ES2203640T3

ES2203640T3 - Papilomavirus recombinante l1.

Info

Publication number: ES2203640T3
Application number: ES95918467T
Authority: ES
Inventors: Ian Frazer; Jian Zhou
Original assignee: University of Queensland UQ
Current assignee: University of Queensland UQ
Priority date: 1994-05-17
Filing date: 1995-05-17
Publication date: 2004-04-16
Anticipated expiration: 2015-05-17
Also published as: JPH10500295A; PT1325957E; CA2190473A1; EP0759935A4; CA2190473C; JP2006321806A; ATE245164T1; DK0759935T3; EP0759935B1; EP0759935A1; NZ285339A; ES2275965T3; JP4016054B2; WO1995031476A1; JP2006001936A; EP1325957A2; KR100384922B1; PT759935E; DE69531297D1; EP1325957B1

Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE A UNA PROTEINA RECOMBINANTE DE TIPO L1 DEL VIRUS DEL PAPILOMA QUE PUEDE PROVOCAR UNA RESPUESTA INMUNE QUE RECONOCE EL VIRUS DEL PAPILOMA VLP QUE INCLUYE LA PROTEINA L1 Y PUEDE FORMAR EXTRACELULARMENTE UNA ESTRUCTURA MULTIMERICA O VLP CUYA ESTRUCTURA COMPRENDE UNA PLURALIDAD DE PROTEINAS L1 RECOMBIANNTES DEL VIRUS DEL PAPILOMA. ESTA INVENCION TAMBIEN INCLUYE EL USO DE LA PROTEINA L1 RECOMBINANTE DEL VIRUS DEL PAPILOMA PARA DETECTAR LA PRESENCIA DE DICHO VIRUS Y PUEDE CONSTITUIR LA BASE DE UNA VACUNA PARA USO PREVENTIVO Y TERAPEUTICO.

Description

Papilomavirus recombinante L1.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a papilomavirus con la proteína L1. En particular, la invención se refiere a la proteína L1 de papilomavirus recombinantes y a su uso para detectar y tratar infecciones producidas por papilomavirus.

Antecedentes de la invención

Los papilomavirus infectan a una serie de hospedadores incluyendo el ser humano, vacas, ovejas, perros y gatos. Para una lista más completa, véase "Papilloma Virus infections in Animals" por J.P. Sundberg, que se describe en Papilloma Viruses and Human Diseases, editado por K. Syrjanen, L. Gissman y L.G. Koss, Springer Verlag, 1987.

Los papilomavirus humanos inducen lesiones hiperproliferativas benignas del epitelio cutáneo y mucoso. De los 70 tipos diferentes de virus que infectan a los seres humanos, más de 20 están asociados con lesiones anogenitales (de Villiers, 1989, J. Virol. 63 4898-4903). Los papilomavirus también se han asociado con diversas formas de cánceres. Los papilomavirus humanos de tipo 16 y 18 se han asociado con varias neoplasias intra-epiteliales cervicales y carcinomas del cuello del útero (Lancaster et al., 1987, Cancer Metast. Rev. 6 6653-6664 y Pfister, 1987, Adv. Cancer Res. 48 113-147).

Los papilomavirus son virus de ADN pequeños que codifican hasta ocho genes tempranos y dos genes tardíos. Los genes tardíos L1 y L2 codifican proteínas estructurales que se ensamblan formando una cápsida dentro de la célula (Galloway et al., 1989, Adv. Virus Res. 37 125-171). La cápsida de un solo virus es un icosaedro T=7d compuesto de 360 capsómeros pentaméricos, conteniendo cada uno de ellos cinco moléculas de la proteína principal de la cápsida L1 (Baker et al., 1991, Biophys. J. 60 1445-1456 y Finch et al., 1965, J. Mol. Bio. 13 1-12). La proteína minoritaria de la cápsida L2 está presente en una cantidad de aproximadamente un décimo de L1 (Doorbar et al., 1987, J. Virol. 61 2793-2799).

Aún no se ha conseguido la propagación de los papilomavirus humanos in vitro (Taichman et al, 1984, J. Invest. Dermatol 83 25) y sólo se han aislado pequeñas cantidades de proteínas de HPV a partir de tejidos infectados (Androphy et al., 1987, Embo J. 6 1989; Banks et al., 1987, J. Gen. Virol. 68 1351; Firzlaff et al., 1988, Virology 164 467; Oltersdorf et al., 1987, J. Gen. Virol. 68 2933; Schneider-Gadicke et al., 1988, Cancer Res. 48 2969; Seedorf et al., Embo J. 6 139 y Smotkin et al., 1986, PNAS 83 4680). Sin embargo, el gen que codifica la proteína L1 se ha clonado y expresado en un sistema de expresión eucariótico usando un virus de vaccinia recombinante (Browne et al., 1988, J. Gen. Virol. 69 1263-1273; Zhou et al, 1990, J. Gen. Virol. 71 2185-2190 y Zhou et al, 1991, Virology 185 251-257), en un sistema de expresión de baculovirus (Park et al, 1993, J. Virol. Meth. 45 303-318) y en un sistema de expresión bacteriano (Strike et al, 1989, J. Gen. Virol. 70 543-555).

