ES2205841T3 - Oligonucleotidos en horquilla de transferencia de energia multifluorescente. - Google Patents
Oligonucleotidos en horquilla de transferencia de energia multifluorescente.Info
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Abstract
Un oligonucleótido que contiene: (a) una primera secuencia de nucleótidos. (b) una segunda secuencia de nucleótidos en el extremo 5¿ de la primera secuencia de nucleótidos. (c) una tercera secuencia de nucleótidos en el extremo 5¿ de la segunda secuencia de nucleótidos, y (d) un trío de transferencia de energía molecular que incluye un resto donador de energía y primer y segundo restos aceptores de energía en donde, el resto donador de energía es capaz de emitir un quantum de energía y el primer y segundo restos aceptores son cada uno de ellos capaces de absorber una cantidad sustancial del quantum de energía. el resto donador está unido a un nucleótido de la primera secuencia de nucleótidos, el primer resto aceptor está unido a un nucleótido de la primera secuencia de nucleótidos, y el segundo resto aceptor está unido a un nucleótido de la tercera secuencia de nucleótidos; o el resto donador está unido a un nucleótido de la tercera secuencia, el primer resto aceptor está unido a un nucleótido de la tercera secuencia de nucleótidos, y el segundo resto aceptor está unido a un nucleótido de la primera secuencia. el oligonucleótido es capaz de formar una horquilla que contiene un nucleótido de la primera secuencia de nucleótidos y un nucleótido de la tercera secuencia de nucleótidos, y si el resto donador emite el quantum de energía, entonces: (1) el primer resto aceptor absorbe una cantidad sustancial del quantum de energía emitida si no se forma la horquilla, y (2) el segundo resto aceptor absorbe una cantidad sustancial del quantum de energía emitida si se forma la horquilla.
Description
Oligonucleótidos en horquilla de transferencia de
energía multifluorescente.
La presente invención se refiere en líneas
generales a una sonda de oligonucleótido útil para detectar
múltiples secuencias de ácidos nucleicos diana en una muestra. Más
particularmente, la presente invención se refiere a una sonda de
oligonucleótido marcada con un trío de transferencia de energía
molecular (MET), incluyendo un donador de energía y dos aceptores de
energía que hacen posible la detección de múltiples dianas usando
una sola longitud de onda de luz de excitación.
El fenómeno MET es un proceso por el cual se pasa
energía entre una molécula donadora y una molécula aceptora. La
transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET), que
implica al menos un fluoróforo, es una forma de MET. Un fluoróforo
es un compuesto que absorbe luz a una longitud de onda, y emite luz
a diferente longitud de onda. Se usa un espectrofluorímetro para,
simultáneamente, emitir la luz que excita al fluoróforo y detectar
la luz emitida por el fluoróforo. En FRET, el fluoróforo es una
molécula donadora que absorbe fotones y, posteriormente, transfiere
esta energía a una molécula aceptora. Las moléculas donadora y
aceptora que forman parte de MET o FRET se denominan pares MET o
pares FRET, respectivamente. Föster, 1949. Z. Naturforsch
A4:321-327; Clegg, 1992, Methods in Enzymology
211:353-388.
Cuando dos fluoróforos están es estrecha
proximidad, y el espectro de emisión del primer fluoróforo solapa
con el espectro de excitación del segundo fluoróforo, la excitación
del primer fluoróforo le provoca la emisión de luz que es absorbida
por el segundo fluoróforo, que en definitiva provoca la emisión de
luz del segundo fluoróforo. Como resultado se amortigua la
fluorescencia del primer fluoróforo, mientras que se incrementa la
fluorescencia del segundo fluoróforo. Si la energía del primer
fluoróforo se transfiere a un compuesto que no es un fluoróforo,
sin embargo, se amortigua la fluorescencia del primer fluoróforo
sin la consiguiente emisión de luz por el no fluoróforo.
El fenómeno FRET se ha explotado en métodos para
la detección de ácidos nucleicos. Uno de estos métodos se describe
en la patente U.S. Nº 5,866,366. La patente `366 describe un
oligonucleótido en horquilla marcado con FRET que se usa como sonda
en los métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para
detectar secuencias de ácidos nucleicos diana. Este oligonucleótido
contiene un donador de energía y un aceptor de energía que
constituyen un par FRET. El donador y el aceptor se sitúan
respectivamente sobre la primera y segunda secuencias de nucleótido
del oligonucelótido. Estas dos secuencias de nucleótidos son
complementarias entre sí y son, por tanto, capaces de formar una
horquilla en el oligonucelótido.
Si la primera y segunda secuencias de nucleótidos
hibridan la una con la otra, entonces el donador y el aceptor están
en estrecha proximidad. En este ordenamiento espacial, el aceptor
absorbe la emisión del donador y, como consecuencia, amortigua la
señal del donador. Sin embargo, si las secuencias de nucleótidos no
se hibridan la una con la otra, entonces el donador y el aceptor
están separados, el aceptor no puede absorber la emisión del donador
y la señal del donador no se amortigua.
Así, si el oligonucleótido se incorpora en un
producto de amplificación durante la PCR, entonces la horquilla se
desplega, teniendo como resultado la separación del donador y del
aceptor y la consiguiente emisión de una señal observable. Sin
embargo, si no se incorpora el oligonucleótido en un producto de
amplificación de PCR, entonces la horquilla se mantiene y la emisión
del donador es amortiguada por el aceptor. La detección de la señal
después de la PCR indica, por tanto, la presencia de la diana.
Además, los oligonucelótidos en horquilla
marcados con FRET descritos anteriormente pueden usarse como un
"faro molecular" para detectar una secuencia de ácido nucleico
diana sin incorporarlo en una molécula de ADN. La tecnología del
faro molecular se describe en Tyagi et al., 1996 Nature
Biotechnology 14:303-308, el contenido completo del
cual es incorporado en la presente invención como referencia. Si el
oligonucleótido hibrida con una diana, la horquilla se desplega y se
genera una señal detectable. Si el oligonucleótido no hibrida con
la diana, la horquilla se mantiene y se amortigua la señal. La
detección de la señal tras la hibridación indica, por tanto, la
presencia de la diana.
La detección de más de una molécula de ácido
nucleico diana en una única muestra usando el método descrito en la
patente `366 y Tyagi et al. requiere un oligonucleótido en horquilla
marcado con FRET específico para cada molécula diana, en donde cada
donador emite una señal distinta. Puesto que cada donador
típicamente debe excitarse con diferente longitud de onda de luz, es
necesario irradiar la muestra con múltiples longitudes de onda de
luz. El principal inconveniente de esta aproximación, sin embargo,
es que se necesita un espectrofluorímetro que emita un amplio
espectro de luz.
Evitando el inconveniente mencionado
anteriormente, la presente invención se refiere a un oligonucleótido
marcado con MET, así como al uso de este oligonucleótido para
detectar múltiples secuencias de ácidos nucleicos diana en una única
muestra. De acuerdo con esta invención, se pueden detectar múltiples
dianas mediante la irradiación de una muestra que contiene las
dianas, con una única longitud de onda de luz de excitación.
Un oligonucleótido, según la presente invención
contiene tres secuencias de nucleótidos: una primera secuencia de
nucleótidos, una segunda secuencia de nucleótidos en el extremo 5'
de la primera secuencia de nucleótidos y una tercera secuencia de
nucleótidos en el extremo 5' de la segunda secuencia de nucleótidos.
Además, el oligonucleótido contiene un trío MET, por ejemplo, un
trío FRET, que incluye un resto donador de energía y un primer y
segundo restos aceptores de energía, donde (i) el resto donador de
energía es capaz de emitir un quantum de energía y (ii) cada uno de
los restos aceptores de energía primero y segundo es capaz de
absorber una cantidad sustancial del quantum de energía.
Preferiblemente, el primer resto aceptor también es capaz de emitir
un quantum de energía.
El resto donador está unido a un nucleótido de la
primera secuencia de nucleótidos. El primer resto aceptor está unido
a un nucleótido de la primera secuencia de nucleótidos y el segundo
resto aceptor está unido a un nucleótido de la tercera secuencia de
nucleótidos o, alternativamente, el resto donador está unido a un
nucleótido de la tercera secuencia de nucleótidos, el primer resto
aceptor está unido a un nucleótido de la tercera secuencia de
nucleótidos y el segundo resto aceptor está unido a un nucleótido
de la primera secuencia de nucleótidos.
