ES2151463T3

ES2151463T3 - Constructos de adn para la activacion y la modificacion de la expresion de genes endogenos.

Info

Publication number: ES2151463T3
Application number: ES96203412T
Authority: ES
Inventors: Scott C. Chappel
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Priority date: 1989-12-22
Filing date: 1990-12-21
Publication date: 2004-10-01
Anticipated expiration: 2010-12-21
Also published as: ZA9010392B; RU2128227C1; LT3998B; EP0505500B1; FI922863L; AU7183691A; LV10655B; IL164252A0; EP0505500A1; DE69034135D1; EP1482053A3; NO922436D0; BG60624B1; ES2104690T3; OA09594A; GR3025057T3; FI107391B; EP1484412A3; HU217212B; HUT62657A

Abstract

NORMALMENTE LOS GENES TRANSCRIPCIONALMENTE INACTIVOS EN UNA LINEA CELULAR EUCARIOTICA PUEDEN SER ACTIVADOS PARA EXPRESION MEDIANTE LA INSERCION DE UN ELEMENTO REGULADOR DE ADN QUE ES CAPAZ DE PROMOVER LA EXPRESION DE UN PRODUCTO GENETICO NORMALMENTE EXPRESADO EN ESA CELULA, EL ELEMENTO REGULADOR SIENDO INSERTADO PARA ESTAR OPERATIVAMENTE UNIDO AL GEN NORMALMENTE INACTIVO EN CUESTION. LA INSERCION SE REALIZA POR MEDIO DE RECOMBINACION HOMOLOGA, UTILIZANDO UNA CONSTRUCCION DE ADN QUE INCLUYA UN SEGMENTO DE ADN DEL GEN NORMALMENTE INACTIVO ("ADN DIANA") Y EL ELEMENTO REGULADOR DE ADN PARA INDUCIR LA TRANSCRIPCION. LA TECNICA TAMBIEN SE UTILIZA PARA MODIFICAR LAS CARACTERISTICAS DE EXPRESION DE CUALQUIER GEN ENDOGENO DE UNA LINEA CELULAR EUCARIOTICA DADA.

Description

Constructos de ADN para la activación y la modificación de la expresión de genes endógenos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un proceso para la modificación de las características de expresión de un gen que está presente naturalmente en el genoma de una estirpe celular estable o microorganismo clonado. En la realización preferida, la presente invención se refiere a un proceso para la activación y expresión de un gen que está presente en una estirpe celular estable y normalmente transcripcionalmente silencioso o inerte. Como resultado, se expresa el producto proteína de ese gen. Este fenómeno ocurre sin transfectar la célula con el ADN que codifica el producto. En su lugar, el gen residente codificante del producto deseado se identifica en una célula y se activa insertando un segmento regulador apropiado mediante una técnica denominada recombinación homóloga. Pueden insertarse también marcadores seleccionables positivos y/o negativos para ayudar a la selección de las células en las que han ocurrido los eventos de recombinación homóloga apropiados. Como realización adicional, un gen especificado puede amplificarse para tasas de expresión potenciadas, tanto si ese gen es normalmente transcripcionalmente silencioso y se ha activado mediante la presente invención, como si expresa producto endógenamente.

Antecedentes de la invención

Es bien conocido que cada célula en un organismo contiene la información genética que codifica todas las proteínas encontradas en ese organismo. Sin embargo, sólo un porcentaje muy pequeño de los genes presentes en un tipo celular dado se transcribe realmente. Los mecanismos intracelulares que regulan el conjunto de genes a transcribir son ahora entendidos. Las proteínas específicas de célula presentes en el núcleo interaccionan con segmentos reguladores de ADN que están ligados a genes particulares. Esta interacción de proteínas nucleares con secuencias reguladoras de ADN es necesaria para la transcripción génica. Esto da como resultado la biosíntesis de ARNm y la expresión última de la proteína codificada (Mitchell y Tjian, Science, 245: 371, 1989).

Estos segmentos o elementos reguladores de ADN para cada gen se encuentran cadena arriba y, en algunos casos, en o incluso cadena abajo de las regiones codificantes. Mediante una interacción con proteínas nucleares específicas de célula, los segmentos reguladores de ADN afectan a la capacidad de la ARN polimerasa, la enzima limitante de la velocidad en la expresión de proteínas, de tener acceso al cuerpo del gen y sintetizar un transcripto de ARNm. Por tanto, estos segmentos de ADN y las proteínas nucleares residentes desempeñan un papel crítico en la regulación de la expresión de genes específicos (Johnson y McKnight, Ann. Rev. Biochem., 58: 799, 1989).

Los segmentos reguladores de ADN son sitios de unión para las proteínas nucleares. Estas proteínas nucleares se unen a la hélice de ADN y aparentemente alteran su estructura para poner a disposición el gen deseado para reconocimiento por la ARN polimerasa, lo que facilita la transcripción génica. La expresión de estas proteínas reguladoras específicas de célula determina cuáles genes se transcribirán en una célula y la tasa a la que ocurrirá esta expresión. Como ejemplo de la especificidad de este sistema, las células pituitarias, pero no las células hepáticas, expresan proteínas pituitarias, aunque los genes para las proteínas pituitarias están presentes en todas las células hepáticas. Los núcleos de las células hepáticas no contienen las proteínas de unión a ADN específicas que interaccionan con los elementos de los genes de pituitaria residentes en las células hepáticas.

Métodos actuales empleados para expresar proteínas utilizando tecnología de ADN recombinante

Con el conocimiento de que se requieren secuencias reguladoras de ADN específicas para activar la transcripción génica en un tipo celular particular, los científicos han expresado genes extraños en un tipo celular particular mediante ingeniería genética. En general, los segmentos reguladores de ADN que son reconocidos por las proteínas nucleares de la célula se disponen cadena arriba de la región codificante de un gen extraño a expresar. De este modo, después de la inserción en la célula, el ADN extraño puede expresarse, puesto que las proteínas reguladoras nucleares de la célula reconocen ahora estas secuencias reguladoras de ADN. Esta tecnología se ha empleado para producir proteínas que han sido difíciles de obtener o purificar a partir de fuentes naturales mediante estrategias de purificación tradicionales.

Además de las secuencias de ADN reconocibles y del gen de interés, se une un marcador seleccionable a la construcción de ADN. De este modo, sólo las células que han incorporado el ADN sobreviven al cultivo siguiente en un medio seleccionable. Por ejemplo, el gen para resistencia a la neomicina puede incluirse en el vector de expresión. Después de la transfección, las células se cultivan en G418, un antibiótico de neomicina que es letal para las células de mamífero. Sin embargo, si las células han adquirido el gen de resistencia a la neomicina, serán capaces de soportar los efectos tóxicos del fármaco. De este modo, sólo las células que han incorporado el ADN transfectado se mantienen en el cultivo. Se entiende que podría utilizarse cualquier marcador seleccionable siempre que proporcione la selección de células que hayan incorporado el ADN transfectado. Se entiende además que no es crítica la localización específica del material genético insertado en la célula. Sólo es importante que se incorpore a algún sitio en el núcleo de modo que tanto el segmento regulador como el gen extraño (así como el marcador seleccionable) se insertan conjuntamente.

Deficiencias en los métodos actuales de expresión génica

Aunque las técnicas anteriores han sido los instrumentos de explotación de la potencia de la ingeniería genética, no han sido siempre los métodos más eficaces para expresar genes. Esto es debido al hecho de que la inserción de ADN en el núcleo de una estirpe celular se realiza habitualmente mediante una técnica conocida como transfección. El ADN que se ha modificado por ingeniería genética para expresión en la estirpe celular de interés se precipita, y la membrana celular se solubiliza para permitir la entrada del ADN. Como se indica anteriormente, el sitio exacto en el que el ADN se incorpora al genoma no es nunca predecible; es más, el ADN puede permanecer episomal (no integrado en el genoma). Esto da como resultado la impredecibilidad tanto del nivel de expresión de la proteína producida como de la estabilidad de la estirpe celular.

Un segundo inconveniente de esta técnica es el hecho de que la construcción del vector de expresión es extremadamente difícil cuando el gen de interés es relativamente grande (mayor de 5-10 kilobases). Muchas de las proteínas expresadas por tecnología de ADN recombinante se han codificado por ADNc en lugar de clones genómicos mucho mayores. Esto se hace para reducir el tamaño total del inserto. Aunque el uso de ADNc hace la ingeniería genética más conveniente, como resultado las tasas de transcripción génica y producción de proteína pueden sufrir. Se ha mostrado recientemente que los niveles de expresión se potencian a veces en gran medida mediante el uso de insertos de ADN genómico en lugar de ADNc (Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 836-840, 1988, y Chung y Perry, Mol. Cell. Biol., 9: 2075-2082, 1989). Aunque los mecanismos responsables de esta observación no se comprenden bien, es sabido que en ciertas situaciones los elementos potenciadores presentes en intrones pueden mejorar la eficacia transcripcional del gen. Existen también evidencias de que los intrones, o los eventos de ayuste como resultado de la presencia de intrones, pueden tener un efecto sobre los eventos de procesamiento de ARN que siguen a la iniciación de la transcripción (Buchman y Berg., Mol. Cell. Biol., 8: 4395-4405, 1988). Esto puede estabilizar el transcripto, mejorando así la tasa de acumulación de ARNm. En el artículo de Brinster et al. anteriormente citado, se postula también que la posición de los intrones en el gen puede ser importante para poner en fase los nucleosomas respecto al promotor. Se discute la influencia de diversos elementos reguladores sobre la transcripción de genes eucarióticos en Khoury et al., Cell, 33: 313-314 (1983), Maniatis et al., Science, 236: 1237-1245 (1987) y Muller et al., Eur. J. Biochem., 176: 485-495 (1988).

En tercer lugar, para entrar al núcleo el ADN transfectado, incluyendo la región codificante entera del gen extraño, debe atravesar el citoplasma después de la entrada a través de la membrana plasmática permeabilizada de la célula. Durante ese tiempo, el ADN puede entrar en contacto con enzimas lisosómicas que pueden alterar o destruir completamente la integridad del ADN. Por tanto, la región codificante del ADN puede no ser idéntica a la que se transfectó.

El nuevo método de activación génica y/o modificación de la expresión que describen los inventores a continuación no puede dar como resultado la producción de formas mutantes de la proteína deseada, puesto que la región codificante del gen deseado no está sometida a modificaciones enzimáticas.

En resumen, una gran cantidad del ADN transfectado en la célula utilizando técnicas tradicionales, y particularmente la región codificante del mismo, no se transcribirá fielmente. Puede degradarse antes de entrar en el núcleo, alterarse enzimáticamente de modo que no codificará la proteína deseada completa o puede no contener todos los segmentos reguladores necesarios para permitir la transcripción. Puede insertarse en una porción del genoma que evite la transcripción. Si el ADNc se transcribe, la proteína de interés puede no producirse eficazmente debido a la omisión de intrones que pueden contener potenciadores o posibilitar un procesamiento eficaz del ARNm. Finalmente, puede permanecer episomal, promover la producción de proteína pero ser inestable a medida que la población celular crece por división celular.

