ES2205012T3 - Nuevo procedimiento combinado para la purificacion de clorhidrato de vancomicina. - Google Patents
Nuevo procedimiento combinado para la purificacion de clorhidrato de vancomicina.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION DESCRIBE UN NUEVO PROCEDIMIENTO PARA PURIFICA RCLORHIDRATO DE VANCOMICINA MEDIANTE LA COMBINACION DE CROMATOGRAFIA PREPARATIVA SOBRE UNA COLUMNA DE GEL DE SILICE Y LA PRECIPITACION CON ETANOL A PARTIR DE UNA SOLUCION DE SAL-AGUAETANOL SIN FILTRACION INTERMEDIA, MEJORANDO ASI LA PUREZA CROMATOGRAFICA DEL PRODUCTO. LA CROMATOGRAFIA SE REALIZA SOBRE UNA COLUMNA QUE CONTIENE UNA FASE ESTACIONARIA DE GEL DE SILICE Y UNA FASE MOVIL ACUOSA A PH, FLUJO DE LA FASE MOVIL, TEMPERATURA, CANTIDAD Y CONCENTRACION DE CLORHIDRATO DE VANCOMICINA DEFINIDOS. DICHO PROCEDIMIENTO SE CARACTERIZA POR SU RENDIMIENTO Y PUREZA CROMATOGRAFICA DEL PRODUCTO OBTENIDO DE APROX. EL 93 % DE LA SUPERFICIE. EL CLORHIDRATO DE VANCOMICINA PURIFICADO DE ACUERDO CON LA PRESENTE INVENCION ES UTIL PARA LA ADMINISTRACION POR VIA PERORAL O PARENTERAL, YA QUE LA FRACCION DE IMPUREZAS QUE CONTIENE ES INFERIOR EN UN TERCIO A LA DE LOS PRODUCTOS DISPONIBLES HASTA EL MOMENTO.
Description
Nuevo procedimiento combinado para la
purificación de clorhidrato de vancomicina.
Clasificación Internacional de Patente: C 07 K
9/10: C 07 K 3/20; C 07 K 3/24; C 07 K 3/28.
La presente invención se refiere a un nuevo
proceso para la purificación de hidrocloruro de vancomicina, que
combina la cromatografía preparatoria en una columna de gel de
sílice que contiene una fase móvil de agua
alcalina-metanol y la precipitación con etanol a
partir de una solución de agua salina-etanol, con lo
que se consigue una mejor pureza cromatográfica del producto,
haciéndolo disponible tanto para administración peroral como
parenteral.
La vancomicina es un antibiótico glicopéptido
anfotérico tricíclico en forma de sal (hidrocloruro) que tiene la
fórmula empírica C_{66}H_{75}Cl_{2}N_{9}O_{24}.HCl y un
peso molecular de 1,486. La preparación de vancomicina por
fermentación de los microorganismos Amycolatopsis orientalis
(anteriormente Nocardia orientalis) se describe con mayor
detalle en la patente US 3.067.099 (presentada en 1995) y en la WO
91/08.300 (presentada en 1990). El hidrocloruro de vancomicina
liofilizado tiene un color blanquecino y con agua forma una
solución transparente que tiene un pH entre 2,5 y 4,5.
El hidrocloruro de vancomicina se utiliza en
particular para el tratamiento inicial de infecciones importantes o
graves causadas por estafilococos resistentes a los antibióticos de
\beta-lactama así como en pacientes que son
sensibles a la penicilina o no responden a penicilinas y
cefalosporinas.
El hidrocloruro de vancomicina está disponible
comercialmente en formas oral (solución y cápsulas/comprimidos) y
parenteral (solución intravenosa estéril en viales).
El uso oral del hidrocloruro de vancomicina sólo
se permite en el tratamiento de la enterocolitis por estafilococos
en la que la forma parenteral no es eficaz. Para otros tipos de
indicaciones sólo es aplicable el uso parenteral.
El hidrocloruro de vancomicina solo o en
combinación con otros aminoglicósidos es útil también en el
tratamiento de endocarditis por estafilococos, estreptococos,
enterococos o diftérica.
Para reducir la posibilidad de efectos
secundarios, es muy importante una elevada pureza cromatográfica de
los antibióticos en algunos tipos de su uso, lo que no puede
conseguirse mediante los procesos de purificación existentes hasta
ahora. Mediante el proceso de acuerdo con la presente invención, se
ha reducido en un tercio la porción de impureza de la muestra.
