo y puede que
contenga un artefacto. Sin embargo, si se añade la secuencia
nucleotídica del extremo 5' de los clones que codifican el
VEGF-B_{167} y/o el
VEGF-B_{174}, el marco abierto de lectura codifica
una proteína de 133 aminoácidos, que produce una proteína madura
que tiene una longitud de 112 aminoácidos y, por lo tanto, se llama
VEGF-B_{112}. La secuencia del ADNc híbrido que
codifica el VEGF-B_{112} (SEC ID Nº: 8) se
presenta en la figura 7, y la secuencia de aminoácidos de la
proteína correspondiente (SEC ID Nº:9) se ilustra en la figura
8.
La figura 9 presenta un múltiple alineamiento de
secuencias de aminoácidos a efectos de comparación de la variante
de 167 aminoácidos del factor de crecimiento endotelial vascular B
de ratón (mVEGF-B_{167}), del factor de
crecimiento endotelial vascular B de ratón
(mVEGF-B_{164}), del factor de crecimiento de la
placenta humano (hPlGF), del factor de crecimiento derivado de las
plaquetas A de ratón (mPDGF A), y del factor de crecimiento
derivado de las plaquetas B de ratón (mPDGF B). Los residuos de
aminoácidos idénticos a los del VEGF-B_{167} de
ratón están enmarcados. La relación de homología de las secuencias
está clara, y la figura demuestra claramente la estructura
conservada de los factores de crecimiento que pertenecen a la
familia PDGF/VEGF de factores de crecimiento, y que el
VEGF-B es un homólogo estructural de los demás
factores de crecimiento de este grupo. La comparación de las
secuencias de aminoácidos por pares muestra que el
VEGF-B de ratón es idéntico en aproximadamente un
43% al VEGF-B_{164} de ratón, idéntico en
aproximadamente un 30% al PlGF humano, e idéntico en
aproximadamente un 20% a los PDGF A y B de ratón. Los residuos
conservados de cisteína son particularmente dignos de notar. Se
puede ver que los ocho primeros residuos de cisteína en los
dominios N-terminales (es decir, los dominios con
semejanza al PDGF) de los cinco factores de crecimiento están
compartidos por todos los miembros de esta familia, y, por lo
tanto, queda patente que los ocho residuos de cisteína, que están
implicados en la unión intramolecular e intermolecular por
disulfuros, son invariables entre estos factores de crecimiento.
Además, los dominios C-terminales del
VEGF-B_{167} y del VEGF_{164} de ratón exhiben
también una similitud considerable con ocho residuos de cisteína
conservados adicionales y varios tramos de aminoácidos básicos.
Se cribaron 10^{6} clones en \lambda de la
biblioteca de ADNc de fibrosarcoma humano HT1080 en \lambdagt11
(Clontech) con el inserto de \approx 0,9 kb del clon pcif 2 de
VEGF-B de ratón según procedimientos corrientes.
Entre varios clones positivos, uno, denominado H.1 se analizó con
más cuidado y se determinó su secuencia nucleotídica. La secuencia
nucleotídica indicó que estaba codificada una isoforma de 207
aminoácidos del VEGF-B humano. El análisis de esta
isoforma se describe posteriormente en el ejemplo 6. Basándose en
la secuencia de H.1, se diseñaron dos oligonucleótidos que
amplificarían la región codificante entera de un presunto ADNc
humano que correspondiese a la isoforma
VEGF-B_{167} de ratón:
| 5'- CACCATGAGCCCTCTGCTCC-3' | (hacia delante) | (SEC ID Nº:18) |
| 5'- GCCATGTGTCACCTTCGCAG-3' | (hacia atrás) | (SEC ID Nº:19) |
Estos oligonucleótidos se usaron para amplificar
por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) la región codificante
entera del VEGF-B humano a partir de ARN cebado con
oligo-dT de células de eritroleucemia humana (HEL).
El producto amplificado se clonó dentro del vector pCR II del kit
de clonación TA (Invitrogen) y se secuenció mediante el uso de
técnicas corrientes. La secuencia nucleotídica del clon de ADNc del
VEGF-B humano se presenta en la fig. 10 (SEC ID
Nº:10), y la secuencia de aminoácidos deducida del
VEGF-B_{167} humano se presenta en la fig. 11 (SEC
ID Nº:11).
El clon de ADNc de ratón de tamaño completo del
ejemplo 2 y el clon de ADNc humano de tamaño completo del ejemplo 4
codifican cada uno un polipéptido de 188 aminoácidos que contiene
una presunta secuencia señal hidrófoba N-terminal.
Por analogía con el VEGF, se cree que el sitio de escisión de la
peptidasa de la señal está situado entre Ala 21 y Pro 22. El
presunto sitio de escisión de la peptidasa de la señal se indica en
la figura 16 mediante una flecha. Por consiguiente, los polipéptidos
VEGF-B procesados de estos dos clones contienen 167
aminoácidos cada uno.
Se analizó el clon que exhibía el fragmento
Spe1/BamH1 de 340 pb que se aisló en el ejemplo 2, y se encontró
que la mayor parte estaba idéntica a los dos primeros clones del
ejemplo 2 que exhibían el fragmento Spe1/BamH1 de 240 pb. La
diferencia se debe a la presencia de una inserción en la parte
C-terminal de la secuencia.
Este fragmento Spe1/BamH1 de 340 pb codifica otra
isoforma del VEGF-B de ratón que contiene 207
aminoácidos. La porción codificante del ADN que codifica esta
proteína (SEC ID Nº:12) se ilustra en la figura 12, y la secuencia
de aminoácidos traducida (SEC ID Nº:13) se ilustra en la figura 13.
Después de la escisión de la secuencia líder de 21 aminoácidos, la
proteína madura contiene 186 aminoácidos y se denomina
mVEGF-B_{186}. Esta isoforma es claramente el
resultado de un ayuste de ADN alternativo como se describe abajo
con referencia a la figura 17.
Se encontró que el clon H.1 aislado como se
describe en el ejemplo 4 codificaba una isoforma del
VEGF-B humano de 207 aminoácidos. La porción
codificante del ADN (SEC ID Nº:14) que codifica esta proteína se
ilustra en la figura 14 y la secuencia de aminoácidos traducida
(SEC ID Nº:15) se ilustra en la figura 15. De nuevo, esta isoforma,
que se denomina hVEGF-B_{186}, parece ser un
producto de ayuste alternativo.
Tanto el mVEGF-B_{186} del
ejemplo 5 como el hVEGF-B_{186} del ejemplo 6
incluyen una inserción de 101 pares de bases entre los nucleótidos
414 y 415 de la secuencia codificante de
VEGF-B_{167}. Después de la inserción, las
secuencias nucleotídicas de estos clones de ADNc eran idénticas a
las secuencias de VEGF-B_{167} correspondientes.
La posición de la inserción de 101 pares de bases corresponde a la
juntura exón 5-exón 6 en el VEGF. La inserción tiene
como resultado un desplazamiento del marco que hace que los
dominios C-terminales de las dos isoformas de
\hbox{VEGF-B} sean completamente
distintos.
La divergencia de las secuencias de aminoácidos
C-terminales que empieza en el aminoácido 116 en
las SEC ID Nº 11 y 15, que corresponden a las dos isoformas
principales del VEGF-B,
VEGF-B_{167} y VEGF-B_{186}, se
refleja por las características bioquímicas distintas de las dos
isoformas. El dominio C-terminal del
VEGF-B_{167} es fuertemente básico (carga neta
+13) y se une a la heparina. El dominio C-terminal
del VEGF-B_{186} es débilmente básico (carga neta
+5) y tiene un largo tramo de residuos de aminoácidos hidrófobos en
su extremo C-terminal. Es poco probable que la cola
hidrófoba en VEGF-B_{186} se comporte como un
dominio transmembrana puesto que esta variante de
VEGF-B se secreta por las células. Por lo tanto, a
pesar de un dominio N-terminal idéntico, estas dos
isoformas principales del VEGF-B tienen propiedades
bioquímicas muy distintas. La ausencia del dominio altamente básico
que se une a la heparina en VEGF-B_{186} permite
que la proteína se secrete libremente por las células. Sin embargo,
la secreción de VEGF-B_{186} es
extraordinariamente lenta; en un experimento de caza del pulso
mediante el uso de células sometidas a transfección, no se
encontraron homodímeros de VEGF-B_{186} en el
medio antes de 1 hora. Por contraste, los homodímeros de VEGF y los
dímeros de VEGF-B_{186}\cdotVEGF aparecen en el
medio dentro de los 30 minutos.
La figura 16 presenta las secuencias de
aminoácidos alineadas del VEGF-B_{167} y del
VEGF-B_{186} de ratón y humano (SEC ID Nº:5, 11,
13 y 15) en código de una letra. Los residuos idénticos están
encerrados en cuadros, mientras que los residuos de aminoácidos que
son distintos entre las isoformas VEGF-B_{167} y
VEGF-B_{186} de ratón y humano están fuera de
los cuadros. Los VEGF-B de ratón y humano exhiben
una identidad de secuencia de aminoácidos de aproximadamente un 88%
y son altamente básicos, especialmente en sus regiones
C-terminales. Los dominios
C-terminales del VEGF-B_{186} de
ratón y humano son idénticos en aproximadamente un 85% a nivel de
los aminoácidos. Los dominios
C-terminales del VEGF-B_{167} de ratón y humano son idénticos en aproximadamente un 84% a nivel de los aminoácidos. Ambos polipéptidos carecen de la secuencia consenso para glicosilación por enlace N (N-X-T/S). La flecha indica el presunto sitio de escisión para la peptidasa de la señal entre Ala^{21} y Pro^{22}. Excepto las secuencias señal, las secuencias de aminoácidos del VEGF-B_{167} de ratón y humano son altamente homólogas con sólo 20 sustituciones entre los 167 residuos. Las sustituciones están agrupadas en la región N-terminal, en dos regiones de aminoácidos entorno a los aminoácidos 60 y 145. Todos los residuos de cisteína en ambas proteínas VEGF-B_{167} son invariables, pero los ocho residuos de cisteína en el extremo C-terminal de VEGF-B_{147} no están conservados en las isoformas de VEGF-B_{186}. Es de notar que las secuencias de ratón y humana en la región entre los residuos 66 y 129 son idénticas a excepción de una sustitución evolutivamente conservada (Q105R). Esto tiene importancia puesto que los dominios de unión a los receptores se encuentran dentro de esta porción de la proteína (en comparación con la estructura del PDGF). De ello se puede concluir que es probable que el VEGF-B de ratón y humano vayan a exhibir unión de reacción cruzada a nivel del receptor y, por lo tanto, vayan a exhibir actividades biológicas idénticas o similares.
