ES2204105T3

ES2204105T3 - Aplicacion local de enzimas utilizando una pelicula susceptible de desprendimiento.

Info

Publication number: ES2204105T3
Application number: ES99906142T
Authority: ES
Inventors: Luppo Edens; Bertus Noordam
Original assignee: Cosmoferm BV
Current assignee: Cosmoferm BV
Priority date: 1998-01-08
Filing date: 1999-01-08
Publication date: 2004-04-16
Anticipated expiration: 2019-01-08
Also published as: BR9904799A; CN1256625A; KR20000076053A; DE69909380D1; DE69909380T2; EP0975326A1; US20010006675A1; EP0975326B1; JP2001515521A; WO1999034774A1; US6368595B2

Abstract

La presente invención se refiere a un procedimiento para la aplicación tópica de una encima, en la que la encima se incorpora a una película, por ejemplo una película de alcohol polivinílico, que se puede despegar después de su aplicación. De esta forma se evita que se liberen partículas de polvo que contenga la enzima en el lugar de la aplicación.

Description

Aplicación local de enzimas utilizando una película susceptible de desprendimiento.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la aplicación local de una composición que contiene enzimas.

Antecedentes de la invención

Las enzimas se utilizan en numerosos productos de consumo, entre los cuales se encuentran detergentes y cosméticos. Un problema asociado con los productos que contienen enzimas es que las enzimas pueden inducir sensibilización alérgica después de inhalación de polvo transportado en el aire o aerosoles. Por ejemplo, después de la aplicación local de una crema que contiene enzimas, partículas de polvo que contienen enzimas pueden liberarse del sitio de aplicación cuando se seca la crema.

Una solución para evitar la inhalación de partículas de polvo que contienen enzimas consiste en inmovilizar la enzima antes de su aplicación actual (véanse las solicitudes de patente japonesas J57073098 y J61268611). No obstante, se sabe que la actividad de una enzima inmovilizada frente a un sustrato sólido (la piel) es muy baja. Por ejemplo, no debe contarse con que las proteasas inmovilizadas interaccionen con las proteínas de la capa córnea.

Por esta razón, sería deseable aplicar una composición que contenga una enzima en una forma no inmovilizada de tal manera que no pudiera producirse la liberación de partículas de polvo del sitio de aplicación.

La presente invención proporciona una solución conveniente a los problemas anteriores proporcionando un método para aplicación local de una enzima, en el cual se evita la liberación de las partículas de polvo que contienen la enzima del sitio de aplicación, al tiempo que se garantiza la actividad de la enzima.

Descripción de la invención

La presente invención expone un método para aplicación local de una composición que contiene enzima, en la cual se aplica una composición enzimática que comprende adicionalmente un agente formador de película. Después de la aplicación local de dicha composición, el agente formador de película permite la formación de una película susceptible de desprendimiento que incorpora la enzima, debido a la evaporación del o de los disolventes utilizados. Después de evaporación del disolvente y después que la enzima ha cumplido su misión, la película que incorpora la enzima se elimina del sitio de aplicación. De este modo, se evita la liberación de las partículas de polvo que contienen enzima, que se forman fácilmente como consecuencia del secado de una composición que contiene enzima en el sitio de aplicación.

Específicamente, el método de la invención comprende los pasos de:

preparar una composición que comprende una enzima y un agente formador de película,

aplicar localmente dicha composición,

incubar dicha composición en el sitio de aplicación durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la formación de una película que incorpora la enzima, y

eliminar dicha película que incorpora la enzima del sitio de aplicación.

En una realización de la invención, la composición que comprende una enzima y un agente formador de película se prepara por mezcla de dos composiciones separadas, a saber una primera composición que comprende la enzima y una segunda composición que comprende el agente formador de película. De este modo, la enzima no se ve influida desfavorablemente por la presencia del agente formador de película disuelto o por la presencia de cualquier agente auxiliar.

Una opción preferida de esta realización comprende el empaquetamiento de dichas dos composiciones individuales en un sistema dispensador de componentes dual. Utilizando un sistema dispensador de componentes dual, es posible el suministro simultáneo de una composición que comprende la enzima y una composición que comprende el agente formador de película. Después del suministro, ambas composiciones individuales se mezclan, sea in situ o en el sistema de dispensación. La mezcla de ambas composiciones da como resultado una composición final que comprende la enzima y el agente formador de película en una forma que es adecuada para uso directo.