En la preparación de vancomicina consistente en
un proceso de varias etapas que incluye la fermentación, el
aislamiento y diversos medios de purificación, a veces se obtiene
un producto con un color más característico y con un olor
desagradable y también se reduce el rendimiento y la pureza, que no
puede mejorarse ni siquiera si se repite el proceso varias
veces.
Como la vancomicina representa un producto muy
interesante y valioso, existe una necesidad constante de nuevos
procesos para su aislamiento y purificación efectivos. Mediante el
uso de los procesos más conocidos hasta ahora y también mediante una
múltiple repetición de los procesos, no puede reducirse la porción
de varias clases de impurezas para obtener vancomicina con un grado
de pureza mejor.
Por consiguiente, el objeto de la presente
invención es preparar hidrocloruro de vancomicina útil tanto para
administración peroral como parenteral con una calidad por lo menos
igual o mejor que la que se encuentra en otros productos disponibles
en el comercio.
Por patentes y otra literatura son conocidos
diversos métodos para la preparación de antibióticos glicopéptidos a
partir del medio de fermentación así como para la purificación de
productos de la fermentación, que incluyen procesos de precipitación
que utilizan NaOH (EP 323.150, US 5.037.652, JP 5.244.964),
formación de fosfatos (EP 145.484) o complejos con péptidos (US
4.667.024) o imidazola (US 4.868.285) así como procesos para la
adsorción en diferentes resinas poliméricas (US 4.440.753, US
4.845.194, US 4.874.843, US 5.149.784, WO 91/08.300, US 5.258.495 o
WO 93/21.207).
La patente US 4.868.285 cita la precipitación del
hidrocloruro de vancomicina con etanol después de la disolución del
complejo con imidazola.
La WO 91/08.300 describe un proceso para la
preparación microbiológica de antibiótico a base de vancomicina por
fermentación aeróbica mediante el uso de varias cepas de cultivo y
cultivos. El aislamiento de la vancomicina puede hacerse de la
manera conocida "per se" o por un proceso que
comprende la cromatografía de intercambio de iones para la
separación del antibiótico a base de vancomicina, concentración
mediante el uso de ósmosis inversa y ultrafiltración.
La patente US 5.235.037 describe un proceso
especialmente adecuado para la vancomicina que se basa en el
aislamiento de la vancomicina por precipitación a partir de una
solución en agua que tiene un pH de 5-9 añadiendo
diferentes sales inorgánicas como el NaCl (5-10%) a
una temperatura de 20-25ºC, teniendo lugar la
precipitación en un período de 16-24 horas con una
concentración de vancomicina de 5-200 g/l.
Posteriormente, se filtra el producto. Este proceso es útil en
cualquier etapa de la preparación de la vancomicina para el caldo
de fermentación completa o para la purificación adicional de
vancomicina parcialmente purificada (por filtración y cromatografía
de adsorción) después de elución con una resina polimérica de
intercambio de cationes consistente en estireno y divinilbenceno. Se
obtiene ya un rendimiento máximo con soluciones diluidas en agua
(5-6 g/l), pero se consigue una mejor filtración
con concentraciones de 100-150 g/l. Esta patente
indica también la separación de la vancomicina del precipitado
obtenido mediante una disolución repetida del precipitado en una
solución de HCl en agua (es decir con pH=2) y precipitación por la
adición de un "no disolvente" adecuado para la vancomicina,
como etanol o isopropanol. El producto es una vancomicina muy pura
en forma de sal hidrocloruro (el grado de pureza depende de manera
importante de la pureza de la solución de partida). La filtración
se hace fácilmente y la sal de adición obtenida es útil para
formulaciones parenterales.
Los fabricantes de antibióticos se enfrentan
constantemente con la necesidad de asegurar un elevado rendimiento
de un producto que tenga una gran pureza cromatográfica. Por
consiguiente, la mejora del proceso de purificación para el
hidrocloruro de vancomicina mediante una combinación de
cromatografía preparatoria en una columna de gel de sílice y la
precipitación con etanol a partir de una solución de agua salina de
acuerdo con la presente invención representa una mejora esencial de
los métodos de la técnica anterior, ya que la porción de impurezas
de la sustancia resultante es menor que o, como mucho, igual a la
de la muestra más pura disponible comercialmente conocida hasta
ahora.