C-terminales del VEGF-B_{167} de ratón y humano son idénticos en aproximadamente un 84% a nivel de los aminoácidos. Ambos polipéptidos carecen de la secuencia consenso para glicosilación por enlace N (N-X-T/S). La flecha indica el presunto sitio de escisión para la peptidasa de la señal entre Ala^{21} y Pro^{22}. Excepto las secuencias señal, las secuencias de aminoácidos del VEGF-B_{167} de ratón y humano son altamente homólogas con sólo 20 sustituciones entre los 167 residuos. Las sustituciones están agrupadas en la región N-terminal, en dos regiones de aminoácidos entorno a los aminoácidos 60 y 145. Todos los residuos de cisteína en ambas proteínas VEGF-B_{167} son invariables, pero los ocho residuos de cisteína en el extremo C-terminal de VEGF-B_{147} no están conservados en las isoformas de VEGF-B_{186}. Es de notar que las secuencias de ratón y humana en la región entre los residuos 66 y 129 son idénticas a excepción de una sustitución evolutivamente conservada (Q105R). Esto tiene importancia puesto que los dominios de unión a los receptores se encuentran dentro de esta porción de la proteína (en comparación con la estructura del PDGF). De ello se puede concluir que es probable que el VEGF-B de ratón y humano vayan a exhibir unión de reacción cruzada a nivel del receptor y, por lo tanto, vayan a exhibir actividades biológicas idénticas o similares.
La estructura del gen del VEGF-B
humano se determinó por establecimiento de los mapas de restricción
y análisis de las secuencias nucleotídicas de fragmentos de PCR
clonados que se obtuvieron de reacciones de PCR que emplearon ADN
genómico humano como plantilla, salvo en el caso del primer exón e
intrón, que se identificaron a partir de un clon genómico en
\lambda. La estructura del gen de ratón se determinó por
establecimiento de los mapas de restricción y análisis de las
secuencias nucleotídicas de fragmentos de PCR clonados que se
amplificaron mediante el uso de distintas combinaciones de
cebadores. Como plantilla en estas amplificaciones por PCR, se usó
un clon genómico en \lambda aislado que contenía el gen
VEGF-B de ratón en su totalidad.
Varios clones en \lambda para el gen
VEGF-B de ratón se aislaron a partir de una
biblioteca genómica de 129/Sw en \lambdaFIX como lo recomienda el
proveedor (Stratagene, Inc.). Se usó el inserto SalI/NotI de
\approx 0,9 kb del ADNc pcif2 para VEGF-B (SEC ID
Nº:1) como sonda. Los ADN en \lambda de varios clones positivos se
aislaron a partir de productos de lisis de placas. Uno de los
clones en \lambda positivos (clon 10) se subclonó como
fragmentos BamH1 en pBluescript SK (Stratagene Inc.). El ADN aislado
a partir de este mismo clon se usó también como plantilla en las
reacciones de PCR (100 ng de ADN en \lambda/reacción) y se
amplificaron las partes codificantes del gen VEGF-B
de ratón mediante el uso de distintas combinaciones de cebadores.
Las secuencias nucleotídicas de estos cebadores procedían de los
clones de ADNc que codifican el VEGF-B_{167} de
ratón y el VEGF-B_{186} de ratón. Se usó la ADN
polimerasa Taq (2,5 U/reacción). Los fragmentos de PCR que se
generaron se clonaron directamente dentro del vector de clonación
pCR II de TA (Invitrogen Inc.). La estructura en exones e intrones
del gen VEGF-B de ratón se estableció por análisis
de la secuencia nucleotídica de los fragmentos genómicos Bam H1
subclonados y de los productos de PCR clonados.
Se aisló un clon genómico humano en \lambda por
cribado de 1 x 10^{6} clones de una biblioteca genómica humana
en EMBL-3 SP6/T7 (Clontech) mediante el uso de
condiciones altamente restrictivas con un fragmento de PCR de 90 pb
que abarca secuencias 5' del ADNc de VEGF-B humano
como sonda. Las condiciones de lavado fueron: un lavado a SSC 1 x a
temperatura ambiente durante 30 minutos y dos lavados a SSC 1 x a
65ºC durante 30 minutos. Los cebadores para la PCR fueron:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
5'- CACCATGAGCCCTCTGCTCC-3' \+ (hacia delante) \+
(SEC ID Nº:18)\cr 5'- GCCATGTGTCACCTTCGCAG-3' \+
(hacia atrás) \+ (SEC ID
Nº:19)\cr}
El clon en \lambda positivo se subclonó como
fragmentos SacI en el vector pGEM 3Z (Promega) y se encontró que
llevaba la región 5' del gen. Las partes restantes del gen del
VEGF-B humano se amplificaron por PCR mediante el
uso de ADN genómico como plantilla. Se usaron distintas
combinaciones de cebadores procedentes de la secuencia de ADNc
humana. Se usó la ADN polimerasa Dynazyme (2,5 U/reacción,
Finnzymes). Los fragmentos de PCR amplificados se clonaron
directamente en el vector de clonación pCRII de TA (Invitrogen
Inc.). Se determinaron los límites exón-intrón y la
longitud de los intrones cortos de los genes del
VEGF-B humano y de ratón por análisis de la
secuencia nucleotídica mediante el uso de cebadores específicos del
vector o cebadores adecuados procedentes de las secuencias de ADNc.
Se calculó la longitud de los intrones más grandes basándose en la
longitud de los fragmentos de PCR amplificados una vez analizados
por electroforesis en gel de agarosa.
Los resultados mostraron que las partes
codificantes de los genes del VEGF-B de ratón y
humano abarcan aproximadamente 4 kb de ADN y que ambos genes están
divididos en siete exones codificantes cuyas longitudes varían desde
19 pb (E7) hasta 236 pb (E6). La figura 17 es una representación
esquemática de las estructuras de los genes de ratón y humano para
VEGF-B. Los tamaños de los exones en pares de bases
se indican dentro de los cuadros, y los tamaños de los intrones se
indican entre los cuadros. Los intrones no se muestran a escala. No
se establecieron las estructuras de las regiones flanqueantes no
traducidas de los genes del VEGF-B de ratón y humano
y se representan por cuadros grises. Se enumeran las junturas
exón-intrón en ambos genes en la tabla 3
siguiente:
(Tabla pasa a página
siguiente)
Como se indicó anteriormente, el exón 6 contiene
un sitio aceptor de ayuste alternativo que permite que el gen
produzca dos transcritos distintos para las isoformas de
VEGF-B. El VEGF-B_{167} usa los
exones 1-5, la última parte del exón 6, y el exón 7
(TGA). El VEGF-B_{186} usa los exones 1 a 5, la
primera parte del exón 6, y acaba en la última parte del exón 6
(TAG). El exón 7 no se traduce en el VEGF-B_{186}
puesto que la inserción de la primera parte del exón 6 introduce un
desplazamiento del marco y da origen a un codón de terminación en
la última parte del exón 6. La posición del codón de terminación
(TAG) para el VEGF-B_{186} está señalada en el
exón 6B, y el codón de terminación (TGA) para el
VEGF-B_{167} está señalado en el exón 7.
Los intrones en ambos genes varían desde 161 pb
hasta aproximadamente 2,6 kb. La longitud de cada exón y la
localización de las junturas de ayuste en los dos genes eran
idénticas, y todos los sitios donantes y aceptores de ayuste siguen
las reglas GT/AG canónicas, Padgett y col., Annual Rev. of
Biochemistry, 55:1119-50 (1986). La única
diferencia destacable entre los genes de ratón y humano son las
longitudes de los intrones 1, 4 y 6 que son más largos en el gen de
ratón. Se encontró que todos los límites
exón-intrón estaban conservados entre
VEGF-B y VEGF, pero los intrones en los genes
VEGF-B eran por lo general más cortos que en el gen
VEGF.
El intrón de 300 pb después del exón 5 en el
VEGF-B es distinto del correspondiente en el VEGF,
que tiene una longitud de 3 kb y contiene un exón ayustado
alternativamente que se encuentra en los transcritos para
VEGF_{189} y VEGF_{206}, que codifica muchos residuos de
aminoácidos básicos. Cuando se analizó este intrón en
VEGF-B con más cuidado, no se pudo encontrar exón
que correspondiera al 6º exón del VEGF. En lugar de eso, se
encontró que el extremo 3' de este intrón y el exón siguiente eran
idénticos a las secuencias correspondientes de los clones de ADNc
que codifican VEGF-B_{186}. Esto se puede
explicar por el hecho de que el ARNm para
VEGF-B_{186} se forma mediante el uso de un
sitio aceptor de ayuste alternativo durante el ayuste del ARNm, lo
cual tiene como resultado la inserción de una secuencia intrón de
101 pb dentro de estos ARNm.
La figura 18 presenta un análisis de
hidrofilicidad comparada del VEGF-B_{167} y del
VEGF-B_{186} de ratón. Los perfiles se generaron
según Kyle y Dolittle mediante el uso de una ventana de nueve (9)
residuos. Como cabría esperar, el patrón de
hidrofilicidad/hidrofobicidad es básicamente idéntico desde el
aminoácido 1 hasta el aminoácido 115. Después del aminoácido 115,
los patrones de hidrofilicidad/hidrofobicidad divergen debido al
desplazamiento del marco introducido por la primera parte del exón
6. Por lo tanto, se puede esperar que el
VEGF-B_{167} y el VEGF-B_{186}
exhiban a la vez actividades similares y distintas.
La figura 19 es un dendrograma que muestra la
relación filogenética de las secuencias de aminoácidos de cinco
miembros de la familia VEGF/PDGF de factores de crecimiento. El
número de reemplazos y sustituciones disminuye de la izquierda a la
derecha de la gráfica. Se puede ver que el VEGF-B se
encuentra entre el VEGF y le grupo del factor de crecimiento
derivado de las plaquetas (PDGF).
Los múltiples alineamientos de las secuencias de
aminoácidos de las figuras 9 y 16 y el análisis filogenético de la
figura 19 se llevaron a cabo según Hein, Methods in
Enzymology, Vol. 183, pp. 626-645, Academic
Press Inc., San Diego (1990) mediante el uso de la tabla de
distancias PAM 250.
Se produjeron antisueros contra el
VEGF-B de ratón por inmunización de conejos con un
oligopéptido 18-mérico que comprende la región
N-terminal del VEGF-B procesado,
unido a la hemocianina de lapa. Se introdujeron residuos de cisteína
como residuos de aminoácidos N-terminales y
C-terminales para permitir la unión del péptido a
la proteína portadora mediante el uso de SPDP (Pharmacia). La
secuencia del oligopéptido fue:
C-P-V-S-Q-F-D-G-P-S-H-Q-K-K-V-V-P-C
(SEC ID
Nº:21).
