ES2203653T3

ES2203653T3 - Produccion de proteinas heteropolimericas.

Info

Publication number: ES2203653T3
Application number: ES96102098T
Authority: ES
Inventors: Christie A. Kelton; Noreen P. Nugent; Scott C. Chappel
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Priority date: 1989-06-20
Filing date: 1990-06-20
Publication date: 2004-04-16
Anticipated expiration: 2010-06-20
Also published as: JP3814156B2; CA2018676C; CA2018676A1; EP0735139A1; EP0404546A2; ES2108688T3; EP0404546B1; EP0404546A3; JP3402604B2; DE69031611T2; JP2001299374A; DK0735139T3; ATE159544T1; DE69034104T2; EP0735139B1; DE69034104D1; JPH0365194A; DE69031611D1; ATE251216T1

Abstract

CELULAS DE MAMIFERO CULTIVADAS TRANSFECTADAS CON NUEVOS VECTORES QUE COMPRENDEN SECUENCIAS DE ADN GENOMICO DE SUBUNIDADES {AL} Y {BE} DE LONGITUD COMPLETA O PARCIAL PRODUCEN NIVELES SIGNIFICATIVAMENTE MAYORES DE HORMONA DE GLUCOPROTEINA DIMERICA DE LO QUE LO HACEN LAS CELULAS TRANSFECTADAS CON SECUENCIAS DE ADNC DE SUBUNIDADES {AL} Y {BE}. EN LOS CASOS EN LOS QUE SOLAMENTE ESTAN DISPONIBLES CLONES DE CADN, LAS SECUENCIAS DE CADN PUEDEN UTILIZARSE EN NUEVOS VECTORES DE EXPRESION QUE COMPRENDEN INTRONES U OTRAS REGIONES GENOMICAS IMPORTANTES DE UNA FUENTE HOMOLOGA O HETEROLOGA.

Description

Producción de proteínas heteropoliméricas.

Este invento se refiere a métodos para la producción de una proteína heteropolimérica y dimérica, seleccionada entre hormona luteinizante, hormona estimuladora del folículo o gonadotropina coriónica, procedente de células transformadas de mamíferos.

La transfección de los clones de cDNA de subunidad \alpha y subunidad \beta en células de mamífero en cultivo ha dado como resultado de manera característica bajos niveles de expresión de gonadotropinas. Estos ha supuesto un serio impedimento a la producción de estas hormonas a escala comercial.

Uno de los aspectos del presente invento es proporcionar métodos comercialmente prácticos para la producción de estas hormonas.

Mientras que algunos genes, tales como los genes de \beta-globina (1, 2) e inmunoglobulinas (3-5), requieren intrones para la producción óptima de los mRNA, otros genes, como el de la timidina-quinasa (6), no los requieren. Los aumentos en la expresión génica dependientes de intrones pueden provenir o de mecanismos no transcripcionales (p. ej., caso de los genes de globinas) o de mecanismos transcripcionales (p. ej., caso de los genes de inmunoglobulinas).

Se ha descrito el aislamiento de los genes que codifican las subunidades \alpha común, FSH\beta y LH\beta humanas y bovinas, y la subunidad TSH\beta humana (8-14). Ramabhadran y col., (15) describieron por primera vez la transfección con el cDNA de la subunidad alfa humana y su posterior expresión en células de ratón. Varios grupos han descrito desde entonces la expresión conseguida de hormonas glicoproteicas diméricas mediante transfección de células de mamífero en cultivo. Alguno de estos grupos (16, 17) emplearon clones de cDNA mientras que otros grupos (14, 18, 19) han usado cDNA que contiene intrones o secuencias genómicas.

El documento WO 85/01958 describe el uso de clones de cDNA (sin intrones) para producir gonadotropinas en células de mamífero en cultivo. Mientras que esos sistemas de expresión producen moléculas biológicamente activas, el rendimiento de las células de mamífero transformadas generalmente es menor que el descrito.

Otro aspecto del presente invento es proporcionar sistemas de expresión mejorados, útiles con, por ejemplo, gonadotropinas, que dan como resultado rendimientos más altos.

Matzuk y Boime (18a) mencionan que un intrón insertado en la región codificadora del cDNA de la subunidad \alpha humana, mejoraba los resultados de la expresión en comparación con el uso de clones de cDNA, pero no proporcionaron datos que apoyaran este argumento ni la descripción concreta de sus métodos. En una publicación reciente, Kaetzel y Nilson (7) han descrito niveles relativamente altos de expresión de LH bovina en células CHO. Su sistema utilizó secuencias genómicas para la expresión tanto de la subunidad \alpha como de la subunidad LH\beta. Sin embargo, el efecto de las secuencias genómicas frente al de las secuencias de cDNA sobre la expresión de LH no se trató en su publicación.

Otro aspecto más del presente invento es aclarar la confusión que manifiesta el estado actual de la técnica y proporcionar las enseñanzas críticas necesarias para obtener vectores mejorados que codifican glicoproteínas diméricas y métodos de producción que utilizan esos vectores.

Los intrones se han relacionado con una acumulación aumentada en células de tejidos en cultivo, del mRNA de \beta-globina de conejo (1, 2, 20), gpt de E. coli (20) y DHFR de ratón (20,21). Ejemplos de genes que contienen intrones con elementos estimuladores que aumentan la transcripción son los genes de las inmunoglobulinas (3-5), el gen del citocromo c de rata (22) y el gen pro-\alpha1 del colágeno (I) humano (23). También se ha observado que los intrones producen una eficiencia transcripcional aumentada en ratones transgénicos en relación con los siguientes genes: hormona de crecimiento de rata, metalotioneína I de ratón y \beta-globina humana (24). Sin embargo, los intrones no tienen ningún efecto sobre la expresión de estos tres últimos genes cuando se transfectan en células de mamíferos en cultivo.