Como la proteína L1 es la proteína principal de la cápsida, se ha usado como base para el desarrollo de vacunas para la protección contra la infección por papilomavirus. Zhou et al. inmunizaron ratones con partículas sintéticas parecidas al virus HPV16 (VLP) usando un virus de vaccinia doble recombinante para las proteínas L1 y L2 de HPV16. El antisuero anti-VLP murino reconocía cápsidas de HPV16 por ELISA y las proteínas L1 y L2 de HPV16 recombinante de baculovirus en inmunotransferencia. Sin embargo, el antisuero anti-VLP murino no reconocía dos péptidos que se reconocían por anticuerpos monoclonales anti-L1 de HPV16 inducidos contra una proteína de fusión L1 recombinante (Zhou et al., 1992, Virology 189 592-599). Estos investigadores concluyeron que los epítopos inmunorreactivos de HPV16 definidos usando partículas parecidas a virus diferían significativamente de los definidos usando proteínas de fusión de L1 de HPV16 recombinante.

Para solucionar los problemas de presentación, se crearon vacunas usando partículas parecidas a virus. Se formaron VLP intracelularmente a partir de proteínas L1 o L1 y L2 recombinantes codificadas por un virus de vaccinia recombinante (Zhou et al., 1991, Virology 185 251-257, Zhoy et al., 1991, Virology 181 203-210 y Memoria Descriptiva de la Patente Internacional WO93/02184). Estas vacunas preparadas usando partículas sintéticas parecidas a virus tienen varios inconvenientes. En primer lugar, los genes L1 o L1 y L2 recombinantes se expresan a partir de un vector de virus de vaccinia que puede no ser adecuado para la producción de una vacuna. En segundo lugar, las partículas parecidas a virus se producen intracelularmente, lo cual es una etapa limitante de la velocidad. En tercer lugar, las partículas parecidas a virus pueden incorporar ADN celular porque se producen intracelularmente y las partículas parecidas a virus que incorporan ADN no son adecuadas para uso en vacunas. En cuarto lugar, las partículas parecidas a virus pueden purificarse sólo parcialmente debido a la necesidad de retener su integridad y, por lo tanto, la correcta presentación del epítopo. Por consiguiente, otras proteínas o materias asociadas con las partículas parecidas a virus pueden contaminar una preparación de vacuna. En quinto lugar, el proceso de producción de una vacuna en cantidades comerciales con partículas parecidas a virus a partir virus de vaccinia recombinantes es comparativamente caro.

Se aplican inconvenientes similares al uso de partículas parecidas a virus producidas a partir de virus de vaccinia recombinantes para la detección de anticuerpos en el suero de pacientes. Rose, R.C.; Bonnez, W., Reichman, R.C. y Garcea, R.L. (1993) J. Virol. 67, 1936-1944 enseñan el autoensamblaje de L1 expresada en células de insectos para formar partículas parecidas a virus que presentan epítopos presentes en las partículas de virus nativas. De acuerdo con este documento, la desnaturalización de L1 conduce a una pérdida de los epítopos mencionados anteriormente.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un método para preparar una estructura multimérica que comprende una o más proteínas L1 de papilomavirus recombinante expresadas en bacterias, incluyendo dicho método las etapas de:

(i) expresar una molécula de ADN recombinante que codifica un proteína L1 de papilomavirus recombinante en una célula bacteriana;

(ii) obtener dicha proteína L1 de papilomavirus recombinante a partir de dicha célula bacteriana en condiciones de desnaturalización;

(iii) purificar dicha proteína L1 de papilomavirus recombinante obtenida en la etapa (ii); y

(iv) formar dicha estructura multimérica a partir de una o más de dichas proteínas L1 de papilomavirus recombinante purificadas en la etapa (iii).

Preferiblemente, la formación de dicha estructura multimérica en la etapa (iv) se realiza en ausencia de sal.

La molécula de ADN recombinante puede comprender una secuencia de nucleótidos 5' de acuerdo con la SEC ID Nº: 2. Además, la molécula de ADN recombinante puede comprender una secuencia de nucleótidos 5' de acuerdo con la SEC ID Nº: 3.