Sería más deseable desarrollar un método de inducción de la expresión génica que produjera una estirpe celular que haya incorporado los atributos positivos de los métodos existentes pero que de algún modo evitara los rasgos no atractivos. Sería adicionalmente deseable ser capaz de expresar o modificar la expresión endógena de genes particulares en el tipo celular de elección. Se desea adicionalmente ser capaz de aprovechar los beneficios potenciales que pueden proporcionar una secuencia genómica completa, que pueden incluir potenciadores transcripcionales crípticos que pueden residir en los intrones, mediante la disposición apropiada de los intrones para poner en fase el nucleosoma apropiado, o mediante eventos de procesamiento de ARNm más eficaces. Estas ventajas no se disfrutan ordinariamente en los métodos de expresión de ADN recombinante debido al tamaño del gen. Si se pudiera expresar un gen que es ya residente en el genoma, concretamente un gen endógeno, la estabilidad de la estirpe celular y las tasas de expresión se harían más consistentes y predecibles.

Sumario de la invención

En consecuencia, es un objeto de la presente invención eliminar las deficiencias anteriormente observadas en la técnica anterior.

Es un objeto de la presente invención proporcionar un método para expresar genes específicos presentes pero normalmente transcripcionalmente silenciosos o inertes en una estirpe celular de elección.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un método para expresar proteínas que aprovecha totalmente las secuencias genómicas completas que son responsables de la acumulación y/o transcripción de ARNm.

Es aún otro objeto de la presente invención proporcionar un método de modificación de las características de expresión de un gen de interés insertando segmentos reguladores de ADN y/o amplificando segmentos en el genoma de una estirpe celular estable o microorganismo clonado cadena arriba de, dentro de, o próximos de otro modo al gen nativo de interés.

Es aún un objeto adicional de la presente invención proporcionar un método para modificar las características de expresión de un gen que está naturalmente presente en el genoma de una estirpe celular estable o microorganismo clonado y al mismo tiempo insertar características que ayudarán a la selección de células que se han modificado apropiadamente.

Es aún otro objeto de la presente invención proporcionar un genoma que tiene en el mismo, próximo a la región codificante o exones de un gen de interés, un segmento regulador o amplificador que no aparece naturalmente en el mismo.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar constructos de ADN que pueden utilizarse para realizar los métodos de recombinación homóloga de la presente invención.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar estirpes celulares y microorganismos que incluyen el genoma según la presente invención.

Estos y otros objetos de la presente invención se realizan mediante la técnica de recombinación homóloga, mediante la que un experto en esta técnica puede causar la expresión y amplificación de genes residentes aunque transcripcionalmente silenciosos. Mediante está técnica, pueden modificarse también las características de un gen que está presente naturalmente, pero no necesariamente silencioso o inerte, en el genoma de una estirpe celular estable tal como, por ejemplo, para volver condicional la expresión, concretamente represible o inducible, o para potenciar la tasa de expresión.

La presente invención proporciona un constructo de ADN adecuado para modificar las características de expresión de un gen en el genoma de una estirpe celular o microorganismo. El constructo de ADN se inserta en ese genoma mediante la técnica de recombinación homóloga. El constructo incluye un segmento regulador de ADN capaz de modificar las características de expresión de cualquier gen al que está ligado operativamente en la estirpe celular o microorganismo hospedador, así como un segmento de direccionamiento homólogo de una región del genoma en la que se desea insertar el segmento regulador de ARN. El constructo y la técnica de inserción se diseñan para hacer que el nuevo segmento regulador de ADN esté ligado operativamente al gen de interés. Por tanto, sin insertar necesariamente ningún nuevo exón codificante, se modifican las características de expresión de ese gen. En la realización preferida, el gen es uno que está normalmente transcripcionalmente silencioso o inerte en la estirpe celular o microorganismo hospedador y, mediante la región reguladora de ADN que se dirige directamente a la posición apropiada con respecto a ese gen mediante recombinación homóloga, se activa ese gen por tanto para la expresión de su producto génico.

El constructo de ADN incluye dos segmentos de direccionamiento que, aunque separados entre sí en el constructo por aquellos elementos a insertar en el genoma, están preferiblemente contiguos en el gen nativo.

El constructo incluye adicionalmente al menos un gen marcador seleccionable expresable, tal como el gen que proporciona resistencia a la neomicina. Este gen marcador, incluyendo un promotor para el mismo, se dispone también entre las dos regiones de direccionamiento del constructo.

El constructo incluye un gen amplificable expresable para amplificar la expresión del gen de interés. Este gen, incluyendo un promotor para el mismo, está también dispuesto entre las dos regiones de direccionamiento del constructo. En algunos casos, el marcador seleccionable y el marcador amplificable pueden ser el mismo.

El constructo de ADN incluye un gen marcador seleccionable negativo que no se expresa en células en la que el constructo de ADN se inserta apropiadamente. Este gen marcador seleccionable negativo se dispone fuera de las dos regiones de direccionamiento de modo que se elimina cuando el constructo se combina apropiadamente en el gen mediante recombinación homóloga. Un ejemplo de dicho gen marcador seleccionable es el gen de timidina quinasa de herpesvirus simplex.

En aún una realización adicional, es posible modificar las características de expresión de un gen específico que expresa ya un producto en la estirpe celular o microorganismo de interés. Esto puede realizarse insertando mediante recombinación homóloga un constructo de ADN que incluye (1) un gen amplificable expresable que aumenta el número de copias del gen de interés cuando la estirpe celular o el microorganismo se somete a condiciones de amplificación y/o (2) un elemento promotor/potenciador (u otro elemento regulador) que modifica la expresión del gen de interés, tal como por ejemplo aumentando la tasa de transcripción, aumentando la eficacia de traducción, aumentando la acumulación de ARNm, haciendo inducible la expresión, etc., dos segmentos de direccionamiento de ADN (A, B) homólogos de una región del genoma en o próxima al gen preseleccionado en la estirpe celular hospedadora, uno de los cuales (A) es homólogo de una región del genoma localizada cadena abajo de la región específica en la que se inserta el segmento regulador (F), y la otra (B) es homóloga de una región del genoma localizada cadena arriba de la región específica en la que se inserta el segmento regulador (F), un marcador seleccionable positivo y un marcador seleccionable negativo. La expresión génica que se modifica de esta manera puede ser expresión natural o expresión que se ha causado mediante manipulación genética previa de la estirpe celular o microorganismo. La manipulación genética previa puede haber sido mediante técnicas convencionales o mediante recombinación homóloga según la presente invención. En este último caso, la inserción de ADN que da como resultado la modificación de las características de expresión puede realizarse como parte de la misma manipulación genética que da como resultado la expresión del gen o puede realizarse como una etapa posterior.

La presente invención incluye los constructos preparados según la discusión anterior así como los genomas que se han sometido apropiadamente a recombinación homóloga mediante dichos constructos y las estirpes celulares y microorganismos que incluyen estos genomas.

Además, se incluye también un proceso para la preparación del producto deseado mediante el cultivo de las células transformadas según la presente invención.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra una esbozo general de un constructo de ADN según la presente invención.

La Fig. 2A muestra el modo de integración del constructo de ADN en el genoma en el evento de recombinación no homóloga o aleatoria.

La Fig. 2B muestra el modo de integración del constructo de ADN en el genoma en el evento de recombinación homóloga.

La Fig. 3 muestra la construcción de un vector de recombinación homóloga preferido según la presente invención.

La Fig. 4 muestra el modo de integración de un trozo circular de ADN mediante recombinación homóloga cuando sólo se emplea un único trozo de ADN de direccionamiento.

La Fig. 5 muestra el plásmido pRSVCAT, incluyendo los sitios de restricción del mismo.

La Fig. 6 muestra la construcción del plásmido pRSV, incluyendo los sitios de restricción del mismo.

La Fig. 7 muestra el plásmido pSV2NEO, incluyendo los sitios de restricción del mismo.

La Fig. 8 muestra la construcción del plásmido pSVNEOBAM, incluyendo los sitios de restricción del mismo.

La Fig. 9 muestra la construcción del plásmido pRSVNEO, incluyendo los sitios de restricción del mismo.

La Fig. 10 muestra la construcción del plásmido pRSVCATNEO, incluyendo los sitios de restricción del mismo.

La Fig. 11 muestra un fragmento de 15,3 kb del gen TSH\beta de rata y muestra diversos segmentos de restricción del mismo.

La Fig. 12 muestra la construcción del plásmido pRSVCATNEOTSHB3, incluyendo los sitios de restricción del mismo.

La Fig. 13 muestra la construcción del plásmido pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI, incluyendo los sitios de restricción del mismo.

La Fig. 14 muestra una porción de la secuencia nucleotídica de TSH\beta junto con las regiones del mismo a las que corresponde cada cebador para amplificación por PCR. Los exones 2 y 3 se muestran en mayúsculas. Se muestra un fragmento amplificado de 247 pb mediante asteriscos subrayados.

La Fig. 15 muestra los resultados de electroforesis en gel de poliacrilamida de ADNc sintetizado a partir de ARN extraído de diversas poblaciones celulares y cuyos ADNc de TSH\beta, si están presentes, se han amplificado por PCR. La naturaleza de las células representadas en los diversos carriles se indica en la Fig. 15 por debajo del gel.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

La recombinación homóloga es una técnica desarrollada en los últimos años para dirigir genes a inducir o corregir mutaciones en genes transcripcionalmente activos (Kucherlapati, Prog. in Nucl. Acid Res. and Mol. Biol., 36: 301 (1989)). Esta técnica de recombinación homóloga se desarrolló como un método para la introducción de mutaciones específicas en regiones específicas del genoma de mamífero (Thomas et al., Cell, 44: 419-428, 1986; Thomas y Capecchi, Cell, 51: 503-512, 1987; Doetschman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 8583-8587, 1988) o para corregir mutaciones específicas en genes defectivos (Doetschman et al., Nature, 330: 576-578, 1987).

Mediante esta técnica, puede dirigirse el trozo de ADN que se desee insertar en el genoma a una región específica del gen de interés uniéndolo a "ADN de direccionamiento". El "ADN de direccionamiento" es ADN que es complementario (homólogo) de una región del ADN genómico. Si dos trozos homólogos de ADN monocatenario (concretamente el ADN de direccionamiento y el ADN genómico) están en estrecha proximidad, hibridarán para formar una hélice bicatenaria. Unida al ADN de direccionamiento está la secuencia de ADN que se desea insertar en el genoma.

Existe una serie de métodos mediante los que puede ocurrir la recombinación homóloga. Un ejemplo es durante el proceso de replicación de ADN durante la mitosis en las células.

