ES2203823T3

ES2203823T3 - Analogos heptapeptidicos de oxitocina.

Info

Publication number: ES2203823T3
Application number: ES97946210T
Authority: ES
Inventors: Per Melin; Anders Nilsson; Jerzy Trojnar; Carl-Johan Aurell; Pierre Riviere; Robert Haigh
Original assignee: Ferring BV
Current assignee: Ferring BV
Priority date: 1996-11-26
Filing date: 1997-11-21
Publication date: 2004-04-16
Anticipated expiration: 2017-11-21
Also published as: KR20000069045A; HRP970630A2; AR008531A1; PL189292B1; NZ336445A; CA2272990C; LV12350B; PT938496E; JP3405460B2; MY125555A; HUP0000577A3; BR9713366B1; WO1998023636A1; HUP0000577A2; CA2272990A1; CN1238781A; US6143722A; SE9604341D0; HRP970630B1; CN1129606C

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNOS ANALOGOS DE HEPTAPEPTIDOS O ALGUNAS DE SUS SALES FARMACEUTICAMENTE ACEPTABLES Y QUE ESTAN CONSTITUIDAS POR UN GRUPO FUNCIONAL HEXAPEPTIDO (S) Y DE UN RADICAL (Z) BE - AMINOALCOHOL CON TERMINACION C UNIDA AL GRUPO FUNCIONAL HEXAPEPTIDO (S) POR UN ENLACE DE AMIDA. EL BE -AMINOALCOHOL (Z) ES - NR - CH (Q) - CH 2 OH. "Q" ES (CH 2 ) N - NH - A. "N" VALE DE 1 A 6. "A" ES H O - C (=NH) NH 2 . "R" ES CH 3 O C 2 H SUB, 5 . EN ESTA FORMULA (S), X ES UN ACIDO AL AMINADO AROMA TICO EN D, E Y ES UN ACIDO AL - AMINADO ALIFATICO, X E Y PRESENTAN UNA ACTIVIDAD ANTAGONISTA DEL OXITOCINA. ESTA INVENCION, QUE SE REFIERE TAMBIEN A UN PROCEDIMIENTO DE SINTESIS DE ESTOS ANALOGOS, SE REFIERE ADEMAS A UNAS COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE CONTIENEN ESTOS ANALOGOS, LA SINTESIS DE DICHAS COMPOSICIONES Y UN PROCEDIMIENTO DE REGULACION DE LAS CONTRACCIONES UTERINAS.

Description

Análogos heptapeptídicos de oxitocina.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevos análogos heptapeptídicos (es decir, heptapéptidos en los que el resto N-terminal está desaminado y el extremo C está reducido a un alcohol) que presentan actividad antagonista de oxitocina, útiles, entre otras cosas, para reducir o bloquear la contracción del músculo uterino asociada con el parto prematuro y con el dolor menstrual. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen estos análogos peptídicos y a su uso.

Antecedentes de la invención

La oxitocina es una hormona peptídica. Estimula la contracción del músculo uterino. Por esta razón, se cree que está implicada en la etiología del parto prematuro y del dolor menstrual. Además se cree que los antagonistas de oxitocina serían útiles en el control de estas situaciones. Se conocen péptidos antagonistas de oxitocina de potencia y selectividad adecuadas para uso terapéutico. A menudo están destinados a la administración en solución acuosa. La fabricación de dosis listas para el uso de tales antagonistas requiere que las soluciones sean estables durante períodos prolongados, lo que no es siempre cierto. En tales casos, el medicamento debe prepararse inmediatamente antes del uso, por ejemplo, a partir del péptido liofilizado o de su sal farmacéuticamente aceptable. Este tipo de manipulación no es conveniente e implica el riesgo de contaminación.

Objetos de la invención

Es un objeto de la invención proporcionar nuevos antagonistas de oxitocina que sean análogos heptapeptídicos con una estabilidad mejorada en un medio acuoso y que conserven al mismo tiempo la potencia y selectividad adecuadas para tener eficacia terapéutica.

Es un segundo objeto de la invención proporcionar composiciones farmacéuticas que contengan dichos nuevos análogos heptapeptídicos antagonistas de oxitocina y que tengan una estabilidad y, por lo tanto, una vida media, mejoradas.

Es un objeto adicional de la invención proporcionar un método para el tratamiento de un estado médico asociado con una contracción uterina inapropiada o excesiva, siendo dicho método la administración de una composición farmacéutica que contiene dicho análogo heptapeptídico.

Sumario de la invención

La invención comprende una clase de compuestos que son análogos heptapeptídicos, composiciones farmacéuticas que contienen dichos análogos, y el uso de estas composiciones que es el tratamiento de contracciones uterinas, particularmente en el contexto del parto prematuro y del dolor menstrual.

Los análogos heptapeptídicos de la invención tienen un resto S hexapeptídico N-terminal y un \beta-aminoalcohol Z C-terminal, que se considera en lo sucesivo el equivalente formal del séptimo aminoácido del heptapéptido. El resto S tiene la estructura:

1

donde Mpa, Ile, Asn, y Abu tienen los significados que se indican a continuación:

Mpa	resto de ácido 3-mercaptopropiónico (denominado de otra manera desaminocisteína)
Ile	resto de isoleucina
Asn	resto de asparagina
Abu	resto de ácido \alpha-aminobutírico;
	y donde
X es un D-\alpha-aminoácido aromático e
Y es un \alpha-aminoácido alifático.

El aminoalcohol Z tiene la estructura:

\newpage

Z---

\delm{N}{\delm{\para}{R}}

---

\uelm{C}{\uelm{\para}{Q}}

H---CH_{2}---OH

donde

R es metilo o etilo, y

Q es -(CH_{2})_{n}-NH-A, donde n es 1-6 y A es H o -C(=NH)NH_{2}.

