ES2204913T3

ES2204913T3 - Metodo para formacion de oligonucleotidos.

Info

Publication number: ES2204913T3
Application number: ES94914046T
Authority: ES
Inventors: Robert L. Letsinger; Sergei M. Gryaznov
Original assignee: Northwestern University
Current assignee: Northwestern University
Priority date: 1993-04-12
Filing date: 1994-04-06
Publication date: 2004-05-01
Anticipated expiration: 2014-04-06
Also published as: JP2004129672A; EP0695305B1; DE69433010T2; JP3593344B2; CA2160016C; EP0695305A4; AU684279B2; JP2005015490A; JP4079875B2; EP0695305A1; CA2160016A1; WO1994024143A1; DE69433010D1; ATE246702T1; AU6626694A; JPH08508998A; US5476930A

Abstract

SE PRESENTA UN METODO PARA LA FORMACION DE UN OLIGONUCLEOTIDO, CUYO METODO CONSISTE EN COLOCAR EN SOLUCION AL MENOS DOS OLIGONUCLEOTIDOS EN SOLUCION ACUOSA EN DONDE UNO DE LOS OLIGONUCLEOTIDOS INCLUYE UN GRUPO {AL}-HALOACILO Y EL OTRO DE LOS NUCLEOTIDOS INCLUYE UN GRUPO FOSFOTIOATO Y ENLAZAR COVALENTEMENTE LOS OLIGONUCLEOTIDOS ENTRE SI A TRAVES DEL GRUPO {AL}-HALOACILO Y EL GRUPO FOSFOTIOATO FORMANDO ESPONTANEAMENTE UN GRUPO TIOFOSFORILACETILAMINO ENTRE ELLOS.

Description

Método de formación de oligonucleótidos.

Sector técnico

La presente invención se refiere a un método de formación de oligonucleótidos y más específicamente a métodos que tienen utilidad como métodos terapéuticos nuevos potenciales para tratar virosis, cáncer, trastornos genéticos y otros, así como aplicaciones diagnósticas de oligonucleótidos.

Antecedentes de la invención

Los oligonucleótidos antisentido han demostrado un potencial como tipos nuevos de agentes terapéuticos para tratar enfermedades y trastornos tales como virosis, cáncer, trastornos genéticos, así como otras enfermedades y trastornos^{1}. Se ha llevado a cabo una amplia investigación y la misma continúa en laboratorios industriales y académicos para explorar este potencial^{2}.

Un problema que se ha observado con el planteamiento de la utilización de oligonucleótidos antisentido como agentes terapéuticos está relacionado con la selectividad de los agentes in vivo. A la vista de las bajas concentraciones objetivo de polinucleótidos intracelulares y las bajas concentraciones de oligonucleótidos terapéuticos que se pueden introducir en células, se reconoce que existe una necesidad de oligonucleótidos con altas afinidades de unión. La afinidad de unión está relacionada con la longitud de los oligonucleótidos, preferentemente 20 meros y mayor. Aunque, en el caso de oligonucleótidos largos, una desadaptación en el apareamiento de bases es menos desestabilizador que en el caso de un oligonucleótido corto. Por lo tanto, el efecto desestabilizador deseado se reduce con el uso de oligonucleótidos más largos mientras que la selectividad aumenta.

Expertos han indicado que una "especificidad de secuencia alta" y una "afinidad alta" son demandas contradic-
torias^{3}. Además se ha concluido que basándose en el nivel al que los oligonucleótidos antisentido pueden provocar disociación de ARNs en lugares objetivo adaptados de forma imperfecta, en sistemas que se probaron, probablemente no fue posible obtener una disociación específico de un ARN objetivo deseado sin provocar también por lo menos la destrucción parcial de muchos ARNs que no eran objetivo^{4}. Por ello, expertos en el sector, basándose en la investigación realizada, han concluido que los requisitos en conflicto de especificidad y afinidad son obstáculos importantes a superar.

Se ha informado sobre varios métodos para unir mediante enlaces covalentes bloques de oligonucleótidos en medios acuosos^{5a-1}. Todos estos métodos requieren que un agente químico adicional genere un producto ligado estable. Dependiendo del planteamiento, el reactivo añadido puede ser un "agente activador" tal como carbodiimida soluble en agua o cianoimidazol^{5a-k} o puede ser un agente reductor tal como cianoborohidruro de sodio^{51}. En cualquiera de los casos, la necesidad del tercer reactivo impide una ligazón química in vivo ya que dichos compuestos son tóxicos, reaccionan con agua, y no se podrían introducir en sistemas vivos en cantidades suficientes como para provocar la reacción de acoplamiento deseada.

