ES2254285T3 - Proceso para la produccion de astaxantina. - Google Patents

Proceso para la produccion de astaxantina.

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ES2254285T3 ES01112221T ES01112221T ES2254285T3 ES 2254285 T3 ES2254285 T3 ES 2254285T3 ES 01112221 T ES01112221 T ES 01112221T ES 01112221 T ES01112221 T ES 01112221T ES 2254285 T3 ES2254285 T3 ES 2254285T3
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Kazuyuki Ojima
Yutaka Setoguchi
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Abstract

Un proceso para producir carotenoides, que consiste en tratar un organismo original (madre; inglés = parent) capaz de producir carotenoides para inducir una reducción de la actividad de la oxidasa alternativa y seleccionar un organismo cuya producción de carotenoides se haya ampliado y en cultivar el organismo seleccionado.

Description

Proceso para la producción de astaxantina.
Ámbito de la invención
La presente invención se refiere a la biología molecular para la obtención de carotenoides y a materiales biológicos útiles para ello.
Antecedentes de la invención
Se sabe que la astaxantina está distribuida en una amplia variedad de organismos, por ejemplo animales (p.ej. aves tales como el flamenco y el ibis escarlata y peces tales como la trucha arco iris y el salmón), algas y microorganismos. Se ha reconocido además que la astaxantina tiene una fuerte propiedad antioxidante frente a especies reactivas del oxígeno, se espera poder aplicar esta propiedad al uso farmacéutico para proteger las células vivas contra algunas enfermedades, por ejemplo el cáncer. Por otro lado, desde el punto de vista de la utilización industrial, está aumentando la demanda de la astaxantina como reactivo colorante, en especial en la industria de las piscifactorías, por ejemplo de salmón, porque la astaxantina confiere una coloración rojo-anaranjada distintiva a los animales y contribuye a la atracción del consumidor en el mercado.
Se sabe que la Phaffia rhodozyma es una cepa de levadura carotenogénica que produce específicamente la astaxantina. A diferencia de la especie Rhodotorula, otra levadura carotenogénica, la Phaffia rhodozyma (P. rhodozyma) puede fermentar algunos azúcares, por ejemplo la D-glucosa. Esta es una característica importante desde el punto de vista de la aplicación industrial. En un estudio taxonómico reciente se ha descrito el ciclo sexual de la P. rhodozyma y su estadio telemórfico se ha designado con el nombre de Xantophyllomyces dendrorhous ((W.I. Golubev, Yeast 11, 101-110, 1995). Se han realizado algunos estudios de mejora de la cepa para obtener superproductores de astaxantina a partir de la P. rhodozyma, pero estos esfuerzos se han limitado en esta década a emplear el método de la mutagénesis convencional y la fusión de protoplastos. Recientemente, Wery y col. han desarrollado un sistema de vector hospedante empleando la P. rhodozyma, en el que se emplea un plásmido no replicable que se integra en el genoma de la P. rhodozyma, en un lugar del DNA ribosómico en multicopias (Wery y col., Gene 184, 89-97, 1997). Y Verdoes y col. describen vectores más perfeccionados para obtener un transformado de la P. rhodozyma así como sus genes carotenogénicos que codifican las enzimas que catalizan las reacciones del pirofosfato de geranil-geranilo con el beta-caroteno (publicación de patente internacional WO 97/23633). La importancia del método de ingeniería genética en el estudio de mejora de la cepa de P. rhodozyma aumentará en un futuro próximo para imponerse a la productividad alcanzada con los métodos convencionales.
Muchos investigadores han especulado con que la astaxantina pueda desempeñar un papel como antioxidante en la Phaffia rhodozyma, porque su producción se estimula en una fase de respiración del crecimiento, más que en la fase de fermentación. En general, las especies reactivas del oxígeno tienden a generarse en la fase de respiración como resultado del desbordamiento electrónico de la cadena respiratoria, provocado por el desequilibrio de la transferencia de electrones entre la velocidad de reducción de las existencias (pool) de ubiquinona y la transferencia de electrones en dirección a 3' (downstream) de la cadena respiratoria. En tal especulación, la astaxantina podría neutralizar dichas especies reactivas del oxígeno, al igual que lo hace la superoxidodismutasa en los organismos vivos.
Schroeder y col. (J. Biol. Chem. 270, 18374-18379, 1995) describen que la cadena respiratoria de la Phaffia rhodozyma se ha desplazado desde la respiración sensible al KCN a otra resistente al KCN en la última fase del crecimiento, cuando se estimula la producción de astaxantina. La cadena respiratoria sensible al KCN es la cadena de transferencia electrónica común, en la que el electrón dentro de las existencias de ubiquinona se transfiere al complejo IV a través del complejo III, que está distribuido en una amplia variedad de organismos. Ya se conoce que esta cadena respiratoria se inhibe con el KCN o la antimicina A. Por otro lado, la cadena respiratoria resistente al KCN está distribuida en plantas y hongos. En esta cadena respiratoria, la proteína de membrana mitocondrial, llamada oxidasa alternativa (AOX), desempeña un papel sustancial en la transferencia del electrón de las existencias de ubiquinona a la molécula de H_{2}O utilizando una molécula de oxígeno como receptor. Se sabe que la actividad de la AOX se inhibe con el galato de n-propilo (n-PG) o con el ácido salicilhidroxámico (SHAM).
En su estudio de caracterización de superproductores, sensibles a la antimicina, de astaxantina derivados de la Phaffia rhodozyma, An y col. (Appl. Env. Microbiol. 55, 116-124, 1989) hacen la especulación de que tales mutantes producen mucha más astaxantina para neutralizar las especies reactivas de oxígeno, que pueden producirse por el desbordamiento de electrones procedente de la cadena de transferencia de electrones.
En "Neurospora crassa alternative oxidase...", Q. Liet y col., Genetics, vol. 142, nº 1, 129-140, 1996, describen la clonación y el análisis del gen de oxidasa alternativa de la Neurospora crassa. Los mitocondrios de Neurospora crassa contienen un mecanismo respiratorio alternativo resistente al cianuro además del mecanismo citocrómico. La oxidasa alternativa está presente solamente cuando está restringido el flujo de electrones a través de la cadena citocrómica. Se han aislado y analizado tanto el cDNA genómico como las copias de cDNA del gen de oxidasa alternativa. En esta publicación se describe también la secuencia de ácido nucleico del gen de la oxidasa alternativa (ALTOX) de la Neurospora crassa y la correspondiente secuencia codificante de aminoácidos.
En el documento WO 91/02060 se describe la producción de una levadura que tiene un contenido ampliado de astaxantina y que consiste en someter a la levadura a cultivo en presencia de un inhibidor de mecanismo metabólico por una influencia que desencadena un mecanismo respiratorio secundario (oxidante), o en someter a la levadura de Phaffia obtenida del modo descrito antes a cultivo en presencia de un inhibidor de mecanismo respiratorio principal y en presencia de un agente o por la influencia de un factor medioambiental que desencadena una mecanismo respiratorio secundario (oxidante).
En el documento WO 90/01552 se describe un proceso para la producción de una levadura que tiene un contenido ampliado de astaxantina (AX), que consiste en: (a) la selección morfológica por cultivo de una levadura del género Phaffia en un medio nutriente que contiene un inhibidor antibiótico de citocromo B o un inhibidor del mecanismo de síntesis de terpenoides y (b) antes y/o después de la selección morfológica, someter la levadura a un total de 2 o más pasos de mutagénesis.
Los documentos WO 91/02060 y WO 90/01552 difieren entre sí por el objeto siguiente: carecen de la característica técnica de producir carotenoides o de establecer y seleccionar una cepa mutante capaz de producir carotenoides en un nivel amplio en condiciones para reducir una actividad de la oxidasa alternativa.
Esta invención se ha creado en base a la hipótesis de que la biosíntesis de la astaxantina puede regularse al alza en condiciones en las que la cadena de transferencia de electrones estaría en estado reducido. Tal estado reducido puede inducirse con la adición de un inhibidor específico, por ejemplo la antimicina A, el KCN, el n-PG o el SHAM. Tal estado puede inducirse también por alguna mutación, que provocaría un desequilibrio en la transferencia de electrones.
Según esta invención se obtienen los mutantes que confieren resistencia contra el SHAM. Tales mutantes permiten obtener una productividad de astaxantina mayor en un 50% que la que tiene la cepa original (= madre; inglés: parent).
Esta invención implica la clonación de un gen, que codifica a la oxidasa alternativa de la Phaffia rhodozyma. Esta invención implica además la caracterización enzimática como resultado de la expresión de tal gen en un organismo hospedante idóneo, por ejemplo la E. coli o el Saccharomyces cerevisiae. El gen así clonado puede utilizarse para la reducción de la actividad de la AOX aplicando una mutagénesis dirigida a una posición de la secuencia de promotor o por un método anti-sentido en un hospedante idóneo, por ejemplo la P. rhodozyma. Y sus efectos en la carotenogénesis pueden confirmarse con el cultivo de tal transformante en un medio apropiado en condiciones adecuadas de cultivo.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona un nuevo proceso para la producción de carotenoides, que consiste en cultivar un organismo que puede obtenerse tratando un organismo original productor de carotenoides en condiciones para inducir la reducción de la actividad de la oxidasa alternativa y seleccionar un organismo, cuya productividad de carotenoides se amplía. El organismo empleado en el proceso de la presente invención puede ser una cepa mutante, cuya productividad de carotenoides se amplía mediante la interacción de la resistencia contra un inhibidor de oxidasa alternativa. Un proceso de la presente invención puede llevarse a la práctica empleando un organismo que pertenezca al reino de los Protista u hongos, con mayor preferencia al género Synechococcus, Synechocystis, Haematococcus, Dunaliella, Phaffia, Xanthophyllomyces, Neurospora, Rhodotorula, Blakeslea o Phycomyces, en el que el organismo más preferido puede ser una cepa de Phaffia rhodozyma y de Xanthophyllomyces dendrorhous.
El inhibidor de oxidasa alternativa que puede utilizarse en la presente invención puede elegirse entre el grupo formado por el galato de n-propilo y el ácido salicilhidroxámico.