Cada conejo recibió una inyección subcutánea con
300 \mug del conjugado peptídico emulsionado en adyuvante completo
de Freund. Se dieron inyecciones de recuerdo subcutáneas cada dos
semanas con la misma cantidad de antígeno emulsionado en adyuvante
incompleto de Freund. Se obtuvieron los sueros después de la
segunda inyección de recuerdo.
Se generó un antisuero antipeptídico contra el
VEGF-B humano por inmunización de conejos con un
oligopéptido 23-mérico ramificado que comprende la
siguiente secuencia de residuos de aminoácidos de la región
N-terminal (SEC ID Nº: 22):
S-Q-P-D-A-P-G-H-Q-R-K-V-V-S-W-I-D-V-Y-T-R-A-T.
El oligopéptido 23-mérico
ramificado se sintetizó según Tam, "Synthetic peptide vaccine
design: synthesis and properties of a high-density
multiple antigenic peptide system", Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, Vol. 85, páginas 5409-413 (1988). En la
primera inmunización, se inyectó subcutáneamente 500 \mug del
péptido ramificado emulsionado en adyuvante completo de Freund a
los conejos. En las inyecciones de recuerdo posteriores, se inyectó
200 \mug del antígeno emulsionado en adyuvante incompleto de
Freund. Se recogieron los antisueros después de la segunda y la
tercera inyección de recuerdo mediante técnicas convencionales.
Se estudiaron las propiedades bioquímicas del
VEGF-B_{167} humano en células de riñón
embrionario humano 293EBNA sometidas a transfección (Invitrogen,
Inc.). Se clonaron los insertos de ADNc que codifican el
VEGF-B_{167} humano y el VEGF_{165} humano
[véase Keck y col., Science, Vol. 246, páginas
1309-312 (1989)] por separado en el vector de
expresión pREP7 (Invitrogen, Inc.). Se sometieron células de riñón
embrionario humano 293EBNA (que expresan el antígeno nuclear 1 del
virus de Epstein-Barr) a transfección por
transfección transitoria con los plásmidos de expresión respectivos
mediante el uso de la precipitación con fosfato cálcico, y se
incubaron las células durante 48 horas. Como control, también se
sometieron células a transfección con un vector de expresión que
contenía el ADNc de VEGF-B_{167} en orientación
contraria. Se incubaron monocapas de células en medio exento de
metionina y exento de cisteína durante 30 minutos seguido de
marcaje con 100 \muCi/ml de [^{35}S]metionina y
[^{35}S]cisteína (Promix, Amersham Inc.) en el mismo
medio durante 2 horas. Se sustituyó el medio de marcaje por medio
normal sin suero, y se cazaron las proteínas marcadas durante 6
horas. Se incluyó heparina durante la caza cuando se indica (100
\mug/ml). Se recogieron los medios después del periodo de caza, y
se solubilizaron las células en Tris 10 mM pH 7,5, NaCl 50 mM,
desoxicolato sódico al 0,5%, Nonidet P-40 al 0,5%,
SDS al 0,1% y 0,1 U/ml de aprotinina.
El VEGF-B_{167} se expresó en
las células que se sometieron a transfección con los plásmidos que
contenían el ADN de VEGF-B_{167}. Se sometieron
alícuotas de los sobrenadantes de cultivo de las células tratadas o
no tratadas con heparina y productos de lisis de células
solubilizadas con detergente a inmunoprecipitación con el antisuero
antipeptídico específico para el VEGF-B que se
obtuvo como se describe en el ejemplo 8 y se analizó por
SDS-PAGE en condiciones reductoras a menos que se
indique lo contrario. Los datos muestran que la heparina libera
homodímeros de VEGF-B_{167} y heterodímeros de
VEGF-B_{167} - VEGF_{165} desde las células. Por
tratamiento con heparina (1-100 \mug/ml) o NaCl
1,2 M, las células liberaron VEGF-B_{167} que se
encontró en el sobrenadante. Si las células no se trataban con
heparina, el VEGF-B_{167} seguía asociado a las
células y no se liberaba en el medio de cultivo. En las mismas
condiciones, las células secretan homodímeros de VEGF_{165} que se
encuentra en los sobrenadantes de cultivo sin tratamiento con
heparina.
En condiciones reductoras, el
VEGF-B_{167} humano migró con una M_{r} de 21
kDa. El análisis de los sobrenadantes de cultivo en condiciones no
reductoras mostró que el VEGF-B_{167} migraba
como una especie de Mr 42 kDa lo cual indica una estructura
dimérica. Estos resultados sugieren que el
VEGF-B_{167} forma dímeros unidos por disulfuros
asociados con la superficie celular, probablemente a través de
interacciones iónicas con proteoglicanos de heparán sulfato
extracelulares. Es probable que la asociación esté mediada por el
dominio básico C-terminal, como se observa para la
variante de ayuste más larga del VEGF.
Puesto que se ha demostrado que el VEGF forma
heterodímeros con el PlGF, se decidió comprobar si el VEGF_{165}
podía formar heterodímeros con el VEGF-B_{167}
también. A estos efectos, se realizó una cotransfección de células
293EBNA con vectores de expresión que codifican tanto el
VEGF_{165} humano como el VEGF-B_{167} humano,
y el VEGF-B_{167} se expresó en combinación con
el VEGF_{165}. Se cazaron en presencia de heparina proteínas
marcadas metabólicamente, y las inmunoprecipitaciones se llevaron a
cabo con antisueros frente a VEGF-B_{167} o a
VEGF_{165}. El antisuero contra el VEGF humano era de R&D
Systems. En condiciones no reductoras, los heterodímeros
VEGF-B_{167}\cdotVEGF-B165
migraron como una especie de Mr 42-46 kDa. Los
resultados demuestran que el VEGF-B puede formar
heterodímeros unidos por disulfuros con el VEGF, que, en ausencia
de heparina, permanecen asociados a las células. Puesto que se
secretan eficientemente homodímeros de VEGF_{165} en los medios,
parece que el VEGF-B determina la secreción del
heterodímero.
El VEGF-B se sintetiza
normalmente en el retículo endoplasmático de la célula fuente para
su exportación posterior. Se puede producir VEGF-B
recombinante mediante la inserción de una secuencia de ADN que
codifica la proteína VEGF-B junto con secuencias
promotoras y de control adecuadas unidas de manera funcional dentro
de un vector adecuado, tal como el bien conocido plásmido pBR322 o
un derivado del mismo, la transformación o la transfección de una
célula huésped adecuada, tal como E. coli o una célula Cos,
con el vector que se obtuvo u otros sistemas bien conocidos en la
técnica, el cribado de los transformantes o resultados de la
transfección obtenidos para la expresión de VEGF-B,
y luego el cultivo de la líneas celulares o las cepas de células
bacterianas que sean positivas para la expresión de
VEGF-B. Se puede usar tanto un vector para
eucariotas como un vector para procariotas, según el tipo de célula
que se quiere transformar o a la que se quiere someter a una
transfección con el mismo. Un sistema particularmente preferido
para la producción de VEGF-B recombinante es el
sistema baculovirus - célula de insecto, que ha demostrado ser
capaz de producir excelentes rendimientos de proteína
recombinante.
Se insertó el gen de
VEGF-B_{167} humano entero dentro de un plásmido
que se puede conseguir en el mercado pCRII (Invitrogen Corp.). A
continuación, el fragmento HindIII-XbaI del
plásmido pCRII-VEGF-B_{167}
obtenido que codifica el marco de lectura abierto entero del
VEGF-B_{167} se clonó dentro de pFASTBAC1, y se
secuenciaron tanto la juntura 3' como la juntura 5'. Se preparó
ADN de "bacmido" según las instrucciones del fabricante para
el "Sistema de expresión en Baculovirus
Bac-to-Bac™" (Life Technologies
Inc.) y se realizó una transfección con liposomas de células Sf9
adaptadas para Sf900II (obtenidas del Dr. Christian
Oker-Blom). Las células Sf9 son de la American Type
Culture Collection Cell Repository Line Bank, Rockville MD (ATCC
CRL-1711). Las células a las que se realizó la
transfección se pusieron en cultivo a continuación en medio
TMN-FH típico en placas de cultivo de 25
cm^{2}.
Aproximadamente 72 horas después de la
transfección, se realizó la lisis de las células y se ensayaron 1
ml de sobrenadante de cultivo y el producto de lisis celular para
el VEGF-B expresado por inmunoprecipitación como se
describe en el ejemplo 9 y por transferencia de tipo Western. Los
productos de la lisis de tres de cuatro cultivos de células a las
que se realizaron transfecciones independientes resultaron positivos
para el VEGF-B, aunque la intensidad de la señal en
la transferencia de tipo Western variara. Resultó que el
polipéptido VEGF-B expresado correspondía en cada
caso en tamaño con la proteína expresada en células de mamíferos en
el ejemplo 9.
Las cepas virales de las células que dieron la
señal más potente en transferencia de tipo Western se amplificaron
dos turnos por infección de las células y recolección de nuevos
virus a partir del medio. Se analizó el sobrenadante obtenido.
También se analizaron células no infectadas como control negativo.
El análisis del curso cronológico mostró que las células que se
cosechaban entre 48 y 72 horas después de la infección contenían la
más alta cantidad de VEGF-B. Después de 96 horas
post infección, como consecuencia de la lisis celular inducida por
el virus, se pudo detectar también VEGF-B en el
sobrenadante de cultivo por inmunoprecipitación y transferencia de
tipo Western. Se pudo precipitar VEGF-B
recombinante a partir del producto de lisis entre 20% y 40% de
(NH_{4})_{2}SO_{4}.
Se usó un fragmento de reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) desde la posición nucleotídica 68 hasta 141 para
introducir un sitio de restricción para BamHI justo detrás del
sitio de escisión de la señal en el plásmido
pCRII-VEGF-B_{167} del ejemplo
10.1. Se clonó el fragmento BamHI de esta construcción
pCRII-VEGF-B_{167} modificada
dentro de pVTBac abierto en BamHI [Tessier y col., "Enhanced
secretion from insect cells of a foreign protein fused to the
honeybee mellitin signal peptide", Gene, Vol. 98, página
177 (1991)]. Se secuenciaron las junturas tanto 3' como 5'. Se
sometieron las células Sf9 a transfección con el vector pVTBac
descrito anteriormente que contenía el gen
VEGF-B_{167} humano, y con ADN de baculovirus
linearizado (Insectin™, Invitrogen Corp.). A continuación se
pusieron las células sometidas a transfección en cultivo en medio
TMN-FH.
Cuarenta y ocho horas después de la transfección,
se recogió el sobrenadante y se sometió a un cribado primario por
inmunoprecipitación. Se aislaron cuatro placas positivas.