El sistema de dispensación a utilizar en esta realización de la invención no es crítico. Puede utilizarse cualquier sistema que permita el alojamiento separado de la composición enzimática y la composición que comprende el agente formador de película.

Por ejemplo, un sistema de dispensación puede seleccionarse de los sistemas de dispensación de componentes duales que se han desarrollado para el envasado y suministro de compuestos químicos no compatibles, es decir compuestos químicos que reaccionan uno con otro cuando se ponen en contacto. Por ejemplo, se conocen dispensadores de componentes duales del campo de los adhesivos.

Aparte de los adhesivos, se han descrito también sistemas de dispensación de componentes múltiples para la formulación de compuestos incompatibles en pastas dentífricas. Tubos dentífricos flexibles de dos compartimientos se describen en las patentes de Estados Unidos U.S. 4.487.757 y U.S. 4.098.435. Un tubo de dos compartimientos para el almacenamiento de una composición enzimática no acuosa separada de la composición acuosa de pasta dentífrica ha sido descrito en el documento FR 2.051.922.

En otro enfoque adicional pero básicamente muy sencillo, un par de bolsas de plástico proporciona material para uso simple únicamente. Las salidas de las dos bolsas están próximas una a otra y la descarga de sus contenidos puede efectuarse abriendo por desgarro las piezas extremas de la bolsa (Solicitud de Patente Alemana DE 3 630 849).

Adicionalmente, el documento alemán "Modelo de Utilidad" DE, U, 93 07 726 menciona una unidad de empaquetado de dos cámaras en la cual los dos componentes empaquetados por separado pueden mezclarse por aplicación de presión a una de las cámaras. Unicamente después que se ha completado la mezcladura, se abre el envase para liberar la mezcla recién preparada.

También es adecuado el envase comercialmente disponible que se muestra en la Figura 1. En este envase, la composición enzimática, v.g. en la forma de un polvo liofilizado, se encuentra en una inserción dispuesta encima de un vial. Al empujar la cápsula hacia abajo se perfora la membrana que separa la composición enzimática y la composición que comprende el agente formador de película. Al agitar mediante sacudidas, la composición enzimática y composición formadora de película se mezclan y se aplican subsiguientemente.

Utilizando los envases que se muestran en las Figuras 2A y B, se obtiene el mismo enfoque de mezcladura completa. El envase de la Figura 2A es un tubo convencional que comprende la composición con el agente formador de película, conteniendo adicionalmente una pequeña bolsita o ampolla que contiene la enzima en una forma estabilizada. El envase de la Figura 2B es un saquito de dos compartimientos, en el cual ambos compartimientos están separados por una membrana que puede romperse. Inmediatamente antes de su utilización, la bolsita o ampolla se abre o se rompe por flexión o presión de tal manera que la enzima estabilizada se libera. Después de mezcladura concienzuda de la enzima con la composición que comprende el agente formador de película, se abre el tubo o la bolsita y se aplica localmente su contenido.

La enzima a utilizar en el método de la invención dependerá de la aplicación deseada. Enzimas adecuadas se encuentran típicamente en las clases de las oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas y/o isomerasas. Por ejemplo, la enzima es una glucosa-oxidasa, peroxidasa, lipoxigenasa, superóxido-dismutasa, tirosinasa, proteasa, fosfatasa, fitasa, glicosidasa, glucanasa, lisozima, esterasa, lipasa, fosfolipasa, sulfatasa, ureasa, transglutaminasa o proteína-disulfuro-isomerasa. Asimismo, es posible aplicar una composición que comprende una mezcla de dos o más enzimas.

Una enzima preferida para uso en el método de la invención es una proteasa.

La forma en que esté formulada la enzima no es crítica para la invención. La enzima puede formularse como una composición sólida o una composición líquida. Una composición líquida puede ser por ejemplo una composición acuosa en la cual la enzima está solubilizada y, preferiblemente, estabilizada, o puede ser una suspensión en la cual una forma sólida de la enzima está suspendida en un líquido. Alternativamente, la enzima puede formularse como una emulsión de aceite en agua o como una emulsión de agua en aceite. En ambos tipos de emulsión, la enzima está presente en la fase acuosa, preferiblemente en una forma estabilizada. Adicionalmente, la enzima puede presentarse como un polvo esencialmente seco, suspendido opcionalmente en un líquido no acuoso. La naturaleza de la composición enzimática puede depender por consiguiente, por ejemplo, de la aplicación deseada.