La presente invención proporciona un método novedoso para unir mediante enlaces covalentes bloques de oligonucleótidos presentes en bajas concentraciones en un medio acuoso sin la necesidad de un reactivo adicional de condensación o estabilización. De este modo se crean expectativas de una ligazón química in situ en sistemas vivos. Como las reacciones se aceleran fuertemente en presencia de una secuencia de oligonucleótidos complementarios, en principio se deberían poder formar cadenas largas de oligonucleótidos selectivamente in vivo cuando hay presente un polinucleótido objetivo (por ejemplo, m-ARN o ADN de una célula viral o cancerosa) que contiene secuencias consecutivas de nucleótidos complementarios con las cadenas de oligonucleótidos individuales. Por esta razón, las cadenas largas de oligonucleótidos, que se enlazan con una alta afinidad, se generarían in situ a partir de cadenas más cortas que se enlazan con una afinidad menor, cuando está presente el polinucleótido objetivo. De este modo la presente invención podría resolver el problema del conflicto de conseguir una alta afinidad así como una alta especificidad, en aplicaciones terapéuticas y también diagnósticas.

Resumen de la invención

Según la presente invención se proporciona un método de formación de un oligonucleótido uniendo de forma irreversible mediante enlaces covalentes por lo menos dos oligómeros que están unidos entre sí de forma reversible mediante enlaces de hidrógeno en posiciones contiguas en un polinucleótido objetivo que contiene una secuencia de bases de nucleósidos complementaria con las secuencias del par de oligómeros, en donde uno de los oligonucleótidos incluye un nucleótido que tiene un primer grupo reactivo que comprende un bromoacetilamino contiguo a un nucleótido del otro oligómero que incluye un segundo grupo reactivo que comprende fosforotioato capaz de formar espontáneamente un enlace de tiofosforilacetilamino covalente con el primer grupo reactivo. Los oligonucleótidos están unidos juntos por enlaces covalentes a través del primer y el segundo grupos reactivos que se han aproximado entre sí al unir los oligonucleótidos en el polinucleótido.

La presente invención proporciona además el uso de por lo menos un primer y un segundo oligonucleótidos para preparar un medicamento o una sonda de oligonucleótidos, para terapia o diagnosis, caracterizada porque:

dicho primer oligonucleótido comprende una pluralidad de unidades base de nucleótidos y tiene un primer grupo reactivo que comprende un bromoacetilamino terminal 3' o 5', siendo dichas unidades base de nucleótidos de dicho primer oligonucleótido sustancialmente complementarias con respecto a una primera secuencia de unidades base de un oligonucleótido o polinucleótido objetivo;

dicho segundo oligonucleótido comprende una pluralidad de unidades base de nucleótidos y tiene un segundo grupo reactivo que comprende un fosforotioato terminal 5' o 3', siendo dichas unidades base de nucleótidos de dicho segundo oligonucleótido sustancialmente complementarias con respecto a una segunda secuencia de unidades base del oligonucleótido o polinucleótido objetivo, en donde dichas primera y segunda secuencias de bases están en posiciones contiguas del oligonucleótido o polinucleótido objetivo;

de tal manera que dichos primer y segundo oligonucleótidos se pueden unir de forma reversible a dichas posiciones contiguas de dicho oligonucleótido o polinucleótido objetivo, con lo cual dicho primer y segundo grupos reactivos se aproximan entre sí de manera que se puede formar espontáneamente un enlace de tiofosforilacetilamino covalente entre dicho bromoacetilamino 3' o 5' de dicho primer oligonucleótido, y dicho fosforotioato 5' o 3' de dicho segundo oligonucleótido, en ausencia de un reactivo añadido.

