PT85346B - Processo para a preparacao de antitrombina iii (atiii) humana e de composicoes farmaceuticas que a contem bem como de vectores e de celulas hospedeiras apropriadas para a obtencao de atiii humana - Google Patents
Processo para a preparacao de antitrombina iii (atiii) humana e de composicoes farmaceuticas que a contem bem como de vectores e de celulas hospedeiras apropriadas para a obtencao de atiii humana Download PDFInfo
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Description
Memória descritiva referente à patente de invenção de BEHRINGWERKE, AKTIENGESELLSCHAFT, alemã, industrial e comercial, com sede em D-3550 Marburg, República Federal Alemã, (inventores: Dr. Gerd Zettlmeissl, Dr. Míchael Brõker e Dr. Hermann Ragg, residentes na República Federal Alemã), para PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE ANTITROMBINA III (ATUI) HUMANA E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE A CONTÊM BEM COMO DE VECTORES E DE CÉLULAS HOSPEDEIRAS APROPRIADAS PARA A OBTENÇÃO DE ATUI HUMANA.
Memória Descritiva
A preparação e a caracterização do cADN que codifica para ATUI bem como a preparação de ATUI em E. coli são conhecidos do pedido de Patente Europeia com o numero de publicação 0 090 505. Nesta publicação encontram-se também informações sobre a preparação de ATUI em culturas de células de mamífero. O vector considerado apropriado referido e um derivado do plasmídeo pBR322 que contém uma marca para a selecção em E. coli bem como uma origem de replicação em E. coli. O vector deve além disso conter a origem de replica ção de SV40 (derivada de um fragmento PvulI-HindIII de 342 pb) .
Pelo contrário, a presente invenção diz respeito a um processo especialmente vantajoso, no qual as
CR.
células hospedeiras utilizadas são células de mamífero que não tem capacidade de produzir ou não produzem em escala suficiente di-hídrofolato-redutase e no qual estas células hospedeiras são transfectadas com dois vectores de expressão dos quais um contém o gene de ATUI e o outro activa a produção de di-hidrofolato-redutase.
A presente invenção diz respeito, por conseguinte, a um processo para a preparação de antitrombina III (ATUI) em cultura de células de mamífero, por meio de um vector de expressão, que contém o cADN da ATUI, caracterizado por se utilizar como células de mamífero uma cultura de células dhfr que, além do vector referido, foram transfec tadas com um outro vector que contém um gene DHFR. Em seguida elucidam-se mais em pormenor aspectos adicionais e os aperfeiçoamentos preferidos da presente invenção cujo âmbito é defini do nas reivindicações.
sistema de cotransfecção de acordo com o processo da presente invenção utiliza deste modo dois vectores de expressão, sendo o primeiro um.vector qualquer, por exemplo um derivado do plasmídeo pBR322, no qual foi integrado de modo conhecido em si o gene da ATUI sob o con trolo de um promotor activo em células eucarióticas, enquanto que no segundo vector, que codifica para a di-hidrofolato-redutase e deste modo possibilita também uma possibilidade de amplificação do gene, a expressão do gene DHFR é controlada por uma sequência de ADN da região ori do pBR322.
As figuras mostram a título exemplificati vo modos de concretização especialmente preferidos da presente invenção:
Na figura 1 e na respectiva continuação, Figura la, descreve-se a construção do vector pSVA STOP 1, que contém o fragmento pBR322-EcoRI-PvuII, o fragmento HindIII-PvulI com a origem da replicação e o promotor para a transcrição precoce e tardia bem como os sítios de poliadenilação do fragmento BamHI-Hpal do genoma de SV40 e adicionalmente a paragem da tradução do plasmídeo pUC12 STOP.
A Figura 2 mostra a integração da sequência de ADN que codifica para a ATUI no vector pSVA STOP.l,
A Figura 3 descreve a construção dos vectores pMTVAdhfr (que contêm o promotor de MMTV-LTR) e pSVOAdhfr (que não apresenta qualquer promotor eucariótico ou virai) .