Mediante un mecanismo que no se entiende completamente, se abre el ADN bicatenario parental inmediatamente antes de la división celular en una región local llamada la burbuja de replicación. Las dos cadenas separadas de ADN pueden servir ahora como moldes de los cuales se sintetizan nuevas cadenas de ADN. Un brazo de la horquilla de replicación tiene el código de ADN en la dirección 5' a 3', que es la orientación apropiada en la que la enzima ADN polimerasa puede "leer". Esta enzima se une a la porción 5' del ADN monocatenario y, utilizando la cadena como molde, empieza a sintetizar la cadena de ADN complementaria. La otra cadena parental de ADN está codificada en la dirección 3' a 5'. No puede leerse en esta dirección por la ADN polimerasa. Para replicar esta cadena de ADN debe ocurrir un mecanismo especial.

Una enzima especializada, la ARN primasa, se une a la cadena de ADN 3' a 5' y sintetiza un corto cebador de ARN a intervalos a lo largo de la cadena. Utilizando estos segmentos de ARN como cebadores, la ADN polimerasa se une ahora al ADN cebado y sintetiza un trozo complementario de ADN en la dirección 5' a 3'. Estos trozos de ADN recién sintetizado se denominan fragmentos de Okazaki. Los cebadores de ARN que fueron responsables de iniciar la reacción completa se eliminan por la función exonucleasa de la ADN polimerasa y se reemplazan por ADN. Este fenómeno continúa hasta que la polimerasa alcanza una extensión no cebada de ADN, en la que el proceso sintético local se detiene. Por tanto, aunque la cadena parental complementaria se sintetiza en conjunto en la dirección 3' a 5', se produce realmente mediante "pespunteado" en la dirección 5' a 3'. Cualquier mella que pueda ocurrir en el ADN durante el proceso de "pespunteado" se sella por una enzima llamada ADN ligasa.

Para mantener una fidelidad absoluta del código de ADN, está presente una función correctora en la ADN polimerasa. La ADN polimera requiere trozos cebados de ADN sobre los que sintetizar una nueva cadena de ADN. Como se citó anteriormente, ésta puede ser una cadena sencilla de ADN cebado con ARN o una cadena complementaria de ADN. Cuando la ADN polimerasa encuentra trozos de ADN complementario desapareados, puede actuar como exonucleasa y eliminar las bases de ADN en la dirección 3' a 5' hasta que se alcanza de nuevo el apareamiento perfecto.

Con estos antecedentes, es ahora posible entender la base de la técnica descrita en la presente memoria. Se ponen en contacto trozos pequeños de ADN de direccionamiento que son complementarios de una región específica del genoma con la cadena parental durante el proceso de replicación de ADN. Es una propiedad general del ADN que se ha insertado en una célula hibridar, y por lo tanto recombinarse, con otros trozos de ADN mediante regiones homólogas compartidas. Si esta cadena complementaria está unida a un oligonucleótido que contiene una mutación o una secuencia de ADN diferente, se incorpora también a la cadena recién sintetizada como resultado de la recombinación. Como resultado de la función correctora, es posible para la nueva secuencia de ADN servir como molde. Por tanto, el ADN transfectado se incorpora al genoma.

Si la secuencia de un gen particular es conocida, puede sintetizarse un trozo de ADN que sea complementario de una región seleccionada del gen u obtenerse de otro modo, tal como mediante la restricción apropiada del ADN nativo en sitios de reconocimiento específicos unidos a la región de interés. Este trozo actuará como dispositivo de direccionamiento tras la inserción en la célula e hibridará con su región homóloga en el genoma. Si esta hibridación ocurre durante la replicación de ADN, este trozo de ADN y cualquier secuencia adicional unida al mismo actuará como un fragmento de Okazaki y pespunteará en la nueva cadena de ADN hija recién sintetizada.

En la técnica de la presente invención, están unidas a estos trozos de ADN de direccionamiento regiones de ADN que son conocidas por interactuar con las proteínas reguladoras nucleares presentes en la célula y, opcionalmente, marcadores de ADN amplificables y seleccionables. Por tanto, la expresión de proteínas específicas puede realizarse no mediante la transfección de ADN que codifica el gen mismo y el ADN marcador, como es lo más común, sino en su lugar mediante el uso de ADN de direccionamiento (regiones de homología con el gen endógeno de interés) acoplado a segmentos reguladores de ADN que proporcionan al gen señales reconocibles para la transcripción. Con esta tecnología, es posible expresar y amplificar cualquier gen semejante presente en un tipo celular sin transfectar realmente ese gen. Además, la expresión de este gen se controla por el ADN genómico entero en lugar de por porciones del gen o el ADNc, mejorando así la tasa de transcripción y la eficacia del procesamiento de ARNm. Además, las características de expresión de cualquier gen semejante presente en un tipo celular pueden modificarse mediante la inserción apropiada de segmentos reguladores de ADN y sin insertar porciones codificantes enteras del gen de interés.

Según estos aspectos de la presente invención, se proporcionan nuevos métodos para expresar genes de interés normalmente transcripcionalmente silenciosos, o para modificar la expresión de genes de interés expresados endógenamente, en una estirpe celular diferenciada. Las secuencias genómicas semejantes que se desea expresar, o modificar su expresión, se proporcionarán con las secuencias de ADN específicas de célula necesarias (segmentos reguladores y/o de amplificación) para dirigir o modificar la expresión del gen en la célula. El ADN resultante comprenderá la secuencia de ADN codificante de la proteína deseada ligada directamente de modo operativo a segmentos heterólogos (para la secuencia de ADN semejante) reguladores y/o de amplificación. Se incluye opcionalmente un marcador seleccionable positivo en la construcción para facilitar el examen de las células resultantes. Se prefiere el uso del gen de resistencia a la neomicina, aunque puede emplearse cualquier marcador seleccionable. Pueden emplearse también, opcionalmente, marcadores seleccionables negativos. Por ejemplo, el gen de timidina quinasa de herpesvirus simplex (HSVtk) puede utilizarse como marcador para seleccionar frente a ADN vectorial integrado aleatoriamente. Los ADN condensados, o ADN expresivos existentes, pueden amplificarse si el ADN de direccionamiento está ligado a un marcador amplificable.

Por lo tanto, según el método de la presente invención, cualquier gen que se expresa normalmente cuando está presente en su estirpe celular eucariótica específica, particularmente una estirpe celular diferenciada, puede forzarse a la expresión en una estirpe celular no específica para él, en la que el gen está en un formato silencioso. Esto ocurre sin insertar realmente la secuencia completa de ADN para ese gen. Además, ese gen, o un gen de expresión normal, puede amplificarse para tasas de expresión potenciadas. Además, las características de expresión de genes no totalmente transcripcionalmente silenciosos pueden modificarse, así como las características de expresión de genes en microorganismos.

En una realización de la presente invención, las células eucarióticas que contienen pero no transcriben normalmente un gen de interés específico se inducen a hacerlo mediante la técnica descrita en la presente memoria. El vector de recombinación homólogo descrito a continuación se inserta en una estirpe celular clonal y, después de selección química, se controla la producción de un producto génico específico mediante cualquier medio apropiado, tal como por ejemplo mediante la detección de ARNm transcrito a partir del gen recién activado, la detección inmunológica del producto génico específico, o un ensayo funcional del producto génico específico.

Se describe el esbozo general del constructo de ADN que se utiliza para activar transcripcionalmente genes endógenos mediante recombinación homóloga en la Figura 1.

En general, el constructo de ADN comprende al menos dos y hasta seis o más segmentos de ADN separados. Los segmentos consisten en al menos uno, preferiblemente dos, segmentos de direccionamiento de ADN (A y B) homólogos de una región del genoma celular en o próxima al gen que se desea expresar, un gen de selección positiva (C), un gen amplificable (D), un gen de selección negativa (E) y un segmento regulador de ADN (F) que es transcripcionalmente activo en la célula a transfectar. En la realización más básica de la presente invención, sólo deben estar presentes un único segmento de direccionamiento (B) y el segmento regulador (F). Todas las demás regiones son opcionales y producen constructos preferidos.

Las regiones A y B son secuencias de ADN que son homólogas de regiones del gen endógeno de interés que se va a hacer transcripcionalmente activo. Las regiones específicas A y B del gen endógeno se seleccionan para estar cadena arriba y cadena abajo, respectivamente, de la posición específica en la que se desea insertar el segmento regulador. Aunque estas regiones están separadas en el constructo, están preferiblemente contiguas en el gen endógeno. Puede haber ocasiones en las que se utilizan porciones no contiguas del genoma como segmentos de direccionamiento, por ejemplo cuando se desea eliminar una porción del genoma, tal como un elemento regulador negativo.

Aunque se prefieren dos regiones de direccionamientod, A y B, para aumentar las regiones totales de homología y aumentar así la eficacia de recombinación, el proceso de la presente invención comprende también el uso de una sola región de direccionamiento. En su forma más simple (cuando se van a insertar sólo el segmento F regulador y el gen C marcador seleccionable y el promotor C'), se emplea un trozo circular de ADN que contiene estos elementos junto con el ADN de direccionamiento (véase la Figura 4). De este modo, la región homóloga (B) hibrida con su contrapartida genómica. Los segmentos C', C y F se insertan en la porción B del gen semejante después del evento de cruzamiento.

Cuando se desea insertar la secuencia reguladora de ADN cadena arriba del gen de interés como, por ejemplo, cuando se desea activar y expresar un gen normalmente transcripcionalmente silencioso, la región de homología es preferiblemente homóloga de una región no codificante del genoma cadena arriba de las porciones codificantes del gen de interés. Cuando están presentes dos regiones de direccionamiento, la región cadena abajo (A) puede incluir una porción de la región codificante, aunque se prefiere que esté también totalmente cadena arriba de la región codificante. Se prefiere además que las regiones homólogas se elijan de modo que la secuencia reguladora de ADN se inserte cadena abajo del promotor nativo para el gen de interés, particularmente si el promotor nativo es un promotor negativo en lugar de un promotor positivo desactivado.

El tamaño de las regiones de direccionamiento, concretamente las regiones de homología, no es crítico, aunque cuanto más cortas son las regiones menos probablemente encontrarán las regiones apropiadas de homología y recombinarán en el sitio deseado. Por tanto, cuanto más cortas son las regiones de homología, menos eficaz es la recombinación homóloga, concretamente será más pequeño el porcentaje de clones recombinados con éxito. Se ha sugerido que el requisito mínimo de homología de secuencia es de 25 pares de bases (Ayares et al., PNAS. USA, 83: 5199-5203, 1986). Además, si cualquiera de los demás elementos del constructo se encuentra también en el genoma de la célula hospedadora, existe la posibilidad de recombinación en el lugar incorrecto. Sin embargo, a la vista de la excelente capacidad de selección positiva y negativa de la presente invención, puede practicarse con éxito incluso si la eficacia es baja. Se obtienen resultados óptimos cuando la región total de homología, incluyendo ambas regiones de direccionamiento, es grande, por ejemplo una a tres kilobases. Siempre que el segmento F regulable pueda ligarse operativamente al gen de interés, no existe límite al tamaño de la región B de direccionamiento.