La molécula de ADN recombinante puede comprender una secuencia de nucleótidos que puede hibridar en condiciones convencionales con la SEC ID Nº: 2 o la SEC ID Nº: 3.

La molécula de ADN recombinante puede insertarse en pTrcHisB en una fase de lectura correcta con respecto a la expresión de la proteína L1 de papilomavirus.

La proteína L1 de papilomavirus puede expresarse en una célula bacteriana E. coli.

El método de la invención, además, puede incluir la etapa de incorporar la estructura multimérica en una vacuna.

La proteína L1 de papilomavirus recombinante puede ser una proteína de fusión.

El método puede usar estructuras multiméricas que comprenden proteínas L1 de papilomavirus recombinante que tienen una secuencia de aminoácidos N terminal que incluye (His)_{6}. La secuencia de aminoácidos N terminal (SEC ID Nº:1) puede incluir:

1

La molécula de ADN recombinante puede construirse a partir de una fuente adecuada de ADN de papilomavirus tal como un papilomavirus humano o un papilomavirus bovino, usando técnicas de clonación y/o de PCR convencionales. La molécula de ADN recombinante también puede incluir un vector de expresión. El vector de expresión puede ser un plásmido, cósmido, fagémido o un virus. Un vector de expresión adecuado codifica (en el siguiente orden) un sitio ATG, un péptido (His)_{6} y después un sitio de clonación donde puede insertarse la secuencia de ADN de la proteína L1 de papilomavirus en la fase de lectura correcta de forma que se obtenga una proteína de fusión (His)_{6}-proteína L1 tras la traducción. Un vector de expresión preferido es uno cualquiera de los plásmidos pTrcHisA, pTrcHisB y pTrcHisC. Un hospedador adecuado es una cepa de E. coli.

El sistema de expresión preferido es un sistema de expresión bacteriano con E. coli y el plásmido pTrcHisB. La introducción de la molécula de ADN recombinante en un hospedador adecuado puede conseguirse por cualquier método adecuado, incluyendo transfección y transformación. Una molécula de ADN recombinante preferida es la secuencia de ADN completa de la proteína L1 de HPV6b insertada en pTrcHisB en una orientación de fase de lectura correcta para formar pTrc6bL1. La molécula de ADN recombinante pTrc6bL1 preferiblemente se utiliza para transformar la cepa DH5 de E. coli.

Después de la expresión, el sistema de expresión puede romperse. Cuando el sistema de expresión es un sistema celular, la célula puede lisarse con técnicas y agentes adecuados tales como sonicación en un tampón que contiene clorhidrato de guanidinio. La proteína L1 de papilomavirus recombinante puede purificarse parcial o completamente. La purificación puede conseguirse usando uno cualquiera o varios procedimientos cromatográficos adecuados. La proteína L1 de papilomavirus recombinante puede purificarse usando una etapa de cromatografía de afinidad con una columna de níquel. Otras etapas de purificación adicionales pueden incluir electroforesis en gel preparativa.

En otro aspecto, la invención proporciona una vacuna profiláctica o terapéutica que incluye dicha proteína L1 de papilomavirus recombinante. La vacuna puede incluir un adyuvante adecuado tal como ISCOMS, alumbre, adyuvante incompleto de Freund, adyuvante completo de Freund, Quil A, otras saponinas, hidróxido de aluminio, algammulin y toxina pertussis. Como alternativa, la vacuna puede no incluir adyuvante, cuando la proteína L1 de papilomavirus recombinante es inmunogénica sin adyuvante.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 ilustra la secuencia de nucleótidos de ADN y la secuencia de aminoácidos de la proteína HPV6bL1
HEXAHIS (SEC ID Nº:3); y

La Fig. 2 es una micrografía electrónica de estructuras pentaméricas de agregados de la proteína HPV6bL1
HEXAHIS.

Ahora puede hacerse referencia a diversas realizaciones preferidas de la invención. En estas realizaciones preferidas, debe indicarse que las referencias particulares a papilomavirus, vacunas y construcciones de moléculas de ADN recombinantes se proporcionan sólo a modo de ejemplo.

Parte experimental Ejemplo 1 Producción de proteína HPV6b L1 HEXAHIS Construcción de pTRC6bL1

La fase de lectura abierta de L1 de HPV6b se clonó a partir de un aislado clínico por medio de una reacción en cadena de la polimerasa usando como cebadores:

2

El producto de PCR de 1,5 kb resultante se escindió con BamH1 y Sam1 y se clonó en un sitio BamH1/Eco R1 de extremos romos por la acción el fragmento de klenow, creado dentro del plásmido pTRCHIS B (Invitrogen). El plásmido recombinante de L1 resultante fue pTRC6bL1.

