ES2202883T3 - Procedimiento para la preparacion e identificacion de nuevas hidrolasas con propiedades mejoradas. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un procedimiento para producir e identificar mutantes de hidrolasas que tienen propiedades mejoradas con respecto a la estereoselectividad y regioselectividad, actividad catalítica o estabilidad durante las reacciones químicas.

Description

Procedimiento para la preparación e identificación de nuevas hidrolasas con propiedades mejoradas.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación e identificación de mutantes de hidrolasas con propiedades mejoradas con respecto a su estereoselectividad o regioselectividad, actividad catalítica o estabilidad en las reacciones químicas.

Estado de la técnica

Las hidrolasas pertenecen a las enzimas más extendidas en la síntesis orgánica. Como subgrupo de las hidrolasas, catalizan en particular esterasas y lipasas una gran número de reacciones, como p. ej., la hidrólisis de ésteres de ácidos carboxílicos, o la síntesis de ésteres o transesterificaciones en disolventes orgánicos. Su elevada estereoselectividad, estabilidad y buena disponibilidad las hacen interesantes para numerosos procesos industriales. De esta manera, se utilizan ya industrialmente las lipasas p. ej. para el desprendimiento de racematos de alcoholes ácidos o aminas quirales, para la preparación de enantiómeros puros de medicamentos, sustancias naturales, protectores de plantas o grasas y aceites de elevado valor (K. Faber, Biotransformations in Organic Chemistry, editorial Springer, Berlín, 2. edición 1995). Sin embargo, no se puede prever con seguridad la enantioselectividad de una lipasa o esterasa con respecto a un sustrato dado y en muchos casos las reacciones ocurren sólo con rendimientos ópticos moderados. Por tanto, existe una necesidad de un procedimiento para la preparación de hidrolasas, que posibilite una optimización dirigida de la enantioselectividad con respecto a un producto deseado y a las condiciones especiales del proceso, como temperatura y disolvente. Con la ayuda de los métodos de Biología Molecular usuales hoy en día de la mutagénesis in vitro, es verdad que se estudian los efectos sobre la enantioselectividad de las lipasas (K. Hult, M. Holmquist, M. Martinelle, European Symposium on Biocatalysis, Graz, 1993, Resúmenes, L-4), sin embargo no se ha podido conseguir ninguna optimización con respecto a un sustrato determinado, que conduzca a una enzima utilizable en la síntesis orgánica.

El diseño de proteínas pertenece a una de las posibilidades de uso más importantes de la ingeniería genética, mediante éste y a base de datos conocidos de la estructura y con la ayuda de la mutagénesis in vitro se introducen mutaciones específicas de base en la secuencia génica de la proteína correspondiente. Mediante intercambio dirigido de aminoácidos ya se preparan de esta manera enzimas con actividad catalítica o estabilidad mejorada (A. Shaw, R. Bott, Current Opinion in Structural Biology, 1996, 6, 546). Esta técnica, la llamada mutagénesis dirigida a los nucleótidos (oligonucleotide-directed) o dirigida (site-directed mutagenisierendensis), se basa en la sustitución de un corto tramo de secuencia del gen para la enzima que aparece de forma natural (tipo silvestre) mediante un oligonucleótido mutado sintéticamente. Después de la subsiguiente expresión del gen, se obtiene un mutante de la enzima, que puede mostrar propiedades ventajosas. En un procedimiento derivado de él, las llamadas mutagénesis de casete (cassette mutagenesis), se utilizan oligonucleótidos con secuencias parcialmente aleatorias. De esta manera se obtiene una restringida gran biblioteca de mutantes, de los que se pueden ensayar sus propiedades.

A pesar de las ventajas de estos métodos establecidos, son sólo mal apropiados para la optimización en etapas de una enzima o para la producción de enzimas con nuevas propiedades. El entendimiento hasta hoy en día incompleto de las regularidades del plegamiento de proteínas y de la relación estructura-función en proteínas, es la causa principal del fracaso de muchos proyectos en el campo del llamado diseño racional de proteínas. Además, un proceso de optimización en etapas es relativamente trabajoso según los métodos clásicos y no garantiza ninguna mejora significante de las propiedades de las enzimas per se.

Recientemente se han descrito nuevos métodos de Biología Molecular para la mutagénesis, que se basan en la reacción en cadena de la polimerasa conocida en la bibliografía (R. K. Saiki, S. J. Scharf, F. F. Faloona, K. B. Mullis, G. T. Horn, H. A. Ehrlich, N. Arnheim, Science, 1985, 230, 1350) (D. W. Leung, E. Chen, D. V. Goeddel, Technique, 1989, 1, 11 y W. P. C. Stemmer, A. Crameri, documento PCT WO 95/22625). En vez de la mutagénesis dirigida, se utilizan en este caso métodos combinatorios para formar grandes bibliotecas de mutantes, que seguidamente se investigan con ayuda de procedimientos de rastreo apropiados para hallar mutantes con propiedades positivas. En este caso se imitan los procesos evolutivos que aparecen en la naturaleza de la replicación o recombinación, de la mutación y selección a nivel molecular. Estos métodos descritos como evolución in vitro (o directed evolution) ya se han acreditado en algunos casos como métodos útiles para la obtención de nuevos biocatalizadores (W. P. C. Stemmer, Nature, 1994, 370, 389 y F. H. Arnold, Chemical Engineering Science, 1996, 51, 5091).

A pesar de los avances conseguidos en este campo, hasta ahora no se puede trasladar este procedimiento de manera general a todas las clases de enzimas, puesto que generalmente faltan métodos de ensayo apropiados para la identificación de mutantes con propiedades positivas. Pero éstos son obligatoriamente necesarios, a la vista del gran número de variantes enzimáticas mutadas, que se pueden esperar en la formación de bibliotecas combinatorias de mutantes. En particular, no se ha conseguido hasta ahora en el caso de las lipasas, interesantes para procesos industriales, formar mutantes con estereoselectividad mejorada con los métodos de la evolución in vitro, porque hasta hoy no existe un método de rastreo eficaz para el ensayo de la enantioselectividad. El método clásico para la determinación de la enantioselectividad de una reacción catalizada con una lipasa o esterasa se basa en la separación mediante cromatografía líquida o gaseosa de los productos de la reacción y eductos, utilizando fases estacionarias, quiralmente modificadas. Sin embargo, este método no es apropiado, a causa de la enorme producción de muestras en el transcurso del rastreo de grandes bibliotecas de mutantes, puesto que las separaciones cromatográficas son en tiempo costosa con columnas quiralmente modificadas y solamente se puede llevar a cabo una detrás de otra. Otro problema hasta ahora no resuelto es la dificultad que se observa frecuentemente, de expresar las lipasas o esterasas funcionales en los organismos hospedadores con rendimiento de actividad lo suficientemente elevado. Sin embargo esto es irrenunciable para un sistema de rastreo capaz de rendir, puesto que son muy difíciles de detectar actividades enzimáticas demasiado pequeñas en la determinación de la enantioselectividad a causa de la sensibilidad limitada de un sistema de ensayo.

Objeto de la invención

Por tanto, la misión de la invención era desarrollar un procedimiento sencillo para la preparación de hidrolasas mutadas, en particular lipasas o esterasas, con estereo- o regioselectividad mejorada, actividad catalítica y estabilidad, con respecto a sustratos datos (p. ej. ácidos carboxílicos, alcoholes, aminas, así como sus derivados), que posibilite además una rápida identificación de mutantes positivos procedentes de grandes librerías de mutantes, así como el uso de las enzimas así preparadas en el desprendimiento de racematos de alcoholes, ácidos y aminas quirales, así como de sus derivados.

Descripción de la invención

La presente invención se refiere a

(1) un procedimiento para la preparación e identificación de mutantes de hidrolasas con propiedades mejoradas con respecto a al estereo- y regioselectividad, caracterizado porque

a)

se muta un gen de partida de hidrolasas mediante una reacción modificada en cadena de polimerasa (PCR), ajustándose, mediante ajuste de las concentraciones de Mg^{2+}, Mn^{2+} y de los desoxinucleótidos una frecuencia media de mutación de 1-2 intercambios de bases, con relación al gen de hidrolasa que se va a mutar, así como mediante ajuste del número de ciclos, el número total de mutaciones en el DNA amplificado,

b)

opcionalmente, se mutan uno o varios genes de hidrolasas mutados según la etapa a) o mezclas de uno o varios genes de partida de hidrolasas y uno o varios genes de hidrolasas mutados según la etapa a) por fragmentación enzimática de estos genes y subsiguiente reordenación enzimática de los fragmentos formados par obtener genes de hidrolasas totalmente recombinados,

c)

los genes de hidrolasas mutados según la etapa a) o b) se transforman en un organismo hospedador y

d)

se identifican mediante un procedimiento de ensayo los mutantes de hidrolasas con propiedades mejoradas con respecto a la estereo- o regioselectividad, que se expresan de los transformantes obtenidos en la etapa c);

(2) un mutante de lipasa con estereoselectividad mejorada con respecto a ácidos carboxílicos o compuestos funcionales de COOH quirales como la lipasa de partida mostrada en la Fig. 2 procedente de la cepa P. aeruginosa, obtenida mediante mutación de la lipasa de partida con un procedimiento según (1);

(3) una secuencia de DNA, que codifica para un mutante de lipasas definido en (2);

(4) un vector, que comprende las secuencia de DNA definida en (3);

(5) un transformante, que comprende una secuencia de DNA, tal como se define en (3) y/o un vector, tal como se define en (4) y

(6) un procedimiento para la preparación de los mutantes de lipasa definidos en (2), que comprende cultivar un transformante según (5).