Los compuestos de la invención pueden formar sales de adición de ácidos, y siempre que estas sales sean farmacéuticamente aceptables, se incluyen dentro del alcance de la invención.

Los compuestos pueden incorporarse en formulaciones sólidas o líquidas. Los ejemplos de tales formulaciones incluyen comprimidos, cápsulas, soluciones y suspensiones. Otros componentes de tales formulaciones pueden incluir, por ejemplo, diluyentes, dispersantes, conservantes, agentes tamponantes, agentes aromatizantes y agentes reguladores de la presión osmótica. Las formulaciones sólidas son particularmente adecuadas para la administración oral, mientras que las soluciones son más útiles para inyección (i.v., i.m. o s.c.) o administración intranasal. Una ventaja particular de los compuestos de la invención es que sus soluciones son más estables durante un almacenamiento prolongado que las de los compuestos conocidos previamente de potencia comparable.

El producto farmacéutico formulado es útil en el control de las contracciones uterinas. Dos indicaciones en las que es probable que se necesite tal control son el parto prematuro y el dolor menstrual. Cuando se usan en el tratamiento del parto prematuro, los productos farmacéuticos pueden usarse como agentes tocolíticos agudos después del inicio del parto y como terapia de mantenimiento para prevenir la recurrencia de tales episodios.

Descripción detallada de la invención

De acuerdo con la presente invención, se describen análogos heptapeptídicos que presentan una actividad antagonista de la oxitocina terapéuticamente útil y que tienen una estabilidad mejorada en un medio acuoso.

Los análogos heptapeptídicos de la invención se caracterizan por una estructura que comprende un resto S N-terminal que es un análogo hexapeptídico y un resto Z C-terminal que es un \beta-aminoalcohol. La estructura del \beta-aminoalcohol Z es:

(Z)---NR---

\delm{C}{\delm{\para}{Q}}

H---CH_{2}OH

donde Q es -(CH_{2})_{n}-NH-A-, n es 1-6, y A es H o -C(=NH)NH_{2},

y donde R es CH_{3} o C_{2}H_{5};

y el resto S es:

2

Mpa	resto de ácido 3-mercaptopropiónico (denominado de otra manera desaminocisteína)
Ile	resto de isoleucina
Asn	resto de asparagina
Abu	resto de ácido \alpha-aminobutírico;
	y donde
X es un D-\alpha-aminoácido aromático; e
Y es un \alpha-aminoácido alifático.

Por un \alpha-aminoácido aromático se entiende un \alpha-aminoácido en el que la cadena lateral incluye un sistema de anillo aromático. Tal sistema puede ser carbocíclico o heterocíclico, monocíclico o condensado. Los ejemplos de \alpha-aminoácidos aromáticos incluyen (pero sin limitación) fenilalanina, tirosina, (O-etil)tirosina, triptófano, \beta-(2-naftil)alanina y fenilglicina. Debe tenerse en cuenta que el resto X tiene la configuración D no natural en los compuestos de la invención.

Por \alpha-aminoácido alifático se entiende un \alpha-aminoácido en el que la cadena lateral sólo tiene átomos de carbono e hidrógeno. Tales cadenas laterales incluirán grupos alquilo y cicloalquilo. Pueden estar insaturados, pero no pueden incluir restos aromáticos. Se incluyen cadenas laterales de 1 a 12 átomos de carbono, aunque el intervalo preferido es de 3-7 átomos de carbono. Los ejemplos de \alpha-aminoácidos alifáticos incluyen (pero sin limitación) alanina, valina, leucina, ciclohexilglicina y adamantilalanina. El resto Y tiene la configuración L natural.

En la estructura del resto S análogo hexapeptídico, la línea que une los restos Mpa y Abu tiene su significado convencional. Significa que existe un enlace covalente que une los extremos de las cadenas laterales de estos dos restos. En este caso, el átomo de azufre del resto Mpa está unido a través de un enlace covalente al átomo de carbono \gamma con respecto a la posición 4-) del resto Abu.

El resto aminoalcohol Z incluye un centro estereogénico y, por lo tanto, puede existir en dos formas epiméricas, R y S, correspondientes a los isómeros D y L de los aminoácidos relacionados. Dentro del alcance de esta invención se incluyen análogos heptapeptídicos con cualquiera de estos isómeros, así como también mezclas de epímeros. Preferiblemente, el resto aminoalcohol está presente como un solo epímero, y preferiblemente tiene la configuración S.

En el contexto de la presente invención, el resto Mpa y el aminoalcohol Z se consideran equivalentes formales de \alpha-aminoácidos y, por consiguiente, los compuestos de la invención se denominan análogos heptapeptídicos.

En una realización preferida de la invención, X es un resto de D-triptófano o un resto de \beta-(2-naftil)-D-alanina.

En otra realización preferida de la invención, Y es un resto de uno de los siguientes: valina, leucina, isoleucina, aloisoleucina, ciclohexilalanina, ciclohexilglicina, y (\beta,\beta-dietil)alanina.

En otra realización preferida de la invención, n está en el intervalo 2-4.

En una realización más preferida de la invención, X es un resto de D-triptófano o un resto de \beta-(2-naftil)-D-alanina e Y es un resto de uno de los siguientes: valina, leucina, isoleucina, aloisoleucina, ciclohexilalanina, ciclohexilglicina y (\beta,\beta-dietil)alanina.

En otra realización preferida de la invención, X es un resto de D-\alpha-aminoácido aromático e Y es un resto de uno de los siguientes: leucina, valina, isoleucina, aloisoleucina, \beta,\beta-dietilalanina, ciclohexilalanina y ciclohexilglicina.

