ES2202537T3 - Uso de sangre congelada para procedimientos biologicos de examen. - Google Patents

Abstract

UNOS PREPARADOS QUE CONTIENEN SANGRE SOBRECONGELADA SON UTILIZADOS EN PROCEDIMIENTOS DE ANALISIS PARA DETERMINAR EL GRADO DE RESPUESTA DE LA SANGRE.

Description

Uso de sangre congelada para procedimientos biológicos de examen.

La invención se encuentra en el ámbito del uso de sistemas biológicos para exámenes. Desde hace mucho tiempo se usan en considerable medida sistemas biológicos para exámenes, poniendo en contacto los materiales que han de examinarse, es decir, los objetos, las sustancias o los agentes que han de examinarse, con el sistema biológico y averiguando luego la respuesta del sistema, lo que también puede ser una falta de respuesta, de forma cualitativa y/o cuantitativa y evaluándola. Tales procedimientos son muy usuales en dermatología, donde para llevar a cabo tal procedimiento biológico de examen se usa la piel de voluntarios o preparados de piel y, en contacto con un material que se ha de examinar, se determina la respuesta de la piel o del preparado de piel. Se usan huevos de gallina incubados para determinar irritaciones de mucosas, se usan materiales de matadero de todo tipo como sistemas biológicos para los más diversos exámenes.

La presente invención se refiere al campo especial del uso de sangre como sistema biológico de examen. Por ejemplo, es conocido que muchos materiales que entran en contacto con tejido, líquidos corporales y células humanas pueden activar o hiperactivar de manera dañina el sistema inmunitario, en parte, porque en sí son estimulantes de la inmunidad, en parte, porque contienen agentes estimulantes de la inmunidad, como los pirógenos, que producen fiebre. A los materiales con tal potencial de peligro pertenecen especialmente los medicamentos, ante todo, productos inhalables, inyectables e infundibles, incluyendo materiales suplentes de la sangre y de intercambio de sangre, plásticos en diversos estados de agregación, formas y fines, incluyendo dispersiones y materiales como membranas y prótesis, así como productos aislados de sustancias naturales, inclusive de plantas, animales y seres humanos, o sus cultivos de células y tejidos, productos aislados como vacunas, medicamentos y productos para terapia genética. Materiales que en contacto con tejido, células o líquidos corporales humanos originan una liberación de factores desde los leucocitos, como citocinas del organismo, se denominan inmunoactivantes, en sentido más estrecho, pirógenos, cuando los factores liberados pueden ocasionar una reacción térmica en el organismo. La seguridad del producto, por ejemplo en el ámbito farmacéutico, es una necesidad indispensable y por ello hace necesarios exámenes individuales constantes en animales de experimentación, para reconocer también lotes excepcionalmente contaminados. Por ello, en lugar de los ensayos en conejos para detectar pirógenos, que están indicados en las diferentes farmacopeas, o del ensayo con lisado de amebocitos de limulus (LAL), que sin embargo sólo detecta una parte de los pirógenos/inmunoactivantes, a saber, las endotoxinas de las bacterias Gram-negativas, los mismos inventores antes ya han descrito un procedimiento (Patente Europea 0741294 A2, Hartung und Wendel, ALTEX 12, págs. 70-75, 1995) en el que de forma sencilla, económica y con un gran alcance se ponen en contacto sangre o preparaciones de sangre como sistema biológico, con el material que ha de examinarse y se mide la liberación de citocinas, por ejemplo, factores de leucocitos como interleuquina 1 (IL-1\beta) que median la producción de fiebre en el organismo (pirógenos endógenos). Pero no pocas veces, de manera muy general, en casos en los que se necesita sangre entera como sistema biológico para el examen, se necesita muy pronto la respuesta sanguínea, de manera que el examen del material que se ha de examinar debe realizarse sin demora, por lo menos, iniciarlo en el transcurso de pocas horas. No queda tiempo para un ensayo de la capacidad de reacción de la sangre entera fresca que se usa, de manera que no se puede excluir con la seguridad necesaria un resultado falseado con consecuencias peligrosas o la inutilidad de los resultados, como consecuencia de una sangre de un ser humano donador con reacciones anormales, por ejemplo, debido a variaciones genéticas, enfermedades o hábitos de vida. Como en el caso ejemplar antes mencionado del examen de lotes de producción farmacéutica, por el peligro del transporte o el almacenamiento inadecuados con frecuencia es necesario un examen del material antes de su uso, no siendo posible una suficiente fiabilidad de una comparación con resultados anteriores de ensayo por los motivos antes mencionados, cuando se usa sangre como sistema biológico.