La preparación de los nuevos biocatalizadores comienza por lo general con el aislamiento de un gen de lipasas o de esterasas del organismo primitivo. En este caso se consideran todos los organismos microbianos, vegetales y animales, que son portadores de un gen de lipasas o de esterasas. Se puede llevar a cabo el aislamiento del gen según los métodos conocidos en la bibliografía (J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Nueva York). Para ello por lo general se fragmenta el DNA genómico con la ayuda de endonucleasas de restricción y se clonan los fragmentos obtenidos de genes en un organismo hospedador (p. ej. E. coli). Utilizando nucleótidos, que sean homólogos de secuencia con respecto a un tramo del gen de lipasas o de esterasas, se identifica seguidamente el gen en experimentos de hibridación en el banco de genes y se aísla a continuación.

Sorprendentemente en el contexto de la invención se ha encontrado, que mediante una reacción en cadena de la polimerasa modificada (PCR), con variación de determinados parámetros de la reacción, se pueden mutar de tal manera los genes de hidrolasas que aparecen en la naturaleza, que se obtiene una gran biblioteca de mutantes, que se puede investigar buscando mutantes con la ayuda de un nuevo procedimiento de ensayo con enantioselectividad mejorada.

La novedad del procedimiento consiste en que partiendo de un gen de lipasas o de esterasas que aparece en la naturaleza (el llamado gen de tipo silvestre), utilizando una PCR modificada (denominada a continuación PCR mutagénica) se puede obtener una gran biblioteca de mutantes aleatoria. Se ha hallado en este caso, que mediante variación de los componentes de reacción de la PCR, se puede ajustar de manera controlada la frecuencia de mutaciones durante la PCR. Mediante la variación de las concentraciones de Mg^{2+} y/o de los desoxinucleótidos y/o de la adición de iones Mn^{2+}, se controla el número de mutaciones en el gen de lipasas considerado (frecuencia de mutaciones). Preferiblemente se utilizan en este caso las siguientes concentraciones en relación con la DNA polimerasa utilizada:

Mg^{2+}: 1,5 mM - 8,0 mM

DNTP: 0,05 mM - 1,0 mM

Mn^{2+}: 0,0 mM - 3,0 mM

Se ha hallado además, que se correlaciona el número de ciclos de la reacción de PCR con el número de mutaciones: cuanto más elevado se elige el número de ciclos, tanto mayor es el número total de mutaciones. Con ayuda de este parámetro se ajusta la diversidad de la biblioteca de mutantes.

Para la determinación de la frecuencia de las mutaciones, se secuencian los productos purificados de la PCR. Mediante la comparación de las secuencias obtenidas con la secuencia del gen de tipo silvestre, se determina la frecuencia de las mutaciones.

La Tabla 1 muestra la dependencia de la frecuencia de mutaciones con la concentración de los componentes antes citados de la reacción de PCR en la amplificación del gen de lipasa procedente de P. aeruginosa (lipA).

TABLA 1

Ensayo	Mg^{2+}	Mn^{2+}	dATP/dGTP	dTTP/dCTP	Frecuencia de mutaciones
	(mM)	(mM)	(mM)	(mM)	(Mutaciones/1000 pb^{1)})
1	6,1	-	0,2	0,2	1-2
2	7,0	0,5	0,2	1,0	15-20
^{1)}pb = pares de bases

En base a los resultados de la secuenciación también resulta, que como tipos de mutaciones aparecen estadísticamente con una frecuencia similar las transiciones y transversiones. Por el contrario, las deleciones e inserciones se observan sólo raramente. Además las mutaciones se encuentran distribuidas uniformemente por todo el gen de lipasa. Por ello se forma con el método descrito un banco de mutantes con mutaciones estadísticamente distribuidas de manera uniforme. Se ha demostrado como ventajoso una frecuencia de mutaciones de 1-2 mutaciones / gen de hidrolasas. De esta manera se impide, que al aparecer varias mutaciones por gen de hidrolasas una mutación negativa enmascare una mutación con efecto positivo. Para obtener una biblioteca completa de mutantes con un intercambio de aminoácidos en cada caso por molécula de enzima, se deben formar teóricamente 5415 mutantes en una lipasa, que esté formada por 285 aminoácidos (en este caso: lipasa procedente de P. aeruginosa). Se obtiene este valor según el siguiente algoritmo:

N = 19 x M x 285! /[(285-M)! x M!]

siendo N = número de mutantes y M = número de intercambios de aminoácidos por molécula de lipasa. En el contexto de la invención, sorprendentemente se pudo mostrar, que ya en tamaños bastante pequeños de bibliotecas se hallaron mutantes positivos, trabajándose con una frecuencia de mutación de 1-2.

Los genes de lipasas o de esterasas mutados, obtenidos según el procedimiento descrito, se ligan en un vector de expresión apropiado y seguidamente se transforman en un organismo hospedador, p. ej. E. coli. A continuación las células transformadas se dispersan y cultivan en placas de agar. Siempre que se dé una tasa de expresión lo suficientemente elevada, se puede trasvasar las colonias obtenidas a placas de microtitulación provistas de medio líquido y utilizarse directamente después del crecimiento para el ensayo de rastreo. En el caso de que en la expresión del gen de lipasa se forme solamente un poco de enzima, o que el producto del gen no esté correctamente plegado en el organismo hospedador utilizado (cuerpo de inclusión) o se segrega de forma incompleta al medio de cultivo, es ventajoso, reclonar los genes mutados en otro organismo hospedador, preferiblemente el organismo primitivo.

Para obtener actividades enzimáticas lo suficientemente elevadas, se transfieren los diferentes clones bacterianos, que contienen un gen mutado de lipasas o de esterasas, desde las placas de agar al pocillo de placas de microtitulación comerciales normales y se cultivan ahí en medio líquido. Preferiblemente se utilizan en este caso placas de microtitulación con 96 pocillos por placa. Se puede controlar el crecimiento de las bacterias mediante medida de la densidad celular (valor OD_{600}). Es ventajoso sembrar de forma paralela una segunda placa de microtitulación de esta manera, para tener una referencia para la posterior identificación de clones positivos. Estos se combinan normalmente después del crecimiento de la bacterias con glicerina y se almacenan hasta la identificación a -80ºC. Siempre que las células segreguen la enzima en el espacio extracelular(p. ej. en la lipasa de P. aeruginosa) se separan por centrifugación las células de las placas de microtitulación y se utiliza el sobrenadante con la actividad de lipasa o de esterasa para el ensayo de rastreo. Para el caso de que las bacterias (p. ej. E. coli) segreguen la enzima al periplasma, se debe llevar a cabo antes una lisis de la pared celular, pudiéndose utilizar métodos conocidos en la bibliografía, como p. ej. un tratamiento con lisozima.

Mediante cultivo de los clones correspondientes de la placa de referencia se aísla suficiente DNA de plásmido, que se pueden utilizar para la caracterización del gen mutado de lipasas o de esterasas. Se localizan las mutaciones en el gen mediante secuenciación. Una ventaja de la mutación es el hecho, de que también sin conocimientos de la posición exacta de las mutaciones en un clon positivo, se puede seguir optimizando el gen mutado en otros ciclos de mutaciones según el procedimiento descrito con respecto a sus propiedades. Para ello se utiliza de nuevo el gen aislado de lipasas o de esterasas en una PCR modificada según las condiciones antes indicadas (PCR mutágena). Este procedimiento se puede repetir tantas veces, hasta que las propiedades de los mutantes de lipasas o de esterasas cumplan los requisitos de la reacción estereoselectiva.

