ES2203690T3 - Bioprocedimiento para la produccion de compuestos basados en dipeptidos. - Google Patents
Bioprocedimiento para la produccion de compuestos basados en dipeptidos.Info
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Abstract
SE DESCRIBEN PROCEDIMIENTOS BIOLOGICOS PARA LA PRODUCCION DE COMPUESTOS QUE SE PUEDEN PRODUCIR A PARTIR DE UN INTERMEDIO DIPEPTIDICO. EL PROCEDIMIENTO COMPRENDE LA PRODUCCION DE UN POLIPEPTIDO RECOMBINANTE QUE CONTIENE EL INTERMEDIO DIPEPTIDICO. EL INTERMEDIO DIPEPTIDICO SE PROCESA ADICIONALMENTE PARA PROPORCIONAR EN ULTIMO TERMINO EL PRODUCTO ACABADO.
Description
Bioprocedimiento para la producción de compuestos
basados en dipéptidos.
La producción a gran escala de compuestos que
están basados, al menos en parte, en un intermedio dipéptido
requiere la fácil disponibilidad de grandes cantidades del
intermedio dipéptido a bajo coste. Los dipéptidos de virtualmente
cualesquier aminoácidos se pueden preparar sintéticamente para este
uso; pero la síntesis del dipéptido puede requerir mucho tiempo y
ser costosa, lo que reduce la eficiencia de la producción del
producto y aumenta los costes de producción. Estos inconvenientes
son particularmente importantes para una producción a escala muy
grande de los compuestos basados en dipéptidos.
El documento
GB-A-2068971 (G.D. Searle & Co.)
describe el uso de procedimientos de DNA recombinante para generar
el polipéptido de Asp-Phe repetido
(Asp-Phe)_{n}.
El documento
EP-A-0036258 (Cetus Corporation)
describe la expresión, en una célula huésped recombinante, de un DNA
recombinante que codifica múltiples repeticiones de
Asp-Phe, que fragmenta el polipéptido en el
intermedio dipéptido Bencil-Asp-Phe,
y que modifica el intermedio dipéptido para producir dipéptido de
aspartamo.
El documento
EP-A-0591524 (M & D Research
Co., Ltd.) da cuenta de un procedimiento para producir grandes
cantidades de proteína recuperable, que implica una proteína de
fusión que comprende una proteína vehículo, un sitio de escisión de
la proteína y el marco de lectura abierta de la proteína recuperable
de interés. Así, se describe una proteína de fusión que tiene una
secuencia de la proteína vehículo flanqueada en cualquier lado con
repeticiones múltiples del sitio de escisión de dipéptido y la
proteína recuperable de interes. La proteína de interés se libera
por hidrólisis enzimática de cualquiera de las uniones
dipeptídicas.
Se describe un procedimiento para la producción
de compuestos intermedios dipéptidos. Estos compuestos intermedios
dipéptidos se producen por técnicas de DNA recombinante y se
producen a partir de una secuencia de DNA sintético o de una
secuencia de DNA natural, codificando ambas proteína o un péptido
que tiene una secuencia repetitiva específica de dipéptidos. Los
intermedios dipéptidos se liberan enzimáticamente de la proteína o
péptido mayor y se tratan ulteriormente para obtener el compuesto
acabado.
La presente invención concierne a un
procedimiento para la preparación de compuestos intermedios
dipéptidos. Estos compuestos intermedios se pueden tratar
ulteriormente para producir el compuesto acabado. Los intermedios
dipéptidos se producen en células huésped recombinantes mediante la
expresión de una molécula de DNA recombinante que codifica al menos
un intermedio dipéptido. La molécula de DNA recombinante puede ser
una molécula de DNA sintético o una secuencia natural de DNA. El DNA
que codifica el dipéptido se clona en un vector de expresión para
expresión en una célula huésped recombinante. Después de la
expresión en el huésped recombinante, el dipéptido se purifica para
ulterior tratamiento. Puede ser necesario separar el dipéptido de un
polipéptido mayor antes de purificarlo. Un polipéptido mayor que
contiene el intermedio dipéptido puede constar de múltiples
repeticiones de la secuencia del dipéptido, o el dipéptido puede
estar presente en una o más copias como parte de una proteína mayor
que contiene secuencias de aminoácidos que no son la secuencia del
dipéptido. Las repeticiones de la secuencia de dipéptido pueden
separarse en dipéptidos individuales por escisión enzimática o
química. Los dipéptidos individuales pueden purificarse luego para
ulterior procesamiento.
En particular, la presente invención proporciona
un procedimiento para producir un dipéptido seleccionado entre
Ala-Pro y Lys-Pro, que
comprende:
(a) transfectar un vector de expresión de DNA en
células huésped adecuadas, vector de expresión de DNA que comprende
una molécula de DNA que codifica un oligopéptido o polipéptido que
contiene múltiples repeticiones directas del mencionado
dipéptido;
(b) cultivar las mencionadas células huésped en
condiciones adecuadas para la expresión del mencionado oligopéptido
o polipéptido del mencionado vector de expresión de DNA;
(c) escindir el mencionado oligopéptido o
polipéptido apropiado con una enzima de manera que se libere el
mencionado dipéptido, y
(d) aislar y purificar el dipéptido.