Breve descripción de las figuras

Se apreciarán fácilmente otras ventajas de la presente invención a medida que la misma se comprenda mejor haciendo referencia a la siguiente descripción detallada cuando se considere en relación con los dibujos adjuntos en los cuales:

la Figura 1 muestra el acoplamiento de dos oligómeros cortos según la presente invención utilizando un molde objetivo;

la Figura 2 muestra la sencilla reacción de un fosforotioato de oligonucleótidos con un derivado de un oligonucleótido de \alpha-haloacilo según la presente invención;

la Figura 3 muestra los resultados de una cromatografía líquida de alta resolución con intercambio iónico (IE HPLC) de productos del experimento 1 en la que: A, después de 2 horas en disolución a 0ºC; B, después de 2 días a 0ºC; y C, después de la etapa final en la que la disolución se congeló y se almacenó a -18ºC durante 5 días, los picos a aproximadamente 17, 21 y 24 minutos se corresponden respectivamente con los compuestos 1, 2, y 3.

La Figura 4 muestra la IE HPLC de productos de un segundo experimento (con congelación, siempre a -18ºC) en la que: A, después de 2 horas en disolución a 0ºC; B, después de 2 días a 0ºC; y C, después de: A, 5 horas; B, 2 días; y C, 5 días, correspondiéndose los picos a aproximadamente 17, 21 y 24 minutos con los compuestos 1, 2, y 3, y correspondiéndose el pico a 27 minutos con el derivado dimérico del compuesto 2 producido por oxidación por aire; y

la Figura 5 muestra lo siguiente: A, IE HPLC de productos de la reacción de los compuestos 1 y 2 en presencia del molde 4 a 0ºC después de 2 horas, correspondiéndose las picos principales con el producto 3 de acoplamiento y el molde 4, observándose que el compuesto 1 (pico a 17 minutos) se ha consumido casi completamente; B, los mismos productos después de un tratamiento con KI_{3} seguido por Ditiotreitol (DTT); observándose que el compuesto 3 ha sido sustituido por dos productos de disociación de oligonucleótidos, que surgen a los 18 y 22 minutos.

Descripción detallada de la invención

Según la presente invención se proporciona un método de formación de un oligonucleótido en general mediante las etapas de disposición de por lo menos dos oligonucleótidos en disolución acuosa en la que uno de los oligonucleótidos incluye un grupo bromoacetilamino y el otro de los nucleótidos incluye un grupo fosforotioato y a continuación la unión mediante enlaces covalentes de los oligonucleótidos juntos a través del grupo y los grupos fosfotioato formando espontáneamente un grupo tiofosforilacetilamino entre ellos.

Este método aprovecha el hecho de que la reacción de acoplamiento descrita en el presente documento es muy lenta en disoluciones acuosas diluidas aunque es rápida en presencia de un polinucleótido molde. Es decir, la reacción se acelera en presencia de un polinucleótido objetivo que posee la sección de secuencia complementaria con respecto a los oligómeros sonda. La presente invención utiliza como agente terapéutico dos oligómeros cortos (por ejemplo, de 8 a 20 meros) que se unirán juntos espontáneamente mediante enlaces covalentes después de la unión en posiciones contiguas en el polinucleótido objetivo. Con este sistema, se produce una aproximación a las propiedades de afinidad de unión y de reconocimiento de una sonda de oligómeros más larga tal como entre 16 y 40 meros, aunque se mantienen las características de dependencia y de apareamiento de bases de las sondas más cortas (de 8 a 20 meros). En otras palabras, la presente invención proporciona la especificidad de polinucleótidos más cortos aunque posee el efecto de polinucleótidos más largos.

Es inherente a la presente invención la necesidad y el uso de polinucleótidos que incluyen grupos reactivos que reaccionarán espontáneamente para formar un enlace covalente entre ellos cuando los grupos estén en proximidad espacial mutua. Específicamente, la presente invención utiliza por lo menos dos oligonucleótidos en los que un conjunto de oligonucleótidos incluye el primer grupo reactivo y el segundo conjunto de oligonucleótidos incluye el segundo grupo reactivo de tal manera que al aproximarse entre ellos, los grupos reaccionarán espontáneamente para formar un enlace covalente estable. La presente invención utiliza un grupo bromoacetilamino y un grupo tiofosforilo, que forman un puente tiofosforilacetilamino de forma eficaz, selectiva e irreversible en medios acuosos diluidos. Tal como se demuestra posteriormente, los productos son estables en agua y se hibridan bien con polinucleótidos complementarios.

A concentraciones oligoméricas bajas, tales como menores de 1 \muM, y en ausencia de un molde complementario las reacciones son muy lentas aunque se pueden llevar a cabo con una conversión elevada en pocos días congelando la disolución. Las técnicas de congelamiento se describen de forma detallada posteriormente. El acoplamiento es bastante rápido (una conversión mayor del 90% en 20 minutos) cuando se lleva a cabo en disolución en presencia de un oligonucleótido complementario que sirve como molde, tal como se muestra posteriormente en la sección de Ejemplos.