Cultivo de Bacterias que codifican la proteína HPV6b L1 HEXAHIS

Se inocularon 10 ml de caldo 2YT (16 mg de triptona, 10 mg de levadura, 5 mg de NaCl) que contenía ampicilina (concentración final 100 \mug/ml) con 10 \mul de un asa de bacterias (E. coli DH5) procedentes de una solución madre en glicerol. El cultivo se incubó a 37ºC con aireación a 120 rpm durante seis horas.

Se inocularon 200 ml de caldo 2YT que contenía ampicilina (concentración final 100 \mug/ml) con el cultivo de 10 ml de 6 horas. El cultivo se incubo a 37ºC con aireación a 120 rpm durante una noche.

En 800 ml del caldo 2YT que contenía ampicilina (concentración final 100 \mug/ml) se inoculó el cultivo de una noche de 200 ml. El cultivo se incubó a 37ºC con aireación a 120 rpm hasta que la absorbancia alcanzó un valor comprendido entre 0,6 y 0,8 unidades O.D. a 600 nm (normalmente 2-3 horas). La proteína HPV6b L1 HEXAHIS se indujo por la adición de IPTG 0,5 mM durante 4-6 horas.

Las bacterias se sedimentaron por centrifugación (rotor Beckman JA14 centrifugado a 5000 rpm durante 10 minutos a 20ºC). El sedimento se lavó en 50 ml de solución salina tamponada con fosfato resuspendiendo el sedimento bacteriano en un tubo de centrifuga de 50 ml. Las bacterias lavadas se volvieron a sedimentar por centrifugación (Beckman TJ-6 a 3000 rpm durante 10 minutos a 20ºC). El sobrenadante se desechó. El sedimento se almacenó a -20ºC o a -70ºC hasta que fue necesario.

Purificación de Proteína HPV6b L1 HEXAHIS

Las bacterias se resuspendieron y se lisaron en 50 ml de tampón de lisis de guanidinio (clorhidrato de guanidinio 6 M y 5,8 ml/litro de solución A [NaH_{2}PO_{4} 177 mM, NaCl 5 M] pH 7,8 usando HCl). La suspensión se sonicó a un
rendimiento del 30% durante 2 minutos. Los desechos celulares se sedimentaron por centrifugación (rotor Beckman JA21 a 10000 rpm durante 30 minutos a 4ºC). Se retuvo el sobrenadante que contenía la proteína HPV6b L1 HEXAHIS.

La proteína HPV6b L1 HEXAHIS se purificó substancialmente por medio de un procedimiento de purificación esencialmente de dos etapas.

El sobrenadante que contenía la proteína HPV6b L1 HEXAHIS se introdujo en una columna de níquel (2,6 cm x 6 cm) usando un sistema BIORAD ECONO a 4ºC. Antes de introducir el sobrenadante, la columna se lavó minuciosamente con tampón NA a 1 ml/minuto. El tampón NA comprende urea 6 M, 5,8 ml/litro de solución A [NaH_{2}PO_{4} 177 mM y NaCl 5 M], y 94 ml/l de solución B [Na_{2}HPO_{4} 200 mM y NaCl 5 M] a pH 7,8 usando HCl antes de añadir la urea. El sobrenadante se introdujo en la columna de níquel a 1 ml/minuto. Se recogieron fracciones de 10 ml cuando la columna se había sobrecargado y sólo eluyó la proteína no unida a través de la columna. Después de introducir el sobrenadante, la columna se lavó con tampón NB a un caudal de 1 ml/minuto. El tampón NB comprende urea 6 M y 100 ml/litro de solución A [NaH_{2}PO_{4} 177 M y NaCl 5 M] a pH 4,0 usando HCl antes de añadir la urea. La columna se lavó con tampón NB de acuerdo con el procedimiento de la tabla 1 donde la reducción del gradiente del pH eliminó las proteínas contaminantes. Se recogieron fracciones de 10 ml del eluyente.

Las fracciones que contenían la proteína HPV6b L1 HEXAHIS se determinaron por dot blot, ELISA directo o SDS PAGE. Después de identificar las fracciones, se continuó el lavado de la columna con tampón NB al 100% hasta que el pH se niveló. La columna después se lavó con tampón NA. (La columna se almacenó en etanol al 20%).