Para posterior optimización de los mutantes positivos identificados, se amplía de tal manera el procedimiento descrito, que el DNA de varios mutantes positivos se fragmenta primero y a continuación, en un proceso combinatorio según W. P. C. Stemmer (Nature, 1994, 370, 389), se puede reensamblar para dar genes funcionales de lipasa o de esterasa. A continuación se expresa la biblioteca de recombinantes in vitro así obtenida y los productos génicos recombinantes se investigan con respecto a una mejor enantioselectividad con la ayuda de los procedimientos de ensayo según la invención. La ventaja de este procedimiento consiste en que, en base a la recombinación se pueden añadir las propiedades positivas de diferentes mutantes de lipasas o de esterasas a un nuevo gen recombinante, lo que puede conducir finalmente a otra mejora de la lipasa o de la esterasa. El desarrollo del proceso descrito es tal como sigue:

Primeramente, se dividen en fragmentos los genes de lipasas o de esterasas con la ayuda de la enzima DNAasa (p. ej. procedente de páncreas de terneras) con una longitud preferida entre 25 pb y 100 pb. Se controla el tamaño de los fragmentos mediante separación con una electroforesis de gel de agarosa y comparación con los correspondientes marcadores de longitud de DNA. Se purifican los fragmentos de DNA así obtenidos, para liberarlos de DNAasa adherida. Se realiza la combinación in vitro en las condiciones de una PCR convencional, sin añadir ningún cebador de PCR. De manera análoga a la PCR convencional, se divide un ciclo en tres etapas: a) desnaturalización, b) reasociación y c) elongación. Durante la reasociación se llega a una hibridación de fragmentos homólogos de secuencia, que pueden proceder de diferentes genes mutados de lipasas o de esterasas. En la siguiente etapa de elongación, se completan las cadenas mediante la DNA-polimerasa, de tal manera que finalmente se obtienen nuevos genes recombinantes de lipasa. Se determina el número óptimo de ciclos en un ensayo inicial. Para ello se separa una pequeña muestra procedente de la carga de reacción después de cada 5 ciclos mediante electroforesis de gel de agarosa y a partir de ahí se calcula el ciclo, en el cual esté el máximo de la distribución de tamaños de los recombinantes en el intervalo de tamaño del gen de la enzima. Preferiblemente se elige un número de ciclos entre 30 y 45. Se purifica la banda obtenida en el gel de agarosa, que corresponde al tamaño del gen de la lipasa o de la esterasa y se amplifica mediante una PCR convencional. Se purifica el producto de la PCR y se transforma después de la ligación en un vector apropiado (plásmido) según E. coli. Como ya se ha hablado en el apartado sobre la PCR mutágena, puede ser necesario, reclonar en otro organismo hospedador, en el caso de que la actividad de la lipasa debiera ser demasiado pequeña según la expresión en E. coli. Se cultivan los recombinantes obtenidos en placas de microtitulación para el ensayo sobre la enantioselectividad.

En una variante de la invención, los procedimientos descritos de la PCR mutágena y de la recombinación in vitro se pueden llevar a cabo o repetir sucesivamente en el orden y en la frecuencia que se quiera para formar bibliotecas de mutaciones o de recombinantes, para optimizar la enantioselectividad de la lipasa o de la esterasa. Preferiblemente se realiza al principio al menos un ciclo de mutación mediante PCR mutágena. Después de esto, se puede llevar a cabo un ciclo de recombinación in vitro, utilizándose en cada caso los mejores clones de mutantes positivos. Mediante controles de la enantioselectividad de los mutantes de enzimas obtenidos se sigue el proceso de optimización.

Biblioteca se puede expresar y rastrear la enantioselectividad mejorada.

Los mutantes positivos de lipasas o de esterasas, que se han identificado mediante el rastreo de mutantes o de recombinantes, se pueden seguir optimizando con la ayuda de mutagénesis de saturación dirigidas al sitio. Para ello se localiza primero la mutación positiva en el gen de lipasas o de esterasas mediante secuenciación. Seguidamente, mediante un método elegido de mutagénesis dirigido al sitio, que permite un cambio de bases repetido, se altera este gen de tal manera, que se forman todos los codones posibles en el sitio del gen, que codifica para la posición que se va a optimizar. De esta manera se obtiene una gran biblioteca limitada de mutantes, en los cuales está sustituido en la posición de aminoácidos que se va a optimizar el aminoácido primitivamente presente mediante los restantes 19 aminoácidos. La gran biblioteca limitada de mutantes así obtenida se puede expresar a continuación e investigar su enantioselectividad mejorada.

En una variante del procedimiento descrito, se utiliza el gen de lipasas o de esterasas de la enzima de tipo silvestre junto con los mutantes positivo encontrados para la recombinación in vitro. De esta manera se puede llegar a retrocruzamientos, en los cuales se pueden eliminar mutaciones con propiedades neutras o negativas. En la biblioteca de recombinación obtenida se puede rastrear la expresión de enantioselectividad mejorada.

En otra variante del procedimiento descrito, se utilizan genes de hidrolasas procedentes de organismos diferentes para la recombinación in vitro, siempre que posean una homología suficientes de secuencias con respecto al gen de hidrolasas primariamente utilizado.

En una variante del procedimiento se lleva a cabo la recombinación in vitro en las condiciones de la PCR modificada descrita. Para ello se altera la concentración de los iones de Mg^{2+} o Mn^{2+}, así como la de los desoxirribonucleótidos (dNTPs), para ajustar la frecuencia de mutaciones durante la recombinación in vitro.

Son también objeto de la invención procedimientos de ensayo, que hacen posible la identificación de mutantes de enzimas con estereoselectividad o regioselectividad mejorada a partir de grandes bibliotecas de mutantes. Para ello se transvasan dos partes alícuotas iguales del sobrenadante que contiene la enzima después de la centrifugación de las células bacterianas en sendos pocillos cercanos de una nueva placa de microtitulación. Después de la adición de los dos sustratos enantiómeros en cada uno de los pocillos, se determina la actividad de la lipasa o de la esterasa de manera espectrofotométrica. Se llevan a cabo las medidas en un espectrofotómetro normal comercial para placas de microtitulación. De esta manera es posible una elevada cantidad de muestras. La elección del sustrato depende del tipo del compuesto quiral, para el que se debe acometer una optimización de la lipasa o de la esterasa. En particular el procedimiento es apropiado para ácidos carboxílicos, alcoholes y aminas quirales.

En el caso de ácidos carboxílicos quirales o compuestos con función COOH, se utilizan los dos ésteres de p-nitrofenilo correspondientes del ácido (R) o (S) con sustratos de ensayo. La Fórmula 1 muestra el principio del procedimiento de ensayo, simbolizando R un resto orgánico cualquiera con al menos un centro asimétrico.

Fórmula 1 Esquema para el procedimiento de ensayo sobre la estereoselectividad en ácidos carboxílicos o compuestos con función COOH quirales

1

2

En base a la elevada extinción del anión de p-nitrofenolato liberado en la hidrólisis del éster catalizada por la hidrolasa (\lambda_{max} = 405 nm, E_{max} = 14.000) se obtiene un procedimiento de ensayo de elevada sensibilidad, con el que se puede realizar una determinación de la actividad también a bajas concentraciones del sustrato. Se determina la enantioselectividad de los mutantes de hidrolasa a partir de los cocientes de las velocidades de hidrólisis V_{app(R)} y V_{app(S)} para los ésteres (R) y (S) con suficiente exactitud. Puesto que las dos tandas de ensayos contienen en cada caso solamente un enantiómero (o el éster (R) o el (S)), se debe considerar en la determinación de la enantioselectividad la reacción de competencia que falta con el otro enantiómero. Es verdad que este efecto cinético puede conducir al cálculo de enantioselectividades incorrectas, sin embargo se ha visto, que las enantioselectividades aparentes obtenidas según los métodos presentados (E_{app}) tienen suficiente fuerza de expresión con respecto a la enantioselectividad de las lipasas mutadas. Eapp se obtiene como V_{app} (R) / V_{app} (S). Otra ventaja es la realización sencilla y la buena reproducibilidad del ensayo, que también es apropiado para un rastreo con elevada cantidad de muestras.

En el caso de alcoholes quirales o de compuestos quirales con función OH, se utilizan esteres de ácidos grasos de los dos alcoholes enantiómeros puros para el ensayo de la estereoselectividad. La longitud de cadena de los ácidos grasos se encuentra en el intervalo de C2 hasta. Como componentes alcohólicos se pueden utilizar alcoholes primarios, secundarios y terciarios, así como sus derivados con al menos un centro de asimetría. Se hidrolizan las soluciones de los ésteres de los alcoholes (R) y (S) en sendos pocillos cercanos de una placa de microtitulación con sobrenadantes de cultivo de los mutantes de hidrolasas. Las velocidades de hidrólisis V_{app(R)} y V_{app(S)} de los ésteres (R) y (S) son una medida para la enantioselectividad de los mutantes estudiados de enzimas. La detección se realiza mediante una reacción enzimática acoplada (H. U. Bergmeyer, Grundlagen der enzimatischen Analyse, Editorial CEIME, Weinheim, 1977), en la que se sigue la liberación continua de ácidos grasos. Se determina de manera colorimétrica el colorante formado a 546 nm (\varepsilon = 19,31 l x mmol^{-1} x cm^{-1}). Se deben elegir de tal manera las concentraciones de los enzimas, de los cofactores y de los coenzimas de las reacciones auxiliares 2 y 3 (véase Fórmula 2), así como de la reacción del indicador 4, que la reacción catalizada por lipasas o esterasas que se va a determinar se determina por la velocidad. El cociente de las velocidades de hidrólisis del éster (R) y (S) corresponde a la enantioselectividad aparente (E_{app}). En una variante se utilizan en vez de los ésteres enantiómeros puros, las amidas de ácidos grasos de aminas o compuestos con función NH_{2} o NHR quirales. La Fórmula 2 muestra el esquema del sistema de ensayo.