Las células huésped recombinantes usadas para
producir el dipéptido pueden ser cualesquier células huésped capaces
de expresar moléculas de DNA recombinante. Los expertos en la
técnica apreciarán fácilmente que virtualmenete cualquier huésped
recombinante es adecuado para uso en el procedimiento de la presente
invención. Entre las células huésped adecuadas están incluidas,
aunque no únicamente, células de bacterias y hongos, incluidas
levaduras. Entre las células huésped de bacterias y hongos que son
adecuadas para uso en la presente invención y que son asequibles
comercialmente, están incluidos, aunque no únicamente,
Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris,
Escherichia coli, Aspergillus niger, Streptomyces
lividans, y Bacillus subtilis.
Los expertos en la técnica también apreciarán
fácilmente que el vector de expresión para expresar el DNA que
codifica el dipéptido puede ser virtualmente cualquier vector de
expresión adecuado para uso en la célula huésped escogida. El grupo
de vectores preferidos incluye, aunque no exclusivamente, los
adecuados para uso en células de bacterias y hongos, incluida
levadura. El grupo de vectores de expresión de bacterias y hongos
que son adecuados para uso en le presente invención y que son
asequibles comercialmente incluye, aunque no limitativamente, los
que se mencionan aquí.
La separación del dipéptido de las restantes
secuencias no dipeptíticas, o la separación de dipéptidos
individuales de repeticiones de dipéptidos, se realiza
enzimáticamente usando una enzima que escinde el polipéptido en la
posición apropiada sin destruir el intermedio de dipéptido. Las
enzimas adecuadas para uso en el procedimiento de la presente
invención pueden ser las disponibles comercialmente o las producidas
por un organismo que posee la actividad enzimática apropiada. La
selección de una enzima apropiada dependerá de la secuencia
particular de péptido que se está expresando.
El dipéptido se puede purificar antes o después
de su separación del resto del polipéptido o de repeticiones del
dipéptido. Para purificar los dipéptidos individuales o el
polipéptido que contiene el dipéptido, son adecuadas en el
procedimiento de la presente invención técnicas cromatográficas
estándar. Entre estas técnicas cromatográficas estándar están
incluidas, aunque no únicamente, fraccionamiento de sales,
cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión de
tamaños, cromatografía de adsorción con hidroxilapatito y
cromatografía de interacción hidrófoba.
El DNA clonado obtenido por los procedimientos
descritos aquí puede expresarse recombinantemente por clonación
molecular en un vector de expresión que contiene un promotor
adecuado y otros elementos reguladores de transcripción adecuados, y
transferirse a células huésped procarióticas o eucarióticas para
producir péptido recombinante. Los procedimientos para tales
manipulaciones son bien conocidas en la técnica.
Los vectores de expresión se definen aquí como
secuencias de DNA que se requieren para la transcripción de copias
clonadas de genes y la traslación de sus mRNAs a un huésped
apropiado. Tales vectores se pueden usar para expresar genes
eucarióticos en una variedad de huéspedes tales como bacterias,
algas azul-verdosas, células de plantas, células de
insectos, células de hongos y células de animales.
Los vectores diseñados específicamente permiten
el transporte de DNA entre huéspedes tales como
bacterias-levadura, o
bacterias-células de animales, o
bacterias-células de hongos o
bacterias-células de invertebrados. Un vector de
expresión construido apropiadamente debe contener un origen de
replicación para replicación autónoma en células huésped, marcadores
seleccionables, un número limitado de sitios útiles de restricción
de enzimas, un potencial para un número alto de copias y promotores
activos. Un promotor se define como una secuencia de DNA que dirige
la DNA polimerasa para unirse a DNA e iniciar la síntesis de RNA. Un
promotor fuerte es el que causa que los mRNAs se inicien con alta
frecuencia. El grupo de vectores de expresión puede incluir, aunque
no exclusivamente, vectores de clonación, vectores de clonación
modificada, plásmidos o virus diseñados específicamente.
Para expresar péptidos recombinantes en células
de mamíferos se pueden usar varios vectores de expresión de
mamíferos. Son, entre otros, vectores de expresión de mamíferos
disponibles comercialmente, que pueden ser adecuados para expresión
recombinante de péptidos, pcDNA3 (Invitrogen), pMClneo (Stratagene),
pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene),
EBO-pSV2-neo (ATCC 37593),
pBPV-1(8-2) (ATCC 37110),
pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC
37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198),
pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) y
\lambdaZD35 (ATCC 37565).
Para expresar péptidos recombinantes en células
bacterianas se pueden usar varios vectores de expresión bacteriana.
Entre los vectores de expresión bacteriana disponibles
comercialmente, que pueden ser adecuados para expresión recombinante
de péptidos están incluidos, aunque no exclusivamente, pET11a
(Novagen), \lambda-gt11 (Invitrogen), pcDNAII
(Invitrogen), pKK223-3 (Pharmacia).