Una realización particularmente preferida de la invención es un análogo peptídico seleccionado entre:

3

7

11

donde se han usado las siguientes abreviaturas:

D-Trp	resto de D-triptófano
alloIle	resto de aloisoleucina
Ala(3,3-diethyl)	resto de (\beta,\beta-dietil)alanina
D-Nal	resto de \beta-(2-naftil)-D-alanina
Leu	resto de leucina
Val	resto de valina
Cha	resto de \beta-ciclohexilalanina

Una realización más preferida de la invención es el análogo peptídico:

14

Los compuestos de la invención contienen un sitio básico (amina o guanidina) y de esta manera pueden formar sales con ácidos, conservando estas sales las propiedades farmacológicas de las bases libres. Por consiguiente, tales sales están incluidas dentro del alcance de la invención. Los ejemplos de tales sales incluyen (pero sin limitación) clorhidrato, bromhidrato, sulfato, acetato, citrato, benzoato, trifluoroacetato y metanosulfonato.

De acuerdo con la invención también se describen composiciones farmacéuticas que incluyen una cantidad farmacológicamente eficaz de al menos uno de los análogos heptapeptídicos antagonistas de oxitocina descritos anteriormente. La composición también puede incluir aditivos farmacéuticamente aceptables tales como conservantes, diluyentes, agentes de dispersión, agentes para promover la absorción en la mucosa (de los que se describen ejemplos en Merkus, F.W.H.M. et al., J. Controlled Release 24, 201-208, 1993, y que incluyen tensioactivos, ácidos biliares, fusidatos, fosfolípidos y ciclodextrinas), agentes tamponantes y aromatizantes. Tales composiciones pueden formularse como sólidos (por ejemplo, como comprimidos, cápsulas o polvos) o como líquidos (por ejemplo, como soluciones o suspensiones) que, como se considera en este documento, incluyen cremas y pomadas, para administración oral o parenteral. Pueden ser vías adecuadas para la dosificación la administración oral (incluyendo sublingual y bucal), intranasal, pulmonar, transdérmica, rectal, vaginal, subcutánea, intramuscular e intravenosa.

Una composición preferida de acuerdo con la invención es una solución acuosa estéril de un análogo heptapeptídico como se ha descrito anteriormente, y particularmente una solución isotónica salina adecuada para la administración intranasal o por inyección intravenosa. La solución puede contener un agente tamponante para mantener el pH de la solución en el intervalo de 3,0 a 7,0, y preferiblemente en el intervalo de 3,5 a 5,5. El tampón es, por ejemplo, un tampón fosfato/citrato.

Otra composición preferida de acuerdo con la invención es un comprimido para administración oral. Se prefiere particularmente un comprimido recubierto con una substancia que es substancialmente insoluble a un pH de 5,0 y menor, como el presente en el estómago, pero que se disuelve al valor de pH más neutro del intestino delgado para liberar el análogo peptídico para su absorción. En los documentos WO 94/2/286 y WO 95/25534 se describen ejemplos de tales recubrimientos que se incorporan en esta memoria descriptiva como referencia.

Una descripción adicional de la invención es un método para reducir o detener las contracciones indeseadas de los músculos del útero. Este método es la administración al sujeto de una cantidad eficaz de uno de los análogos heptapeptídicos antagonistas de oxitocina de la invención, preferiblemente formulado como una de las composiciones descritas anteriormente. Será evidente que esta descripción de la invención es igualmente la descripción de un uso para los compuestos y formulaciones de la invención.

Una realización particularmente preferida de la invención es un método para detener las contracciones del útero en un parto prematuro. Después de la intervención inicial, que implicará un período de 1-3 días, el tratamiento puede continuarse para prevenir la recurrencia del parto hasta el momento que el médico a cargo del caso considere oportuno. De esta forma, hay dos aspectos de esta realización, un uso tocolítico agudo y un uso terapéutico de mantenimiento.

Otra realización preferida de la invención es un método para reducir las contracciones dolorosas del útero asociadas con la menstruación.

La cantidad de análogo heptapeptídico que constituye una dosis terapéuticamente eficaz dependerá de varios factores. La vía de administración será una consideración importante. Es probable que la inyección intravenosa sea la vía de administración más eficaz, mientras que se puede esperar que la administración intranasal sea más eficaz que la dosificación oral. Por consiguiente, se necesitará menos compuesto para una sola dosis intravenosa que para una sola dosis intranasal, y se necesitará más compuesto para una sola dosis oral. El médico a cargo del caso también tendrá que tener en cuenta factores tales como la edad, el peso y el estado de salud del paciente. También es probable que el tratamiento del dolor menstrual requiera menos compuesto que el parto prematuro. La cantidad de compuesto que constituye una sola dosis eficaz para tratamiento intravenoso de una mujer media en caso de parto prematuro es de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 500 mg, y preferiblemente de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 200 mg, en un período de 24 horas.

Los análogos heptapeptídicos de la presente invención inhiben selectivamente las contracciones del músculo uterino y no tienen las propiedades indeseables de los agonistas de oxitocina. También tienen pocos efectos antidiuréticos, hipotensivos o hipertensivos, o carecen de estos efectos, que podrían ser efectos secundarios de los análogos de oxitocina y de la hormona relacionada vasopresina. Son comparables en potencia a los compuestos conocidos en la técnica a los que más se parecen estructuralmente. Difieren de estos compuestos, que se describen en el documento WO95/02609, en la naturaleza del resto C-terminal. Los compuestos conocidos tienen una función carboxamida
(-CONH_{2}) donde los compuestos de la presente invención tienen un alcohol primario (-CH_{2}OH). Los compuestos de la presente invención son superiores a los del documento WO95/02609 con respecto a su estabilidad, particularmente en medio acuoso. Esto es claramente una ventaja cuando el compuesto se va a formular como una solución acuosa que, por consiguiente, tendrá una mayor vida media y tendrá requisitos menos estrictos de refrigeración, pero también es una ventaja en los procesos de fabricación y formulación, que implicarán períodos en los que el compuesto está en solución aunque la composición final sea un sólido.