Por lo tanto, uno de los objetivos de la invención consiste en asegurar un transcurso reproducible, exento de perturbaciones, cuando se usa sangre como sistema biológico para exámenes, excluir la posibilidad de resultados falseados debidos a reacciones anormales e indicar una vía que permita la comparabilidad de los resultados de examen del mismo material examinado. Se debe posibilitar el examen repetido estandarizado, en distintos lugares y en distintos momentos. Otros objetivos resultan de las demás ventajas que se hacen valer.

Se logra alcanzar el objetivo planteado por el uso de sangre o preparaciones de sangre humana o animal congeladas que contienen agentes criopreservantes, para un procedimiento biológico de examen para determinar la respuesta sanguínea después del contacto de la sangre descongelada o la preparación de sangre descongelada con el material que se ha de examinar y de la incubación.

El uso de sangre congelada o una preparación que contiene tal sangre posibilita la disponibilidad en cualquier momento de una sangre antes analizada y con ello exenta de reacciones anormales, como sistema biológico, por lo menos una capacidad de estandarización y con ello el uso de un reactivo estandarizado. Pudiendo prepararse uniformemente una gran cantidad de unidades idénticas congeladas a partir de un lote de sangre, se puede cumplir con la exigencia de reproducibilidad en distintos momentos en distintos lugares, aparte de que además una caracterización de tal lote con datos relevantes para el examen también abre vías para comparaciones con resultados de examen cuando se usa otro lote de sangre, también caracterizado de manera suficiente. Del documento US-A-4731330 se conoce un polvo patrón para calibrar los dispositivos. Pero aparte de la diferencia de tarea y solución, este material desnaturalizado para calibrar no sirve para el uso conforme a la invención.

Para la sangre congelada demostró ser apropiada sangre entera animal o humana, sin separar componentes individuales, especialmente sangre recién obtenida de donadores humanos sanos. Los componentes individuales, incluyendo los leucocitos, así se encuentran en su entorno natural, incluyendo todos los componentes del suero, que posiblemente influyan
sobre el efecto del material que ha de examinarse. Por eso el uso de sangre entera congelada es ampliamente preferido, aunque no esté excluido el uso de leucocitos aislados de sangre. Sin embargo, la mayoría de los procedimientos de aislamiento son muy costosos para un análisis de rutina, de manera que el uso de sangre entera es más sencillo y es más seguro para el informe deseado y da un informe más preciso por la posibilidad de la influencia de interacciones de los otros componentes de la sangre.

De cualquier manera, en cada caso, para llevar a cabo el procedimiento biológico de examen se debe descongelar el producto congelado. Se pone en contacto el material que se ha de examinar con la sangre o sus preparaciones, durante el tiempo que sea necesario y de tal manera como sea necesario, para lograr una respuesta suficiente de la sangre; pueden ser suficientes tiempos de contacto de algunos segundos o minutos, sin excluir tiempos de contacto de varias horas. Se puede usar toda forma de contacto apropiada para lograr el objetivo indicado precedentemente, por ejemplo, en el caso de objetos, la inmersión, el lavado o el escurrido, en el caso de soluciones, dispersiones, cultivos y sustancias sólidas, el mezclado con la sangre o la adición de o a la sangre o las preparaciones de sangre, y similares. Para averiguar la respuesta sanguínea, regularmente después de la incubación de la sangre o de la preparación de sangre, también de corta duración, después del contacto con el material que se ha de examinar, pueden usarse los procedimientos biológicos, físicos, químicos y/o fisicoquímicos usuales de determinación y medición. A éstos pertenecen ensayos biológicos y procedimientos RIA (radioinmunoensayos), preferentemente procedimientos espectrométricos, todos los procedimientos que sirvan para la medición cualitativa y cuantitativa de sustancias liberadas o formadas, como ELISA, además procedimientos turbidimétricos, de quimioluminiscencia, etc.