La presente invención proporciona también un método para establecer una cepa mutante capaz de producir carotenoides en un nivel ampliado con respecto al organismo original, que consiste en cultivar un organismo productor de carotenoides en condiciones de reducir la actividad de la oxidasa alternativa y seleccionar un organismo capaz de producir carotenoides en un nivel más elevado que dicho organismo original. Dichas condiciones de reducir la actividad de la oxidasa alternativa pueden consistir en la presencia de un inhibidor de la oxidasa alternativa. El inhibidor de la oxidasa alternativa para este fin puede elegirse entre el grupo formado por el galato de n-propilo y el ácido salicilhidroxámico. El organismo de la cepa mutante de la presente invención puede pertenecer al reino de los Protista u hongos, con mayor preferencia al género Synechococcus, Synechocystis, Haematococcus, Dunaliella, Phaffia, Xanthophyllomyces, Neurospora, Rhodotorula, Blakeslea o Phycomyces, en el que el organismo más preferido puede ser una cepa de Phaffia rhodozyma o de Xanthophyllomyces dendrorhous.
En otro aspecto, la presente invención se refiere además a una cepa mutante de un organismo capaz de producir carotenoides en una cantidad ampliada con respecto a un organismo original, que puede obtenerse por el método descrito anteriormente. Dichos mutantes pueden caracterizarse de forma más específica por el hecho de que pueden cultivarse incluso en un medio que contiene de 0,3 a 0,45 mg/ml de SHAM en una velocidad de crecimiento similar a la registrada en un medio que no contenga SHAM.
Como forma de ejecución de la presente invención se proporcionan mutantes resistentes al SHAM, que se derivan de la Phaffia rhodozyma ATCC-96594. Dichos mutantes resistentes al SHAM se depositaron en la DSMZ (Deutsche Sammlung der Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania) con los números DSM 13429, DSM 13430 y DSM 13431, respectivamente, con fecha 3 de abril de 2000.
El organismo empleado en el proceso de la presente invención puede ser un organismo recombinante, que altere la expresión genética de la oxidasa alternativa para reducir la eficacia, si se compara con el organismo original. La presente invención proporciona además un organismo recombinante capaz de producir carotenoides en un nivel mayor si se compara a un organismo hospedante, que se caracteriza porque la expresión genética de la oxidasa alternativa se altera para reducir la eficacia en comparación con el organismo hospedante. Tal organismo puede ser tal que altere la expresión genética de la oxidasa alternativa mediante una técnica elegida entre la tecnología antisentido, la mutagénesis dirigida a una posición, la mutagénesis química, etc. El organismo para este fin puede pertenecer al reino de los Protista u hongos, con mayor preferencia al género Synechococcus, Synechocystis, Haematococcus, Dunaliella, Phaffia, Xanthophyllomyces, Neurospora, Rhodotorula, Blakeslea o Phycomyces, en el que el organismo más preferido puede ser una cepa de Phaffia rhodozyma o de Xanthophyllomyces dendrorhous, en especial los depósitos recién mencionados.
La presente invención proporciona además una secuencia de DNA recombinante que codifica a la oxidasa alternativa derivada de un organismo productor de carotenoides. El DNA recombinante puede obtenerse a partir de un organismo que pertenezca al reino de los Protista u hongos, con mayor preferencia al género Synechococcus, Synechocystis, Haematococcus, Dunaliella, Phaffia, Xanthophyllomyces, Neurospora, Rhodotorula, Blakeslea o Phycomyces, en el que el organismo más preferido puede ser una cepa de Phaffia rhodozyma o de Xanthophyllomyces dendrorhous, en especial los depósitos recién mencionados. La secuencia de DNA recombinante según la presente invención puede ser la identificada con la SEQ ID NO: 2 o que tenga una identidad con la SEQ ID NO: 2 superior al 55%, con mayor preferencia superior al 75% y con preferencia especial superior al 95%.
Dicha secuencia de DNA recombinante puede caracterizarse de modo más específico porque: (a) codifica a dicha enzima que tiene una secuencia de aminoácidos descrita en la SEQ ID NO: 1, o (b) codifica a una variante de dicha enzima, elegida entre (i) una variante alélica e (ii) una enzima que tenga la adición, inserción, deleción y/o sustitución de uno o varios aminoácidos y que tenga la actividad de enzima establecida. Las secuencias de DNA aisladas, especificadas particularmente, mencionadas antes, pueden ser las derivadas de un gen de Phaffia rhodozyma y se eligen entre: (i) una secuencia de DNA representada en la SEQ ID NO: 2, (ii) una variante isocodificante o alélica de la secuencia de DNA representada en la SEQ ID NO: 2, e (iii) un derivado de la secuencia de DNA representada en la SEQ ID NO: 2, con la adición, inserción, deleción y/o sustitución de uno o varios nucleótidos y que codifica al polipéptido que tiene dicha actividad enzimática.
La presente invención proporciona además el uso de dicho DNA recombinante para transformar un organismo hospedante. Una forma conveniente de DNA recombinante puede ser un vector. El organismo recombinante obtenido por aplicación del DNA recombinante es capaz de disminuir la actividad enzimática de la oxidasa alternativa. El organismo hospedante transformado con el DNA recombinante puede ser útil para mejorar el proceso de producción de carotenoides, en particular de la astaxantina. Por lo tanto, la presente invención proporciona también tal organismo recombinante.
Además, la presente invención proporciona un método para la producción biológica de carotenoides, que consiste en introducir un DNA recombinante, ya descrito, en un organismo hospedante idóneo y cultivar el organismo recombinante así obtenido. Por lo tanto, el método para producir un carotenoide, caracterizado porque se cultiva un organismo recombinante descrito antes en condiciones que conduce a la producción del carotenoide, es uno de los aspectos de la presente invención. Este método puede aplicarse a la producción biológica de la astaxantina.
Breve explicación de la figura
La figura 1 representa un modelo de trabajo de la cadena respiratoria de la P. rhodozyma.
Descripción detallada de la invención
Tal como se ha descrito antes, muchos investigadores han especulado con que la astaxantina pueda desempeñar un papel como antioxidante en la Phaffia rhodozyma porque su producción se estimula en la fase de respiración del crecimiento, más que en la fase de fermentación. En general, las especies reactivas de oxígeno tienden a producirse en la fase de respiración como resultado de un desbordamiento de electrones de la cadena respiratoria, que resulta del desequilibrio en la transferencia de electrones entre la velocidad de reducción de las existencia de ubiquinona y la transferencia de electrones en el sentido descendente de la cadena respiratoria (figura 1). En tal especulación, la astaxantina podría neutralizar las especies reactivas de oxígeno al igual que lo hace la superoxido-dismutasa.
En base a esta especulación, la superproducción de astaxantina podría realizarse por inhibición de la cadena respiratoria de la Phaffia rhodozyma. De hecho, An y col. (Appl. Env. Microbiol. 55, 116-124, 1989) han aislado mutantes cuya respiración sensible al KCN se bloquea y que producen mucha más astaxantina a partir de la Phaffia rhodozyma.
Por otro lado, tal como han publicado Schroeder y col. (J. Biol. Chem. 270, 18374-18379, 1995), la cadena respiratoria de la Phaffia rhodozyma se desplaza de una respiración sensible al KCN a otra resistente al KCN en la última fase del crecimiento, cuando se estimula la producción de astaxantina. En este contexto, la respiración resistente al KCN, mediada por la oxidasa alternativa, tendría un efecto mayor en la respiración en la fase de producción de astaxantina. La inhibición de la oxidasa alternativa podría conducir a la superproducción de astaxantina.
Con el fin de examinar el efecto de la inhibición específica de la actividad respiratoria en la producción de la astaxantina en la Phaffia rhodozyma, se añade el SHAM, del que se sabe que inhibe la oxidasa alternativa, a un medio de cultivo agar en una serie de concentraciones diluidas. En el curso de este estudio aparecen varios mutantes espontáneos, que presentan una actividad de crecimiento similar incluso en la presencia de 0,3 a 0,45 mg/ml de SHAM, al igual que en el medio que no contiene SHAM. Ahora se ha encontrado de modo sorprendente que tales mutantes producen un 50% más de astaxantina que sus originales. Esto indica que hay alguna mutación, que conduce a la superproducción de astaxantina, que puede complementar la inhibición de crecimiento con un estado reducido de la cadena respiratoria, provocado por una disminución de la actividad de la oxidasa alternativa.
La presente invención proporciona, pues, mutantes aislados que son resistentes a una cantidad de 0,3 a 0,45 mg/ml del inhibidor específico de la oxidasa alternativa, el SHAM. Al igual que antes, los expertos en la materia entenderán fácilmente que las cepas mutantes capaces de producir astaxantina en mayor cantidad pueden establecer por cultivo de organismos apropiados en presencia de uno o varios inhibidores de la oxidasa alternativa y por exploración de los organismos que presentan actividad de crecimiento en presencia de dicho o dichos inhibidores y una productividad de astaxantina superior a la de los organismos originales. La productividad de astaxantina puede determinarse por extracción de los carotenoides de las células de la P. rhodozyma y midiendo los niveles de astaxantina, tal como se ilustra en el ejemplo 2. Un aumento de la productividad en torno al 10% sería un criterio posible para seleccionar una cepa mutante capaz de producir la astaxantina en un nivel más alto que la cepa original. Para mejorar la productividad puede recurrirse al re-cultivo y exploración de la cepa mutante así obtenida bajo la presión del inhibidor de la oxidasa alternativa. La cepa mutante así obtenida puede aplicarse a la producción de astaxantina en un medio apropiado.
Con el fin de disminuir la actividad de la oxidasa alternativa, hay una estrategia empleada en ingeniería genética que tiene varias ventajas sobre la estrategia de la adición de un inhibidor específico, por ejemplo el SHAM, al medio de cultivo. Una de estas ventajas es de índole económica. La adición de tal inhibidor aumentaría el coste de la producción. Y la adición de tal inhibidor al medio de cultivo tiene otro inconveniente en el paso de purificación, puesto que hay que eliminar los inhibidores añadidos del producto final.