Para expresar péptidos recombinantes en células
de hongos se pueden usar varios vectores de expresión de células de
hongos. Entre los vectores de expresión de células de hongos
disponibles comercialmente, que pueden ser adecuados para expresión
recombinante de péptidos, están incluidos, aunque no exclusivamente,
pYES2 (Invitrogen), vector de expresión de Pichia
(Invitrogen).
Para expresar péptidos recombinantes en células
de insectos se pueden usar varios vectores de expresión de células
de insectos. Entre los vectores de expresión recombinante de
péptidos, que pueden ser adecuados para expresión recombinante de
péptidos están incluidos, aunque no exclusivamente, pBlue Bac III
(Invitrogen).
Se puede usar un vector de expresión que contiene
DNA que codifica el intermedio dipéptido para expresión de péptido
en una célula huésped recombinante. Las células huésped
recombinantes pueden ser procarióticas o eucarióticas, entre las que
están incluidas, no exclusivamente, bacterias tales como E.
coli, células de hongos tales como levadura, células de
mamíferos, incluidas, aunque no exclusivamente, lineas de células
humanas, de origen de bovinos, porcinos, de monos y de roedores, y
de células de insectos incluidas, aunque no únicamente, lineas de
células derivadas de Drosophila y de gusano de seda. Las
lineas de células derivadas de especies de mamíferos que pueden ser
adecuadas y que están disponibles comercialmente incluyen, entre
otras, células L L-M(TK-) (ATCC CCL 1,3),
células L L-M (ATCC CCL 1,2), 293 (ATCC CRL 1573),
Raji (ATCC CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70),
COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC
CRL 1651), CHO-KI (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92),
NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C1271 (ATCC CRL 1616),
BS-C-1 (ATCC CCL 26) y
MRC-5 (ATCC CCL 171).
El vector de expresión se puede introducir en
células huésped mediante una de varias técnicas, entre las que están
incluidas, aunque no únicamente, transformación, transfección,
lipofección, fusión de protoplasto y electroporación. Las células
que contienen el vector de expresión se propagan clonalmente y se
analizan individualmente para determinar si producen proteína. La
identificación de los clones de células huésped que expresan
péptidos se puede hacer por varios medios, entre los que están
incluidos, entre otros, reactividad inmunológica con anticuerpos
antipeptídicos, y la presencia de actividad B1 asociada a la célula
huésped, tal como unión con ligando específico al péptido o
transducción de señal definida como respuesta mediada por la
interacción de ligandos específicos para B1 en el receptor.
La expresión de DNA se puede realizar también
usando mRNA sintético producido in vitro o mRNA nativo. El
mRNA sintético o el mRNA aislado de células que producen péptido se
puede traducir eficientemente en varios sistemas exentos de células
entre las que están incluidos, entre otros, extractos de germen de
trigo y extractos de reticulocitos, así como traducirse
eficientemente en sistemas basados en células, entre las que entre
otros está incluida la microinyección en oocitos de rana, que es la
preferida.
Para determinar la(s) secuencia(s)
de DNA que da(n) niveles óptimos de proteína, se pueden
construir moléculas de DNA, por ejemplo, que incluyen: el marco de
lectura abierta de longitud total del DNA y varias construcciones
que contienen porciones de DNA que codifican la proteína.
Los niveles de expresión de proteína se pueden
determinar siguiendo la introducción, tanto individualmente como en
combinación, de estas construcciones en células huésped apropiadas.
Después de la determinación de la casete de DNA que da la expresión
óptima, por ejemplo en ensayos transitorios, esta construcción de
DNA se transfiere a una variedad de vectores de expresión, para
expresión de células huésped, entre las que, entre otras, están
incluidas células de mamíferos, células de insectos, E. coli
y células de levadura tales como S. cerevisiae.
Los transfectantes de células huésped y oocitos
microinyectados se pueden ensayar en cuanto al nivel de proteína por
los procedimientos siguientes. Después de transcurrido un período de
tiempo apropiado para la expresión, se mide el nivel de péptido. Un
procedimiento para detectar el péptido implica la medida directa del
nivel de péptido en células enteras o lisados de células preparados
a partir de células huésped transfectadas con DNA.