El objeto de la presente invención es mejorar el
proceso de purificación del hidrocloruro de vancomicina a partir de
la etapa del concentrado parcialmente purificado en adelante
combinando la cromatografía preparatoria en una columna de gel de
sílice y la precipitación con etanol a partir de una solución de
agua salina-etanol. Todo el proceso se lleva a cabo
como sigue:
El caldo de fermentación con un caudal de
0,5-1m^{3}/h es bombeado continuamente desde el
fermentador al dispositivo de microfiltración, con lo que la
porción sólida del caldo se concentra y se lava con agua
desmineralizada que circula con un caudal de
0,8-1,8 m^{3}/h, por lo que la porción sólida se
separa de la solución de impregnación que contiene la mayoría de la
vancomicina. Se mantiene un valor constante de pH=7 de la solución
de impregnación mediante la adición continua de HCl. El rendimiento
de la microfiltración es del 90-95%.
Luego se lleva a cabo la adsorción de la
vancomicina con pH=7 de la solución de impregnación después de
microfiltración en 2,5 m^{3} de resina Amberlite XAD 16 (pueden
fijarse 20 g de vancomicina en 1 l de la resina) con un caudal de
0,1-2,5 m^{3}/h. Posteriormente, las impurezas
coloreadas y las sales inorgánicas se eliminan lavando con agua
desmineralizada añadiendo NaOH al 50% en una cantidad adecuada para
ajustar el pH a 10 con un caudal de 5-10 m^{3}/h,
después se lava con metanol alcalino al 20% (se añade NaOH al 50%
para ajustar el pH a 10) con un caudal de 2,5 m^{3}/h. Luego, se
empieza la elución de la vancomicina de la resina utilizando metanol
ácido al 20% (se añade ácido acético) con un caudal de 1 m^{3}/h
y con un pH de 2,7-2,8.
Mediante ósmosis inversa se hace la separación
del metanol ácido al 20% de los eluatos combinados con el fin de
reducir su volumen de 8-15 m^{3} a 0,8
m^{3}.
Se añade HCl al concentrado bajo lavado con 15
m^{3} de agua desmineralizada durante la ósmosis inversa (para
mantener el pH en 2,7-3,0) y luego se concentra a
450 L. En este proceso se produce el desplazamiento de aniones de
acetato por aniones de cloruro, dando lugar a la conversión de la
vancomicina en hidrocloruro de vancomicina. El ácido acético
utilizado en la elución se elimina lavando sobre una membrana. El
concentrado obtenido por ósmosis inversa se enfría y se añade a él
carbono activo (300 g por cada kg de vancomicina). Después de
revolver durante 8-12 horas, se filtra la
suspensión obtenida en una prensa filtradora y se lava con agua
desmineralizada. Se obtiene un producto decolorado con una
concentración del 6-12%.
El hidrocloruro de vancomicina disuelto en agua
se aplica sobre una columna preparatoria que contiene una fase
estacionaria de gel de sílice y una fase móvil de agua
alcalina/metanol.
Sin embargo, para conseguir una purificación
satisfactoria es muy importante seleccionar un caudal apropiado de
la fase móvil a través de la columna y su valor de pH así como la
temperatura en cada etapa de purificación en la columna. Es decir,
con un caudal bajo, la presencia del hidrocloruro de vancomicina en
la fase móvil alcalina dura más tiempo, lo que da lugar a una mayor
posibilidad de que se descomponga, mientras que con un caudal alto
la cinética de la purificación no es apropiada. La elución de la
vancomicina con un valor de pH demasiado bajo se produce más
lentamente, mientras que con un valor de pH demasiado alto se
produce una rápida elución de la vancomicina junto con otras
impurezas recién formadas.
El producto obtenido de la columna se separa en
dos fracciones mediante el uso de un detector de UV:
| Fracción | Conc. de vancomicina. HCl | Pureza cromatográfica (área) |
| principal | por encima de \approx 1,5 g/l | media 93% |
| secundaria | hasta \approx 1,5 g/l | hasta 90% |
La mayor estabilidad del hidrocloruro de
vancomicina se da con un valor de pH entre 2,5 y 5,5, pero no en un
medio alcalino, por lo que es necesario acidular la fracción
principal a pH = 3-5 con HCl diluido (5%)
(neutralización del carbonato ácido de amonio). La otra posibilidad
es una sustitución de los cationes de amonio por cationes de
hidrógeno mediante intercambio de iones.