El oligonucleótido es capaz de formar una
horquilla que contiene un núcleotido de la primera secuencia de
nucleótidos y un nucleótido de la tercera secuencia de nucleótidos.
Si el resto donador emite el quantum de energía, entonces, el primer
resto aceptor absorbe una cantidad sustancial del quantum de energía
emitido si, preferiblemente sólo si, no se forma la horquilla, y el
segundo resto aceptor absorbe una cantidad sustancial del quantum de
energía emitido si, preferiblemente sólo si, se forma la
horquilla.
Un oligonucleótido de esta invención comprende,
preferiblemente, una cuarta secuencia de nucleótidos en el extremo
3' de la primera secuencia de nucleótidos. Idealmente, la tercera
secuencia de nucleótidos no es complementaria de la cuarta secuencia
de nucleótidos, y la cuarta secuencia de nucleótidos es
complementaria de una secuencia de nucleótidos que flanquea una
secuencia de nucleótidos diana, por ejemplo, una secuencia de ADN.
El oligonucleótido puede estar incluido en un kit que contenga una
polimerasa. El oligonucleótido preferiblemente comprende un
desoxirribonucleótido.
De forma ventajosa, el resto donador y el primer
resto aceptor son cada uno fluoróforos, mientras que el segundo
resto aceptor es un amortiguador de la luz emitida por el resto
donador. El resto donador, primer resto aceptor y segundo resto
aceptor preferidos son fluoresceína,
6-carboxi-rodamina (ROX) y ácido
benzoico
4-(4'-dimetilamino-fenilazo)
(DABSYL), respectivamente.
Preferiblemente, hay de 0 a 50 nucleótidos entre
el nucleótido al cual se une el resto donador y el nucleótido al
cual se une el primer resto aceptor, y hay de 0 a 50 nucleótidos
entre el nucleótido al cual se une el resto donador y el nucleótido
al cual se une el segundo resto aceptor. Más preferiblemente, hay
de 5 a 10 nucleótidos entre el nucleótido al cual se une el resto
donador y el nucleótido al cual se une el primer resto aceptor, y
hay de 5 a 10 nucleótidos entre el nucleótido al cual se une el
resto donador y el nucleótido al cual se une el segundo resto
aceptor.
De forma ventajosa, si se forma la horquilla,
entonces el nucleótido al cual se une el resto donador es el
complementario del nucleótido al cual se une el segundo resto
aceptor o hay de 0 a 5 nucleótidos entre el nucleótido al cual se
une el resto donador y el complementario del nucleótido al cual se
une el segundo resto aceptor.
Un oligonucleótido preferido comprende o consiste
en la secuencia de nucleótidos de Nº ID. SEC. 1, en donde la
fluoresceína se une al nucleótido en posición 1 de Nº ID. SEC.: 1,
ROX se une al nucleótido en posición 21 de Nº ID. SEC.: 1 y DABSYL
se une al nucleótido en posición 5 ó 10 de Nº ID. SEC.: 1.
Un método de la presente invención es un método
para determinar si una secuencia de nucleótidos diana está presente
en una muestra, que comprende los siguientes pasos:
En el paso (a), se pone en contacto una muestra
con un oligonucleótido que contiene una primera secuencia de
nucleótidos, una segunda secuencia de nucleótidos en el extremo 5'
de la primera secuencia de nucleótidos y una tercera secuencia de
nucleótidos en el extremo 5' de la segunda secuencia de nucleótidos.
El oligonucleótido también contiene un trío MET que incluye un
resto donador de energía y un primer y segundo restos aceptores de
energía, en donde el resto donador es capaz de emitir un primer
quantum de energía, el primer y segundo restos aceptores son
capaces cada uno de ellos de absorber una cantidad sustancial del
primer quantum de energía y el primer resto aceptor es capaz de
emitir un segundo quantum de energía. El resto donador, el primer
resto aceptor y el segundo resto aceptor preferidos son
fluoresceína, ROX y DABSYL, respectivamente.
El resto donador se une a un nucleótido de la
primera secuencia de nucleótidos, el primer resto aceptor se une a
un nucleótido de la primera secuencia de nucleótidos y el segundo
resto aceptor se une a un nucleótido de la tercera secuencia de
nucleótidos, o, alternativamente, el resto donador se une a un
nucleótido de la tercera secuencia de nucleótidos, el primer resto
aceptor se una a un nucleótido de la tercera secuencia de
nucleótidos y el segundo resto aceptor se une a un nucleótido de la
primera secuencia de nucleótidos.
El oligonucleótido es capaz de formar una
horquilla que contiene un nucleótido de la primera secuencia de
nucleótidos y un nucleótido de la tercera secuencia de nuleótidos.
Si el resto donador emite el primer quantum de energía, entonces el
primer resto aceptor absorbe una cantidad sustancial del primer
quantum de energía emitido si, preferiblemente sólo si, no se forma
la horquilla, y el segundo resto aceptor absorbe una cantidad
sustancial del primer quantum de energía emitido si,
preferiblemente sólo si, se forma la horquilla.
En el paso (b), si se detecta el segundo quantum
de energía, entonces se determina que la secuencia de nucleótidos
diana está presente en la muestra, o si no se detecta el segundo
quantum de energía, entonces se determina que la secuencia de
nucleótidos diana no está presente en la muestra.
Un segundo método de la presente invención es un
método para determinar si una secuencia de nucleótidos diana está
presente en una muestra, que comprende los siguientes pasos:
En el paso (a), la muestra se pone en contacto
con un oligonucleótido que contiene una primera secuencia de
nucleótidos, una segunda secuencia de nucleótidos en el extremo 5'
de la primera secuencia de nucleótidos y una tercera secuencia de
nucleótidos en el extremo 5' de la segunda secuencia de nucleótidos.
El oligonucleótido también contiene un trío MET que incluye un
resto donador de energía y un primer y segundo restos aceptores de
energía, en el que el resto donador es capaz de emitir un primer
quantum de energía, el primer y segundo restos aceptores son
capaces de absorber una cantidad sustancial del primer quantum de
energía y el primer resto aceptor es capaz de emitir un segundo
quantum de energía. El resto donador, el primer resto aceptor y el
segundo resto aceptor preferidos son fluoresceína, ROX y DABSYL,
respectivamente.
El resto donador se une a un nucleótido de la
primera secuencia de nucleótidos, el primer resto aceptor se une a
un nucleótido en la primera secuencia de nucleótidos y el segundo
resto aceptor se une a un nucleótido de la tercera secuencia de
nucleótidos, o, alternativamente, el resto donador se une a un
nucleótido de la tercera secuencia de nucleótidos, el primer resto
aceptor se une a un nucleótido de la tercera secuencia de
nucleótidos y el segundo resto aceptor se une a un nucleótido de la
primera secuencia de nucleótidos.
El oligonucleótido es capaz de formar una
horquilla que comprende un nucleótido de la primera secuencia de
nucleótidos y un nucleótido de la tercera secuencia de nucleótidos.
Si el resto donador emite el primer quantum de energía, entonces el
primer resto aceptor absorbe una cantidad sustancial del primer
quantum de energía emitido si, preferiblemente sólo si, no se forma
la horquilla, y el segundo resto aceptor absorbe una cantidad
sustancial del primer quantum de energía emitido si,
preferiblemente sólo si, se forma la horquilla.
En el paso (b), se incorpora el oligonucleótido,
preferiblemente usando una polimerasa, en un ácido nucleico de
doble hebra si la secuencia de nucleótidos diana está presente en
la muestra, previniendo, de este modo, la formación de la
horquilla.
En el paso (c), que es opcional, se realiza una
reacción de amplificación, que tiene como resultado la incorporación
del oligonucleótido en un producto de amplificación si la secuencia
de nucleótidos diana está presente en la muestra.
En el paso (d), si se detecta el segundo quantum
de energía, entonces se determina que la secuencia de nucleótidos
diana está presente en la muestra, o si no se detecta el segundo
quantum de energía, se determina que la secuencia de nucleótidos
diana no está presente en la muestra.