Además, la presente invención proporciona una secuencia de DNA recombinante aislado que codifica a la oxidasa alternativa de la Phaffia rhodozyma.
Dicho DNA de la presente invención puede significa un cDNA que contenga solamente un marco abierto de lectura flanqueado por fragmentos cortos en sus regiones 5' y 3' sin traducir y también un DNA genómico que contenga sus intrones y secuencias reguladoras, como son el promotor y el terminador, que intervienen en la expresión del gen de interés.
En primer lugar hemos clonado un fragmento parcial del gen, que contiene una porción del gen AOX empleando el método PCR degenerado. Dicho método PCR degenerado es un método para clonar un gen de interés que tiene una homología elevada de la secuencia de aminoácidos con la enzima conocida de otra especie, que tiene una función igual o similar. El cebador degenerado, que se emplea para indicar un cebador de la PCR degenerada, se diseña por una traducción inversa de la secuencia de aminoácidos en los nucleótidos correspondientes ("degenerados"). Para tal cebador degenerado de este tipo se emplea por lo general un cebador mixto que tenga una cualquiera de A, C, G o T, o un cebador que tenga inosina en un código de ambigüedad. En esta invención se emplean cebadores mixtos como cebadores degenerados para clonar los genes mencionados. Las condiciones de la PCR aplicadas varían en función de los cebadores y de los genes a clonar del modo recién descrito.
Puede clonarse un gen entero, que contenga su región codificadora con su intrón y su región reguladora con su promotor o terminador, a partir de un cromosoma por exploración de la biblioteca genómica, que se construye en un vector fago o en un vector plásmido en un hospedante apropiado, empleando un fragmento parcial de DNA obtenido por PCR degenerada, tal como se ha descrito antes, como sonda, después de haberse marcado. En general se suelen emplear la E. coli como cepa hospedante y la E. coli como vector, un vector fago, por ejemplo un vector fago lambda, o un vector plásmido, por ejemplo el vector pUC, para la construcción de una biblioteca y para la manipulación genética posterior, por ejemplo la secuenciación, la digestión de restricción, la ligación y similares. En esta invención se construye una biblioteca genómica de EcoRI de la P. rhodozyma en el derivado del vector lambda, el lambda gt11. El tamaño del inserto, como se la longitud del inserto a clonar, se determina mediante una hibridación "southern blot" (transferencia southern) antes de construir la biblioteca. En esta invención se emplea un DNA para la sonda que se marca con digoxigenina (DIG), un hapteno esteroide en lugar del marcador convencional de P^{32}, con arreglo a las instrucciones del fabricante (Boehringer-Mannheim, Mannheim, Alemania). Se explora una biblioteca genómica construida a partir del cromosoma de la P. rhodozyma empleando un fragmento de DNA marcado con DIG, que tiene una porción del gen de interés como sonda. Las placas hibridadas se recogen y se emplean para el estudio posterior. Después de aislar la placa positiva se subclona el fragmento de inserto en un vector plásmido apropiado, que puede utilizarse de modo conveniente para la secuenciación. En esta invención, el fragmento de inserto del vector fago positivo se subclona en el vector pOCUS-2, que se utiliza para la construcción de derivados de secuenciación insertados en transposón (Locus Pocus System, Novagene, Madison, EE. UU.).
En esta invención se emplea el secuenciador de DNA fluorescente automatizado, el sistema ALFred (Pharmacia, Uppsala, Suecia), con un protocolo de secuenciación de autociclo, en el que para la mayor parte de los casos de secuenciación se emplea la polimerasa de Taq-DNA.
Después de la determinación de la secuencia genómica se emplea una secuencia de una región codificadora para clonar el cDNA del gen correspondiente. Se explota también el método PCR para clonar el fragmento de cDNA. Se sintetizan los cebadores de PCR, cuyas secuencias son idénticas a la secuencia del extremo 5' y 3' del marco abierto de lectura (ORF) con la adición de un sitio de restricción apropiado y se lleva a cabo una PCR empleando estos cebadores de PCR. En esta invención se emplea un banco (pool) de cDNA como molde para esta clonación PCR del cDNA. Dicho banco de cDNA consta de varias especies de cDNA, que se sintetizan "in vitro" por transcriptasa inversa vírica y la Taq-polimerasa (kit CapFinder fabricado por Clontech, Palo Alto, EE.UU.) empleando el mRNA obtenido a partir de la P. rhodozyma como molde. El cDNA de interés así obtenido puede confirmarse en esta secuencia. Además, el cDNA así obtenido puede utilizarse para la confirmación de su actividad enzimática después de la clonación del fragmento de cDNA en el vector de expresión, que funciona en la E. coli o el S. cerevisiae bajo el control de un promotor apropiado.
Para expresar un gen que se derive de eucariota se suele emplear un procedimiento en el que el cDNA se clona en un vector de expresión en E. coli o S. cerevisiae. Esto se debe a que la especificidad de la estructura del intrón varía entre los organismos y a la incapacidad de reconocer la secuencia del intrón de otras especies. De hecho, el procariota no tiene estructura de intrón en su propia base genética. Incluso en la levadura, la base genética es diferente entre los ascomicetos, a los que pertenece el Saccharomyces cerevisiae, y los basidiomicetos, a los que pertenece la P. rhodozyma. Wery y col. (Yeast 12, 641-651, 1996) demostraron que la estructura de intrón del gen de actina de la P. rhodozyma no puede reconocerse ni empalmarse por acción de una levadura de tipo ascomiceto, el Saccharomyces cerevisiae.
Otros investigadores informan de que las estructuras de intrón de algunos tipos de genes implican la regulación de sus expresiones genéticas (Dabeva, M.D. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 5854, 1986). Puede ser importante utilizar un fragmento genómico que tenga su intrón en un caso de auto-clonación del gen de interés, cuya estructura de intrón implica tal regulación de su propia expresión genética.
Para aplicar un método de ingeniería genética en un estudio de mejora de la cepa es necesario estudiar su mecanismo genético en el caso de la transcripción y de la traducción. Para estudiar el mecanismo genético es importante determinar una secuencia genética de la secuencia de activación en dirección a 5' (upstream) (UAS), del promotor, la estructura del intrón y del terminador, no solo la de su exón.
Según esta invención, el gen que codifica a la oxidasa alternativa se clona a partir del DNA genómico de la P. rhodozyma y se determinan sus secuencias genómicas que contienen el gen de la oxidasa alternativa (AOX) que incluye las regiones adyacentes de 5' y 3' así como sus estructuras de intrón.
Después de la confirmación de la actividad de la enzima se puede emplear el estudio de modificación genética para disminuir la actividad de la oxidasa alternativa.
En la presente invención, la secuencia de polipéptido incluye la SEQ ID NO: 2 y fragmentos de la misma que tengan actividad de AOX y las secuencias de polipéptido que se hibridan con la SEQ ID NO: 2 en condiciones de restricción que sean suficientes para identificar la fijación específica con la SEQ ID NO: 2 y dichos híbridos codifican un polipéptido que tiene la función de una oxidasa alternativa. Por ejemplo, para lograr la fijación específica requerida puede utilizarse cualquier combinación de las siguientes condiciones de hibridación y lavado:
Hibridación de alta restricción
6X SSC
SDS del 0,5%
100 microgramos/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado
formamida del 50%
Se incuba a 42ºC durante una noche con agitación suave.
Lavado de alta restricción
1 lavado con 2X SSC, SDS del 0,5% a temperatura ambiente durante 15 minutos y después otro lavado en 0,1X SSC, SDS del 0,5% a temperatura ambiente durante 15 minutos.
Hibridación de baja restricción
6X SSC
SDS del 0,5%
100 microgramos/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado
formamida del 50%
Se incuba a 37ºC durante una noche con agitación suave.
Lavado de baja restricción
1 lavado en 0,1X SSC, SDS del 0,5% a temperatura ambiente durante 15 minutos.
Las condiciones moderadamente restrictivas pueden obtenerse variando la temperatura en la que tiene lugar la reacción de hibridación y/o las condiciones de lavado descritas antes. En la presente invención es preferido el uso de condiciones de hibridación y de lavado de alta restricción.
Para disminuir una expresión genética por métodos genéticos puede recurrirse a algunos métodos. Uno de tales métodos es el método anti-sentido. El método anti-sentido es un método para disminuir la expresión del gen de interés introduciendo un fragmento de gen artificial, cuya secuencia sea complementaria de la del gen de interés. Un fragmento antisentido de este tipo formará un complejo con el fragmento de mRNA maduro del gen objetivo "in vivo" y, como consecuencia, inhibirá la traducción eficaz del mRNA. Para la construcción del RNA anti-sentido del gen de la AOX puede emplearse un método PCR para clonar la hebra de cDNA complementario del gen de la AOX.
El otro método es una mutación de la región del promotor. En general, el gen consta de varias partes, que tienen funciones diferentes entre sí. En un eucariota, los genes que codifican las proteínas correspondientes se transcriben a un RNA mensajero prematuro (pre-mRNA) diferente de los genes del RNA ribosómico (rRNA), del RNA de núcleo pequeño (snRNA) y RNA de transferencia (tRNA). Aunque la polimerasa II de RNA (PolII) desempeña un papel central en este acontecimiento de transcripción, la PolII puede no solamente iniciar la transcripción sin el elemento cis que cubre la región contigua en dirección a 5' (upstream) que contiene un promotor y un UAS, y un factor de proteína que actúa como trans. En primer lugar, un complejo de iniciación de transcripción que consta de varios componentes de proteína básica reconoce la secuencia del promotor en la región adyacente 5' del gen a expresar. En este acontecimiento se requieren algunos participantes adicionales en el caso de que el gen se exprese bajo alguna regulación específica, por ejemplo una respuesta a un choque térmico, o la adaptación a una privación de nutrición, etcétera. En tal caso se requiere que exista un UAS en la región 5' ascendente siguiente (upstream) no traducida alrededor de la secuencia del promotor y algunas proteínas de regulador positivo o negativo reconocen y se fijan sobre el UAS. La fuerza de la unión del complejo de iniciación de la transcripción sobre la secuencia del promotor está afectada por la fijación del factor que actúa de trans alrededor del promotor y esto permite la regulación de la actividad de transcripción.