A continuación se realizan las siguientes
etapas:
- -
- un aumento de la concentración de hidrocloruro de vancomicina hasta aproximadamente 50 g/l por ósmosis inversa;
- -
- despirogenación del concentrado por ultrafiltración ;
- -
- diafiltración (eliminación del NH_{4}Cl formado) por ósmosis inversa simultáneamente con la concentración hasta una concentración final de aproximadamente 100 g/l con un pH de aproximadamente 3;
- -
- descoloración con carbono activo (10-15% con respecto al hidrocloruro de vancomicina) en condiciones de frío;
- -
- preparación de un producto sólido por liofilización en un secador de pulverización o por precipitación.
Mediante purificación en una columna de gel de
sílice se consigue una pureza cromatográfica del hidrocloruro de
vancomicina en la fracción principal de un área de aproximadamente
el 93%, las demás impurezas coloreadas se eliminan, por ejemplo,
mediante el uso de carbono activo. Mediante este proceso, se reduce
la porción de la mayoría de impurezas en más del 40%.
Como en las fracciones secundarias (contenido de
hidrocloruro de vancomicina de hasta aproximadamente 1,5 g/l y
pureza cromatográfica de hasta un área del 90%), debido a su gran
porción de impurezas, no es posible continuar la purificación por
cromatografía, se introduce además la precipitación con etanol a
partir de una solución de agua salina-etanol y
posteriormente se purifica repetidamente el producto por
cromatografía preparadora en una columna de gel de sílice.
Las fracciones secundarias obtenidas por
purificación del hidrocloruro de vancomicina en columna de gel de
sílice se acidulan hasta un pH \approx 3, se desalifican después
en la ósmosis inversa y se concentran hasta una concentración del 8%
con respecto al hidrocloruro de vancomicina. A esta solución se
añade una cantidad igual en volumen de etanol y de NaCl al
10-20% con respecto a la cantidad de solución de
vancomicina al 8%. A partir de la solución recién obtenida se
precipita el hidrocloruro de vancomicina con una cantidad triple de
etanol con respecto a la cantidad utilizada. La suspensión obtenida
se enfría y se filtra. El producto se filtra bien.
La solución concentrada descolorada de
hidrocloruro de vancomicina se seca en un secador de pulverización
con una temperatura del aire de entrada de
115-130ºC y una temperatura del aire de salida de 85
\pm 5ºC. Habitualmente, el contenido de agua del hidrocloruro de
vancomicina es superior al 4%, por lo que se seca además en un
secador de vacío giratorio a una temperatura de
45-50ºC para obtener un producto sólido seco.
En la precipitación con etanol a partir de la
solución de agua salina-etanol, la filtración del
precipitado se hace más fácilmente y más rápidamente con una mayor
(mejor) pureza cromatográfica, cuyo porcentaje de aumento depende de
la pureza cromatográfica de partida (proporcionalidad inversa) y del
tipo de impurezas. La pureza cromatográfica del producto después de
la cromatografía en columna aumenta hasta aproximadamente el 93%. La
porción de la mayoría de impurezas disminuye más del 40%.
El precipitado filtrado puede ser:
- a)
- desalificado en ósmosis inversa o mediante intercambiador de iones y aplicado repetidamente a una columna de gel de sílice, o
- b)
- desalificado y liofilizado en la mayor parte por la adición del 12% de etanol como máximo con el fin de obtener el producto final.
El rendimiento total de la purificación de las
fracciones principal y secundarias aplicadas a la columna es de
hasta el 80%.
Mediante el proceso de la presente invención se
obtiene hidrocloruro de vancomicina que tiene una pureza
cromatográfica tal que puede ser utilizado para administración
peroral y parenteral.
La presente invención se ilustra pero no se
limita de ninguna manera con los siguientes dos ejemplos.
La fracción principal del hidrocloruro de
vancomicina se purifica mediante cromatografía preparadora con los
siguientes parámetros:
hidrocloruro de vancomicina: concentración 77
g/l; pH=2,85;
permeabilidad de solución al 5% T_{405} =
57,3%;
tamaño de la columna: 30 x 80 cm;
fase estacionaria: gel de sílice, tamaño de las
partículas 100-200 \pmm con poros de 6 nm;
relación de vancomicina a gel de sílice en peso:
1:100;
fase móvil: acuosa (NH_{4}HCO_{3} al 0,35% en
metanol al 7%);
caudal: 30 l/h:
temperatura: 15ºC.
Se disolvió el depósito en 3,5 l de agua
desmineralizada, se aplicó después a la columna y se sometió a
cromatografía.
Se seleccionó la fracción principal mediante el
uso de detección por UV: 120 l con el contenido de 1,82 g/l y un
área del 93,3% de pureza cromatográfica. El rendimiento fue del
80%.