Las fracciones que contenían la proteína HPV6b L1 HEXAHIS se reunieron y se dializaron frente a cinco litros de dH_{2}O o Tris HCl 10 mM, pH 7,5, durante una noche a 4ºC (o dos horas a temperatura ambiente). La proteína después se precipitó con acetona en una relación entre acetona y muestra de 8:2, durante dos horas a -70ºC o durante una noche a -20ºC. La solución de proteína-acetona se centrifugó (Beckman TJ-6 a 3000 rpm y 4ºC durante 20 minutos). El sobrenadante se desechó. El sedimento se secó bajo una corriente de gas nitrógeno durante cinco minutos para retirar toda la acetona restante.

El sedimento se resuspendió en 1 ml de ddH_{2}O y 4-5 ml de 4 x tampón de carga [1,0 ml de Tris 0,5 M, pH 6,8, 0,8 ml de glicerol, 1,6 ml de SDS al 10% p/v, 0,1 g de DTT al 1% p/v, 0,2 ml de azul de bromofenol al 0,1% p/v y 4,4 ml de dH_{2}O]. El sedimento resuspendido se calentó a 65-70ºC durante15 minutos para asegurar que se había disuelto toda la proteína.

La resuspensión se introdujo en una BIORAD Prep Cell que contenía un gel de separación al 10% (de 4,5 cm de altura por 4 cm de diámetro) con un gel de adherencia al 4% (de 4 cm de altura por 4 cm de diámetro). La Prep Cell se hizo funcionar a una potencia constante de 12 W.

Cuando el colorante en la parte frontal del gel alcanzó 2 cm desde la parte inferior, se recogieron fracciones de 10 ml a una velocidad de elución de 1 ml/minuto. Las fracciones se ensayaron con respecto a la proteína HPV6b L1 HEXAHIS por dot blot, ELISA directo o SDS PAGE (con el sistema Phast). Las fracciones positivas se ensayaron en SDS PAGE y se reunieron las que se descubrió que tenían una sola banda de proteína HPV6bL1HEXAHIS. Las fracciones reunidas se dializaron frente a 5 litros de ddH_{2}O para retirar la glicina. La diálisis se realizó durante una noche a una temperatura de 4ºC y usando dos cambios de ddH_{2}O.

La proteína HPV6b L1 HEXAHIS dializada se precipitó con acetona para retirar el SDS. Se usó una relación entre acetona y muestra de 8:2 durante 2 horas a -70ºC o durante una noche a -20ºC. La solución de proteína-acetona se centrifugó (Beckman TJ-6 a 3000 rpm y a 4ºC durante 20 minutos). El sobrenadante se desechó y el sedimento se secó bajo una corriente de gas nitrógeno durante cinco minutos para retirar toda la acetona restante.

Después, la proteína se resuspendió en un tampón elegido y pudo determinarse su concentración. Posteriormente se demostró que esta proteína formaba capsómeros por medio de la purificación de la proteína HPV6b L1 HEXAHIS como se ha descrito, la eliminación gradual de la urea por diálisis frente a Tris HCl 10 mM pH 7,5, y el examen del inmunoprecipitado resultante por microscopía electrónica de barrido. La fig. 2 muestra las estructuras pentaméricas típicas de agregados de proteína de HPV6b L1 HEXAHIS.

Ejemplo 2 Demostración de la producción de anticuerpos contra la proteína HPV6b L1 HEXAHIS

Para producir anticuerpos contra la proteína HPV6b L1 HEXAHIS, a ratones (cepa C57BI/6) se les inyectaron por vía subcutánea dos veces, a un intervalo de cuatro semanas, 50 \mug de proteína/ratón siguiendo el protocolo experimental de la tabla 2. Dos semanas después de la segunda inyección, se extrajo sangre de los ratones. Se obtuvo suero de los ratones a partir de la sangre extraída usando procedimientos convencionales.

El suero se ensayó con respecto a la producción de anticuerpos contra la proteína HPV6b L1 HEXAHIS usando tres antígenos diferentes.

El suero se ensayó frente a una preparación de cápsida de HPV6B de papilomavirus humano. El suero de diluyó a 1 en 200 y se ensayó frente a una preparación de cápsida de HPV6B en tampón RIPA (Tris-HCl 20 mM, pH 7,6; EDTA 2 mM; NaCl 50 mM, desoxicolato al 1%; Triton X-100 al 1%, SDS al 0,25%, aprotinina al 1% y PMSF 1 mM). Los precipitados de anticuerpo-antígeno se procesaron en SDS PAGE al 10% separando los componentes individuales del complejo inmune. La presencia de la proteína HPV6b L1 se detectó con anticuerpo anti-L1 de HPV6b. La presencia de la proteína L1 de HPV6b indica que se produjo anticuerpo anti-L1 de HPV6b en el ratón contra la proteína 6bL1HEXAHIS. Los grupos A, B, C, D, E y F dieron resultados positivos.