A Figura 4 mostra as contribuições de expressão de ATIII por linhas de células que contêm cada uma um dos dois últimos vectores referidos e que foram obtidas por uma amplificação de genes com metotrexato.
E conveniente que não apenas o primeiro vector, que contém o gene da ATIII, mas também o segundo vector com o gene DHFR seja obtido sob a forma dum derivado do plasmídeo pBR322.Estes vectores tem a vantagem de serem amplificáveis em E. coli e simultaneamente poderem ser utilizados como vectores pêndulo em células eucarióticas. Para marca de selecção utiliza-se com vantagem o gene de resis tencia à ampicilina contido no fragmento EcoRI-PvuII-pBR322. É evidente que é possível integrar de acordo com métodos conhe eidos em si outros nBrwdcres,nnroadcres adicionais bem como alterar ou eliminar regiões não essenciais.
Um outro aperfeiçoamento preferido dos vectores consiste em que a sequência de paragem de tradução de pUC12 STOP (M. Broeker e E. Amann, Appl. Microbiol. Biotechnol. 23 (1986) 294-296) segue em associação ao gene estrutural. Neste segmento de ADN encontram-se codões de paragem da tradução em concordância com todos os três quadros de leitu ra, o que possibilita a expressão de genes modificados que não possuem qualquer sinal próprio de paragem da tradução.
São conhecidas em geral células de mamífe fero que não produzem di-hidrofolato-redutase ou que não produ zem esta enzima em quantidade suficiente (dhfr ), sendo igualmente conhecidos vectores apropriados que compensam este defeito (Ernst-L. Winnacker, gene und Klone, eine Einfuhrung in die Gentechnologie, VCH Verlagsgesellschaft Weinheim, 1984 pág. 267/268, 282, 289).
Por exemplo, G. Urlaub e L. A. Chasin descrevem em Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77 (1980), 4216-4220, o isolamento de mutantes CHO de células que são deficientes com respeito à actividade de de-hidrofolato-redutase. Deste modo,obtêm-se linhas de células do tipo dhfr. De modo análogo, podem também ser prepa radas outras linhas de células de mamífero de forma reproductível. Os mutantes são triplamente auxotróficos e necessitam para o crescimento de glicina, de um nucleootideo purínico c£ mo a hipoxantina e de timidina.
Descrevem-se vectores que podem integrar em células animais, o gene da di-hidrofolato-redutase por exemplo em F. Lee et al., Nature 294 (1981) 288. Neste caso faz-se uso do cADN que codifica para di-hidrofolato-redutase de rato (A.C.Y. Chang et al., Nature 275 (1978) 617-624). De modo análogo podem incorporar-se outros genes de di-hidrofo lato-redutase funcionais em células de mamífero.
Considera-se preferido o sistema constituído por células CHO-dhfr” e pelo gene de dhfr do rato.
Os vectores de expressão para ATUI tiram proveito do promotor precoce do domínio de ADN da origem de replicação de SV40, do promotor da metalotioneina-II humana (M. Karin e R.I. Richards, Nature 299 (1982) 797-802), do domínio intensificador-promotor de um gene immediate early do HCMV (citomegalovirus humano, M. Boshart et al·., Cell 41 (1985) 521-530), ou do promotor da proteína de choque térmico (hsp 70) da Drosophila (Holmgren et al., Cell 18 (1979)
1359-1370). A expressão da di-hidrofolato-refutase pode ser levada a efeito sob regulação de um promotor fracamente activo na linha de células de mamífero como o MMTV-LTR (mouse mammary tumor virus-long terminal repeat, F. Lee et al., op. cit.) ou - correspondendo a um modo de concretização preferido da presente invenção - também sem promotor eucariotico. No último caso o gene de dhfr está em ligação imediata com uma se quência de ADN do plasmídeo pBR322, a qual é reconhecida de forma manifesta como um promotor fraco em células de mamífero (K. -D. Langer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83 (1986) 1598-1602).