Puede determinarse fácilmente de forma empírica si las regiones de direccionamiento son demasiado grandes o si el segmento F regulable está demasiado separado de la región codificante del gen a ligar operativamente o no. En dicho caso, las regiones A y B pueden hacerse homólogas de una sección diferente del gen de interés y repetirse el proceso hasta que el segmento F regulable esté apropiadamente insertado de modo que se ligue operativamente al gen de interés. Por ejemplo, el sitio de restricción de la región combinada A-B del gen endógeno puede cambiarse y repetirse el proceso. Una vez conocido el concepto de la presente invención, junto con las técnicas descritas en la presente memoria, un experto en la técnica sería capaz de preparar y utilizar la presente invención con respecto a cualquier gen de interés dado en cualquier estirpe celular o microorganismo sin el uso de experimentación indebida.

La región C es un gen marcador seleccionable positivo que es capaz de volver a la estirpe celular transfectada resistente a un entorno normalmente tóxico. Son ejemplos de dichos genes adenosina desaminasa (ADA), aminoglicósido fosfotransferasa (neo), dihidrofolato reductasa (DHFR), higromicina-B-fosfotransferasa (HPH), timidina quinasa (tk), xantina-guanina fosforribosiltransferasa (gpt), gen de resistencia múltiple a fármacos (MDR), ornitina descarboxilasa (ODC) y resistencia al N-(fosfonoacetil)-L-aspartato (CAD).

Además del gen marcador seleccionable positivo, se incluye también opcionalmente un gen amplificable en el constructo en la región D. Los genes amplificables son genes que conducen a un aumento del número de copias cuando están bajo presión selectiva. El número de copias de un gen situado adyacentemente al gen amplificable aumentará también. Los genes amplificables que pueden utilizarse incluyen DHFR, MDR, ODC, ADA y CAD. Los miembros del grupo de genes marcadores seleccionables positivos y aquellos del grupo de genes amplificables se solapan de modo que, en teoría, en lugar de utilizar dos genes, uno para selección positiva y otro para amplificación, podría utilizarse un gen con ambos fines. Sin embargo, puesto que la mayoría de las estirpes celulares contienen copias endógenas de estos genes amplificables, las células serán ya algo resistentes a las condiciones de selección y puede ser difícil distinguir las células que han transfectado ADN de aquellas que no reciben ADN transfectado. Por tanto, en casos en que se desea un gen amplificable, debería incluirse en el constructo un gen de selección positiva que sea dominante, tal como HPH, gpt, neo y tk (en células tk-). Para algunas aplicaciones puede ser posible o preferible omitir el marcador amplificable. Por ejemplo, el gen de interés puede no necesitar amplificarse como, por ejemplo, cuando la activación transcripcional por la secuencia reguladora de ADN heterólogo es suficiente sin amplificación. También, si la eficacia de la recombinación homóloga es muy baja, puede ser necesario prescindir del gen amplificable, puesto que la relación de ADN no homólogo a ADN homólogo está directamente relacionada con la eficacia de recombinación homóloga (Letsou, Genetics, 117: 759-770, 1987). También es posible eliminar el gen de selección positiva y seleccionar células únicamente mediante examen de la producción de la proteína o ARNm deseado. Sin embargo, se prefiere en la mayoría de los casos incluir al menos el gen de selección positiva.

La región E del constructo es un gen marcador seleccionable negativo. Dicho gen no se expresa en células en las que el constructo de ADN se inserta apropiadamente mediante recombinación homóloga, pero se expresa en células en las que el constructo de ADN se inserta inapropiadamente, tal como mediante integración aleatoria. Uno de dichos genes es el gen de timidina quinasa de herpesvirus simplex (HSVtk). El HSVtk tiene un bajo rigor para nucleótidos y es capaz de fosforilar análogos de nucleótidos que las células normales de mamífero son incapaces de fosforilar. Si el HSVtk está presente en las células, los análogos de nucleótidos tales como aciclovir y ganciclovir se fosforilan y se incorporan al ADN de la célula hospedadora, matando así la célula. La presencia del gen marcador seleccionable negativo posibilita utilizar la selección positiva-negativa para recombinación homóloga como se describe por Mansour et al., (Nature, 336: 348-352, 1988). Capecchi utiliza una estrategia que aprovecha los diferentes modos de integración que ocurren cuando se inserta ADN vectorial linealizado mediante recombinación homóloga en comparación con cuando se inserta mediante integración aleatoria. Si el ADN vectorial se inserta aleatoriamente, la mayoría de los insertos se insertarán por los extremos (Folger et al., Mol. Cell. Biol., 2: 1372-1387, 1982; Roth et al., Mol. Cell. Biol., 5: 2599-2607, 1985; y Thomas et al., Cell, 44: 419-428, 1986). Por otro lado, si el vector se inserta mediante recombinación homóloga, se recombinará mediante las regiones de homología que causan la pérdida de secuencias fuera de estas regiones.

Utilizando el constructo descrito en la Figura 1 como ejemplo, el modo de integración para recombinación homóloga frente a integración aleatoria se ilustra en las Figuras 2A y 2B. En el caso de recombinación no homóloga (Figura 2A), el vector se inserta por los extremos del constructo. Esto permite a la región E, en este caso el gen HSVtk, insertarse en el genoma. Sin embargo, cuando ocurre recombinación homóloga (Figura 2B), se pierde el gen HSVtk. La primera ronda de selección utiliza el fármaco o condiciones apropiados para la selección positiva presente en el constructo. Las células que tienen ADN integrado por recombinación homóloga o integración aleatoria sobrevivirán a esta ronda de selección. Las células supervivientes se exponen después a un fármaco tal como ganciclovir que matará todas las células que contienen el gen HSVtk. En este caso, la mayoría de las células en las que el vector se integra mediante una inserción aleatoria contienen el gen HSVtk y se matan por el fármaco, mientras que aquellas en que el vector se integra mediante recombinación homóloga han perdido el gen HSVtk y sobreviven. Esto permite la eliminación de la mayoría de las células que contienen ADN integrado aleatoriamente, dejando la mayoría de las células supervivientes que contienen ADN que se integró mediante recombinación homóloga. Esto facilita en gran medida la identificación del evento de recombinación correcto.

La etapa de selección negativa puede eliminarse también si es necesario. Requerirá que la etapa de examen sea de trabajo más intensivo, implicando la necesidad de técnicas tales como reacción en cadena con polimerasa (PCR) o examen inmunológico.

La sexta región (F) contiene el segmento regulador de ADN que se utilizará para preparar el gen de interés transcripcionalmente activo. El segmento regulador de ADN apropiado se selecciona dependiendo del tipo celular a utilizar. El segmento regulador utilizado preferiblemente es uno conocido por promover la expresión de un gen dado en una estirpe celular hospedadora diferenciada. Por ejemplo, si la estirpe celular hospedadora consiste en células de pituitaria que expresan naturalmente proteínas tales como hormona de crecimiento y prolactina, el promotor para cualquiera de estos genes puede utilizarse como elemento F regulador de ADN. Cuando se inserta según la presente invención, el segmento regulador se ligará operativamente al gen de interés normalmente transcripcionalmente silencioso y estimulará la transcripción y/o expresión de ese gen en la estirpe celular hospedadora. Son también utilizables segmentos reguladores de ADN promiscuos que funcionan en varios tipos celulares, tales como el promotor del virus de sarcoma de Rous (RSV). Siempre que el segmento regulador estimule la transcripción y/o expresión, o pueda inducirse a estimular la transcripción y/o expresión, del gen de interés después de insertarse en la estirpe celular hospedadora de modo que se liga operativamente al gen de interés mediante la presente invención, puede utilizarse en la presente invención. Resulta importante al unir el segmento F regulador al segmento A de direccionamiento que no se introduzca accidentalmente ningún codón de inicio en la secuencia, puesto que dicha aparición podría alterar el marco de lectura del gen que se desea expresar. Por supuesto, el constructo debe construirse e insertarse de tal modo que el segmento F regulador se ligue operativamente al gen de interés.

El segmento regulador de ADN, la región F, no necesita estar presente en casos en que se desea potenciar o amplificar la transcripción de un gen que se expresa ya en la estirpe celular de interés, porque se expresa naturalmente en esa estirpe celular o porque se ha manipulado previamente el ADN de la estirpe celular para causar dicha expresión. En dichos casos, la inserción de un gen amplificable, la región D, preferiblemente con el gen marcador seleccionable positivo, la región C, y opcionalmente también con un gen marcado seleccionable negativo, la región E, será suficiente para aumentar el número de copias del gen de interés y potenciar así la cantidad total de transcripción. Como alternativa, puede incluirse un nuevo segmento regulador, la región F, que promueve inherentemente una tasa de transcripción aumentada (o modificada de otro modo) en comparación con la región reguladora existente para el gen de interés, para potenciar adicionalmente la transcripción del gen de interés expresivo existente. Dicho nuevo segmento regulador podría incluir promotores o potenciadores que mejoran la eficacia de la transcripción.

Las regiones C', D' y E' son regiones promotoras que se utilizan para activar los genes de las regiones C, D y E, respectivamente. Estos promotores son transcripcionalmente activos en la estirpe celular elegida y pueden ser el mismo o diferentes que el promotor en la región F utilizado para activar el gen endógeno de interés. La dirección de transcripción específica especificada en la Fig. 1 no es crítica. Los expertos en esta técnica pueden determinar cualquier disposición apropiada de los genes C, D y E y sus promotores C', D' y E' de tal modo que los promotores estimularán la expresión de sus genes asociados sin desestabilizar simultáneamente en modo alguno la expresión del gen de interés o de cualquiera de los otros genes del constructo.

La presente invención puede ilustrarse por referencia a la activación de la subunidad beta de tirotropina de rata (TSH\beta) en estirpes celulares GH_{1} (ATCC CCL 82), GH_{3} (ATCC CCL 82.1) o GH_{4}C1 (GH). Las estirpes celulares GH derivan de un tumor de pituitaria inducido por radiación en ratas designadas como MtT/W5 (Takemoto, Cancer Res., 22: 917, 1962) y adaptadas para crecer en cultivo por Tashjian et al., Endocrinology, 82: 342-352, 1968. Estas estirpes celulares pueden subclonarse y examinarse su capacidad de producir hormona de crecimiento y TSH\beta. Dicho examen puede ser preferiblemente mediante análisis de transferencia Northern para determinar si está presente ARNm para el gen de hormona de crecimiento de rata y para establecer que no hay ARNm para el gen TSH\beta que se está produciendo. Las estirpes celulares pueden examinarse también mediante análisis Southern para determinar que hay al menos una copia del gen TSH\beta presente en el genoma. Sólo se utilizan estirpes celulares GH que producen hormona de crecimiento y no TSH\beta, pero que contienen una copia del gen TSH\beta.