En una realización preferida de la invención, la composición enzimática es una composición acuosa en la cual está solubilizada la enzima. Para formular de manera estable una enzima en una composición acuosa, la composición enzimática comprende preferiblemente una cantidad suficiente de un agente reductor de la actividad de agua. Por ejemplo, puede utilizarse para la estabilización un poliol.

En este sentido, la elección del poliol que se utiliza para estabilizar una composición enzimática acuosa no es critica para la invención. Puede utilizarse cualquier poliol que sea conocido por las personas expertas como estabilizador eficaz de una enzima en una solución acuosa. Polioles que son particularmente útiles son los polioles seleccionados del grupo de glicerol, sorbitol, propilenglicol, maltodextrinas, o un azúcar tal como sacarosa, lactosa, glucosa o trehalosa. Para aplicaciones locales, debería considerarse un poliol que sea aceptable para uso local, es decir glicerol, polietilenglicol, butilen-glicol, propilen-glicol, trehalosa o sorbitol.

El poliol se utiliza en una concentración elevada, es decir una concentración que da como resultado una actividad de agua suficientemente baja en la composición enzimática para estabilizar adecuadamente la enzima. Se sabe en la técnica que estas concentraciones pueden variar ligeramente con el poliol utilizado. Preferiblemente, el poliol se utiliza en una concentración de 20-100%, más preferiblemente en una concentración de 30-90%, todavía más preferiblemente en una concentración de 40-90%, aún más preferiblemente en una concentración de 50-90%, y muy preferiblemente en una concentración de 60-80%.

Una composición acuosa estable de este tipo puede utilizarse también para producir, cuando se combina con un emulsionante adecuado, una emulsión de agua en aceite (véase el documento WO 95/28092) o una emulsión de aceite en agua.

En otra realización preferida de la invención, la composición enzimática es una composición acuosa que es una suspensión de la enzima en forma precipitada. Por ejemplo, la enzima se precipita por la adición de una concentración elevada de una sal, tal como sulfato de amonio.

El agente formador de película puede ser cualquier agente que permita tanto la formación de una máscara susceptible de desprendimiento (película susceptible de desprendimiento) después de la evaporación del disolvente que ocurre después de la aplicación local de la composición que comprende la enzima y el agente formador de película, así como la liberación del 90% o más de la enzima que está incorporada en dicha película susceptible de desprendimiento.

Por ejemplo, el agente formador de película puede ser un coloide soluble o dispersable, con inclusión de una extensa gama de compuestos polímeros tales como poli(alcohol vinílico), (co)polímeros acrílicos, poliuretano, látex, polivinilpirrolidona, hidrocoloides tales como goma karaya o alginato, y análogos. La elección del agente formador de película a utilizar puede depender, entre otras cosas, de la enzima que se desee aplicar localmente. Dicha elección puede ser dependiente adicionalmente de la solubilidad, tacticidad, plasticidad, reología, y tiempo de secado deseados. Aparte de estos aspectos, también puede tenerse en cuenta la estabilidad al almacenamiento.

Un agente formador de película preferido para utilizar en la composición de acuerdo con la invención es poli(alcohol vinílico) (PVA). Es generalmente conocido por las personas expertas que las propiedades de una película de PVA dependerán principalmente del tipo de PVA que se utilice para su preparación. Las propiedades de los diversos tipos de PVA están regidas principalmente por el peso molecular (grado de polimerización) y el contenido remanente de grupos acetilo (véase, por ejemplo, el folleto Hoechst High Chem. sobre Mowiol PVA, que puede obtenerse de Clariant Benelux, Amsterdam, Países Bajos).

El tipo específico de PVA que puede seleccionarse depende también de los aspectos generales que se tengan en cuenta para la elección de un agente formador de película específico.

Si se desea, pueden aplicarse mezclas de diferentes tipos de PVA para obtener una película que tenga características óptimas.

Por ejemplo, un PVA adecuado para uso en combinación con una composición acuosa que contiene enzima es un PVA que proporciona una viscosidad satisfactoria en presencia de una cantidad sustancial de agua. La viscosidad de una formulación de PVA dependerá por tanto típicamente del tipo de PVA así como de la concentración del PVA.

Además de un agente formador de película, pueden estar presentes en la composición de acuerdo con la invención compuestos que puedan influir en las propiedades de la composición y/o la película resultante.