Também são descritos sistemas de expressão adequados na publicação de Patente US 4 399 216 e 4 576 821 bem como no pedido de Patente Europeia com os números de publicação 0 100 521 e 0 117 060.
Um outro aperfeiçoamento da presente invenção consiste em se usarem vectores que não contém quaisquer in troes ou splice sites. Foi surpreendente que estes vecto res fossem tão activos, uma vez que na EP-A2 090 505 se tor naram necessários splice sites de ARN para vectores a fim de se obter a expressão da ATUI em culturas de células .
É conhecido o facto de que a di-hidrofolato-redutase é inibida pelo metotrexato. As células que crescem em meios sem glicina, hipoxantina e timidina são, por consequência, inibidas no respectivo crescimento ou mortas pelo metotrexato. Por variações da concentração no meio e da densidade das células é possível seleccionar as células que cres^ cem em presença de metotrexato. Estas células sao resistentes às concentrações de metotrexato escolhidas em virtude de uma amplificação do gene DHFR e de uma consequente mais elevada produção da enzima DHFR. As células sobreviventes podem de novo ser expostas a concentrações mais elevadas de metotrexato, obtendo-se deste modo linhas de células com um número ainda maior de genes DHFR.
A amplificação de genes pode ser realizada de acordo com duas técnicas diferentes:
1. As células são amplificadas por uma passagem simples em concentrações crescentes de metotrexato. Deste modo obtém-se uma população de células geneticamente heteróloga em que existem células com diferentes graus de amplificação.
2. Após cada fase de concentração de metotrexato, isolam-se e analisam-se os clones de células geneticamente idênticas, tomando-se-pará cada fase sucessiva apenas as linhas de células que se expressam melhor na fase anterior.
Demonstrou-se que nas linhas de células cotransfectadas da presente invenção a amplificação de genes com metotrexato não conduz apenas a um aumento do numero de genes DHFR mas também a uma amplificação do gene da ATUI.
Para multiplicar células animais em cultura necessita-se em geral da presença de soro no meio de crescimento. Descobriu-se agora que as linhas de células que produ zem ATUI podem ser conservadas tanto em meios contendo so ro como em meios isentos de soro, não se verificando qualquer redução da taxa de expressão de ATUI após várias passagens. Este aperfeiçoamento do processo da presente invenção não é apenas vantajoso pelo motivo de se poder economizar soro, que é um material caro, mas também por se facilitar consideravelmente a separação da ATUI quando a última fase de produção é levada a efeito em meio isento de soro.
A ATUI recombinante obtida apresenta uma actividade biológica integral. Este produto é estimulado pela heparina - tal como acontece com o produto natural isolado a partir de plasma humano. Portanto é adequado para a preparação de medicamentos tanto como o produto natural.
Nos exemplos que se seguem elucida-se mais em pormenor a presente invenção. As construções dos vectores são adicionalmente ilustradas através das figuras 1 a 3, nas quais em geral, os desenhos não estão à escala. Em especial os fragmentos pequenos e as sequências de ligantes poliméricos são, em regra, representados ampliados.
EXEMPLO 1
a) Construção dum vector de expressão para células animais
Cortou-se o plasmideo pSV2dhfr (Fig. 1) (Lee et al. op. cit.) com HindIII e EcoRI e isolou-se o fragmento vector de 2,65 Kb que contém o promotor early de SV4O. No vector deste modo obtido ligou-se um fragmento HindIII-EcoRI de 67 pb de pUC12 STOP (Broeker e Amann, op. cit.), obtendo-se o plasmídeo pSV2 STOP. No fragmento de 67 pb de pTJC12 STOP encontram-se codões de paragem de tradução em todos os três quadros de leitura.