Otros derivados de vasotocina para uso en el tratamiento terapéutico de las contracciones del músculo uterino se describen en el documento WO-A-92 009 96 y están comprendidos por la fórmula (I), distinguiéndose las estructuras de los compuestos de los compuestos de la presente invención por al menos una característica.

Aunque anteriormente se ha subrayado que los compuestos de la invención son particularmente útiles en el control de las contracciones del músculo uterino, una persona familiarizada con la técnica apreciará que también son posibles otros usos terapéuticos de antagonistas de oxitocina. Por ejemplo, otra diana para la acción de la oxitocina es la glándula mamaria, en la que promueve la salida de leche. Por lo tanto, los compuestos de la presente invención podrían usarse para controlar una lactancia inapropiada. También podrían ser útiles en el control de ciertos tumores, particularmente tumores de mama y metástasis secundarias derivadas de un tumor de mama primario. Otro objetivo terapéutico podría ser la hiperplasia prostática. También se ha sugerido que la oxitocina está implicada en el desarrollo luteal y en la facilitación del transporte del esperma después del coito. De esto se puede deducir que los compuestos de la invención podrían ser útiles como anticonceptivos o como agentes reguladores de la fertilidad. Otra diana periférica de la oxitocina es el sistema inmune. Por lo tanto, los antagonistas de oxitocina son potencialmente útiles como agentes inmunomoduladores y anti-inflamatorios. La oxitocina también está presente en el cerebro, donde se ha sugerido que tiene un papel en la etiología de diversas afecciones tales como la disfunción eréctil psicogénica, la esquizofrenia y deficiencias neuropsicológicas inducidas por el alcohol. En algunas especies ha demostrado tener un efecto sobre el comportamiento social complejo. Por consiguiente, los compuestos de la invención podrían usarse, por ejemplo, como anti-psicóticos o agentes potenciadores de la cognición. Se pretende que el uso de los compuestos de la invención en cualquiera de estas situaciones terapéuticas esté dentro del alcance de esta descripción.

A continuación, la invención se describirá en general y por medio de ejemplos específicos. Debe entenderse que esta memoria descriptiva no pretende limitar el alcance de la invención, y que igualmente están dentro de este alcance las variaciones conocidas en la técnica que el especialista considere equivalentes.

Métodos generales para la síntesis

Las transformaciones químicas necesarias para efectuar la síntesis de los compuestos de la invención son bien conocidas en la técnica. Son particularmente relevantes las técnicas de química de péptidos en solución y en soportes sólidos. Se describen métodos en fase de solución en las referencias que se indican a continuación:

Law, H.B. y Du Vigneaud, V., J. Am. Chem. Soc. 82, 4579-4581, 1960;

ZhuZe, A.L. et al., Coll. Czech. Chem. Comm. 29, 2648-2662, 1964; y

Larsson, L.-E. et al., J. Med. Chem. 21, 352-356, 1978.

Se describen métodos en fase sólida en:

Merrifield, R.B., J. Am. Chem. Soc. 85, 2149, 1963;

Merrifield, R.B., Biochemistry 3, 1385, 1964; y

König, W. y Geiger. R., Chem. Ver. 103, 788, 1970.

La ruta usada por los inventores se describe a grandes rasgos a continuación y después se ilustra con detalle. Para una persona familiarizada con la práctica de la química de péptidos será evidente que puede cambiarse el orden en el que se realizan algunas de las transformaciones. No es la intención de los inventores excluir tales variaciones obvias del alcance de la invención.

La mayoría de las veces, el material de partida será un N-alquil aminoácido protegido de fórmula general 1.

15

R y n se seleccionan entre las posibilidades indicadas anteriormente. P^{1} es un grupo protector de nitrógeno. Una selección particularmente preferida para P^{1} es 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc).

Cuando en el compuesto diana A tiene que ser H, entonces P^{2} es un grupo protector de nitrógeno distinguible de P^{1} (por ejemplo, benciloxicarbonilo) y P^{3} es H o igual que P^{2}, o P^{2} y P^{3} juntos son un grupo protector divalente para el nitrógeno (por ejemplo, ftaloílo).

Cuando A va a ser -C(=NH)NH_{2}, P^{2} es H o un grupo protector como se ha indicado anteriormente y P^{3} es
-C(=NP^{4})NH_{2}, donde P^{4} es un grupo protector, y preferiblemente es igual que P^{2}. Para el especialista será evidente que estas guanidinas protegidas pueden existir como tautómeros e isómeros posicionales. Aunque -(CH_{2})_{n}-N(P^{2})P^{3} se ha definido como 2^{A}, los isómeros 2^{B}, 2^{C} y 2^{D} pueden considerarse equivalentes a esta estructura para los fines de esta descripción.

16

17

Cuando los N-alquil aminoácidos protegidos de fórmula general 1 no estén disponibles en el mercado, pueden prepararse por métodos descritos en la bibliografía, o por métodos análogos a los mismos.

Suponiendo que se van a usar métodos en fase sólida, el aminoácido 1 se une a una resina adecuada para dar 3 como un primer intermedio.

18

donde Res representa la resina polimérica

P^{1} se escinde y se acopla FmocAbu (SCH_{2}CH_{2}CO_{2}t-Bu)OH para dar 4.