10.3 Se clonó un inserto de ADNc que
codifica el VEGF-B_{186} de ratón (un fragmento
de ADNc de un clon de ADNc de VEGF-B_{186} de
ratón (SEC ID Nº:12) cortado por EcoR1) en pFASTBAC 1. También se
clonó un fragmento de ADNc de VEGF-B167 de ratón
(SEC ID Nº:4) cortado por EcoR1 en pFASTBAC 1. Se transformaron
bacterias con los plásmidos obtenidos como se describe en 10.1
arriba, y los plásmidos recombinados se aislaron y se usaron para
la transfección con liposomas de células Sf9 y Sf21. Se
amplificaron los sobrenadantes que contenían baculovirus
recombinantes por varios turnos de reinfección de células Sf21. Las
valoraciones finales de las cepas de baculovirus se determinaron
por valoración en placas y resultaron variar entre 4 x 10^{8} y 2
x 10^{9} partículas de baculovirus por mililitro de sobrenadante
de cepa.
Se infectaron células Sf21 [véase Vaughn y col.,
in vitro, 13:213-217 (1977)] con las cepas
de baculovirus del ejemplo 10 a una multiplicidad de infección de 10
partículas de virus por célula. Las células Sf21 infectadas se
hicieron crecer en matraces rotativos y se sembraron a una densidad
de 2 x 10^{6} células por ml de medio exento de suero (Sf900II,
Gibco-BRL) durante 96 horas. A continuación se
recogieron los medios de cultivo y las células. Se analizaron
alícuotas de los productos de lisis celular y de los medios por
SDS-PAGE. Se visualizaron los patrones de proteínas
totales por tinción de los geles con azul brillante de Coomassie y
se visualizó la presencia de isoformas de VEGF-B
expresadas por inmunotransferencia mediante el uso de anticuerpos
antipeptídicos específicos para el VEGF-B humano y
de ratón como se describió arriba en el ejemplo 8. El análisis
reveló que los polipéptidos VEGF-B_{167} tanto
humano como de ratón eran del tamaño esperado de 21.5 kDa. Ambas
proteínas fueron retenidas intracelularmente en las células
infectadas y no se liberaron en el medio. Por contraste, el
VEGF-B_{186} de ratón se secretó fácilmente en el
medio en forma dimérica. Los homodímeros de
VEGF-B_{186} migraron como una especie de
52-54 kDa lo cual sugirió que las proteínas
producidas por células de insecto no sufrieron la misma
modificación covalente que la que se encontró para la
VEGF-B_{186} secretada a partir de células
Cos-1 que se sometieron a transfección.
Se clonaron insertos que codifican el
VEGF-B_{186} de ratón y el VEGF_{165} humano
dentro del vector de expresión pSG5 [Green y col., Nucleic Acid
Res., 16:369 (1988)]. Se mantuvieron las células
Cos-1 en medio esencial mínimo (MEM) que contenía
suero de ternera fetal al 10%, glutamina 2 mM y antibióticos
apropiados. Para las transfecciones, se volvieron a sembrar las
células en placas en placas de Petri de 90 mm. Se sometieron las
células a transfección con los vectores de expresión, por separado o
en combinación, mediante el uso de la precipitación con fosfato
cálcico y se incubaron durante 36-48 horas. Las
monocapas de células se incubaron en medio exento de metionina y
cisteína durante 30 min y luego se incubaron en el mismo medio que
contenía 100 \muCi/ml de [^{35}S]-metionina y
[^{35}S]-cisteína durante 2 horas (Promix Amersham
Inc.).
Para los experimentos de
pulso-caza, se marcaron las células durante 30
minutos, se lavaron dos veces con medio normal y luego se incubaron
hasta 6 horas en MEM sin suero de ternera fetal. Se recogieron los
medios después del periodo de caza y se solubilizaron las células
en tampón Tris 10 mM pH 7,5 que contenía NaCl 50 mM, desoxicolato al
0,5%, nonidet P-40 al 0,5% y SDS al 0,1%. Se
sometieron alícuotas de los medios y de los productos de lisis
celular a inmunoprecipitación mediante el uso del antisuero
específico para el VEGF-B de ratón del ejemplo 8a y
un antisuero específico para el VEGF humano que se puede conseguir
en el mercado de R&D Systems. Se analizaron los precipitados
por SDS-PAGE.
Se estudiaron las propiedades bioquímicas del
VEGF-B_{186} de ratón en células
Cos-1 que se sometieron a una transfección
transitoria como se describe en el ejemplo 12 con un vector de
expresión apropiado. Las células se marcaron metabólicamente, y se
inmunoprecipitaron las proteínas de las células marcadas mediante el
uso de un anticuerpo antipeptídico contra el
VEGF-B. Se sometió el material precipitado a
análisis por SDS-PAGE en condiciones reductoras. Se
analizaron tanto el medio de cultivo celular (M) como un producto
de lisis de células solubilizado con detergente. Se presentan los
resultados en la figura 22. Se puede ver que el
VEGF-B_{186} asociado a las células migró como un
polipéptido de M_{r} 24.000 aproximadamente en condiciones
reductoras. Por contraste, el VEGF-B_{186}
presente en el medio de las células sometidas a transfección migró
como una especie de M_{r} 32.000, lo cual sugiere que la proteína
se modificó covalentemente durante su transporte intracelular y su
secreción. Las moléculas correspondientes no se detectaron en los
productos de lisis celular o en los medios de células
Cos-1 sometidas a un simulacro de transfección que
se usaron como control.
La inmunoprecipitación de los medios y el
análisis por SDS-PAGE en condiciones no reductoras,
dejó ver una especie de M_{r} 60.000 aproximadamente, lo cual
sugiere que el VEGF-B_{186} formó homodímeros
unidos por disulfuros. La inclusión de 100 \mug/ml de heparina
durante el marcaje no afectó a la secreción o a la liberación de
homodímeros de VEGF-B_{186} desde las células
sometidas a transfección.
Se estudió la biosíntesis de homodímeros de
VEGF-B_{186} por experimentos de
pulso-caza. Se marcaron metabólicamente a células
Cos-1 a las que se realizó una transfección,
durante 30 minutos y luego se realizó la caza hasta 4 horas. La
inmunoprecipitación y el análisis por SDS-PAGE de
los productos de lisis de células solubilizados con detergente y de
los medios mostraron que se detectaba fácilmente la especie asociada
a las células de M_{r} 24.000 aproximadamente a lo largo del
periodo de caza. La disminución de la intensidad de esta especie
molecular estaba asociada con un aumento de la proteína de M_{r}
32.000 presente en el medio. La especie de M_{r} 32.000 apareció
en el medio al cabo de una hora de caza. Los más altos niveles de
VEGF-B_{186} secretada se obtuvieron después del
periodo de caza de 4 horas. No se detectaron intermedios en los
productos de lisis celular, pero la proteína de M_{r} 32.000
secretada pareció ligeramente heterogénea. La naturaleza de la
modificación no se conoce actualmente, pero se puede excluir la
N-glicosilación en ausencia de sitios de consenso
para esta modificación.
Como se indicó arriba, el VEGF-B
y el VEGF se coexpresan en muchos tejidos y los heterodímeros
VEGF-B_{167}-VEGF_{165} se
forman fácilmente cuando se coexpresan en células sometidas a
transfección. Para examinar si el VEGF-B_{186}
podía formar también heterodímeros con el VEGF_{165}, se realizó
una transfección de células Cos-1 como se
describió arriba con los vectores de expresión apropiados, bien
solos o en combinación. Las proteínas marcadas metabólicamente
presentes en los medios de las células a las que se realizó la
transfección se sometieron a inmunoprecipitaciones mediante el uso
de antisueros contra VEGF-B y VEGF. La figura 23A
muestra el resultado del análisis por SDS-PAGE en
condiciones reductoras de los inmunoprecipitados de los medios de
cultivos celulares de células Cos-1 sometidas a
transfección transitoria que expresan por separado el
VEGF-B_{186} y el VEGF, respectivamente. Se puede
ver que los antisueros fueron específicos para el
VEGF-B y el VEGF, respectivamente, sin reactividad
cruzada detectable.
Se realizó una cotransfección de células
Cos-1 con vectores de expresión para
VEGF-B_{186} y VEGF_{165}. Se sometieron los
medios de cultivo celular (M) y los productos de lisis (L)
solubilizados con detergente de las células obtenidas que
coexpresaban el VEGF-B_{186} y el VEGF_{165} a
inmunoprecipitación y análisis por SDS-PAGE en
condiciones reductoras. Los resultados se presentan en la figura
23B. La prueba demostró que el VEGF-B_{186} de
ratón y el VEGF_{165} humano forman heterodímeros intracelulares
y que se secretan.
Los medios de cultivo de células que expresan el
VEGF-B_{186} de ratón y el VEGF_{165} humano
se sometieron, bien por separado o en combinación, a
inmunoprecipitación mediante el uso de anticuerpos contra el
VEGF-B y el VEGF y se analizaron por
SDS-PAGE en condiciones no reductoras. Como control,
se analizó el medio de cultivo celular de células sometidas a un
simulacro de transfección. Los resultados se presentan en la figura
23C. Se encontró que el VEGF-B_{186} forma
homodímeros unidos por disulfuros que se secretan y que el
VEGF-B_{186} y el VEGF_{165} juntos forman
heterodímeros unidos por disulfuros que se secretan.
Para analizar si la formación de heterodímeros
con el VEGF afectaba a la secreción y liberación del
VEGF-B_{186}, se llevaron a cabo experimentos de
pulso-caza que usaron células
Cos-1 a las que se realizó una transfección
transitoria con vectores de expresión para
VEGF-B_{186} y VEGF_{165}. Se pudieron recuperar
heterodímeros unidos por disulfuros asociados a las células
después del periodo de marcaje de 30 minutos, y ya se recuperaron
heterodímeros secretados al cabo de un periodo de caza de 30
minutos. Las heterodímeros secretados se acumularon en el medio
hasta 2 horas después del marcaje. En el punto de tiempo de caza de
4 horas, había una disminución de la cantidad de heterodímeros en
el medio, probablemente debida a una degradación del complejo.
Algunos heterodímeros VEGF-B_{186}\cdotVEGF
permanecieron asociados a las células a lo largo de la caza. Estos
resultados sugirieron que la formación de heterodímeros con el VEGF
estimuló la secreción de VEGF-B_{186} en
comparación con la secreción de homodímeros de
VEGF-B_{186}. Además, la presencia de
heterodímeros que ya se formaban después del periodo de marcaje de
30 minutos sugirió que la liberación lenta de los homodímeros de
VEGF-B_{186} no se debía a una capacidad mermada
del VEGF-B_{186} para dimerizar.