Linearizou-se pSV2 STOP com Saci e eliminou-se a extremidade saliente 3’ com o auxílio da actividade de exonuclease 3' -$> 5' da ADN-polimerase I. Em seguida digeriu
-se com EcoRI. Após ligação com um fragmento EcoRI-Hpal de 133 pb de comprimento proveniente de pBB3 (fig. la) (B. Bourachot et al., Embo J. 1 (1982) 895-900), que contém o sinal de poliadenilação de SV40 para transcrição precoce, foi possível obter o vector de expressão pSVA STOP 1.
O sítio de poliadenilação pode também ser isolado a partir do vector pIG6 (Bourachot et al., op.cit.). Do mesmo modo pode -se isolar o fragmento BamHI-Hpal de 133 pb do genoma de SV40, preencher o sítio de corte BamHI e aplicar um ligante EcoRI.
plasmídeo pSVA STOP1 contém deste modo, entre o promotor ”early de SV40 e o sinal de poliadenilação de SV40 para transcrição precoce um ligante polimérico de clonagem com três sítios de restrição singulares (HindIII-Sal I-Xbal) e uma sequência com paragens de tradução em concordância com todos os três quadros de leitura.
b) Construção dum vector de expressão ATUI cADN da ATUI e conhecido da EP -A2 0 090 505 e pode ser preparado conforme descrito naquela publicação ou pode ser sintetizado de acordo com os métodos habituais. No pedido de Patente Alemã P36 18 638.4 descreve-se o plasmídeo p/)AT6 (Figura 1), o qual contém o cADN da ATUI no sítio de corte do plasmídeo pUG13.
O plasmídeo de subclonagem para o ATUI, pj)AT6 (Fig. 2), foi linearizado por corte no sítio singular EcoRI. A extremidade 5* saliente foi tornada romba por preenchimento da contra-catenãria com ADN-polimerase-I (fragmen to de Klenow) e em seguida ligou-se com o ligante Sal I
5’d(pGGTCGACC) 3'
Por digestão subsequente com Xbal isolou- se um fragmento de ADN de cerca de 1400 pb de comprimento , o qual codifica para a pré-ATIII integral.
Por ligação destes fragmentos no vector de expressão pSVASTOPl cortado com SáL I e Xbal obteve-se o plasmídeo pSVATIII. A unidade de transcrição de ATUI no plasmídeo pSVATIII não apresenta qualquer splice sites de m-ARN.
c) Construção do vector de expressão de DHFR para co- transfecção ponto de partida para o vector DHFR utilizado para cotransfecção foi o plasmídeo pMTVdhfr (Lee et. al., op. cit.). Cortou-se o plasmídeo pMTVdhfr (fig. 3) com BglII e preencheram-se as extremidades 5' salientes do ADN com o auxílio de polimerase I (fragmento de Klenow). Após digestão com EcoRI isolou-se um fragmento de 4,47 kb de comprimento e ligou-se com um fragmento de 133 pb obtido a partir de pBB3 com EcoRI-Hpal (Bourachot et al., op. cit.). 0 novo plasmídeo pMTVAdhfr contém o cADN DHFR de rato flanqueado por MMTV-LTR e pelo sítio SV40 de poliadenila ção para a transcrição precoce.
plasmídeo pSVOAdhfr foi obtido a partir do plasmídeo pMTVAdhfr por supressão de um fragmento HindIII de 1450 pb de comprimento, o qual contém o MMTV-LTR.
Tanto o plasmídeo pMTVAdhfr como o pSVOAdhfr contém splice sites de m-ARN.