Fórmula 2 Esquema para el procedimiento de ensayo sobre la estereoselectividad en alcoholes quirales

R simboliza un resto orgánico preferido con al menos un centro asimétrico; abreviaturas: CoA (coenzima A), ATP (adenosín-5'-trifosfato), AMP (adenosín-5'-monofosfato)

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En una variante del procedimiento, se pueden utilizar en vez de los ésteres o amidas de ácidos grasos los correspondientes ésteres y amidas del ácido succínico. Con respecto a los ácidos grasos, tienen la ventaja de la mejor solubilidad en soluciones acuosas o disolventes acuoso-orgánicos. Se realiza la medida por espectrometría de UV a 340 nm (\varepsilon = 6,3 l x mmol^{-1} x cm^{-1}). También hay que tener en cuenta en este procedimiento de ensayo, que la Reacción 1 catalizada por las hidrolasas se puede determinar la velocidad. El cociente de las velocidades de hidrólisis V_{app(R)} y V_{app(S)} del éster (R) y (S) corresponde a la enantioselectividad aparente (E_{app}). En una variante se utilizan en vez de los ésteres enantiómeros puros las amidas de ácidos grasos de aminas quirales. Se pueden utilizar como componente amínico tanto aminas primarias como secundarias. El esquema del procedimiento de ensayo se representa en la Fórmula 3.

Fórmula 3 Esquema para el procedimiento de ensayo sobre la estereoselectividad en alcoholes quirales

R simboliza un resto orgánico preferido con al menos un centro asimétrico; abreviaturas: CoA (coenzima A), ITP (inosín-5'-trifosfato), IDP (inosín-5'-difosfato), NADH / NAD^{+} (nicotinamid-adenín-dinucleótido reducido u oxidado)

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El ensayo para la identificación de mutantes de hidrolasa con estereoselectividad mejorada se puede realizar además de tal manera, que estén los dos estereoisómeros en el material del ensayo. De esta manera se puede renunciar a la medida separada del enantiómero (R) y (S). El principio del ensayo parte de una unión de una mezcla racémica del sustrato quiral a una fase sólida. Mediante una unión éster o amida a este compuesto quiral se une un resto orgánico marcado radiactivamente. Se diferencian dos casos:

a)

ácido carboxílico quiral unido a fases sólidas: se esterifica la función carboxilo con un alcohol marcado radiactivamente

b)

alcohol quiral o amina quiral, o compuestos con función OH- o NH_{2} (NHR) unidos a fases sólidas: la función hidroxilo o amino se marca con un ácido carboxílico marcado radiactivamente.

Es decisorio, que los dos enantiómeros de la mezcla racémica unida a la fase sólida estén marcados con diferentes isótopos. Preferiblemente se utilizan compuestos marcados con ^{3}H y ^{14}C. Como fase sólida se pueden utilizar tanto todos los polímeros funcionalizados orgánicos normales, como los soportes funcionalizados inorgánicos. Preferiblemente se utilizan fases sólidas sobre base de poliestireno y soporte de gel de sílice. A continuación se unen a la fase sólida los compuestos quirales marcados radiactivamente, debiendo adaptarse la unión a la fase sólida a la estructura química del sustrato quiral. La Fórmula 4 muestra el esquema de la fase sólida modificada y el principio del procedimiento del ensayo.

Fórmula 4 Esquema del ensayo de rastreo en fase sólida sobre la estereoselectividad con sustrato doblemente marcado radiactivamente

(X = O, NH; R es un resto orgánico marcado radiactivamente)

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Se pueden distribuir cantidades similares del soporte así modificado en pequeños recipientes de reacción (p. ej. en los pocillos de placas de microtitulación) y se combinan a continuación con los sobrenadantes de los cultivos de mutantes de hidrolasas. En la reacción subsiguiente se hidrolizan los componentes marcados radiactivamente (ácido carboxílico o alcohol) de la fase sólida y se vierten en el medio líquido. Seguidamente se toma una parte alícuota del medio y se mide en un aparato de medida de la escintilación la cantidad de radioactividad. Se puede calcular el exceso de enantiómeros y la cantidad de la reacción y por tanto la enantioselectividad de las esterasas o lipasas mutadas, a partir de la relación entre sí de los dos isótopos diferentes. Mediante el uso de compuestos de ensayo regioisómeros, también se utilizan los ensayos descritos para la identificación de mutantes de hidrolasas con regioselectividad mejorada. En vez de los mutantes de hidrolasas se pueden utilizar también otros catalizadores, para determinar la estereo- o regioselectividad.

También se puede realizar el ensayo sobre enantioselectividad de los mutantes de hidrolasas preparados según el método descrito mediante la separación capilar-electroforética utilizando capilares quiralmente modificados, que hacen posible una separación directa de los sustratos o productos enantiómeros de la reacción del ensayo catalizada por las hidrolasas. En este caso se pueden utilizar los sustratos de ensayo como racemato. Se puede realizar la separación tanto en capilares como también utilizando microchips preparados, que hacen posible una separación electroforética y paralelismo de los análisis con el objeto de un elevado gasto de muestras. Un requisito previo es en los dos casos, que los enantiómeros sean separables por electroforesis capilar.

Se aclarará con más detalle la invención mediante los siguientes Ejemplos y Figuras.

La Figura 1 muestra las curvas de medida obtenidas de manera experimental para la determinación de la enantioselectividad aparente (E_{app}) en la hidrólisis de ésteres p-nitrofenílicos de ácido (R) y (S)-2-metildecanoico con sobrenadantes de cultivos de los mutantes de lipasas P1B 01-E4, P2B 08-H3, P3B 13-D10, P4B 04-H3, P5B 14-C11, P4BSF 03-G10 y la lipasa de tipo silvestre procedente de P. aeruginosa (los aumentos tienen la unidad [mOD/min]).

Fig. 2: Comparación de las secuencias de DNA de los mutantes de lipasas P1B 01- E4, P2B 08-H3, P3B 13-D10, P4B 04-H3, P5B 14-C11, P4BSF 03-G10 con la secuencia del tipo silvestre de lipasa procedente de P. aeruginosa (las bases mutadas con relación al tipo silvestre están recuadradas, el inicio de los mutantes maduros de lipasas se encuentra en la base 163 o en la base 162 del tipo silvestre).

Ejemplo 1

En el siguiente Ejemplo se ha recurrido al gen de la lipasa de P. aeruginosa (aislamiento según K. E. Jäger, Universidad del Ruhr, Bochum) para una optimización. El sustrato, sobre el que se debería mejorar la enantioselectividad de la lipasa, era ácido (R,S)-2-metildecanoico. Se debería desarrollar un mutante de lipasa con una preferencia para el enantiómero (S). Se realizó el ensayo de rastreo con éster p-nitrofenílico de ácido (R) o (S)-2-metildecanoico.

Fórmula 5

6

Cepas bacterianas

E. coli JM109: E14-(McrA), recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17(r_{k}-m_{k}+), supE44, relA1, \Delta(lac-proAB), [F' tra\Delta36 proAB lacl^{q} Z\DeltaM15] (Firma Stratagene).

P. aeruginosa PABST7.1: lacUV5/lacq gen de polimerasa T7 regulado, establemente integrado en el cromosoma de la cepa de P. aeruginosa PABS, que lleva una deleción en el gen estructural de la lipasa lipA (K.-E. Jaeger et al. J. Mol. Cat. Part B, 1997, en prensa).

Plásmidos

PMut5: fragmento BamHI/Apal (1046 pb) del gen de lipasa de P. aeruginosa lipA en el vector pBluescript KSII (Firma Stratagene).

PUCP6A: fragmento BamHl/Hindi (2,6 Kpb), que comprende el operón de lipasa de P. aeruginosa, en el vector pCUPKS (Watson et al., Gene 1996, 172, 163) bajo el control del promotor de T7.

Cultivo de las bacterias

Se cultiva E. coli JM109 durante toda la noche a 37ºC en 5 ml de medio LB en una rueda de tubos de ensayo. Para P. aeruginosa PABST7.1 se añade el medio IPTG 1 mM. Para el ensayo de rastreo se cultiva P. aeruginosa PABST7.1 en placas de microtitulación sobre un agitador redondo, siendo el volumen del cultivo 200 \mul y alargando el tiempo de incubación a 36-48 h. Se añaden antibióticos con la siguiente concentración:

E. coli JM109: ampicilina 100 \mug/ml; P. aeruginosa PABST7.1: carbenicilina 200 \mug/ml, tetraciclina 50 \mug/ml.

PCR mutágena

Se amplifica el gen de lipasa lipA utilizando el plásmido pMut5, linearizado mediante la endonucleasa Xmn, como plantilla y siguientes cebadores de PCR:

A: 5'-GCGCAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAA-3'

B: 5'-GCGTAATACGACTCACTATAGGGCGAA-3'

Después de la purificación del producto de la PCR mediante una Quiagen Quiaquick Column® se utiliza como plantilla en una reacción de PCR mutagénica. Las condiciones de reacción son como sigue: un volumen de 100 \mul de reacción contiene (NH_{4})_{2}SO_{} 16,6 mM; tris-HCl 67 mM (pH 8,8); MgCl_{2} 6,1 mM; EDTA 6,7 \muM (pH 8,0); dNTPs 0,2 mM; mercaptoetanol 10 mM; 10 \mul de DMSO; en cada caso 10 pmol del cebador; 0,1 ng de DNA de plantilla y 1U de Taq polimerasa (Goldstar, Firma Eurogentec). Se cubre el volumen de la reacción con 100 \mul de parafina. Se realizan 10 reacciones en paralelo, que se unen después del final de la reacción. El protocolo de los ciclos es como sigue: después de 2 minutos de desnaturalización a 98ºC, siguen 25 ciclos con 1 min a 94ºC, 2 min a 64ºC, 1 min a 72ºC sobre un Robocycler 40 (Firma Stratagen), seguido de una incubación durante 7 min a 72ºC. Se añade la Taq polimerasa después de la desnaturalización del 1. ciclo. La secuenciación de los productos de la PCR da una tasa de errores de aproximadamente 1-2 intercambios de bases por 1000 pb.