La selectividad también es una preocupación importante en aplicaciones diagnósticas de la presente invención y en general en el uso de oligonucleótidos. Las mismas características de la presente invención que hacen que la química novedosa de la presente invención resulte atractiva para aplicaciones terapéuticas también la hacen atractiva para usos diagnósticos. Por ejemplo, la presente invención se podría utilizar en un sistema diagnóstico de la manera siguiente.

Haciendo referencia a la Figura 1, A es un oligómero que consiste en, por ejemplo, un elemento de 10 meros que porta un marcador (*) en la cadena y un grupo bromoacetilamino en el terminal 3'. B es otro oligómero corto con un grupo tiofosforilo en el extremo 5'. C es una secuencia de oligonucleótidos objetivo con una secuencia complementaria con respecto a A + B. Si en disolución diluida el acoplamiento de A y B es suficientemente lento en ausencia del molde, con respecto al acoplamiento en presencia del molde, únicamente será significativo el acoplamiento en el molde. De este modo este sistema de ligazón química se podría utilizar en amplificación y detección de forma análoga al sistema de ligazón enzimática (Reacción en Cadena de la Ligasa, o LCR). Tiene el potencial para ser superior ya que algún acoplamiento no específico introduce una fuente de error en el esquema enzimático. El hecho de que a concentraciones muy bajas de oligonucleótidos (es decir, en la gama de interés en aplicaciones diagnósticas) la velocidad de la ligazón química en ausencia de molde resulte extremadamente lenta indica que el acoplamiento no referido a un molde podría tener poca importancia en este caso.

Ejemplos

Tal como se muestra en la Figura 2, la ligazón indicada en la ecuación 1 para los oligómeros 1 y 2 aprovecha la reacción sencilla de un fosforotioato con un derivado del \alpha-haloacilo.

Específicamente, el compuesto 1 (Sec. ID 1) en la Figura 2 tiene una unidad 3'-(bromoacetilamino)-3'-deoxitimidina en el terminal 3'. Para la preparación del compuesto 1, a 4,9 unidades A_{260} del precursor del 3'-aminodeoxirribo -oligonucleótido, ACACCCAATT-NH_{2}, se le añadieron 15 \muL de bromoacetato de N-succinimidilo acuoso 0,4 M (obtenido de Calbiochem). El método de preparación está descrito por Gryaznov et al., 1992^{6}. La reacción se llevó a cabo en 10 \muL de tampón de borato de sodio 0,2 M a temperatura ambiente. Después de 35 minutos, la mezcla se diluyó con 0,5 mL de agua, se desaló mediante filtración por gel en una columna NAP-5 (producida por Pharmacia), y se purificó por cromatografía líquida de alta presión RP HPLC y se desaló nuevamente, obteniéndose 4 unidades A_{260} del compuesto 1. Los tiempos de elución son los siguientes: RP HPLC, 17,4 minutos; IE HPLC, 17,4 minutos.

La IE HPLC llevada a cabo anteriormente y todos los procedimientos similares llevados a cabo posteriormente se realizaron en una columna Dionex Omni Pak NA100 de 4x250 mm con un pH 12 (hidróxido sódico 10 mM) con un gradiente del 2% por minuto de cloruro sódico 1,0 M en hidróxido sódico 10 M. Para la RP HPLC, se utilizó una columna Hypersil ODS (4,6x200 mm) con un gradiente del 1% por minuto de acetonitrilo en un tampón de acetato de trietilamonio 0,03 M con un pH 7,0.

El compuesto 2 (Sec. ID 2) se sintetizó a una escala de 1 \mumoles en un Sintetizador de ADN Milligen/Biosearch Cyclone utilizando 5'-dimetoxitritil-N -isobutilrildeoxi-guanosina soportada por LCAA CPG. Se utilizó la química de la fosforamidita de cianoetilo estándar. Cuando se completó el alargamiento de la cadena, el grupo 5'-hidroxilo terminal se fosfitiló (5 minutos) con 150 \muL de una disolución 0,1 M del reactivo "Phosphate ON^{TM}" (de Cruachem) en acetonitrilo y 150 \muL de tetrazol 0,5 M en acetonitrilo. El fosfito resultante se sulfuró por tratamiento con una disolución al 5% de azufre en piridina/disulfuro de carbono (1:1, v/v, 45 minutos a temperatura ambiente). Después de la disociación del grupo DMT (DCA al 3% en diclorometano, 1,5 minutos) se obtuvo el polímero soportado como en el caso del compuesto 1.