Exemplo 2
Cotransfectaram-se os plasmídeos pSVATIII e pMTVAdhfr ou pSVOAdhfr em células CHO-dhfr- por meio do método de precipitação com fosfato de cálcio (Graham e von der Eb, Virology 52 (1973) 456-467). De acordo com este mé todo, misturaram-se e coprecipitaram-se 20 yug do plasmídeo pSVATIII com 5 yug do plasmídeo de expressão para DHFR pMTVAdhfr ou pSVOAdhfr. O coprecipitado da mistura de plasmídeos foi transfectado em células CHO-dhfr- tal como descrito acima (0,5 x 10° células em placas de cultura de 25 cm ). Após 3 dias trataram-se as células com tripsina, transferiram-se para várias placas de Petri de 60 mm e trataram-se com meio de selecção (meio sem glicina, hipoxantina e timidina).
Nestas condições apenas sobreviveram as células que tinham si do transfectadas de modo estável com o gene DHFR.
Após 1 a 3 semanas eram visíveis nas placas de Petri colónias formadas pelas células transfectadas. Deste modo foi possível calcular as seguintes taxas de transfecção.
pMTVAdhfr 5 x 106 pSVOAdhfr 1 x 10^
Separaram-se colónias isoladas e multipLi caram-se em meio sem glicina, hipoxantina e timidina.
Ensaiaram-se os sobrenadantes das culturas destas novas linhas de células (CHO SVAT III) por meio de análises ELISA específicas pela detecção de ATUI humana em ATUI recombinante. Deste modo verificou-se que 20 7a das linhas de células CHO-dhfr+ ensaiadas segregavam no meio ATUI humana em quantidade detectável. A fim de determinar quantitavamente a taxa de expressão das linhas de células produtoras de ATUI, efectuou-se o seguinte procedimento normalizado de análise: transferiram-se das placas 0,5 x 10^ células para placas de cul tura de 25 cm com 5 ml de meio. Apos 24 h retirou-se o meio para se submeter a análise ELISA e trataram-se as células com tripsina.
Os valores dados representam médias de pe lo menos três passagens, verificando-se que a taxa de expressão se manteve constante dentro de uma margem de variação de + 25%. Em todos os valores apresentados em seguida para as taxas de ex pressão (pg/10° células/24 h) o número de células por placas de 25 cn/ no fim do ensaio era de 1 + 0,25 x 10^ células. No resumo seguinte apresentam-se as taxas de expressão dos clones básicos analisados de acordo com a técnica e o procedimento descritos:
CHO SVAT III-MTVAdhfr clone 1: 0,14 yug/10^ células/24 h clone 2: 0,11 /ig/10^ células/24 h
I
CHO SVAT III-SVOAdhfr
clone 1: 0,08yug/10 células/24 h clone 2: 0,14yUg/10^ células/24 h
Exemplo 3
Amplificação da sequência de ATUI integrada
a) Amplificação sem isolamento de clones
Cultivaram-se CHO SVAT III-MTVAdhfr (cio nes 1 e 2) e CHO SVAT III-SVOAdhfr (clones 1 e 2) por transferências sucessivas em concentrações crescentes de metotrexato (Mtx). De acordo com o método normalizado referido acima determinaram-se as seguintes taxas de expressão Qug/ 10^ células/24 h:
| Mtx | CHO SVAT III-pMTVAdhfr | CHO SVAT III-SVOAdhfr | ||
| Clone 1 | Clone 2 | Clone 1 | Clone 2 | |
| 0 | 0,14 | 0,11 | 0,08 | 0,14 |
| 0,05 | 0,34 | 0,54 | - | - |
| 0,15 | - | 0,60 | 0,64 | 2,7 |
| 0,3 | 0,55 | 1,15 | - | 3,3 |
| 0,6 | 1,18 | 2,00 | 0,86 | - |
| 1 | - | - | 1,5 | - |
| 5 ^1M | - | 4,00 | - | 8,5 |
| b) | Amplificação | com isolamento | de clones | |
| Os níveis de concentrações de Mtx | usados foram |
de 0,1 juM e 1 pM. A partir de CHO SVAT III-MTVAdhfr (clone 2) isolaram-se 8 clones resistentes a Mtx 0,1 yuM e a partir de CHO SVAT III-SVOAdhfr (clone 1) isolaram-se 11 clones e caracterizaram-se em relação ãs respectivas taxas de expressão (Fig. 4); em ordenadas representam-se os rendi6 mentos em ATUI em yUg/10 células/24 h) . Todos estes clones produziram uma maior quantidade de ATUI em comparação com os respectivos clones de partida (ver acima).
