JPH10267932A - 生物系による試験法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 生物系として標準化された血液を用いる再現
性のある生物学的試験法の提供。 【解決手段】 試験物質との接触に対する血液応答を求
めることを含む生物学的試験法に使用するためにヒト又
は動物急速冷凍血液又は急速冷凍血液を含む標品を使用
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野及び従来の技術】本発明は、試
験に使用するための生物系の使用に関する。生物系は、
長い間試験のためにかなり用いられてきた。それらの試
験においては、試験物質、即ち、試験される物体、物質
又は装置を生物系と接触させる。次に、その生物系の応
答（非応答を含む）を定性的及び／又は定量的に検出し
評価する。かかる方法は、皮膚科学ではごく一般的なも
のである。そこでは、かかる生物学的試験を行う生物系
として試験被検者の皮膚又は皮膚標品が用いられ、試験
物質と接触させた皮膚又は皮膚標品の応答が求められ
る。粘膜刺激の試験にはインキュベートした鶏卵が用い
られている。広範囲の試験には生物系として全ての種類
の食肉処理場の産物が用いられている。

【０００２】本発明は、生物学的試験方法として特殊な
血液使用領域に関する。例えば、多くの物質がヒト組
織、体液及び細胞と接触するときに免疫系の細胞を活性
化し、有害な形としては過剰活性化することがあること
は既知である。応答は、物質自体がしばしば免疫系を刺
激するためである。試料が熱を引き起こす発熱物質のよ
うな免疫刺激成分を含むためのこともある。そのような
有害な可能性のある物質としては、特に薬剤及び特に吸
入、注射及び注入される製品が含まれる。血液置換品及
び血液代用品、膜及び人工臓器のような分散液及び物質
を含むいろいろな凝集、形及び使用状態のプラスチック
並びに植物、動物及びヒトを含む天然産物から単離した
物質又はその細胞又は組織培養液、ワクチンのような単
離した産物、薬剤及び遺伝子治療剤が挙げられる。ヒト
組織、細胞又は体液と接触させた場合に生物の白血球か
らサイトカインのような因子を放出させる物質は、免疫
活性化因子と呼ばれる。更に詳しくは、放出した因子が
生物において熱反応を引き起し得る場合には発熱物質と
呼ばれる。製品の安全は医薬剤において緊急に要求され
ることであるので、例外的な汚染ロットを確認するため
に実験動物に対する個々の通常の試験が必要とされる。

【０００３】発熱物質又は免疫活性化因子、即ち、グラ
ム陰性菌の一部しか検出しない種々の薬局方に規定され
るウサギに対する発熱物質試験又はカブトガニアメーバ
様細胞溶解物（ＬＡＬ）テストの代わりに、本発明者ら
は生物系として血液又は血液標品を試験されるべき物質
と接触させると共にサイトカイン、例えば、生物内に熱
を生じる（内因性発熱物質）インターロイキン（ＩＬ−
１β）のような白血球因子の放出を測定する簡便で経済
的で広く応用できる方法を以前に記載した（欧州特許第
0 741 294 A2号, Hartung & Wendel, ALTEX 12, pp. 70
-75, 1995)。できるだけ早く要求されることは血液応答
が異常でないことであり、そのことは全血が試験用生物
系として必要とされる場合にはごく一般的なことであ
る。その場合、試験物質の試験は遅れずに、遅れても
２、３時間以内には開始しなければならない。そのこと
は使用した全血の反応性を十分にチェックする時間がな
く、遺伝的変異、疾患又は生活様式に起因するような正
常でない反応をもつヒトドナーからの血液を使用するこ
とにより、結果が不正確で危険な結果を伴う可能性或い
は又は異常である可能性を必然的な信頼性をもって除外
することができない。一例として述べられる医薬剤の個
々のロットの試験の場合のように、誤った輸送又は貯蔵
の危険には物質が使用前に試験されることが必要である
ことがよくある。しかし、上記の理由のために血液が生
物系として用いられる場合には十分な信頼性をもって以
前の試験結果と比較できない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
の１つは、円滑で再現性のある方法を確かめ、正常でな
い反応による誤りの可能性を除外し、かつ血液を試験用
生物系として用いる場合に同じ試験物質との試験結果を
比較することができる方法を指摘することである。いろ
いろな場所での反復試験が標準化されかついろいろな時
間に可能にすることが企図される。他の目的は、下記に
指摘される利点に由来することである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】確立した目的は、試験物
質と接触するときの血液応答を求める生物学的試験法又
はそのことによる生物学的試験法に使用するための急速
冷凍血液又は急速冷凍血液を含む標品の使用によって得
られる。急速冷凍血液又はその血液を含む標品の使用
は、以前に試験し正常でない反応を含まないいかなると
きにも生物系として用いうる血液があることを可能にす
る。最少量で標準化され、標準試薬として用いられる。
多数の完全に同一の急速冷凍単位はあるロットの血液か
ら調製されるので、異なる時間や場所での試験の再現性
に要求されることは満たされている。更に、試験に適切
なデータでそのロットを確認すると、十分に確認されて
いる別のロットの血液の使用からの結果と比較するルー
トも開かれている。

