ES2206095T3 - Sintetasa de astaxantina. - Google Patents

Abstract

Un DNA aislado que consta de una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima que tiene actividad de sintasa de astaxantina que cataliza la reacción desde beta- caroteno hasta astaxantina, caracterizada porque dicha secuencia de nucleótidos se elige entre secuencias de nucleótidos representadas por SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3.

Description

Sintetasa de astaxantina.

La presente invención se refiere a la producción recombinante de carotenoides (sinónimo: carotinoides) y a materiales biológicos útiles para tal fin.

La Phaffia rhodozyma (P. rhodozyma) es una cepa de levadura carotenogénica que produce la astaxantina. La astaxantina se distribuye en un amplio abanico de organismos, por ejemplo animales (aves, tales como el flamenco y el ibis escarlata, y peces como la trucha arco iris y el salmón), algas y microorganismos. Se ha constatado además que la astaxantina tiene un fuerte efecto antioxidante frente al radical oxígeno, que se espera poder aplicar en usos farmacéuticos para proteger las células vivas contra enfermedades, por ejemplo el cáncer. Además está aumentando la demanda industrial de astaxantina como reactivo colorante, en especial en la industria de los pescados de piscifactoría, por ejemplo el salmón, debido a que la astaxantina imparte una coloración rojo-anaranjada peculiar a los animales y contribuye a atraer al consumidor que acude al mercado.

La P. rhodozyma es conocida como cepa de levadura carotenogénica que produce la astaxantina. A diferencia de otra levadura carotenogénica, la especie Rhodotorula, la P. rhodozyma puede fermentar algunos azúcares, por ejemplo la D-glucosa. Este es un rasgo importante desde el punto de vista de la utilización industrial. En un estudio taxonómico reciente, se ha observado el ciclo sexual de la P. rhodozyma y se ha designado el estado telemórfico con el nombre de Xanthophyllomyces dendrorhous (W.I. Golubev, Yeast 11, 101-110, 1995). Se han realizado algunos estudios de mejora de la cepa con el fin de obtener superproductores de astaxantina a partir de la P. rhodozyma, pero tales esfuerzos se han limitado en esta década a emplear el método de la mutagénesis convencional y la fusión de protoplastos. En fechas más recientes, Wery y col. han desarrollado un sistema de vector hospedante empleando la P. rhodozyma en el que se emplea un plásmido no replicable para integrarlo en multicopias en el genoma del DNA ribosómico de la P. rhodozyma (Wery y col., Gene 184, 89-97, 1997). Verdoes y col. describen vectores mejorados para obtener un transformante de P. rhodozyma así como de sus tres genes carotenogénicos que codifican las enzimas que catalizan las reacciones del pirofosfato de geranilgeranilo para obtener el beta-caroteno (WO 97/23633).

Una vía específica de biosíntesis carotenogénica se deriva de la vía general de isoprenoides en el punto del producto intermedio importante, el pirofosfato de farnesilo (FPP) (figura 1). El FPP y el IPP se condensan por acción de la sintetasa del pirofosfato de geranilgeranilo (GGPP) que se codifica por acción del gen crtE de la P. rhodozyma para producir el GGPP. A continuación, el GGPP se convierte en beta-caroteno por reacción secuencial de una enzima de doble función que actúa como fitoenosintasa y licopenociclasa que se codifica por parte del crtBY y la fitoenodesaturasa que se codifica por parte del crtI.

En las bacterias se han aislado y caracterizado con detalle las enzimas y genes que intervienen en la formación de la xantofila. La hidroxilasa del beta-caroteno, que se codifica con el crtZ, interviene en las dos etapas de hidroxilación del anillo de beta-yonona del beta-caroteno en ambos extremos. El gen crtZ se clona a partir de un gran número de organismos, por ejemplo la Erwinia uredovora (Misawa y col., J. Bacteriol. 172, 6704-6712, 1990), la especie Flavobactor (L. Pasamontes y col., 185 (1), 35-41, 1997) y Agrobacterium aurantiacum (Misawa y col., J. Bacteriol. 177 (22), 6575-6584, 1995). La cetolasa del beta-caroteno, codificada por el crtW, cataliza las dos etapas de introducción del grupo oxo en el anillo de beta-yonona del beta-caroteno por ambos extremos. Kajiwara y col. han clonado y secuenciado los genes bkt correspondientes al crtW en eubacterias del Haematococcus bluvialis (Kajiwara y col., P. Mol. Biol. 29, 343-352, 1995). Harker y col. han clonado y secuenciado también los genes crtO correspondientes al crtW en eubacterias del Synechococcus PCC7942 (Harker y col., FEBS Letters 404, 129-134, 1997). Las dos enzimas, la hidroxilasa y la cetolasa, tienen una gran especificidad de sustrato y esto asegura la formación de un amplio abanico de xantofilas en el caso de que ambas enzimas reacciones al mismo tiempo en función de las condiciones de reacción (figura 1).

Tal como se ha dicho antes se han aislado todos los genes que intervienen en la formación del beta-caroteno a partir del FPP, pero no se han identificado las enzimas y los genes que pueden intervenir en la última etapa de formación de la xantofila a partir del beta-caroteno, por lo menos en los niveles de proteína y ADN de la P. rhodozyma. A pesar de que Johnson y col. (Crit. Rev. Biotechnol. 11 (4), 297-326, 1991) han propuesto la existencia de dos vías independientes para la formación de la astaxantina suponiendo que algunos de los compuestos de xantofila aislados por ello eran productos intermedios de la biosíntesis de la astaxantina, las dos vías independientes citadas no han podido demostrarse porque no se han podido aislar las enzimas y genes que participan en ellas. Además no se puede descartar que estos compuestos de xantofila puedan ser el resultado de un artefacto experimental de la etapa de aislamiento de estos compuestos. El fracaso en aislar un mutante de la P. rhodozyma que acumule productos intermedios en la vía de biosíntesis desde el beta-caroteno hasta la astaxantina impide clarificar la biosíntesis que lleva del beta-caroteno a la astaxantina.

Esta invención se refiere a un gen y una enzima que intervienen en la última etapa de la síntesis de la astaxantina que se inicia en el beta-caroteno y termina en la astaxantina.

La presente invención proporciona un DNA aislado, en concreto un cDNA que contiene una secuencia de nucleótido que codifica la sintetasa de astaxantina que interviene en la reacción que lleva del beta-caroteno a la astaxantina en la P. rhodozyma, por ejemplo el gen AST.

En una forma preferida de ejecución, el fragmento DNA clonado puede caracterizarse porque

(a) dicha secuencia de nucleótido codifica a dicha enzima que tiene una secuencia de aminoácido descrita en la SEQ ID NO: 1 o bien

(b) dicha secuencia de nucleótido codifica a una variante de dicha enzima elegida entre (i) una variante alélica e (ii) una enzima que tenga una o varias adiciones, inserciones, deleciones y/o sustituciones de aminoácidos y que tenga la actividad enzimática prevista.

En otra forma preferida de ejecución, el fragmento cDNA aislado puede derivarse de un gen de la Phaffia rhodozyma y se elige entre:

(i) una secuencia cDNA representada en la SEQ ID NO: 2,

(ii) una variante isocodificante o alélica de la secuencia cDNA representada en la SEQ ID NO: 2 e

(iii) un derivado de una secuencia cDNA representada en la SEQ ID NO: 2 con adición, inserción, deleción y/o sustitución de uno o varios nucleótidos y codificación de un polipéptido que tenga dicha actividad enzimática.

En otra forma preferida de ejecución, la presente invención se refiere al cDNA aislado ya descrito anteriormente, que se caracteriza porque dicha secuencia de nucleótidos es:

(i) una secuencia de nucleótidos representada en SEQ ID NO: 2,

(ii) una secuencia de nucleótidos que, debido a la degeneración del código genético, codifica una sintasa de astaxantina que tiene la misma secuencia de aminoácidos que la codificada por la secuencia de nucleótidos (i) e

(iii) una secuencia de nucleótidos que se híbrida en el complemento de la secuencia de nucleótidos de i) o de ii) en las condiciones estándar de hibridación.

En otra forma preferida de ejecución, el fragmento de DNA genómico aislado puede derivarse de un gen de Phaffia rhodozyma y se elige entre:

(i) una secuencia de DNA genómico representada en la SEQ ID NO: 3,

(ii) una variante isocodificadora o alélica de la secuencia de DNA genómico representada en la SEQ ID NO: 3 e

(iii) un derivado de una secuencia de DNA genómico representada en la SEQ ID NO: 3 con adición, inserción, deleción y/o sustitución de uno o varios nucleótidos y codificación de un polipéptido que tenga la misma actividad enzimática.