Clonación de los productos de la PCR

Se precipitan con etanol los productos de la PCR y se vuelven a suspender en agua destilada. Después de la restricción con Apal y BamHI, se purifica el fragmento de 1046 pb formado mediante una Quiagen Quiaquick Column® y se une, utilizando una ligasa de DNA de T4 (Firma MBI Fermentas) durante 2 h a temperatura ambiente al vector correspondiente preparado pUCPL6A. Se diluye el volumen de reacción 1:5 y se transforma en 200 \mul de células competentes de E. coli JM109, que preparan según el método de Hanahan (J. Mol. Biol. 1983, 166, 557). Para ello se almacenan DNA y células durante 1 h sobre hielo, 2 min a 42ºC y, después de la adición de 700 \mul de medio de LB, se incuban con agitación durante 45 min a 37ºC. Seguidamente se coloca en placas la suspensión celular sobre placas LB (ampicilina 100 \mug/ml). 60 ng del producto de la PCR, que se utilizan en la reacción de unión, dan aproximadamente 1500 colonias. Se vuelven a suspender todas las colonias en medio estéril de LB, se purifica el DNA del plásmido y se transforma por electroporación según el método de Farinha y Kropinski (FEMS Microbiol. Lett. 1990, 70, 221). Se inoculan los 96 pocillos de las placas de microtitulación cada uno con una colonia y se tratan, tal como se ha descrito en el apartado "Cultivo de bacterias". Se centrifugan las placas de microtitulación durante 30 min a 4000 rpm para obtener el sobrenadante del cultivo, que a continuaciones utiliza en el ensayo de estereoselelctividad.

Ensayo de estereoselectividad

Se pipetean los sobrenadantes de cultivo, que contienen lipasa, obtenidos por centrifugación en sendas partes alícuotas iguales en pocillos vecinos de una placa de microtitulación. El volumen del ensayo es de 100 \mul y consta de los siguientes componentes (Tabla 2):

TABLA 2 Composición de la cantidad de reacción para el ensayo sobre enantioselectividad mejorada de mutantes de lipasa

Cantidad de (R)	Cantidad de (S)
50 \mul de sobrenadante de cultivo	50 \mul de sobrenadante de cultivo
40 \mul de tampón de tris/HCl 10 mM, pH 7,5	40 \mul de tampón de tris/HCl 10 mM, pH 7,5
10 \mul de solución de sustrato [10 mg / ml	10 \mul de solución de sustrato [10 mg / ml
de éster p-nitrofenílico de ácido (R)-2-	de éster p-nitrofenílico de ácido (R)-2-
metildecanoico en DMF]	metildecanoico en DMF]

Después de la adición del tampón de tris/HCl a los sobrenadantes, se incuba la placa de microtitulación durante aproximadamente 5 min a 30ºC. Después de la adición de la solución de sustrato, se sigue la reacción de manera espectrofotométrica y continua durante 10 min a 410 nm y 30ºC. A partir del incremento lineal de la curva de absorción, que es una medida para la velocidad inicial constante de la hidrólisis, se determina la enantioselectividad aparente (E_{app}). Para ello se dividen las elevaciones medidas en el intervalo lineal de las velocidades iniciales de las reacciones del par de enantiómeros, y se obtiene el valor para la enantioselectividad aparente de los correspondientes mutantes de lipasa.

Determinación de la estereoselectividad mediante cromatografía gaseosa

Se cultivan los clones positivos elegidos en cultivos líquidos de 5 ml (medio LB) y se utiliza para la reacción el sobrenadante que contiene lipasa, después de la centrifugación y eliminación de los nódulos de bacterias. Se utilizan como sustrato 100 \mul de una solución de éster p-nitrofenílico de ácido (R,S)-2-metildecanoico (10 mg/ml en dimetilformamida). Ésta se combina con 700 \mul de tampón tris/HCl 10 mM pH 7,5. Se inicia la reacción mediante adición de 100 \mul de sobrenadante del cultivo y se realiza a 30ºC y 1000 rpm en recipientes de reacción Eppendorf. Después de 2,5 h, se toman sendas muestras de 200 \mul y se traspasan a un recipiente de Eppendorf lleno con 200 \mul de diclorometano. Después de la adición de 25 \mul de ácido clorhídrico al 20%, se extraen los productos y eductos (agitador vórtex, 1 min). Finalmente se utiliza la fase orgánica para el análisis por cromatografía de gases (GC, por sus siglas en inglés). En este caso se consigue una separación de los enantiómeros del ácido 2-metildecanoico libre.

Condiciones de separación de la GC

Aparato:	Hewlett Packard 5890
Columna:	25 m 2,6 DM 3 pent \ beta-CD / 80% SE 54
Detector:	FID
Temperatura:	230ºC de entrada; 80-190ºC con 2ºC / min
Gas:	0,6 bares de H_{2}
Cantidad de muestra:	0,1 ml

Resultados (1. ciclo)

De aproximadamente 1000 clones estudiados, que se obtuvieron mediante la PCR mutágena con el DNA de partida (gen del tipo silvestre de la lipasa de P. aeruginosa), se identificaron 12 con enantioselectividad mejorada con respecto a la enzima correspondiente del tipo silvestre. Se eligieron finalmente 3 clones y se determinó su enantioselectividad mediante análisis por GC.

TABLA 3 Mutantes elegidos de lipasa con enantioselectividad mejorada (1. ciclo)

Mutante	V_{app} (S)	V_{app} (R)	E_{app}^{1})	% de ee	Valor de E ^{2})
	(mOD/min)	(mOD/min)		(según GC)	(calculado
				/% de	según GC)
				conversión
Tipo silvestre
P1B 01-E4	21,8	14,9	1,5	2,4 / 15,3	1,1
P1B 01-F12	128,4	43,2	3,0	36,1 / 23,2	2,4
P1B 01-H1	78,8	35,7	2,2	14,1 / 30,5	1,4
	158,7	56,2	2,8	37,6 / 4,5	2,4
^{1}) E_{app} = V_{app} (S) / V_{app} (R)
^{2}) E = In[1-c(1+ee_{p})] / In[1-c(1-ee_{p})] con c = conversión, ee_{p}= valor de ee del producto

Se utilizó como producto de partida el DNA del clon P1B 01-E4 para una nueva ronda de mutagénesis mediante PCR. Para ello se aisló el plásmido pUCPL6A del clon y, tal como se describe anteriormente, se transformó en E. coli JM109. Después de la preparación del DNA del plásmido, se recuperó el fragmento grande de 1046 pb mediante restricción con Apal y BamHI y subsiguiente purificación y se ligó al correspondiente plásmido preparado pMut5. Después de la transformación y aislamiento del plásmido, sirvió este plásmido como DNA de plantilla en una reacción de PCR mutágena en las condiciones antes descritas. El DNA obtenido de la PCR mutágena sirvió para la preparación de una nueva biblioteca de mutantes (2. generación).

Resultados (2. ciclo)

De la biblioteca de mutantes de la 2. generación se sacaron aproximadamente 2200 clones para el ensayo de rastreo. En este caso se identificaron 10 mutantes con una enantioselectividad mejorada con respecto al mutante P1B 01-E4. Se investigaron más detalladamente 2 mutantes (P2B 04-G11 y P2B 08-H3) por análisis por GC.

TABLA 4 Mutantes elegidos de lipasa con enantioselectividad mejorada (2. ciclo)

Mutante	V _{app} (S)	V _{app} (R)	E_{app}^{1})	% de ee	Valor de E ^{2})
	(mOD/min)	(mOD/min)		(según GC)	(calculado
				/% de	según GC)
				conversión
P2B 04-G11	224,9	52,3	4,3	47,8 / 30,0	3,4
P2B 08-H3	310,8	67,4	4,6	56,6 / 19,3	4,1
^{1}) E_{app} = V_{app} (S) / V_{app} (R)
^{2}) E = In[1-c(1+ee_{p})] / In[1-c(1-ee_{p})] con c = conversión, ee_{p} = valor de ee del producto

Se utilizó el clon P2B 08-H3 para la siguiente ronda de mutaciones (3. generación).

Resultados (3. ciclo)

De la biblioteca de mutantes de la 3. generación se sacaron aproximadamente 2400 clones para el ensayo de rastreo. En este caso se identificó 1 mutante (P3B 13-D10) con una enantioselectividad mejorada con respecto al mutante P2B 08-H3. Se investigó más detalladamente ésta por análisis por GC.