Se ha observado que se puede influir sobre los niveles de expresión por medio de diferentes regiones en 3' que no se traducen y regiones de poliadenilación (24, 25). Por ejemplo, se producen niveles de expresión más altos del gen marcador galK si la región de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina se utiliza para la terminación de la transcripción en lugar de la región de poliadenilación de la región temprana de SV40 o la región de poliadenilación de colágeno humano (24).

De acuerdo con los distintos principios y aspectos del presente invento, se proporcionan métodos nuevos que emplean el uso de secuencias genómicas de subunidades \alpha, o construcciones de cDNA de subunidades \alpha que llevan intrones añadidos, que aumentan de manera significativa e inesperada la producción de hormonas glicoproteicas diméricas en células de mamífero. Este descubrimiento facilitará el desarrollo de procedimientos para una producción de alto rendimiento de hormonas glicoproteícas diméricas que comparten la subunidad \alpha común. Estas hormonas incluyen la gonadotropina coriónica (CG), hormona estimuladora del folículo (FSH) (del inglés, " Follicle Stimulating Hormone") y hormona luteinizante (LH).

Las realizaciones preferidas y los ejemplos del presente invento se describirán a continuación con referencia a los dibujos que lo acompañan en los que:

Figura 1A+B: muestra la estrategia usada para construir por ingeniería genética un gen de la subunidad \alpha humana, de expresión en células de tejidos en cultivo. Se indican los sitios de las endonucleasas de restricción importantes. Los recuadros negros representan los exones del gen de la subunidad \alpha; las líneas continuas y gruesas representan los intrones del gen de la subunidad \alpha; las líneas continuas y finas representan el vector pBR322 o el vector pUC18; y las líneas en zigzag representan regiones de adaptadores de policlonación de pUC18.

Figura 2: muestra el vector de expresión básico, CLH3AXSV2[DHFR, ODC, o TPA], usado para transfecciones estables o transitorias. Se muestra la posición del sitio XhoI usado para la inserción de las secuencias de la subunidad \alpha o la subunidad \beta.

Las líneas dobles continuas representan las secuencias que se necesitan para la expresión en células de mamíferos. Se indican las posiciones relativas de las regiones del promotor, del sitio de poliadenilación y del gen marcador. La línea simple continua representa la región de pML-1, derivado de pBR322, necesaria para la propagación y selección (a través de la resistencia a ampicilina) en E. coli.

Figura 3: la parte A muestra el gen de TSH\beta de longitud completa. Se indican las posiciones de los tres exones (I, II y III), dos intrones (a, b), codón ATG de iniciación y codón de terminación (TAA). También se indican los sitios PvuII usados para aislar el fragmento a partir del que se obtuvieron las construcciones parciales. Los recuadros sombreados indican las secuencias no codificadoras de los exones. La parte B muestra las construcciones genómicas parciales usadas para comparar la acumulación de mRNA de TSH\beta en células COS-7 transfectadas de manera transitoria. La TSH\beta 0,9 está constituida por los dos exones codificadores separados por la IVS endógena, teniendo retiradas todas las secuencias aguas arribas desde el ATG de iniciación y todas las secuencias aguas abajo desde el TAA (secuencia mostrada en la Tabla 9). TSH\beta 1,2 y TSH\beta 2,0 contienen, además, unos 300 pares de bases del intrón a y se construyeron añadiendo un sitio sintético donador de corte y empalme (\blacktriangle) que posibilita el procesamiento de corte y empalme del intrón truncado. TSH\beta 2,0 conservó la señal de poliadenilación endógena (\Delta) y aproximadamente 0,8 kb de una secuencia flanqueadora en 3'.

Figura 4: describe el CLH3AXSV2DHFR. Este vector se construyó a partir de los siguientes componentes: (i) la unidad transcripcional de la dihidrofolato-reductasa (DHFR) (nucleótidos números del 1 al 1.925 de la Figura 4) que está constituida por el promotor de la región temprana de SV40 (33, 34), el gen de la DHFR de ratón (REFS) y las secuencias del intrón de la proteína T pequeña y de la señal de poliadenilación de la región temprana de SV40 (33, 34); (ii) las secuencias del vector plasmídico bacteriano pML (nucleótidos números del 2.201 al 4.542 de la Figura 4), derivado del vector pBR322 (29) en el que se ha delecionado una secuencia de 1.370 pares de bases (32); y (iii) el promotor de la metalotioneína (nucleótidos números del 4.542 al 7.514 de la Figura 4), derivado del gen de la metalotioneína-1 de ratón (30, 31) en el que se han retirado los intrones y la secuencia de la señal de poliadenilación; y (iv) las secuencias de la señal de poliadenilación de la región temprana de SV40 (nucleótidos números del 7.514 al 7.751 de la Figura 4) (33, 34). Los análogos del gen de tPA se insertaron en el vector en forma de un fragmento SalI en el sitio único XhoI. La orientación del inserto en relación con las secuencias del promotor y de la señal de poliadenilación se determinó mediante análisis con enzimas de restricción.