Un tercer método de la presente invención es un
método para detectar una secuencia de nucleótidos diana que
comprende los siguientes pasos:
En el paso (a), se hibrida un primer
oligonucleótido con una secuencia de nucleótidos que flanquea una
secuencia de nucleótidos diana, en donde el primer oligonucleótido
comprende una primera secuencia de nucleótidos, una segunda
secuencia de nucleótidos en el extremo 5' de la primera secuencia de
nucleótidos y una tercera secuencia de nucleótidos en el extremo 5'
de la segunda secuencia de nucleótidos. El primer oligonucleótido
también comprende un trío MET que incluye un resto donador de
energía y un primer y segundo restos aceptores de energía, en donde
el resto donador es capaz de emitir un primer quantum de energía y
el primer y segundo restos aceptores son capaces cada uno de
absorber una cantidad sustancial del primer quantum de energía. El
resto donador, el primer resto aceptor y el segundo resto aceptor
preferidos son fluoresceína, ROX y DABSYL, respectivamente.
El resto donador se une a un nucleótido de la
primera secuencia de nucleótidos, el primer resto aceptor se une a
un nucleótido de la primera secuencia de nucleótidos y el segundo
resto aceptor se une a un nucleótido de la tercera secuencia de
nucleótidos, o, alternativamente, el resto donador se une a un
nucleótido de la tercera secuencia de nucleótidos, el primer resto
aceptor se una a un nucleótido de la tercera secuencia de
nucleótidos y el segundo resto aceptor se une a un nucleótido de la
primera secuencia de nucleótidos.
El primer oligonucleótido es capaz de formar una
horquilla que comprende un nucleótido de la primera secuencia de
nucleótidos y un nucleótido de la tercera secuencia de nucleótidos.
Si el resto donador emite el primer quantum de energía, entonces el
primer resto aceptor absorbe una cantidad sustancial del primer
quantum de energía emitido si, preferiblemente sólo si, no se forma
la horquilla, y el segundo resto aceptor absorbe una cantidad
sustancial del primer quantum de energía emitido si,
preferiblemente sólo si, se forma la horquilla.
El oligonucleótido, de forma ventajosa, comprende
una cuarta secuencia de nucleótidos en el extremo 3' de la primera
secuencia de nucleótidos. Idealmente, la tercera secuencia de
nucleótidos no es complementaria de la cuarta secuencia de
nucleótidos y la cuarta secuencia de nucleótidos es complementaria
de una secuencia de nucleótidos que flanquea una secuencia de
nucleótidos diana.
En el paso (b), se extiende el extremo 3' del
primer oligonucleótido usando la secuencia de nucleótidos diana
como molde para formar una primera hebra extendida, en donde la
secuencia de nucleótidos diana se hibrida con la primera hebra
extendida.
En el paso (c), se separa la secuencia de
nucleótidos diana de la primera hebra extendida.
En el paso (d), se hibrida el segundo
oligonucleótido con la primera hebra extendida.
En el paso (e), se extiende el extremo 3' del
segundo oligonucleótido usando la primera hebra extendida como molde
para formar una segunda hebra extendida, en donde la primera hebra
extendida se hibrida con la segunda hebra extendida.
En el paso (f), que es opcional, se amplifican la
primera y segunda hebras extendidas.
En el paso (g), se detecta un segundo quantum de
energía emitido por el primer resto aceptor para detectar la
secuencia de nucleótidos diana.
Se pueden usar varios métodos de amplificación en
le paso (f) para amplificar la primera y segunda hebras extendidas
(por ejemplo, amplificación por PCR, amplificación por
desplazamiento de hebra y amplificación en cascada por círculo
rodante). El método preferible de amplificación es la amplificación
por PCR que comprende los siguientes cuatros pasos.
En el paso (1), se separa la primera hebra
extendida de la segunda hebra extendida.
En el paso (2), se hibrida el primer
oligonucleótido con la segunda hebra extendida y el segundo
oligonucleótido se hibrida con la primera hebra extendida.
En el paso (3), el extremo 3' del primer
oligonucleótido se extiende usando la segunda hebra extendida como
molde para formar otra primera hebra extendida, en donde la segunda
hebra extendida se hibrida con la otra primera hebra extendida.
Además, el extremo 3' del segundo oligonucleótido se extiende usando
la primera hebra extendida como molde para formar otra segunda hebra
extendida, en donde la primera hebra extendida se hibrida con la
otra segunda hebra extendida.
En el paso (4), se repiten los pasos (1), (2) y
(3) durante un número finito de veces, en donde, en el paso (1), la
primera y segunda hebras extendidas son, respectivamente, la
primera hebra extendida y la otra segunda hebra extendida del paso
(3), o son, respectivamente, la otra primera hebra extendida y la
segunda hebra extendida del paso (3).
Un cuarto método de la presente invención es un
método para detectar una secuencia de nucleótidos diana, que
comprende los siguientes pasos:
En el paso (a), se hibrida un primer
oligonucleótido con una secuencia de nucleótidos que flanquea una
secuencia de nucleótidos diana, en donde el primer oligonucleótido
contiene una primera secuencia de nucleótidos complementaria de la
secuencia de nucleótidos que flanquea la secuencia de nucleótidos
diana y una segunda secuencia de nucleótidos en el extremo 5' de la
primera secuencia de nucleótidos.
En el paso (b), se extiende el extremo 3' de la
primera secuencia de nucleótidos usando la secuencia de nucleótidos
diana como molde para formar una primera hebra extendida, en donde
la secuencia de nucleótidos diana se hibrida con la primera hebra
extendida.
En el paso (c), se separa la secuencia de
nucleótidos diana de la primera hebra extendida.
En el paso (d), se hibrida un segundo
oligonucleótido con la primera hebra extendida.
En el paso (e), se extiende el extremo 3' del
segundo oligonucleótido usando la primera hebra extendida como molde
para formar una segunda hebra extendida, en donde se hibrida la
primera hebra extendida con la segunda hebra extendida.
En el paso (f), se separa la primera hebra
extendida de la segunda hebra extendida.
En el paso (g), se hibrida un tercer
oligonucleótido con la segunda hebra extendida, en donde el tercer
oligonucleótido consiste en una primera secuencia de nucleótidos,
una segunda secuencia de nucleótidos en el extremo 5' de la primera
secuencia de nucleótidos, una tercera secuencia de nucleótidos en el
extremo 5' de la segunda secuencia de nucleótidos y una cuarta
secuencia de nucleótidos en el extremo 3' de la primera secuencia de
nucleótidos. La tercera secuencia de nucleótidos también contiene un
trío MET que comprende un resto donador de energía y un primer y
segundo restos aceptores de energía. El resto donador es capaz de
emitir un quantum de energía y el primer y segundo restos aceptores
son capaces cada uno de absorber una cantidad sustancial del quantum
de energía. El resto donador, el primer resto aceptor y el segundo
resto aceptor preferidos son fluoresceína, ROX y DABSYL,
respectivamente.
El resto donador se une a un nucleótido de la
primera secuencia de nucleótidos, el primer resto aceptor se une a
un nucleótido de la primera secuencia de nucleótidos y el segundo
resto aceptor se une a un nucleótido de la tercera secuencia de
nucleótidos, o, alternativamente, el resto donador se une a un
nucleótido de la tercera secuencia de nucleótidos, el primer resto
aceptor se una a un nucleótido de la tercera secuencia de
nucleótidos y el segundo resto aceptor se une a un nucleótido de la
primera secuencia de nucleótidos.
El primer oligonucleótido es capaz de formar una
horquilla que comprende un nucleótido de la primera secuencia de
nucleótidos y un nucleótido de la tercera secuencia de nucleótidos
y si el resto donador emite el primer quantum de energía, entonces
el primer resto aceptor absorbe una cantidad sustancial del primer
quantum de energía emitido si, preferiblemente sólo si, no se forma
la horquilla, y el segundo resto aceptor absorbe una cantidad
sustancial del primer quantum de energía emitido si, preferiblemente
sólo si, se forma la horquilla.
La cuarta secuencia de nucleótidos es
complementaria al complementario de la segunda secuencia del primer
oligonucleótido. Idealmente, la tercera secuencia de nucleótidos no
es complementaria a la cuarta secuencia de nucleótidos y la cuarta
secuencia de nucleótidos es complementaria a una secuencia de
nucleótidos que flanquea una secuencia de nucleótidos diana.