En otra forma preferida de ejecución, la presente invención se refiere al DNA genómico aislado, ya descrito anteriormente, que se caracteriza porque dicha secuencia de nucleótidos es:

(i) una secuencia de nucleótidos representada en la SEQ ID NO: 3,

(ii) una secuencia de nucleótidos que, debido a la degeneración del código genético, codifica la sintasa de astaxantina que tiene la misma secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos (i), e

(iii) una secuencia de nucleótidos que se hibrida en el complemento de la secuencia de nucleótidos de i) o de ii) en las condiciones estándar de hibridación.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona un polipéptido recombinante que tiene actividad de sintasa de astaxantina que interviene en la reacción que va desde el beta-caroteno a la astaxantina en la P. rhodozyma, que puede obtenerse por expresión del fragmento de DNA clonado, tal como se indica anteriormente.

Una forma preferida de polipéptido recombinante de la presente invención se caracteriza porque

(a) dicho polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 1, o bien

(b) dicho polipéptido es una variante del péptido definido en (a) que se elige entre (i) una variante alélica e (ii) una enzima que tiene una o varias adiciones, inserciones, deleciones y/o sustituciones de aminoácidos y que tiene la actividad enzimática prevista.

La presente invención se refiere además a variantes de polipéptidos del caso presente. Dichas variantes se definen sobre la base de la secuencia de aminoácidos de la presente invención por adición, inserción, deleción y/o sustitución de uno o varios restos de aminoácido de tales secuencias, en las que dichos derivados tienen todavía el mismo tipo de actividad enzimática que los polipéptidos correspondientes de la presente invención o son el resultado del fenómeno bien conocido de la variación alélica. Tales actividades pueden medirse mediante cualquiera de los ensayos perfectamente conocidos en la técnica o los descritos específicamente en esta memoria. Tales variantes pueden obtenerse ya sea por síntesis química de péptidos, ya conocida en la técnica, ya sea por medios recombinantes basados en secuencias de DNA descritas en la presente por métodos ya conocidos del estado de la técnica, por ejemplo los descritos por Sambrook y col. (Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Nueva York, EE. UU., segunda edición, 1989). Los intercambios de aminoácidos en proteínas y péptidos que por lo general no alteran la actividad de tales moléculas ya se conocen por el estado de la técnica y se han descrito por ejemplo por parte de H. Neurath y R.L. Hill en "The Proteins" (Academic Press, Nueva York, 1979, ver especialmente la figura 6 de la página 14). Los intercambios que se realizan con mayor frecuencia son: Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Art, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly así como los inversos.

Por otro lado, la presente invención se refiere no solo a secuencias de DNA, descritas p.ej. en la lista de secuencias así como sus hebras complementarias, sino también a las que incluyen estas secuencias, secuencias de DNA que se hibridan en condiciones estándar con tales secuencias o fragmentos de las mismas y secuencias de DNA que, por la degeneración del código genético, no se hibridan en condiciones estándar con tales secuencias, pero que codifican a polipéptidos que tienen exactamente la misma secuencia de aminoácidos.

Las "condiciones estándar" de hibridación significan en este contexto las condiciones que un experto emplea habitualmente para detectar señales específicas de hibridación y que se describen p.ej. por parte de Sambrook y col. (loc. cit.) o con preferencia las condiciones llamadas de hibridación astringente y de lavado no astringente, o con mayor preferencia las condiciones llamadas de hibridación astringente y lavado astringente, con las que los expertos están familiarizados y que se describen p.ej. en Sambrook y col. (loc. cit.) o con mayor preferencia las condiciones llamadas de medio astringente, p.ej. empleando un kit marcador de digoxigenina (DIG) y un kit de detección luminiscente de Boehringer Mannheim (Mannheim, Alemania) con arreglo a las instrucciones del fabricante y utilizando la siguiente solución de hibridación:

formamida (WAKO, Osaka, Japón), al 50% (v/v)

5 x SSC

reactivo bloqueante (Boehringer), al 2% (p/v)

N-lauroilsarcosina, al 0,1% (p/v)

SDS, al 0,3% (p/v)

a una temperatura de 42ºC durante una noche y posterior lavado y detección del modo indicado por el fabricante.

Las secuencias de DNA, que se derivan de secuencias de DNA de la presente invención ya sea porque se hibridan con tales secuencias de DNA (ver antes), ya sea porque pueden obtenerse (construirse) por reacción en cadena de polimerasa (PCR) empleando cebadores apropiados sobre la base de dichas secuencias de DNA, pueden obtenerse del modo ya indicado, a saber por reacción PCR o por mutagénesis dirigida a un sitio [ver p.ej. Smith, Ann. Rev. Genet. 19, 423, 1985] o por síntesis del modo descrito p.ej. en EP-747 483 o por los métodos habituales de la clonación molecular, descritos p.ej. en Sambrook y col. (loc. cit.).

La presente invención se refiere además a un vector o plásmido que contiene un DNA ya descrito anteriormente y una célula huésped transformada o transfectada por un DNA ya descrita anteriormente o un vector o plásmido ya indicados anteriormente.

La presente invención proporciona además un organismo recombinante que puede obtenerse por transformación de un huésped empleando un DNA recombinante que lleve el DNA ya mencionado anteriormente.

La presente invención se refiere también a un método de obtención de un polipéptido enzimático capaz de catalizar la reacción de beta-caroteno a astaxantina, que consiste en cultivar un organismo recombinante descrito anteriormente en las condiciones que conducen a la formación de dicho polipéptido enzimático.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de producción de astaxantina que consiste en introducir uno o varios DNA descritos anteriormente en un organismo huésped apropiado y cultivar este organismo transformado en condiciones que conduzcan a la producción de la astaxantina.

Los polipéptidos enzimáticos de la presente invención pueden ser útiles también como método de producción de astaxantina, dicho método consiste en poner en contacto el beta-caroteno con el polipéptido recombinante que tiene actividad de sintasa de astaxantina y que participa en la reacción de beta-caroteno a astaxantina, ya descrita anteriormente, en presencia de un dador de electrones apropiado en una mezcla de reacción idónea que contiene una membrana reconstituida adecuada. En este método, dicho polipéptido recombinante puede estar presente en forma de una membrana reconstituida que se obtiene a partir de membranas biológicas, por ejemplo membranas de microsomas o de mitocondrios. El polipéptido recombinante puede estar presente además en forma de una membrana artificial reconstituida, por ejemplo liposomas. El dador de electrones, por ejemplo la reductasa P450 de citocromas, es un dador de electrones idóneo que puede reducir un centro de reacción de la enzima de la presente invención.

Las figuras siguientes se incluyen para ilustrar con mayor amplitud la presente invención junto con la descripción detallada que sigue.

La figura 1 representa la vía de biosíntesis de la acetil-CoA a la astaxantina en la P. rhodozyma.

La figura 2 representa el mapa de restricción del plásmido pR16 que alberga un gen AST genómico parcial.

En general existe un gran número de métodos para clonar un gen que codifica a enzimas biosintéticas. Puede utilizarse por ejemplo la PCR degenerada. La PCR degenerada es un método para clonar un gen de interés que tiene una gran homología en su secuencia codificada de aminoácidos con una de las enzimas conocidas de otra especia que tiene la misma función o una función similar. Un cebador degenerado, que se utiliza como conjuntado de cebadores en la PCR degenerada, se designa por traducción inversa de la secuencia de aminoácidos en los nucleótidos correspondientes ("degenerados"). En dicho cebador degenerado se utiliza normalmente un cebador mixto que consiste en cualquiera de A, C, G o T, o un cebador que contiene inosina en un código de ambigüedad. Una vez clonado un fragmento parcial del gen de interés puede explorarse (screen) el fragmento genético que contiene el gen completo empleando como sonda el fragmento parcial de DNA clonado y marcado.