Por ejemplo, para obtener una solución muy viscosa, se puede añadir un aumentador de la viscosidad adecuado, tal como xantano o hidroxietilcelulosa.

Una cantidad elevada de agua en la composición de acuerdo con la invención permite que la enzima actúe sobre la piel durante un periodo de tiempo relativamente largo. Sin embargo, puede ser más conveniente para el usuario un tiempo de secado relativamente corto. Para acortar el tiempo de secado de la solución de PVA, puede ser una opción reducir el contenido de agua de la formulación. Por ejemplo, la fase acuosa de la composición puede contener adicionalmente un disolvente para acelerar la evaporación, tal como etanol.

Para reducir aún más el contenido de agua de la formulación, puede utilizarse un grado de PVA de baja viscosidad, por ejemplo Mowiol 3-83 ó 4-88 (Clariant), dado que un grado de PVA de viscosidad baja puede aplicarse en una concentración relativamente alta. Con estos grados de PVA de viscosidad baja, soluciones que contienen hasta 35% (p/v) en agua proporcionan una extensibilidad aceptable. Una ventaja asociada de dichas concentraciones de PVA relativamente altas es una resistencia incrementada al desgarramiento de la película formada después del secado.

Para producir una película con un grado de plasticidad variable, puede utilizarse un agente plastificante, tal como glicerol, sorbitol, o etilenglicol.

Para minimizar la tacticidad, puede añadirse un denominado reductor de la adhesión. Ejemplos de tales compuestos son aceite de silicona o ciertas ceras. Para aumentar la tacticidad, se pueden añadir ciertos compuestos cosméticamente aceptables, tales como por ejemplo miel.

Para aumentar la extensibilidad, el comportamiento de secado y la susceptibilidad de eliminación, la composición de la invención puede comprender un agente tensioactivo que funcione como agente humectante, v.g. un agente tensioactivo no iónico, tal como Tween 20, y/o una betaína.

El PVA se aplica en la formulación en una concentración que puede variar desde 0,1 a 40%. Un grado de PVA de alta viscosidad, tal como Mowiol 40-88 (Clariant), se aplica típicamente en los intervalos de concentración más bajos, v.g. de 0,1 a 20%, preferiblemente de 1 a 10%, en tanto que un grado de PVA de viscosidad baja, tal como Mowiol 3-83 ó 4-88, se aplica típicamente en los intervalos más altos, v.g. de 20-40%, preferiblemente de 25-30%.

La composición de acuerdo con la invención puede incluir otros ingredientes activos aparte de una enzima y un agente formador de película.

Por ejemplo, la composición de acuerdo con la invención puede incluir un sustrato para la enzima que está presente en la composición. Ejemplos son ácido linoleico o linolénico como sustrato para lipoxigenasa; caseína como sustrato para transglutaminasa; peróxido de hidrógeno como sustrato para peroxidasa; precursores vitamínicos como sustrato para esterasas/lipasas.

Adicionalmente, la composición de acuerdo con la invención puede incluir un ingrediente activo que actúe sinérgicamente con la enzima de interés.

Depende de la elección de la persona experta que el ingrediente activo adicional esté presente en la composición que comprende el agente formador de película, o en la composición enzimática. Ciertos ingredientes activos, tales como un sustrato para la enzima de interés, están presentes preferiblemente en la composición que comprende el agente formador de película.

Preparaciones cosméticas específicas incluyen adicionalmente los componentes usuales.

La composición comprende un vehículo para permitir que el ingrediente activo sea transportado hasta la piel. Los vehículos pueden incluir agua, sólidos y líquidos. Éstos se clasifican como emolientes, emulsionantes, agentes tensioactivos, solubilizantes, propelentes, disolventes, humectantes, espesantes y polvos. La composición puede comprender adicionalmente un conservante para inhibir un crecimiento microbiano excesivo.

Los emolientes incluyen ácidos grasos de alquilo superior, aceites naturales, alcoholes grasos superiores, ésteres de glicerilo e isopropilo, aceites minerales, y ésteres de alcoholes grasos.

Los emulsionantes comprenden compuestos que tienen un valor HLB (balance hidrófilo/lipófilo) que se encuentra en las gamas inferiores o en las gamas superiores, es decir, compuestos que son capaces de formar una emulsión de agua en aceite o compuestos que son capaces de formar una emulsión de aceite en agua, respectivamente.