El dipéptido alanil-prolina,
Ala-Pro es un material de partida para la síntesis
del inhibidor de ACE, enalapril. El dipéptido
Lys-Pro es un material de partida para la síntesis
del inhibidor de ACE lisinopril. El dipéptido disponible
comercialmente usualmente se sintetiza químicamente. Se ha
desarrollado un nuevo bioprocedimiento que elimina con éxito la
necesidad de etapas químicas para producir Ala-Pro o
Lys-Pro. El procedimiento utiliza un huésped
recombinante para superexpresar un péptido que contiene repeticiones
del dipéptido Ala-Pro o Lys-Pro que
luego se hidroliza en sus unidades constitutivas
Ala-Pro o Lys-Pro usando
prolilpeptidasas bacterianas. Se escogió Escherichia coli
como huésped debido a la disponibilidad de vectores de expresión. Se
clonó en el vector de expresión disponible comercialmente, pMAL, un
oligonucleótido sintetizado químicamente que codifica repeticiones
de Ala-Pro y sitios apropiados para ligación. La
fermentación del E. coli recombinante que contiene la
construcción dió el producto de fusión deseado según se determinó
por geles de proteína. Se empleó el procesamiento enzimático para
liberar las unidades de Ala-Pro. Se usó el factor X
disponible comercialmente para liberer el péptido
(Ala-Pro)_{n-20}, aunque
también podían usarse las prolilpeptidasas. La exploración previa de
prolilpeptidasas condujo a la identificación de las cepas
Lactobacillus helveticus y Xanthomonas maltophilia con
actividad frente a Ala-Pro-pNA y
sustratos sintéticos de (Ala-Pro)_{n}. Se
presentaron extractos en bruto de cada cultivo para procesar con
éxito (Ala-Pro)_{n-20} a
Ala-Pro según determinaciones por análisis de HPLC.
Se observó un efecto sinérgico cuando se combinaron extractos de
ambos cultivos. Se creyó que la actividad de la prolilpeptidasa de
L. helveticus era debida a la actividad de la exopeptidasa en
oposición a la actividad de la endopeptidasa presentada por X.
maltophilia. El bioprocedimiento descrito tiene la ventaja de evitar
material tóxico usado en la síntesis química, y es adaptable a otros
péptidos.
Seguidamente a la expresión del intermedio
dipéptido en una célula huésped recombinante, se puede recuperar la
proteína recombinante para obtener el intermedio dipéptido en forma
purificada. Hay disponibles varios procedimientos de purificación,
adecuados para uso. Como se describe aquí, los intermedios
dipéptidos recombinantes pueden purificarse de lisados y extractos
de células por aplicación de varios procedimientos individuales, o
combinaciones de ellos, tales como fraccionamiento de sales,
cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión de
tamaños, cromatografía de adsorción en hidroxilapatito y
cromatografía de interacción hidrófoba.
Después de la purificación del intermedio
dipéptido por uno o más procedimientos descritos aquí y por los
conocidos por los expertos en la técnica de la purificación de
péptidos, los intermedios dipéptidos se tratan para llegar al
producto final. En el caso del intermedio dipéptido
Ala-Pro, el procesamiento para llegar al producto
final, conocido como enalapril y compuestos afines, se realiza como
se describe en la patente U.S. nº. 4.374.829 y en la patente U.S.
nº. 4.555.502. En el caso del intermedio dipéptido
Lys-Pro, el procesamiento para llegar al producto
final, conocido como lisinopril y compuestos afines, se realiza como
se describe en la patente U.S. nº. 4.374.829 y la patente U.S. nº.
4.555.502.
Los ejemplos siguientes se presentan para
ilustrar la presente invención, sin que la invención quede limitada
a los mismos.
Para la construcción de un vector que expresa una
secuencia de DNA de repeticiones de dipéptidos se puede escoger un
plásmido. El vector elegido tendrá un origen de replicación para el
huésped en cuestión; alternativamente, el vector puede contener
orígenes para expresión en más de un gen para que pueda actuar con
un vector de transporte. Son necesarios sobre el plásmido genes
resistentes a los antibióticos y/o marcadores auxotrópicos para
verificar que se ha realizado la transformación o entrada del vector
en la célula y mantener la estabilidad del vector por presiones
selectivas. Un promotor fuerte, tal como el promotor tac, que es
inducible, permitirá la expresión máxima del (los) gen(es)
corriente abajo. Se incluirá un sitio de consenso de unión de
ribosoma y que sea reconocido específicamente por el huésped
preferido. Se pueden incluir secuencias de terminación de
transcripción corriente abajo y codones de parada para asegurar la
longitud apropiada del péptido recombinante.
Alternativamente, en el vector de expresión se
puede codificar una proteína de fusión. El vector de interés
codificará un péptido truncado que por lo general se expresa mucho
en el huésped preferido de su promotor nativo u otro promotor
fuerte. Por técnicas de síntesis se pueden diseñar sitios de
clonación para el gen o nucleótido que codifica un intermedio
dipéptido tal como una repetición Ala-Pro o
Lys-Pro, o se pueden colocar basándose en las
secuencias de DNA 5' o 3' de las repeticiones. La construcción de
DNA resultante, cuando se expresa, da una proteína que contiene la
enzima truncada o proteína de unión tal como una proteína de unión
de maltosa de E. coli fusionada a la secuencia del intermedio
dipéptido. La separación se puede realizar fácilmente usando el
partícipe de fusión y el procesamiento posterior eliminará el
péptido 5'. En algunos huéspedes, para secretar el producto deseado
pueden usarse péptidos de señal o guía para que haya un transporte
extracelular apropiado.