El suero también se ensayó por análisis de transferencia de western con L1 de HPV6b producida a partir de baculovirus. Un resultado positivo indica que se produjo anticuerpo anti-L1 de HPV6b en el ratón contra la proteína HPV6b L1 HEXAHIS. Los grupos A, B, C, D, E y F dieron resultados positivos, demostrándose los mejores resultados cuando se usó hidróxido de aluminio como adyuvante. Los grupos de control A, B, C, D y E dieron resultados negativos.

El suero se ensayó por dot blot y ELISA usando técnicas convencionales contra la proteína L1 del papilomavirus bovino. Se consiguió el mejor resultado con suero de ratones del grupo D (es decir, cuando se usó aluminio como adyuvante) con una lectura de OD de 0,96. Éste estuvo seguido del suero del grupo C (es decir, con adyuvante completo de Freund) con una lectura de OD de 0,70, del suero del grupo E (es decir, con algammulin) con una lectura de OD de 0,34, después, del suero del grupo B (es decir, hervido en SDS al 1% y enfriado) con una lectura de OD de 0,24 y del suero del grupo A (sin adyuvante) con un lectura de OD de 0,34. Todos los grupos de control tuvieron una lectura de OD de 0,05.

El ensayo del suero frente a tres antígenos diferentes demostró que la proteína HPV6b L1 HEXAHIS era inmunogénica y producía anticuerpos anti-L1 de HPV6b cuando se usaba como un antígeno con o sin adyuvante.

Ejemplo 3 Demostración de hipersensibilidad de tipo retrasado (y confirmación de producción de anticuerpos) en ratones por la proteína HPV6b L1 HEXAHIS

La hipersensibilidad de tipo retrasado implica reacciones inmunes mediadas por células así como algunas reacciones inmunes humorales. Se trataron ratones (cepa BALB/c) (por inyección intraperitoneal) con la proteína HPV6b L1 HEXAHIS en una diversidad de condiciones indicadas en la tabla 3. En el día 11, la oreja se expuso (por inyección intradérmica) a la proteína HPV6b L1 HEXAHIS o a otra proteína HEXAHIS. Se midió el espesor de la oreja en el día 13 y en el día 14. Los ratones que dieron una respuesta positiva en el día 14 se sacrificaron y se examinó la histología de la oreja.

En este ejemplo, se demostró que la proteína HPV6b L1 HEXAHIS sin adyuvante inducía una buena hipersensibilidad de tipo retrasado con dosis iniciales de 50 \mug/ratón pero no a 5 \mug/ratón. Sin embargo, los ratones necesitaban tratarse con toxina pertussis para inducir una respuesta de hipersensibilidad de tipo retrasado.

Con respecto a los tres ejemplos, se ha demostrado que la proteína L1 de HPV6b expresada y aislada en el método del ejemplo 1 formaba agregados capsoméricos, y los agregados capsoméricos de la proteína L1 de HPV6b sin un adyuvante adicional eran inmunogénicos, produciendo una respuesta de anticuerpos y una respuesta mediada por células. Por lo tanto, la proteína HPV6b L1 HEXAHIS serviría como base adecuada para una vacuna diseñada para prevenir la infección por el papilomavirus humano por medio de la inducción de anticuerpos neutralizadores o para tratar lesiones existentes por medio de la inducción de inmunidad mediada por células específica para la proteína L1. Los ejemplos 1 a 3 han usado la proteína L1 de HPV6b como ejemplo para demostrar la inmunogenicidad de la preparación y, como ejemplo, la invención no se restringe a este ejemplo y puede usarse cualquier proteína L1 de papilomavirus.

Ejemplo 4 Demostración de que los anticuerpos inducidos contra la proteína HPV6b L1 HEXAHIS reconocen partículas parecidas a virus (VLP) de L1 de HPV6b

Se recubrieron pocillos de placas a 0,2 \mug de proteína/pocillo con HPV6b L1 HEXAHIS producida en E. coli, HPV6b VLP-L1 producida en baculovirus y preparaciones de baculovirus y E. coli (sobrenadantes de fermentación de células) como controles, en PBS a pH 7,2, y se dejaron incubar durante una noche a temperatura ambiente. Se realizó un lavado con PBS a pH 7,2. La unión no específica se bloqueó incubando las placas con caseína al 1% (p/v) durante una hora a temperatura ambiente.