Los espesantes incluyen polisacáridos, gomas y polímeros que contienen grupo carboxílico.

Los polvos incluyen creta, talco y almidón.

El método de la invención es adecuado para cualquier forma de aplicación local, tanto en el campo cosmético como en el dermatológico, en la cual se requiera la acción de una enzima. El método de la invención es particularmente adecuado para aplicación local de una proteasa. Las proteasas se aplican típicamente en composiciones cosméticas por sus propiedades limpiadoras, suavizantes de la piel, anti-crecimiento de pelo y anti-acné.

Breve descripción de las figuras

Figuras 1 y 2. Envases para suministro de dos composiciones separadas.

Ejemplo 1 Eliminación de una proteasa por una película de PVA

Se preparó una formulación de proteasa mezclando primeramente 35 g de glicerol, 35 g de butilen-glicol, 15 mg de cloruro de calcio.1aq, 150 mg de ácido sórbico, 800 mg de Carbopol Ultrez 10 (BF Goodrich), 160 mg de MES (ácido 2-N-morfolino-etano-sulfónico) y 16 g de agua. A continuación, el pH de la mezcla se ajustó a 6,0 utilizando hidróxido de sodio 8N. Se disolvieron aproximadamente 500 mg de proteasa (Maxatase^{TM}, serina-proteasa alcalina de Bacillus subtilis, 2000 Unidades de proteasa/mg) en la mezcla descrita anteriormente y se ajustó el peso total a 100 g por adición de agua.

El polvo de Maxatase^{TM} (2,16 BYU/kg) se obtuvo de Genencor International (Brujas, Bélgica) y se purificó hasta homogeneidad utilizando cromatografía sobre una resina catiónica fuerte de tipo gel. La enzima se aplicó a la columna en acetato de sodio de concentración 30 mmol/l de pH 5,3, y se eluyó con citrato de sodio de concentración 100 mmol/l, de pH 5,8.

Aparte de la formulación de proteasa, se preparó una formulación de PVA por disolución de Mowiol 40-88 (Clariant) al 4% en agua.

Para ensayar la eliminación de la enzima proteasa por la película de PVA, se mezcló una parte de la formulación de proteasa con 9 partes de la formulación de PVA, y se pipetearon 4 ml de esta mezcla proteasa/PVA en un vaso de precipitados de vidrio. Después de incubación durante una noche a 40ºC, se había evaporado el agua y la película de PVA formada se eliminó del fondo del vaso de precipitados de vidrio. Después de la eliminación de la película, se enjuagó el vaso de precipitados de vidrio con 4 ml de una solución 50 mM de cloruro de sodio.

La formulación de proteasa, la mezcla proteasa/PVA no solidificada y el líquido de lavado se analizaron en cuanto a actividad de proteasa (por su capacidad para hidrolizar la caseína a pH 7). Los resultados se enumeran en la tabla 1.

TABLA 1: Actividad de proteasa de las diferentes muestras

Muestra	Contenido de proteasa
	(Unidades/g)
Formulación de proteasa	11.200
Mezcla proteasa/PVA	1.260
Líquido de lavado	< 4

Estos resultados indican claramente que la proteasa utilizada es activa en la solución de PVA y que la proteasa se inmoviliza eficazmente en el interior de la película secante de PVA.

Ejemplo 2 Eficiencia de la proteasa en una mezcla proteasa/PVA

Una parte alícuota de 50 \mul de la mezcla proteasa/PVA no solidificada como se describe en el Ejemplo 1 se puso sobre la capa de gelatina de una película fotográfica. Como muestra de referencia, se utilizó una mezcla de 1 parte de formulación de proteasa (véase Ejemplo 1) y 9 partes de agua destilada. La película con las dos muestras líquidas se incubó a 40ºC y la acción de la proteasa se inspeccionó visualmente después de diferentes tiempos de reacción. La aplicación de la mezcla proteasa/PVA así como la muestra de referencia dio como resultado un orificio completamente transparente en la capa de gelatina después de 15 minutos de tiempo de incubación. Así pues, la acción de la proteasa no se ve influenciada desfavorablemente por la presencia de PVA en la solución.