As taxas de expressão dos clones cultivados em Mtx 0,1 ^tiM si fruam-se, para os clones obtidos; a partir de CHO SVAT III-MTVAdhfr (clone 2), entre 0,15 e 0,8 jug/10 células/24 h (correspondente a uma elevação por um factor de 1,4 a 7) e para os clones obtidos a partir de CHO SVAT III-SVOAdhfr (clq o ne 1), entre 0,35 e 3,2 ^ug/10 celulas/24 h (correspondente a uma elevação por um factor de 1 a 40). Por meio de análise de Southern blot (Southern, J. Mol.Biol. 98 (1975) 503) foi possível verificar que em todos os clones cultivados em Mtx 0,1 yuM que foram analisados se tinha amplificado um fragmento BamHI-HindIII de 1400 pb de comprimento proveni ente do cADN de ATUI transfectado.
Com uma das linhas de células melhores resistentes a Mtg: 1 A; 2,2 yug/10
A2) efectuou-se yuM. Deste modo
0,1 yuM (CHO SVAT III-SVOAdh células/24 h; designado na uma segunda série de amplifica foi possível, por outro lado,
Mtx clones ensaiados, isolar uma linha de células (CHO SVAT yUg/10 productoras fr, clone
Fig. 4 por ção em em 9
III-SVOAdhfr clone 1A27), o qual produzia cerca de 10 células/24 h.
Exemplo 4
Síntese de ATUI em meio isento de soro clone 1 A27 (Mtx 1 joM) de CHO
SVAT III-SVOAdhfr foi cultivado em placas de cultura de 175 cm com meio de selecçao HamF12 (sem glicina, timidina e hipoxantina) na presença de 10Z (v/v) de soro fetal de vite la até cerca de 80 % de confluência, as células foram em seguida lavadas com meio de Iskov e depois conservadas neste meio durante 48 h para produção de ATIII. No fim deste período a concentração de ATIII no meio era de 5 a 6 yug/ml. As células foram em seguida conservadas durante 24 a 48 h em meio contendo soro, até um segundo periodo de produção de 48 h de duração em meio isento de soro. Foi possível repetir várias vezes o ciclo de produção descrito sem redução das taxas de expressão de ATIII.
ί
Exemplo 5 Purificação e caracterização de ATUI obtida a partir de células animais
Purificou-se a ATUI por meio de cromatografia de afinidade em SEPHAROSE^-heparina (Miller-Ander sen ed al., Tromb. Res. 5 (1974) 439 - 452) tanto em meio contendo soro como em meio isento de soro. 0 material purificado mostrou identidade imunológica com ATUI obtida a partir de soro humano no ensaio de imunodifusão de acordo com Ou chterlony (Prog. Allergy 5, (1958) 1). Também no ensaio de Western blot com anticorpos específicos para ATUI se verificou haver identidade entre a ATUI obtida a partir de plasma humano e a ATUI recombinante obtida a partir de célu las CHO.
A AT III segregada por células CHO possui tanto factor de heparina (Hensen e Loeliger, Tfcrombm Diath.haemah 9(1963)Suppl. 1, 18 - 29) como actividade de inibição progressiva (Schrader et al., Arztl. Lab. 29 (1983) 35 - 39) em escala integral.