Se aislaron homodímeros de
VEGF-B_{186} secretados a partir de medios de
cultivo exentos de suero de células Sf21 infectadas con baculovirus
como sigue:
La principal proteína contaminante en los medios
de cultivo fue la proteína de baculovirus gp64/67, una proteína
ácida secretada por las células infectadas por baculovirus. Para
eliminar esta proteína, se concentraron los medios de cultivo
veinte veces por ultrafiltración, y luego se pasaron a través de una
columna de Sephadex G-25 equilibrada en tampón
fosfato 20 mM pH 6,5 que contenía NaCl 20 mM. Las proteínas que se
eluyeron se pasaron a continuación a través de una columna de
intercambio iónico de CM-Sepharose (Pharmacia)
equilibrada en el mismo tampón. Se lavó la columna con el tampón
fosfato para eliminar las proteínas no unidas, y se eluyeron las
proteínas unidas al incrementar paso a paso la concentración en NaCl
del tampón de elución. La proteína principal gp64/67 codificada por
el baculovirus no se unía a la columna de intercambio iónico en
estas condiciones mientras que los homodímeros de
VEGF-B_{186} se eluyeron a una concentración en
NaCl de 90 mM. A juzgar por el análisis por SDS-PAGE
de la fracción que se eluyó, los homodímeros de
VEGF-B_{186} eran puros al 5-15%
por este procedimiento.
Se purifican los homodímeros de
VEGF-B_{186} hasta la homogeneidad en una columna
de MonoS acoplada a un sistema de FPLC (Pharmacia). La proteína
unida se eluye con un gradiente lineal de NaCl en tampón fosfato 20
mM pH 6,5.
Para averiguar si las dos isoformas de ayuste del
VEGF-B exhibían una distribución diferencial en los
tejidos y si existían isoformas suplementarias, se llevó a cabo un
análisis por RT-PCR que usó ARN total que se extrajo
de cerebro, corazón, hígado y riñón de ratón y de corazón y músculo
esquelético embrionario humano. Se analizaron los transcritos por
PCR mediante el uso de cuatro pares de cebadores específicos que
cubrían los exones 4 a 7 y los exones 3 a 7 en los genes de
VEGF-B de ratón y humano, respectivamente.
Se aislaron los ARN totales de tejidos humanos y
de ratón mediante el uso de procedimientos corrientes como los
describen Chirgwin y col., Biochemistry,
18:5294-99 (1979). Se usaron dos a cinco \mug de
ARN total por reacción para la síntesis de la primera hebra de ADNc
mediante el uso de la transcriptasa inversa del virus de la
mieloblastosis aviaria (20 U/reacción). Las reacciones se cebaron
con oligo-(dT)_{19}. Se usaron alícuotas de estas
reacciones como plantillas en reacciones de PCR que usaron la ADN
polimerasa Taq (2,5 U/reacción). Para amplificar el ADNc de
ratón, se usaron dos pares de cebadores. Estos pares se obtuvieron
al combinar un cebador 5' común
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
5'-CACAGCCAATGTGAATGCA \+ (hacia delante) \+ (SEC
ID
Nº:23)\cr}
que se encuentra en el exón 4 con dos cebadores
3' distintos
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
5'- GCTCTAAGCCCCGCCCTTGGCAATGGAGGAA \+ (hacia atrás) \+ (SEC ID
Nº:25)\cr and 5'-ACGTAGATCTTCACTTTCGCGGCTTCCG \+
(hacia atrás) \+ (SEC ID Nº:
25)\cr}
(este último cebador tiene un sitio para Bgl II y
4 bases adicionales en su extremo 5') que se encuentran en los
exones 6B y 7 respectivamente. Después del análisis por
electroforesis en gel de agarosa, se transfirieron las bandas
amplificadas a un filtro de nailon (Genescreen Plus) y se
hibridaron secuencialmente con sondas oligonucleotídicas específicas
para los exones 6A y 6B. Las sondas oligonucleotídicas fueron
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
5'- CTCTGTTCCGGGCTGGGACTCTA \+ (exón 6A) \+ (SEC ID Nº:26) y\cr
5'- TCAGGGCGTTGACGGCGCTGGGTGCAA \+ (exón 6B) \+ (SEEC ID Nº:
27)\cr}
Las sondas oligonucleotídicas se marcaron con
[^{32}P]dCTP mediante el uso de la terminal transferasa
hasta una actividad específica elevada. Las hibridaciones, que
usaron 1 x 10^{6} cpm de sonda marcada/ml de solución, se llevaron
a cabo a 37ºC en SSC 6 x que contenía solución de Denhardt 5 x, SDS
al 0,5% y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón. Se lavaron los
filtros a la misma temperatura en SSC 6 x que contenía SDS al 0,5%
durante 2 x 15 min y se expusieron a una
película.
Los dos pares de cebadores que se usaron para la
amplificación del ADNc humano se combinaron mediante el uso de dos
cebadores 5' distintos,
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
5'-CCTGACGATGGCCTGGAGTGT \+ (hacia delante) \+ (
SEC ID
Nº:28)\cr}
que se encuentra en el exón 3
y
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
5'-TGTCCCTGGAAGAACACAGCC \+ (hacia delante) \+ (
SEC ID
Nº:29)\cr}
que se encuentra en el exón 4, con un cebador 3'
común,
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
5'-GCCATGTGTCACCTTCGCAG \+ (hacia atrás) \+ ( SEC
ID
Nº:19)\cr}
que se encuentra en el exón 7. Se analizaron
alícuotas de los productos amplificados por electroforesis en gel
de agarosa. Se clonaron las alícuotas directamente en el vector de
clonación pCRII de TA (Invitrogen, Inc.), y los plásmidos generados
se analizaron por secuenciación de nucleótidos. La amplificación de
GAPDH hizo las veces de
control.
El análisis de los productos de PCR amplificados
por electroforesis en gel de agarosa reveló dos bandas principales
de 215 y 316 pb, respectivamente. Estos tamaños concuerdan con los
dos ARNm que corresponden al VEGF-B_{167} y al
VEGF-B_{186}. Estas dos bandas eran de la misma
intensidad lo cual sugiere que las dos isoformas se expresaron a
niveles aproximadamente iguales en todos los tejidos de ratón y
humanos que se estudiaron.
Para comprobar la identidad de los productos
amplificados a partir de tejidos de ratón, se transfirió el ADN
amplificado por PCR a un filtro y se sondeó con sondas
oligonucleotídicas específicas para los exones 6A y 6B,
respectivamente. Las autorradiografías mostraron que una sonda
específica para el exón 6 hibridaba con la banda de 316 pb mientras
que la sonda específica para el exón 6B hibridaba con las dos
bandas amplificadas de 215 pb y de 316 pb. Estos resultados
concuerdan con el uso alternativo de sitio aceptor en el exón 6
para crear las dos isoformas de VEGF-B y así todos
los productos amplificados correspondieron a aquellos pronosticados
a partir de las secuencias de las isoformas
VEGF-B_{167} y VEGF-B_{186}.
La electroforesis en gel de agarosa de productos
del análisis por PCR de ARN total aislado a partir de corazón y
músculo embrionario humano hizo ver dos bandas amplificadas
principales de 329 pb y 430 pb.
En su conjunto, estos datos demuestran que el
VEGF-B_{167} y el VEGF-B_{186}
son las dos isoformas principales del VEGF-B en los
tejidos. El patrón de los productos de PCR y la localización de los
cebadores indican que si existe alguna isoforma de ayuste aún más
larga para el VEGF-B, un transcrito semejante usa un
sitio aceptor de ayuste situado un poco más 5' que en el caso del
VEGF-B_{186}. Además, no se detectaron productos
de PCR que correspondiesen al VEGF_{121}, que carece de los
dominios de unión a la heparina, es decir secuencias que
corresponden al exón 6 en el VEGF-B. Sin embargo, el
ayuste desde el exón 5 hasta el exón 7 daría origen a un transcrito
que codifica una isoforma del VEGF-B que
corresponde al VEGF_{121}, y esta presunta isoforma del
VEGF-B podría expresarse en tejidos distintos de
los que se analizaron en este ejemplo.
Se determinó la capacidad del
VEGF-B_{167} para estimular la proliferación de
las células endoteliales mediante el análisis de la incorporación de
[^{3}H]timidina en células endoteliales de la vena
umbilical humana (HUVEC) y en células endoteliales de los capilares
bovinos (BCE).
Se sometieron células 293EBNA a transfección
según se describió arriba con vectores de expresión para
VEGF-B_{167}, VEGF_{165} o el vector vacío
(simulacro) en presencia de 1 \mug/ml de heparina. Se diluyeron
los medios acondicionados de estas células en los medios
respectivos, se aplicaron a células endoteliales de la vena
umbilical humana (HUVEC) y a células endoteliales de los capilares
bovinos (BCE) y se midió la incorporación de
[^{3}H]timidina. Como control positivo, se añadió bFGF
recombinante a células BCE.
Para la elaboración, se recogieron los medios
acondicionados que contenían VEGF-B humano y
VEGF_{165} humano de células 293EBNA sometidas a transfección con
los vectores de expresión apropiados o con el vector vacío
(simulacro) en presencia de heparina (1 \mug/ml) 48 horas después
de la transfección. Se sembraron en placa HUVEC de segundo pasaje
en placas de 96 pocillos (4 x 10^{3} células/pocillo) en medio
M-199 complementado con suero bovino fetal al 10% y
se incubaron durante 24 horas. Los medios acondicionados se
diluyeron con el medio de crecimiento, y se estimularon las células
durante 48 horas. Se añadieron medios acondicionados frescos que
contenían 10 \muCi/ml de [^{3}H]timidina (Amersham Inc.)
a las células, y se prolongaron las estimulaciones durante 48 horas
adicionales. Se lavaron las células con PBS y se sometieron a
tratamiento con tripsina, y se determinó la radiactividad
incorporada por recuento en centelleo líquido. Se sembraron células
BCE en placas de 24 pocillos y se hicieron crecer hasta alcanzar la
confluencia en medio esencial mínimo (MEM) complementado con suero
de ternera fetal al 10%. Se privaron a las células de nutrientes en
MEM complementado con suero de ternera fetal al 3% durante 72
horas, tras los cual se añadieron medios acondicionados diluidos en
medio exento de suero a las células y se estimuló a las células
durante 24 horas. Se incluyó [^{3}H]timidina durante las
últimas 4 horas de estimulación (1 \muCi/ml). Se llevaron a cabo
estimulaciones con bFGF como arriba mediante el uso de 6 ng/ml de
bFGF recombinante (Synergen Inc.). Las células se lavaron con PBS,
se produjo su lisis con NaOH, y se determinó la radiactividad
incorporada por recuento en centelleo líquido.