【０００６】

【発明の実施の形態】成分が分離されていないヒト又は
動物の全血は、急速冷凍血液として良好であることがわ
かった。ヒトドナーから新たに採取された血液が特に良
好であることがわかる。白血球を含む個々の成分は天然
環境にあり、全ての血清成分が試験物質の作用に影響す
ることができる。従って、血液から単離した白血球の使
用が除外されなくても急速冷凍全血の使用は非常に好ま
しい。しかしながら、たいていの単離方法は通常の試験
として大変高価であるので、全血の使用は簡便であり、
求める結果が信頼でき、かつ他の血液成分間の相互作用
の可能性があることから情報が多い。いずれにしても急
速冷凍生成物は生物学的試験法を行うために解凍しなけ
ればならない。試験物質は、十分な血液応答を生じるの
に必要とされる時間及び方法で血液又はその標品と接触
させる。接触時間は数秒又は数分が十分であるが数時間
の接触時間を除外しない。指定した目的を得るのに適し
た接触形態が用いられる。例としては、物体については
浸漬、灌流又は流出、及び溶液、分散液、培養物及び固
形物については血液又は血液標品等との混合又は添加が
挙げられる。血液又は血液標品の簡単なインキュベーシ
ョンに続いて試験物質と接触させた後に通常の血液応答
を求めるために通常の生物学的、物理的、化学的及び／
又は物理化学的分析及び測定方法が用いられる。その方
法としては、生物学的分析及びＲＩＡ好ましくは分光
法、ＥＬＩＳＡのような放出又は形成された物質の定性
的及び定量的測定を与える全ての方法、又は比濁分析又
は化学発光法等が含まれる。

【０００７】急速冷凍血液又は白血球との標品は、希釈
剤、凝固を遅らせる成分、凍害防止剤、及び試験結果に
影響を及ぼさない限り既知の他の物質を含むことができ
る。塩化ナトリウム等張液のような等張液、リンゲル液
及びＲＭＰＩのような細胞培養液が希釈剤として良好で
あることがわかった。試験を行うためにのみ又は解凍、
例えば、３７℃にした後に希釈剤を加えることが有利で
ある。希釈剤は、例えば、全標品の５〜９５容量％に調
製される。希釈剤は、１〜１０容量部がよく用いられ
る。血液又は血液標品を凍害防止剤と混合して急速冷凍
血液試薬を生成することができる。必要な場合には、適
当に分配してから急速冷凍される。適切な凍害防止剤の
例としては、有機溶液、無機溶液、塩含有溶液も、又は
その可変割合の混合液が含まれる。例えば、１０％ジメ
チルスルホキシドのみ又はグリコール又はグリセリンの
み又はジメチルスルホキシドと混合したものを用いるこ
とが特に適切であることがわかった。緩慢な凍結、例え
ば、−１℃／分の制御が有利である。−７０℃の貯蔵温
度は、急速冷凍冷蔵庫及び液体窒素又はドライアイスの
ような凝縮又は固化したガスの使用での冷凍血液が良好
であることがわかった。後者は輸送に特に適切である。

【０００８】急速冷凍標品は、凝固遅延成分を含有する
ことができ、解凍中又は解凍後及び試験法を行っている
間、例えば、インキュベーション中に添加される。適切
な抗凝固剤の例としては、クエン酸ナトリウム、例え
ば、最終濃度0.３８重量％、又はヘパリン、例えば、ヘ
パリンナトリウム、ヘパリン画分等が挙げられる。本発
明の急速冷凍血液又は急速冷凍白血球を含む急速冷凍血
液を含有する標品の使用は、最初に述べた物体、物質及
び装置のような物質についてそれらの物質と解凍した急
速冷凍血液又は血液標品との接触のときの血液応答の知
見、定量又は評価によって免疫刺激作用もしくは免疫調
節作用又は免疫関連作用の定性及び／又は定量分析を試
験するのに特に有利に用いられる。発熱原性のような免
疫刺激作用以外の物質は、免疫系の後続の活性化をモジ
ュレートすることができる。そのことは免疫治療剤に望
ましいが、望まれていない毒性作用がよくある。かかる
作用は、免疫薬剤の開発において探究されなければなら
ないが、多くの物質については除外されなければならな
い。一方では、免疫刺激剤が絶対的又は相対的免疫不全
の治療に治療上の興味がある。他方では、免疫抑制剤及
び消炎剤、抗リウマチ剤及び抗アレルギー剤を含む抗炎
症剤が興味がある。サブスタンスのような物質の免疫毒
性作用は、近年ますます一般に注目されるようになって
きた。いままでのところ免疫薬剤又は免疫毒性物質試験
の試験方法は標準化されていない。しかし、刺激された
全血は、活性サブスタンスの薬理学的性質を確認する科
学的使用が増加している[Hartungら, Blood 85 (1995)2
482-2489]。