En el paso (h), se extiende el extremo 3' del
tercer oligonucleótido usando la segunda hebra extendida como molde
para formar una primera hebra doblemente extendida, en donde la
primera hebra doblemente extendida se hibrida con la segunda hebra
extendida.
En el paso (i), se separa la primera hebra
doblemente extendida de la segunda hebra extendida marcada.
En el paso (j), se hibrida el segundo
oligonucleótido con la primera hebra doblemente extendida.
En el paso (k), se extiende el extremo 3' del
segundo oligonucleótido usando la primera hebra doblemente extendida
como molde para formar una segunda hebra doblemente extendida, en
donde la primera hebra doblemente extendida se hibrida con la
segunda hebra doblemente extendida.
En el paso (l), que es opcional, se amplifican la
primera y segunda hebras doblemente extendidas.
En el paso (m), se detecta un segundo quantum de
energía que es emitido por el primer resto aceptor para detectar la
secuencia de nucleótidos diana.
Se pueden usar varios métodos de amplificación en
el paso (1) para amplificar la primera y segunda hebras extendidas
(por ejemplo, amplificación por PCR, amplificación por
desplazamiento de hebra y amplificación en cascada por círculo
rodante). El método preferible de amplificación es la amplificación
por PCR que comprende los siguientes cuatros pasos:
En el paso (1), se separa la primera hebra
doblemente extendida de la segunda hebra doblemente extendida.
En el paso (2), se hibrida el segundo
oligonucleótido con la primera hebra doblemente extendida y el
tercer oligonucleótido se hibrida con la segunda hebra doblemente
extendida.
En el paso (3), se extiende el extremo 3' del
segundo oligonucleótido usando la primera hebra doblemente extendida
como molde para formar otra segunda hebra doblemente extendida, en
donde la primera hebra doblemente extendida se hibrida con la otra
segunda hebra doblemente extendida. Además, se extiende el extremo
3' del tercer oligonucleótido usando la segunda hebra doblemente
extendida como molde para formar otra primera hebra doblemente
extendida, en donde la segunda hebra doblemente extendida se hibrida
con la otra primera hebra doblemente extendida.
En el paso (4) se repiten los pasos (1), (2) y
(3) durante un número limitado de veces, en donde, en el paso (1),
la primera y segunda hebras doblemente extendidas son,
respectivamente, la primera hebra doblemente extendida y la otra
segunda hebra doblemente extendida del paso (3), o son,
respectivamente, la otra primera hebra doblemente extendida y la
segunda hebra doblemente extendida del paso (3).
Un quinto método de la presente invención es un
método para determinar si una primera o segunda secuencia de
nucleótidos está presente en una muestra, que comprende los
siguientes pasos:
En el paso (a), se pone en contacto la muestra
con el primer y segundo oligonucleótidos. El primer oligonucleótido
contiene una primera secuencia de nucleótidos, una segunda secuencia
de nucleótidos en el extremo 5' de la primera secuencia de
nucleótidos y una tercera secuencia de nucleótidos en el extremo 5'
de la segunda secuencia. El primer oligonucleótido también contiene
un trío MET que incluye un primer resto donador de energía y un
primer y segundo restos aceptores de energía, en donde el primer
resto donador es capaz de emitir un primer quantum de energía y el
primer y segundo restos aceptores son capaces cada uno de absorber
una cantidad sustancial del primer quantum de energía.
El primer resto donador se une a un nucleótido de
la primera secuencia de nucleótidos, el primer resto aceptor se une
a un nucleótido de la primera secuencia de nucleótidos y el segundo
resto aceptor se une a un nucleótido de la tercera secuencia de
nucleótidos, o, alternativamente, el primer resto donador se une a
un nucleótido de la tercera secuencia de nucleótidos, el primer
resto aceptor se una a un nucleótido de la tercera secuencia de
nucleótidos y el segundo resto aceptor se une a un nucleótido de la
primera secuencia de nucleótidos.
El primer oligonucleótido es capaz de formar una
primera horquilla que comprende un nucleótido de la primera
secuencia de nucleótidos y un nucleótido de la tercera secuencia de
nucleótidos. Si el primer resto donador emite el primer quantum de
energía, entonces el primer resto aceptor absorbe una cantidad
sustancial del primer quantum de energía emitido si, preferiblemente
sólo si, no se forma la primera horquilla, y el segundo resto
aceptor absorbe una cantidad sustancial del primer quantum de
energía emitido si, preferiblemente sólo si, se forma la primera
horquilla.
El segundo oligonucleótido contiene una cuarta
secuencia de nucleótidos, una quinta secuencia de nucleótidos en el
extremo 5' de la cuarta secuencia de nucleótidos y una sexta
secuencia de nucleótidos en el extremo 5' de la quinta secuencia de
nucleótidos. El segundo oligonucleótido también contiene un par MET
que incluye un segundo resto donador de energía y un tercer resto
aceptor de energía, en donde el segundo resto donador es capaz de
emitir un segundo quantum de energía y el tercer resto aceptor es
capaz de absorber una cantidad sustancial del segundo quantum de
energía.
El segundo resto donador se une a un nucleótido
de la cuarta secuencia de nucleótidos y el tercer resto aceptor se
une a un nucleótido en la sexta secuencia de nucleótidos, o,
alternativamente, el segundo resto donador se une a un nucleótido de
la sexta secuencia de nucleótidos y el tercer resto aceptor se une
a un nucleótido de la cuarta secuencia de nucleótidos.
El segundo oligonucleótido es capaz de formar una
segunda horquilla que comprende un nucleótido de la cuarta secuencia
de nucleótidos y un nucleótido de la sexta secuencia de nucleótidos.
Si el segundo resto donador emite el segundo quantum de energía,
entonces el tercer resto aceptor absorbe una cantidad sustancial del
segundo quantum de energía emitido si, preferiblemente sólo si, se
forma la segunda horquilla.
El primer y segundo restos donadores preferidos
son cada uno fluoresceína, el primer resto aceptor preferido es ROX
y el segundo y tercer restos aceptores preferidos son cada uno
DABSYL. Idealmente, el primer oligonucleótido comprende una séptima
secuencia de oligonucleótidos en el extremo 3' de la primera
secuencia de nucleótidos, la tercera secuencia de nucleótidos no es
complementaria a la séptima secuencia de nucleótidos, la séptima
secuencia de nucleótidos es complementaria de una secuencia de
nucleótidos que flanquea la primera secuencia de nucleótidos diana.
El segundo oligonucleótido, además comprende una octava secuencia
de nucleótidos en el extremo 3' de la cuarta secuencia de
nucleótidos, la sexta secuencia de nucleótidos no es complementaria
a la octava secuencia de nucleótidos, y la octava secuencia de
nucleótidos es complementaria de una secuencia de nucleótidos que
flanquea la segunda secuencia de nucleótidos diana.
En el paso (b), se incorpora el primer
oligonucleótido usando preferiblemente una polimerasa en un primer
ácido nucleico de doble hebra si la primera secuencia de nucleótidos
diana está presente en la muestra, previniendo, de este modo, la
formación de la primera horquilla. Además, se incorpora el segundo
oligonucleótido usando preferiblemente una polimerasa, en un segundo
ácido nucleico de doble hebra si la segunda secuencia de nucleótidos
diana está presente en la muestra, previniendo, de este modo, la
formación de la segunda horquilla.
En el paso (c), el cual es opcional, se realiza
una primera reacción de amplificación, incorporando de este modo el
primer oligonucleótido en un primer producto de amplificación si la
primera secuencia de nucleótidos diana está presente en la muestra.
Además, se realiza una segunda reacción de amplificación,
incorporando de este modo el segundo oligonucleótido en un segundo
producto de amplificación si la segunda secuencia de nucleótidos
diana está presente en la muestra.
En el paso (d), se determina que la primera
secuencia de nucleótidos diana está presente en la muestra si se
detecta un tercer quantum de energía emitido por el primer resto
aceptor, o se determina que la primera secuencia de nucleótidos
diana no está presente en la muestra si no se detecta el tercer
quantum de energía. Además, se determina que la segunda secuencia de
nucleótidos diana está presente en la muestra si se detecta un
cuarto quantum de energía emitido por el tercer resto aceptor, o se
determina que la segunda secuencia de nucleótidos diana no está
presente en la muestra si no se detecta el cuarto quantum de
energía.