Las preparaciones con sangre congelada o también de leucocitos, pueden contener diluyentes, componentes anticoagulantes, criopreservantes, y otros aditivos en sí conocidos, mientras no influyan en el resultado del examen. Como diluyentes demostraron ser apropiadas soluciones isotónicas, como solución isotónica de cloruro de sodio, solución de Ringer y medios de cultivo de células como RMPI 1640. Es conveniente adicionar los diluyentes en el momento de efectuar el ensayo, durante o después de la descongelación, por ejemplo, a 37ºC. Los diluyentes pueden estar contenidos, por ejemplo, en cantidades de
5-95% en volumen en la preparación total. Con frecuencia se usa una dilución de 1:10 partes en

\hbox{volumen.}

Para la preparación del reactivo de sangre congelada se adicionan criopreservantes a la sangre o la preparación de sangre, dado el caso, se fracciona de manera apropiada y se congela. Como tales soluciones criopreservantes son apropiadas soluciones orgánicas, soluciones inorgánicas, también con contenido de sales o sus mezclas en proporciones variables. Así, por ejemplo, demostró ser especialmente apropiado el uso de dimetilsulfóxido al 10% solo o de glicol o glicerina solos o en mezclas uno con otro o con dimetilsulfóxido. Una congelación lenta dirigida, por ejemplo, con un descenso de -1ºC por minuto es ventajosa. Demostró ser apropiado un almacenamiento de la
sangre congelada a -70ºC en el congelador, o también el uso de gases condensados o sólidos, como nitrógeno líquido o hielo seco. Este último es especialmente apropiado para el transporte.

Los componentes anticoagulantes pueden estar tanto contenidos en la preparación congelada, como también pueden adicionarse durante y después de descongelar y durante la realización del procedimiento de examen, por ejemplo, durante una posible incubación.

Ejemplos de anticoagulantes apropiados son citrato de sodio, por ejemplo, en una concentración final de 0,38% en peso o heparina, como heparina sódica, fracciones de heparina y similares.

El uso conforme a la invención de preparaciones que contienen sangre congelada, incluyendo sangre congelada o leucocitos congelados, se efectúa con especial ventaja para el examen de materiales, como los objetos, sustancias y agentes ya descritos al principio, para detectar efectos inmunoestimulantes o inmunomoduladores o para la determinación cualitativa y/o cuantitativa de efectos inmunorrelevantes, averiguando, determinando o evaluando la respuesta sanguínea por contacto de estos materiales que se han de examinar con la sangre o la preparación de sangre congelada que se ha descongelado.

Además de efectos inmunoestimulantes, por ejemplo, efectos pirógenos, los materiales pueden modular la activación subsiguiente del sistema inmunológico, lo que es deseado en la terapéutica inmunológica, pero con frecuencia también es un efecto tóxico indeseado. Tal efecto se debe buscar selectivamente para el hallazgo inmunofarmacológico de principios activos, pero en muchas otras sustancias se debe excluir. Por un lado, los inmunoestimulantes son de interés terapéutico para la terapia de inmunodeficiencia absoluta o relativa y, por el otro lado, lo son los inmunosupresores y antiinflamatorios, incluyendo los antiflogísticos, antirreumáticos, antialérgicos. Los efectos inmunotoxicológicos de materiales, por ejemplo, sustancias, sólo en los últimos años han llegado de forma creciente al conocimiento público. Para el examen inmunofarmacológico, así como inmunotoxicológico, de sustancias hasta ahora no existen sistemas de ensayo estandarizados. Sin embargo, se usa de forma creciente la sangre entera estimulada para ensayos científicos para caracterizar propiedades farmacológicas de principios activos [Hartung y col., Blood (Sangre) 85 (1995) 2482-2489].

Justamente también en el examen para detectar efectos inmunorrelevantes, como en la determinación de pirógenos, inmunomoduladores e inmunotoxinas, el problema central del uso de sangre y su liberación de factores es la estandarización de la sangre usada.