La figura 20 es una diagrama de barras que
muestra la inducción relativa de la incorporación de
[^{3}H]timidina por el VEGF-B_{167} en
células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) y en
células endoteliales de los capilares bovinos (BCE), en comparación
con la actividad basal inducida por medio acondicionado de células
sometidas a un simulacro de transfección. A efectos de comparación,
se muestran también la inducción por el VEGF_{165} y el bFGF. Las
barras presentan la media \pm desviación típica de muestras
paralelas. Se obtuvieron resultados similares en varios otros
experimentos independientes. Los resultados de la prueba demuestran
claramente que el VEGF-B indujo la incorporación de
[^{3}H]timidina tanto en las células HUVEC como en las
células BCE y estimuló la proliferación de las células endoteliales
in vitro, demostrando así que el VEGF-B es
un factor de crecimiento endotelial.
Se cribó una biblioteca de ADN genómico humano en
el bacteriófago \lambda EMBL mediante el uso de un fragmento de
PCR 5' que contenía las secuencias del primer y del segundo exón
del VEGF-B como sonda. Se obtuvieron dos clones
positivos, y uno de estos se subclonó en el plásmido Bluescript
SKII como fragmentos Sac I. Se obtuvo un fragmento de 1,4 kb, que
contenía aproximadamente 0,4 kb de secuencias cadena arriba de un
sitio para Nco I presente en el ADNc (situado menos de 100 pb cadena
arriba del sitio de iniciación de la traducción ATG).
Además, se subclonó un fragmento XhoI de
aproximadamente 6 kb del otro clon en \lambda en el plásmido
pGEMEX. Este subclon contenía aproximadamente 1,5 pb de secuencias
cadena arriba del sitio para NcoI. Se subclonaron el fragmento
SacI/NcoI y un fragmento EcoRI(policonector) - NcoI dentro
del vector pGL3 basic (Promega) en las orientaciones
transcripcionales respectivas. Se realizó una transfección de
células HeLa con el ADN de estos subclones, y del vector control
pGL3 que contiene el promotor de SV40, mediante el uso de
precipitación con fosfato cálcico. Dos días después de la
transfección, se midieron las actividades luciferasa en productos de
lisis de las células sometidas a transfección. Los resultados
indicaron que el fragmento SacI/NcoI de 400 pb tiene una actividad
promotora igual a aproximadamente el 30% de la actividad del vector
control pGL3, mientras que el fragmento de 1,5 kb dio sólo actividad
de fondo. El uso de un promotor más potente o más activo, por
ejemplo el promotor del CMV o el promotor del factor de elongación
1-alfa, daría probablemente una actividad más
elevada en las células y los tejidos humanos. La estructura de los
fragmentos clonados se ilustra en la figura 24.
Se secuenció el fragmento de 1,5 kb cadena arriba
del sitio para Nco I. La secuencia obtenida (SEC ID Nº:17) se
ilustra en la figura 25. La secuencia obtenida reveló un presunto
elemento silenciador [Weissman y Singer, Molecular and Cellular
Biology, 11:4228-234 (1991)] compuesto de dos
tramos de ocho pares de bases entre los nucleótidos
166-187 (enmarcados en el dibujo). Este silenciador
podría ser el responsable de la relativa falta de actividad del
fragmento de 1,5 kb.
Se consiguieron piel normal y tejidos
melanomatosos de pacientes que acuden al departamento de
radioterapia y oncología, hospital central de la universidad de
Helsinki. Se obtuvieron cuatro muestras de melanomas metastáticos
recién después de su escisión quirúrgica, se envolvieron
inmediatamente en Tissue-tek (Miles) y se congelaron
en nitrógeno líquido. Las muestras de piel normal se consiguieron
de pacientes voluntarios que se sometieron a cirugía para un
carcinoma mamario y escisión de un nevo cutáneo. Todas las muestras
fueron inspeccionadas por un patólogo para confirmar el
diagnóstico.
Se aisló el ARN total mediante el procedimiento
del isotiocianato de guanidina [Chomczinsky y col., Anal.
Biochem. 162:156-159 (1987)]. Se sintetizó el
ADNc mediante el uso de 0,2 \mug de cebadores
hexadesoxinucleotídicos aleatorios, 5 unidades de transcriptasa
inversa de ratón, 5 \mug de ARN total como plantilla y un kit de
síntesis de la primera hebra de ADNc (Pharmacia). Después de la
incubación a 37ºC durante 1 hora, la mezcla de reacción se almacenó
a -70ºC. Se prepararon muestras de control negativo para las
amplificaciones por PCR de la misma manera salvo que no se añadió
la transcriptasa inversa. También se probó la
\lambda-actina como patrón interno porque se
expresa a un nivel constitutivo elevado, y su expresión no demuestra
mucha variación en células distintas.
Para la amplificación por PCR, se escogieron las
secuencias de cebadores a partir de los genes de
VEGF-B y de \lambda-actina de la
manera siguiente:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
VEGF-B sentido \+
5'-GCCATGTGTCACCTTCGCAG –3' \+ (SEC ID Nº:19)\cr
VEGF-B antisentido \+
5'-TGTCCCTGGAAGAACACAGCC –3' \+ (SEC ID Nº:29)\cr
B-actina sentido \+
5'-CGGGAAATCGTGCGTGCGTGACAT-3' \+
(SEC ID Nº:30)\cr B-actina antisentido \+
5'-GGAGTTGAAGGTAGTTTCGTG-3' \+ (SEC
ID
Nº:31)\cr}
[las secuencias de
\lambda-actina comprenden los nucleótidos
2105-2125 y 2411-2432 de Ng y col.,
Mol. Cell Biol. 5:2720-732 (1985)].
Se calentó una alícuota de 4 \mul del producto
de reacción de ADNc a 94ºC durante 5 minutos y se usó como
plantilla para la amplificación por PCR con 20 pmol de cebadores,
tampón de PCR 10 x, 1 \mul de dNTP 20 mM y 2,5 U de polimerasa
Taq. Se ajustó el volumen final a 100 \mul con agua tratada con
DEPC. La desnaturalización fue a 95ºC durante 1 minuto, el
alineamiento a 62ºC durante 45 segundos, y la polimerización a 72ºC
durante 50 segundos, para un total de 35 ciclos para el
VEGF-B y de 25 ciclos para la
\lambda-actina. Después de cada 5 ciclos, se
tomaron alícuotas de 15 \mul para su análisis.
Se realizó la electroforesis de 5 \mul de la
mezcla de reacción de PCR en un gel de agarosa al 2% que contenía
bromuro de etidio. Los fragmentos de ADN marcadores de tamaños
tenían una longitud que variaba desde 24 hasta 726 pares de bases
(marcador de ADN de \lambdaX174/Hinf I de Promega, Madison, WI,
EE.UU.). Así, las muestras probadas incluyeron cuatro melanomas
metastáticos, músculo, piel normal, un control negativo (sin la
transcriptasa inversa) y el marcador de tamaños de ADN de
\lambdaX174/Hinf I. Los resultados del análisis de la
RT-PCR para el VEGF-B (longitudes de
productos de PCR de 323 y 234 pb) y para la
\lambda-actina muestran que el
VEGF-B se expresa altamente en todos los melanomas
estudiados, a niveles aproximadamente similares a la expresión en el
tejido muscular. Por otra parte, la piel normal tiene muy poco del
ARN de VEGF-B. Se pueden sacar conclusiones
similares a partir de transferencias de Northern y análisis de la
hibridación.
Los resultados anteriores indican que el
VEGF-B es un novedoso factor de crecimiento para las
células endoteliales que desempeña un papel en la vascularización,
en particular del músculo. Se podría estimular el crecimiento de
arterias colaterales en el corazón o el miembro isquémicos por
administración arterial de un bolus de VEGF-B
mediante el uso de técnicas descritas por Takeshita y col., Am.
J. Pathol., 147:1649-60 (1995). La asociación
del VEGF-B a las células podría tener varias
consecuencias para la regulación de la vascularización y el
crecimiento de las células endoteliales. En los embriones en
desarrollo y en los tejidos contráctiles, puede que el
VEGF-B asociado a las células proporcione
indicaciones espaciales a las células endoteliales en extensión
durante el establecimiento y el mantenimiento del árbol vascular.
También puede que, a través de su asociación a las células, sirva
de soporte para la regeneración del endotelio dañado en los vasos
adultos. La regeneración del endotelio de una lesión arterial podría
estimularse por la aplicación directa del VEGF-B
mediante el uso de técnicas descritas por Asahara y col.,
Circulation, 91(11):2793-802 (1995).
La capacidad del VEGF-B para modular la secreción
del VEGF por la formación de heterodímeros sugiere un papel
indirecto para el VEGF-B en la señalización por el
VEGF, regulando de este modo la activación y/o la unión al receptor
como lo describe Potgens y col., J. Biol. Chem.,
269(52):32879- 85 (1994). La formación de múltiples
complejos heterodiméricos de estos factores de crecimiento podría
proporcionar una base para un conjunto variado de señales
reguladoras para las células endoteliales.
Se puede usar el VEGF-B como
factor de crecimiento para poblaciones de células endoteliales
in vitro. Se puede usar el VEGF-B para
estimular una angiogénesis conveniente, es decir la formación de
nuevos vasos y capilares sanguíneos; véase Takeshita y col.,
supra. Por ejemplo, podría ser útil en la estimulación del
desarrollo del cuerpo lúteo y del endometrio como ayuda para iniciar
y/o mantener la gestación. También sería útil en la reparación ósea
en virtud de su efecto sobre las células endoteliales. La
administración de VEGF-B podría también ser útil
para ayudar a la embriogénesis, así como al crecimiento somático y
el desarrollo y la diferenciación vascular. La aplicación tópica de
VEGF-B a heridas podría ser útil para estimular la
curación de las heridas, y la administración oral de
VEGF-B podría ser útil para acelerar la curación de
úlceras gástricas y/o duodenales. La capacidad del
VEGF-B para modular la secreción del VEGF por la
formación de heterodímeros podría proporcionar un papel terapéutico
para el VEGF-B en enfermedades en las que serían
útiles agonistas del VEGF; véase Potgens y col., supra.
El VEGF-B puede ejercer efectos
proliferativos sobre las células mesodérmicas bien directamente o a
través de mejorías en el suministro de sangre.
Se encontró que el VEGF-B se
sobreexpresaba en tumores tales como los melanomas. Por
consiguiente, se pueden usar ensayos para la expresión del
VEGF-B como herramientas en el diagnóstico de
tumores, y puede que la supresión de la expresión de
VEGF-B, por ejemplo con anticuerpos monoclonales,
sea útil para retrasar el crecimiento tumoral.