TABLA 5 Mutantes elegidos de lipasa con enantioselectividad mejorada (3. ciclo)

Mutante	V_{app} (S)	V _{app} (R)	E_{app}^{1})	% de ee	Valor de E ^{2})
	(mOD/min)	(mOD/min)		(según GC)	(calculado
				/% de	según GC)
				conversión
P3B 13-D10	240,0	35,2	6,9	74,8 / 34,6	10,2
^{1}) E_{app} = V_{app} (S) / V_{app} (R)
^{2}) E = In[1-c(1+ee_{p})] / In[1-c(1-ee_{p})] con c = conversión, ee_{p} = valor de ee del producto

Resultados (4. ciclo)

De la biblioteca de mutantes de la 4. generación se sacaron aproximadamente 2000 clones para el ensayo de rastreo. En este caso se identificaron 4 mutantes (P3B 13-D10) con una enantioselectividad mejorada con respecto al mutante P3B 13-D10. Se investigó más detalladamente ésta por análisis por GC.

TABLA 6 Mutantes elegidos de lipasa con enantioselectividad mejorada (4. ciclo)

Mutante	V_{app} (S)	V_{app} (R)	E_{app}^{1})	% de ee	Valor de E^{2})
	(mOD/min)	(mOD/min)		(según GC)	(calculado
				/% de	según GC)
				conversión
P4B 04-H3	355,6	26,5	13,4	81,0 / 20,0	11,2
P4B 01-F2	162,4	13,8	11,7	82,1 / 5,0	10,6
P4B 15-G1	315,4	28,1	11,2	80,0 / 18,0	10,7
P4B 15-H7	288,0	25,1	11,5	78,4 / 22,0	10,2
^{1}) E_{app} = V_{app} (S) / V_{app} (R)
^{2}) E = In[1-c(1+ee_{p})] / In[1-c(1-ee_{p})] con c = conversión, ee_{p} = valor de ee del producto

Se utilizó el clon P4B 04-H3 para la siguiente ronda de mutaciones (5. generación).

Resultados (5. ciclo)

De la biblioteca de mutantes de la 5. generación se sacaron aproximadamente 5200 clones para el ensayo de rastreo. En este caso se identificaron 2 mutantes (P3B 13-D10) con una enantioselectividad mejorada con respecto al mutante P4B 04-H3. Se investigó más detalladamente ésta por análisis por GC.

TABLA 7 Mutantes elegidos de lipasa con enantioselectividad mejorada (5. ciclo)

Mutante	V_{app} (S)	V_{app} (R)	E_{app}^{1})	% de ee	Valor de E^{2})
	(mOD/min)	(mOD/min)		(según GC)	(calculado
				/% de	según GC)
				conversión
P5B 14-C11	275,9	17,3	15,9	77,0 / 43,0	13,7
P5B 08-F2	124,0	8,7	14,3	79,7 / 40,3	15,1
^{1}) E_{app} = V_{app}(S) / V_{app} (R)
^{2}) E = In[1-c(1+ee_{p})] / In[1-c(1-ee_{p})] con c = conversión, ee_{p} = valor de ee del producto

Secuenciación de los mutantes positivos

Mediante secuenciación de los mutantes positivos, se pueden localizar las mutaciones en los genes de lipasa (véase Figura 2). Después de la asignación de los tripletes de bases con los correspondientes aminoácidos, se obtienen los siguientes intercambios de aminoácidos con respecto a la lipasa de tipo silvestre de P. aeruginosa:

P1B 01-H1:	T103I (Thr_{103} \rightarrow Ile_{103}), S149G (Ser_{149} \rightarrow Gly_{149})
P1B 01-E4:	S149G (Ser_{149} \rightarrow Gly_{149})
P2B 08-H3:	S149G (Ser_{149} \rightarrow Gly_{149}), S155L (Ser_{155} \rightarrow Leu_{155})
P3B 13-D10:	S149G (Ser_{149} \rightarrow Gly_{149}), S155L (Ser_{155} \rightarrow Leu_{155}), V47G (Val_{47} \rightarrow Gly_{47})
P4B 04-H3:	S149G (Ser_{149} \rightarrow Gly_{149}), S155L (Ser_{155} \rightarrow Leu_{155}), V47G (Val_{47} \rightarrow Gly_{47}), S33N
	(Ser_{33} \rightarrow Asn_{33}), F259L (Phe_{259} \rightarrow Leu_{259})
P5B 14-C11:	S149G (Ser_{149} \rightarrow Gly_{149}), S155L (Ser_{155} \rightarrow Leu_{155}), V47G (Val_{47} \rightarrow Gly_{47}), S33N
	(Ser_{33} \rightarrow Asn_{33}), F259L (Phe_{259} \rightarrow Leu_{259}), K110R (Lys_{110} \rightarrow Arg_{110})

Se depositaron los mutantes P1B 01-E4, P2B 08-H3 y P3B 13-D10 con las denominaciones DSM 11 658, DSM 11 659 y DSM 11 659 el 16.07.1997 en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares S. L.(DSMZ GmbH, por sus siglas en alemán), D-38124 Brunswick, Mascheroder Weg 1b.

Se depositaron los mutantes P5B 14-C11 y P4B 04-H3 con las denominaciones DSM 12 320 y DSM 12 322 el 20.07.1998 en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares S. L.(DSMZ GmbH, por sus siglas en alemán), D-38124 Brunswick, Mascheroder Weg 1b.

Ejemplo 2

Las directrices para el cultivo de las bacterias, de la PCR mutágena, así como el procedimiento de ensayo sobre la enantioselectividad son análogos a los del Ejemplo 1. Sin embargo, la preparación de grandes bibliotecas de mutantes se realiza en este Ejemplo mediante recombinación in vitro.

El DNA utilizado para la recombinación in vitro o se genera mediante PCR mutágena o se obtiene por la unión del DNA de un número elegido de clones de una o varias generaciones de clones, formadas por PCR mutágena repetida. Si los productos de la PCR de una PCR mutágena eran un punto de partida para la obtención de DNA para la recombinación in vitro, se procederá como sigue: Se purifican los productos de PCR de la PCR mutágena (véase el Ejemplo 1), se cortan con las endonucleasas de restricción Apa I y BamH I, se une al correspondiente vector cortado pMUTS y seguidamente se transforma en E. coli JM 109. Se aísla el DNA del plásmido procedente de todos los clones de la transformación. Si un número preferido de clones elegidos de una o de diferentes generaciones en clones de mutantes era el punto de partida para la obtención de DNA para la recombinación in vitro, de igual manera se aísla y se reúne el DNA del plásmido del vector pMUT5 con las correspondientes variantes del gen de lipasa de P. aeruginosa. En los dos casos se sigue procediendo como sigue: Mediante restricción con la endonucleasa Pvu II se obtiene un fragmento grande de 1430 pb, que comprende, además del gen estructural para la lipasa de P. aeruginosa, los lugares de unión de los cebadores A y B ya utilizados en la PCR mutágena. Se purifica este fragmento y se divide mediante incubación con desoxirribonucleasa I (DNAasa I de páncreas de terneras) en fragmentos generados casualmente. En este caso se puede influir mediante la elección de las condiciones de incubación en el tamaño de los fragmentos, así como en la tasa de errores del reensamblaje siguiente.

\newpage

Tratamiento con DNAasa

En un volumen total de 100 \mul se incuban 3 \mug de fragmentos de Pvu II en tris/HCl 50 mM pH 7,5, MgCl_{2} 10 mM o MnCl_{2} 10 mM y 50 \mug/ml de BSA durante 10-25 min o 1-10 min a 23ºC con 0,075 U de DNAasa I. Se termina la reacción mediante incubación durante 10 minutos a 93ºC. En relación con la duración de la reacción se forman en este caso fragmentos menores de 500 pb a menores de 10 pb. En el caso de que solamente se utilice un determinado intervalo de tamaño, se pueden preparar estos fragmentos mediante electrotransferencia selectiva sobre membrana DEAE de geles de agarosa (según F. M. Ausubel, et al., compiladores, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 1989). Después de la purificación de los fragmentos mediante el Quiagen Nucleotide Removal Kit® (Firma Quiagen), se lleva a cabo el siguiente reensamblaje.

Reacción de reensamblaje

10-30 ng de los fragmentos que proceden de la restricción de DNAasa I se someten en tris/HCl 50 mM pH 9,0, (NH_{4})_{2} SO_{4} 20 mM, Tween® 20 al 0,01% (p/v), MgCl_{2} 1,5 mM, dNTPs 0,2 mM con 2 U de Taq polimerasa Goldstar (Firma Eurogentec) en un volumen total de 50 \mul al siguiente programa de PCR: 2 min a 94ºC, 2 min a 52ºC y 1 min a 72ºC, finalizando 7 min a 72ºC. Se añade la Taq polimerasa después de la etapa de desnaturalización de 1 minuto del 1. ciclo.