19

El péptido se extiende por acoplamiento secuencial con FmocAsn, FmocY, FmocIle y después BocX. Cuando X es D-Trp, es ventajoso proteger el nitrógeno del indol como su derivado formilo. El uso de protección Boc para este aminoácido permite la escisión simultánea del éster t-butílico y el grupo protector N-terminal. En esta etapa, está presente el intermedio 5.

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El péptido se escinde de la resina usando condiciones convencionales apropiadas y después se esterifica, por ejemplo, por tratamiento con bromuro de bencilo para dar el éster bencílico 6.

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Esto puede escribirse como

22

El grupo Boc y el éster t-butílico se escinden por tratamiento ácido, y la amina y los grupos ácidos resultantes se condensan para formar el macrociclo. Después, el éster bencílico se reduce para dar el alcohol primario del compuesto diana, por ejemplo, mediante reacción con borohidruro sódico en isopropanol acuoso. Convenientemente, durante esta conversión también puede conseguirse la eliminación de los grupos protectores restantes. Si no es el caso, es necesaria una etapa final de desprotección. El producto se aisla y se purifica usando técnicas convencionales.

Los siguientes ejemplos específicos se prepararon de acuerdo con este esquema general. Son representativos de los compuestos de la presente invención. Se usan las siguientes abreviaturas:

TBTU	tetrafluoroborato de 2-(1-H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3,-tetrametiluronio
Boc	terc-butiloxicarbonilo
Fmoc	9-fluorenilmetiloxicarbonilo
TFA	ácido trifluoroacético
DMF	dimetilformamida
DBU	1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno
Bn	bencilo
Orn	ornitina
Pht	ftaloílo

Los aminoácidos protegidos se obtuvieron como se indica a continuación:

FmocAbu (SCH_{2}CH_{2}CO_{2}t-Bu) se preparó de acuerdo con Prochazka, E. et al., Coll. Czech. Comm. 57, 1335, 1992;

FmocN^{\alpha}MeOrn (Pht) se preparó por analogía con la ruta usada para el derivado de lisina por Freidinger, R. M. et al., J. Org. Chem. 48, 77, 1983;

Fmoc-alloIle se preparó de acuerdo con Ten Kortenaar, P.B.W. et al., Int. J. Peptide Protein Res. 27, 398, 1986;

FmocAla(3,3-dietilo) se preparó de acuerdo con Eisler, K. et al., Coll. Czech. Chem. Comm. 31, 4563, 1966;

Boc-D-Trp(CHO); Boc-D-Nal; FmocAsn; FmocIle; FmocVal; FmocLeu; FmocCha son de Bachem (CH y USA)

Ejemplo 1

23

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El péptido Ia se sintetizó usando la metodología de fase sólida sobre una resina de o-clorotritilo y con la estrategia de Fmoc.

Se unió a la resina el primer aminoácido, FmocN^{\alpha}MeOrn(Pht)OH. La escisión del grupo Fmoc se consiguió con DBU al 2% en DMF. Se acoplaron secuencialmente otros restos, terminando con Boc-D-Trp(CHO)OH. El péptido unido a la resina se trató con una mezcla de ácido acético/trifluoroetanol/diclorometano (1:2:7), después la mezcla se filtró y el filtrado se evaporó y se liofilizó. El ácido del péptido resultante se esterificó por reacción con bromuro de bencilo (2 eq.) y diisopropiletilamina (2,5 eq) en DMF durante 27 horas. El disolvente se evaporó y el residuo se liofilizó en ácido acético.

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El grupo Boc N-terminal y el éster t-butílico de Ia se escindieron mediante tratamiento con TFA al 95%/anisol al 2,5%/agua al 2,5% durante 1,5 horas a temperatura ambiente. El TFA se evaporó y el producto se precipitó por la adición de éter dietílico. El péptido se cicló por tratamiento con TBTU (1 eq) y N-metilmorfolina (17 eq) en DMF a temperatura ambiente. El disolvente se evaporó y el péptido Ib se purificó por cromatografía de fase inversa.

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El éster bencílico Ib purificado se trató con NaBH_{4} (7 eq) en solución en una mezcla de isopropanol/agua (6:1) a temperatura ambiente durante 22 horas en una atmósfera de gas inerte. Se añadió ácido acético (18 eq) y la mezcla se calentó a 80ºC durante 6 horas. El disolvente se evaporó y el péptido Ic del producto (= "péptido I") se purificó por cromatografía líquida de fase inversa: fase estacionaria; Kromasil® 13\mu o 5\mu, 100 \ring{A}, C_{18} o C_{8} (EKA Nobel, Suecia): fase móvil; acetonitrilo/TFA al 0,1% en agua. Rendimiento 14 mg. La espectrometría de masas (ionización de electronebulización, análisis de captador de iones, modo positivo) indicó una masa molecular de acuerdo con la estructura propuesta (encontrada m/z = 830,5 [MH^{+}]; calculada para [C_{40}H_{63}N_{9}O_{8}+H^{+}] m/z = 830,5).

Ejemplos II - VII

Usando el mismo método que en el ejemplo I, y substituyendo Boc-D-Trp(CHO)OH y Fmoc-alloIleOH por los aminoácidos protegidos apropiados, se prepararon los péptidos indicados en la tabla 1.

TABLA 1 Datos de espectroscopía de masas

\vskip1.000000\baselineskip

27

\vskip1.000000\baselineskip

Péptido	X	Y	Espectrometría de masas
			Calc. MH^{+}	Encontrado
II	D-Trp	Leu	830,5	830,4
III	D-Trp	Val	816,4	816,4
IV	D-Trp	Cha	870,5	870,5
V	D-Trp	Ile	830,5	830,5
VI	D-Nal	alloIle	841,5	841,5
VII	D-Trp	Ala (3,3-diethyl)	844,5	844,5

Se prepararon varias amidas de péptidos de referencia de acuerdo con los métodos descritos en el documento WO95/02609 para comparar las propiedades de la presente invención con las conocidas en la técnica. Estos péptidos de referencia se indican en la tabla 2.