Para intensificar la expresión se pueden
manipular preferencias de codón en el organismo huésped. Por lo
general, el uso del codón será favorecido en la célula huésped de
manera que durante la expresión de genes específicos
predominantemente se usan uno o más codones. Típicamente, genes
altamente expresados que dan niveles altos de proteínas o péptidos
se codifican por codones favorecidos, o usados más frecuentemente
que otros. En E. coli, hay disponibles dos codones para
lisina, AAA y AAG; son posibles cuatro codones para prolina, CCA,
CCC, CCG y CCU. La secuencia de codón CCG es un codón muy
frecuentemente usado y así, los restos de Pro en el oligonucleótido
sintético Lys-Pro serían designados CCG. Lys se
codifica por sólo dos codones sin una clara preferencia y, por
tanto, se escogerían AAA y AAG, ambos, al designar el nucleótido que
se convierte en la repetición Lys-Pro expresada como
polipéptido Lys-Pro. Para un oligonucleótido
Ala-Pro, GCT y GCA son secuencias de codón
preferidas para restos Ala y serían así escogidos para máxima
expresión en E. coli.
Se produce péptido recombinante en E. coli
después de la transferencia de la casete de expresión del péptido en
vectores de expresión de E. coli, incluidas, aunque no
exclusivamente, las series pET (Novagen). Los vectores pET ponen la
expresión del péptido bajo control del promotor T7 bacteriófago
estrechamente regulado. Después de la transferencia de esta
construcción en un huésped E. coli que contiene una copia
cromosómica del gen de polimerasa T7 RNA guiado por el promotor
inducible lac, se induce la expresión del péptido cuando se añade al
cultivo un sustrato de lac (IPTG) apropiado. Los niveles de péptido
expresado se determinan por los ensayos aquí descritos.
El cDNA que codifica el marco entero de lectura
abierta del péptido se inserta en el sitio NdeI de pET 11a. Las
construcciones en la orientación positiva se identifican por
análisis de secuencias y se usan para transformar la cepa BL21 del
huésped de expresión. Se usan luego transformantes para inocular
cultivos para la producción de proteína. Los cultivos se pueden
crecer en medios M9 o ZB, cuya formulación es conocida por los
expertos en la técnica. Después de crecer a un OD_{600}= 1,5, se
induce la expresión del péptido con IPTG 1 mM durante 3 horas a
37ºC.
Se diseñan vectores de baculovirus, que derivan
de genoma del AcNPV virus, para proporcionar un alto nivel de
expresión de cDNA en la línea Sf9 de células de insectos (ATCC CRL
#1711). Se producen baculovirus de recombinación que expresan DNA
que codifica intermedio dipéptido por los siguientes procedimientos
estándar (InVitrogen Maxbac Manual): Las construcciones de DNA se
ligan al gen de polihedrina en una variedad de vectores de
transferencia de baculovirus, incluido el vector pAC360 y el Blue
Bac (InVitrogen). Se generan baculovirus recombinantes por
recombinación homóloga seguida de cotransfección del vector de
transferencia de baculovirus y DNA genómica de AcNPV linearizada
[Kitts, P.A., Nuc. Acid. Res., 18, 5667 (1990)] en células
Sf. Los virus recombinantes de pAC360 se identifican por la ausencia
de cuerpos de inclusión en células infectadas y los virus
recombinantes de pBlueBac se identifican sobre la base de la
expresión de \beta-galactosidasa (Summers, M.D. y
Smith, G.E., Texas Agricluture Exp. Station Bull. nº.1555). Después
de la purificación en la placa, se mide la expresión del péptido por
los ensayos descritos en las referencias.
El cDNA que codifica el marco total de lectura
abierta del péptido se inserta en el sitio BamHI del pBlueBacII. Las
construcciones en la orientación positiva se identifican por
análisis de secuencia y se usan para transfectar células Sf9 en
presencia de DNA de tipo salvaje de AcNPV lineal.
El péptido auténtico se encuentra en asociación
con las células infectadas. El péptido se extrae de las células
infectadas por lisis hipotónica o detergente.
Alternativamente, el péptido se expresa en la
línea de células Schneider 2 de Drosophila por cotransfección de las
células Schneider 2 con un vector que contiene el DNA del péptido
corriente abajo y bajo control de un promotor inducible de
metionina, y un vector que codifica el gen resistente de neomicina
G418. Después de crecer en presencia de G418, se obtienen se
obtienen células resistentes y se inducen para expresar el péptido
añadiendo CuSO_{4}.
Se produce péptido recombinante en levadura S.
cerevisiae después de la inserción de cistrón óptimo de DNA en
vectores de expresión diseñados para dirigir la expresión
intracelular o extracelular de proteínas heterólogas. En el caso de
expresión intracelular, se ligan vectores tales como EmBLyex4 o
similares al cistrón [Rinas, U. y otros, Biotechnology 8,
543-545 (1900); Horowitz y otros, J. Biol. Chem.,
265, 4189-4192 (1989)]. Para expresión
extracelular, el cistrón se liga a vectores de expresión de levadura
que fusionan una señal de secreción. Los niveles de péptido
expresado se determinan por los ensayos descritos en las
referencias.
El péptido producido recombinantemente puede ser
purificado por cromatografía de afinidad de anticuerpos.