Después de la activación de un complejo de iniciación de transcripción por fosforilación, un complejo de iniciación de transcripción inicia la transcripción desde el punto de partida de la transcripción. Algunas partes del complejo de iniciación de transcripción se separan en forma de complejo de elongación de la región del promotor en dirección 3' del gen (este paso se llama acontecimiento de separación del promotor) y un complejo de elongación continúa la transcripción hasta que llega a una secuencia de terminación que está ubicada en la región adyacente en dirección a 3' (downstream) del gen.
Para disminuir la expresión de un gen de interés se suele aplicar la mutación por mutagénesis química convencional o la mutagénesis genética dirigida a una posición de la región del promotor del gen objetivo que contiene la secuencia UAS descrita antes. En esta estrategia se mutageniza un gen cassette que contiene un gen informante (reporter) que se fusiona con la región del promotor derivada de un gen de interés por su extremo 5' y una región de terminador del gen de interés por su extremo 3' y a continuación se introduce en la P. rhodozyma. Detectando la diferencia de actividad del gen informante se podrá explorar una mutación eficaz. La cepa mutante, en la que puede disminuirse la expresión de la enzima de interés, puede obtenerse por transformación de la cepa hospedante con un DNA recombinante que tenga dicha región de promotor mutada.
Tales constructos en forma de vector que contiene el gen de la AOX anti-sentido o el promotor mutado del gen de la AOX pueden transferirse a cepas hospedantes apropiadas. En el caso de utilizar la Phaffia rhodozyma como cepa hospedante, esto se realiza clonando tales constructos en el vector apropiado en el que se alberga un marcador seleccionable, que funcione en la P. rhodozyma. A menudo se emplea como marcador seleccionable un gen de resistencia a los fármacos, que codifica a la enzima y permite al hospedante sobrevivir en presencia de un antibiótico tóxico. El gen de resistencia G418, albergado en el pGB-Ph9 (Wery y col., Gene 184, 89-97, 1997) es un ejemplo de un gen de resistencia a los fármacos. Tal plásmido puede integrarse en el cromosoma de la Phaffia rhodozyma mediante la recombinación homóloga entre el cromosoma y el plásmido.
Como método de transformación se aplican el método de LiAc y el método de electroporación (Wery y col., Gene 148, 89-97, 1997) para transformar la P. rhodozyma.
Tal P. rhodozyma obtenida por ingeniería genética puede cultivarse en un medio apropiado y después evaluarse su productividad de astaxantina.
La presente invención se ilustra además con ejemplos descritos a continuación, con referencia a la figura anexa.
Ejemplos
Se emplean los siguientes materiales y métodos en los ejemplos que siguen.
Cepas
P. rhodozyma ATCC-96594 (redepositada con en número de registro (accession number) ATCC-74438 con fecha 8 de abril de 1998, con arreglo al Tratado de Budapest)
E. coli Y1090r : araD139, hsdR (r_{k}^{-}, m_{k}^{+}), mcrB^{+}, rpsL, supF, trpC12::Tn10, \DeltalacU169, \Deltalon, F^{-}, \lambda^{-}, (pMC9) (Clontech)
E. coli DH5alfa: F^{-}, \varphi80d, lacZ\DeltaM15, \Delta(lacZYa-argF)U169, hsd (r_{k}^{-}, m_{k}^{+}), recA1, endA1, deoR, thi-1, gyrA96, relA1 (Toyobo, Osaka, Japón)
E. coli dador delta gamma: \Delta(gpt-proA)62, leu, 44, ara14, galK2, lacY1, \Delta(mcrC-mrr), (r_{B}^{-}, m_{B}^{-}), xyl-5, mtl-1, recA13, [F^{+}::Tn1000 (tet^{s})] (Novagene)
E. coli receptor delta gamma: F^{-}, araD139, \Delta(ara-leu)7696, galE15, galK16, \Delta(lac)X74, (Str^{r}), hsdR2 (r_{k12}^{-}, m_{k12}^{+}), mcrA, mcrB1::Tn5 (kan^{r}) (Novagene)
E. coli TOP10: F^{-}, mcrA, \Delta(mrr-hsdRMS-mcrBC), \varphi80, M15, \DeltalacX74, recA1, deoR, araD139, (ara-leu)7697, galU, galK, rpsL (Str^{r}), endA1, nupG (Invitrogen, NV Leek, Holanda)
Vectores
lambda gt11 (Clontech)
pCR2.1-TOPO (Invitrogen)
pOCUS-2
pBluescript II SK (Stratagene)
pGBPh9 (Wery y col., Yeast 12, 641-651, 1996)
Medios
Se mantiene la cepa de P. rhodozyma del modo habitual en medio YPD (DIFCO, Detroit, EE.UU.). Se mantiene la cepa de E. coli en medio LB (10 g de Bactotrypton (DIFCO), 5 g de extracto de levadura (DIFCO) y 5 g de NaCl por litro). Se utiliza el medio NZY (5 g de NaCl, 2 g de MgSO_{4}-7H_{2}O, 5 g de extracto de levadura (DIFCO), 10 g de amina NZ de tipo A (WAKO, Osaka, Japón) por litro) para la propagación del fago lambda en un agar blando (agar del 0,7%, WAKO). Cuando se prepara un medio agar se suplementa con un 1,5% de agar (WAKO). Se adquiere el ácido salicilhidroxámico (SHAM) a Aldrich (Milwaukee, EE.UU.).
Métodos
El método general de las técnicas de la genética molecular es acorde con el método descrito en Molecular cloning: a Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Las enzimas de restricción y la T4-DNA-ligasa se adquieren a Takara Shuzo (Ohtsu, Japón).
El aislamiento del DNA cromosómico de la P. rhodozyma se realiza empleando el kit llamado QIAGEN Genomic Kit (QIAGEN, Hilden, Alemania) con arreglo a las instrucciones del fabricante. La "mini-prep" de DNA plásmido de la E. coli transformada se realiza con un sistema de aislamiento automático de DNA (PI-50, Kurabo, Co. Ltd., Osaka, Japón). La "midi-prep" del DNA plásmido de la E. coli transformante se efectúa empleando una columna QIAGEN (QIAGEN). Se aísla un fragmento de DNA y se purifica en agarosa empleando QIAquick o QUIAEX II (QIAGEN).
El aislamiento del RNA total a partir de la P. rhodozyma se efectúa por el método del fenol empleando Isogen (Nippon Gene, Toyama, Japón). Se purifica el mRNA del RNA total así obtenido empleando un kit de separación de mRNA (Clontech). Se sintetiza el cDNA empleando un kit CapFinder de construcción de cDNA (Clontech).
Se efectúa el empaquetamiento "in vitro" empleando un extracto de empaquetamiento en oro Gigapack III (Stratagene, La Jolla, EE.UU.). El aislamiento del lambda-DNA se realiza con un sistema de purificación de DNA "preps" Wizard lambda (Promega, Madison, EE.UU.) con arreglo a las instrucciones del fabricante.
Se efectúa la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con el ciclador térmico de Perkin Elmer modelo 2400. Cada condición de la PCR se describe en los ejemplos. Los cebadores de la PCR se adquieren a un proveedor comercial. La secuenciación del DNA se realiza con un secuenciador automático fluorescente de DNA (ALFred, Pharmacia).
Las células competentes de DH5alfa se adquieren a Toyobo. Todos los productos químicos empleados se adquieren a WAKO, a menos que se indique lo contrario.
Ejemplo 1 Aislamiento de mutantes resistentes al SHAM, el SHAM1, el SHAM2 y el SHAM3 de la P. rhodozyma ATCC-96594
Con el fin de examinar el efecto de la inhibición de la respiración resistente al KCN mediada por la oxidasa alternativa en el crecimiento de la P. rhodozyma se efectúa la adición de SHAM al cultivo de la P. rhodozyma en medio YPD-agar. Se disuelve el SHAM en etanol y se añade al medio YPD-agar en una concentración final de 0,05, 0,15, 0,30, 0,45 y 0,90 mg/ml, respectivamente. En este medio se dispersan 2 x 10^{7} células/ml de P. rhodozyma ATCC-96594 después de la dilución. Después de 3 días de cultivo a 20ºC se cuentan las colonias producidas. El resultado es que el número de colonias formadas en el YPD-agar que contiene SHAM es casi el mismo que el producido en un medio de control que no contiene el SHAM. Pero, el tamaño de las colonias formadas en el medio que contiene SHAM es más pequeño que el de las colonias del medio de control. En la tabla 1 se recoge el diámetro medio comparado con el de la colonia de control.
TABLA 1 Tamaño relativo de colonia formada en medio YPD-agar que contiene SHAM
SHAM (mg/ml) 0,05 0,15 0,30 0,45 0,90
diámetro rel. colonia (%) 100 70 40 30 12
Es interesante observar entre las colonias formadas en medio que contiene 0,3 y 0,45 mg/ml de SHAM que algunas colonias tenían un tamaño similar al de la colonia de control. Dichas colonias poseían además una pigmentación más oscura que la colonia de control. Se extraen cuatro colonias, que tienen un tamaño de colonia similar a la colonia de control y se extienden sobre medio YPD-agar. Todas las colonias tienen una pigmentación más oscura que la colonia de control, incluso en el medio YPD-agar, que no contiene el SHAM. De este resultado puede deducirse que estas cepas pueden ser mutantes espontáneos y se denominan SHAM1, SHAM2, SHAM3 y SHAM4.
Ejemplo 2 Fermentación en matraz de mutantes resistentes SHAM1, SHAM2 y SHAM3
Para evaluar la productividad de astaxantina de los mutantes SHAM1, SHAM2 y SHAM3, resistentes al SHAM, se realiza una fermentación en matraces agitados. Estos mutantes y la cepa original, la ATCC-96594, se inoculan de un cultivo en agar recién preparado en 50 ml de medio YPD en un matraz "baffle" de 500 ml de capacidad hasta una densidad óptica (OD) final de 0,05 a 660 nm. Se realiza la fermentación a 20ºC y 200 rpm. A intervalos apropiados se sacan 3 ml del caldo y se analizan para determinar el rendimiento celular y el contenido de astaxantina.