Ejemplo 1 Construcciones en plásmidos para la expresión de la subunidad \alpha común y la subunidad FSH\beta

A. El clon genómico completo de la subunidad \alpha humana puede obtenerse de manera conveniente a partir de diferentes fuentes, en forma de un inserto EcoRI de 17 kilo pares de bases (kb) en pBR322. Debido a que el promotor de la subunidad \alpha se ha visto que es específico de tejidos y sería improbable que actuara eficazmente en las células de tejidos en cultivo, comúnmente utilizadas para la expresión de genes heterólogos, se necesitaron etapas para separar todas las secuencias flanqueadoras en 5'. La presencia de sitios EcoRI internos precisó varias etapas de subclonación antes de ensamblar la secuencia genómica retocada. La estrategia de construcción por ingeniería genética, usada de manera ventajosa, está representada en forma de diagrama en la Figura 1. Se construyeron dos subclones de pUC18, el primero con el segmento 5' BamHI-SacI, de 8,0 kb (pUCbs8,0), y el segundo con el segmento 3' SacI-EcoRI de 2,7 kb (pUCse2,7). Para generar una terminación compatible con los sitios de clonación XhoI en los vectores de expresión utilizados por los autores del invento, el pUCse2,7 se digirió con EcoRI, los extremos se hicieron romos mediante tratamiento con el fragmento de Klenow de la DNA-polimerasa I de E. coli, y a continuación se añadieron adaptadores SalI en una reacción de ligación. La posterior digestión de la mezcla de reacción con la endonucleasa de restricción SalI, produjo un segmento SalI de la subunidad \alpha humana, de 2,7 kb, además del fragmento vector de 2,6 kb. El segmento SalI de la subunidad \alpha humana, de 2,7 kb, se purificó en gel y se reinsertó en el sitio SalI del pUC18 (pUCss2,7). Se eligió un clon que contenía el inserto SalI en la orientación que permitía el aislamiento del fragmento de la subunidad \alpha, de 2,7 kb, en forma de un segmento SacI. Este fragmento se purificó en gel y luego se insertó en el sitio SacI del pUCbs8,0 para ensamblar la secuencia codificadora completa del gen de la subunidad \alpha humana en forma de un inserto de 11 kb en pUC18. El inserto pudo cortarse en forma de un fragmento SalI en virtud de un sitio SalI pre-existente en el adaptador de policlonación de pUC18 en el extremo 5' del gen, y del sitio SalI convertido (a partir del sitio EcoRI) situado en el extremo 3' del gen. La construcción genómica completada, de expresión de la subunidad \alpha, a la que de aquí en adelante se hace referencia como secuencia "genómica de longitud completa de la subunidad \alpha", incluía parte del exón I (menos los 35 primeros nucleótidos que incluyen la región del mRNA en 5' que no se traduce), la totalidad de los exones II, III y IV así como las secuencias interpuestas, y aproximadamente dos pares de kilobases (kb) de la secuencia flanqueadora en 3'. Esta construcción se insertó en el sitio XhoI del vector de expresión CLH3AXSV2DHFR (Figura 2) de manera que la transcripción estaba dirigida por el promotor de la metalotioneína-I (MT-I) de ratón. El vector de expresión también contenía el gen de la dihidrofolato-reductasa (DHFR) de ratón como marcador de selección y amplificación.

B. El cDNA de la subunidad \alpha humana se construyó por ingeniería genética para su expresión, digiriendo el clon de longitud completa con NcoI, que incluye el ATG de iniciación, y con Hind III, que escinde en los 215 pb de la región en 3' que no se traduce, en dirección aguas abajo del codón de terminación TAA. Un sitio SalI y la secuencia de consenso de Kozac (27) en 5' fueron proporcionados por oligonucleótidos sintéticos, y un sitio SalI en 3' fue proporcionado por adaptadores que se añadieron según se ha descrito anteriormente. La secuencia de DNA del clon de cDNA de la subunidad \alpha, construido por ingeniería genética, que tiene una longitud de aproximadamente 600 pb, se muestra en la Tabla 7. Esta secuencia se insertó en el sitio XhoI del vector de expresión CLH3AXSV2DHFR (Figura 2). La región endógena que no se traduce en 5' y la señal de poliadenilación en 3' se retiraron del clon de cDNA en el procedimiento de construcción por ingeniería genética y por lo tanto fueron aportados por secuencias del vector: el promotor de la MT-I y la señal de poliadenilación de la región temprana del virus 40 de simios (SV40), respectivamente.

C. El clon genómico parcial de la FSH\beta humana usado en este estudio fue un segmento DdeI-Sau3A, de 2,0 kb, que contenía la región codificadora de proteína del exón II, además de 40 pb de la secuencia aguas arriba desde el ATG de iniciación, la región codificadora de proteína del exón III, y el intrón de 1,6 kb que separa los dos exones (Tabla 7). Los sitios DdeI en 5' y Sau3A en 3' ya habían sido previamente convertidos en los sitios EcoRI y BamHI respectivamente, y por lo tanto no eran compatibles con los vectores de expresión usuales. El clon genómico parcial de FSH\beta fue provisto por lo tanto con terminaciones SalI haciendo extremos romos, según se ha descrito anteriormente, y añadiendo adaptadores SalI comercialmente preparados. El segmento SalI se insertó luego en el sitio XhoI de CLH3AXSV2ODC (Figura 2), un vector de expresión estructuralmente similar al CLH3AXSV2DHFR a excepción de que la región codificadora de DHFR se había reemplazado con la región codificadora de la ornitina-descarboxilasa (ODC) murina.

Ejemplo 2 Comparación de las unidades de transcripción en CLH3AXSV2DHFR de la secuencia genómica de la subunidad \alpha de longitud completa y del cDNA de la subunidad \alpha, en transfecciones estables

Las construcciones en CLH3AXSV2DHFR de la secuencia genómica de la subunidad \alpha y del cDNA de la subunidad \alpha se compararon mediante la cotransfección de cada uno de los plásmidos de expresión de la subunidad \alpha con el plásmido de expresión CLH3AXSV2ODC que porta la secuencia de la FSH\beta humana, y la medida de la producción del dímero de FSH.