Se hacen columnas de afinidad de anticuerpos de
péptidos añadiendo los anticuerpos antipéptidos a
Affigel-10 (Biorad), un soporte de gel que se
preactiva con ésteres de N-hidroxisuccinimida de
manera que los anticuerpos formen enlaces covalentes con el soporte
de lecho de gel de agarosa. Los anticuerpos se acoplan luego al gel
mediante uniones amida con el brazo del espaciador. Los ésteres
activados restantes se extinguen con HCl 1 M en etanolamina (pH 8).
La columna se lava con agua y seguidamente HCl 0,23 M en glicina (pH
2,6) para eliminar cualquier anticuerpo no conjugado o proteína
extraña. La columna se equilibra luego en solución salina tamponada
con fosfato (pH 7,3) junto con agentes apropiados solubilizantes de
membranas, tales como detergentes, y las sustancias sobrenadantes
del cultivo de células o los extractos de células que contienen
péptido solubilizado se hacen pasar lentamente por la columna. La
columna se lava luego con solución salina tamponada con fosfato
junto con detergentes hasta que la densidad óptica (A280) cae al
nivel de fondo, luego se eluye la proteína con
glicina-HCl 0,23 M (pH 2,6) junto con detergentes.
La proteína purificada se dializa luego frente a solución salina
tamponada con fosfato.
La estrategia para la producción de un
polipéptido Ala-Pro en E. coli implicó la
clonación de una secuencia que codifica repeticiones de
Ala-Pro. Hay varios sistemas comercialmente
disponibles. Para minimizar el tiempo de desarrollo, se compró de
New England Biolabs un sistema de expresión disponible
comercialmente, p-MAL. El sistema utiliza un vector
que contiene un gen para la proteína de unión de maltosa adyacente a
un sitio policonector en el que se puede clonar una secuencia de DNA
de interés tal como un codón Ala-Pro repetido.
Después de la inducción de un clon que contiene el vector anterior,
se expresaría una proteína de fusión
maltosa-(Ala-Pro), el dominio de unión usado para
unir una columna de maltosa, y el dominio de la maltosa se
escindiría, después de aislamiento, por el factor X.
Hacia ese extremo, se diseñaron dos
oligonucleótidos complementarios (87 mer y 91 mer) para codificar 14
unidades Ala-Pro y un codón de parada. Los oligos se
sintetizaron por procedimientos estándar. Los oligos se purificaron
por SDS-PAGE y se extrajeron del gel. Se usó una
estrategia de clonación direccional, empleando un extremo embotado y
un extremo cohesivo, para asegurar un alineamiento y una ligación
apropiados del gen ala-pro en el plásmido. Los
clones se seleccionaron seguidamente a la transformación de E.
coli. El análisis de proteína y los experimentos de inducción en
un clon, AP/2, revelaron que las proteínas de fusión estaban
produciendo la inducción siguiente. La unión de bandas sobre geles
de SDS-PAGE sugiere más de un producto de fusión.
Sin embargo, son evidentes la inducción y producción de proteína de
fusión.
Las reservas en cuanto al reordenamiento de la
secuencia clonada y el reconocimiento apropiado del codón de parada
diseñado en el oligonucleótido condujo a la secuenciación del DNA
insertado. Se secuenció DNA del clon usando el cebador universal
M13. Es interesante que la secuencia del inserto codifica para 20
repeticiones de ALA-PRO en vez de 14 repeticiones de
Ala-Pro. El codón de parada TAG está presente al
final de las 20 repeticiones. Se cree que la presencia de
(ALA-PRO)_{20} es debida a los dos
oligonucleótidos que se han anillado en una configuración
escalonada, llenándose los huecos resultantes con la polimerasa
durante la recombinación. El anillamiento no es inusual debido a la
secuencia altamente repetida. En este caso puede ser beneficioso,
puesto que dió por resultado un gen más largo (y así, más
repeticiones de Ala-Pro).
Se obtuvieron de ATCC tres cultivos bacterianos,
Lactobacillus helveticus, L. sp. y Xanthomonas
maltophilia, de los que la bibliografía señala que producen
actividad de la prolildipepsidasa. Los cultivos se hicieron crecer
en matraces de 250 ml y se examinó su actividad hidrolítica frente a
un sustrato colorimétrico disponible comercialmente,
Ala-Pro-pNA (fuente). Los tres
cultivos dieron actividad, de la que la mayoría esta asociada a las
células (Tabla 1). Posteriormente se hicieron reservas de cultivo en
medio sólido en tubo inclinado y en FVMs congelados. Para un
crecimiento óptimo, los lactobacilos requerían una cámara
microaerófila para medio sólido en tubo inclinado y cultivo líquido
estacionario en matraces.