\newpage

TABLA 2 Péptidos de referencia

28

Péptido	X	Y
r-IX	D-Trp	alloIle
r-X	D-Trp	Val
r-XI	D-Nal	alloIle

Ejemplo VIII

Usando el método del ejemplo I, pero substituyendo el N^{\alpha}-metil aminoácido por N^{\alpha}-etilornitina, se preparó el siguiente péptido (encontrado m/z = 855,1 [MH^{+}]; calculado para [C_{41}H_{65}N_{9}O_{8}S+H^{+}] m/x = 855,5).

29

Péptido VIII

Ejemplo IX Evaluación biológica de los compuestos

Los compuestos de la presente invención pueden evaluarse en varios sistemas biológicos in vitro e in vivo. Estos sistemas de ensayo se seleccionan por tener la mayor relevancia posible para el paciente humano.

i) Ensayo de unión al receptor de oxitocina

Se expresaron receptores de oxitocina humana recombinantes en células CHO o HEK293 usando técnicas de biología molecular convencionales. Se preparó una fracción de membrana y se incubó en presencia de [^{125}I]-oxitocina y concentraciones variables de análogo heptapeptídico. Después, las membranas se aislaron por filtración y se contó la radiactividad para determinar la unión de oxitocina. Se determinó una constante de inhibición K_{i} para el análogo. Los resultados obtenidos se presentan en la tabla 3.

TABLA 3

Ensayo del receptor de oxitocina; constantes de inhibición K_{i}
Péptido	K_{i}(nM): media \pm SEM
I	0,25 \pm 0,16
II	3,2 \pm 0,75
III	0,80 \pm 0,30
IV	7,0 \pm 1,85
V	1,4 \pm 0,15
VI	0,1 \pm 0,0
VII	2,4 \pm 0,85

ii) Efecto antagonista in vitro en un modelo de útero humano

Se cortó en tiras tejido de músculo uterino de una mujer en la última fase del embarazo a la que se le estaba practicando una cesárea, y las tiras se montaron en un baño de tejido rellenado con tampón de Krebs-Ringer y oxigenado con gas carbógeno (95% de O_{2} + 5% de CO_{2}). Los cambios en la tensión isométrica del músculo detectados con un transductor de tensión se registraron en un polígrafo Grass.

Se registró la curva de concentración-efecto de la oxitocina. El efecto medido en este caso corresponde al valor neto de la curva de contracción integrada durante el período de 10 minutos posterior a la administración del agonista (es decir, oxitocina). Se seleccionó una concentración de oxitocina que proporcionaba al menos la mitad de la respuesta máxima. Esta concentración de agonista se administró al tejido en presencia de distintas concentraciones de análogo heptapeptídico antagonista y se registró la respuesta. La concentración de antagonista requerida para reducir la respuesta a un 50% de su valor de control se determinó mediante un análisis de regresión y se proporciona en este documento como un valor de IC_{50}. [valor de IC_{50} = concentración de antagonista que se requiere para reducir el efecto de un dosis de agonista dada en un 50%]. Los resultados se proporcionan en la tabla 4.

TABLA 4

Inhibición del efecto agonista (modelo de útero)
Péptido	IC_{50}, modelo de útero humano (nM)
I	5 \pm 1
r-V_{I}II	18 \pm 3

iii) Modelo de rata in vivo

Se anestesiaron ratas Sprague Dawley (de aprox. 250 g) en la fase estro natural con Inactin (0,5 mg/100 g de peso corporal, i.p.). La actividad del miometrio se midió con la ayuda de un catéter fijado en la cavidad uterina y relleno de solución de Locke modificada. El catéter se conectó a un transductor de fuerza Statham P23d y las contracciones se registraron en un polígrafo Grass (modelo 7D).

Se registró la curva de dosis-respuesta para la oxitocina (2x10^{-4} - 5x10^{-3} \mumol/kg). En este caso, la respuesta se cuantificó por medio de la integración de la curva durante los 15 minutos posteriores a la inyección del agonista. Se seleccionó una dosis de oxitocina que proporcionaba un efecto correspondiente a una presión de contracción intraluminal de 10 - 30 mm Hg y dentro de la sección lineal de la curva. Esta dosis de oxitocina se administró al animal junto con al menos dos dosis diferentes de antagonista y se registró el efecto. La dosis de antagonista que reduce el efecto del agonista a un 50% de su nivel de control se determinó por interpolación y se proporciona en este documento como un valor de ID_{50} [valor de ID_{50} = dosis de antagonista que se requiere para reducir el efecto de una dosis de agonista dada en un 50%]. Los resultados se proporcionan en la tabla 5.

En este modelo también se calculó la duración de la acción de los antagonistas. Se seleccionó una dosis de oxitocina (2x10^{-4} - 5x10^{-3}) que proporcionaba un efecto correspondiente a la mitad del efecto máximo (esta dosis es la ED_{50}). El efecto determinado aquí es el mismo que para la determinación de la ID_{50} definida anteriormente. Se seleccionó una dosis de antagonista (8x10^{-4} - 4x10^{-3} \mumol/kg) para proporcionar una inhibición de al menos un 50% de la respuesta al agonista. Al comienzo del experimento, se co-administraron dosis individuales de agonista y antagonista. Después, se administraron dosis del agonista solo a intervalos de 20 minutos y se midió la respuesta. El tiempo necesario para que la inhibición del efecto agonista se redujera al 25% de su valor de partida se determinó por interpolación y se proporciona aquí como el valor de t_{75}. [valor de t_{75} = período de tiempo que se necesita para que la eficacia de una sola dosis se reduzca en un 75%]. Los resultados se presentan en la tabla 5.