PCR

Se utiliza 1 \mul procedente de la reacción de reensamblaje en una reacción subsiguiente de PCR, que tiene las siguientes diferencias, tal como se ha descrito para la reacción de reensamblaje: en vez de los fragmentos generados de DNAasa I, se utiliza 1 \mul procedente de la reacción de reensamblaje como DNA de plantillas. Se añaden además los cebadores A y B en una concentración de 0,2 mM, así como dimetilsulfóxido al 10%. El protocolo de ciclos es como sigue:

2 min a 98ºC, 30 ciclos de 1 min a 94ºC, 2 min a 64ºC, 1 min a 72ºC y finalmente 7 min a 72ºC: se llevan a cabo cargas paralelas. Se purifican los productos de la PCR que se forman en estas reacciones, se restringen con las endonucleasas de restricción Apa I y BamH I y se clonan, tal como se ha descrito en el apartado "PCR mutágena" del Ejemplo 1.

Resultados (recombinación in vitro)

Se utilizaron 12 clones procedentes de la 1. generación de la biblioteca de mutantes obtenida mediante la PCR mutágena (véase el Ejemplo 1) para la recombinación in vitro. Se utilizaron los siguientes clones, que habían mostrado en el ensayo de rastreo enantioselectividad mejorada:

P1B 01-A2, P1B 01-A6, P1B 01-D2, P1B 01-D5, P1B 01-E1, P1B 01-E4, P1B 01-F3, P1B 01-F11, P1B 01-H1, P1B 01-H3, P1B 01-F12.

Se clona el DNA recombinado de estos clones según la manera de proceder antes descrita, tal como se indica en el apartado "PCR mutágena" y se utiliza el sobrenadante de los cultivos para el ensayo de la enantioselectividad. Se ensayaron aproximadamente 1000 clones recombinantes. Los dos recombinantes identificados S2A 01-E11 y S2A 02-G3 muestran con respecto al mejor mutante de la 1. generación (P1B 01_E4) del Ejemplo 1 una mejora significativa de la enantioselectividad.

TABLA 8 Mutantes elegidos de lipasa con enantioselectividad mejorada (recombinación in vitro)

Mutante	V_{app} (S)	V_{app} (R)	E_{app}^{1})	% de ee	Valor de E^{2})
	(mOD/min)	(mOD/min)		(según GC)	(calculado
				/% de	según GC)
				conversión
S2A 01-E11	145,6	41,6	3,5	41,0 / 27,0	2,8
S2A 02-G3	210,8	62,0	3,4	38,0 / 23,0	2,5
^{1}) E_{app} = V_{app} (S) / V_{app} (R)
^{2}) E = In[1-c(1+ee_{p})] / In[1-c(1-ee_{p})] con c = conversión, ee_{p} = valor de ee del producto

Ejemplo 3 Mutagénesis de saturación dirigida al sitio en la posición del aminoácido 155 del mutante de lipasa P3B 13-D10 Plásmidos

pMut5 13D10: Fragmento BamHI/Apal (1046 pb) del gen del mutante P3B 13D10 de la lipasa de P. aeruginosa en pBluescript KS II

pMut5\DeltaAK 13D10: deleción del fragmento AfIIII/Kpnl en pMut5 13D10

Se amplifica un fragmento del gen de la lipasa del mutante P3B 13D10 utilizando el plásmido pMut5 13D10 linearizado mediante la endonucleasa XmnI y subsiguiente cebador de PCR:

A: 5'-GCGCAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAA-3'

M: 5'-GGTACGCAGAATNNNCTGGGCTCGC-3'

N representa en este caso A o G o T.

Las condiciones de reacción son en este caso como sigue: un volumen de reacción de 50 \mul contiene tris/HCl 75 mM pH 9,0 (a 25ºC), (NH_{4})_{2}SO_{4} 20 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, Tween® 20 al 0,01% (p/v), DMSO al 10% (v/v); en cada caso 10 pmol del cebador; 0,1 ng del DNA de plantilla y 2 U de Taq polimerasa (Goldstar, Firma Eurogentec). El protocolo de ciclos es como sigue: Después de 2 min de desnaturalización a 98ºC siguen 30 ciclos con 1 min a 94ºC, 2 min a 64ºC, 1 min a 72ºC en un Robocycler 40 (Firma Stratagen), seguido de 7 min de incubación a 72ºC. Se añade la polimerasa de Taq después de la etapa de desnaturalización del 1. ciclo. Después de la purificación de los productos de la PCR mediante electroforesis con gel de agarosa y elución del DNA a partir del gel de agarosa utilizando el kit de extracto de Nucleospina (Macherey & Ángel), se utilizó éste como cebador (el llamado megacebador) en una subsiguiente PCR. Para ello se amplifica el gen de lipasa sobre el plásmido pMut5\DeltaAK 13D10 linearizado con la endonucleasa XmnI utilizando el siguiente cebador de PCR y en las condiciones de reacción antes descritas:

A: 5'-GCGCAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAA-3'

M: (megacebador) 5'-GCGTAATACGACTCACTATAGGGCGAA-3'

Las condiciones de reacción y el protocolo de ciclos son tal como se han descrito anteriormente con la diferencia, de que a la carga de reacción se añaden 1-10 ng del megacebador. La clonación de los productos de la PCR se realiza tal como se ha descrito en clonación de los productos de la PCR.

Resultados (mutagénesis de saturación 3. generación, P3B13-D10)

De la biblioteca de mutantes de la mutagénesis de saturación (3. generación, P3B 13-D10) se sacaron aproximadamente 900 clones para el ensayo de rastreo. En este caso se identificó 1 mutante (P4BSF 03-G10) con una enantioselectividad mejorada con respecto al mutante P3B 13-D10. Ésta se siguió investigando mediante análisis por GC.

TABLA 9 Mutantes elegidos de lipasa con enantioselectividad mejorada (3. generación, P3b 13-D10)

Mutante	V_{app} (S)	V_{app} (R)	E_{app}^{1})	% de ee	Valor de E^{2})
	(mOD/min)	(mOD/min)		(según GC)	(calculado
				/% de	según GC)
				conversión
P4BSF	384,7	25,3	15,2	87,3 / 19,0	20,4
03-G10
^{1}) E_{app} = V_{app} (S) / V_{app} (R)
^{2}) E = In[1-c(1+ee_{p})] / In[1-c(1-ee_{p}))] con c = conversión, ee_{p})= valor de ee del producto

Secuenciación de los mutantes positivos

Mediante secuenciación de los mutantes positivos, se pudieron localizar las mutaciones en los genes de lipasa (véase Figura 2). Después de la asignación de los tripletes de bases con los correspondientes aminoácidos, se obtuvo el siguientes intercambio de aminoácidos con respecto al mutante P3B 13-D10:

P4BSF 03-G10: L155F (Leu_{155}\rightarrow Phe1_{155})

Se depositó el mutante P4BSF 03-G10 con la denominación DSM 12 321 el 20.07.1998 en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares S. L.(DSMZ GmbH, por sus siglas en alemán), D-38124 Brunswick, Mascheroder Weg 1b.

(1) INDICACIONES GENERALES:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Studiengesellschaft Kohle mbH

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CALLE: Kaiser-Wilhelm-Platz 1

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Muelheim an der Ruhr

\vskip0.333000\baselineskip

(E)

NACIÓN: Alemania

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 45470

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

DENOMINACIÓN DE LA INVENCIÓN: Procedimiento para la preparación e identificación de nuevas hidrolasas con propiedades mejoradas

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 21

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

VERSIÓN LEGIBLE CON ORDENADOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

SOPORTE DE DATOS: disquete

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

SISTEMA DE FUNCIONAMIENTO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: Patentin Release #1.0, version #1.30 (EPA)

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INDICACIONES SOBRE LA SEC. ID. Nº: 1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: no se sabe

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GCGCAATTAA CCCTCACTAA AGGGAACAAA

\hfill

30

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INDICACIONES SOBRE LA SEC. ID. Nº: 2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: no se sabe

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GCGTAATACG ACTCACTATA GGGCGAA

\hfill

27

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INDICACIONES SOBRE LA SEC. ID. Nº: 3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1049 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: no se sabe

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: no se sabe

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: DNA genómico

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 85..1017

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE mat_péptido

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 163..1017

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

7

8

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INDICACIONES SOBRE LA SEC. ID. Nº: 4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 311 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: Nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 4:

9

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INDICACIONES SOBRE LA SEC. ID. Nº: 5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1049 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: no se sabe

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: no se sabe

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: DNA genómico

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 85..1017

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE mat_péptido

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 163..1017

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 5:

10

11

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INDICACIONES SOBRE LA SEC. ID. Nº: 6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 311 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

(Secuencia pasa a página siguiente)

12

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INDICACIONES SOBRE LA SEC. ID. Nº: 7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1049 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: no se sabe

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: no se sabe

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: DNA genómico

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 85..1017

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE mat_péptido

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 163..1017

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 7:

13

14

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INDICACIONES SOBRE LA SEC. ID. Nº: 8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 311 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

(Secuencia pasa a página siguiente)

15

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INDICACIONES SOBRE LA SEC. ID. Nº: 9:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1047 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: no se sabe

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: no se sabe

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: DNA genómico

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 84..1016

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE mat_péptido

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 162..1016

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 9:

16

17

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INDICACIONES SOBRE LA SEC. ID. Nº: 10:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 311 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

(Secuencia pasa a página siguiente)

18

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INDICACIONES SOBRE LA SEC. ID. Nº: 11:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1050 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: no se sabe