En la preparación de los conjugados colorante-oligonucleótido se ha utilizado la reacción de un oligonucleótido de tiofosforilo con un derivado haloacetilaminoaromático en DMS^{0} y agua^{7}.

Dependiendo del uso de la invención y de la cinética deseada, el acoplamiento de los oligonucleótidos se puede llevar a cabo bien en disolución acuosa, en un estado congelado en hielo, o bien en una disolución acuosa en presencia de un molde, tal como se ha descrito anteriormente y tal como se ejemplifica posteriormente.

En un experimento inicial, se preparó y se mantuvo a 0ºC durante 5 días 1,0 mL de una disolución (pH 7,05, fosfato 15 mM, NaCl 85 mM) que contenía los compuestos 1 (0,39 unidades A_{260}, 4 \muM) y 2 (0,41 unidades A_{260}, 4 \muM). La disolución se calentó a 50ºC durante 2,5 horas, y finalmente se congeló y almacenó a -18ºC durante 5 días adicionales. Un análisis por IE HPLC de muestras después de 2 horas y 48 horas mostró la formación de un producto con una elución más lenta, el oligómero 3 (Figura 2), con rendimientos de aproximadamente el 25% y el 80%, respectivamente. No se observó ningún cambio significativo después de los 3 días adicionales a 0ºC o el calentamiento a 50ºC. No obstante, la reacción prosiguió adicionalmente en el estado congelado, consiguiendo una conversión elevada en el compuesto 3 (Sec. ID 3) en 5 días tal como se muestra en la Figura 3. El alcance mejorado de la reacción en la matriz de hielo se puede atribuir a la alta concentración local de los reactantes de los oligonucleótidos dentro de las cavidades en el hielo. Se han llevado a cabo otras reacciones de forma similar en una matriz de hielo^{8}.

A la vista de este resultado, se congeló directamente y se mantuvo a -18ºC una mezcla equimolar de los compuestos 1 y 2 (2 \muM cada uno) en el mismo tampón. Los perfiles HPLC obtenidos de las muestras después de 5 horas y diariamente después de esta última muestran una progresión para proporcionar un alto rendimiento de 3 en 5 días, mostrando la Figura 4 datos representativos.

En la Figura 5 se presentan datos correspondientes al acoplamiento de los compuestos 1 y 2 en disolución en presencia de un molde oligonucleótido complementario (CCATTTTCAGAATTGGGTGT, compuesto 4 (Sec. ID 4)). El sistema era el mismo que en el primer experimento excepto que también estaba presente el molde 4 (4 \muM). En este caso la reacción prosiguió hasta finalizar >90% en 20 minutos y se completo esencialmente en 2 horas.

La estructura asignada al compuesto 3 está apoyada por las propiedades de un compuesto modelo (T-NHC(O)CH_{2}-SP(O)(O^{-})O-T, preparado en disolución a una escala mayor que la utilizada para el compuesto 3), por la movilidad del compuesto 3 en electroforesis en gel (Rm 0,58, en comparación con Rm 0,89, 0,95, y 0,61 para los compuestos 1, 2, y 4, respectivamente), y por la estabilidad del complejo formado con el oligonucleótido complementario, 4. Referencias anteriores, tiempo de retención, RP HPLC 10,5 minutos; espectro de masas FAB^{+}, M+H^{+} 620, M+Na^{+} 642; ^{31}P NMR, 8 en D_{2}O, 18,7 ppm, han dado a conocer características para el grupo alquiltiofosfato^{9}.