Otros objetivos, aspectos y ventajas de la
presente invención se harán evidente a partir de la siguiente
descripción detallada. Debería entenderse, sin embargo, que la
descripción y los ejemplos específicos, mientras que indican
realizaciones preferidas de la invención, se dan a modo sólo
ilustrativo, puesto que varios cambios y modificaciones en el
espíritu y alcance de la invención se harán evidentes para los
expertos en la materia a partir de esta descripción detallada.
Como se ha explicado anteriormente, el
oligonucleótido de la presente invención contienen dos secuencias de
nucleótidos que son capaces de hibridar la una con la otra para
formar una horquilla. Una secuencia de nucleótidos contiene un
donador de energía y el primer aceptor de energía, mientras que la
segunda secuencia de nucleótidos contiene un segundo aceptor de
energía que es capaz de amortiguar la señal generada por el donador.
Así, el oligonucleótido de la presente invención contiene un trío
MET. En una forma de realización preferida, el donador y el primer
aceptor son fluoróforos, el espectro de emisión del fluoróforo
donador solapa con el espectro de emisión del fluoróforo aceptor
(es decir, el primer aceptor) y el segundo aceptor es un
amortiguador de la señal emitida por el fluoróforo donador.
De acuerdo con la presente invención, el
fluoróforo donador y el amortiguador son colocados en el
oligonucleótido para que, si se forma la horquilla, entonces, el
fluoróforo donador y el amortiguador estén en estrecha proximidad y
la energía emitida por el fluoróforo donador sea absorbida por el
amortiguador, teniendo como resultado la extinción de la señal del
fluoróforo donador. Si no se forma la horquilla, sin embargo, y como
consecuencia el amortiguador no absorbe la energía emitida por el
donador, entonces la energía emitida es absorbida por el fluoróforo
aceptor y, posteriormente, es emitida por el fluoróforo aceptor
como una señal detectable.
De acuerdo con la presente invención, la
detección de una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra se
da en una de al menos dos formas. Primero, el oligonucleótido puede
incorporarse en un producto de amplificación que contiene la
secuencia diana. Segundo, el oligonucleótido puede hibridar con la
secuencia diana. En una realización preferida, la irradiación de la
muestra usando un espectrofluorímetro después de tal incorporación o
hibridación, provoca que el fluoróforo aceptor emita una señal que
es detectada por el espectrofluorómetro. De este modo, la detección
de la señal indica que la diana está presente, mientras que la
ausencia de señal indica que la diana no está presente.
Se ensaya una muestra para la presencia de dos
dianas mediante el uso del oligonucleótido descrito anteriormente en
conjunción con otro oligonucleótido. El otro oligonucleótido
también contiene dos secuencias de nucleótidos capaces de formar
una horquilla junto con un fluoróforo donador y un amortiguador
colocados, con respecto a la horquilla, como en el presente
oligonucleótido. El donador del presente oligonucleótido y el otro
oligonucleótido se excitan con la misma, o aproximadamente la misma,
longitud de onda de luz. Sin embargo, el otro nucleótido no
contiene el fluoróforo aceptor y, por tanto, contiene un par MET en
lugar de un trío MET. El presente oligonucleótido y el otro
oligonucleótido son específicos de la primera y segunda diana,
respectivamente.
Si la muestra contiene la primera y segunda
diana, entonces se previene la formación de una horquilla en el
presente oligonucléotido y en el otro oligonucleótido después de que
se realicen las reacciones de amplificación o hibridación.
Posteriormente, la irradiación de la muestra con una única longitud
de onda de luz que excita el fluoróforo donador del presente
oligonucleótido y del otro oligonucleótido, pero no el fluoróforo
aceptor del presente oligonucleótido, provoca que se generen dos
señales distintas. La primera es emitida por el resto aceptor del
oligonucleótido presente, mientras que la segunda señal es emitida
por el fluoróforo donador del otro oligonucleótido. Así, se detecta
la primera diana mediante la observación de la primera señal,
mientras que la segunda diana se detecta mediante la observación de
la segunda señal. Se pueden detectar, por tanto, dos dianas
mediante la irradiación de la muestra con una sola longitud de onda
de luz.
La invención se describe además por referencia a
los ejemplos que siguen, que son sólo ilustrativos.
Se sintetizaron un total de siete
oligonucleótidos. Todos estos oligonucleótidos tienen la siguiente
secuencia de nucleótidos:
5'-ACCGATGCGTTGAGCATCGGTGAAGGTC-GGAGTCAACGGATT-3'
(Nº ID. SEC.: 1). Todos los oligonucleótidos contienen un resto de
fluoresceína (es decir, el primer fluoróforo) unido al nucleótido
en posición 1 y un resto de DABSYL unido al nucleótido en posición
21. Los oligonucleótidos 1 a 4 contienen cada uno un segundo
fluoróforo unido al nucleótido en posición 5, mientras que los
oligonucléotidos 5 a 7 contienen cada uno un segundo fluoróforo
unido al nucleótido en posición 10. El segundo fluoróforo en los
oligonucleótidos 1 a 5 es
N,N,N',N''-tetrametil-6-carboxirrodamina
(TAMRA), en los oligonucleótidos 3 a 6 es ROX, en los
oligonucleótidos 4 a 7 es Rojo Texas y en el oligonucleótido 2 es
Bodipy 564/570.
Los restos de fluoresceína y DABSYL se
incorporaron en cada oligonucleótido durante su síntesis usando un
dA-fluoresceína fosforamidita y un
dU-DABSYL fosforamidita, respectivamente. Además se
unió un resto hexilamina al átomo de carbono en la posición 5 del
resto base de los nucleótidos en posición 5 de los oligonucleótidos
1 a 4, y en posición 10 de los oligonucleótidos 5 a 7. Este resto
hexilamina se incorporó en cada oligonucleótido durante su síntesis
usando un dU-hexilamida fosforamidita.
Después de que se sintetizaron los
oligonucleótidos como se describe anteriormente, cada
oligonucleótido fue desprotegido, eliminadas las sales y purificado
por cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa usando
gradientes de sílica C18 y acetato de
trietilamina-acetonitrilo. Posteriormente se
juntaron las fracciones apropiadas, se precipitaron usando acetona,
se secaron al vacío, se disolvieron y se eliminaron las sales.
Para el análisis espectroscópico de cada
oligonucleótido, se disolvieron de 4 a 5 picomoles de
oligonucleótido en un volumen de 0,6 ml. Se analizó cada solución de
oligonucleótido usando un espectrofluorímetro analítico Shimadzu RFU
5000. Para inducir la conformación cerrada, en la cual el
oligonucleótido contiene una horquilla, se disolvió el
oligonucleótido en tampón de hibridación que contenía
Tris-HCl 10 mM, pH 8, MgCl_{2} 3 mM y NaCl 50 mM.
La conformación abierta, en la cual está ausente la horquilla, se
indujo por la adición en el tampón de hibridación de un exceso
molar de un oligonucleótido complementario sin marcar a cada uno de
los oligonucleótidos, calentando la solución a 90ºC durante tres
minutos y enfriando la solución a temperatura ambiente.
Se excitó el resto de fluoresceína de cada
oligonucleótido en las conformaciones abierta y cerrada por
irradiación. La tabla 1 que sigue demuestra que tal irradiación
tiene como resultado una emisión de luz sustancial por parte del
segundo fluoróforo de cada oligonucleótido en la conformación
abierta. En la conformación cerrada, sin embargo, cada
oligonucleótido muestra poca emisión del segundo fluoróforo en las
longitudes de onda de excitación de la fluoresceína.
Se ensaya una muestra para la presencia de un
ARNm codificado por un gen de un antígeno específico de próstata
(PSA). Como control para asegurar que se puede realizar una reacción
de PCR en la muestra, se añade a la muestra una cantidad de ADNc
específico del gen de la
gliceraldehido-3-fosfato
deshidrogenasa (gapDH).