También aquí las preparaciones de sangre antes mencionadas, como sangre entera, dado el caso, pueden usarse diluidas, por ejemplo, con medios de cultivo para células, tampones o solución clínica de cloruro de sodio. Aquí con especial frecuencia se debe comenzar la realización del examen dentro de pocas horas, de manera que generalmente no es posible un examen previo para averiguar si es apropiado el material sanguíneo usado. De manera que especialmente se plantea el objetivo antes mencionado en el examen de materiales para detectar efectos inmunorrelevantes, como efectos pirógenos, inmunomoduladores o inmunotóxicos y se debe posibilitar el examen previo de la sangre, así como la repetición del examen de un material en diferentes lugares y en diferentes momentos, con la misma sangre de ensayo. Esto se logra fiablemente mediante el uso conforme a la invención.

La particular ventaja de la invención consiste en la determinación de efectos y datos inmunológicos relevantes en el uso de un sistema biológico, que provee informes relevantes para la exposición del ser humano. Como parámetros en la medición sirven citocinas como los pirógenos endógenos interleuquina- 1\beta, interleuquina-6 y el factor de necrosis tumoral, eicosanoides como el pirógeno endógeno prostaglandina E2 u otras sustancias liberadas por leucocitos, como productos de desgranulación, receptores solubles, proteínas o sustancias de peso molecular bajo (véase también el documento EP 0741294 A2, haciéndose referencia a éste). Es notable que también en el presente procedimiento de uso no sólo los anticoagulantes citrato y heparina no influyen falseando el resultado, sino que también la conservación por congelación, incluyendo los criopreservantes mencionados, conduce a una sangre que después de descongelar no manifiesta ningún efecto desventajoso sobre el resultado de examen.

La invención presenta toda una serie de ventajas adicionales. Después de descongelar la sangre congelada, nuevamente se detectan reacciones propias del cuerpo de células inmunitarias nativas, en condiciones y proporciones de mezcla naturales.

Gracias a la conservación por congelación, se puede usar repetidamente la misma sangre en diversos momentos y en diversos lugares. Por ensayos previos correspondientes se pueden reconocer reacciones anormales de la sangre y se puede descartar el material correspondiente. Se pueden establecer de antemano normas en condiciones estandarizadas para el lote de sangre respectivo. Esto posibilita la realización del ensayo aún sin posibilidades inmediatas de extracción de sangre. No sólo se pueden detectar, por ejemplo, inmunoactivantes directos, sino que también se pueden detectar inmunomoduladores/inmunotoxinas por su modulación del efecto de un estímulo estándar como una endotoxina (lipopolisacárido de bacterias Gram-negativas). La invención también es apta para examinar terapias farmacológicas o exposiciones ex vivo, para lo que se obtiene sangre de pacientes, voluntarios o animales de ensayo correspondientes después de la administración, y se congela de manera correspondiente, por ejemplo, por criopreservación y sólo más tarde se ensaya, por ejemplo, la capacidad de reacción contra un estímulo estándar.

También es objeto de la invención el uso de dosis unitarias estandarizadas que contienen sangre o una preparación de sangre congelada que presenta criopreservantes para procedimientos biológicos de examen, para determinar la respuesta sanguínea después del contacto de la sangre o de la preparación de sangre descongelada con el material que ha de ser examinado y de la incubación.

Como sangre preferentemente se usa sangre entera fresca de donadores sanos animales o humanos que, dado el caso, después de adicionar criopreservantes, diluyentes y/o anticoagulantes, como los que están descritos anteriormente de manera ejemplar, se fracciona y se congela. La dosis unitaria generalmente contiene entre 50 y 500 microlitros, preferentemente 100 microlitros de sangre entera, sin limitarse a esto. Para llevar a cabo el procedimiento de examen se descongela la sangre congelada de una dosis unitaria, se lleva a un volumen deseado, por ejemplo, de 1 mililitro con diluyentes, por ejemplo, del tipo mencionado anteriormente, se pone en contacto con el material que ha de examinarse y se determina y se evalúa la respuesta sanguínea de manera usual. El volumen de sangre entera que usualmente se puede extraer de una vez a un dador humano sano permite la preparación de varios miles de tales dosis unitarias de, por ejemplo, 100 microlitros de sangre. Las dosis unitarias pueden hacerse entrar en circulación reunidas en paquetes colectivos de, por ejemplo, 5, 10 o más dosis unitarias, dado el caso, provistos de datos útiles para el procedimiento de examen, manteniendo la congelación. Los paquetes colectivos, para fines de uso especiales, además de unidades con dosis unitaria también pueden contener unidades con un múltiplo de la dosis