En el caso de clonar un gen que codifica una enzima, cuya actividad pueda medirse mediante un ensayo enzimático, un buen método consiste en la purificación de tal enzima por seguimiento (monitoring) de la actividad enzimática y determinación de su secuencia de aminoácidos relativos a la enzima. La secuencia de aminoácidos así obtenida puede traducirse fácilmente a la inversa en la o las correspondientes secuencias de nucleótidos. Puede sintetizarse in vitro un fragmento de DNA que tenga la correspondiente secuencia de nucleótidos con un sintetizador de DNA y marcarse para el uso directo en forma de sonda de hibridación. Un método alternativo de obtener una sonda de hibridación consiste en la PCR degenerada, empleando la información de secuencia de aminoácidos.

Para clonar un gen, cuya función no puede caracterizarse desde el punto de vista enzimático, se ha empleado como método convencional de clonación el método llamado de exploración de escopeta (shot-gun). Este método consiste en aislar una cepa mutante a la que le falta el gen específico que codifica cualquiera de las enzimas biosintéticas de interés y en transformar la cepa mutante con el DNA preparado a partir del organismo que posee un gen intacto que corresponde al gen mutado. Para aislar tal mutante se emplea a menudo la mutagénesis convencional. La confirmación de que el fenotipo adquirido es el mismo que el de la cepa original puede llevarse a cabo examinando su auxotrofia, etcétera. En caso de que el DNA del donante contenga el gen que corresponde al gen mutado de la cepa mutante, el transformante de tal gen adquiere el mismo fenotipo que la cepa original como resultado de la complementación genética.

Como vector puede utilizarse para la clonación tipo escopeta (shot gun) cualquier forma de vector, tanto si replican como no en el huésped de clonación. Para usar un vector replicante es indispensable la capacidad de complementación y no es necesario que tal vector contenga una secuencia homóloga del genoma del receptor. En caso de utilizar un vector no replicante, es necesario que tal vector contenga una secuencia homóloga del genoma del huésped para lograr la recombinación entre el dador y el receptor del DNA.

Para la clonación de los DNA de la presente invención puede emplearse el método llamado "complementación de color". Los organismos no carotenogénicos, como son la Escherichia coli, pueden adquirir una capacidad carotenogénica como resultado de la transformación de los genes carotenogénicos que pueden clonarse a partir de organismos carotenogénicos, por ejemplo la Erwinia uredovora, Erwinia herbicola, etcétera. La E. coli que alberga los genes crtE, crtB, crtI y crtY puede producir el beta-caroteno y colorear las células de amarillo. Por ejemplo, para clonar el gen crtY que codifica a la ciclasa de licopeno, como huésped de transformación se prepara la E. coli que alberga a los crtE, crtB y crtI sobre un vector compatible contra el vector pUC. Dicho huésped vira al rojo, lo cual indica una acumulación de licopeno. A continuación puede generarse (construirse) un cDNA o una biblioteca genómica a partir de organismos carotenogénicos empleando el vector pUC. Si en el plásmido transformado está presente el gen correspondiente a crtY del organismo carotenogénico dador, entonces tendrá lugar una complementación genética y la E. coli se volverá amarilla, lo cual indica que ha adquirido la capacidad de producir beta-caroteno. De hecho, los genes crtE, crtBY y crtI se clonan por este método a partir de la P. rhodozyma (Verdoes y col., WO 97/23633).

En lo que respecta a la clonación de genes que intervienen en la reacción que convierte el beta-caroteno en astaxantina, Kajiwara y col. han formado (construido) una biblioteca de expresión de cDNA a partir de la P. rhodozyma en el huésped E. coli que alberga a los genes crtE, crtB, crtI y crtY de la E. uredovora (Kajiwara y col., WO 96/28545, 1996). En tal sistema de clonación podría clonarse teóricamente a partir de la P. rhodozyma el gen que interviene en la reacción de beta-caroteno a astaxantina por valoración de la pigmentación roja que indica una acumulación de cantaxantina o de astaxantina. Sin embargo, hasta el momento no ha descrito un gen de este tipo. Muchos investigadores especulan acerca de la posibilidad de que las enzimas carotenogénicas fijadas sobre membrana puedan formar un complejo enzimático. En tal modelo, la afinidad entre las enzimas carotenogénicas sería necesaria para lograr una carotenogénesis eficaz. Basándose en tal supuesto, este método de complementación de color no es apropiado para clonar la enzima que interviene en la última etapa de la biosíntesis de la astaxantina, a saber la que va del beta-caroteno a la astaxantina, porque las enzimas exógenas han de tener afinidad con la enzima carotenogénica de la Phaffia en la reacción secuencial de la carotenogénesis.

En esta invención se ha depositado de nuevo la P. rhodozyma ATCC96815 en calidad de depósito acorde con el Tratado de Budapest en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) con el número de entrada 74486 con fecha 18 de febrero de 1999 y se bloquea para la reacción de beta-caroteno a astaxantina en la que se emplea como huésped de transformación (Schroeder, W.A. y Johnson, E.A., J. Ind. Microbiol. 14, 502-507, 1995). Para aislar el clon que produce la astaxantina se utiliza la transformación de este mutante con la biblioteca genómica preparada a partir del genoma de la cepa tipo salvaje de la P. rhodozyma ATCC96594 que se ha depositado nuevamente en calidad de depósito acorde con el Tratado de Budapest en la Colección Americana de Cultivo Tipo (ATCC) con el número de entrada 74438 de fecha 8 de abril de 1998. En la presente invención se aísla el fragmento genético que complementa la reacción de beta-caroteno a astaxantina en la P. rhodozyma y se determina su secuencia de nucleótidos.

Tal gen / DNA de la presente invención puede utilizarse para la superproducción de astaxantina mediante un efecto de dosificación genética empleando la amplificación genética o la modificación de promotor, distintas a la complementación de la mutación bloqueada.

En esta invención se determina la mutación puntual de la cepa de P. rhodozyma ATCC96815 que traslada la producción de beta-caroteno a la cepa de tipo salvaje de P. rhodozyma. Del resultado de la secuenciación se sugiere que el cambio de bases en la secuencia de corte y empalme del octavo intrón del gen AST da lugar a tal fenotipo de acumulación específica de beta-caroteno por el corte y empalme inadecuados del mRNA. El análisis RT-PCR detecta un producto cortado y empalmado de forma inadecuada del gen AST y con fuerte soporte de la identificación del punto de mutación.

Esta invención proporciona además el gen AST recombinante que puede expresarse en diferentes organismos huésped, tales como la E. coli. En esta invención, este gen AST recombinante se expresa en E. coli y se ha confirmado que el tamaño del producto proteico codificado por el gen AST corresponde al peso molecular deducido. La producción biológica de astaxantina puede realizarse empleando el nuevo gen AST y las técnicas de DNA recombinante.

Según la presente invención, el gen que codifica la enzima que interviene en la última etapa de la biosíntesis de la astaxantina se ha clonado a partir de la biblioteca de cDNA de la P. rhodozyma y se ha determinado su secuencia de nucleótidos. Además se ha clonado una parte del DNA genómico, incluidos el promotor y el terminador, y puede utilizarse para la clonación de su gen completo, incluida la región del promotor y del terminador.

Existen diversas estrategias para ampliar la actividad enzimática deseada de la proteína de interés empleando su secuencia de DNA.

Una estrategia consiste en utilizar el mismo gen en su forma nativa. El intento más simple consiste en amplificar la secuencia genómica, incluidas sus secuencias reguladoras, por ejemplo el promotor y el terminador. Esto puede hacerse clonando el fragmento genómico que codifica la enzima de interés en un vector apropiado con un marcador seleccionable que funcione en la P. rhodozyma. Normalmente se emplea como marcador seleccionable un gen de resistencia a los fármacos que codifica a una enzima que permite al huésped sobrevivir en presencia de un antibiótico tóxico. El gen de resistencia G418 que se alberga en gBG-Ph9 (Wery y col., Gene 184, 89-97, 1997) es un ejemplo de tal construcción de vectores. Como vector se emplean normalmente dos tipos de vectores. Uno de estos tipos es un vector de integración que no tiene una secuencia de replicación autónoma. El plásmido pGB-Ph9 es un ejemplo de este tipo de vectores. Debido a que este vector no tiene una secuencia de replicación autónoma, el vector anterior no puede replicar por sí mismo y puede estar presente solamente en forma integrada en el cromosoma del huésped como resultado de una recombinación cruzada simple empleando una secuencia homóloga entre un vector y el cromosoma. Aumentando la concentración del fármaco correspondiente en el medio de selección solo puede sobrevivir la cepa en la que se amplifica el gen integrado en el cromosoma. Otro tipo de vector es un vector replicable que tiene una secuencia de replicación autónoma. Tal vector existe en un estado de multicopia. En este tipo de vectores puede utilizarse un marcador de complementación de nutrición en el huésped que tenga un marcador de auxotrofia apropiado. La cepa ATCC24221 de P. rhodozyma que requiere citidina para crecer es un ejemplo de tal auxótrofo. Utilizando una CTP-sintetasa como dador de ATCC24221 puede estabilizar el sistema de vector huésped empleando una complementación de nutrición.