A. Veinticuatro horas antes de realizar las transfecciones, se sembraron placas de 100 milímetros con 7x10^{5} células CHO DUKX (DHFR menos). Se obtuvieron las precipitaciones en fosfato cálcico añadiendo 31 microlitros (\mul) de CaCl_{2} 2 Molar (M) al DNA plasmídico suspendido en 500 \mul del tampón de transfección [NaCl 14 milimolar (mM), KCl 5 mM, Na_{2}HPO_{4} 0,7 mM, dextrosa 5,5 mM y HEPES 20 mM (pH 7,5)]. Las cantidades de DNA plasmídico usadas fueron, para la subunidad \alpha (cDNA o secuencia genómica): 10 \mug, y para FSH\beta: 30 \mug. Se dejó que los precipitados se formaran durante 45 minutos a temperatura ambiente. El medio de cultivo se separó de las células y se reemplazó con el precipitado de DNA. Después de dejar que las células se asentaran a temperatura ambiente durante 20 minutos, a cada una de las placas se añadieron 5 ml de medio de cultivo y la incubación se continuó a 37ºC durante 4 horas. Las células a continuación se trataron durante 3,5 minutos en glicerol al 15% a 37ºC. Después de una incubación durante 48 horas a 37ºC en el medio de cultivo, las células se dividieron en proporción 1:10 y se añadió un medio de selección que contenía metotrexato (MTX) 0,02. El medio de selección usado fue un medio de Eagle modificado, \alpha-menos, complementado con suero bovino fetal dializado al 10% y L-glutamina al 1%. De diez a catorce días más tarde los focos se hicieron visibles y se transfirieron a placas de 24 pocillos. Los medios de cultivo procedentes de estas placas se ensayaron con respecto a la expresión del dímero de FSH, usando un radioinmunoensayo basado en un anticuerpo monoclonal específico (Serono Diagnostics, Randolph, MA). Los clones positivos se transfirieron a matraces T-25 en el medio de selección que contenía una concentración incrementada de MTX de 0,1 \muM. Cuando los cultivos alcanzaron la confluencia, los medios se ensayaron de nuevo con respecto al dímero de FSH y se efectuó el recuento de las células para calcular los niveles de expresión en picogramos por célula, en 24 horas.

B. En la Tabla 1 se presentan los niveles de secreción del dímero de la FSH humana, medidos en siete clones seleccionados al azar, procedentes de cada una de las cotransfecciones de la secuencia genómica de la subunidad \alpha/FSH\beta humanas y cDNA de la subunidad \alpha/FSH\beta humanas.

TABLA 1

Secuencia genómica \alpha-DHFR / FSH\beta-ODC	cDNA \alpha-DHFR / FSH\beta-ODC
Línea celular	pg/célula/24 h	Línea celular	pg/célula/24 h
GFSH	en MTX 0,1 \muM	CFSH	en MTX 0,1 \muM
1	0,43	18		0,003
3	1,95	37		0,03
4	0,50	51		0,08
5	0,70	57		0,02
7	1,44	60		0,056
8	1,18	66		0,051
9	2,56	70		0,013
Media	1,25	Media		0,04

Los resultados muestran que la expresión del dímero de FSH está enormemente aumentada en las células transfectadas con la secuencia genómica de longitud completa de la subunidad \alpha. Los niveles de expresión medios indican que la magnitud sorprendentemente grande del aumento observado en este experimento particular fue de aproximadamente treinta veces.

C. Para demostrar una vez más la superioridad de la secuencia de genómica de longitud completa de la subunidad \alpha, líneas celulares estables se transfectaron con el vector de expresión CLH3AXSV2DHFR que contenía o el clon de cDNA de la subunidad \alpha humana o el clon de la secuencia genómica de la subunidad \alpha humana. Se compararon las tasas de expresión de la subunidad \alpha libre. En todos los casos, la expresión de la subunidad \alpha humana, determinada con un radioinmunoensayo sensible y específico, nunca fue mayor que 0,05 pg/célula/24 h en las líneas celulares que contenían cDNA. Como se detalla en la Tabla 2, las células que se habían transfectado con el clon de la secuencia genómica de la subunidad \alpha, expresaron niveles de la proteína 5-20 veces superiores:

TABLA 2

Alfa	Nivel de expresión
Línea celular	pg/célula/24 h
2	0,32
10	0,36
12	0,57
17	0,37
18	0,39
38	1,28
47	0,63
51	0,26

Ejemplo 3 Construcciones que contienen la secuencia de la hormona estimuladora del tiroides

Para demostrar la efectividad y la amplia aplicación de este invento, se prepararon líneas de células CHO transfectadas de manera estable mediante cotransfección de la secuencia genómica de longitud completa de la subunidad \alpha humana en CLH3AXSV2DHFR con una secuencia genómica parcial de TSH\beta en CLH3AXSV2ODC. El fragmento genómico parcial de TSH\beta usado en este experimento constaba de las regiones codificadoras de proteína del exón II y exón III, y el intrón de 0,5 kb que separaba los dos exones (Tabla 9). Las regiones 5' y 3' que flanquean la secuencia codificadora de proteína de TSH\beta se retiraron en esta construcción particular. Después de la cotransfección con los dos vectores de expresión, las líneas celulares estables se cultivaron y analizaron con respecto a su capacidad para expresar TSH. Los niveles de expresión del dímero, determinados mediante un radioinmunoensayo sensible y específico, aparecen listados en la Tabla 3. Estudios previos realizados con la transfección del cDNA de la subunidad \alpha junto con el clon genómico de TSH\beta habían demostrado que los niveles de expresión estaban normalmente por debajo de la sensibilidad del radioinmunoensayo, siendo normalmente menores que 0,02 pg/célula/24 h.