【０００９】使用血液の標準化は、発熱物質、免疫モジ
ュレーター及び免疫毒素の定量のような免疫関連作用の
試験に使用するための血液の使用及びその因子放出にお
いて中心的課題である。ここでも全血、おそらく細胞培
養液、バッファー又は臨床用塩化ナトリウム液等で希釈
した前述の血液標品が用いられる。これらの場合には、
特に試験を２、３時間以内に開始しなければならないの
で使用血液物質の適合性を予め試験することは通常不可
能である。前述の目的は、発熱原性、免疫調節作用又は
免疫毒性作用のような免疫関連作用の試験を可能にする
ものであり、血液を予め試験すること及び同じ試験血液
を用いていろいろな時間や場所で物質を繰り返し試験す
ることを可能にしなければならない。そのことは、本発
明の適用によって確かに達成される。本発明の具体的な
利点は、免疫関連作用の定量及びヒト曝露に適した情報
を得る生物系の適用におけるデータからなる。測定した
パラメーターとしては、内因性発熱物質インターロイキ
ン−１β、インターロイキン−６及び腫瘍壊死因子のよ
うなサイトカイン；内因性発熱物質プロスタグランジン
Ｅ₂ のようなエイコサノイド、又は脱顆粒産物、可溶性
レセプター、タンパク質又は低分子量サブスタンスのよ
うな白血球から放出された他のサブスタンスが含まれる
（欧州特許第0741 294 A2号を参照されたい、この明細
書の記載は本願明細書に含まれるものとする) 。抗凝固
剤のクエン酸塩やヘパリンが結果を虚偽する影響がない
ばかりでなく更に上述した凍害防止剤を含む急速冷凍の
凍害防止剤が解凍後の試験結果に不利な影響を示さない
血液を生じることは注目すべきことである。

【００１０】本発明は、全体に連続する利点もある。急
速冷凍血液の解凍後に天然条件下で未変性免疫細胞の固
有の生理的反応及び混合比を検出することが可能であ
る。急速冷凍保存により異なる時間や場所で繰り返し同
じ血液を使用することが可能である。正常でない血液反
応は適切な予備的試験で確認され、対応する物質が除去
される。個々の血液ロットの標準値は、標準化条件下で
予め求められる。血液を直接採血することが可能でない
場合さえ試験を行うことを可能にする。例えば、直接免
疫活性化因子だけでなく内毒素（グラム陰性菌のリポ多
糖類）のような標準刺激の作用のモジュレーションによ
って免疫モジュレーター／免疫毒素を求めることが可能
である。本発明は、また、薬剤治療又は生体外曝露を試
験するのに適切である。その場合、医薬剤の投与後に対
応する患者、被検者又は試験動物から血液を採取する。
それを適切に急速冷凍又は凍結保存し、一例として標準
刺激に対する反応性を後で試験するだけである。本発明
の他の目的は、試験物質と接触のときの血液応答を定量
することを含む生物学的試験法のために標準化単位用量
として急速冷凍血液を含む集合体を含む標品である。

【００１１】健常な動物又はヒトドナーからの新鮮な全
血を使用することが好ましい。所望される場合には、例
として記載された凍害防止剤、希釈剤及び／又は抗凝固
剤と混合し、分配し、急速冷凍される。単位用量は、通
常５０〜５００μl 、好ましくは１００μl の全血を含
有するが、その量に限定されない。試験法を行うため
に、１単位用量の急速冷凍血液が解凍される。例えば、
１mlのような所望量に前述の種類のような希釈剤で調製
され、試験物質と接触させる。血液応答が通常の方法で
求められ、評価される。健常なヒトドナーから一度に採
血される全血量は、数千単位用量、例えば、１００μl
の調製を可能にする。単位用量は、例えば、５、１０又
はそれ以上の単位用量のセットに合わせられる。所望さ
れる場合には、試験法に用いうるデータが得られる。商
業ベースに導入され、急速冷却が維持される。特定の適
用については、セットが単位用量による単位だけでなく
多数の単位用量による単位も含むことができる。個々の
単位用量は、同じ成分を含有し、同じ組成を有し、前述
の急速冷凍血液を含む標品として同じ方法で調製及び使
用される。