Otra estrategia para superexpresar una enzima de interés consiste en la colocación del gen de interés en un promotor fuerte. En tal estrategia, el gen de interés tiene que estar necesariamente en estado de multicopia. Puede utilizarse también un promotor, cuya actividad de promotor se induzca en una fase de crecimiento apropiada y en una velocidad apropiada de cultivo. La producción de astaxantina se acelera en la última fase de crecimiento, como es la fase de producción de un metabolito secundario. Por ejemplo, colocando genes carotenogénicos bajo el control de un promotor vegetativo, la expresión de estos genes puede inducirse en la fase de crecimiento exponencial y la producción de astaxantina puede asociarse al crecimiento de la cepa de producción.

En esta invención, el fragmento promotor y terminador del gen de la isomerasa de fosfato de triosa (TPI) se clona a partir de la P. rhodozyma, como ejemplo de tales promotores y terminadores constitutivos. Se confirma además el restablecimiento de la producción de astaxantina en los transformantes en los que se ha expresado el gen AST en diversos lugares (lugar AMY que contiene el gen de amilasa) del cromosoma del beta-caroteno que produce la P. rhodozyma ATCC96815, accionado por el promotor y terminador constitutivos derivados del gen TPI.

Otra estrategia para superexpresar enzimas de interés es la mutación de sus elementos reguladores. A tal fin se inserta entre la secuencia del promotor y la del terminador del gen de interés una especie de gen informador (reporter), por ejemplo un gen de beta-galactosidasa, un gen de luciferasa, un gen de codifique una proteína fluorescente verde, etcétera, de modo que se fusionen y funcionen juntas todas las partes, incluidos el promotor, terminador y el gen informador. Una P. rhodozyma transformada, en la que dicho gen informador se ha introducido en el cromosoma o en el vector, puede mutagenizarse ``in vivo'' para inducir una mutación en la región del promotor del gen de interés. El seguimiento de la mutación puede realizarse detectando el cambio en la actividad codificada por el gen informador. Si la mutación tiene lugar en un elemento cis del gen, el punto de mutación puede determinarse rescatando el gen mutagenizado y secuenciándolo. Esta mutación puede introducirse después en la región del promotor del cromosoma por recombinación entre la secuencia de promotor nativa y la mutada. De igual manera puede realizarse una mutación en el gen que codifica un factor de transacción.

Puede inducirse también una mutación por una mutagénesis ``in vitro'' de un elemento cis en la región del promotor. En este intento se mutageniza un casette genético, que contiene un gen informador que se ha fusionado con la región del promotor derivada de un gen de interés en su extremo 5' y con la región del terminador de un gen de interés en su extremo 3', y a continuación se introduce en la P. rhodozyma. Detectando la diferencia de actividad del gen informador (reporter) se explorará una mutación efectiva. Tal mutación puede introducirse en la secuencia de una región de promotor nativo del cromosoma por el mismo método que en el caso de un ensayo de mutación ``in vivo''.

Como DNA dador se podría introducir un gen que codifique una enzima que cataliza la reacción de beta-caroteno a astaxantina. Puede utilizarse una secuencia de codificación idéntica a su secuencia nativa así como su variante alélica, una secuencia que tenga una o varias adiciones, deleciones y/o sustituciones de aminoácidos, en el supuesto de que su enzima correspondiente tenga el mismo tipo de actividad enzimática. Tal vector puede introducirse en la P. rhodozyma por transformación y los transformantes puede seleccionarse extendiendo las células transformadas sobre un medio apropiado de selección, por ejemplo un medio agar YPD que tenga geneticina en el caso de pGB-Ph9 o un medio agar mínimo sin citidina en el caso de usar ATCC24221 auxótrofa como receptor.

Tal P. rhodozyma producida por ingeniería genética puede cultivarse en un medio apropiado y después se puede evaluar su productividad de astaxantina. Un superproductor de astaxantina seleccionado de este modo se confirmaría en vista de la relación entre su productividad y el nivel de expresión genética o proteica que se ha introducido mediante tal método de ingeniería genética.

Ejemplos

En los ejemplos específicos, descritos seguidamente, se emplean los siguientes materiales y métodos.

Cepas

P. rhodozyma ATCC96594 (esta cepa se ha redepositado el día 8 de abril de 1998 en calidad de depósito acorde con el Tratado de Budapest con la entrada nº 74438)

P. rhodozyma ATCC96815 (esta cepa se ha redepositado el día 18 de febrero de 1999 en calidad de depósito acorde con el Tratado de Budapest con la entrada nº 74486)

E. coli DH5alpha F^{-}, phi80d, lacZdeltaM15, delta(lacZYA-argF)U169, hsd(r_{k}^{-}, m_{k}^{+}), recA1, endA1, deoR, thi-1, supE44, gyrA96, relA1 (Toyobo, Osaka, Japón)

E. coli XL1-Blue MRF': delta(mcrA)183, delta(mcrCB-hsdSMR-mrr)173, endA1, supE44, thi-1, recA1, gyrA96, relA1, lac[F' proAB, lacI^{q}ZdeltaM15, Tn10(tet^{r})] (Stratagene, La Jolla, EE. UU.)

E. coli SOLR: e14^{-}(mcrA), delta(mcrCB-hsdSMR-mrr)171, sbcC, recB, recJ, umuC :: Tn5(kan^{r}), uvrC, lac,
gyrA96, relA1, thi-1, endA1, lambda^{R}, [F' proAB, lacI^{g}ZdeltaM15]Su^{-} (no supresora) (Stratagene)

E. coli TOP10: F^{-}, mcrA, delta(mrr-hsdRMS-mcrBC), phi80, delta(lacZM15), delta(lacX74), recA1, deoR, araD
139, (ara-leu)7697, galU, galK, rpsL(Str^{r}), endA1, nupG (Invitrogen, NV Leek, Holanda)

E. coli BL21 (DE3) (pLysS): dcm^{-}, ompTr_{B}^{-}m_{B}^{-}, lon^{-}lambda(DE3), pLysS (Stratagene)

Vectores

pUC19 (Takara Shuzo, Otsu, Japón)

lambdaZAPII (Stratagene)

pCR2.1-TOPO (Invitrogen)

pET11c (Stratagene)

Medios

La cepa de P. rhodozyma se mantiene habitualmente en un medio YPD (DIFCO, Detroit, EE. UU.). La cepa de E. coli se mantiene en un medio LB (10 g de Bacto-Trypton, 5 g de extracto de levadura (DIFCO) y 5 g de NaCl por litro). Si se prepara un medio agar, se suplementa con un 1,5% de agar (WAKO, Osaka, Japón).

Métodos

Se aplican los métodos generales de biología molecular con arreglo a los descritos en "Molecular cloning: a laboratory manual", 2ª edición (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Las enzimas de restricción y la ligasa de T4-DNA se adquieren a Takara Shuzo.

El aislamiento del DNA cromosómico de la P. rhodozyma se efectúa empleando un QIAGEN Genomic Kit (QIAGEN, Hilden, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. La mini-preparación de DNA plásmido a partir de E. coli transformada se realiza con un sistema automático de aislamiento de DNA (PI-50, Kurabo Co. Ltd., Osaka, Japón). La midi-preparación de DNA plásmido a partir de E. coli transformante se realiza empleando una columna QIAGEN (QIAGEN). Se aísla un fragmento de DNA y se purifica en agarosa empleando QIAquick o QIAEX II (QIAGEN).

Los cebadores de DNA fluorescentes para secuenciar el DNA se adquieren a Pharmacia. La secuenciación de DNA se realiza con el secuenciador de DNA fluorescente automático (ALFred, Pharmacia, Uppsala, Suecia).

Las células correspondientes de DH5alpha se adquieren a Toyobo.

El aparato y el reactivo para la transformación biolística de la P. rhodozyma se adquieren a Nippon Bio-Rad Laboratories (Tokyo, Japón).