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TABLA 3

TSH	Tasa de expresión
Línea celular	pg/célula/24 h
7	0,19
8	0,22
10	0,24
12	0,24
37	0,13
48	2,97

La producción de TSH, por lo tanto, al igual que la producción de FSH, puede aumentarse enormemente mediante el uso de la secuencia genómica completa de la subunidad \alpha, en lugar de la secuencia de cDNA de la subunidad \alpha, en transfecciones realizadas en células de mamíferos. En este experimento el intervalo de aumento de producción de TSH fue de 6 a 100 veces.

Ejemplo 4 Intrones y aumento de la expresión

La construcción que contiene la secuencia genómica de la subunidad \alpha humana difería de la construcción que contiene el cDNA de la subunidad \alpha humana no sólo en que contenía intrones, sino también en que contenía la secuencia endógena en 5' que no se traduce, la señal de poliadenilación endógena y secuencias flanqueadoras en 3' adicionales. Por lo tanto, de los resultados de la anterior serie de experimentos no se pudo deducir qué regiones genómicas son las que contribuían al aumento de la expresión.

A. Para determinar si los intrones contenidos en la secuencia genómica de la subunidad \alpha eran responsables de los elevados niveles de la subunidad \alpha, se insertó una porción XbaI-PstI del intrón A de la subunidad \alpha humana, entre la región que no se traduce en 5' de la MT-I de ratón y la secuencia de cDNA de la subunidad \alpha en el vector CLH3AXSV2TPA (Figura 2). El intrón truncado conservaba el sitio aceptor endógeno de corte y empalme, pero el sitio donador de corte y empalme se proveyó con un oligonucleótido sintético.

B. Se construyó otro plásmido para determinar el efecto de un intrón heterólogo sobre la expresión de la subunidad \alpha. En esta construcción, un intrón de 130 pb procedente del gen MOPC41 de la cadena \kappa de inmunoglobulina (5), se insertó entre la región que no se traduce en 5' de la MT-I de ratón y la secuencia de cDNA de la subunidad \alpha. No había incluidos elementos estimuladores de la transcripción en esta secuencia interpuesta particular.

C. Las construcciones de cDNA de la subunidad \alpha que contenían el intrón se compararon con la construcción de cDNA de la subunidad \alpha original, y con la secuencia genómica de longitud completa de la subunidad \alpha, por medio de una transfección transitoria de células COS-7 con el DNA plasmídico y análisis de los niveles de mRNA mediante transferencia Northern. En este experimento, el cDNA del activador del plasminógeno tisular (tPA) se utilizó como estándar interno y se usó para corregir las variaciones en la eficiencia de la transfección de las diferentes construcciones plasmídicas y normalizar así los niveles medidos del mRNA de la subunidad \alpha. Las transfecciones se realizaron por duplicado usando el protocolo que utiliza DEAE-dextrano de Seed y Aruffo (28). Dos días después de la transfección, el RNA celular total se aisló procedente de las células. El RNA (5 microgramos) se fraccionó en geles en presencia de formaldehído y luego se transfirió a membranas de nilón usando técnicas estándar de transferencia Northern. Las membranas a continuación se hibridaron, o con la subunidad \alpha humana marcada con ^{32}P o con una sonda de tPA marcada con ^{32}P, y las señales resultantes se cuantificaron en un analizador de transferencias Betascope, Modelo 603 (Betagen Corp., Walthan, MA). Los valores normalizados del mRNA de la subunidad \alpha, para las comparaciones relativas, se calcularon dividiendo el número de cuentas correspondientes a la subunidad \alpha entre el número de cuentas correspondientes a tPA y calculando después la media de las cantidades obtenidas de las muestras duplicadas. Los resultados del experimento se muestran en la Tabla 4.

TABLA 4 Cuentas medidas en el Betascope

Construcción		Sonda de \alpha	Sonda de tPA	Valores normalizados	Media de los
plasmídica				(\alpha/tPA)	duplicados
1. Secuencia	A	6.315	958	6,6	7
genómica de \alpha	B	7.836	1.177	6,7

TABLA 4 (continuación)

Construcción		Sonda de \alpha	Sonda de tPA	Valores normalizados	Media de los
plasmídica				(\alpha/tPA)	duplicados
2. cDNA de \alpha	A	25.353	1.294	19,6	21
+ IVS de \alpha	B	34.616	1.559	22,2

3. cDNA de \alpha	A	31.743	1.690	18,8	17
+ IVS de Ig	B	37.495	2.327	16,1

4. cDNA de \alpha	A	3.891	2.608	1,5	1
	B	3.671	3.341	1,1

Los resultados indicaron que las construcciones de cDNA que contenían o el intrón de la subunidad \alpha humana (n.º 2) o el intrón de inmunoglobulina (n.º 3) eran más eficientes que la secuencia genómica de longitud completa (n.º 1) en la acumulación del mRNA de la subunidad \alpha. En concreto, los niveles normalizados del mRNA de la subunidad \alpha fueron de 7 a 21 veces más altos que los producidos por la construcción que contiene el cDNA (n.º 4) que no lleva intrón. Los autores del invento por lo tanto han descubierto de manera inesperada que los intrones, y no las regiones en 5' y 3' que flanquean la secuencia codificadora de proteína de la subunidad \alpha, son los principales responsables del aumento en los niveles de expresión y que el efecto es debido, al menos en parte, a una acumulación aumentada del mRNA de la subunidad \alpha.