Puede que los ensayos de tumores para el
VEGF-B sean útiles como indicadores del riesgo de
metástasis. Por ejemplo, el uso de anticuerpos contra el
VEGF-B de forma análoga a los procedimientos
descritos por Takahashi y col., Cancer Res.,
55:3964-68 (1995) para cuantificar la
neovascularización y la proliferación se podría usar como un
indicador del riesgo metastático de un cáncer de colon. Los ensayos
de VEGF-B en los fluidos corporales o el tumor
mismo por histoquímica podrían ser útiles como factores pronósticos
de tumores. Un ELISA análogo al procedimiento descrito por Kondo y
col., Biochemica et Biophysica Acta,
1221(2):211-14 (1994) podría ser útil para
detectar la regulación desde arriba por el VEGF-B
como cribado de tumores. Un ensayo inmunoabsorbente conjugado a
enzimas de la expresión del VEGF-B que use técnicas
descritas por Boocock y col., J. Natl. Cancer Inst.,
87:506-16 (1995) podría ser útil como índice
diagnóstico del cáncer de ovarios. Un ensayo de la expresión del
VEGF-B parecido al ensayo para el VEGF descrito por
Weindel y col., Neurosurgery, 35:439-48 (1994)
podría ser útil como indicador de malignidad en los tumores
cerebrales.
Además, puesto que el crecimiento tumoral
requiere angiogénesis, la administración de VEGF-B
podría ser útil también para estimular el crecimiento tumoral en
animales de laboratorio para probar fármacos
anti-oncogénicos. El VEGF-B podría
ser útil también para aumentar la microvascularización de las
regiones hipóxicas de los tumores y volverlos más sensibles a las
radiaciones, a fármacos que sensibilizan a las radiaciones, etc.
La acción angiogénica del VEGF-B
podría ser útil para tratar estados isquémicos. La administración
de un bolus intraarterial de VEGF-B por las técnicas
descritas en el documento de Bauters y col., American Journal of
Physiology, 267(4 Pt
2):H1263-71(1994) podría ser útil para tratar
la isquemia de las extremidades inferiores y aumentar la perfusión
en las extremidades. Mediante el uso de procedimientos descritos por
Mesri y col., Circulation Research,
76:161-67 (1995) se podría producir una respuesta
angiogénica en los tejidos a los que se inyectan células de
fibroblasto transducidas con un virus que expresa el
VEGF-B para tratar la isquemia de los tejidos (por
ejemplo, la isquemia del miocardio). Se podrían usar el
VEGF-B o agonistas para estimular el desarrollo de
la circulación colateral en los casos de obstrucción arterial y/o
venosa, por ejemplo, infartos de miocardio, miembros isquémicos,
trombosis venosas profundas, y/o problemas vasculares posparto;
véase Takeshita y col., supra.
Se podría usar un sistema
VEGF-B/receptor para VEGF-B como
sistema de ensayo para detectar pequeñas moléculas tales como
agonistas/antagonistas para su desarrollo como nuevos fármacos. Los
ejemplos de pequeñas moléculas que se podrían detectar incluyen,
pero no se restringen a, productos químicos orgánicos, péptidos, y
moléculas de ARN.
Se podrían producir composiciones farmacéuticas
por mezcla de una cantidad farmacéuticamente eficaz de proteína
VEGF-B con uno o más vehículos o adyuvantes
adecuados tales como el agua, aceite mineral, polietilenglicol,
almidón, talco, lactosa, espesantes, estabilizadores, agentes de
suspensión, etc. Tales composiciones podrían estar en forma de
soluciones, suspensiones, comprimidos, cápsulas, cremas, pomadas,
ungüentos, u otras formas convencionales.
Como se mostró en el ejemplo 7, la proteína
VEGF-B puede usarse también para producir
anticuerpos. Por lo general, se pueden usar técnicas de producción
de anticuerpos convencionales para producir anticuerpos contra el
VEGF-B. Por ejemplos, se podrían producir
anticuerpos monoclonales específicos por inmunización con proteínas
de fusión obtenidas por expresión de ADN recombinante.
Los anticuerpos monoclonales marcados, en
particular, deberían se útiles para el cribado para estados
asociados con niveles anormales de VEGF-B en el
cuerpo. Por ejemplo, un ensayo de VEGF-B en los
fluidos sinoviales y/o en los tejidos articulares por técnicas
inmunofluorométricas análogas al procedimiento descrito por Fava y
col., Journal of Experimental Medicine,
180:341-46 (1994) podría ser útil como indicador
diagnóstico del reuma articular. Un radioinmunoanálisis de
VEGF-B en el fluido ocular mediante el uso de
técnicas descritas por Aiello y col., en New England Journal of
Medicine, 331(22):1480-87 (1994) podría
ser útil como indicador diagnóstico de la retinopatía diabética, la
neovascularización del iris o la oclusión de la vena retiniana. Los
inmunoanálisis de los niveles de VEGF-B en la
sangre, la orina u otros fluidos corporales podrían ser útiles
también como marcadores tumorales; véase Kondo y col., supra.
Estos anticuerpos monoclonales contra el VEGF-B
podrían ser útiles también para inhibir la angiogénesis asociada
con altos niveles de VEGF-B en el cuerpo, por
ejemplo, en tumores en rápida proliferación que dependen de
angiogénesis en mamíferos, y podrían retrasar así el crecimiento de
tales tumores. El tratamiento con un anticuerpo monoclonal
específico para el VEGF-B mediante el uso de
técnicas análogas a las descritas por Kim y col., en Nature,
362(6243):841-44 (1993) podría ser útil para
suprimir o inhibir el crecimiento tumoral in vivo. La inyección
intravenosa y/o subcutánea de anticuerpos monoclonales contra el
VEGF-B mediante el uso de procedimientos tales como
los descritos por Asano y col., en Cancer Research,
55:5296-5301 (1995) podría ser útil para inhibir la
neovascularización y el crecimiento primario y metastático de
tumores sólidos. Para la terapia de humanos, es preferible
quimerizar o humanizar tales anticuerpos monoclonales. El
tratamiento se puede llevar a cabo, por ejemplo, por dos
inyecciones intraperitoneales semanales de 10 a 500 \mug,
preferiblemente 50-100 \mug de anticuerpo
monoclonal.
Los antagonistas del VEGF-B tales
como anticuerpos podrían ser útiles también para inhibir nuevos
vasos sanguíneos en la retinopatía diabética, la psoriasis, las
artropatías y/o los tumores vasculares tales como los hemangiomas;
véase Aiello y col., supra.
(1) INFORMACIONES GENERALES:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: ERIKSSON, Ulf
\hskip3.3cmOLOFSSON, Birgitta
\hskip3.3cmALITALO, Kari
\hskip3.3cmPAJUSOLA, Katri
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: FACTOR DE CRECIMIENTO ENDOTELIAL VASCULAR B Y ADN QUE CODIFICA EL MISMO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 31
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Evenson, McKeown, Edwards & Lenahan
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 1200 G Street, N.W., Suite 700
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Washington
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: DC
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EEUU
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 20005
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible IBM
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE LA SOLICITUD: US
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 01-MAR-1996
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE LA SOLICITUD: US 08/397.651
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 01-MAR-1995
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE LA SOLICITUD: US 08/469.427
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 06-JUN-1995
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE LA SOLICITUD: US 08/569.063
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 06-DIC-1995
\vskip0.666000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: EVANS, Joseph D
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 26.269
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/RESGUARDO: 1064/41979PCT
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (202) 628-8800
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (202) 628-8844
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 886 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: embrión de ratón
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: pcif2
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:1:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 102 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: embrión de ratón
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:2:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 55 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: embrión de ratón
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:3:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 565 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: corazón de ratón adulto
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:4:
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:5:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 188 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: corazón de ratón adulto
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:5:
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:6:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 591 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: corazón de ratón adulto
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:6:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:7:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 195 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: corazón de ratón adulto
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:7:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:8:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 405 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:8:
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:9:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 133 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:9:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:10:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 570 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: fibrosarcoma humano
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:10:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:11:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 188 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: fibrosarcoma humano
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:11:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:12:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 624 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: ratón
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:12:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:13:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 207 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: ratón
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:13:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:14:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 624 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: humano
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:14:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:15:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 207 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: humano
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:15:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:16:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:16:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Xaa Cys Val Xaa Xaa Arg Cys Xaa Gly Cys
Cys}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:17:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1550 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:17:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:18:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCACCATGAGC CCTCTGCTCC
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:19:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGCCATGTGTC ACCTTCGCAG
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:20:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGGGCATCAGG CTGGGAGACA G
\hfill21
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:21:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:21:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Pro Val Ser Gln Phe Asp Gly Pro Ser Hits
Gln Lys Lys Val Val Pro Cys}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:22:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:22:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His Gln Arg Lys
Val Val Ser Trp Ile}
\sac{Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:23:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCACAGCCAAT GTGAATGCA
\hfill19
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:24:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGCTCTAAGCC CCGCCCTTGG CAATGGAGGA A
\hfill31
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:25:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:25:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipACGTAGATCT TCACTTTCGC GGCTTCCG
\hfill28
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:26:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCTCTGTTCCG GGCTGGGACT CTA
\hfill23
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:27:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTCAGGGCGTT GACGGCGCTG GGTGCAA
\hfill27
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:28:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCCTGACGATG GCCTGGAGTG T
\hfill21
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:29:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTGTCCCTGGA AGAACACAGC C
\hfill21
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:30:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCGGGAAATCG TGCGTGACAT
\hfill20
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:31:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGGAGTTGAAG GTAGTTTCGT G
\hfill21
Claims (63)
1. Un ácido nucleico aislado que se escoge de
entre:
- i)
- SEC ID Nº: 1; SEC ID Nº: 4; SEC ID Nº: 6; SEC ID Nº: 8; SEC ID Nº: 10; SEC ID Nº: 12; SEC ID Nº: 14; y
- ii)
- secuencias que:
- a)
- hibridan en condiciones restrictivas con las secuencias en (i)
- b)
- codifican una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos característica
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Pro-Xaa-Cys-Val-Xaa-Xaa-Xaa-Arg-Cys-Xaa-Gly-Cys-Cys
\+ (SEC ID Nº:16);
y\cr}
- c)
- codifican una proteína que tiene la propiedad de estimular la proliferación de las células endoteliales o las células mesodérmicas.
2. Un ácido nucleico según la reivindicación 1,
en el que dicho ácido nucleico es un ADNc.
3. Un ácido nucleico según la reivindicación 1 ó
2 que comprende un ADNc que corresponde al ADN de las figuras 1 y 2
(SEC ID Nº: 1).
4. Un ácido nucleico según cualquiera de las
reivindicaciones 1-3 en el que dicha secuencia de
ácido nucleico es un ADN de mamífero.
5. Un ácido nucleico según la reivindicación 4,
en el que dicho ácido nucleico es un ADN de ratón.
6. Un ácido nucleico según la reivindicación 4,
en el que dicho ácido nucleico es un ADN humano.