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: no se sabe

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: DNA genómico

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 85..1017

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE mat_péptido

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 163..1017

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 11:

19

20

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INDICACIONES SOBRE LA SEC. ID. Nº: 12:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 311 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

21

22

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INDICACIONES SOBRE LA SEC. ID. Nº: 13:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1049 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: no se sabe

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: no se sabe

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: DNA genómico

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 85..1017

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE mat_péptido

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 163..1017

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 13:

23

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INDICACIONES SOBRE LA SEC. ID. Nº: 14:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 311 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 14:

24

25

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INDICACIONES SOBRE LA SEC. ID. Nº: 15:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1049 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: no se sabe

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: no se sabe

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: DNA genómico

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 85..1017

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE mat_péptido

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 163..1017

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

26

27

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INDICACIONES SOBRE LA SEC. ID. Nº: 16:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 311 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

(Secuencia pasa a página siguiente)

28

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INDICACIONES SOBRE LA SEC. ID. Nº: 17:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1049 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: no se sabe

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: no se sabe

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: DNA genómico

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 85..1017

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE / CLAVE mat_péptido

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 163..1017

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 17:

29

30

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INDICACIONES SOBRE LA SEC. ID. Nº: 18:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 311 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

31

32

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INDICACIONES SOBRE LA SEC. ID. Nº: 19:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: no se sabe

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GCGCAATTAA CCCTCACTAA AGGGAACAAA

\hfill

30

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INDICACIONES SOBRE LA SEC ID Nº: 20:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: no se sabe

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GGTAACGCAGA ATNNNCTGGG CTCGC

\hfill

25

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INDICACIONES SOBRE LA SEC. ID. Nº: 21:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: nucleótido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

FORMA DE LA CADENA: no se sabe

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE LA MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GCGTAATACG ACTCACTATA GGGCGAA

\hfill

27

Claims (27)

1. Procedimiento para la preparación e identificación de mutantes de hidrolasas con propiedades mejoradas con respecto a la estereo- o regioselectividad, caracterizado porque

a)

se muta un gen de partida de hidrolasas mediante una reacción modificada en cadena de polimerasa (PCR), ajustándose, mediante ajuste de las concentraciones de Mg^{2+}, Mn^{2+} y de los desoxinucleótidos, una frecuencia media de mutación de 1-2 intercambios de bases, con relación al gen de hidrolasa que se va a mutar, así como mediante ajuste del número de ciclos, el número total de mutaciones en el DNA amplificado,

b)

eventualmente, se mutan uno o varios genes de hidrolasas mutados según la etapa a) o mezclas de uno o varios genes de partida de hidrolasas y uno o varios genes de hidrolasas mutados según la etapa a) por fragmentación enzimática de estos genes y subsiguiente reordenación enzimática de los fragmentos formados para obtener genes de hidrolasas totalmente recombinados,

c)

los genes de hidrolasas mutados según la etapa a) o b) se transforman en un organismo hospedador y

d)

se identifican mediante un procedimiento de ensayo los mutantes de hidrolasas con propiedades mejoradas con respecto a la estereo- o regioselectividad, que se expresan de los transformantes obtenidos en la etapa c).

2. Procedimiento según la reivindicación 1, utilizándose en la etapa a) como gen de partida de hidrolasas un gen de hidrolasas mutado en una PCR anterior realizada según la reivindicación 1.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque en la etapa b) se realiza la fragmentación del gen de hidrolasas con una desoxirribonucleasa.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el reensamblaje en la etapa b) se realiza de manera enzimática con la ayuda de una DNA polimerasa termoestable utilizando un programa de temperatura cíclico, en el cual se fijan los parámetros de temperatura y duración de los ciclos.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, fijándose en la etapa b) la frecuencia de mutaciones durante el reensamblaje enzimático mediante ajuste de la concentración de Mg^{2+}, de Mn^{2+} y de los desoxinucleótidos.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, amplificándose en la etapa b) mediante una reacción en cadena de la polimerasa el gen de las hidrolasas totalmente recombinado después de finalizar la reacción de reensamblaje.

7. Procedimiento según la reivindicación 1, sometiéndose en la etapa b) a la fragmentación y reensamblaje o el gen de hidrolasas modificado obtenido de la etapa a) según la reivindicación 1, o varios genes de hidrolasas mutados según la reivindicación 2.

8. Procedimiento según la reivindicación 1, utilizándose además en la etapa b) para el reensamblaje fragmentos de genes preparados de manera sintética.

9. Procedimiento según la reivindicación 1, pudiéndose utilizar en la etapa b) para el reensamblaje fragmentos de gen de hidrolasas procedentes de diferentes organismos, que contienen una homología de secuencia entre sí de al menos 60%.

10. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 5, siendo los mutantes de hidrolasas mutantes de lipasas o de esterasas y siendo la concentración de los iones magnesio 1,5 a 8,0 mM, preferiblemente 5,8 a 6,4 mM y siendo la concentración de los iones manganeso 0,0 a 3,0 mM, preferiblemente < 0,3 mM.

11. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 5, siendo los mutantes de hidrolasas mutantes de lipasas o de esterasas y siendo la concentración de los trifosfatos de desoxinucleótido 0,05 mM a 1,0 mM, preferiblemente 0,2 mM.

12. Procedimiento según la reivindicación 1, realizándose en la etapa d) el ensayo sobre estereo- o regioselectividad mediante la determinación de la variación temporal de concentraciones de ácidos grasos libres o ácido succínico, hidrolizándose los correspondientes ésteres o amidas de ácidos carboxílicos estereo- o regioisómeros con la ayuda de mutantes de hidrolasas en recipientes separados para dar ácidos grasos libres o ácido succínico.

13. Procedimiento según la reivindicación 1, realizándose en la etapa d) el ensayo sobre estereo- o regioselectividad mediante la medida de la radiactividad, haciendo reaccionar los mutantes de hidrolasas con estereo- o regioisómeros marcados radiactivamente de manera diferente en un grupo funcional, estando fijada en un soporte la mezcla de estereo- y regioisómeros.

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14. Procedimiento según la reivindicación 13, estando marcado uno de los estereo- o regioisómeros de la mezcla unida al soporte del compuesto isómero con el radioisótopo ^{3}H y el otro estereo- o regioisómero con el radioisótopo ^{14}C.

15. Procedimiento según la reivindicación 1, realizándose en la etapa d) el ensayo sobre estereoselectividad mediante la determinación por electroforesis capilar de los productos y eductos de la reacción de una reacción de ensayo, realizándose la separación de productos y eductos de la reacción en capilares quiralmente modificados.

16. Procedimiento según las reivindicaciones 12 a 15, realizándose varias reacciones de forma paralela en placas de microtitulación.

17. Procedimiento según la reivindicación 1, localizándose mediante secuenciación en los mutantes identificados en la etapa d) con propiedades mejoradas la posición del codón que codifica el aminoácido alterado, siguiendo, mediante mutagénesis de saturación dirigida al sitio, un conjunto de genes de hidrolasas con todos los codones posibles para esta posición, y se siguen tratando los genes de hidrolasas mutados así obtenidos de manera análoga a las etapas c) y d) de la reivindicación 1.

18. Procedimiento según la reivindicación 17, realizándose la localización de la posición del codón, que codifica el aminoácido cambiado, mediante secuenciación de DNA.

19. Mutantes de lipasa con estereoselectividad mejorada con respecto a ácidos carboxílicos quirales o compuestos con función COOH quirales que la lipasa de partida mostrada en la Fig. 2 procedente de la cepa P. aeruginosa, que se obtiene mediante mutagénesis de la lipasa de partida con un procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 1 a 18.

20. Mutante de lipasa según la reivindicación 19, que se puede obtener por expresión de los transformantes P1B 01-E4 (DSM 11 658), P2B 08-H3 (DSM 11 659), P3B 13-D10 (DSM 11 660), P4B 04-H3 (DSM 12 322), P5B 14-C11 (DSM 12 320) o P4BSF 03-G10 (DSM 12 321).

21. Mutante de lipasa según la reivindicación 19, que tiene la secuencia de aminoácidos de las proteínas maduras mostradas en la SEC. ID. N^{os.} 4, 6, 8, 12, 14, 16 ó 18.

22. Secuencia de DNA, que codifica un mutante de lipasa según una o varias de las reivindicaciones 19 a 21.

23. Secuencia de DNA según la reivindicación 22, que comprende una secuencia de DNA mostrada en las SEC. ID. N^{os.} 3, 5, 7, 11, 13, 15 ó 17.

24. Vector, que comprende una secuencia de DNA según la reivindicación 22 ó 23.

25. Transformantes, que comprenden una secuencia de DNA según la reivindicación 22 ó 23 y/o un vector según la reivindicación 25.

26. Transformante según la reivindicación 25, que es el transformante P1B 01-E4 (DSM 11 658), P2B 08-H3 (DSM 11 659), P3B 13-D10 (DSM 11 660), P4B 04-H3 (DSM 12 322), P5B 14-C11 (DSM 12 320) o P4BSF 03-G10 (DSM 12 321).

27. Procedimiento para la preparación de mutantes de lipasa según la reivindicación 19, que comprende cultivar un transformante según la reivindicación 25 ó 26.