Ejemplo 5 Aumento de expresión no debida a las tasas de transcripción aumentadas

Se utilizaron ensayos de determinación de la actividad transcripcional nuclear (del inglés, "nuclear runoff transcription assays") para determinar si el alto nivel de acumulación de mRNA inducido por la secuencia genómica de la subunidad \alpha era debido a una tasa de transcripción aumentada. La transfección transitoria de células COS-7 con los plásmidos CLH3AXSV2TPA que contenían la secuencia genómica de la subunidad \alpha y el cDNA de la subunidad \alpha se realizó según se describe en el Ejemplo 4. Se usaron métodos estándar en la preparación de los núcleos y para el ensayo de determinación de la actividad transcripcional (Current Protocols in Molecular Biology; Ausubel, F. M. y col., ed., John Wiley & Sons, NY, NY). Las sondas de DNA correspondientes a la subunidad \alpha, DHFR y tPA fueron secuencias de los insertos purificadas en gel, y aproximadamente 0,25 \mug de cada una de las sondas de DNA se sometieron a una transferencia en ranura por duplicado sobre membranas de nitrocelulosa. Las membranas se hibridaron con el RNA resultante de la actividad transcripcional nuclear, marcado con [^{32}P-UTP], preparado en células COS-7 que habían sido transfectadas sin DNA (falsa transfección), con el clon genómico de longitud completa de la subunidad \alpha humana contenido en CLH3AXSV2TPA, o con el clon de cDNA de la subunidad \alpha humana contenido en CLH3AXSV2TPA. La señal de hibridación se cuantificó en un analizador de transferencias Betascope Modelo 603 (Betagen, Corp., Waltham, MA). Los valores normalizados de la tasa de transcripción se obtuvieron dividiendo la media de las cuentas obtenidas de la subunidad \alpha entre la media de las cuentas obtenidas del tPA. El RNA resultante de la actividad transcripcional nuclear de la DHFR procedente de mono, no debería hibridarse con la secuencia de la sonda de DNA de la DHFR de ratón en las condiciones usadas en este experimento, y por lo tanto se utiliza como control negativo. Los resultados de las tasas de transcripción relativas se encuentran resumidos a continuación en la Tabla 5.

TABLA 5 RNA resultante de la actividad transcripcional nuclear

	Falsa transfección	cDNA \alpha/SV2TPA	secuencia genómica
	de COS-7		\alpha/SV2TPA
Sondas de DNA	1	2	1	2	1	2
cDNA \alpha	119	160	2.093	2.155	492	620
tPA	387	413	18.022	17.667	8.486	7.388
DHFR	230	307	54	0	32	765*
Cocientes de las
tasas:	-	0,12	0,07
\alpha/tPA

* Un fondo inespecífico produjo este valor artificialmente alto

En este experimento particular, la tasa de actividad transcripcional del cDNA de la subunidad \alpha (0,12) fue sorprendentemente más alto que el de la secuencia genómica de la subunidad \alpha (0,07). Una tasa de transcripción aumentada no es por lo tanto el mecanismo mediante el que la secuencia genómica de la subunidad \alpha genera unos niveles de expresión más altos de la subunidad \alpha.

Ejemplo 6 La expresión de la subunidad TSH\beta es intrón-dependiente

A. El gen genómico de longitud completa de THS\beta (14a) está representado en forma de diagrama en la Figura 3, Parte A. Se indican las posiciones de los tres exones (I, II y III), los dos intrones (a, b), el codón ATG de iniciación y el codón de terminación (TAA). Los sitios PvuII estaban separados por aproximadamente 2 kb de la secuencia de DNA, e incluían los exones II y III, y contenían la secuencia codificadora de proteína completa de la TSH\beta. Las construcciones que contenían la secuencia genómica parcial de TSH\beta, usadas en este estudio, derivaron del fragmento PvuII de 2 kb y están representadas en forma de diagrama en la Figura 3B. La construcción que contenía TSH\beta 0,9 (de 0,9 kb) fue la misma construcción usada en las transfecciones estables del Ejemplo 1 y estaba constituida por los dos exones codificadores, separados por la secuencia interpuesta endógena, teniendo retiradas todas las secuencias aguas arriba desde el ATG de iniciación y todas las secuencias aguas abajo desde el TAA. TSH\beta 1,2 (de 1,2 kb) y TSH\beta 2,0 (de 2,0 kb) contenían además aproximadamente 300 pares de bases del intrón A y se construyeron añadiendo un sitio sintético donador de corte y empalme para posibilitar el procesamiento de corte y empalme del intrón truncado. TSH\beta 2,0 conservó la señal de poliadenilación endógena y aproximadamente 0,8 kb de una secuencia flanqueadora 3' adicional.

B. Cultivos duplicados (A, B) de células COS 7 se transfectaron, usando el protocolo descrito en el Ejemplo 4, con plásmidos CLH3AXSV2DHFR, que contenían uno de los siguientes fragmentos genómicos parciales: (1) TSH\beta 0,9, (2) TSH\beta 1,2, o (3) TSH\beta 2,0. Los genes se insertaron en el sitio de clonación XhoI de manera que la transcripción fuera iniciada por el promotor de la MT-I y, en el caso de TSH\beta 0,9 y TSH\beta 1,2, terminara con la señal de poliadenilación de la región temprana de SV40. Después de una incubación de 48 horas, el RNA celular total se aisló procedente de las células. El RNA (9 microgramos) se fraccionó sobre geles de formaldehído y después se transfirió a membranas de nilón usando técnicas estándar de transferencia Northern. Las membranas se hibridaron o con una sonda de la MT-I de ratón, marcada con ^{32}P (para detectar el mRNA de TSH\beta que contiene también 50 pares de bases de la secuencia en 5' que no se transcribe de la MT-I), o con una sonda de DHFR marcada con ^{32}P (para comparar las eficiencias de las transfecciones). Las señales resultantes se cuantificaron en un analizador de transferencias Betascope Modelo 603 (Betagen, Corp., Waltham, MA). Los valores normalizados del mRNA de TSH\beta, para las comparaciones relativas, se calcularon dividiendo las cuentas correspondientes a la MT-I entre las cuentas correspondientes a la DHFR. Con los valores normalizados obtenidos de transfecciones hechas por duplicado se calculó el valor promedio y se dividió entre el número obtenido para la TSH\beta 0,9. Los resultados comparativos obtenidos con respecto a la acumulación de mRNA se encuentran resumidos en la Tabla 6.