Ejemplo 3 Eliminación de la proteasa de la piel utilizando una película de PVA

Se preparó una formulación de proteasa mezclando primeramente 35 g de glicerol, 35 g de butilen-glicol, 15 mg de cloruro de calcio.1aq, 150 mg de ácido sórbico, 800 mg de hidroxietilcelulosa, 160 mg MES y 16 g de agua. A continuación se ajustó el pH de la mezcla a 6,0 utilizando hidróxido de sodio 8N. El peso total se ajustó a 100 g por adición de agua. Se disolvió en esta mezcla polvo de proteasa (serina-proteasa alcalina de Bacillus subtilis, 4345 Unidades de proteasa/mg) en una concentración de 10 mg/ml.

Se preparó una formulación de PVA al 4% disolviendo Mowiol 40-88 en agua. Se ajustó la viscosidad de esta formulación de PVA por adición de 0,8% de hidroxietilcelulosa (Natrosol®, Hercules), después de lo cual se ajustó el pH a 6,0. Se mezcló 1 parte de la formulación de proteasa con 9 partes de la formulación de PVA. Se aplicó aproximadamente 1 g de esta mezcla proteasa/PVA que contenía 4710 Unidades de proteasa sobre piel humana (10 cm^{2} de superficie).

Después de aproximadamente 45 minutos, el agua se había evaporado y pudo eliminarse de la piel una película de PVA. Después de la eliminación de la película, la piel tratada se enjuagó con 2 ml de un tampón MES 10 mM de pH 6,0 que contenía también cloruro de sodio 50 mM y 1 mg/ml de BSA. La mezcla proteasa/PVA y el líquido de enjuagado se analizaron en cuanto a actividad de proteasa, y los resultados se enumeran en la Tabla 2.

El ensayo de aplicación a la piel descrito anteriormente se llevó a cabo sobre dos puntos del antebrazo volar de tres personas de ensayo.

TABLA 2 Eliminación de la proteasa por PVA

Muestra	Punto	Proteasa	Proteasa
		residual	eliminada
		(Unidades)	(%)
Persona de ensayo 1	1	38	99,2
Persona de ensayo 1	2	36	99,2
Persona de ensayo 2	1	24	99,5
Persona de ensayo 2	2	30	99,4
Persona de ensayo 3	1	32	99,3
Persona de ensayo 3	2	26	99,4

Ejemplo 4 Eficiencia de las películas que contienen concentraciones altas de PVA

Los resultados de este experimento indican claramente que la película susceptible de desprendimiento es muy eficiente en la encapsulación de la enzima libre (en este caso proteasa) y por consiguiente minimiza la liberación de partículas de polvo de enzima.

Para minimizar el contenido de agua en las películas de PVA y aumentar la resistencia al desgarramiento de la película formada, se llevaron a cabo experimentos con calidades de PVA de viscosidad baja. Los materiales de partida fueron Mowiol 3-83 y Mowiol 4-88, ambos de Clariant. Después de pesar la cantidad deseada de PVA, el material seco se añadió a agua Milli-Q y se calentó bajo agitación constante a 70-80ºC hasta que el PVA se hubo disuelto por completo. Después de la adición suficiente de agua para alcanzar la concentración de PVA deseada, la solución se homogeneizó y se enfrió. El valor de pH de la solución resultante era aproximadamente 6.

El concentrado de enzima se preparó por disolución de polvo de proteasa purificado en tampón MES de 50 mmol/l, pH 6,0; NaCl 50 mmol/l y CaCl_{2} 2 mmol/l. Después de enfriar, cada una de las diversas soluciones de PVA se mezcló con el concentrado de enzima en una relación de 1 parte de concentrado por 10 partes de solución de PVA para alcanzar las concentraciones de PVA que se especifican en la Tabla 3. A continuación se determinaron la viscosidad, extensibilidad, tiempo de secado y actividad proteolítica de cada solución. La viscosidad se determinó en un viscosímetro Brookfield DV-III y se registró la viscosidad a 25ºC y 50 rpm (husillo SC 4-29). La eficiencia proteolítica en la mezcla de PVA se determinó por aplicación de partes alícuotas sobre una película fotográfica como se describe en el Ejemplo 2. El tiempo requerido para producir un orificio transparente en la capa de gelatina a 40ºC se utilizó como indicación de la actividad proteolítica (período de incubación corto requerido = actividad alta; período de incubación largo requerido = actividad baja). Los datos obtenidos se muestran en la Tabla 3.