Claims (1)
- REIVINDICAÇÕES _ ia _Processo para a preparação de antitrombina III (ATUI) humana em culturas de células de mamífero, por meio de um vector de expressão, que contém o cADN da ATUI, caracterizado por se utilizar como células de mamífero uma cultura de células dhfr que foram transfectadas com um outro vector que contém um gene DHFR.- 2â -Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o gene DHFR não conter intercalado qualquer promotor eucariótico ou virai.- 3§ 12Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 °u 2 caracterizado por o gene DHFR estar contido a jusante da região ori de plasmídeo pBR322._ 4a _Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1, 2 ou 3 caracterizado por o gene DHFR estar contido a jusante da região ori de um segmento do plasmídeo pBR322 que contenha uma marca de selecção.-5ê -Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a marca de selecção ser o gene de resistência à ampicilina.-6ê -Processo de acordo com qualquer das reivindicações 4 ou 5, caracterizado por se utilizar como segmento do plasmídeo pBR322 e fragmento EcoRI-PvuII.-7§ -Processo de acordo com qualquer uma ou várias das reivindicações anteriores caracterizado por o gene da ATUI ser regulado por um promotor virai.-8â -Processo de acordo com qualquer uma ou vã rias das reivindicações anteriores caracterizado por os vectt) res não conterem qualquer splice site._ 9a _Processo de acordo com qualquer uma ou vá rias das reivindicações anteriores caracterizado por se ampli ficar o gene DHFR em conjunto com o gene da ATUI mediante 0 uso de metotrexato.- 10a 13Processo de acordo com qualquer uma ou vã rias das reivindicações anteriores caracterizado por se efectuar a produção de ATIII num meio isento de soro.- lia -Processo para a produção de um vector de expressão com a sequência plasmídeo pBR322 edo cADN da ATIII caracterizado por se incorporar uma sequência de promotor SV40 e um sítio de poliadenilação SV40 e pela ausên cia de splice sites.-12ê -Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o sítio de poliadenilação ser essencialmente o fragmento BamHI-Hpal de 133 pb.-13ã -Processo de acordo com qualquer das reivindicações 11 ou 12 caracterizado por se incorporar adicionalmente a sequência de tradução do plasmídeo pUC12 STOP.-14ê -Processo para a preparação de um vector com o gene DHFR de rato, caracterizado por se intercalar o gene DHFR a jusante da região ori do plasmídeo pBR322.-15a -Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o vector conter adicionalmente um sítio de poliadenilação SV40.-16& _Processo de acordo com qualquer das reivindicações 14 ou 15, caracterizado por o vector não conter qualquer splice site.- 17a 14 Processo para a preparação de ATUI que apresenta actividade inibidora progressiva e que é estimulada por heparina, caracterizado por se provocar a expressão de cADN da ATUI em células de mamífero.- 18â _Processo para a preparação de uma composi ção farmacêutica caracterizado por se incorporar ATUI quando preparada de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10 ou 17.A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado na República Federal Alemã em 19 de Julho de 1986, sob o n° P 36 24 453.8.Lisboa, 16 de Julho de 1987PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE ANTITROMBINA III (ATUI) HUMANA E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE A CONTÊM BEM COMO DE VECTORES E DE CÉLULAS HOSPEDEIRAS APROPRIADAS PARA A OBTEN ÇÃO DE ATUI HUMANAA invenção refere-se a um processo para a preparação de antitrombina III (ATUI) humana em cultura de células de mamífero, por meio de um vector de expressão que contém o cADN da ATUI, que compreende utilizar-se como células de mamífero uma cultura de células dhfr que foram transfectadas com um outro vector que contém um gene DHFR.pUC 12 STOP- (HindllI/Pstl/Sall/Xbal/BamHI) — (TLstop)-(SacI/EcoRI) (1) “lAGCTl-(TLStop)EcoRI (HindDI)GCTTAA (EcoRI) (2)FIG.1 AGCTI-(SV40ori) (pBR322)-pTT*» (4) (HindDI) (EcoRI) (6)FIG.Ia AAn G C-[SV40poly(A)]-ffi (EcoRI) (Hpal) (8)BamHIEcoRI pBR322 (17)X/EcoRI <5 W
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