Los oligonucleótidos en horquilla se usaron como
cebadores directos durante la PCR. La secuencia de nucleótidos del
cebador directo específico del ADNc de la gapDH es
5'-AGCGATGCGTTCGAGCATCGCTGAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3'
(Nº ID. SEC.: 2), en donde los nucleótidos en posición 1 y 22 están
marcados con fluoresceína y DABSYL, respectivamente, y el nucleótido
en posición 5 ó 10 está marcado con TAMRA. La secuencia de
oligonucleótidos del cebador en horquilla específica del ARNm de PSA
es
5'-AGCGATGCGTTCGAGCATCGCTGAAGGTGACCAAGTTCAT-3'
(Nº ID. SEC.: 3), en donde los nucleótidos en posición 1 y 22 están
marcados con fluoresceína y DABSYL, respectivamente. Las secuencias
de nucleótidos de los cebadores inversos específicas para el ADNc
de gapDH y el ARNm de PSA son
5'-GGATCTCGCTCCTGGAAGATGGT-3' (Nº
ID. SEC.: 4) Y
5'-GGTGTACAGGGAAGGCCTTTCGGGAC-3' (Nº
ID. SEC.: 5), respectivamente.
Cada muestra de reacción de PCR contiene, en un
tubo de reacción de PCR de 0,2 ml, Tris-HCl 10 mM,
pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, dNTPs 250 \mum, 0,25 \mum
de cada cebador directo, 0,25 \mum de cada cebador inverso, ADNc
de gapDH y 2 unidades de Taq polimerasa en 50 \mul. Una muestra
control, además contenía el ARNm de PSA, el cual es producido, por
ejemplo, por cultivos celulares de LNCaP disponible en la American
Type Culture Collection, Manassas, VA.
Cada tubo de reacción se coloca en un
termociclador, como un ABI 7700 de tiempo real o un Perkin Elmer
9600 ó 9700. El programa de ciclos es como sigue: [94ºC, 4
min]-[94ºC, 15 s: 55ºC, 30 s: 72ºC,1 min] durante 35 ciclos-[72ºC, 5
min]-[4ºC mantenidos]. El progreso de la amplificación del ADNc de
gapDH se sigue observando directamente la emisión de luz que tiene
una longitud de onda de 580 nm (es decir, la emisión de TAMRA),
mientras que el progreso de la amplificación del ARNm de PSA se
sigue observando directamente la emisión de luz que tiene una
longitud de onda de 530 nm (la emisión de la fluoresceína). El
análisis del punto final es efectuado por medio de un lector
fluorescente de placas, como Wallac Victor equipado con filtros que
permiten la detección de luz de 530 nm y 580 nm.
Claims (53)
1. Un oligonucleótido que contiene:
- (a)
- una primera secuencia de nucleótidos.
- (b)
- una segunda secuencia de nucleótidos en el extremo 5' de la primera secuencia de nucleótidos.
- (c)
- una tercera secuencia de nucleótidos en el extremo 5' de la segunda secuencia de nucleótidos, y
- (d)
- un trío de transferencia de energía molecular que incluye un resto donador de energía y primer y segundo restos aceptores de energía
en
donde,
el resto donador de energía es capaz de emitir un
quantum de energía y el primer y segundo restos aceptores son cada
uno de ellos capaces de absorber una cantidad sustancial del quantum
de energía.
el resto donador está unido a un nucleótido de la
primera secuencia de nucleótidos, el primer resto aceptor está unido
a un nucleótido de la primera secuencia de nucleótidos, y el segundo
resto aceptor está unido a un nucleótido de la tercera secuencia de
nucleótidos; o el resto donador está unido a un nucleótido de la
tercera secuencia, el primer resto aceptor está unido a un
nucleótido de la tercera secuencia de nucleótidos, y el segundo
resto aceptor está unido a un nucleótido de la primera
secuencia.
el oligonucleótido es capaz de formar una
horquilla que contiene un nucleótido de la primera secuencia de
nucleótidos y un nucleótido de la tercera secuencia de nucleótidos,
y
si el resto donador emite el quantum de energía,
entonces:
- (1)
- el primer resto aceptor absorbe una cantidad sustancial del quantum de energía emitida si no se forma la horquilla, y
- (2)
- el segundo resto aceptor absorbe una cantidad sustancial del quantum de energía emitida si se forma la horquilla.
2. El oligonucleótido de la reivindicación 1, en
el que el primer resto aceptor absorbe la cantidad sustancial del
quantum de energía emitido sólo si no se forma la horquilla.
3. El oligonucleótido de la reivindicación 1, en
el que el segundo resto aceptor absorbe la cantidad sustancial del
quantum de energía emitido sólo si se forma la horquilla.
4. El oligonucleótido de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, que comprende un desoxiribonucleótido.
5. El oligonucleótido de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, que además comprende una cuarta secuencia
de nucleótidos en el extremo 3' de la primera secuencia de
nucleótidos.
6. El oligonucleótido de la reivindicación 5, en
el que la tercera secuencia de nucleótidos no es complementaria de
la cuarta secuencia de nucleótidos.
7. El oligonucleótido de la reivindicación 5, en
el que la secuencia de nucleótidos es complementaria de una
secuencia que flanquea una secuencia de nucleótidos diana.
8. El oligonucleótido de la reivindicación 7, en
el que la secuencia de nucleótidos diana es ADN.
9. El oligonucleótido de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el resto donador es un
fluorófofo.
10. El oligonucleótido de la reivindicación 9, en
el que el segundo resto aceptor es un amortiguador de la luz
emitida por el fluoróforo.
11. El oligonucleótido de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el primer resto aceptor es
capaz de emitir otro segundo quantum de energía.
12. El oligonucleótido de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el primer resto aceptor es
un fluoróforo.
13. El oligonucleótido según una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que el resto donador es
fluoresceína.
14. El oligonucleótido según una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que el primer resto aceptor
es ROX.
15. El oligonucleótido de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el segundo resto aceptor es
DABSYL.
16. El oligonucleótido de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que hay de 0 a 50 nucleótidos
entre el nucleótido al que está unido el resto donador y el
nucleótido al que está unido el primer resto aceptor.
17. El oligonucleótido de la reivindicación 16,
en el que hay de 5 a 10 nucleótidos entre el nucleótido al que está
unido el resto donador y el nucleótido al que está unido el primer
resto aceptor.
18. El oligonucleótido de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que hay de 0 a 50 nucleótidos
entre el nucleótido al que está unido el resto donador y el
nucleótido al que está unido el segundo resto aceptor.
19. El oligonucleótido de la reivindicación 18,
en el que hay de 5 a 10 nucleótidos entre el nucleótido al que está
unido el resto donador y el nucleótido al que está unido el segundo
resto aceptor.
20. El oligonucleótido de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes en el que, si se forma la horquilla,
entonces el nucleótido al que está unido el resto donador es el
complementario del nucleótido al que está unido el segundo resto
aceptor.
21. El oligonucleótido de una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes en el que, si se forma la horquilla,
entonces hay de 0 a 5 nucleótidos entre el nucleótido al que está
unido el resto donador y el complementario del nucleótido al que
está unido el segundo resto aceptor.
22. Un oligonucleótido que comprende la secuencia
de nucleótidos de Nº ID.SEC.: 1, en el que la fluoresceína está
unida al nucleótido de la posición 1 de Nº ID. SEC.: 1; ROX está
unido al nucleótido de la posición 21 de Nº ID. SEC.: 1, y DANSYL
está unido al nucleótido de la posición 5 ó 10 de Nº ID. SEC.:
1.
23. El oligonucleótido de la reivindicación 22
que consiste en la secuencia de nucleótido de Nº ID. SEC.: 1.
24. Un kit que comprende el oligonucleótido de
una cualquiera de las reivindicaciones precedentes y una
polimerasa.
25. El kit de la reivindicación 24, en el que la
polimerasa es una ADN polimerasa.
26. Un método para determinar si una secuencia de
nucleótidos diana está presente en una muestra, que comprende:
- (a)
- poner en contacto la muestra con un oligonucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 21 (cuando dependen de la reivindicación 11), 22 ó 23; y
- (b)
- si se detecta el segundo quantum de energía, determinar entonces si la secuencia de nucleótidos diana está presente en la muestra; o si no se detecta el segundo quantum de energía, determinar entonces si la secuencia de nucleótidos diana no está presente en la muestra.