TABLA 5

Inhibición del efecto agonista (modelo de rata in vivo)
Péptido	ID_{50}, modelo de rata (nmol/kg)	t_{75}, modelo de rata (min)
I	2,9 \pm 0,3	169 \pm 2
r-IX	2,9 \pm 0,3	180 \pm 9

Por los resultados presentados en las tablas 3-5, es evidente que los compuestos de la presente invención son al menos tan buenos como los compuestos anteriores en el modelo de rata, tanto en términos de potencia como de duración de la acción, y que son superiores a los compuestos anteriores en el modelo humano más relevante.

Ejemplo X Formulaciones farmacéuticas Solución en suero salino isotónico tamponado para inyección i.v.

Se prepararon las siguientes soluciones:

Solución A (ácido cítrico 0,02 M)
ácido cítrico monohidrato	0,42 g
agua destilada ad	100 ml
Solución B (hidrógeno fosfato disódico 0,04 M)
Na_{2}HPO_{4}.2H_{2}O	0,712 g
agua destilada ad	100 ml

A 27 ml de solución A se le añaden 23 ml de solución B, 0,81 g de NaCl y 0,322 g de acetato de péptido I. El pH se ajusta a 4,5 con solución A, y después se añade agua destilada para dar un volumen total de 100 ml. Finalmente, la mezcla se filtra a través de un Sterivex-GV de 0,22 \mum. Esto proporciona una solución isotónica que contiene
0,3 mg/ml de péptido I (calculado como la base libre) adecuada para inyección intravenosa.

Comprimidos para administración oral

Se combinaron los siguientes componentes:

acetato de péptido I	108 mg
manitol	7,7 g
lactosa	6,0 g
celulosa microcristalina	6,0 g
carboximetilcelulosa reticulada	200 mg
talco	800 mg
estearato de magnesio	200 mg
polivinilpirrolidona/etanol	cantidad necesaria

La mezcla se transformó en comprimidos usando métodos convencionales. La mezcla es suficiente para preparar 100 comprimidos que contienen, cada uno, 1 mg de péptido I (calculado como base libre).

Comprimido entérico para administración oral

Se recubrieron 25 de los comprimidos mencionados anteriormente por medio de un pulverizador de aire con 100 mg de acetato ftalato de celulosa (4 mg por comprimido).

También es útil en la invención la composición descrita en el documento WO95/25534, en la que el agente activo (desmopresina, por ejemplo) puede substituirse por los compuestos de acuerdo con la presente invención. La adaptación de esta composición para manejar las mayores cantidades de agente activo que se tienen que incorporar en el comprimido está dentro de las capacidades del especialista en la técnica.

Ejemplo XI Evaluación de la estabilidad

Se prepararon soluciones de análogos heptapeptídicos de la presente invención con composiciones representativas de formulaciones acuosas. Las soluciones se almacenaron durante varias semanas a 50ºC y se extrajeron alícuotas periódicamente para su análisis por HPLC. Los péptidos de referencia se estudiaron en paralelo. La degradación se determinó como la pérdida de péptido (% en peso por semana), independiente de la naturaleza de los productos de descomposición. Los resultados se presentan en la tabla 6.

TABLA 6

Ensayo de estabilidad
Péptido	Composición de la solución de ensayo	Degradación a 50ºC (% en peso/semana)
I	tampón citrato/fosfato isotónico, pH 4,5	0,4
r-IX	como antes	2,9
III	como antes	0,7
r-X	como antes	4,3
VI	como antes	1,2
r-XI	igual	4,0

Los resultados presentados anteriormente indican claramente que los compuestos de la invención son más estables en solución que los compuestos descritos previamente. En la práctica, esta mayor estabilidad significa que las formulaciones acuosas tendrán una mayor vida media y serán menos exigentes en sus requisitos de almacenamiento refrigerado. Además del ahorro económico resultante, se obtendrán beneficios tanto en la conveniencia como en la seguridad debido a que se reducirá la necesidad de preparar dosis inmediatamente antes de la administración.

También se beneficiará el proceso de fabricación, ya que los compuestos serán más resistentes a la descomposición durante y después de la purificación.

Claims

1. Un análogo heptapeptídico, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que tiene actividad antagonista de la oxitocina y que consta de un resto hexapeptídico S y un resto de \beta-aminoalcohol C-terminal Z unido al resto S por un enlace amida, donde el \beta-aminoalcohol Z es:

(Z)---NR---

\delm{C}{\delm{\para}{Q}}

H---CH_{2}OH

donde Q es (CH_{2})_{n}-NH-A-, n es 1-6 y A es H o -C(=NH)NH_{2},

y donde R es CH_{3} o C_{2}H_{5};

y el resto S es:

30

Mpa resto de ácido 3-mercaptopropiónico Ile resto de isoleucina Asn resto de asparagina Abu resto de ácido \alpha-aminobutírico; y donde X es un D-\alpha-aminoácido aromático; e Y es un \alpha-aminoácido alifático.

2. El análogo heptapeptídico de la reivindicación 1, donde X es el resto amino acilo de D-triptófano o \beta-(2-naftil)-D-alanina.

3. El análogo heptapeptídico de la reivindicación 2, donde Y es el resto amino acilo de leucina, valina, isoleucina, aloisoleucina, \beta, \beta-dietilalanina, ciclohexilalanina o ciclohexilglicina.