Se mide el rendimiento celular en forma de OD a 660 nm. Se mide en forma de peso celular seco pesando las células derivadas de 1,0 ml de caldo después de calentarlas a 120ºC durante una noche en un tubo de microcentrifugación de 1,5 ml. El contenido en astaxantina de la P. rhodozyma se mide por el método de la HPLC después de extraer los carotenoides de las células de P. rhodozyma por disgregación de las mismas con esferillas de vidrio, del modo siguiente. Después de la centrifugación se obtienen las células a partir de 1 ml de caldo, se concentran con una cantidad doble de agua destilada y se añaden a la suspensión 10,0 gramos de esferillas de vidrio (0,5 ml) en un tubo de ensayo de color pardo (13,5 mm, 11 cm). A continuación se añaden 1,5 ml de acetona/tolueno hidroxibutilado (BHT)/agua (45 mg de BHT en 450 ml de acetona y 50 ml de agua) y entonces se agita el tubo de ensayo en una agitador de sobremesa horizontal durante una hora. Después de la extracción se añaden 5 ml de acetona/BHT/agua que contiene una concentración apropiada de bixina (nacalai tesque, Kyoto, Japón), como patrón interno. Se analiza el sobrenadante para determinar el contenido de astaxantina mediante un sistema HPLC (el programa informático para el sistema HPLC se adquiere a Tosoh (Tokyo, Japón)).
Columna HPLC: YMC-Pak ODS-A (6 mm, 150 mm, YMC, Inc., Milford, EE.UU.).
Temperatura: temperatura ambiente.
Eluyente: acetonitrilo/metanol/isopropanol (85/10/5).
Volumen inyectado: 10 microlitros.
Caudal: 2,0 ml/minuto.
Detección: UV a 471 nm.
Los resultados se recogen en la tabla 2. Todos los mutantes presentan una productividad de astaxantina un 50% mayor que la cepa original, la ATCC-96594. De este resultado se deduce que puede ocurrir alguna mutación de estos mutantes para compensar la inhibición de la actividad de la oxidasa alternativa aumentando la producción de la astaxantina.
TABLA 2 Productividad de astaxantina por mutantes resistentes al SHAM
Productividad de astaxantina
mg/l mg/g células secas OD a 660 nm
horas 38 72 38 72 38 72
SHAM-1 1,65 4,07 0,179 0,380 24,5 30,6
SHAM-2 2,36 4,43 0,217 0,385 29,5 30,5
SHAM-3 2,87 3,97 0,247 0,381 29,2 29,5
ATCC-96594 2,00 2,76 0,164 0,258 27,4 28,7
Ejemplo 3 Aislamiento de mRNA de la P. rhodozyma y construcción de una biblioteca de cDNA
Para construir la biblioteca de cDNA de la P. rhodozyma se aísla el RNA total por el método de extracción con fenol, inmediatamente después de la disgregación celular y se purifica el mRNA de la cepa de P. rhodozyma ATCC-96594 empleando un kit de separación de mRNA (Clontech).
En primer lugar se recolectan por centrifugación (1500 rpm durante 10 min) las células de la cepa ATCC-96594 de 10 ml de un cultivo de dos días en medio YPD y se lavan una vez con tampón de extracción (citrato Na 10 mM/HCl, pH 6,2, que contiene KCl 0,7 M). Después de suspender el material en 2,5 ml de tampón de extracción se disgregan las células en un homogeneizar de tipo "french press" (Ohtake Works Corp., Tokyo, Japón) a 1500 kgf/cm^{2} y se mezclan inmediatamente con dos veces el volumen en isogen con arreglo al método descrito por el fabricante. En un paso se recuperan 400 microgramos de RNA total.
A continuación se purifica este RNA total empleando un kit de separación de mRNA (Clontech) con arreglo al método especificado por el fabricante. Finalmente se obtienen 16 gramos de mRNA a partir de la cepa ATCC-96594 de la P. rhodozyma.
Para construir la biblioteca de cDNA se emplea el kit CapFinder de construcción de cDNA por PCR (Clontech) con arreglo al método especificado por el fabricante. Se aplica un microgramo de mRNA purificado para la primera síntesis de la hebra y posterior amplificación por PCR. Después de esta amplificación por PCR se obtiene 1 mg de banco (pool) de cDNA.
Ejemplo 4 Clonación del gen AOX parcial (oxidasa alternativa) de la P. rhodozyma
Para clonar un gen AOX parcial de la P. rhodozyma se recurre a un método de PCR degenerada. Las especies y los números de registro del banco de datos, cuya secuencia de oxidasa alternativa se utiliza para los análisis de alineamiento múltiple (Clustal, W., Thompson, J.D. y col., Nucleic Acids Research 22, 4673-4680, 1994) son los siguientes:
Aspergillus niger AB016540 (DDBJ/GenBank/EMBL)
Candida albicans AF031229 (DDBJ/GenBank/EMBL)
Chlamydomonas reinhardtii AF047832 (DDBJ/GenBank/EMBL)
Mangaporthe grisea AB005144 (DDBJ/GenBank/EMBL)
Neurospora crassa Q01355 (Swissprot)
Oryza sativa AB004813 (DDBJ/GenBank/EMBL)
Pichia anomala Q00912 (Swissprot)
Trypanosoma brucei brucei Q26710 (Swissprot)
Se diseñan dos cebadores mixtos y se sintetizan del modo indicado en la tabla 3 en base a la secuencia común de genes conocidos de oxidasa alternativa de otras especies.
TABLA 3 Secuencias de cebadores empleados para la clonación del gen de la AOX
aox3: AAYGARMGNATGCAYYTNYTNACNTT (cebador sentido) (SEQ ID NO: 3)
aox5: GCYTCYTCYTCNARRTANCCNACRAA (cebador antisentido) (SEQ IN NO: 4)
en las que N = A, C, G o T; R = A o G; Y = C o T; M = A o C.
Después de 25 ciclos de la reacción PCR a 95ºC durante 30 segundos, a 50ºC durante 30 segundos y a 72ºC durante 15 segundos empleando la ExTaq (Takara Shuzo) como DNA-polimerasa y el banco (pool) de cDNA obtenido en ejemplo 1 como molde se somete la mezcla reaccionante a una electroforesis a través de un gel de agarosa. Se recupera una banda de PCR que tiene la longitud deseada y se purifica con QIAquick (QIAGEN) con arreglo al método descrito por el fabricante y después se liga al pCR2.1-TOPO (Invitrogen). Después de la transformación de la E. coli TOP10 competente se seleccionan 6 colonias blancas y se aislan los plásmidos con un sistema automático de aislamiento de DNA. Como resultado de la secuenciación se encuentra que 3 clones tienen una secuencia, cuya secuencia deducida de aminoácidos es similar a la de los genes conocidos de la oxidasa alternativa. Este clone de cDNA aislado se denomina pAOX514 y se utiliza para el posterior estudio.
Ejemplo 5 Aislamiento del DNA genómico de la P. rhodozyma
Para aislar el DNA genómico de la P. rhodozyma se emplea el kit genómico de QIAGEN con arreglo al método especificado por el fabricante.
En primer lugar se recolectan por centrifugación (1500 rpm durante 10 min) las células de la P. rhodozyma de la cepa ATCC-96594 a partir de 100 ml de cultivo de una noche en medio YPD y se lavan una vez con tampón TE (Tris 10 mM/HCl, pH 8,0, que contiene EDTA 1 mM). Después de la suspensión en 8 ml de tampón Y1 del kit genómico de QIAGEN se añade la liticasa (SIGMA, St. Louis, EE.UU.) en una concentración de 2 mg/ml para disgregar la células por degradación enzimática y se incuba la mezcla reaccionante a 30ºC durante 90 minutos y después se procede al siguiente paso de extracción. Finalmente se obtienen 20 microgramos de DNA genómico.
Ejemplo 6 Hibridación "southern blot" (transferencia southern) empleando el pAOX514 como sonda
Se realiza una hibridación "southern blot" para clonar un fragmento genómico que contenga el gen de la AOX a partir de la P. rhodozyma. Se digieren dos microgramos del DNA genómico con EcoRI y se someten a electroforesis a través de gel de agarosa y después se tratan con medio ácido y alcalino. Se transfiere el DNA desnaturalizado a una membrana de poliamida (Hybond N+, Amersham, Buckinghamshire, G.B.) empleando el transblot (Joto Rika, Tokyo, Japón) durante una hora. Se fija el DNA, que se ha transferido a la membrana de poliamida, con un tratamiento térmico (80ºC, 90 minutos). Se prepara la sonda marcando un DNA molde (pAOX514 digerido en EcoRI) por el método de multicebado DIG (Boehringer Mannheim). Se realiza la hibridación por el método especificado por el fabricante. Como resultado se visualiza una banda hibridada en el intervalo de 5,5 a 7,0 kilobases (kb).
Ejemplo 7 Clonación de un fragmento genómico que contiene el gen de la AOX
Se digieren cuatro microgramos del DNA genómico en EcoRI y se someten a una electroforesis a través de gel de agarosa. A continuación se recuperan los DNA, cuya longitud está dentro del intervalo de 5,0 a 7,0 kb, con el kit de extracción en gel QIAEX II (QIAGEN) con arreglo al método especificado por el fabricante. Se liga a 16ºC durante una noche el DNA purificado a 0,5 microgramos de lambda-gt11 digerido con EcoRI y tratado con CIAP (fosfatasa alcalina de intestino de ternera) (Clontech) y se empaqueta con extracto de empaquetamiento oro Gigapack III (Stratagene). Se infecta el extracto empaquetado con la cepa Y1090 de E. coli y se recubre con medio NZY que se vierte sobre medio agar LB. Se exploran unas 6000 placas empleando como sonda el pAOX514 digerido en EcoRI. Se híbrida una placa con la sonda marcada.