Ejemplo 1 Aislamiento de DNA genómico de P. rhodozyma

Para aislar el DNA genómico de la P. rhodozyma, ATCC96594, se emplea el kit genómico de QIAGEN siguiendo el método descrito en las instrucciones del fabricante.

En primer lugar se recolectan por centrifugación (1500 rpm durante 10 min) las células de P. rhodozyma ATCC
96594 a partir de 100 ml de cultivo de una noche en medio YPD y se lavan una vez con tampón TE (10 mM de Tris / HCl (pH 8,0) que contiene 1 mM de EDTA). Una vez suspendidas en 8 ml de tampón Y1 del kit genómico de QIAGEN se añade liticasa (SIGMA, St. Louis, EE. UU.) en una concentración de 2 mg/ml para disgregar las células por degradación enzimática y se incuba la mezcla reaccionante a 30ºC durante 90 minutos y después se efectúa la siguiente etapa de extracción. Finalmente se obtienen 20 \mug de DNA genómico.

Ejemplo 2 Construcción de una biblioteca genómica de la P. rhodozyma ATCC96594

Tal como se ha descrito en la sección "descripción detallada de la invención", se construye un plásmido que alberga un casette de marcador resistente a los fármacos por inserción de un gen de estructura resistente a G418 entre la región del promotor y la del terminador del gen de la deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato (GAP) y ligando este casette en el pUC19 digerido por la KpnI y la HindIII. Este plásmido recibe el nombre de pUC-G418 y se utiliza a continuación. Entonces se liga un engarce (linker) ClaI al único sitio EcoRI del vector pUC-G418 y el plásmido pUC-G418Cl512 resultante que se obtiene se utiliza como esqueleto de vector para la construcción de la biblioteca genómica de la Phaffia.

Seguidamente se digieren parcialmente, del modo descrito en el anterior ejemplo 1, 10 \mug de DNA cromosómico obtenido a partir de la P. rhodozyma ATCC96594 en 1,6 unidades de HpaII a 37ºC durante 45 minutos y se someten a electroforesis a través de gel de agarosa. Una vez efectuada la tinción con bromuro de etidio, se recupera la especie de DNA parcialmente digerido de 4 a 10 kb por electroelución empleando una membrana de diálisis. Se precipita en etanol de los fragmentos recuperados de HpaII se obtienen 1,215 \mug de DNA.

A continuación se digieren 3 \mug de pG418Cl512 en 10 unidades de ClaI a 37ºC durante una hora y se precipitan con etanol. Después se desfosforila el pG418Cl512 digerido en ClaI empleando fosfatasa alcalina de intestino bovino. El vector pG418Cl512 digerido en ClaI y desfosforilado se somete seguidamente a electroforesis a través de gel de agarosa y se recupera el fragmento de DNA empleando el método QIAquick con arreglo a las instrucciones del fabricante. Finalmente se obtienen 2,62 \mug de pG418Cl512 digerido en ClaI y desfosforilado.

Se ligan a 16ºC durante una noche 2,62 \mug de pG418Cl512 digerido en ClaI y desfosforilado a 1,22 \mug de DNA genómico de Phaffia parcialmente digerido en HpaII y la solución resultante de la ligación se utiliza como DNA dador para la transformación de una cepa DH5alpha de E. coli. La mezcla total de ligación (270 \mul) se trasvasa a 1 ml de células competentes de DH5a (Toyobo). Una vez realizado el tratamiento de choque térmico a 42ºC durante 45 minutos después de haber mantenido las células en hielo durante 30 minutos se colocan las células transformadas sobre hielo durante 2 minutos y se incuban a 37ºC durante una hora con la adición de 5 ml de medio SOC:

0,5% de extracto de levadura (DIFCO)

2% de Trypton (DIFCO)

10 mM de NaCl

2,5 mM de KCl

10 mM de MgCl_{2}

20 mM de MgSO_{4}

20 mM de glucosa.

Las células así incubadas se trasladan a 100 ml de medio LB que contiene 100 gamma de ampicilina/ml. Se prosigue el cultivo a 37ºC durante una noche y después se recolectan las células para la midi-preparación de plásmido.

Se obtiene una biblioteca de plásmidos a partir de las células recolectadas empleando columnas midi-prep de QIAGEN siguiendo el método descrito en las instrucciones del fabricante. Finalmente se obtienen 0,3 mg/ml de biblioteca genómica de Phaffia en un volumen total de 5 ml y se utilizan como biblioteca genómica en el estudio ulterior.

Ejemplo 3 Transformación de la P. rhodozyma ATCC96594 con un método biolístico

La transformación se realiza con arreglo al método descrito en "Methods in Molecular Biology" (Johnston y col., 53, 147-153, 1996). En calidad de cepa hospedante se cultiva la P. rhodozyma ATCC96815 en medio YPD en fase estacionaria. Una vez centrifugado el caldo se concentran las células 10 veces con agua esterilizada y se extienden 200 \mul de suspensión celular sobre medio YPD que contiene 100 gamma de geneticina/ml y 0,75 M de manita y sorbita. Se extienden cinco microgramos de la biblioteca genómica, obtenida del modo descrito en el ejemplo 2, sobre 1,5 mg de partículas de oro de 0,9 \mum y se emplean como DNA dador para la transformación biolística. Después de una incubación a 20ºC durante una semana se recogen aproximadamente veinte mil clones resistentes a la geneticina (de 300 a 500 colonias por placa). A pesar de que la mayoría de los transformantes presentan una coloración amarilla (al igual que la cepa hospedante ATCC96815), tres colonias tienen pigmentación roja y se emplean a continuación.

Ejemplo 4 Análisis de carotenoides obtenidos a partir de transformantes pigmentados rojos

Se cultivan en tubos de ensayo a 20ºC en 10 ml de medio YPD los transformantes pigmentados rojos obtenidos a partir de la P. rhodozyma ATCC96815. Después se recolectan las células de 0,5 ml de caldo y se utilizan para extraer carotenoides de dichas células. El contenido en carotenoides de la P. rhodozyma se determina por cromatografía HPLC después de extraer los carotenoides de las células de P. rhodozyma por disgregación con bolas de vidrio. Una vez realizada la extracción se recogen las células disgregadas por centrifugación y se analiza el líquido sobrenadante resultante para determinar su contenido en carotenoides por cromatografía HPLC.

Columna HPLC: Chrompack Lichrosorb si-60 (4,6 mm, 250 mm)

Temperatura: temperatura ambiente

Eluyente: acetona/hexano (18/82) añadiendo 1 ml de agua por litro de eluyente

Volumen a inyectar: 10 \mul

Caudal: 2,0 ml/minuto

Detección: UV, a 450 nm

Se adquiere una muestra de beta-caroteno de la empresa SIGMA y la astaxantina se adquiere de Hoffmann-La Roche (Basilea, Suiza).

Como consecuencia del análisis HPLC se confirma que los tres transformantes rojos producen específicamente astaxantina a pesar de que la cepa hospedante, la ATCC96815, produce solamente beta-caroteno.

Ejemplo 5 Rescate de plásmidos de los cromosomas de los transformantes rojos que producen astaxantina

Se obtiene DNA cromosómico de todos los transformantes que producen astaxantina. A tal efecto se utiliza el kit genómico de QIAGEN con arreglo al método descrito en las instrucciones del fabricante, tal como se indica en el ejemplo 1. De este modo se obtienen 5 \mug de DNA cromosómico que se digieren en HindIII y después se purifican con arreglo al método de QIAquick. Se transforman las células competentes de cepa DH5alpha de E. coli con soluciones de DNA ligado y después se extienden sobre medio agar LB que contiene 100 \mug/ml de ampicilina. Todos los transformantes tienen los mismos fragmentos insertados en sus plásmidos, a juzgar por el análisis de secuencia de dichos plásmidos. Esto indica que los tres transformantes rojos independientes derivados de la P. rhodozyma ATCC96815 se obtienen por el mismo tipo de fenómeno de recombinación entre el DNA dador de la biblioteca genómica y el DNA cromosómico. Uno de los plásmidos rescatados de este modo recibe el nombre de pR2-4 y se utiliza a continuación.

Ejemplo 6 Exploración (screening) de la biblioteca genómica original empleando el pR2-4 como sonda de hibridación

Debido a que el fragmento rescatado de pR2-4 puede tener mutaciones en función de la dirección del fenómeno de recombinación que da lugar a los transformantes rojos de la P. rhodozyma, la exploración de la biblioteca genómica original se realiza empleando el pR2-4 como sonda de hibridación.