Se añadió antisuero de conejo contra HPV6b L1 HEXAHIS a cada uno de los pocillos recubiertos con HPV6b L1 HEXAHIS, HPV VLP-1, controles preparados con baculovirus o controles preparados con E. coli (preparados por duplicado), y las placas se diluyeron en serie a la mitad. Como control negativo se usaron sueros inducidos contra A/PR-8 del virus de la influenza. Como control positivo, en placas HPV VLP-L1 se usaron sueros inducidos contra HPV VLP-L1. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente y después se lavaron tres veces con PBS que contenía Tween 20 al 0,05% (v/v) a pH 7,2. A cada pocillo se le añadió conjugado de IgG-HRP de
cabra-conejo y las placas se incubaron y se lavaron como se ha indicado anteriormente. La unión específica de
los antisueros al antígeno se detectó usando TMB. La reacción se detuvo después de cinco minutos usando HCl 0,5 M.

Resultados

Los resultados del experimento se muestran en la tabla 4. Tanto la proteína HPV6b L1 HEXAHIS como la proteína HPV6 VLP-L1 formaron complejos con anticuerpos inducidos contra la proteína HPV6b L1 HEXAHIS, lo cual indica que HPV6b L1 HEXAHIS presenta correctamente in vivo uno o más epítopos presentados por HPV VLP-L1. Los sueros inducidos contra la proteína L1 de HPV6 también fueron negativos en los pocillos de baculovirus o E. coli, lo que demuestra la especificidad de la reacción. Esto justifica el uso de HPVL1 HEXAHIS como un inmunógeno de vacuna adecuado para inducir anticuerpos que puedan interaccionar y neutralizar potencialmente virus. Además, este ejemplo justifica un inmunoensayo para la detección de la proteína L1 de papilomavirus demostrado por el recubrimiento de varias proteínas en pocillos y uso de anticuerpos inducidos contra la proteína HPV6b L1 HEXAHIS recombinante. Los pocillos que contenían un antígeno derivado de HPV6b dieron un resultado positivo. Este ejemplo también justifica un inmunoensayo para la detección de anticuerpos específicos para la proteína L1 de papilomavirus demostrado por el recubrimiento de los pocillos con la proteína HPV6b L1 HEXAHIS recombinante y el uso de sueros inducidos contra A/PR-8 del virus de la influenza y sueros inducidos contra la proteína HPV6b L1 HEXAHIS. En este caso, los pocillos que contenían sueros inducidos contra la proteína HPV6b L1 HEXAHIS dieron un resultado positivo, mientras que los inducidos contra el virus de la influenza fueron negativos.

Ejemplo 5 Ensayo de captura de ELISA que demuestra la formación de complejos de estructura multimérica-anticuerpo

Se realizaron experimentos de transferencia de western y ELISA como se ha descrito previamente o siguiendo procedimientos convencionales. Se realizó un ensayo de captura ELISA por el siguiente método:

(1) se usó un anticuerpo monoclonal (moAb 8) específico para VLP para recubrir los pocillos de una placa de microtitulación;

(2) se añadió proteína HPV VLP L1, se incubó en condiciones adecuadas y se lavó con PBS que contenían Tween 20 al 0,1% a pH 7,4;

(3) se añadieron anticuerpos inducidos contra diversos inmunógenos (mostrados en la columna 2 de la tabla 5) en diversos animales (mostrados en la columna 1 de la tabla 5); y

(4) se añadieron agentes de detección adecuados (en el caso de antisuero de conejo, se usó suero de cabra anti-conejo conjugado con peroxidasa) para detectar el complejo de estructura multimérica/VLP-anticuerpo.

Resultados

En la tabla 5 se proporciona la cantidad de HEXAHIS de papilomavirus recombinante capturada por pocillo. Estos experimentos demuestran que los antisueros inducidos contra proteínas L1 HEXAHIS de papilomavirus recombinante desencadenan una respuesta inmune que reconoce VLP de papilomavirus, incluyendo la proteína L1.

TABLA 1

Procedimiento para lavar la columna de níquel con tampón NB
Tiempo (Minutos)	% de Tampón NB
0	0
30	0
300	100
310	100
320	100
330	100

TABLA 2

Protocolo experimental para inyectar en ratones proteína 6b L1 HEXAHIS para producir anticuerpos
Grupo de Ratones^{a}	Adición de proteína 6b L1	Otras condiciones
	HEXAHIS^{b}
A	+	sin adyuvante
A_{1}	-	sin adyuvante
B	+	hervido en SDS al 1% y enfriado
B_{1}	-	hervido en SDS al 1% y enfriado
C	+	con adyuvante completo de Freund
C_{1}	-	con adyuvante completo de Freund
D	+	absorbido en hidróxido de aluminio
D_{1}	-	absorbido en hidróxido de aluminio
E	+	con algammulin
E_{1}	-	con algammulin
F	+	con L2 (50 \mug) y sin adyuvante