El vector de recombinación homóloga específico para uso en células GH puede diseñarse de la siguiente manera (Figura 3). La región A puede consistir en la región 5' cadena arriba no traducida del gen TSH\beta definida por el fragmento HindIII que se extiende de -74 a -2785 y la región B puede contener el fragmento de ADN que se extiende desde el sitio HindIII -2785 a un sitio NcoI aproximadamente 2,1 kb cadena arriba, como se describe por Carr et al., (J. Biol. Chem., 262; 981-987, 1987) y Croyle et al., (DNA, 5: 229-304, 1986). El gen de selección positiva (región C) puede ser un fragmento BglII-SmaI de 1067 pb derivado del plásmido pSV2neo (ATCC nº 37.149) (Southern et al., J. Mol. Appl. Gen., 1: 327-341, 1982) El gen neo puede activarse por el promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV) (región C') que deriva del fragmento NdeI-HindIII del plásmido pRSVcat (nº ATCC 37.152) (Gorman et al., PNAS, 79: 6777-6781, 1982). En este ejemplo, no necesita utilizarse ningún marcador amplificable y por tanto no necesita haber región D para optimizar la eficacia de la recombinación homóloga. La eficacia está inversamente relacionada con la proporción de secuencias no homólogas a homólogas presentes en el constructo (Letsou et al., Genetics, 117: 759-770, 1987). La región E, o el gen de selección negativa, puede consistir en el gen HSVtk que es un fragmento XhoI de 2 kb obtenido del plásmido pMCITK (Capecchi et al., Nature, 336: 348-352, 1988). El gen HSVtk en ese constructo puede activarse por el promotor y potenciador del virus de polioma (región E') como se construyó por Thomas et al. (Cell, 51: 503-512, 1987). En un segundo constructo de ADN, el promotor de polioma puede reemplazarse por el promotor RSV descrito anteriormente. La secuencia reguladora de ADN utilizada para activar el gen TSH\beta puede ser el promotor RSV o el promotor de hormona de crecimiento de rata. El promotor de hormona de crecimiento de rata consiste en el fragmento SacI-EcoRI obtenido del plásmido pRGH237CAT (Larson et al., PNAS, 83: 8283-8287, 1986). El promotor RSV tiene la ventaja de ser utilizable en otras estirpes celulares además de células GH, mientras que el promotor GH es conocido por ser activo en células GH y puede inducirse específicamente (Brent et al., J. Biol. Chem., 264: 178-182, 1989). El promotor de hormona de crecimiento de rata y el promotor RSV pueden insertarse en la localización F en constructos separados.

Después de la transfección del constructo anterior en una estirpe celular GH, las células pueden hacerse crecer en medio que contiene G418. Esto permitirá que crezcan sólo aquellas células que hayan integrado ADN de plásmido en el genoma mediante recombinación homóloga o integración aleatoria. Las células supervivientes pueden hacerse crecer en medio que contiene ganciclovir. La mayoría de las células que sobreviven a esta ronda de selección serán aquellas en que el ADN de plásmido vectorial se integra mediante recombinación homóloga. Estas células pueden examinarse para demostrar que producen ARNm que corresponde al gen TSH\beta y que producen la proteína TSH\beta. El ADN genómico puede secuenciarse también alrededor de las áreas de inserción del promotor heterólogo para asegurar que ocurre el evento de recombinación apropiado.

Ejemplo Activación del gen TSH\beta en células de pituitaria de rata

Utilizando el siguiente protocolo, se activó la transcripción del gen de la subunidad beta de tirotropina (TSH\beta), que normalmente no ocurre en la estirpe celular de pituitaria GH_{3} de rata, en esas células utilizando el proceso de recombinación homóloga para dirigir un elemento activador cadena arriba de la región codificante de TSH\beta. El promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV) es conocido por funcionar eficazmente en células GH_{3} (Christian Nelson et al., Nature, 322: 557-562 (1986); Zheng-Sheng Ye et al., The Journal of Biological Chemistry, 263: 7821-7829 (1988)) y por tanto se eligió como elemento activador. Se construyó un vector de plásmido que contenía el elemento activador de RSV, porciones de la región 5' flanqueante del locus del gen TSH\beta, y un marcador de fármaco seleccionable, el gen de aminoglicósido fosfotransferasa (NEO), para el aislamiento de poblaciones celulares transfectadas. Se extrajo ácido ribonucleico (ARN) de poblaciones celulares GH_{3} resistentes a fármacos agrupadas y se convirtió en ácido desoxirribonucleico complementario (ADNc). En el ADNc se examinó después mediante la técnica de reacción en cadena con polimerasa (PCR) la presencia de ADNc de TSH\beta. La construcción de los vectores de recombinación homólogos y los vectores de control se esboza a continuación junto con los procedimientos y resultados experimentales.

Construcción de plásmido Recombinación homóloga (RH) del vector cadena principal (pRSVCATNEO)

El promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV) se derivó del plásmido pRSVCAT (Cornelia M. Gorman et al., Proceedings of the National Academy of Science 79: 6777-6781 (1982)) (figura 5) mediante aislamiento del fragmento NdeI-HindIII de 580 pares de bases (pb) que contiene la unidad promotora funcional. Los extremos de este fragmento se enromaron utilizando el fragmento Klenow de ADN polimerasa I y se ligaron engarces XbaI a los extremos romos. Después de digestión con endonucleasa de restricción XbaI y purificación en gel, se ligó el fragmento resultante al sitio XbaI de pUC18. Una colonia bacteriana que alberga un plásmido con el inserto RSV en la orientación mostrada en la Figura 6 se designó como pRSV. El gen de aminoglicósido fosfotransferasa (NEO) se clonó de pSV2NEO (P.J. Southern et al., Journal of Molecular and Applied Genetics, 1: 327-341 (1982)) mediante el aislamiento del fragmento BglII y BamHI (Figura 7) y ligando ese fragmento al sitio BamHI de pRSV (Figura 6). Se recogió un plásmido que contenía el gen NEO en la orientación mostrada en la Figura 8, y se designó pRSVNEOBAM. Se digirió pRSVNEOBAM con SmaI y se aisló el fragmento de 4328 pb que contenía la región promotora de RSV, la mayoría del gen NEO y pUC18 mediante electroforesis en gel. Los extremos SmaI de este fragmento se engarzaron con XhoI, se escindieron con enzima de restricción XhoI y el plásmido se recircularizó mediante ligamiento. El plásmido resultante se muestra en la Figura 9 y se denomina pRSVNEO. Esta última etapa de clonación dio como resultado la deleción de un fragmento de 786 pb del extremo 3' del fragmento NEO que no es necesario para su expresión funcional. Esta construcción proporciona un plásmido en el que el gen NEO está activado transcripcionalmente por el promotor RSV.

A continuación, el sitio NdeI localizado 5' del promotor RSV en pRSVCAT (Figura 5) se convirtió en un sitio SalI. Esto se realizó digiriendo pRSVCAT con NdeI, rellenado los extremos utilizando fragmento Klenow de ADN polimerasa I y ligando engarces SalI a los extremos romos resultantes. Los engarces se digirieron hasta terminación con SalI y el plásmido se recircularizó mediante ligamiento. En el sitio SalI recién construido, se clonó el fragmento SalI-XhoI de pRSVNEO (Figura 9) que contenía el promotor RSV y el gen NEO. Se aisló un plásmido con el promotor RSV y el fragmento NEO orientado como se muestra en la Figura 10, y se denominó pRSVCATNEO. Cuando se transfectó este plásmido en células GH_{3}, fue capaz de conferir resistencia al G418 a esas células, demostrando la capacidad del promotor RSV de activar la transcripción del gen NEO y la capacidad de ese ARN de traducirse a una proteína funcional (datos no mostrados). El ARN total de los transfectantes estables anteriores se analizó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para determinar si el gen CAT se estaba transcribiendo. Los resultados de PCR mostraron que el gen CAT se estaba transcribiendo de hecho en todas las colonias resistentes al G418 presentes (datos no mostrados), indicando que el promotor RSV 5' del gen CAT era capaz de activar la transcripción de un gen localizado 3' de él. Esto es importante porque este promotor RSV será responsable de activar la transcripción del gen TSH\beta cuando el vector TSH\beta de RH descrito a continuación se integre mediante recombinación homóloga en el genoma de GH_{3}.

Vector TSH\beta de RH

Se creó un vector capaz de integrarse en el genoma de GH_{3} mediante recombinación homóloga insertando dos extensiones de las regiones 5' flanqueantes del gen de la subunidad beta de tirotropina (TSH\beta) en los sitios SalI y HindIII únicos contenidos en pRSVCATNEO (Figura 10). Se obtuvo una biblioteca genómica de bazo de rata que contenía insertos de 15 kilobases (kb) o mayores clonados en DASH lambda de Stratagene, San Diego, CA. Utilizando protocolos estándar (Current Protocols in Molecular Biology, pp. 1.9.1-1.13.6, 6.1.1-6.4.10), se aisló un clon de 15,3 kb del gen TSH\beta genómico de rata incluyendo 9 kb de secuencia 5' del primer exón. El fragmento de 15,3 kb consistía en dos fragmentos XbaI, un fragmento de 10,6 kb correspondiente al extremo 5' del fragmento de 15,3 kb y un trozo de 4,7 kb correspondiente a la región 3' del fragmento de 15,3 kb (Figura 11). Ambos fragmentos XbaI se subclonarón en pUC18 y se aislaron plásmidos que contenían insertos en ambas orientaciones. El fragmento XbaI-HindIII de 2,3 kb contenido en el fragmento XbaI de 4,7 kb (Figura 11) se purificó, y el sitio XbaI de este fragmento se convirtió en un sitio HindIII rellenando los extremos con fragmento Klenow y ligando a engarces HindIII. Este fragmento se ligó al sitio HindIII único contenido en pRSVCATNEO (Figura 10). Se asignó a un aislamiento correspondiente a un plásmido con el inserto de 2,3 kb en la orientación correcta como se muestra en la Figura 12 el nombre pRSVCATNEOTSHB3.

Se aisló el fragmento XbaI de 10,6 kb subclonado del clon TSH\beta de rata (Figura 11) y los extremos XbaI se convirtieron en sitios SalI mediante enromado del fragmento con fragmento Klenow de ADN polimerasa I y uniendo engarces SalI. Este fragmento SalI de 10,6 kb se clonó después en el sitio SalI de pRSVCATNEOTSHB3 (Figura 12). Se identificó un plásmido que contenía el inserto en la orientación correcta y se denominó pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI (Figura 13). Este último plásmido se ha depositado en la "American Type Culture Collection", Rockville, MD, y ha recibido el número de depósito ATCC 40933. Con los fines de este depósito, el plásmido se renombró pHRTSH. Este depósito se realizó según todos los requisitos del Tratado de Budapest.