A tal efecto se transfieren veinte mil transformantes de E. coli de la biblioteca genómica original, del modo descrito en el ejemplo 2, a filtros de membrana de poliamida (nylon) (Hybond-N+, Amersham, Buckinghamshire, GB) y se someten a hibridación de colonias. Se aíslan tres transformantes que albergan la misma secuencia de nucleótido en su inserto que el pR2-4. Los plásmidos aislados a partir de estos transformantes reciben el nombre de pR3, pR5.1 y pR16.

A continuación se transforma la P. rhodozyma ATCC96815 con el pR3, pR5.1 y pR16. Todos los transformantes tienen coloración roja. Este resultado indica que los plásmidos aislados pueden contener el gen que codifica la enzima que interviene en la reacción de beta-caroteno a astaxantina en la P. rhodozyma. A este gen lo llamaremos gen AST. Entre estos plásmidos, el pR16 se utiliza seguidamente.

Ejemplo 7 Aislamiento de mRNA de la P. rhodozyma para análisis del cDNA

Para analizar los modelos de transcritos de la P. rhodozyma se aísla el RNA total de la P. rhodozyma ATCC96594 y ATCC96815 por extracción con fenol combinada con la disgregación celular con bolas de vidrio y se purifica el mRNA empleando un kit de separación de mRNA (Clontech, Palo Alto, EE. UU.).

En primer lugar se recolectan por centrifugación (1500 rpm durante 10 min.) células de cepas ATCC96594 y ATCC96815 de 10 ml de un cultivo de dos días en medio YPD y se lavan una vez con tampón de extracción (100 mM de Tris/HCl (pH 7,5) que contiene 0,1 M de LiCl y 0,1 mM de EDTA). Después de introducir 5,0 ml de suspensión de células en el mismo tampón de extracción en un tubo desechable de centrífuga de 50 ml (IWAKI Glass, Tokyo, Japón) se añaden 1,5 ml de isogen-LS (Nippon gene, Toyama, Japón) y 10 gramos de bolas de vidrio. Los tubos de centrífuga que contienen la suspensión celular, el isogen-LS y las bolas de vidrio se agitan en una máquina agitadora horizontal de sobremesa durante una hora. En esta etapa se recuperan 300 \mug del RNA total.

A continuación se purifica el mRNA empleando un kit de separación de mRNA (Clontech). De este modo se obtienen 8,0 \mug de mRNA de las cepas ATCC96594 y ATCC96815 de P. rhodozyma.

Para sintetizar el cDNA se emplea un kit SMART para la construcción de cDNA (Clontech) siguiendo el método descrito en las instrucciones del fabricante. Aplicamos 2 \mug de mRNA purificado para la síntesis de la primera hebra y después se realiza la amplificación por PCR, obteniéndose 1 mg de cDNA.

Ejemplo 8 Subclonación de pR16 y análisis funcional de su fragmento insertado

El mapa de restricción del pR16 se representa en la figura 2. Cada fragmento EcoRI, cuya longitud se sitúa entre 0,7 y 2,7 kb, se subclona en pUC-G418 y recibe el nombre de pRS913 y pRLR913, respectivamente.

A continuación se transforma la cepa ATCC96594 de P. rhodozyma que produce la astaxantina con el pRS913. Como resultado de este trabajo de transformación se obtienen transformantes amarillos. Esto sugiere que el fragmento de EcoRI de 0,7 kb puede que contenga un gen AST truncado y que la transformación a través de la recombinación cruzada simple entre el fragmento EcoRI de 0,7 kg y su secuencia homóloga del cromosoma de la P. rhodozyma puede haberse traducido en una disgregación del gen AST del cromosoma de la P. rhodozyma.

Seguidamente se transforma la cepa ATCC96815 que produce beta-caroteno con el pRLR913 y se obtienen transformantes rojos. Esto sugiere que el punto de mutación de la cepa ATCC96815 que hace que la cepa de tipo salvaje que produce astaxantina produzca beta-caroteno se sitúa en el fragmento EcoRi de 2,7 kg que está situado originalmente en posición adyacente al fragmento EcoRI de 0,7 kb en el pR16.

Se someten a electroforesis a través de gel de agarosa dos mil \mug de cDNA obtenido en el ejemplo 7, para un análisis Northern virtual. En este caso de los cDNA obtenidos a partir de ATCC96594 y 96815, dos bandas de los mismos, a saber de 3,2 y de 2,0 kb, se hibridan en ambos casos empleando el fragmento EcoRI de 2,7 kb del pRLR913 como sonda de hibridación. Esto sugiere que la mutación de AST de la cepa ATCC96815 sería una mutación puntual que no se reflejaría en un cambio de longitud del mRNA, como el que produciría una mutación de sentido erróneo (missense).

En caso de utilizar como sonda de hibridación el fragmento EcoRI de 0,7 kb del pRS913 se hibrida una banda de 2,0 kb. A partir de este trabajo de investigación parece que el gen AST pueda dar un transcrito de 2,0 kb en la P. rhodozyma.

Ejemplo 9 Clonación del cDNA del gen AST

Para clonar el cDNA del gen AST de la P. rhodozyma hemos construido una biblioteca de cDNA a partir de la cepa ATCC96594 de la P. rhodozyma. Se aísla el RNA total por extracción con fenol combinada con disgregación de las células con bolas de vidrio, del modo descrito en el ejemplo 7.

En primer lugar se recolectan por centrifugación (1500 rpm durante 10 min.) células de la cepa ATCC96594 a partir de 50 ml de un cultivo de dos días en medio YPD y se lavan una vez con tampón de extracción (100 mM de Tris / HCl (pH 7,5) que contiene 0,1 M de LiCl y 0,1 mM de EDTA). Se introducen 5,0 ml de suspensión celular con el mismo tampón de extracción en tubos de centrífuga desechables de 50 ml (IWAKI Glass) y se les añaden 1,5 ml de isogen-LS (Nippon gene) y 10 gramos de bolas de vidrio. Se agitan los tubos de centrífuga que contienen la suspensión celular, el isogen-LS y las bolas de vidrio en una máquina agitadora horizontal de sobremesa durante una hora. En esta etapa se recogen 1,8 mg de RNA total.

A continuación se purifica el mRNA empleando el sistema de aislamiento PolyATtract mRNA (Promega Corp., Madison, EE. UU.) con arreglo al método descrito en las instrucciones del fabricante. Finalmente se obtienen 8,0 \mug de mRNA de la cepa ATCC96594 de P. rhodozyma.

Para construir una biblioteca de cDNA se emplean 8,0 \mug del mRNA purificado en un kit COPY (Invitrogen, Carlsbad, EE. UU.) con arreglo al método descrito en las instrucciones del fabricante. Después de la ligación de un adaptador EcoRI (Stratagene) se somete el cDNA sintetizado a una electroforesis a través de gel de agarosa. Después de la escisión (excision) de la pieza de gel de agarosa que abarca la longitud de cDNA de 1,9 a 2,3 kb se purifica la especie cDNA recolectada por un QIAEX II (QIAGEN). El cDNA clasificado por tamaños se liga a un lambdaZAPII digerido con EcoRI y desfosforilado (Stratagene). La mezcla de ligación de una noche se empaqueta ``in vitro'' con extracto de oro Gigapack III (Stratagene) y se utiliza para infectar la cepa XL1-Blue MRF' de E. coli.

La exploración (screening) convencional de placas se realiza frente a 6000 placas empleando los fragmentos EcoRI 2,7 y 0,7 kb como sondas de hibridación, del modo descrito en el ejemplo 8. Una placa se hibrida intensamente con estas sondas, se recoge con un palillo esterilizado y la partícula eluida del fago se emplea para la escisión (excision) ``in vivo'', con arreglo al método descrito en las instrucciones del fabricante. Finalmente se aíslan los transformantes infectados con células SOLR de E. coli que muestran resistencia a la ampicilina. Una vez secuenciados los plásmidos aislados obtenidos a partir de estos transformantes se constata que estos plásmidos contienen el mismo fragmento que una parte de la secuencia de pR16 que se ha descrito en el ejemplo 6.

Se determina la secuencia completa de cDNA del gen AST y se presenta en la SEQ ID NO: 2 y su secuencia deducida de aminoácidos en la SEQ ID NO: 1.