\hbox{unitaria.}

La respectiva dosis unitaria, por lo demás puede contener los mismos componentes y presentar la misma composición, así como estar preparada de igual manera y usarse de igual manera que las preparaciones que contienen sangre congelada, descritas
anteriormente.

Ejemplo

Inmediatamente después de la extracción se adicionó dimetilsulfóxido al 10% (Merck, Darmstadt) a sangre citratada de donadores sanos, se formaron alícuotas de 100 \mul respectivamente, en recipientes de reacción de 2 ml (Eppendorf, Hamburgo) y se transfirieron a sistemas comerciales de congelamiento (Mr. Freezy, Nalgene) en un congelador a -70ºC. El descongelamiento se efectúa en un termosacudidor (Eppendorf, Hamburgo) a 37ºC. Inmediatamente después de descongelar se adicionan respectivamente 900 \mul de RPMI 1640 (Gibco, Eggenstein) calentado a 37ºC. A continuación se adicionan las sustancias que han de examinarse, por ejemplo, diluciones de un pirógeno, aquí un lipopolisacárido de Salmonella abortus equi (Sigma, Deisenhofen). Después de incubar durante cuatro horas a 37ºC, por ejemplo, en la estufa de incubación (Heraeus, Fellbach), con 5% de dióxido de carbono, se sacuden las incubaciones, se centrifugan. En el sobrenadante exento de células, dado el caso, después de congelar, se determinan pirógenos endógenos, aquí IL-1\beta. La figura 1 muestra la formación de IL-1\beta, que depende de la cantidad adicionada de pirógenos, en la sangre criopreservada de cuatro donadores sanos. La cantidad de IL-1\beta fue medida mediante un ensayo ELISA (ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas) de anticuerpos de la empresa Pharmingen (Hamburgo). El ensayo muestra la liberación de pirógenos endógenos, en presencia de cantidades ínfimas de pirógenos.

Las figuras 2 y 3 muestran la liberación de IL-1, que depende de la cantidad respectiva adicionada de azatioprina o dexametasona, en sangre entera congelada, estimulada con LPS (lipopolisacárido).

Claims (8)

1. Uso de sangre humana y animal congelada, que contiene criopreservantes o de preparaciones de sangre que contienen la misma para un procedimiento biológico de examen para o con la determinación de la respuesta sanguínea después del contacto de la sangre descongelada, o la preparación de sangre descongelada con material que ha de examinarse y de la

\hbox{incubación.}

2. Uso conforme a la reivindicación 1, en el que como sangre se usa una preparación congelada que contiene leucocitos aislados de sangre.

3. Uso conforme a una de las reivindicaciones precedentes, en el que la preparación contiene anticoagulantes.

4. Uso conforme a una de las reivindicaciones precedentes para averiguar datos inmunorrelevantes.

5. Uso de sangre congelada que presenta criopreservantes o una preparación de sangre que contiene la misma en forma de dosis unitarias estandarizadas, para procedimientos biológicos de examen para o con la determinación de la respuesta sanguínea, después del contacto de la sangre o la preparación de sangre descongelada con material que ha de examinarse y de la incubación.

6. Uso de dosis unitarias estandarizadas conforme a la reivindicación 5, que además de las unidades respectivas con dosis unitaria estandarizada también contienen unidades con un múltiplo de la dosis
unitaria.

7. Uso conforme a las reivindicaciones 5 ó 6, en el que las preparaciones contienen anticoagulantes y/o diluyentes.

8. Uso conforme a una de las reivindicaciones precedentes para averiguar datos inmunorrelevantes.