Este derivado de lambda-gt11 que contiene el supuesto gen de la AOX de la P. rhodozyma se obtiene por el sistema Wizard de purificación de DNA de preps lambda (Promega). Como resultado de la digestión con EcoRI se pone de manifiesto que este derivado de lambda-gt11 contiene un inserto EcoRi de 6 kb. A continuación se realiza la PCR empleando este derivado de lambda-gt11 como molde y dos cebadores, el aox3 y el aox5, como cebadores. Como resultado de la PCR realizada en las mismas condiciones de PCR descritas en el ejemplo 4, se obtiene la banda esperada de 0,3 kb. Esto sugiere que este derivado de lambda-gt11 puede contener el supuesto gen de la AOX de la P. rhodozyma. Se purifica el fragmento EcoRi de 6,0 kb insertado en este derivado de lambda-gt11 empleando el QIAquick (QIAGEN) y se somete a subclonación en el vector pOCUS-2 (Novagen) empleando como cepa hospedante el DH5alfa para obtener el pOCUSAOX607.
Ejemplo 8 Secuenciación de un fragmento genómico que contiene el gen de la AOX
Se transfiere el pOCUSAOX607 a células dadoras de gamma-delta competentes y se utiliza para preparar los derivados de secuenciación que se emplean en el sistema Locus Pocus (Novagen). El método de obtención de los derivados de secuenciación se realiza con arreglo a las instrucciones del fabricante. Como cebadores de secuenciación se utilizan los cebadores marcados con Cy5, cuya secuencia se recoge en la tabla 4, y para la secuenciación se emplea el kit de secuenciación AutoCycle (Pharmacia).
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TABLA 4 Secuencia de cebadores empleados para la secuenciación del gen de la AOX
poc1: (Cy5-)AGCTACAACATACGAAAGGG (SEQ ID NO: 5)
poc2: (Cy5-)GGGGAACTGAGAGCTCTAAA (SEQ ID NO: 6)
Como resultado de la secuenciación se determina a partir de la P. rhodozyma la secuencia de nucleótido que tiene 2561 pares de bases del fragmento genómico que contiene el gen de la AOX.
La región codificadora tiene 1206 pares de bases, que constan de 10 exones y 9 intrones. Los intrones están dispersos a lo largo de la región codificadora, sin bies en 5' ni en 3'. Empleando el programa informático de análisis genético GENETYX-SV/RC (Software Development Co., Ltd., Tokyo, Japón), versión 4.0.1, se ha encontrado un marco abierto de lectura que contiene 402 aminoácidos (SEQ ID NO: 1), cuya secuencia es estrictamente similar a la secuencia de aminoácidos conocida de la oxidasa alternativa de otras especies (un 51,5% de identidad con la oxidasa alternativa del Aspergillus niger). Un tramo de restos aminoácidos hidrófobos del extremo terminal amino se esperaba que formaran una estructura de hélice alfa, indicando que esta región terminal amino podría ser un dominio de tensión de membrana o un péptido de tránsito para mitocondrios. El programa PSORTII (http://psort.nibb.ac.jp:8800/) predice que esta proteína puede ser una proteína mitocondrial con un valor de predicción del 82,6%.
Ejemplo 9 Clonación de la región adyacente en dirección a 5' (upstream) del gen de la AOX
La clonación de la región adyacente en dirección a 5' del gen de la AOX se realiza empleando in kit llamado "Genome Walker" (Clontech), porque parece que el pAOX514 no tendría una longitud suficiente para contener el promotor del gen de la AOX. En primer lugar se sintetizan los cebadores de PCR, cuyas secuencias se recogen en la tabla 5.
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TABLA 5 Secuencia de cebadores empleados para la clonación de la región adyacente en dirección a 5' del gen de la AOX
aox13: GTGTCAGAAACCTCAGATCAACAGGC (cebabor primario) (SEQ ID NO: 7)
aox14: CAACAGGCAGTACAGTCAGCAGATTC (cebador anidado) SEQ ID NO: 8)
Los protocolos para la construcción de la biblioteca y las condiciones de la PCR son los mismos que describe el fabricante. Como molde de la PCR se emplea el preparado de DNA genómico obtenido en el ejemplo 5. Se recuperan los fragmentos de PCR que tienen un sitio ScaI en el extremo 5' (1,2 kb) y que tienen el sitio DraI en el extremo 5' (3,0 kb) y se clonan en el pCR2.1-TOPO empleando la TOP10 de E. coli como cepa hospedante. Como resultado de la secuenciación de cada 2 clones independientes de ambos constructos se confirma que se ha clonado la región adyacente en dirección a 5' del gen de la AOX. El clon obtenido con el constructo ScaI del ensayo anterior se denomina pAOXSc702 y se emplea en el estudio posterior. Basándose en la secuencia del fragmento inserto en el pAOXSc702 se sintetizan 4 cebadores de PCR, cuya secuencia se describe en la tabla 6.
TABLA 6 Secuencias de cebadores empleados para clonar la región de promotor de la AOX
aox15: GAATTCAACAGGTCAAATGA (cebador sentido) (SEQ ID NO: 9)
aox16: ATCCACCCACGCCTGTTTCC (cebador antisentido) (SEQ ID NO: 10)
aox17: GGAAACAGGCGTGGGTGGAT (cebador sentido) (SEQ ID NO: 11)
aox18: GAATTCAGTAAACGCATTAG (cebador antisentido) SEQ ID NO: 12)
Las condiciones de la PCR son las mismas que en el ejemplo 4, excepto que ahora se emplea la polimerasa HF (Clontech) en lugar de la DNA-polimerasa. Con la combinación de aox15 y aox16 se amplifica la longitud del fragmento que tiene 0,7 kb. Con la combinación de aox17 y aox18 se amplifica la longitud del fragmento que tiene 0,5 kb. Se clonan estos fragmentos en el pCR2.1-TOPO y se transforman con TOP10 de E. coli. Se preparan los plásmidos a partir de 6 colonias blancas independientes y se someten a la secuenciación. Como resultado se obtienen los clones esperados, cuyas secuencias de fragmento insertado son idénticas entre sí. El clon obtenido con la combinación de aox15 y aox16 se denomina pAOX714#1516. El clon obtenido con la combinación de aox17 y aox18 se denomina pAOX714#1718. Como resultado de la secuenciación se determina la secuencia del pAOX714#1516 y del pAOX714#1718, que contienen la región de promotor del gen de la AOX de la P. rhodozyma. La secuencia determinada que contiene el promotor de AOX tiene una longitud de 1406 pares de bases.
Combinando las secuencias obtenidas en los ejemplos 8 y 9 se determina que la secuencia de nucleótido (3,7 kb) contiene el gen de la AOX, su promotor y su terminador (SEQ ID NO: 2).
Ejemplo 10 Construcción de plásmido antisentido para el gen de AOX
Se amplifica por el método PCR un fragmento de gen antisentido que cubre la totalidad de la estructura del gen de AOX y después se clona en un vector de integración, en el que se transcribe el gen AOX antisentido por acción del promotor AST en la P. rhodozyma.
TABLA 7 Secuencias de cebadores empleados en la construcción antisentido del gen AOX
aox101: GGCCATTATGGCCTCAATTGGTCTGAGACATGC (SEQ ID NO: 13)
aox102: GGCCGAGGCGGCCATGTCTCTTGCTAGATGTCT (SEQ ID NO: 14)
Ambos cebadores, el aox101 y el 102, tienen una secuencia de reconocimiento asimétrica para la enzima de restricción, SfiI (GGCCNNNNNGGCC), pero se ha diseñado su secuencia remanente (hang-over) para que sea diferente. Esto permite una clonación direccional en el vector de expresión, que tiene la misma secuencia asimétrica en su secuencia de ligación.
Se realiza la PCR empleando la polimerasa HF (Clontech) en forma de polimerasa Taq y se emplean como molde los cDNA obtenidos en el ejemplo 3, en las condiciones siguientes: 30 ciclos de 94ºC durante 15 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 45 segundos. El fragmento amplificado con la PCR se purifica y se clona en el vector pCR2.1-TOPO. Como resultado de la secuenciación se pone de manifiesto que un clon tiene el fragmento correcto y este clon se denomina pAOX1007#0102. La secuencia del fragmento antisentido del gen de la AOX se describe en la SEQ ID NO: 15.
Para el fragmento promotor y terminador, que llevan la transcripción del gen AOX antisentido, se clonan el promotor y terminador AST del cromosoma obtenido en el ejemplo 5.
TABLA 8 Secuencias de cebadores empleados para clonar el promotor y el terminador AST
ast49: GCGGCCGCACGTACAGACTAAGATCGAC (cebador sentido) (SEQ ID NO: 16)
ast50: GGCCATAATGGCCATGGAGAAAGTAGGTGGCAA (cebador antisentido) (SEQ ID NO: 17)
ast36: CCTGCAGGCCGCCTCGGCCGTTGATTCTTCATATGTTAA (cebador sentido) (SEQ ID NO: 18)
ast37: GGTACCCTGCAGTCGACAAACATGAA (cebador antisentido) (SEQ ID NO: 19)
Las condiciones de la PCR son las siguientes: 25 ciclos de 94ºC durante 15 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 90 segundos. Con la combinación del ast49 y el ast50 se amplifica la longitud del fragmento que tiene 1,25 kb. Con la combinación del ast36 y ast37 se amplifica la longitud del fragmento que tiene 0,3 kb. Se clonan estos fragmentos en el pCR2.1-TOPO y se transforman en el TOP10 de E. coli. Se obtienen plásmidos de 6 colonias blancas independientes y se someten a secuenciación. Como resultado se seleccionan los clones que tienen la secuencia correcta del promotor y del terminador AST (EP-1 035 206 A1) para el estudio posterior (pUAST407 para el promotor AST y pAST526#3637 para el terminador AST).
A continuación se fusiona la secuencia de terminador AST con la cassette resistente G418 por ligación del pAST526 #3637 digerido en NotI más KpnI y del pG418Sa330 (EP-1 035 206 A1) digerido en KpnI más SacI sobre un p-BluescriptII SK digerido en NotI y SacI (Stratagene). Se transforma la mezcla de ligación en células KB822 competentes. Como resultado del análisis de restricción se elige para el estudio posterior un clon (pUAST418) que tiene la estructura correcta.