Las fracciones secundarias de hidrocloruro de
vancomicina se purificaron también por precipitación con etanol a
partir de una solución de agua salina-etanol.
Se disolvieron en agua 10 g de hidrocloruro de
vancomicina que tenía un contenido del 80% y un área del 83,6% de
pureza cromatográfica, a lo que se añadió agua en cantidad
suficiente hasta un volumen de 100 ml. Con fines de separación, se
añadieron 10 g de NaCl y 150 ml de etanol absoluto y se removió
hasta que la solución se aclaró. Se añadieron a ella otros 250 ml
de etanol absoluto, se dejó al precipitado obtenido reposar una
noche a +5ºC y luego se filtró. Se desalificó el hidrocloruro de
vancomicina en ósmosis inversa (45 x 75 cm) y se aplicó dos veces
una cantidad de 61.
Se obtuvieron entonces 8,7 g de un producto con
un contenido del 65,7% y una pureza cromatográfica de área
90,3%.
Rendimiento: 7,14%.
Claims (16)
1. Un proceso para la purificación de
antibióticos a base de vancomicina, caracterizado porque
combina la cromatografía preparadora en una columna de gel de sílice
que contiene una fase móvil de agua alcalina-metanol
y la precipitación con etanol a partir de una solución de agua
salina-etanol para las fracciones secundarias, que
comprende las siguientes etapas:
- a)
- concentración de las fracciones secundarias combinadas aciduladas del antibiótico que tienen concentraciones de hasta aproximadamente 1,5 g/l por ósmosis inversa;
- b)
- adición de NaCl y remoción para conseguir la disolución de la sal y la precipitación del antibiótico;
- c)
- adición de etanol a la suspensión resultante a temperatura ambiente para provocar en primer lugar la disolución del antibiótico precipitado y una posterior adición de etanol (en total cuatro veces más etanol que agua) para iniciar la precipitación del antibiótico;
- d)
- enfriamiento de la suspensión obtenida a aproximadamente 5ºC y centrifugación;
- e)
- desalificación del antibiótico en ósmosis inversa y continuación del proceso como se hace para la fracción principal.
2. Un proceso según la reivindicación 1,
caracterizado porque el producto final se prepara por
precipitación a partir de una solución de agua
salina-etanol.
3. Un proceso según la reivindicación 2,
caracterizado porque el producto final se seca en un secador
de pulverización.
4. Un proceso según la reivindicación 2,
caracterizado porque el producto final se prepara por
liofilización a partir de la solución etanólica del antibiótico.
5. Un proceso según la reivindicación 4,
caracterizado porque la liofilización se lleva a cabo
mediante la adición del 12% de etanol como máximo.
6. Un proceso según la reivindicación 1,
caracterizado porque se utiliza para la purificación de
vancomicina y de hidrocloruro de vancomicina.
7. Un proceso según la reivindicación 1,
caracterizado porque la concentración del antibiótico
aplicado a la columna y antes del comienzo de la precipitación es de
aproximadamente 50 a aproximadamente 120 g/l.
8. Un proceso según la reivindicación 7,
caracterizado porque la concentración del antibiótico
aplicado a la columna y antes del comienzo de la precipitación es de
aproximadamente 80 g/l.
9. Un proceso según la reivindicación 1,
caracterizado porque la relación en peso del antibiótico al
gel de sílice en la columna es de aproximadamente 1:100.
10. Un proceso según la reivindicación 1,
caracterizado porque la fase móvil es un 0,35% de
NH_{4}HCO_{3} en metanol al 7%.
11. Un proceso según la reivindicación 1,
caracterizado porque el caudal de la fase móvil está entre
aproximadamente 20 l/min y aproximadamente 100 l/min.
12. Un proceso según la reivindicación 1,
caracterizado porque el pH de la fase móvil está entre
aproximadamente 7,9 y aproximadamente 8,5.
13. Un proceso según la reivindicación 1,
caracterizado porque la temperatura en la columna es de
aproximadamente 15ºC.
14. Un proceso según la reivindicación 1,
caracterizado porque la precipitación se hace mediante el
uso de aproximadamente un 10 a aproximadamente un 20% de NaCl con
respecto al agua.
15. Un proceso según la reivindicación 1,
caracterizado porque la precipitación se hace mediante el
uso de aproximadamente un 15% de NaCl con respecto al agua.
\newpage
16. Un proceso según la reivindicación 1,
caracterizado porque se obtiene un antibiótico de tal
pureza que puede ser utilizado para administración peroral o
parenteral.
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