【００１２】

【実施例】

実施例１ 健常なドナーからのクエン酸血液を採血直後に１０％ジ
メチルスルホキシド(Merck, ダルムシュタット) と混合
した。１００μl ずつを２mlの反応容器(Eppendorf, ハ
ンブルグ) に分配し、市販の冷凍システム (Mr. Freez
y, ナルジェーネ) の−７０℃低温ボックスに移した。
解凍は３７℃のサーモシェーカー(Eppendorf, ハンブル
グ) で行った。解凍直後に３７℃に加温した９００μl
のＲＰＭＩ１６４０(Gibco, エッゲンシュタイン) を加
えた。試験物質、例えば、発熱物質、本例ではサルモネ
ラ・アボルツスエクィ (Salmonella abortus equi, Sig
ma,ダイゼンホッフェン) の希釈液を加えた。３７℃で
４時間、例えば、５％二酸化炭素を含むインキュベータ
ー(Heraeus, フェルバックス) でインキュベートした
後、インキュベートした試料を振盪し、遠心した。内因
性発熱物質、本例ではＩＬ−１βを、所望される場合に
は凍結後の細胞を含まない上清で求める。図１は、発熱
物質の添加量に対する４人の健常ドナーからの凍結保存
した血液におけるＩＬ−１βの生成を示すグラフであ
る。ＩＬ−１βは、ファーミンゲン社（ハンブルグ）製
の抗体からＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント検定
法）で求めた。試験から最少量の発熱物質の存在下に内
因性発熱物質を放出することがわかる。図２及び図３
は、アザチオプリン又はデキサメタゾンの添加量に対す
るＬＰＳで刺激した冷凍全血におけるＩＬ−１の放出を
示すグラフである。

【図面の簡単な説明】

【図１】 発熱物質の添加量に対するＬＰＳで刺激した
１０％冷凍全血からのＩＬ−１βの放出を示すグラフで
ある。

【図２】 アザチオプリンの添加量に対するＬＰＳで刺
激した冷凍全血におけるＩＬ−１の放出を示すグラフで
ある。

【図３】 デキサメタゾンの添加量に対するＬＰＳで刺
激した冷凍全血におけるＩＬ−１の放出を示すグラフで
ある。

フロントページの続き (71)出願人 597178331 デーペーツェー ビールマン ゲゼルシャ フト ミット ベシュレンクテル ハフツ ング ドイツ連邦共和国 デー61231 バート ナウハイム ホーヘ シュトラーセ ４− ８ (72)発明者 アルベレヒト ヴェンデル ドイツ連邦共和国 デー72070 テュービ ンゲン イム ブッケンロー 19 (72)発明者 トーマス ハルテュング ドイツ連邦共和国 デー78464 コンシュ タンツ グレールニッシュシュトラーセ 17

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 試験物質との接触に対する血液応答を求
   めることを含む生物学的試験法に使用するためのヒト又
   は動物急速冷凍血液又は急速冷凍血液を含む標品の使
   用。
2. 【請求項２】 血液から単離した白血球を含む急速冷凍
   標品が該血液として用いられる請求項１記載の使用。
3. 【請求項３】 該標品が凍害防止剤を含む請求項１又は
   ２記載の使用。
4. 【請求項４】 該標品が抗凝固剤を含む請求項１〜３の
   いずれか１項に記載の使用。
5. 【請求項５】 免疫関連データを求めるための請求項１
   〜４のいずれか１項に記載の使用。
6. 【請求項６】 試験物質との接触に対する血液応答を求
   めることを含む生物学的試験法に使用するための標準化
   血液単位用量として急速冷凍血液を含む標品を含む集合
   体。
7. 【請求項７】 各々が標準化単位用量を含む単位と共に
   多数の該単位用量を含む請求項６記載の集合体。
8. 【請求項８】 該標品が凍害防止剤、抗凝固剤及び／又
   は希釈剤を含む請求項６又は７記載の集合体。
9. 【請求項９】 免疫関連データを求めるための請求項１
   〜８のいずれか１項に記載の集合体。