TABLA 6

		Cuentas medidas	Valores	Valores
		en el Betascope	normalizados	relativos
Construcción plasmídica		Sonda de MT	Sonda de DHFR	(MT/DHFR)	(promediados)
1. TSH\beta 0,9	A	983	3.985	0,25	1
	B	834	4.118	0,20

2. TSH\beta 1,2	A	4.480	254	17,6	60
	B	2.748	285	9,6

3. TSH\beta 2,0	A	1.381	1.209	1,2	5
	B	1.632	1.254	1,3

C. Los resultados indicaron que las dos construcciones que conservaban una porción del primer intrón (TSH\beta 1,2 y TSH\beta 2,0) produjeron una acumulación de mRNA 5-60 veces más alta que la construcción que no contenía secuencias del primer intrón. Por lo tanto, la expresión del gen THS\beta, al igual que la expresión del gen de la subunidad \alpha, es intrón-dependiente. Fue interesante la observación inesperada de que el intrón B, que se encontraba presente en todas las construcciones y que estaba en la región codificadora de la proteína, no confería un aumento óptimo de la transcripción. Esto sugería, o bien que existen secuencias específicas en el primer intrón del gen TSH\beta que aumentaban la acumulación de mRNA, o bien que, más probablemente, la posición del intrón (cercana al extremo 5' del mRNA) era el factor crucial. El hecho de que la expresión génica intrón-dependiente puede estar afectada por el emplazamiento del intrón dentro de la unidad de transcripción, viene apoyado por experimentos preliminares con el cDNA de la subunidad \alpha humana. La inserción del intrón del gen de la cadena \kappa de inmunoglobulinas en la región en 3' que no se traduce del mRNA, entre el cDNA de la subunidad \alpha y la región de poliadenilación de SV40, no produjo una mayor acumulación de mRNA cuando se comparó con la producida por el cDNA de la subunidad \alpha no alterado.

D. Ya que TSH\beta 1,2 produjo cantidades de mRNA 10 veces más altas que TSH\beta 2,0, es probable que la señal de poliadenilación endógena y la secuencia flanqueadora en 3' portadas en TSH\beta 2,0 no sean requeridas para la formación eficiente de mRNA, y pueden de hecho ser perjudiciales. De manera alternativa, la disparidad en la acumulación de mRNA entre TSH\beta 1,2 y TSH\beta 2,0 puede estar relacionada con las diferentes distancias entre el promotor de la MT-I y el promotor temprano de SV40 (que dirige la expresión de DHFR) en las dos construcciones plasmídicas. La proximidad más estrecha (0,8 kb) de los dos promotores en la construcción TSH\beta 1,2 puede permitir una interacción aumentada entre los elementos estimuladores de SV40 y el promotor de la MT-I, aumentando de este modo la tasa de transcripción por parte de este último.

Debido a la similitud de la estructura de los genes de la subunidad \alpha y TSH\beta entre distintos mamíferos, se espera que los descubrimientos de los autores del invento basados en las subunidades \alpha y TSH\beta humanas se apliquen igualmente a esas mismas unidades de otras especies, tales como la especie bovina, equina, porcina, mandriles y monos. Del mismo modo, los genes de las subunidades LH\beta y FSH\beta pueden presentar una dependencia similar de la estructura del DNA genómico para su expresión óptima y estos requerimientos se aplicarían a las especies.

La construcción de vectores de expresión se simplificará ventajosamente mediante la aplicación del conocimiento de que determinadas regiones genómicas, tales como los intrones, son importantes para la acumulación de mRNA, y que la posición de estas regiones en la unidad de transcripción puede ser importante. Por ejemplo, estas regiones genómicas pueden subclonarse o sintetizarse e incluirse en construcciones junto con las secuencias de cDNA de las subunidades \alpha y \beta. Los clones de cDNA con frecuencia son más fáciles de obtener y de construir por ingeniería genética que los clones genómicos que tienen un tamaño mucho mayor. Así, este descubrimiento simplificará el desarrollo de líneas celulares que producen elevados niveles de hormona y, finalmente, permitirá la producción a gran escala de estas proteínas a un coste más bajo. Estos y otros aspectos y variaciones del presente invento resultarán ahora fácilmente evidentes para los expertos en la técnica, y no se considera que se apartan ni del espíritu ni del alcance del presente invento.

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Excepto que se indique lo contrario, los procedimientos y técnicas usados son en general los descritos en la técnica y son convencionales dentro de ella, tal como ésta se describe en Maniatis y col., A Cloning Manual, Cold Spring Harbor (1982). Todas las referencias bibliográficas citadas con anterioridad o citadas en esta memoria descriptiva se incorporan aquí en su totalidad a modo de referencia.

TABLA 7

(SEQ ID NO. 1)

1

\vskip1.000000\baselineskip

100

101

Secuencia de cDNA de la subunidad \alpha, construida por ingeniería genética. Se indican los sitios de las endonucleasas de restricción y la región de consenso de Kozak, que son aportadas por oligonucleótidos sintéticos. También se muestra la secuencia de aminoácidos de la subunidad alfa.