Los valores Rm son relativos al azul de bromofenol en un gel 20% poliacrilamida/5% bis acrilamida. El valor Tm, 56ºC en NaCl 0,1 M, se aproxima al del complejo formado a partir del elemento de 20 meros totalmente de fosfodiéster y el compuesto 4 (60ºC)^{10} y difiere de forma significativa con respecto a los valores de los complejos formados a partir de los compuestos 1 ó 2 con el compuesto 4 (37ºC y 31ºC). Adicionalmente, al producirse la oxidación con el KI_{3}^{9} (Figura 5) se observó que el enlace del internucleótido -NH(CO)CH_{2}SP(O)(O^{-})- se disociaba selectivamente. Más específicamente, el elemento dúplex que contenía los compuestos 3 y 4 (cada uno 0,3 unidades A_{260}) en 100 \muL de agua se trató con 100 \muL de KI_{3} acuoso 0,2 M durante 15 minutos a 50ºC. A continuación, a la disolución se le añadieron 10 \muL de DTT acuoso 1 M. Después de 5 minutos la mezcla se desaló en una columna NAP-5 y fue analizada por IE HPLC. La experimentación mencionada proporciona pruebas de que la presente invención presenta una química novedosa que proporciona unos medios adecuados para acoplar de forma selectiva e irreversible oligonucleótidos en disolución acuosa en la gama de una concentración oligomérica 4 \muM o mayor. Los productos han demostrado que son estables en disolución neutra y durante unas pocas horas incluso con un pH 12 a temperatura ambiente. Con concentraciones inferiores a 1 \muM, la velocidad en la fase líquida resulta extremadamente lenta. No obstante, las reacciones se pueden realizar hasta completarse casi totalmente en el estado congelado. La velocidad de acoplamiento se ve acelerada notablemente por la presencia de un molde oligonucleótido complementario. Estas propiedades proporcionan un potencial en el diseño de sistemas de amplificación química y ligazón in situ en aplicaciones antisentido así como en la construcción de estructuras complejas a partir de bloques de oligonucleótidos sobre la base de la química conocida.

Referencias

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2. Proceedings, International Conference on Nucleic Acid Medical Applications, Cancún, México, Enero 26-30, 1993; P.O.P. Ts'o y P.S. Miller, Organizadores, John Hopkins University, Baltimore, M.D.

3. Proceedings, International Conference on Nucleic Acid Medical Applications, Cancún, México, Enero, 1993, pg. 60.

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE: Letsinger, Robert L.

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Gryaznov, Sergei M.

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MÉTODO DE FORMACIÓN DE OLIGONUCLEÓTIDOS

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 4

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(iv): DIRECCIÓN POSTAL:

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(A): DESTINATARIO: Reising, Ethingthon, Barnard, Perry & Milton

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(B): CALLE: Apdo. de correos 4390

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(C): CIUDAD: Troy

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(D): ESTADO: Michigan

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(E): PAÍS: USA

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(F): CÓDIGO POSTAL: 48099

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(v): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A): TIPO DE SOPORTE: Disco floppy

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(B): ORDENADOR: PC IBM compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25

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(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/046,032

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(B): FECHA DE REGISTRO: 12-ABR-1993

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(C): CLASIFICACIÓN:

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(viii): INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

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(A): NOMBRE: Kohn, Kenneth I.

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(B): NÚMERO DE REGISTRO: 30.955

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(C): NÚMERO DE REFERENCIA/SUMARIO: NU9310

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(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

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(A): TELÉFONO: (313) 689-3554

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(B): TELEFAX: (313) 689-4071

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº DE ID:1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 11 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE CADENA: ambos

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(D): TOPOLOGÍA: ambas

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(ix): PRESENTACIÓN:

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(A): NOMBRE/CLAVE: misc_difference

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(B): UBICACIÓN: replace(1..11, '''')

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(D): OTRA INFORMACIÓN: /note= "N es un grupo bromoacetilamino"

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº DE ID:1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

ACACCCAATT N

\hfill

11

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº DE ID:2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico.

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(C): TIPO DE CADENA: ambos

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: ambas

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): PRESENTACIÓN:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_difference

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: replace(1..2, '''')

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /note= "N es un grupo tiofosforilo"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº DE ID:2:

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\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

NCTGAAAATG G

\hfill

11

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº DE ID:3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE CADENA: ambos

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: ambas

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): PRESENTACIÓN:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_difference

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: replace(11..12, '''')

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /note= "NN es un grupo tiofosforilacetilamino"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº DE ID:3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

ACACCCAATT NNCTGAAAAT GG

\hfill

22

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº DE ID:4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: ambos

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: ambas

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.666000\baselineskip

(ix): PRESENTACIÓN:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.333000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1..20

\vskip0.333000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /note= "Complementaria con respecto a la Sec. 3 sin NN"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº DE ID:4:

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\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