Después se inserta el lugar de 3,1 kb del DNA ribosómico (rDNA) que contiene el fragmento SacI (Wery y col., Gene 184, 89-97, 1997) en el lugar adyacente en dirección a 3' del cassette G418 del pUAST418. El fragmento de rDNA existe en multicopias en el cromosoma del eucariota. El acontecimiento de la integración mediante el fragmento de rDNA se traduce en una integración multicopiada en el cromosoma del hospedante empleado y esto permite la sobreexpresión de genes ajenos, que estén albergados en el vector de expresión. A tal fin se liga el fragmento SacI del gen de rDNA que contiene el pGBPh9 con el pUAST418 digerido en SacI y tratado con fosfatasa alcalina bacteriana. Se transforma la mezcla de ligación en células KB822 competentes. Como resultado del análisis de restricción se eligen para el estudio posterior dos clones (el pURDNA421 y el pURDNAR421) en los que el fragmento rDNA está insertado en orientaciones diferentes entre sí.
A continuación se inserta el promotor AST en la región adyacente en dirección a 5' del terminador AST para construir el vector de expresión que funciona en la P. rhodozyma. Se ligan los 1,0 kb del fragmento NotI y BglII del pUAST407 y los 0,25 kb del fragmento de BglII y PstI del pUAST407 con el pURDNA421 o el pURDNAR421 digeridos en NotI y Sse8387I. Se transforman las células KB822 competentes con la mezcla de ligación y cada una de las 6 colonias resultantes se someten a un análisis de restricción. Para el estudio posterior se eligen los clones (pF718 y pR718, que tienen orientaciones opuestas entre sí del fragmento rDNA) que tienen una inserción correcta del promotor AST.
Finalmente se completa el constructo AOX antisentido insertando los 1,2 kb del fragmento SfiI del pAOX1007#0102 en el pF718 o el pR718 digeridos en SfiI o pR718. Los plásmidos resultantes se llaman pFAOX828 y pRAOX828.
Ejemplo 11 Transformación de la P. rhodozyma con el vector antisentido de AOX
Se transforman los vectores antisentido de AOX, el pFAOX828 y el pRAOX828, en la cepa de tipo salvaje de la P. rhodozyma, la ATCC-96594. Se realizan las transformaciones biolísticas con arreglo al método descrito por Johnson y col., Methods in Molecular Biology 53, 147-153, 1996. Se cultiva la cepa ATCC-96594 de P. rhodozyma en medio YPD hasta la fase estacionaria. Después de la centrifugación del caldo se concentran las células hasta 10 veces con agua esterilizada y se dispersan 200 microlitros de la suspensión celular sobre medio YPD que contiene 100 microgramos/ml de geneticina y D-manita y D-sorbita 0,75 M. Se recubre con cinco microgramos de plásmidos 1,5 mg de partículas de oro de 0,9 micrómetros (= micras) y se utilizan como DNA dadores en la transformación biolística. Se selecciona una colonia resistente a la geneticina, que se ha transformado con pFAOX828 y posee una mejor pigmentación, para la ulterior caracterización con vistas a su productividad de astaxantina y su menor actividad de oxidasa alternativa, que se codifica con el gen AOX.
Ejemplo 12 Caracterización del integrante pFAOX828 derivado de la P. rhodozyma, ATCC-96594
Se cultiva el transformante de P. rhodozyma, ATCC-96594::pFAOX828, junto con su cepa original, la ATCC-96594, en 50 ml de medio YPD en un matraz erlenmeyer de 500 ml a 20ºC durante 3 días, empleando su cultivo de siembra, que se hace crecer en 10 ml de medio YPD en tubos de ensayo (diámetro: 21 mm) a 20ºC durante 3 días. En diferentes momentos, p.ej. al cabo de 24, 43 y 65 horas después de la inoculación, se retira un volumen apropiado de caldo de cultivo y se utiliza para el análisis de su crecimiento, de la productividad de astaxantina y de su actividad de absorción de oxígeno en presencia y en ausencia de KCN. Los momentos después de las 24, 43 y 65 horas correspondiente a sus fases de crecimiento siguientes: la fase logarítmica tardía, la fase estacionaria media y la fase estacionaria tardía, respectivamente.
Para el análisis del crecimiento se mide la densidad óptica a 660 nm mediante un fotómetro UV-1200 (Shimadzu Corp., Kyoto, Japón) además de determinar su peso de células secas por secado de las células derivadas de 1 ml de caldo después de la microcentrifugación a 100ºC durante un día.
Para el análisis del contenido en astaxantina y en carotenoides totales se recolectan las células de 1,0 ml de caldo después de la microcentrifugación y se utilizan para la extracción de los carotenoides de las células de P. rhodozyma por disgregación con esferillas de vidrio. Después de la extracción, las células disgregadas se retiran por centrifugación y se analiza el contenido de carotenoides del líquido sobrenadante por HPLC. Las condiciones empleadas en la HPLC son las siguientes:
columna HPLC: Chrompack Lichrosorb si-60 (4,6 mm; 250 mm)
temperatura: temperatura ambiente
eluyente: acetona/hexano (18/82) y se añade 1 ml/l de agua al eluyente
volumen a inyectar: 10 microlitros
caudal: 2,0 ml/minuto
detección: UV a 450 nm
Se obtiene una muestra de referencia de astaxantina de la empresa F. Hoffmann-La Roche AG (Basilea, Suiza).
Para determinar la actividad de respiración por medición de la actividad de absorción de oxígeno en presencia y en ausencia del KCN se recurre al DO-metro modelo B-505 y a la sonda DO, GU-BM fabricados por Iijima Electronics Corporation (Aichi, Japón). Se resuspenden las células recolectadas en KPB 0,5 M (pH 7,4). Después se diluyen 200 microlitros de esta suspensión celular con 2,3 ml de agua en la cámara del análisis DO. Se inicia la medición con la adición de 0,2 ml de glucosa 1 M en presencia o en ausencia de KCN 0,48 mM.
Los resultados se recogen en la tabla 9.
TABLA 9
cepa ATCC-96594::pFAOX828 ATCC-96594
tiempo (horas) 24 43 65 24 43 65
OD a 660 nm 22,75 28,26 27,91 28,75 31,707 31,10
células secas (mg/ml) 10,8 12,7 12,3 11,6 12,1 11,6
astaxantina (mg/g células secas) 0,090 0,223 0,240 0,107 0,194 0,211
carotenoides (mg/g cél. secas) 0,218 0,336 0,354 0,213 0,269 0,288
respiración
sensible al KCN 11,29 5,84 4,02 16,03 6,13 4,96
resistente al KCN 0,29 0 0 1,48 0,78 0,15
(La actividad de respiración se expresa en nmoles de O_{2} absorbido/min x mg de células secas.)
Tal como se indica en la tabla 9, el transformante AOX antisentido ATCC-96594::pFAOX828 presenta un rendimiento celular similar al de la cepa original, la ATCC-96594 al cabo de 43 horas de cultivo, aunque presenta un crecimiento menor al cabo de 24 horas.
El contenido en astaxantina y en carotenoides del transformante aumentan en un 15%. En lo referente a la actividad de respiración, el transformante tiene una actividad similar de respiración sensible al KCN a la de su cepa hospedante (95%), pero la respiración resistente al KCN mediada por la oxidasa alternativa disminuye hasta niveles del 20% de la cepa hospedante al cabo de 24 horas de cultivo y está totalmente reducida al cabo de 43 horas de cultivo.
De este resultado se deduce que la disminución de la actividad de la oxidasa alternativa, que media la respiración resistente al KCN, puede conducir a una superproducción de astaxantina y de carotenoides en la P. rhodozyma.