TABLA 8

(SEQ ID NO. 2)

2

\newpage

Secuencia genómica parcial de la subunidad beta de la FSH humana, construida por ingeniería genética. Los nucleótidos en letra minúscula de la terminación 3' provienen de la unión de adaptadores sintéticos. La secuencia de aminoácidos de la subunidad beta de FSH señala las regiones codificadoras de los exones II y III. La línea de puntos representa una secuencia interpuesta (IVS) (del inglés, " Inter-vening Sequence").

TABLA 9

(SEQ ID NO. 3)

3

Secuencia genómica parcial de la subunidad beta de la TSH, construida por ingeniería genética. Se indican los sitios SalI y la secuencia de consenso de Kozak, que son aportados por oligonucleótidos sintéticos. La secuencia de aminoácidos de la subunidad beta de TSH señala las regiones codificadoras de los exones II y III.

SEQ ID NO: 1

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: TIPO DE SECUENCIA: Secuencia de nucleótidos con la correspondiente secuencia de la proteína

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: LONGITUD DE LA SECUENCIA: 592 pares de bases

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: CARACTERÍSTICAS:

\vskip1.000000\baselineskip

: sitio SalI desde el pb 1 al pb 6

: sitio KpnI desde el pb 7 al pb 12

: región de consenso de Kozak desde el pb 11 al pb 15

: sitio SalI desde el pb 587 al pb 592

\vskip1.000000\baselineskip

: PROPIEDADES: Secuencia de cDNA construida por ingeniería genética, de la subunidad alfa de hormonas glicoproteicas diméricas.

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA:

4

40

FINAL DE LA SEQ ID NO: 1

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SEQ ID NO: 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

: LONGITUD DE LA SECUENCIA: 2.000 pares de bases que incluyen una secuencia interpuesta no caracterizada

\vskip1.000000\baselineskip

: CARACTERÍSTICAS:

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: sitio SalI situado delante del pb 1

: exón II desde el pb 42 al pb 209

: secuencia interpuesta (IVS) no caracterizada desde el pb 210 al pb 1.655

: exón III desde el pb 1.666 al pb 1.979

: nucleótidos que proceden de la unión de adaptadores sintéticos desde el pb 1.988 al pb 2.000

: sitio SalI desde el pb 1.995 al pb 2.000

\vskip1.000000\baselineskip

: PROPIEDADES: Secuencia genómica humana construida por ingeniería genética, de la subunidad beta de la hormona estimuladora del folículo (FSH)

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA:

\vskip1.000000\baselineskip

5

50

6

FINAL DE LA SEQ ID NO: 2

\vskip1.000000\baselineskip

SEQ ID NO: 3

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\vskip1.000000\baselineskip

: LONGITUD DE LA SECUENCIA: 886 pares de bases

\vskip1.000000\baselineskip

: CARACTERÍSTICAS:

\vskip1.000000\baselineskip

: sitio SalI desde el pb 1 al pb 6

: secuencia de consenso de Kozak desde el pb 7 al pb 15

: exón II desde el pb 16 al pb 177

: exón III desde el pb 626 al pb 878

\vskip1.000000\baselineskip

: PROPIEDADES: Secuencia genómica construida por ingeniería genética, de la subunidad beta de la hormona estimuladora del tiroides (TSH)

\vskip1.000000\baselineskip

SECUENCIA:

7

70

8

FINAL DE LA SEQ ID NO: 3

Claims

1. Un método para la producción de una proteína heteropolimérica y dimérica, seleccionada entre hormona luteinizante, hormona estimuladora del folículo o gonadotropina coriónica, método que comprende las etapas de:

a) proporcionar al menos un vector que comprende un promotor, un gen estructural que codifica al menos una porción de la subunidad \beta de dicha proteína y, opcionalmente, también al menos una porción de la subunidad \alpha, y una secuencia de terminación; en el que el gen estructural comprende un intrón en una secuencia que codifica al menos una porción de la subunidad \beta de dicha proteína y también un intrón localizado en 5' con respecto a la región codificadora de dicha al menos una porción de la subunidad \alpha de dicha proteína (si el DNA que codifica dicha al menos una porción de la subunidad \alpha de dicha proteína está presente en el vector);

b) si el vector no codifica al menos una porción de la subunidad \alpha, proporcionar un segundo vector que codifica dicha subunidad \alpha, o una de sus porciones, y que contiene un intrón que está localizado en 5' con respecto a la región codificadora de dicha subunidad \alpha o de una de sus porciones;

c) transformar las células hospedadoras con el vector(es) para de este modo formar células transfectadas de manera estable; y

d) cultivar las células transformadas en condiciones en las que se produce dicha proteína;

con la condición de que dicha proteína no es la hormona luteinizante bovina.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que uno de los vectores comprende una secuencia de cDNA que codifica la subunidad \alpha.

3. Un método según la reivindicación 2, en el que la subunidad \alpha comprende la secuencia expuesta en la Tabla 7.

4. Un método según la reivindicación 2 ó 3, en el que la subunidad \beta es parte de un segundo vector.

5. Un método según cualquiera de las reivindicaciones de 2 a 4, en el que dicho cDNA que codifica dicha subunidad \alpha comprende una pluralidad de intrones, secuencias flanqueadoras en 3' y 5', una secuencia endógena en 5' que no se traduce y una señal de poliadenilación.

6. Un método según la reivindicación 4, en el que el vector comprende DNA genómico que codifica la subunidad \alpha y DNA genómico que codifica la subunidad \beta.

7. Un método según la reivindicación 6, en el que una parte de la subunidad \beta de FSH tiene la secuencia mostrada en la Tabla 8.