Estirpe celular

Las células GH_{3} son una población subclonada de MtT/W5 que se derivó de un tumor de pituitaria inducido por radiación en ratas (B.K. Takemoto, Cancer Research, 22: 917 (1962)) y se adaptó para crecimiento en cultivo por Tashjian et al., Endocrinology, 82: 342-352 (1968). Las células GH_{3} se obtuvieron del banco celular "American Type Culture Collection" y se mantienen en cultivo mediante crecimiento en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) + 15% de suero equino (HS) + 2,5% de suero fetal bovino (FBS) + 1% de L-glutamina (medio GH_{3}) a 37ºC en 5% de CO_{2}.

Preparación de ADN Preparación a gran escala de ADN de plásmido

Todos los plásmidos utilizados para transfecciones estables se purificaron utilizando el método de lisis alcalina para purificación de ADN de plásmido a gran escala como se describe en Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, pp. 1.7.1-1.7.2. El ADN aislado mediante el método de lisis alcalina se purificó adicionalmente mediante la formación de bandas dobles en un gradiente de cloruro de cesio como se describe también en Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, pp. 1.7.5-1.7.7.

Antes de la transfección, se digirieron los vectores de RH con AatII o ApaI. Se utilizó ApaI para linealizar el plásmido control pRSVCATNEO y AatII para linealizar el plásmido de RH pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI. La localización de los sitios de escisión de ApaI y AatII puede observarse en las Figuras 10 y 13, respectivamente. Después de la digestión con la enzima de restricción apropiada, la reacción se extrajo con fenol/cloroformo, se extrajo con cloroformo, se precipitó con etanol y se lavó una vez con etanol al 70%. Los plásmidos se resuspendierón después en agua estéril desionizada (H_{2}O d) a una concentración de 1 microgramo/microlitro (\mug/\mul) como se determina mediante la absorbancia a DO_{260}. En un intento de aumentar la eficacia de transfección y/o la relación de positivos de homólogos de recombinación a aquellos debidos a integración aleatoria, se digirió pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI con ApaI. La digestión con ApaI corta en tres sitios separados en pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI y elimina todas las regiones del vector excepto aquellas necesarias para recombinación homóloga (Figura 13). Después de la digestión con ApaI, la reacción se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% y la banda superior correspondió al fragmento de 10.992 pb que contenía las dos regiones 5' flanqueantes del gen TSH\beta y el promotor RSV; el promotor RSV activador de la región NEO y del gen TSH\beta se aisló del gel mediante electroelución en tubos de diálisis. El ADN electroeluido se purificó adicionalmente utilizando una minicolumna elutip (Schleicher y Schuell) con el protocolo estándar recomendado por el fabricante. El ADN se eluyó de la columna, se precipitó con etanol, se lavó con etanol al 70% y se resuspendió a una concentración de 1 \mug/\mul.

Transfecciones estables Transfección con fosfato de calcio

48 horas antes de la transfección se sembraron 3 \times 10^{6} células GH_{3} en discos de 10 centímetros (cm). Para cada disco, se añadieron 10 \mug de ADN vectorial junto con 30 \mug de ADN de esperma de salmón sonicado a 0,5 mililitros (ml) de tampón de transfección. El tampón de transfección se preparó combinando 4 g de NaCl, 0,185 g de KCl, 0,05 g
de Na_{2}HPO_{4}, 0,5 g de dextrosa, 2,5 g de HEPES y H_{2}O d a un volumen final de 500 ml, y llevando el pH a 7,5. Se añadieron 31 \mul de CaCl_{2} 2 molar (M) a los 0,5 ml de ADN + tampón de transfección y se agitó con vórtex. Esta solución se dejó reposar a temperatura ambiente durante 45 minutos. Cuando el ADN-CaCl_{2}-tampón de transfección estuvo preparado, se eliminó el medio GH_{3} de las células GH_{3} y se dispuso el ADN-CaCl_{2}-tampón de transfección sobre las células. Las células se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Después de 20 minutos, se añadieron 5 ml de medio GH_{3} y las placas se incubaron a 37ºC durante 6 horas. Las células se sometieron después a shock aspirando el medio y añadiendo 5 ml de tampón de transfección fresco que contenía 15% de glicerol durante 3,5 minutos. Las células se aclararon 2 x con PBS y se alimentaron con 10 ml de medio GH_{3}. 48 horas después de la transfección, el medio se eliminó y se añadieron 10 ml de medio GH_{3} que contenía G418 400 \mug/ml.

Electroporación

Se llevó a cabo la electroporación utilizando un BTX 300 Transfector con 3,5 mililitros (ml) de hueco entre electrodos. Se retiraron 1 \times 10^{7} células GH_{3} que crecían en fase logarítmica de sus placas de cultivo por tripsinización, se sedimentaron por centrifugación y se lavaron una vez con PBS. Las células se resuspendierón en 1,0 ml de PBS y se transfirieron a 2,9 ml de cubetas desechables Ultra-UV (American Scientific Products) en hielo. Se añadieron 10 \mug de ADN a las células, se mezclaron y se dispusieron de nuevo en hielo durante 5 minutos. Después de 5 minutos, los electrodos se dispusieron en la cámara y las células se electroporarón en unas condiciones de 750 microfaradios con un pulso de 200 voltios. La cubeta se devolvió después al hielo durante 10 minutos. Las células se transfirieron de la cubeta a 9 ml de medio GH_{3} que contenía 1% de penicilina y 1% de estreptomicina a temperatura ambiente en un tubo cónico de 15 ml, y se dejaron reposar durante 10 minutos. La electroporación total de 1 \times 10^{7} células se transfirió a tres placas de cultivo de 10 cm, proporcionando aproximadamente 3 \times 10^{6} células por placa de cultivo. Después de 48 horas, se añadió medio GH_{3} que contenía G418 400 \mug/ml.

Transfección de células GH_{3} con pRSVCATNEOTSBH3-5XbaI (corte con AatI), pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI (corte con ApaI) y pRSVCATNEO (corte con ApaI)

Se transfectaron plásmidos pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI (corte con AatI), pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI (corte con ApaI) y pRSVCATNEO (corte con ApaI) en células GH_{3} junto con un control sin ADN utilizando tanto el protocolo de fosfato de calcio como el protocolo de electroporación. 48 horas después de la transfección, las células se pusieron bajo selección por G418. Aproximadamente 14 a 21 días después, las colonias se hicieron visibles para el ojo en discos de 10 cm y se contaron. En todos los controles sin ADN, no hubo colonias visibles, demostrando que la selección por G418 estaba funcionando y que la presencia de un plásmido que contiene la región RSV-NEO era necesaria para conferir resistencia al G418. En ese momento, se recogieron las colonias y se agruparon aislando regiones en el disco de 10 cm con anillos de clonación de 17 mm de ancho. Estos grandes anillos de clonación comprendían entre 10 y 70 colonias dependiendo de la densidad de las colonias por placa de cultivo, y permitieron retirar las células GH_{3} en esa región aislada y agruparlas al mismo tiempo por tripsinización. Las colonias tripsinizadas en cada anillo se transfirieron a placas de cultivo de 6 pocillos y se dejaron crecer en medio GH_{3} que contenía G418. Después de alcanzar de 70 a 80% de confluencia, se transfirieron 80.000 células a una placa de cultivo de 24 pocillos y las células restantes se conservaron criogénicamente para ensayos adicionales en una fecha posterior. Las células en las placas de cultivo de 24 pocillos se hicieron crecer hasta que alcanzaron 50 a 80% de confluencia. Se recogió después el ARN total de estas células GH_{3} mediante el siguiente procedimiento.

Aislamiento de ARN de células GH_{3} transfectadas crecidas en placas de cultivo de 24 pocillos

La siguiente es una modificación del protocolo descrito por Chomczynski y Sacchi, Anal. Biochem., 162: 156-159 (1987). Se retiraron los medios que cubrían las células GH_{3} en las placas de cultivo de 24 pocillos y las células se lavaron con 1 ml de PBS. Se añadió 1 ml de solución de GTC y las células se incubaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. La solución de GTC se preparó disolviendo 250 g de tiocianato de guanidinio (Fluka) en 293 ml de H_{2}O d, y añadiendo después 17,6 ml de citrato de sodio 0,75 M a pH 7,0 y 26,4 ml de sarcosilo (L-laurilsarcosina) al 10%. Justo antes del uso, se añadieron 360 \mul de \beta-mercaptoetanol por 50 ml de solución de GTC. Después de 5 minutos a temperatura ambiente, se transfirió 1 ml de GTC-lisado celular a un tubo Sarstedt 55.518 de tapa a presión que contenía 2 ml de solución de GTC. Se añadieron a cada tubo 300 \mul de acetato de sodio 2 M a pH 4,0 y el tubo se agitó con vórtex. A continuación, se añadieron 3 ml de fenol saturado con H_{2}O d y los tubos se agitaron con vórtex de nuevo. Se añadieron a cada tubo 600 \mul de cloroformo: alcohol isoamílico (49:1) y el tubo se agitó a mano durante 10 segundos y se dispuso en hielo durante 15 minutos. Los tubos se centrifugaron después en un Sorval RC-5B utilizando un rotor SM24 a 8000 revoluciones por minuto (rpm) durante 20 minutos a 4ºC. La fase acuosa se transfirió a un tubo Sarstedt nuevo que contenía 3 ml de isopropanol y se dispuso a -20ºC durante 1 hora. Después de 1 hora, los tubos se centrifugaron en un Sorval RC-5B utilizando un rotor SM24 a 8000 rpm durante 20 minutos a 4ºC. Los sobrenadantes se eliminaron y los sedimentos se resuspendierón en 500 \mul de solución de GTC. El ARN resuspendido se transfirió a un tubo Eppendorf de 1,5 ml al que se añadieron 500 \mul de isopropanol. Los tubos se dispusieron de nuevo a -20ºC durante 1 hora. Los tubos Eppendorf se centrifugaron durante 5 minutos en una microcentrífuga y se desechó el sobrenadante. El sedimento se lavó con etanol al 70% dos veces y se dejó secar hasta que el etanol se hubo evaporado por completo. El sedimento se resuspendió en 20 \mul agua tratada con pirocarbonato de dietilo (depc) y se calentó a 65ºC durante 5 minutos. Este ARN se utilizó después para preparar ADNc en uno de los dos procedimientos descritos a continuación.