<110> F. HOFFMANN-LA ROCHE AG
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<120> Mejora de la producción biológica de carotenoides y materiales biológicos para la misma
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<130> Case 20685
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<140> -
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<141> -
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<150> 00111148.3
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2000-05-24
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<160> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
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<210> 1
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<211> 401
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<212> PRT
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<213> Phaffia rhodozyma 
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<400> 1
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1
2 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 3724
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<212> DNA
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<213> Phaffia rhodozyma 
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<220>
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<221> exón
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<222> (1407)..(1674)
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intrón
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<222> (1675)..(1769)
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> exón
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<222> (1770)..(1873)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intrón
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<222> (1874)..(1948)
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> exón
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<222> (1949)..(2155)
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intrón
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<222> (2156)..(2264)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> exón
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<222> (2265)..(2295)
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intrón
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<222> (2296)..(2372)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> exón
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<222> (2373)..(2423)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intrón
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2424)..(2515)
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> exón
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2516)..(2645)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> intrón
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<222> (2646)..(2735)
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> exón
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<222> (2736)..(2831)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> intrón
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<222> (2832)..(2914)
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<220>
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<221> exón
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<222> (2915)..(2998)
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<220>
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<221> intrón
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<222> (2999)..(3085)
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<220>
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<221> exón
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<222> (3086)..(3206)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> intrón
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<222> (3207)..(3320)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> exón
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<222> (3321)..(3434)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> 5'UTR
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<222> (1295)..(1296)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> (EXPERIMENTAL)
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> sitio polyA_
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<222> (3682)..(3683)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> (EXPERIMENTAL)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
3
4
5 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de PCR degenerada (cebador sentido)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaygarmgna tgcayytnyt nacntt 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de PCR degenerada (cebador antisentido)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcytcytcyt cnarrtancc nacraa 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de secuenciación (el nucleótido 5' está marcado con Cy5)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agctacaaca tacgaaaggg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> DNA
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de secuenciación (el nucleótido 5' está marcado con Cy5)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggggaactga gagctctaaa 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 26
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<212> DNA
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de PCR "genome walking" (cebador primario)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
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\hskip-.1em\dddseqskip
gtgtcagaaa cctcagatca acaggc 
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26 
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<210> 8
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<211> 26
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<212> DNA
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de PCR "genome walking" (cebador anidado)
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<400> 8
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caacaggcag tacagtcagc agattc 
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26 
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<210> 9
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> secuencia artificial
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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de PCR para clonar la región de promotor (cebador sentido)
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<400> 9
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gaattcaaca ggtcaaatga 
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20 
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<210> 10
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> secuencia artificial
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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de PCR para clonar la región de promotor (cebador antisentido)
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<400> 10
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atccacccac gcctgtttcc 
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20 
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<210> 11
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> secuencia artificial
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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de PCR para clonar la región de promotor (cebador sentido)
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<400> 11
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ggaaacaggc gtgggtggat 
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20 
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<210> 12
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<211> 20
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<212> DNA
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<213> secuencia artificial
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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de PCR para clonar la región de promotor (cebador antisentido)
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<400> 12
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gaattcagta aacgcattag 
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20 
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<211> 33
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<212> DNA
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<213> secuencia artificial
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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de PCR para la construcción del gen AOX antisentido (cebador sentido)
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<400> 13
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ggccattatg gcctcaattg gtctgagaca tgc 
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33 
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<210> 14
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<212> DNA
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<213> secuencia artificial
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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de PCR para la construcción del gen AOX antisentido (cebador antisentido)
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<400> 14
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ggccgaggcg gccatgtctc ttgctagatg tct 
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33 
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<210> 15
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<211> 1232
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<212> DNA
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<213> Phaffia rhodozyma 
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<400> 15
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6
7 
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<210> 16
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<211> 28
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<212> DNA
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<213> secuencia artificial
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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de PCR para clonar el promotor AST (cebador sentido)
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<400> 16
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gcggccgcac gtacagacta agatcgac 
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28 
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<210> 17
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<212> DNA
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<213> secuencia artificial
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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de PCR para clonar el promotor AST (cebador antisentido)
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<400> 17
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ggccataatg gccatggaga aagtaggtgg caa 
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33 
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<211> 39
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<212> DNA
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<213> secuencia artificial
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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de PCR para clonar el terminador AST (cebador sentido)
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<400> 18
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cctgcaggggcc gcctcggccg ttgattcttc atatgttaa 
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39 
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<210> 19
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<212> DNA
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<213> secuencia artificial
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<223> Descripción de secuencia artificial: cebador de PCR para clonar el terminador AST (cebador antisentido)
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<400> 19
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ggtaccctgc agtcgacaaa catgaa 
\hfill
26 
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Claims (22)

1. Un proceso para producir carotenoides, que consiste en tratar un organismo original (madre; inglés = parent) capaz de producir carotenoides para inducir una reducción de la actividad de la oxidasa alternativa y seleccionar un organismo cuya producción de carotenoides se haya ampliado y en cultivar el organismo seleccionado.
2. Un proceso según la reivindicación 1, en el que el organismo seleccionado es una cepa mutante, cuya productividad de carotenoides se amplía mediante la alteración de la resistencia a un inhibidor de oxidasa alternativa.
3. Un proceso según la reivindicación 1 ó 2, en el que el organismo seleccionado es un mutante resistente a un inhibidor de oxidasa alternativa.
4. Un proceso según la reivindicación 2 ó 3, en el que dicho organismo pertenece al reino de los Protista o de los hongos, con mayor preferencia al género Synechococcus, Synechocystis, Haematococcus, Dunaliella, Phaffia, Xanthophyllomyces, Neurospora, Rhodotorula, Blakeslea o Phycomyces.
5. Un proceso según una cualquiera de las reivindicaciones de 2 a 4, en el que dicho organismo es una cepa de la Phaffia rhodozyma.
6. Un proceso según una cualquiera de las reivindicaciones de 2 a 5, en el que dicho organismo es una cepa elegida entre el grupo formado por la DSM 13429, 13430 y 13431.
7. Un proceso según una cualquiera de las reivindicaciones de 2 a 6, en el que el inhibidor de la oxidasa alternativa se elige entre el grupo formado por el galato de n-propilo y el ácido salicilhidroxámico.
8. Un método para establecer una cepa mutante capaz de producir carotenoides en un nivel más amplio con relación a un organismo original, que consiste en cultivar un organismo original capaz de producir carotenoides en condiciones que reduzcan la actividad de la oxidasa alternativa y en seleccionar un organismo capaz de producir carotenoides en un nivel más alto que dicho organismo original.
9. Un proceso según la reivindicación 8, en el que la condición para reducir la actividad de la oxidasa alternativa consiste en la presencia de un inhibidor de oxidasa alternativa.
10. Un método según la reivindicación 9, en el que el inhibidor de la oxidasa alternativa se elige entre el grupo formado por el galato de n-propilo y el ácido salicilhidroxámico.
11. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones de 8 a 10, en el que dicho organismo pertenece al reino de los Protista o de los hongos, con mayor preferencia al género Synechococcus, Synechocystis, Haematococcus, Dunaliella, Phaffia, Xanthophyllomyces, Neurospora, Rhodotorula, Blakeslea o Phycomyces.
12. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones de 8 a 11, en el que dicho organismo es una cepa de la Phaffia rhodozyma.
13. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones de 8 a 12, en el que el organismo seleccionado es una cepa del grupo formado por la DSM 13429, 13430 y 13431.
14. Un proceso según la reivindicación 1, en el que el organismo seleccionado es un organismo recombinante y en el que la expresión genética de la oxidasa alternativa se altera para reducir su eficacia si se compara con la del organismo original.
15. Un proceso según la reivindicación 14, en el que la expresión genética de la oxidasa alternativa se altera mediante una técnica elegida entre la tecnología antisentido, la mutagénesis dirigida a una posición (site-directed), la mutagénesis química, etc.
16. Un proceso según la reivindicación 14 ó 15, en el que dicho organismo pertenece al reino de los Protista o de los hongos, con mayor preferencia al género Synechococcus, Synechocystis, Haematococcus, Dunaliella, Phaffia, Xanthophyllomyces, Neurospora, Rhodotorula, Blakeslea o Phycomyces.
17. Un proceso según una cualquiera de las reivindicaciones de 14 a 16, en el que dicho organismo es una cepa de la Phaffia rhodozyma.
18. Un organismo recombinante capaz de producir carotenoides en un nivel elevado si se compara con su organismo original (madre), que está caracterizado porque la expresión genética de la oxidasa alternativa se altera para reducir la eficacia si se compara con la del organismo original, en el que dicho organismo pertenece al género Synechococcus, Synechocystis, Haematococcus, Dunaliella, Phaffia, Xanthophyllomyces, Neurospora, Rhodotorula, Blakeslea o Phycomyces.
19. Un organismo recombinante según la reivindicación 18, en el que la expresión genética de la oxidasa alternativa se altera mediante una técnica elegida entre la tecnología antisentido, la mutagénesis dirigida a una posición, la mutagénesis química, etc.
20. Un organismo recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 18 y 19, dicho organismo es una cepa de la Phaffia rhodozyma.
21. Una secuencia de DNA recombinante que codifica a una oxidasa alternativa derivada de un organismo productor de carotenoides, en la que dicho organismo es una cepa de la Phaffia rhodozyma y dicha secuencia es la SEQ ID NO: 2 o tiene una identidad superior al 55% con la SEQ ID NO: 2.
22. Una secuencia de DNA recombinante según la reivindicación 21, cuya secuencia deducida de aminoácidos es la SEQ ID NO: 1 o tiene una identidad superior al 51,5% con la SEQ ID NO: 1.
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2324625C (en) * 1999-12-01 2011-09-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Recombinant production of carotenoids, particularly astaxanthin
WO2004029232A2 (en) * 2002-09-27 2004-04-08 Dsm Ip Assets B.V. Acc gene
EP2371967B1 (en) 2005-03-18 2015-06-03 DSM IP Assets B.V. Production of carotenoids in oleaginous yeast and fungi
US8691555B2 (en) 2006-09-28 2014-04-08 Dsm Ip Assests B.V. Production of carotenoids in oleaginous yeast and fungi
WO2009149465A1 (en) 2008-06-06 2009-12-10 Aurora Biofuels, Inc. Transformation of algal cells
US20100022393A1 (en) * 2008-07-24 2010-01-28 Bertrand Vick Glyphosate applications in aquaculture
US8809046B2 (en) 2011-04-28 2014-08-19 Aurora Algae, Inc. Algal elongases
US8865468B2 (en) * 2009-10-19 2014-10-21 Aurora Algae, Inc. Homologous recombination in an algal nuclear genome
US8709765B2 (en) * 2009-07-20 2014-04-29 Aurora Algae, Inc. Manipulation of an alternative respiratory pathway in photo-autotrophs
US8722359B2 (en) 2011-01-21 2014-05-13 Aurora Algae, Inc. Genes for enhanced lipid metabolism for accumulation of lipids
JP2014519810A (ja) 2011-04-28 2014-08-21 オーロラ アルギー，インコーポレイテッド 藻類のデサチュラーゼ
WO2013166065A1 (en) 2012-04-30 2013-11-07 Aurora Algae, Inc. ACP Promoter
CN114574376A (zh) * 2022-05-09 2022-06-03 暨南大学 一种高产类胡萝卜素的酿酒酵母Delta-M3及其应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2880545B2 (ja) * 1988-08-08 1999-04-12 アイジーン・バイオテクノロジイ・インコーポレイテッド アスタキサンチンのイン・ビボ生産方法およびアスタキサンチン含量を増加させるファフィア・ロドジマ酵母
NZ232366A (en) * 1989-07-28 1991-08-27 Igene Biotechnology Inc Production of astaxanthin and the enhancement of its content in yeast
NZ248628A (en) * 1992-09-11 1996-02-27 Gist Brocades Nv Transformed phaffia (yeast) strains and methods and vectors used
US6329141B1 (en) * 1995-12-22 2001-12-11 Dsm N.V. Methods for transforming Phaffia strains, transformed Phaffia strains so obtained and recombinant DNA in said methods
EP0955363A3 (en) * 1998-05-06 2004-01-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Dna sequences encoding enzymes involved in production of isoprenoids
AU2736500A (en) * 1999-01-29 2000-08-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize alternative oxidase genes and uses thereof

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