4. El análogo heptapeptídico de la reivindicación 1, donde Y es el resto amino acilo de leucina, valina, isoleucina, aloisoleucina, \beta, \beta-dietilalanina, ciclohexilalanina, o ciclohexilglicina.

5. El análogo heptapeptídico de la reivindicación 4, donde n es 2, 3 ó 4.

6. El análogo heptapeptídico de la reivindicación 1, donde n es 2, 3 ó 4.

7. El análogo heptapeptídico de la reivindicación 6, donde X es el resto amino acilo de D-triptófano o \beta-(2-naftil)-D-alanina.

8. El análogo heptapeptídico de la reivindicación 1, donde X es el resto amino acilo de D-triptófano o \beta-(2-naftil)-D-alanina, Y es el resto amino acilo de leucina, valina, isoleucina, aloisoleucina, \beta,\beta-dietilalanina, ciclohexilalanina o ciclohexilglicina, y n es 2, 3 ó 4.

9. Un análogo heptapeptídico de acuerdo con la reivindicación 8, seleccionado entre:

31

320

32

10. El análogo heptapeptídico de la reivindicación 1, que tiene la estructura:

42

11.El análogo heptapeptídico de la reivindicación 1, que tiene la estructura:

43

\newpage

12. El análogo heptapeptídico de la reivindicación 1, que tiene la estructura:

44

13. El análogo heptapeptídico de la reivindicación 1, que tiene la estructura:

45

14. El análogo heptapeptídico de la reivindicación 1, que tiene la estructura:

46

15. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad farmacológicamente eficaz de un análogo heptapeptídico de la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

16. La composición de la reivindicación 15, que es una solución acuosa para administración nasal, subcutánea o intravenosa.

17. La composición de la reivindicación 15, donde el vehículo incluye un agente tamponante.

18. La composición de la reivindicación 15, en forma de un comprimido, una cápsula, gránulos, y similares, para administración oral.

19. El uso de un análogo heptapeptídico de la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para reducir o bloquear la contracción del músculo uterino.

20. El uso de la composición de la reivindicación 15, para la fabricación de un medicamento para reducir o bloquear la contracción del músculo uterino.

21. El uso de la reivindicación 20, donde la contracción del músculo uterino está asociada con el parto prematuro.

22. El uso de la reivindicación 20, donde la contracción del músculo uterino está asociada con el dolor menstrual.

23. El uso de la composición de la reivindicación 15, para la fabricación de un medicamento para la administración a una mujer en parto prematuro.

24. El uso de un análogo heptapeptídico de la reivindicación 1, para el tratamiento de neoplasias e hiperplasias, esquizofrenia, trastornos del comportamiento, disfunción eréctil, inflamación y expulsión inapropiada de leche, o como agente potenciador de la cognición, inmunomodulador, o regulador de la fertilidad.

25. Un método para preparar un análogo heptapeptídico, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que tiene actividad antagonista de oxitocina y que consta de un resto hexapeptídico S y un resto de \beta-aminoalcohol C-terminal Z unido al resto S por un enlace amida, donde el \beta-aminoalcohol Z es:

(Z)---NR---

\delm{C}{\delm{\para}{Q}}

H---CH_{2}OH

donde Q es (CH_{2})_{n}-NH-A-, n es 1-6 y A es H o -C(=NH)NH_{2}, y donde R es CH_{3} o C_{2}H_{5}; y el resto S es:

47

Mpa resto de ácido 3-mercaptopropiónico Ile resto de isoleucina Asn resto de asparagina Abu resto de ácido \alpha-aminobutírico; y donde X es un D-\alpha-aminoácido aromático; e Y es un \alpha-aminoácido alifático,

por reducción de un compuesto correspondiente en el que Z es Y:

(Y)---NR^{1}---

\melm{\delm{\para}{M}}{C}{}

H—CO---OBn

donde M es (CH_{2})_{n}-N(Pht) o -(CH_{2})_{n}-N(P)-C(=NP)NP_{2}, donde uno o dos de los grupos P son grupos protectores de nitrógeno y el resto son hidrógenos, n es 1-6, y R^{1} es CH_{3} o C_{2}H_{5}, usando una sal borohidruro o un borohidruro substituido o borano.

26. El método de la reivindicación 25, donde el borohidruro es NaBH_{4}.

27. Un método para preparar una composición farmacéutica destinada para el tratamiento de parto prematuro y del dolor menstrual, neoplasias e hiperplasias, esquizofrenia, trastornos del comportamiento, disfunción eréctil, inflamación y expulsión inapropiada de leche, o como agente potenciador de la cognición, inmunomodulador, o regulador de fertilidad, comprendiendo el método la combinación de un análogo heptapeptídico, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que tiene actividad antagonista de la oxitocina y consta de un resto hexapeptídico S y un resto de \beta-aminoalcohol C-terminal Z unido al resto S por un enlace amida, donde el \beta-aminoalcohol Z es:

(Z)---NR---

\delm{C}{\delm{\para}{Q}}

H---CH_{2}OH

donde Q es (CH_{2})_{n}-NH-A-, n es 1-6 y A es H o -C(=NH)NH_{2},

y donde R es CH_{3} o C_{2}H_{5};

y el resto S es:

48

donde Mpa, Ile, Asn y Abu tienen los significados que se indican a continuación:

con un aditivo farmacéuticamente aceptable.

28. El método de la reivindicación 27, donde la composición es una mezcla íntima del análogo heptapeptídico o una sal del mismo y el aditivo.

29. El método de la reivindicación 28, que comprende cubrir dicha mezcla con un recubrimiento entérico, en particular un recubrimiento entérico que no se disuelva fácilmente a pH 5,0 y menor.

30. El método de la reivindicación 28 ó 29, que comprende formar comprimidos o granular la mezcla y/o introducirla en una cápsula.