Ejemplo 10 Caracterización ``in vitro'' del producto genético AST

Para la caracterización enzimática del producto genético AST puede aplicarse un ensayo estándar que se utiliza para la caracterización de las enzimas P450. A tal efecto es necesario que la mezcla reaccionante contenga una membrana reconstituida. En calidad de membrana reconstituida se utilizan a menudo los aislados naturales, por ejemplo membranas mitocondriales o los microsomas y membranas artificiales. En algunos casos es necesario realizar una transferencia electrónica entre un aceptor de electrones y un dador. Como dador de electrones se suele añadir a la mezcla reaccionante la reductasa citocrómica de P450. En calidad de aceptor de electrones se emplean moléculas de oxígeno. En presencia de una fuente de electrones, por ejemplo el NADPH+ reducido, puede convertirse en astaxantina el beta-caroteno, que es un sustrato de la sintasa de astaxantina. La astaxantina producida puede someterse a ensayos cualitativos y cuantitativos mediante cromatografía HPLC.

Ejemplo 11 Clonación del fragmento genómico que contiene el gen AST

Para determinar la secuencia genómica que contiene el gen AST se realiza un ensayo de secuenciación empleando el procedimiento de rondas de cebos (primer-walking). El análisis de secuencia del pRS913 indica que el pRS913 no contiene el extremo 3' del gen AST. Para introducir el fragmento genómico adyacente de 3' en el gen AST se realiza el ensayo de rondas (walking) de genoma. Para ello se emplea el kit universal "genome walker" (Clontech) con arreglo al método descrito en las instrucciones del fabricante. Se emplea como molde de la PCR un DNA cromosómico obtenido en el ejemplo 1. Se sintetiza el cebador específico del gen, el ast15, cuya secuencia se recoge en la tabla 1 y se utiliza como cebador de la PCR.

Tabla 1

Secuencia del cebador empleado en las rondas (walking) de genoma del gen AST

ast15: TAGAGAGAAGGAGGGGTACCAGATGC (SEQ ID NO. 9)

De la biblioteca EcoRV y StuI se obtienen fragmentos de PCR de longitud adecuada (menores que 1 kb), se purifican y se clonan en el pCR2.1-TOPO (Invitrogen). Como resultado de la secuenciación se encuentra que ambos fragmentos contienen un fragmento genómico contenido en el gen AST. Basándose en la secuencia, que se sitúa a 200 bp del sitio polyA del gen AST, se designa el cebador de la PCR que se reseña en la tabla 2.

Tabla 2

Secuencia de cebador para clonar el fragmento adyacente a 3' en gen AST

ast18: CCCCGGATTGTGGAGAAACT (SEQ ID NO: 10)

Empleando los cebadores ast15 y ast18 como cebadores de la CPR y el DNA cromósico obtenido en el ejemplo 1 como molde de la PCR se efectúa la PCR. La polimerasa correctora de lectura (o editora, = proofreading) (polimerasa HF, Clontech) asegura que la amplificación de los fragmentos de la PCR tenga la secuencia exacta. Las condiciones de la PCR son las siguientes: 25 ciclos de 15 segundos a 94ºC, 30 segundos a 55ºC y 30 segundos a 72ºC. Seis clones independientes, que tenían insertos de 400 bp, presentan una secuencia idéntica.

Combinando con secuencias de pRS913 y pRL913 se determina un gen AST que contiene una secuencia de 3,9 kb en la que la región del promotor tiene 474 bp y la región del terminador tiene 269 bp (SEQ ID NO: 3). Por consiguiente, el gen AST posee una estructura rica en intrones (17 intrones).

Ejemplo 12 Determinación del punto de mutación de la cepa ATCC96815 de P. rhodozyma que produce beta-caroteno

Para confirmar el hecho de que la producción de beta-caroteno por parte de la cepa ATCC96815 de P. rhodozyma se debía a la mutación dentro del gen AST se determina la secuencia genómica que contiene el gen AST obtenido a partir de la cepa ATCC96815 y de su cepa original, la ATCC24230 de la P. rhodozyma. Para ello se sintetizan los cebadores de la PCR, cuyas secuencias se recogen en la tabla 3, y se emplean para la clonación por PCR.

Tabla 3

Cebadores de PCR para clonar gene AST genómico entero

ast21: ATGTTCATCTTGGTCTTGCT (cebador de sentido) (SEQ ID NO: 11)

ast4: ACGTAGAAGTCATAGCGCCT (cebador antisentido) (SEQ ID NO: 12)

Empleando la polimerasa HF (Clontech) como polimerasa de la PCR y DNA cromosómico, obtenido a partir de las cepas ATCC96815 y ATCC24230 por el mismo método descrito en el ejemplo 1, como molde de la PCR se realiza una PCR en las condiciones siguientes: 25 ciclos de 15 segundos a 94ºC, 30 segundos a 55ºC y 4 minutos a 72ºC. Los fragmentos PCR obtenidos, cuya longitud aproximada es de 3,5 kb, se clonan en el pCR2.1-TOPO y se secuencian en la totalidad de sus secuencias por el procedimiento de rondas de cebador (primer walking). Se encuentran 7 cambios de bases entre la secuencia de la cepa ATCC96594 y de la cepa ATCC24230 de la P. rhodozyma. Cuatro cambios de bases se encuentran en su secuencia de exón, pero estos cambios no se traducen en cambio alguno de aminoácidos. Se encuentran tres cambios de bases en su estructura de intrón. En la comparación de la cepa ATCC96815, que produce beta-caroteno, con su cepa original, la ATCC24230, se observa un cambio de bases que se sitúa en la secuencia de corte y empalme de 5' (GTAAGT > GTAAAT) dentro del octavo intrón. Esto podría indicar que la mutación, que transfiere el fenotino de acumulación de beta-caroteno a la P. rhodozyma que produce la astaxantina, estaría provocada por un corte y empalme incorrectos del mRNA del gen AST.

Para confirmar esta hipótesis se realiza una RT-PCR empleando como molde de la PCR un cDNA obtenido a partir de la cepa ATCC96815 de la P. rhodozyma. El mRNA se aísla de la ATCC96815 de la P. rhodozyma por el mismo método. Para obtener el cDNA a partir de este mRNA, obtenido de la ATCC96815 por el método de la PCR, se aplica un kit de construcción de bibliotecas SMART PCR cDNA (Clontech) con arreglo al método descrito en las instrucciones del fabricante. Se sintetizan los cebadores siguientes, cuya secuencia se recoge en la tabla 4 y que abarca el octavo intrón, y se utilizan como cebadores en la PCR.

Tabla 4

Cebadores PCR para la RT-PCR para detectar el producto de corte y empalme incorrectos del gen AST

ast7: TTTGACTCAAGGATTAGCAG (cebador de sentido) (SEQ ID NO: 13)

ast26: TGTCTTCTGAGAGTCGGTGA (cebador antisentido) (SEQ ID NO: 14)

Las condiciones de la RT-PCR son las siguientes: 25 ciclos de 15 segundos a 94ºC, 30 segundos a 55ºC y 30 segundos a 72ºC. Como resultado de la PCR se amplifican 300 bp de productos PCR y se clonan en el pCR2.1-TOPO. Se secuencian dos clones independientes que tienen un inserto de 300 bp. Por lo tanto se confirma que los productos de corte y empalme incorrectos del gen AST se sintetizan en la cepa ATCC96815 de la P. rhodozyma. El corte y empalme incorrectos del octavo intrón del gen AST podría provocar la producción de una proteína AST truncada más corta que la proteína AST cortada y empalmada correctamente, porque el codón de terminación (stop codon) está situado en el octavo intrón. Este resultado indica que el punto de mutación se sitúa en el gen AST que no logra realizar un corte y empalme correctos.

Ejemplo 13 Fermentación en frasco por recombinantes en la que el gen AST recombinante se integra en el cromosoma de la P. rhodozyma que produce beta-caroteno

La productividad de astaxantina se valúa en la fermentación en frasco. La formulación del medio para la fermentación en frasco es la siguiente.