Reacciones de ADNc

Método 1

Se sintetizó ADNc de la primera cadena a partir de 2,5-6,0 \mul de ARN total (aproximadamente 0,5-6 \mug) en un volumen de reacción de 10-20 \mul. El ARN total se obtuvo mediante el método de extracción descrito anteriormente, y se desnaturalizó durante 5-10 minutos a 70ºC y enfriamiento rápido en hielo antes de añadir los componentes de la reacción. Las condiciones de reacción fueron Tris-HCl 50 milimolar (mM) (pH 8,3), MgCl_{2} 10 mM, DTT 10 mM, 0,5 mM de cada uno de dCTP, dATP, dGTP y dTTP (Pharmacia), KCl 40 mM, 500 unidades/ml de ARNasina (Promega, Biotech), 85 \mug/ml de oligo(dT)_{12-18} (Collaborative Research, Inc.) y 15.000-20.000 unidades/ml de transcriptasa inversa de virus de la leucemia de múrido Moloney (Bethesda Research Laboratories) incubado a 37ºC durante 60 minutos. La reacción se terminó mediante la adición de EDTA 40 mM, y el ácido nucleico se precipitó añadiendo acetato de sodio a una concentración 0,3 M y dos volúmenes de etanol. Se dejó formar un precipitado a 0ºC durante 30 minutos y se sedimentó mediante centrifugación en una microcentrífuga a 14.000 rpm durante 30 minutos. El sedimento se lavó con etanol al 70%, se secó y se resuspendió en agua tratada con depc a un volumen de 15-25 \mul.

Método 2

Las condiciones para la síntesis de la primera cadena de ADNc a partir de ARN se adaptaron de Carol A. Brenner et al., BioTechniques, vol. 7, nº 10, pág. 1096-1103 (1989). Se añadió 1 \mul de ARN total del procedimiento preparativo de ARN descrito anteriormente a 9 \mul de tampón de reacción en un tubo Eppendorf de 0,5 ml. El tampón de reacción consistía en 200 unidades de transcriptasa inversa del virus de la leucemia de múrido Moloney (MMLVRT, Bethesda Research Labs) y una concentración final de los siguientes reactivos: Tris-HCl 70 mM, pH 8,8, KCl 40 mM, 0,1% de Triton X-100, 1 mM de cada dNTP, MgCl_{2} 4 mM y 0,45 unidades DO_{260} de hexámeros aleatorios (Pharmacia). Después de mezclar, los tubos se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos y después se dispusieron a 42ºC durante 1 hora. Después de 1 hora, los tubos se calentaron a 90ºC durante 1 minutos para desactivar la MMLVRT y después se enfriaron a temperatura ambiente.

Amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de ARN de células GH_{3}

Se utilizaron los siguientes cebadores para amplificar, mediante PCR, ADNc de TSH\beta sintetizado a partir de transcriptos de ARN producidos por las células GH_{3} como resultado de la activación por plásmidos de RH del gen TSH\beta endógeno mediante recombinación homóloga.

Cebador	5'	3'
TSH\beta5	AGTATATGATGTACGTGGACAGG
TSH\beta3	CACTTGCCACACTTGCAGCTCAGG

La Figura 14 muestra las regiones del gen TSH\beta a las que corresponde cada cebador.

Condiciones de la reacción PCR

Todas las reacciones PCR se realizaron en el termociclador Ericomp Twinblock. Si la amplificación por PCR iba a realizarse con ADNc preparado mediante el método 2, se añadieron directamente 40 \mul de la mezcla de reacción adicional a los 10 \mul de la reacción de ADNc, llevando el volumen total hasta 50 \mul. Las concentraciones finales de reactivos en los 50 \mul fueron Tris-HCl 70 mM, pH 8,8, KCl 40 mM, 0,1% de Triton X-100, 2,25 unidades de polimerasa Taq (Pharmacia), 0,2 micromolar (mM) de cada cebador, 200 \muM de cada dNTP y MgCl_{2} 0,8 mM.

Si la PCR se iba a realizar con ADNc preparado mediante el método 1 anterior, se añadieron 5 a 10 \mul del ADNc resuspendido a 40 a 45 \mul que contenían las concentraciones finales siguientes: Tris-HCl 70 mM, pH 8,8, KCl 40 mM, 0,1% de Triton X-100%, 2,25 unidades de polimerasa Taq, 0,2 \muM de cada cebador, 200 \muM de cada dNTP y MgCl_{2} 0,8 mM.

Las reacciones se sometieron después a los siguientes ciclos PCR.

1 minuto a 94ºC.

30 segundos a 55ºC.

2 minutos a 72ºC.

El ciclo anterior se repitió de 30 a 40 veces. Se corrieron 10 \mul de cada mezcla de reacción en un gel de poliacrilamida al 6% y se examinó la presencia de un fragmento PCR de 247 pb que indicaría la presencia del ARNm apropiadamente ayustado para TSH\beta.

Resultados de PCR para la amplificación de ARN de TSH\beta de células GH_{3} y ARN total de glándula pituitaria de rata

Para determinar si las células GH_{3} sintetizan normalmente ARN de TSH\beta, se sometió ADNc de células GH_{3} no transfectadas, así como ADNc de glándulas pituitarias de rata, a las condiciones de reacción PCR anteriores. La banda de 247 pb correcta indicativa de la presencia de ARNm de TSH\beta fue visible en el control positivo de la muestra de glándula pituitaria de rata, pero no se visualizó ninguna banda de la muestra de ARN total de células GH_{3} incluso después de 60 ciclos (datos no mostrados).

Resultados de transfección

El número de colonias resistentes al G418 presentes en los discos de 10 cm se tabuló entre 14 y 21 días después de la adición de G418 a los medios.

Método de transfección	Colonias por disco de 10 cm
	pRSVCATNEO	pRSVCATNEOTSHB3-5XBAI
		Corte con ApaI	Corte con Aat2
Fosfato de calcio 1	48	13	29
Fosfato de calcio 2	-	21	58
Electroporación 1	-	1295	415
Electroporación 2	-	1051	723

Se recogió el ARN total de las agrupaciones de colonias contenidas en las placas de cultivo de 24 pocillos como se describe anteriormente. El ADNc se preparó a partir de estas preparaciones de ARN y se sometió a amplificación por PCR. El número de colonias positivas productoras de ARNm de TSH\beta se determinó mediante la presencia de un fragmento de 247 pb visualizado en gel de poliacrilamida. Cada una de las agrupaciones examinadas contenía entre 10 y 70 colonias. El número estimado de colonias por agrupación por transfección se utilizó para aproximar el número de clones de células GH_{3} resistentes al G418 en los que estaba activada la transcripción del gen TSH\beta. Si una agrupación se comprobaba positiva, se asumió que esto representaba una colonia positiva presente en esa agrupación particular.

Plásmido	Colonias resistentes al G418	Positivos de ARN de TSH\beta
pRSVCATNEO	60	0
pRSVCATNEOTSHB3-5XBAI
(digerido con Aat2)	4942	3
pRSVCATNEOTSHB3-5XBAI
(digerido con Apa1)	8580	6

Estos resultados demuestran la activación exitosa del gen TSH\beta normalmente transcripcionalmente silencioso mediante el método de la presente invención. Aunque el número de colonias que son positivas por transcripción de TSH\beta es pequeño comparado con el número de colonias que son resistentes al G418 (aproximadamente una de cada 10^{3} colonias resistentes al G418), este resultado es generalmente consistente con las tasas reseñadas para otros experimentos de recombinación homóloga (Michael Kriegler, Gene Transfer and Expression. A Laboratory Manual, Stockton Press, Nueva York, NY, (1990), pág. 56-60). Se ha observado generalmente que la tasa de recombinación homóloga parece ser proporcional a la tasa de transcripción del gen diana (M. Frohman y G. Martin, Cell, 56: 145 (1989); S.L. Mansour et al., Nature, 336: 348 (1988)). Debe observarse que la tasa que se ha demostrado es tres órdenes de magnitud mayor de la que podría esperarse por mutación aleatoria activando el gen TSH\beta.

Para asegurar que los resultados para cada agrupación de colonias fueran reproducibles y que la activación de la transcripción de ARN fuera estable, se descongelaron y expandieron en cultivo agrupaciones de colonias previamente congeladas correspondientes a agrupaciones que se comprobaron positivas en el primer examen. Las agrupaciones positivas de GH_{3} recién descongeladas se sembraron en matraces de cultivo de tejido T 25 y se expandieron hasta que las células alcanzaron 70% a 80% de confluencia. Se sembraron después 80.000 células en placas de cultivo de 24 pocillos de cada matraz y se hicieron crecer hasta que fueron de 50% a 70% confluentes. Se extrajo el ARN de las células, se convirtió en ADNc y se examinó una vez más la presencia de ARN de TSH\beta corriendo 10 ml de cada reacción PCR en un gel de poliacrilamida al 6%. La Figura 15 muestra los resultados de reacciones PCR representativas del segundo examen visualizadas en un gel de poliacrilamida mediante tinción con bromuro de etidio y fluorescencia. Los carriles 1, 2 y 3 contienen las reacciones PCR corridas con ADNc de células GH_{3} que se habían transfectado con pRSVCATNEO. El pRSVCATNEO no contiene regiones de homología con TSH\beta y por tanto no es capaz de activar el gen TSH\beta mediante recombinación homóloga. Como puede observarse en el gel de la Figura 15, no existen bandas correspondientes a 247 pb en esos carriles, indicando que el gen TSH\beta no está activado. El carril 6 contiene también un control negativo. En ese carril, se combinaron tres agrupaciones de muestras de células GH_{3} que se habían transfectado con pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI (corte con ApaI) pero que fueron negativas para transcripción del gen TSH\beta en el primer examen. La ausencia del fragmento de 247 pb en el carril 6 demuestra que la presencia de un plásmido pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI transfectado (corte con ApaI) integrado aleatoriamente en el genoma no es capaz de producir el fragmento PCR de TSH\beta de 247 pb. Los carriles 7, 8, 9 y 10 incluyen reacciones PCR corridas con ADNc preparado a partir de ARN total recogido de glándulas pituitarias de rata en cantidades de 25 nanogramos, 100 nanogramos, 200 nanogramos y 400 nanogramos por reacción, respectivamente. La presencia en estos carriles de la banda esperada de 247 pb, producida a partir de ADNc preparado a partir de un tejido de rata que expresa normalmente TSH\beta, mostró que las condiciones de reacción PCR se habían optimizado correctamente, y que la banda PCR obtenida en los carriles 4 y 5 que contenían los positivos de TSH\beta de recombinación homóloga es del tamaño correcto. Dos agrupaciones transfectadas con pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI (corte con ApaI) que fueron positivas en el primer examen, ApaI-107 en el carril 4 y ApaiI-136 en el carril 5, se comprobaron de nuevo positivas para activación del gen TSH\beta como demostraba la presencia de la banda PCR de TSH\beta correcta amplificada a partir de ADNc preparado a partir de extractos de ARN total de esas agrupaciones, probando que la transcripción del gen TSH\beta se ha activado establemente. La presencia de bandas a 247 pb en los carriles 4 y 5 que contienen ARN de las ApaI-107 y ApaI-136 positivas anteriores y la ausencia de bandas en los controles negativos de células GH_{3} transfectadas con pRSVCATNEO en los carriles 1-3 y los negativos de pRSVCATNEOTSHB3-5XbaI (corte con ApaI) en el carril 6 demostraron que la producción de ARN de TSH\beta en una estirpe celular que no produce normalmente ese ARN se ha activado establemente mediante recombinación homóloga.