CCATTTTCAG AATTGGGTGT

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20

Claims

1. Uso de por lo menos un primer y un segundo oligonucleótidos para preparar un medicamento o una sonda de oligonucleótidos, para terapia o diagnosis, caracterizada porque:

de tal manera que dichos primer y segundo oligonucleótidos se pueden unir de forma reversible a dichas posiciones contiguas de dicho oligonucleótido o polinucleótido objetivo, con lo cual dichos primer y segundo grupos reactivos se aproximan entre sí de manera que se puede formar espontáneamente un enlace de tiofosforilacetilamino covalente entre dicho bromoacetilamino 3' o 5' de dicho primer oligonucleótido y dicho fosforotioato 5' o 3' de dicho segundo oligonucleótido, en ausencia de un reactivo añadido.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que cada uno de dichos primer y segundo oligonucleótidos consta esencialmente de 8 a 20 bases de nucleótidos.

3. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho bromoacetilamino se proporciona en el terminal 3' de dicho primer oligonucleótido y dicho fosforotioato se proporciona en el terminal 5' de dicho segundo oligonucleótido.

4. Uso según la reivindicación 3, en el que dicho primer oligonucleótido es ACACCCAATT - NHC(=O)CH_{2}Br y dicho segundo oligonucleótido es SPO_{3} - CTGAAAATGG.

5. Producto que comprende por lo menos un primer y un segundo oligonucleótidos para ser utilizado como medicamento o sonda de oligonucleótidos, caracterizado porque:

6. Producto según la reivindicación 5, en el que cada uno de dichos primer y segundo oligonucleótidos consta esencialmente de 8 a 20 bases de nucleótidos.

7. Producto según la reivindicación 5 ó 6, en el que dicho bromoacetilamino se proporciona en el terminal 3' de dicho primer oligonucleótido y dicho fosforotioato se proporciona en el terminal 5' de dicho segundo oligonucleótido.

8. Producto según la reivindicación 7, en el que dicho primer oligonucleótido es ACACCCAATT - NHC(=O)CH_{2}Br y dicho segundo oligonucleótido es SPO_{3} - CTGAAAATGG.

9. Método de formación, in vitro, de una sonda diagnóstica de oligonucleótidos, comprendiendo dicho método:

(a): la unión reversible de por lo menos un primer y un segundo oligonucleótidos a posiciones contiguas de un oligonucleótido o polinucleótido objetivo, en el que

: dicho primer oligonucleótido comprende una pluralidad de unidades base de nucleótidos y tiene un primer grupo reactivo que comprende un bromoacetilamino terminal 3' o 5', siendo dichas unidades base de nucleótidos de dicho primer oligonucleótido sustancialmente complementarias con respecto a una primera secuencia de unidades base de dicho oligonucleótido o polinucleótido objetivo, y

: dicho segundo oligonucleótido comprende una pluralidad de unidades base de nucleótidos y tiene un segundo grupo reactivo que comprende un fosforotioato terminal 5' o 3', siendo dichas unidades base de nucleótidos de dicho segundo oligonucleótido sustancialmente complementarias con respecto a una segunda secuencia de unidades base de dicho oligonucleótido o polinucleótido objetivo, en donde dichas primera y segunda secuencias de bases están en posiciones contiguas de dicho oligonucleótido o polinucleótido objetivo;

(b): la unión por medio de enlaces covalentes de dichos primer y segundo oligonucleótidos juntos a través de la aproximación mutua del primer y el segundo grupos reactivos al unirse dichos oligonucleótidos a dicho oligonucleótido o polinucleótido objetivo para formar espontáneamente un enlace de tiofosforilacetilamino, en ausencia de un reactivo añadido.

10. Método según la reivindicación 9, en el que las etapas (a) y (b) se producen en disolución acuosa.

11. Método según la reivindicación 9 ó 10, en el que cada uno de dichos primer y segundo oligonucleótidos consta esencialmente de 8 a 20 bases de nucleótidos.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que dicho bromoacetilamino se proporciona en el terminal 3' de dicho primer oligonucleótido y dicho fosforotioato se proporciona en el terminal 5' de dicho segundo oligonucleótido.

13. Método según la reivindicación 12, en el que dicho primer oligonucleótido es ACACCCAATT - NHC(=O)CH_{2}Br y dicho segundo oligonucleótido es SPO_{3} - CTGAAAATGG.