TABLA 5 Formulación de medio de siembra para la fermentación en frasco

glucosa	30,0 g/l
NH_{4}Cl	4,83 g/l
KH_{2}PO_{4}	1,0 g/l
MgSO_{4}-7H_{2}O	0,88 g/l
NaCl	0,06 g/l
CaCl_{2}-2H_{2}O	0,2 g/l
KH-ftalato	20,0 g/l
FeSO_{4}-7H_{2}O	28 mg/l
ácido cítrico-1H_{2}O	15,0 mg/l
ZnSO_{4}-7H_{2}O	40,0 mg/l
CuSO_{4}-5H_{2}O	0,75 mg/l
MnSO_{4}-4,5H_{2}O	0,6 mg/l
H_{3}BO_{3}	0,6 mg/l
Na_{2}MoO_{4}-2H_{2}O	0,6 mg/l
KI	0,15 mg/l
mio-inositol	60,0 mg/l
ácido nicotínico	3,0 mg/l
D-pantotenato Ca	3,0 mg/l
vitamina B1 (tiamina HCl)	3,0 mg/l
ácido p-aminobenzoico	1,8 mg/l

vitamina B6 (piridoxina HCl)	0,3 mg/l
biotina	0,048 mg/l
7 m / tubo de ensayo (diámetro: 21 mm)

TABLA 6 Formulación del medio para la fermentación en frasco

MgSO_{4}-7H_{2}O	2,1 g/l
CaCl_{2}-2H_{2}O	0,865 g/l
(NH_{4})_{2}SO_{4}	3,7 g/l
FeSO_{4}-7H_{2}O	0,28 g/l
glucosa (esterilizada aparte)	22 g/l
KH_{2}PO_{4} (esterilizado aparte)	14,25 g/l
ácido cítrico-1H_{2}O	0,21 g/l
ZnSO_{4}-7H_{2}O	70,14 mg/l
CuSO_{4}-5H_{2}O	10,5 mg/l
MnSO_{4}-4,5H_{2}O	8,4 mg/l
H_{3}BO_{3}	8,4 mg/l
Na_{2}MoO_{4}-2H_{2}O	8,4 mg/l
KI	2,1 mg/l
mio-inositol	0,374 mg/l
ácido nicotínico	18,7 mg/l
D-pantotenato Ca	28,05 mg/l
vitamina B1 (tiamina HCl)	18,7 mg/l
ácido p-aminobenzoico	11,22 mg/l
vitamina B6 (piridoxina HCl)	1,87 mg/l
biotina	1,122 mg/l
CaCO_{3}	10 g/l

Se añade a cada frasco 1 gota de Actcol (Takeda Chemical Industries Ltd., Osaka, Japón).

50 ml (volumen final con 5% de inóculo sembrado)/500 ml de frasco con "buffles".

Se recolectan las células del caldo de fermentado después de una fermentación de 7 días y se analiza su acumulación de astaxantina y de beta-caroteno por cromatografía HPLC según lo descrito en el ejemplo 4. Los resultados se recogen en la tabla 7.

TABLA 7

Restablecimiento de la producción de astaxantina en los recombinantes en los que se ha integrado el gen AST. (Los datos se presentan como valor relativo de astaxantina y de beta-caroteno con respecto al valor del beta-caroteno acumulado por la cepa ATCC96815 de P. rhodozyma.)

	Valor relativo (%)
cepa	astaxantina	beta-caroteno
ATCC96815 :: pR16	34,0%	18,6%
ATCC96815	0%	100%

\vskip0.333000\baselineskip

<110> F:HOFFMANN-LA ROCHE. AG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<120> Mejora de la producción de astaxantina y del material biológico para ella

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<130> P450ast

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<140>

\vskip0.333000\baselineskip

<141>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<160> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 557

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Phaffia rhodozyma

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> TRANSITO

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (1)..(26)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

1

2

3

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 1932

\vskip0.333000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Phaffia rhodozyma

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (33)..(1706)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> sitio polyA

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (1871)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> mRNA

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (14)..(1891)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

4

5

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 3969

\vskip0.333000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Phaffia rhodozyma

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> 5'UTR

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (517)..(518)

\vskip0.333000\baselineskip

<223> EXPERIMENTAL

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (535)..(652)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (653)..(734)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (735)..(783)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (784)..(898)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (899)..(1015)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (1016)..(1087)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (1088)..(1179)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (1180)..(1302)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (1303)..(1517)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (1518)..(1600)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (1601)..(1634)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (1635)..(1723)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (1724)..(1866)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (1867)..(1939)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (1940)..(1999)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (2000)..(2081)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (2082)..(2181)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (2182)..(2257)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (2258)..(2354)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (2355)..(2431)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (2432)..(2542)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (2543)..(2618)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (2619)..(2652)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (2653)..(2742)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (2743)..(2814)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (2815)..(2962)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (2963)..(3050)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (3051)..(3113)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (3114)..(3171)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (3172)..(3247)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (3248)..(3321)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (3322)..(3398)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (3399)..(3423)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> intrón

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (3424)..(3513)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> exón

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (3514)..(3700)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221>

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (3865)..(3866)

\vskip0.333000\baselineskip

<223> EXPERIMENTAL

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

10

11

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.333000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Artificial Secuencia

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de sentido para la expresión del gen AST en la E. coli:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

gttcaaagtt catttatgga

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.333000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de sentido para la expresión del gen AST en la E. coli:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

ggatcctcag tggtggtggt ggtggtgttc gaccggcttg acctgca

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.333000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de sentido 5', para la expresión del gen AST modificado en la E. coli:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

catatgcacc accaccacca ccacctgtat aaccttcagg ggccc

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.333000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de sentido 5' para la expresión del ges AST modificado en la E. coli:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

gtaacaacac catctccggt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.333000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de sentido 3' para la expresión del gen AST modificado en la E. coli:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

ggatcctcaa ctcattcgac cggctt

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.333000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador antisentido para la clonación de la región de terminador del gen AST

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

ccccggattg tggagaaact

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.333000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de sentido para la clonación del gen AST genómico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

atgttcatct tggtcttgct

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.333000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador antisentido para la clonación del gen AST genómico

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

acgtagaagt catagcggcct

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.333000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador antisentido para la RT-PCR del gen AST

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 13

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

tttgactcaa ggattagcag

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.333000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\dddseqskip

tgtcttctga gagtcggtga

\hfill

20

Claims (8)

1. Un DNA aislado que consta de una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima que tiene actividad de sintasa de astaxantina que cataliza la reacción desde beta-caroteno hasta astaxantina, caracterizada porque dicha secuencia de nucleótidos se elige entre secuencias de nucleótidos representadas por SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3.

2. El DNA aislado de la reivindicación 1, caracterizado porque dicha secuencia de nucleótidos es:

(a) una secuencia de nucleótidos que, debido a la degeneración del código genético, codifica la sintasa de astaxantina que tiene la misma secuencia de aminoácidos codificada por las secuencias de nucleótidos indicadas con SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3;

(b) una secuencia de nucleótidos que se hibrida con el complemento de la secuencias de nucleótidos SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3 que codifican una sintasa de astaxantina en las condiciones hibridación en medio astringente: formamida al 50% (v/v), 5 x SSC, reactivo bloqueante al 2% (p/v), N-lauroilsarcosina al 0,1% (p/v) y SDS al 0,3% (p/v), a una temperatura de 42ºC durante una noche.

3. Un vector o plásmido que contiene el DNA aislado reivindicado en las reivindicaciones 1 ó 2.

4. Una célula hospedante transformada o transfectada por el DNA aislado reivindicado en las reivindicaciones 1 ó 2 o un vector o plásmido reivindicado en la reivindicación 3.

5. Un polipéptido codificado por el DNA aislado reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4.

6. Un proceso para la producción de un polipéptido que tiene la actividad de sintasa de astaxantina que consiste en cultivar una célula hospedante transformada, reivindicada en la reivindicación 4, en las condiciones que conducen a la producción de dicha enzima.

7. Un proceso para la producción biológica de astaxantina que consiste en introducir uno o varios DNA aislados, reivindicados en la reivindicación 1 ó 2, en un organismo hospedante idóneo, en cultivar el organismo resultante en las condiciones que conducen a la producción de astaxantina y en recuperar la astaxantina del cultivo.

8. Un proceso de producción de astaxantina, dicho proceso consiste en poner en contacto el beta-caroteno con un polipéptido codificado por las secuencias de nucleótidos representadas en SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3 y que tiene la actividad de sintasa de astaxantina en presencia de un dador de electrones, por ejemplo la reductasa P450 citocrómica, que puede reducir el centro de reacción del polipéptido en una mezcla reaccionante que contiene el polipéptido en forma de membrana reconstituida, que se obtiene a partir de una membrana biológica, por ejemplo un microsoma o una membrana mitocondrial, o bien en la que el polipéptido está presente en forma de una membrana artificial reconstituida, por ejemplo un liposoma.