TABLA 3

Mowiol	Viscosidad	Tiempo de	Extensibilidad	Actividad
Tipo	%(p/p)	(mPas)	secado (min)		proteolítica
	10	10 \pm 3	-	-	10 min
	20	135 \pm 3	15	muy delgada	10 min
3-83	25	308 \pm 24	16	razonable	10 min
	30	966 \pm 40	20	satisfactoria	20 min
	35	3148 \pm 51	25	moderada	20 min
	40	7961 \pm 33	20	mala	20 min

TABLA 3 (Continuación)

Mowiol	Viscosidad	Tiempo de	Extensibilidad	Actividad
Tipo	%(p/p)	(mPas)	secado (min)		proteolítica
	10	19 \pm 3	-	-	10 min
	20	266 \pm 20	20	muy delgada	10 min
4-88	25	551 \pm 18	15	razonable	10 min
	35	2953 \pm 62	15	moderada	20 min
	35	8215 \pm 58	20	mala	20 min
	40	25017	25	mala	20 min

Las concentraciones de PVA comprendidas entre 25 y 35% producen una mezcla finamente extensible. La adición de un espesante adicional no es necesaria en estas condiciones. Lo más importante es que en estas condiciones con bajo contenido de agua el tiempo de secado de la película es muy corto, mientras que la actividad proteolítica de la mezcla se ve escasamente empeorada.

Ejemplo 5 Eliminación de la enzima utilizando una formulación de PVA optimizada

Aparte de incrementar el contenido de PVA de la formulación, puede incorporarse un disolvente que se evapora rápidamente, como por ejemplo etanol, para acelerar la formación de la película de PVA. Adicionalmente, la adición de agentes tensioactivos suaves, tales como por ejemplo Tween 20 (ICI), puede aumentar aún más la extensibilidad de la formulación sobre la piel (v.g. humectación mejorada) y aumentar por consiguiente la eliminación de la proteasa de la piel.

Una de las formulaciones básicas de PVA seleccionadas (es decir sin concentrado de enzima añadido) contenía:

\sqbullet Mowiol 3-83	28% (p/p)
\sqbullet Etanol	10% (p/p)
\sqbullet Tween 20	1% (p/p)
\sqbullet Agua Milli-Q	hasta 100

Se añadió etanol después de la disolución completa y enfriamiento de la formulación Mowiol/Tween. Subsiguientemente, se añadió el concentrado de enzima en una relación 1 a 10 como se describe en el Ejemplo 4. Después de mezclar cuidadosamente, se aplicó la mezcla total en capa delgada sobre la piel (antebrazo volar) de seis personas de ensayo. Como referencia, se preparó una solución que contenía 0,7% de hidroxietilcelulosa y un nivel similar de proteasa en agua Milli-Q y se aplicó también sobre la piel de las personas de ensayo.

Los resultados obtenidos con el PVA y la solución de hidroxietilcelulosa demostraron que más del 99% de toda la proteasa aplicada se eliminaba por arrancamiento de la película seca de PVA de la piel.

Esto implica una reducción drástica del riesgo de sensibilización alérgica impuesto por los materiales cosméticos enzimáticamente activos, aun cuando la enzima utilizada se encuentre en una forma no inmovilizada.

Claims

1. Un método para aplicación local de una enzima, comprende el método los pasos de preparar una composición que comprende la enzima-agente formador de película, aplicar localmente la composición, incubar la composición en el sitio de aplicación durante un periodo de tiempo que es suficiente para permitir la formación de una película susceptible de desprendimiento que incorporará enzima, y eliminar la película que incorporará enzima del sitio de aplicación.

2. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la composición que comprende la enzima y el agente formador de película se prepara por mezcla de una primera composición que comprende la enzima y una segunda composición que comprende el agente formador de película.

3. El método de la reivindicación 2, caracterizado porque la aplicación local de la composición que comprende la enzima y el agente formador de película se realiza por utilización de un sistema de dispensación de componentes dual.

4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque como agente formador de película se hace uso de un poli(alcohol vinílico).

5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque como enzima se hace uso de una proteasa.

6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque la composición de enzima es una composición acuosa que contiene la enzima en una forma solubilizada.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque la composición comprende una cantidad de un agente estabilizador de poliol para la enzima.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque la composición contiene 50-90% en peso del agente estabilizador de poliol.

9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque se elimina al menos 90% de la enzima cuando se elimina la película que incorpora la enzima.

10. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que es un método para aplicación cosmética.