La presente invención no está limitada a la estirpe celular que se describe en la presente memoria. Todas las estirpes celulares tienen información genética que es normalmente silenciosa o inerte. La mayoría son capaces de expresar sólo ciertos genes. Sin embargo, un gen normalmente transcripcionalmente silencioso o inerte de cualquiera de dichas estirpes celulares puede activarse para expresar el producto génico según la presente invención, y pueden modificarse las características de expresión de cualquier gen del genoma según la presente invención. Pueden utilizarse incluso estirpes celulares previamente transformadas siempre que la transformación previa no desestabilizara el gen de interés. La fuente de la estirpe celular no es importante. La estirpe celular puede ser animal, de planta, primaria, continua o inmortal. Por supuesto, es deseable que cualquiera de dichas estirpes celulares sea estable e inmortal, de modo que después del tratamiento con la técnica según la presente invención pueda comercializarse la expresión. Los microorganismos clonados, procarióticos o eucarióticos, pueden tratarse también mediante la técnica de la presente invención.

Aunque la presente invención se ha descrito preferiblemente con respecto a la expresión de un gen normalmente transcripcionalmente silencioso o inerte, la técnica de la presente invención es también aplicable a la modificación de las características de expresión de un gen que se expresa naturalmente en la estirpe celular hospedadora. Por ejemplo, si se desea volver la expresión de un gen dependiente de las condiciones de cultivo o similares de modo que la expresión pueda activarse y desactivarse a voluntad, puede insertarse un segmento regulador de ADN apropiado, tal como un promotor regulable, que confiera dichas características, tales como represibilidad o inducibilidad. Por ejemplo, si es conocido que el tipo celular contiene receptores esteroides nucleares tales como de estrógeno, testosterona o glucocorticoide, o receptores de tiroxina, podrían utilizarse los elementos de respuesta a esteroides o tiroxina como región F. Dicho elemento de respuesta es cualquier ADN que se une a dicho receptor para desencadenar una respuesta positiva respecto a la transcripción. Incluso si una célula no es naturalmente sensible a glucocorticoides, por ejemplo, podría añadirse un trozo de ADN que codifica el receptor de glucocorticoides al constructo, o insertarlo de otra manera en algún lugar del genoma, de modo que hiciera a la célula sensible a los glucocorticoides. El uso de un promotor regulable podría ser deseable tanto si el gen de interés en normalmente transcripcionalmente silencioso como si no. Pueden obtenerse también otros tipos de regulación dirigiendo el segmento regulador de ADN apropiado a la posición exacta de interés mediante el proceso de la presente invención.

Por tanto, aunque la estimulación de la expresión de genes normalmente transcripcionalmente silenciosos es la aplicación preferida de la presente invención, en su sentido más amplio es aplicable a la modificación de las características de expresión de cualquier gen endógeno de la estirpe celular hospedadora.

La técnica específica de recombinación homóloga no es, per se, una nueva parte de la presente invención. Dichas técnicas son conocidas y los expertos en la técnica entenderán que puede utilizarse cualquiera de dichas técnicas en la presente invención siempre que permita dirigir la secuencia reguladora de ADN a la localización deseada con respecto al gen de interés. Aunque se describe una técnica preferida, utilizando un constructo linealizado con dos regiones homólogas en cada extremo de las secuencias a insertar, cualquier otra técnica que realice esta función, como por ejemplo utilizando constructos circulares, se pretende que esté también comprendida por la presente invención. El rasgo crítico de la presente invención es el uso de técnicas de recombinación homóloga para insertar una secuencia reguladora de ADN que causa la modificación de las características de expresión en la estirpe celular o microorganismo que se están utilizando, ligada operativamente a un gen en el genoma de la estirpe celular, preferiblemente uno que es normalmente transcripcionalmente silencioso, o insertar una secuencia amplificable, sin una secuencia reguladora, suficientemente cerca de un gen en el genoma de la estirpe celular que se transcribe ya como para causar la amplificación de dicho gen tras la amplificación de la secuencia amplificable. No es absolutamente necesario incluir también un marcador seleccionable. La selección puede basarse solamente en la detección del producto génico o ARNm de interés en los medios o células después de la inserción del constructo de ADN. Además, en la realización en la que se inserta una secuencia reguladora, la amplificación, aunque deseada, no es crítica para la operabilidad. Lo mismo es cierto para el gen de selección negativa, que hace más fácil el proceso de examen pero no es crítico para el éxito de la invención. Por tanto, la realización básica requiere sólo la inserción del segmento regulador de ADN o el segmento amplificable en la posición específica deseada. Sin embargo, se prefiere la adición de genes marcadores seleccionables positivos y/o negativos para uso en la técnica de selección, así como la adición de un gen amplificable en la realización en la que se añade un segmento regulador.

La expresión "modificación de la expresión", como se utiliza en toda la presente memoria y reivindicaciones, se define en la presente memoria excluyendo la terminación de la expresión mediante la inserción por recombinación homóloga de una mutación, deleción, codón de paro u otra secuencia nucleotídica, incluyendo un gen completo, en el gen de interés de modo que se evita la expresión del producto de interés. La técnica anterior muestra el uso de la recombinación homóloga para insertar mutaciones específicas, y la expresión de un producto celular puede terminarse inherentemente por medio de la misma (véase, por ejemplo, Schwartzberg et al., PNAS (USA), 87: 3210-3214 (1990)). La presente invención no pretende comprender dicho procedimiento. En la presente invención, la "modificación de la expresión" se realiza mediante la inserción de regiones reguladoras y/o de amplificación en una localización deseada específica mediante recombinación homóloga. Las modificaciones preferidas son aquellas que activan y/o potencian la expresión del producto de interés.

Siempre que la presente memoria utiliza la frase de que un segmento regulador de ADN está "ligado operativamente a" un gen, con dicha terminología se pretende indicar que el segmento regulador de ADN está dispuesto con respecto al gen de interés de modo que la transcripción de dicho gen está regulada por ese segmento regulador de ADN. El segmento regulador está preferiblemente cadena arriba del gen, pero puede estar cadena abajo o en el gen, a condición de que opere regulando la expresión del gen de alguna manera. El segmento regulador de ADN puede ser un promotor, terminador, operador, potenciador, silenciador, atenuador o similar, o cualquier combinación de los mismos.

Siempre que se utilizan las expresiones "cadena arriba" o "cadena abajo" en las presentes memoria y reivindicaciones, se pretende indicar en la dirección 5' o en la dirección 3', respectivamente, respecto a la cadena codificante del gen de interés.

La anterior descripción de las realizaciones específicas revela tan completamente la naturaleza general de la invención que otros pueden modificar y/o adaptar fácilmente dichas realizaciones específicas para diversas aplicaciones sin apartarse del concepto genérico. Cualquiera de dichas adaptaciones y modificaciones se pretende que estén comprendidas en el significado e intervalo de equivalentes de las realizaciones descritas. Ha de entenderse que la fraseología y terminología empleadas en la presente memoria son con fines de descripción y no de limitación.

Claims

1. Un constructo de ADN adecuado para uso en la modificación de las características de expresión de un gen preseleccionado en una estirpe celular hospedadora eucariótica predeterminada y adecuado para dirigir dicho gen preseleccionado mediante recombinación homóloga, comprendiendo el constructo:

: un segmento regulador de ADN (F) que activa y/o potencia la expresión de dicho gen preseleccionado cuando se liga operativamente al mismo,

: dos segmentos de direccionamiento de ADN (A, B) homólogos de una región del genoma en o próxima al gen preseleccionado en la estirpe celular hospedadora, uno de los cuales (A) es homólogo de una región del genoma localizada cadena abajo de la región específica en la que se inserta el segmento regulador (F), y el otro (B) es homólogo de una región del genoma localizada cadena arriba de la región específica en la que se inserta el segmento regulador (F),

: un marcador seleccionable positivo,

: un marcador seleccionable negativo, y

: un gen amplificable.

2. Un constructo de ADN según la reivindicación 1, en el que el segmento regulador de ADN (F) es un promotor.

3. Un constructo de ADN según la reivindicación 1 ó 2, en el que al menos el segmento B de direccionamiento de ADN es homólogo de una región no codificante del genoma.

4. Un constructo de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el segmento A de direccionamiento de ADN incluye una porción del gen preseleccionado.

5. Un constructo de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el marcador seleccionable positivo tiene una región promotora transcripcionalmente activa diferente del segmento regulador de ADN (F).

6. Un constructo de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el marcador seleccionable negativo tiene una región promotora transcripcionalmente activa diferente del segmento regulador de ADN (F).

7. Un constructo de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el gen amplificable tiene una región promotora transcripcionalmente activa diferente del segmento regulador de ADN (F).

8. Un constructo de ADN según la reivindicación 1 a 7, en el que el marcador seleccionable positivo se selecciona de adenosina desaminasa (ADA), aminoglicósido fosfotransferasa (neo), dihidrofolato reductasa (DHFR), higromicina-B-fosfotransferasa (HPH), timidina quinasa (tk), xantina-guanina fosforribosiltransferasa (gpt), gen de resistencia múltiple a fármacos (MDR), ornitina descarboxilasa (ODC) y resistencia al N-(fosfonoacetil)-L-aspartato
(CAD).

9. Un constructo de ADN según la reivindicación 1 a 8, en el que el marcador seleccionable negativo es el gen de timidina quinasa del herpesvirus simplex (HSVtk).

10. Un constructo de ADN según la reivindicación 1 a 9, en el que el gen amplificable se selecciona de DHFR, MDR, ODC, ADA y CAD.

11. Un constructo de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el constructo de ADN está linealizado.

12. Un constructo de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el constructo de ADN es circular.

13. Uso de un constructo de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes para modificar las características de expresión de un gen preseleccionado en una estirpe celular hospedadora eucariótica predeterminada.

14. Uso de un constructo de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para la expresión de proteínas en una estirpe celular hospedadora predeterminada.

15. Uso según la reivindicación 13 ó 14, en el que la célula hospedadora eucariótica es una estirpe celular estable.

16. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que la célula hospedadora eucariótica es una estirpe celular diferenciada.

17. Una célula hospedadora eucariótica transfectada con un constructo de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

18. Un genoma que comprende un constructo de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

19. Uso de una célula según la reivindicación 17 para la producción de un producto génico.

20. Uso según la reivindicación 19, en el que el producto génico es el ARNm de dicho gen.

21. Uso según la reivindicación 19, en el que el producto génico es el producto proteína.

22. Proceso para la preparación de un producto génico que comprende la etapa de cultivar la célula según la reivindicación 17.

23. Proceso según la reivindicación 22, que comprende además la etapa de selección química.

24. Proceso según la reivindicación 22 ó 23, que comprende además la etapa de monitorizar la producción del producto génico específico del gen recién activado en la estirpe celular hospedadora eucariótica.