| Cultivo^{4} | Activ. específ. | U/L^{1} | pH Opt.^{2} | Temp. opt.^{3} |
| (U/mg)^{1} | ||||
| L. Helveticus | 0,156 | 8 | 5,6 | 50ºC |
| L. sp. desc. | 0,085 | 14,7 | 6,0 | 40ºC |
| X. maltophilia | 0,446 | 107 | 6,6 | 45ºC |
| 1. U-\mumol de ALA-PRO liberado/min a 37ºC y pH óptimo | ||||
| 2. Tampón de citrato fosfato a temperatura óptima | ||||
| 3. Realizado a pH 8,0 | ||||
| 4. Extractos de enzima de células virtis homogeneizadas |
Fue deseable obtener sustratos que pudieran
reflejar el sustrato oligómero real Ala-Pro que
estuviera disponible después del crecimiento de un E. coli
recombinante. A este respecto, se sintetizaron por Biosynthesis Inc.
oligómeros péptidos para uso como sustratos de prolilpeptidasa. Se
evaluó un procedimiento de HPLC para separar péptidos de bajo peso
molecular y aminoácidos libres con el fin de evaluar la actividad de
enzimas frente a sustratos Ala-Pro auténticos. Las
polimerasas de péptido de Biosynthesis se purificaron ulteriormente
usando el procedimiento de HPLC. Después de recoger las fracciones
de la HPLC, estaban disponibles los péptidos Ala-Pro
de 2, 4 y 6 repeticiones. Para cada uno de los extractos en bruto se
ha determinado la temperatura de los péptido y los pH óptimos (Tabla
2). El L. helveticus proporcionó el título más alto de enzima
y las más altas actividades específicas. Para todos los estudios se
usaron los medios complejos recomendados en la bibliografía; no se
optimizó ningún medio ni se hizo exploración alguna. Sobre la base
de diferencias en el aspecto de los productos hidrolíticos, parece
que los lactobacilos producen una
endo-prolilpeptidasa y que Xanthomonas
produce una exopeptidasa. Un beneficio de esta observación se revela
combinando enzimas para conseguir un efecto sinérgico en la
hidrólisis de (Ala-Pro)_{6}.
| Fuente de enzima | Proteína (mg/ml) | U/litro^{1} (A-P)_{2} | Actividad específica (U/mg)^{1} | ||
| (A-P)_{2} | (A-P)_{4} | (A-P)_{6} | |||
| Lactobacillus helveticus | 2,04 | 186 | 1,82 | 2,15 | 0,94 |
| Lactobacillus especie desc. | 3,02 | 156 | 1,53 | 1,53 | 0,87 |
| Xanthomonas | |||||
| maltophilia | 0,70 | 28 | 0,17 | 0,35 | 0,43 |
| 1. Unidades definidas como mmol de ALA-PRO liberadas por minuto a 35ºC y pH 7,0 | |||||
| 2. Extractos de enzimas de células homogeneizadas de "ojeador de cuentas". |
Se encontró que cuando se introdujo en
Ala-Pro un exceso de enzima (concentrado 600x en
comparación con condiciones normales de ensayo), el sustrato de
Ala-Pro se hidrolizó a alanina y prolina. Los
inhibidores de metaloproteasas y de cisteína fueron efectivos para
inhibir la hidrólisis de Ala-Pro, a la vez que
tenían un efecto pequeño sobre la hidrólisis de
(Ala-Pro)_{6} a Ala-Pro, lo
que sugiere que una enzima separada facilita la escisión de
Ala-Pro. La purificación parcial debería eliminar
también actividades indeseables de estos extractos en bruto.
En el caso del intermedio dipéptido
Ala-Pro, el procesamiento para obtener el producto
final conocido como enalapril y compuestos afines se realiza como se
describe en la patente U.S. nº. 4.374.829 y la patente U.S. nº.
4.555.502.
Se pueden encontrar secuencias naturales, ricas
en Lys-Pro, que codifican secuencias en genes de
proteínas de la pared celular de la familia de habas de soja
(Glycine max) [De: Hong y otros, J. Biol. Chem.,
1990]. Los tres genes de proteína rica en prolina del haba de soja
son SbPRP1, SbPRP2 y SbPRP3, que tienen una longitud de 256, 230 y
90 aminoácidos, respectivamente. Las composiciones de aminoácidos de
estas proteínas indican que de 34 a 40% de los restos son prolina y
de 18 a 25% son lisina. de particular interés, el SbPRP1 contiene 37
pares de aminoácidos Lys-Pro en la secuencia de
péptido y es así una fuente excelente del dipéptido
Lys-Pro. SbPRP3 codifica 12 secuencias de dipéptido
Lys-Pro, incluidas dos secuencias repetidas
Lys-Pro-Lys-Pro
codificadas a 183 y 195 bp en el gen.
La clonación del gen SbPRP1 rico en
Lys-Pro es realiza generando cebadores PCR basados
en las secuencias de DNA informadas. Se generan fragmentos de DNA
que contienen las secuencias de interés usando los cebadores y una
biblioteca que contiene el DNA de soja. El DNA resultante, rico en
codones de Lys-Pro, se liga a sitios de restricción
apropiados en un ventor de expresión. Usando un huésped E. coli, se
expresan los péptidos de haba de soja y se recuperan de células
lisadas. Usando Lactobacillus helveticus o la prolilpeptidasa
derivada de esta cepa, la proteína se hidroliza en aminoácidos
constituyentes y péptidos pequeños que incluyen los restos de
Lys-Pro. La cromatografía o extracción proporcionará
Lys-Pro relativamenet puro.