(Tabla pasa a página siguiente)

3

TABLA 4

Resultados de ELISA usando antisuero de conejo contra HPV6b L1 HEXAHIS
Antígeno	ELISA usando antisuero de conejo contrA
	HPV6b L1 HEXAHIS
HPV6 VLP-L1	>4,0 excede los límites a 1:4000
HPV6b L1 HEXAHIS	2,12 \pm 0,1 a 1:4000
preparación de control de baculovirus	0,63 \pm 0,01 a 1:4000
preparación de control de E. coli	0,12 \pm 0,00 a 1:4000

(Tabla pasa a página siguiente)

4

Leyendas

Tabla 2

^{a}cada grupo de ratones contiene cuatro ratones

^{b}la proteína 6b L1 HEXAHIS se administró a 50 \mug de proteína por ratón

Tabla 3

^{a}Los grupos constan de 4 a 6 ratones Balb/C (68-102)

^{b}L1 denota la proteína L1 HEXAHIS e IRR denota la proteína HEXAHIS irrelevante

^{c}PBS solución salina tamponada con fosfato y CFA es adyuvante completo de Freund

^{d}la proteína 6b L1 HEXAHIS se administró a 10 \mug en un volumen máximo de 2 \mul

^{e}se añadieron 30 \mug de toxina pertussis

^{f}mediciones de la oreja (\mum x 10)

Tabla 5

ND: no puede determinarse técnicamente

Figura 1

Secuencia de nucleótidos de ADN y secuencia de aminoácidos de la proteína HPV6b L1 HEXAHIS (SEC ID

\hbox{Nº:
3)}

Figura 2

Macrografía electrónica de estructuras pentaméricas de agregados de la proteína HPV6b L1 HEXAHIS

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): SOLICITANTE:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE: Universidad de Queensland

\vskip0.333000\baselineskip

(B): CALLE:

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CIUDAD: St. Lucia

\vskip0.333000\baselineskip

(E): PAÍS: Australia

\vskip0.333000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): QLD 4072

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Papilomavirus Recombinante L1

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 7

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disco flexible

\vskip0.333000\baselineskip

(B): ORDENADOR: PC IBM compatible

\vskip0.333000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.333000\baselineskip

(D): SOFTWARE: PatenIn Release No. 1.0, Versión No. 1.30 (EPO)

\vskip0.666000\baselineskip

(v): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/AU95/00292

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 32 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA:

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr}

\sac{Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp}

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 96 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: ambas

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

ATGCGGGGTT CTCATCATCA TCATCATCAT GGTATGGCTA GCATGACTGG TGGACAGCAA

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

ATGGGTCGGG ACTTGTACGA CGATGACGAT AAGGAT

\hfill

96

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1599 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: ambas

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.333000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..1596

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /producto = "proteína HPV6bL1 HEXAHIS"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:

5

6

7

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 532 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:

8

9

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 41 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:5:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

GCGGATCCAG ATGTGGCGGC CTAGCGACAG CACAGTATAT G

\hfill

41

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 43 pares de base

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.666000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: NO

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:6:

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CGCCCGGGTT ACCTTTTAGT TTTGGCCTCG CTTACGTTTT AGG

\hfill

43

Claims

1. Un método para preparar una estructura multimérica que comprende una o más proteínas L1 de papilomavirus recombinante expresadas en bacterias, incluyendo dicho método en las etapas de:

2. El método de la reivindicación 1, donde en la etapa (iv) la formación de dicha estructura multimérica se realiza en ausencia de sal.

3. El método de la reivindicación 1, donde la molécula de ADN recombinante comprende una secuencia de nucleótidos 5' de acuerdo con la SEC ID Nº:2.

4. El método de la reivindicación 1, donde la molécula de ADN recombinante comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la SEC ID Nº:3.

5. El método de la reivindicación 1, donde la molécula de ADN recombinante comprende una secuencia de nucleótidos que puede hibridar en condiciones convencionales con la SEC ID Nº:2 o la SEC ID Nº:3.

6. El método de la reivindicación 1, donde la molécula de ADN recombinante se inserta en pTrcHisB en una fase de lectura correcta con respecto a la expresión de la proteína L1 de papilomavirus.

7. El método de la reivindicación 1, donde la proteína L1 de papilomavirus se expresa en una célula bacteriana
E. coli.

8. El método de la reivindicación 1, que incluye además la etapa de incorporar la estructura multimérica en una vacuna.

9. El método de la reivindicación 1, donde dicha proteína L1 de papilomavirus recombinante es una proteína de fusión.