27. Un método para determinar si una secuencia de
nucleótidos diana está presente en una muestra, que comprende:
- (a)
- poner en contacto la muestra con un oligonucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 21 (cuando depende de la reivindicación 11), 22 ó 23; y,
- (b)
- incorporar el oligonucleótido a un ácido nucleico de doble hebra si la secuencia de nucleótidos diana está en la muestra, previniendo de este modo la formación de la horquilla.
- (c)
- opcionalmente llevar a cabo una reacción de amplificación, de este modo, si la secuencia de nucleótidos diana está presente en la muestra el oligonucleótido se incorpora dentro de un producto de amplificación, y
- (d)
- si se detecta el segundo quantum de energía, determinar entonces que la secuencia de nucleótidos diana está presente en la muestra; o si el segundo quantum de energía no se detecta, determinar entonces que la secuencia de nucleótidos diana no está presente en la muestra.
28. El método de la reivindicación 27, en el que
en el paso (b), el oligonucleótido se incorpora en el ácido
nucleico de doble hebra usando una polimerasa.
29. Un método para detectar una secuencia de
nucleótidos diana que comprende:
- (a)
- hibridar un primer oligonucleótido con una secuencia de nucleótidos que flanquea una secuencia de nucleótidos diana, en el que el primer oligonucleótido es uno según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 23.
- (b)
- extender el extremo 3' del primer oligonucleótido usando la secuencia del nucleótido diana como molde para formar una primera hebra extendida, en el que la secuencia de nucleótidos diana se híbrida con la primera hebra extendida;
- (c)
- separar la secuencia de nucleótidos diana de la primera hebra extendida;
- (d)
- hibridar un segundo oligonucleótido con la primera hebra extendida;
- (e)
- extender el extremo 3' del segundo oligonucleótido usando la primera hebra extendida como molde para formar una segunda hebra extendida, en la que la primera hebra extendida híbrida con la segunda hebra extendida;
- (f)
- opcionalmente amplificar la primera y segunda hebras extendidas; y
- (g)
- detectar un segundo quantum de energía emitido por el primer resto aceptor para detectar la secuencia de nucleótidos diana.
30. El método según la reivindicación 29, en el
que el paso (f) comprende:
- (1)
- separar la primera hebra extendida de la segunda hebra extendida;
- (2)
- hibridar el primer oligonucleótido con la segunda hebra extendida, e hibridar el segundo oligonucleótido con la primera hebra extendida;
- (3)
- extender el extremo 3' del primer oligonucleótido usando la segunda hebra extendida como molde para formar otra primera hebra extendida, en el que la segunda hebra extendida hibrida con la otra primera hebra extendida; y extender el extremo 3' del segundo oligonucleótido usando la primera hebra extendida como molde para formar otra segunda hebra extendida, en el que la primera hebra extendida híbrida con la otra hebra segunda extendida; y
- (4)
- repetir los pasos (1), (2) y (3) un número limitado de veces, en el que, en el paso (1), la primera y segunda hebras extendidas son, respectivamente, la primera hebra extendida y la otra segunda hebra extendida del paso (3), o respectivamente son la otra primera hebra extendida y la segunda hebra extendida del paso (3).
31. Un método para detectar una secuencia de
nucleótidos diana que comprende:
- (a)
- hibridar un primer oligonucleótido con una secuencia de nucleótidos que flanquea una secuencia de nucleótidos diana, en el que el primer oligonucleótido contiene:
- (1)
- una primera secuencia de nucleótidos complementaria con la secuencia de nucleótidos que flanquea la secuencia de nucleótidos diana, y
- (2)
- una segunda secuencia de nucleótidos en el extremo 5' de la primera secuencia de nucleótidos.
- (b)
- extender el extremo 3' del primer oligonucleótido usando la secuencia de nucleótidos diana como molde para formar una primera hebra extendida, en el que la secuencia de nucleótidos diana híbrida con la primera hebra extendida;
- (c)
- separar la secuencia de nucleótidos diana de la primera hebra extendida;
- (d)
- hibridar un segundo oligonucleótido con la primer hebra extendida;
- (e)
- extender el extremo 3' del segundo oligonucleótido usando la primera hebra extendida como molde para formar una segunda hebra extendida, en el que la primera hebra extendida hibrida con la segunda hebra extendida;
- (f)
- separar la primera hebra extendida de la segunda hebra extendida;
- (g)
- hibridar un tercer oligonucleótido con la segunda hebra extendida, en el que el tercer oligonucleótido contiene:
- (1)
- una primera secuencia de nucleótidos,
- (2)
- una segunda secuencia de nucleótidos en el extremo 5' de la primera secuencia de nucleótidos,
- (3)
- una tercera secuencia de nucleótidos en el extremo 5' de la segunda secuencia de nucleótidos,
- (4)
- una cuarta secuencia de nucleótidos en el extremo 3' de la primera secuencia de nucleótidos, y
- (5)
- un trío de transferencia de energía molecular que comprende un resto donador de energía y un primer y segundo restos aceptores de energía.
en
donde:
la cuarta secuencia de nucleótidos es
complementaria del complementario de la segunda secuencia de
nucleótidos del primer oligonucleótido,
el resto donador es capaz de emitir un primer
quantum de energía,
el primer y segundo restos aceptores son capaces
de absorber una cantidad sustancial del primer quantum de
energía,
el primer resto aceptor es capaz de emitir un
segundo quantum de energía
el resto donador está unido a un nucleótido de la
primera secuencia de núcleotidos, el primer resto aceptor está unido
a un nucleótido de la primera secuencia de nucleótidos, y el segundo
resto aceptor está unido a un nucleótido de la tercera secuencia de
nucleótidos; o el resto donador está unido a un nucleótido de la
tercera secuencia de nucleótidos, el primer resto aceptor está unido
a un nucleótido de la tercera secuencia de nucleótidos, y el segundo
resto aceptor está unido a un nucleótido de la primera secuencia de
nucleótidos,
el tercer oligonucleótido es capaz de formar una
horquilla que contiene un nucleótido de la primera secuencia de
nucleótidos y un nucleótido de la tercera secuencia de nucleótidos,
y
si el resto donador emite el primer quantum de
energía, entonces el primer resto aceptor absorbe una cantidad
sustancial del primer quantum de energía emitido si la horquilla no
se forma; y el segundo resto aceptor absorbe una cantidad sustancial
del primer quantum de energía emitido si la horquilla se forma.
- (h)
- extender el extremo 3' del tercer oligonucleótido usando la segunda hebra extendida como molde para formar una primera hebra doblemente extendida, en el que la primera hebra doblemente extendida híbrida con la segunda hebra extendida;
- (i)
- separar la primera hebra doblemente extendida de la segunda hebra extendida marcada;
- (j)
- hibridar el segundo oligonucleótido con la primera hebra doblemente extendida;
- (k)
- extender el extremo 3' del segundo oligonucleótido usando la primera hebra doblemente extendida como molde para formar una segunda hebra doblemente extendida.
en el que la primera hebra doblemente extendida
híbrida con la segunda hebra doblemente extendida;
- (l)
- opcionalmente amplificar la primera y segunda hebras doblemente extendidas; y
- (m)
- detectar un segundo quantum de energía emitida por el primer resto aceptor para detectar la secuencia de nucleótidos diana.
32. El método de la reivindicación 31, en el que
el primer resto aceptor absorbe la cantidad sustancial del primer
quantum de energía emitido sólo si no se forma la horquilla.
33. El método de la reivindicación 31, en el que
el primer resto aceptor absorbe la cantidad sustancial del primer
quantum de energía emitido sólo si se forma la horquilla.
34. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 31 a 33, en el que el paso (1) comprende:
- (1)
- separar la primera hebra doblemente extendida de la segunda hebra doblemente extendida;
- (2)
- hibridar el segundo oligonucleótido con la primera hebra doblemente extendida, e hibridar el tercer oligonucleótido con la segunda hebra doblemente extendida;
- (3)
- extender el extremo 3' del segundo oligonucleótido usando la primera hebra doblemente extendida como molde para formar otra segunda hebra doblemente extendida,
en el que la primera hebra doblemente extendida
híbrida con la otra segunda hebra doblemente extendida; y extender
el extremo 3' del tercer oligonucleótido usando la segunda hebra
doblemente extendida como molde para formar otra primera hebra
doblemente extendida, en el que la segunda hebra doblemente
extendida híbrida con la otra primera hebra doblemente extendida;
y
- (4)
- repetir los pasos (1), (2) y (3) por un número limitado de veces, en el que, en el paso (1) la primera y segunda hebras doblemente extendidas, respectivamente, son la primera hebra doblemente extendida y la otra segunda hebra doblemente extendida del paso (3), o respectivamente son la otra primera hebra doblemente extendida y la segunda hebra doblemente extendida del paso (3).
35. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 31 a 34, en el que la tercera secuencia de
nucleótidos no es complementaria de la cuarta secuencia de
nucleótidos.
36. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 31 a 34, en el que la tercera secuencia de
nucleótidos es complementaria de la secuencia de nucleótidos que
flanquea la secuencia de nucleótidos diana.
37. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 31 a 36, en el que el resto donador es
fluoresceína.
38. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 31 a 37, en el que el primer resto aceptor es
ROX.
39. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 31 a 38, en el que el segundo resto aceptor es
DABSYL.
40. Un método para determinar si una primera o
segunda secuencia de nucleótidos diana está presente en una muestra,
que comprende:
- (a)
- poner en contacto la muestra con:
- (1)
- un primer oligonucleótido que contiene:
- (i)
- una primera secuencia de nucleótidos;
- (ii)
- una segunda secuencia de nucleótidos en el extremo 5' de la primera secuencia de nucleótidos;
- (iii)
- una tercera secuencia de nucleótidos en el extremo 5' de la segunda secuencia de nucleótidos; y
- (iv)
- un trío de transferencia de energía molecular que incluye un primer resto donador de energía y un primer y segundo restos aceptores de energía,
en donde,
el primer resto donador de energía es capaz de
emitir un primer quantum de energía,
el primer y segundo restos aceptores son capaces
de absorber una cantidad sustancial del quantum de energía,
el primer resto aceptor es capaz de emitir un
tercer quantum de energía,
el primer resto donador está unido a un
nucleótido de la primera secuencia de nucleótidos, el primer resto
aceptor está unido a un nucleótido de la primera secuencia de
nucleótidos, y el segundo resto aceptor está unido a un nucleótido
de la tercera secuencia de nucleótidos; o el primer resto donador
está unido a un nucleótido de la tercera secuencia de nucleótidos,
el primer resto aceptor está unido a un nucleótido de la tercera
secuencia de nucleótidos, y el segundo resto aceptor está unido a
un nucleótido de la primera secuencia de nucleótidos,
el primer oligonucleótido es capaz de formar una
primera horquilla que contiene un nucleótido de la primera secuencia
de nucleótidos y un nucleótido de la tercera secuencia de
nucleótidos, y
si el primer resto donador emite el primer
quantum de energía, entonces el primer resto aceptor absorbe una
cantidad sustancial del primer quantum de energía emitido si no se
forma la primera horquilla, y el segundo resto aceptor absorbe una
cantidad sustancial del primer quantum de energía emitido si se
forma la primera horquilla, y
- (2)
- un segundo oligonucleótido que contiene:
- (i)
- una cuarta secuencia de nucleótidos;
- (ii)
- una quinta secuencia de nucleótidos en el extremo 5' de la cuarta secuencia de nucleótidos;
- (iii)
- una sexta secuencia de nucleótidos en el extremo 5' de la quinta secuencia de nucleótidos, y
- (iv)
- un par de transferencia de energía molecular que incluye un segundo resto donador de energía, y un tercer resto aceptor de energía,
en donde,
el segundo resto donador de energía es capaz de
emitir un segundo quantum de energía,
el tercer resto aceptor de energía es capaz de
absorber una cantidad sustancial del segundo quantum de energía,
el tercer resto aceptor de energía es capaz de
emitir un cuarto quantum de energía,
el segundo resto donador está unido a un
nucleótido de la cuarta secuencia de nucleótidos y el tercer resto
aceptor está unido a un nucleótido de la sexta secuencia de
nucleótidos; o el segundo resto donador está unido a un nucleótido
de la sexta secuencia de nucleótidos y el tercer resto aceptor está
unido a un nucleótido de la cuarta secuencia de nucleótidos,
el segundo oligonucleótidos es capaz de forma una
segunda horquilla que contiene un nucleótido de la cuarta secuencia
de nucleótidos y un nucleótido de la sexta secuencia de nucleótidos,
y
si el segundo resto donador emite el segundo
quantum de energía, entonces el tercer resto aceptor absorbe una
cantidad sustancial del segundo quantum de energía emitido si se
forma la segunda horquilla,
- (b)
- incorporar
- (1)
- el primer oligonucleótido en un primer ácido nucleico de doble hebra si la primera secuencia de nucleótidos diana está presente en la muestra, previniendo de este modo la formación de la horquilla del primer oligonucleótido, y
- (2)
- el segundo oligonucleótido en un segundo ácido nucleido de doble hebra si la segunda secuencia de nucleótidos diana está presenta en la muestra, previniendo de este modo la formación de la horquilla del segundo oligonucleótido,
- (c)
- opcionalmente llevar a cabo:
- (1)
- una primera reacción de amplificación, incorporando de este modo el primer oligonucleótido en un primer producto de amplificación si la primera secuencia de nucleótidos diana está presente en la muestra, y
- (2)
- una segunda reacción de amplificación, incorporando de este modo el segundo oligonucleótido en un segundo producto de amplificación si la segunda secuencia de nucleótidos diana está presente en la muestra; y
- (d)
- determinar que:
- (1)
- la primera secuencia de nucleótidos está presente en la muestra si se detecta un tercer quantum de energía emitida por el primer resto aceptor, o que la primera secuencia de nucleótidos diana no está presente en la muestra si no se detecta el tercer quantum de energía, y
- (2)
- la segunda secuencia de nucleótidos diana está presente en la muestra si se detecta un cuarto quantum de energía emitida por el tercer resto aceptor, o que la segunda secuencia de nucleótidos diana no está presente en la muestra si no se detecta el cuarto quantum de energía.
41. Un método según la reivindicación 40, en el
que el primer resto aceptor absorbe una cantidad sustancial del
primer quantum de energía emitido sólo si no se forma la primera
horquilla.
42. Un método según la reivindicación 40, en el
que el primer resto aceptor absorbe una cantidad sustancia del
primer quantum de energía emitido sólo si se forma la primera
horquilla.
43. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 40 a 42, en el que el tercer resto aceptor absorbe
una cantidad sustancial del segundo quantum de energía emitido sólo
si se forma la segunda horquilla.
44. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 40 a 43, en el que el primer oligonucleótido además
comprende una séptima secuencia de nucleótidos en el extremo 3' de
la primera secuencia de nucleótidos.
45. El método de la reivindicación 44, en el que
la tercera secuencia de nucleótidos no es complementaria de la
séptima secuencia de nucleótidos.
46. El método de la reivindicación 44, en el que
la séptima secuencia de nucleótidos es complementaria de una
secuencia de nucleótidos que flanquea la primera secuencia de
nucleótidos diana.
47. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 40 a 46, en el que la segunda secuencia de
oligonucleótidos además comprende una octava secuencia de
núcleotidos en el extremo 3' de la cuarta secuencia de
nucleótidos.
48. El método de la reivindicación 47, en el que
la sexta secuencia de nucleótidos no es complementaria de la octava
secuencia de nucleótidos.
49. El método de la reivindicación 47, en el que
la octava secuencia de nucleótidos es complementaria de una
secuencia de nucleótidos que flanquea la segunda secuencia de
nucleótidos diana.
\newpage
50. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 40 a 49, en el que el primer y segundo restos
donadores son fluoresceína.
51. El método según una cualquiera de la
reivindicaciones 40 a 50, en el que el primer resto aceptor es
ROX.
52. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 40 a 51, en el que el segundo y tercer resto
aceptor son DABSYL.
53. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 40 a 52 en el que, en el paso (b) el primer
oligonucleótido se incorpora dentro de los primeros ácidos nucleicos
de doble hebra usando una polimerasa, y el segundo oligonucleótico
se incorpora en el segundo ácido nucleico de doble hebra usando una
polimerasa.
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