Un procedimiento alternativo es sintetizar
oligonucleótidos que corresponden a repeticiones de
Lys-Pro-Lys-Pro en
SbPRP3 [o usar dos series hacia atrás pero no contiguas en la
secuencia natural] diseñado con los sitios de restricción apropiados
para inserción en el vector de expresión de interés. La expresión en
el huésped apropiado da cantidades significativas de
Lys-Pro como oligopéptidos. Usando Lactobacillus
halveticus o la prolilpeptidasa derivada de esta cepa, el
péptido rico en lisina y prolina se hidroliza en restos de
Lys-Pro. Alternativamente, para hidrolizar el
péptido se usa una peptidasa específica para la prolina de
Flavobacterium menigosepticum [Yoshimoto, T. y otros,
Agric. Biol. Chem., 42:2417, 1978]. La cromatografía o la
extracción proporciona Lys-Pro relativamente
puro.
En el caso del intermedio dipéptido
Lys-Pro, el procesamiento ulterior al producto final
conocido como lisinopril y compuestos afines se realiza como se
describe en la patente U.S. nº. 4.374.829 y la patente U.S. nº.
4.555.502.
Un polipéptido ácido de aproximadamente 75 kDa,
encontrado en gránulos de almacenamiento en glándulas de la piel de
Xenopus laevis, conocida como proteína APEG, es rica en
dipéptidos Ala-Pro [Gmachl, M. y otros, FEBS
Letters, 260:145-148]. Como mínimo 80% de la masa es
alanina, prolina, ácido glutámico y glicina en una proporción de
2:2:1:1.
Se puede explorar una biblioteca de expresión de
cDNA en un vector derivado de lambda con sondas de oligonucleótidos
de la secuencia publicada para aislar el fragmento de interés.
Alternativamente, para explorar tal bibiloteca de expresión de cDNA
se pueden usar anticuerpos frente a APEG. El fragmento de interés se
puede aislar del clon de interés e insertar en un vector de
expresión. (Procesando el péptido resultante como en el Ejemplo 6 -
Hidrólisis de sustratos Ala-Pro).
Un procedimiento preferido es sintetizar un
oligonucleótido que corresponde a las secuencias naturales de APEG
DNA para
Ala-Pro-Ala-Pro-Ala-Pro
(CACCAGCTCCAGCACCAG). Con los sitios de restricción apropiados en el
nucleótido, el DNA se clona en un vector de expresión para expresión
en una célula huésped recombinante como se ha indicado antes. El
polipéptido que contiene las repeticiones del intermedio dipéptido
se hidroliza enzimáticamente como se ha descrito antes y el
intermedio dipéptido Ala-Pro se aisla para ulterior
procesamiento al producto.
En el caso del intermedio dipéptido
Ala-Pro, el procesamiento para obtener el producto
final conocido como enalapril y compuestos afines se realiza como se
describe en la patente U.S. nº. 4.374.829 y en la patente U.S. nº.
4.555.502.
Claims (9)
1. Un procedimiento para producir un dipéptodo
seleccionado entre Ala-Pro y
Lys-Pro, que comprende:
(a) transfectar un vector de expresión de DNA en
células huésped adecuadas, vector de expresión de DNA que comprende
una molécula de DNA que codifica un oligopéptido o polipéptido que
contiene múltiples repeticiones directas del mencionado
dipéptido;
(b) cultivar las mencionadas células huésped en
condiciones adecuadas para la expresión del mencionado oligopéptido
o polipéptido del mencionado vector de expresión de DNA;
(c) escindir el mencionado oligopéptido o
polipéptido apropiado con una enzima de manera que se libere el
mencionado dipéptido, y
(d) aislar y purificar el dipéptido.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el
que el mencionado vector de expresión de DNA codifica una proteína
de fusión que comprende un fragmento escindible unido al mencionado
oligopéptido o polipéptido que contiene múltiples repeticiones
directas del mencionado dipéptido.
3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el
que el mencionado fragmento escindible es la proteína que une la
maltosa de E. coli.
4. Un procedimiento de acuerdo con cualquier
reivindicación precedente, en el que el dipéptido es
Ala-Pro.
5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el
que la enzima se selecciona entre el grupo constituido por
prolilpeptidasa de Lactobacillus helveticus, prolilpeptidasa
de Xanthomonas maltophilia y mezclas de las mismas.
6. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 4 o la reivindicación 5, en el que el vector de
expresión de DNA expresa el oligopéptido
Ala-Pro-Ala-Pro-Ala-Pro.
7. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1-3, en el que el dipéptido es
Lys-Pro.
8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el
que la enzima se selecciona entre el grupo constituido por
prolilpeptidasa de Lactobacillus helveticus, prolilpeptidasa
de Flavobacterium meningosepticum y mezclas de las
mismas.
9. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 7 o la reivindicación 8, en el que el vector de
expresión de DNA expresa el oligopéptido
Lys-Pro-Lys-Pro.
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