7. Un ácido nucleico según cualquiera de las
reivindicaciones 1-6 en el que dicho ácido nucleico
codifica una proteína que estimula la proliferación de las células
endoteliales vasculares.
8. Un ácido nucleico según la reivindicación 1,
que comprende un ADNc que corresponde al ADN de la SEC ID Nº: 4.
9. Un ácido nucleico según la reivindicación 1,
que comprende un ADNc que corresponde al ADN de la SEC ID Nº: 6.
10. Un ácido nucleico según la reivindicación 1,
que comprende un ADNc que corresponde al ADN de la SEC ID Nº: 8.
11. Un ácido nucleico según la reivindicación 1,
que comprende un ADNc que corresponde al ADN de la SEC ID Nº:
10.
12. Un ácido nucleico según la reivindicación 1,
que comprende un ADNc que corresponde al ADN de la SEC ID Nº:
12.
13. Un ácido nucleico según la reivindicación 1,
que comprende un ADNc que corresponde al ADN de la SEC ID Nº:
14.
14. Un vector que comprende un ácido nucleico
según cualquiera de las reivindicaciones 1-13 unido
de manera funcional con una secuencia promotora.
15. Un vector según la reivindicación 14, en el
que dicho vector es un vector de eucariotas.
16. Un vector según la reivindicación 14, en el
que dicho vector es un vector de procariotas.
17. Un vector según la reivindicación 14, en el
que dicho vector es un plásmido.
18. Una proteína aislada que exhibe una secuencia
característica
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Pro-Xaa-Cys-Val-Xaa-Xaa-Xaa-Arg-Cys-Xaa-Gly-Cys-Cys
\+ (SEC ID
Nº:16)\cr}
y tiene la propiedad de estimular la
proliferación de las células endoteliales o las células
mesodérmicas, comprendiendo dicha proteína una secuencia de
aminoácidos que corresponde a una secuencia de aminoácidos que se
escoge de entre el grupo que está formado por la secuencia de
aminoácidos de la figura 1 (SEC ID Nº: 2), la secuencia de
aminoácidos de la figura 2 (SEC ID Nº: 3), la secuencia de
aminoácidos de la figura 4 (SEC ID Nº: 5), la secuencia de
aminoácidos de la figura 6 (SEC ID Nº: 7), la secuencia de
aminoácidos de la figura 8 (SEC ID Nº: 9), la secuencia de
aminoácidos de la figura 11 (SEC ID Nº: 11), la secuencia de
aminoácidos de la figura 13 (SEC ID Nº: 13), y la secuencia de
aminoácidos de la figura 15 (SEC ID Nº:
15).
19. Una proteína aislada según la reivindicación
18, en la que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos
que corresponde a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº:
2.
20. Una proteína aislada según la reivindicación
18, en la que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos
que corresponde a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº:
3.
21. Una proteína aislada según la reivindicación
18, en la que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos
que corresponde a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº:
5.
22. Una proteína aislada según la reivindicación
18, en la que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos
que corresponde a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº:
7.
23. Una proteína aislada según la reivindicación
18, en la que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos
que corresponde a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº:
9.
24. Una proteína aislada según la reivindicación
18, en la que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos
que corresponde a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº:
11.
25. Una proteína aislada según la reivindicación
18, en la que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos
que corresponde a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº:
13.
26. Una proteína aislada según la reivindicación
18, en la que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos
que corresponde a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº:
15.
27. Una proteína aislada según cualquiera de las
reivindicaciones 18-26, en la que dicha proteína es
una proteína de mamífero.
28. Una proteína aislada según la reivindicación
27, en la que dicha proteína es una proteína de ratón.
29. Una proteína aislada según la reivindicación
27, en la que dicha proteína es una proteína humana.
30. Una proteína aislada según cualquiera de las
reivindicaciones 18-29, en la que dicha proteína
estimula la proliferación de las células endoteliales
vasculares.
31. Una proteína aislada producida por expresión
de una ADN escogido de entre el grupo que está formado por el ADN
de las figuras 1 y 2 (SEC ID Nº: 1), el ADN de la figura 3 (SEC ID
Nº: 4), el ADN de la figura 5 (SEC ID Nº: 6), el ADN de la figura 7
(SEC ID Nº: 8), el ADN de la figura 10 (SEC ID Nº: 10), el ADN de la
figura 12 (SEC ID Nº: 12), el ADN de la figura 14 (SEC ID Nº: 14), y
ADN que hibridan en condiciones restrictivas con por lo menos una de
las secuencias de ADN precedentes.
32. Una composición farmacéutica que comprende
una proteína según las reivindicaciones 18-30, y por
lo menos un vehículo o diluyente farmacéutico convencional.
33. Un anticuerpo que se une con una proteína
según las reivindicaciones 18-30 en el que dicho
anticuerpo no se une al VEGF-2.
34. Un anticuerpo según la reivindicación 33, en
el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
35. Una célula huésped transformada o a la que se
realizó una transfección con un vector según la reivindicación 14,
tal que dicha célula huésped expresa una proteína que tiene la
propiedad de estimular la proliferación de las células endoteliales
o mesodérmicas.
36. Una célula huésped a la que se realizó una
transfección según la reivindicación 35, en la que dicha célula
huésped es una célula eucariota.
37. Una célula huésped a la que se realizó una
transfección según la reivindicación 35 ó 36, en la que dicha
célula huésped es una célula COS.
38. Una célula huésped transformada según la
reivindicación 35, en la que dicha célula huésped es una célula
procariota.
39. Una célula huésped transformada según la
reivindicación 35, en la que dicha célula huésped es una célula
293EBNA.
40. Una célula huésped transformada según la
reivindicación 35 ó 36, en la que dicha célula huésped es una
célula de insecto.
41. Un procedimiento de diagnóstico para detectar
cuantitativamente una proteína según cualquiera de las
reivindicaciones 18-29 en una muestra de prueba,
comprendiendo dicho procedimiento un anticuerpo según la
reivindicación 33 ó 34, que se une con dicha proteína para detectar
la cantidad de dicha proteína en la muestra.
42. Un procedimiento de diagnóstico según la
reivindicación 41, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo
marcado.
43. Un procedimiento de diagnóstico para detectar
un ácido nucleico en una muestra de prueba, comprendiendo dicho
procedimiento por lo menos un par de cebadores adaptados para unirse
específicamente a una secuencia de ácido nucleico según cualquiera
de las reivindicaciones 1-13, y la amplificación de
dicho ácido nucleico de prueba por una reacción en cadena de la
polimerasa.
44. Un procedimiento de diagnóstico según la
reivindicación 43 en el que dicha reacción en cadena de la
polimerasa facilita una comparación de secuencias de un ácido
nucleico en una muestra de prueba con un ácido nucleico según
cualquiera de las reivindicaciones 1-13.
45. Una composición farmacéutica que comprende
anticuerpos según la reivindicación 33 ó 34, y por lo menos un
vehículo o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
46. Una composición farmacéutica que comprende
una proteína según cualquiera de las reivindicaciones
18-30, y el VEGF.
47. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 46, que comprende además heparina.
48. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 32, que comprende además heparina.
49. Una composición farmacéutica que comprende
una proteína según cualquiera de las reivindicaciones
18-30.
50. Un dímero proteico aislado que comprende una
proteína según cualquiera de las reivindicaciones
18-30.
51. Un dímero proteico aislado según la
reivindicación 50, en el que dicho dímero proteico es un homodímero
de dicha proteína.
52. Un dímero proteico aislado según la
reivindicación 50, en el que dicho dímero proteico es un
heterodímero de dicha proteína y el VEGF.
53. Un dímero proteico aislado según la
reivindicación 50, en el que dicho dímero proteico es un dímero con
enlaces disulfuro.
54. Un procedimiento in vitro para
estimular la liberación de por lo menos una proteína escogida de
entre el grupo que está formado por proteínas según cualquiera de
las reivindicaciones 18-30, desde una célula que
expresa dicha por lo menos una proteína, dicho procedimiento
comprendiendo la exposición de la célula a la heparina.
55. Un vector que comprende una secuencia
nucleotídica antisentido complementaria de por lo menos parte de
una secuencia de ácido nucleico según cualquiera de las
reivindicaciones 1-13.
56. Un procedimiento in vitro para
retrasar la expresión de una proteína según cualquiera de las
reivindicaciones 18-29 a partir de una célula que
expresa dicha proteína, comprendiendo dicho procedimiento la
transfección de dicha célula con un vector según la reivindicación
55.
57. Un procedimiento según la reivindicación 56,
en el que dicha célula es una célula tumoral.
58. Un ácido nucleico aislado que comprende una
secuencia nucleotídica que corresponde a la secuencia de la SEC ID
Nº: 17, o un ácido nucleico que hibrida en condiciones restrictivas
con dicha secuencia nucleotídica.
59. Una célula huésped transformada o sometida a
transfección con un vector de expresión que comprende una secuencia
de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones
1-13, de tal manera que dicha célula huésped exprese
una proteína según cualquiera de las reivindicaciones
18-29.
60. Una célula huésped según la reivindicación
59, en la que dicha proteína comprende una secuencia de aminoácidos
que corresponde a una secuencia de aminoácidos que se escoge de
entre el grupo que está formado por la secuencia de aminoácidos de
la figura 1 (SEC ID Nº: 2), la secuencia de aminoácidos de la
figura 2 (SEC ID Nº: 3), la secuencia de aminoácidos de la figura 4
(SEC ID Nº: 5), la secuencia de aminoácidos de la figura 6 (SEC ID
Nº: 7), la secuencia de aminoácidos de la figura 8 (SEC ID Nº: 9),
la secuencia de aminoácidos de la figura 11 (SEC ID Nº: 11), la
secuencia de aminoácidos de la figura 13 (SEC ID Nº: 13), y la
secuencia de aminoácidos de la figura 15 (SEC ID Nº: 15).
61. Una prueba de diagnóstico que consiste en una
reacción en cadena de la polimerasa para detectar un ácido nucleico
en una muestra de prueba, comprendiendo dicha reacción por lo menos
un par de cebadores complementarios de una secuencia de ácido
nucleico según cualquiera de las reivindicaciones
1-13.
62. Un procedimiento in vitro para
estimular la liberación de por lo menos una proteína escogida de
entre el grupo que está formado por proteínas según las
reivindicaciones 18-30, y el VEGF a partir de una
célula que expresa dicha por lo menos una proteína, comprendiendo
dicho procedimiento la exposición de la célula a la heparina para
inducir la liberación de dicha por lo menos una proteína.
63. Un procedimiento para adecuar un vector para
la expresión de una proteína según cualquiera de las
reivindicaciones 18-29, comprendiendo dicho
procedimiento la incorporación de una secuencia nucleotídica según
cualquiera de las reivindicaciones 1-13.
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