ES2206616T3 - Ligantes activados y metodos para su fabricacion y purificacion. - Google Patents
Ligantes activados y metodos para su fabricacion y purificacion.Info
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Abstract
ESTA INVENCION SE RELACIONA CON LOS PROCEDIMIENTOS PARA FABRICAR LIGADORES ACTIVADOS, CONCRETAMENTE LOS QUE TIENEN ACEPTORES REACTIVOS MICHAEL, Y CON UN PROCESO EFICAZ PARA PURIFICAR LOS LIGADORES ACTIVADOS QUE UTILIZA LA CROMATOGRAFIA DE INTERACCION HIDROFOBA (CIH) PARA SEPARAR LOS LIGADORES ACTIVADOS BASANDOSE EN SU TAMAÑO Y FUNCIONALIDAD DE GRUPO EXTREMO. LOS LIGADORES ACTIVADOS PURIFICADOS SE PUEDEN EMPLEAR PARA MODIFICAR MOLECULAS BIOLOGICAMENTE ACTIVAS Y MEJORAR LA PRODUCCION GLOBAL DE ESTAS.
Description
Ligantes activados y métodos para su fabricación
y purificación.
La presente invención se refiere a métodos para
preparar ligantes activados con PEG, particularmente ligantes
activados que tienen aceptores Michael reactivos, y a un proceso
eficiente para purificar los ligantes activados y moléculas
biológicamente activas reguladas.
Los polietilenglicoles ("PEGs") son
polímeros sintéticos lineales, de cadena larga compuestos por
unidades de óxido de etileno. Las unidades de óxido de etileno
pueden variar de modo que los compuestos de PEG pueden obtenerse con
pesos moleculares que oscilan entre 200 - 100.000. El PEG es,
típicamente, incoloro, inoloro, hidrosoluble, estable al calor, no
se hidroliza o deteriora, y es no tóxico. Como tal, los PEGs han
sido extensamente estudiados para su utilización en productos
farmacéuticos, en implantes artificiales, y en otras aplicaciones
donde la biocompatibilidad es de importancia.
Diversos derivados de PEG que tienen una porción
activa que permite que el PEG se adhiera a diversas superficies y
moléculas son conocidos. Por ejemplo, los derivados de PEG se han
utilizado para acoplar el PEG a superficies para controlar el
humedecimiento, acumulación estática, y unión de otras moléculas a
la superficie. Específicamente, los derivados del PEG han sido
formados haciendo reaccionar PEGs con un reactivo que tiene un
grupo carbonilo, nitrilo o sulfona reactivo para convertir el grupo
oxhidrilo en un aceptor de Michael reactivo, formando de ese modo
un "ligante activado" útil para modificar diversas proteínas
para proporcionar conjugados biológicamente activos mejorados.
La unión del PEG a proteínas ("PEGilación")
ha demostrado: (1) aumentar la vida media en plasma de las
proteínas, véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No.
5.349.052, Delgado y otros, concedida el 20 de Septiembre, 1994; (2)
alterar las propiedades bioquímicas y físicas de la proteína,
incluyendo aumentar la solubilidad, Chen y otros, Biocem. Biophys.
Acta, 660: 293 - 298 (1988), y mejorar la protección contra
proteólisis, Sada y otros, J. Fermentation Bioengineering 71: 137 -
139 (1991); y (3) reducir la antigenicidad, Davis y otros,
"Biomedical Polymers. Polymeric Materials and Pharmaceuticals for
Biomedical Use", (Eds. Goldberg & Nakajima) páginas 441 -
452, Academic Press, N.Y. (1980).
Ha habido problemas en la unión de PEG a
superficies y moléculas. La vasta mayoría de los reactivos
PEGilantes reaccionan con grupos amino primarios libres del
polipéptido, y la mayoría de estas aminas libres son el grupo
arepsilon-NH_{2} de residuos aminoácidos de
lisina. Debido a que las proteínas típicas poseen una gran cantidad
de residuos lisina, la unión al azar de múltiples moléculas de PEG,
es decir, PEGilación no específica, ocurre frecuentemente. La
PEGilación no específica puede conducir a pérdida de la actividad
proteica, y, si la proteína PEGilada es para uso terapéutico, las
múltiples especies que son el resultado del uso de la PEGilación no
específica conduce a dificultades en la preparación de un producto
con propiedades reproducibles y caracterizables. Como tal, la
PEGilación no específica hace difícil evaluar la terapéutica y
establecer la eficacia e información de dosificación. La PEGilación
selectiva de un sitio de ese tipo de proteínas podría conducir a
materiales modificados en forma reproducible que obtienen los
atributos deseables de PEGilación sin la pérdida de actividad.
La Publicación PCT publicada No. WO 95/13312
describe, entre otras cosas, PEGs activados con sulfona
hidrosolubles los cuales son altamente selectivos para acoplar con
porciones tiol en lugar de porciones amino en moléculas y en
superficies. Estos derivados de PEG son estables contra la
hidrólisis para períodos prolongados en ambientes acuosos a PHs de
aproximadamente 11 o menos, y pueden formar ligaciones con
moléculas para formar conjugados los cuales también son
hidrolíticamente estables. La ligación mediante la cual los PEGs y
la molécula biológicamente activa son acoplados incluye una porción
sulfona acoplada a una porción tiol y tiene la estructura
PEG-SO_{2}-CH_{2}-CH_{2}-S-W,
donde W representa la molécula biológicamente activa, y donde la
porción sulfona es vinilsulfona o una etilsulfona activa.
Un ejemplo de una molécula biológicamente activa
la cual puede ser modificada mediante ese tipo de ligantes
activados con sulfona es proteína de enlace TNF ("TNFbp", TNF
binding protein) (también denominada inhibidor de TNF). TNFbp es de
interés terapéutico en el tratamiento de la enfermedad mediada por
TNF, incluyendo la artritis reumatoidea y el choque séptico. Las
proteínas de enlace a TNF son descritas en la técnica; véase, por
ejemplo, la Patente Europea 308 378, Patente Europea 393 438,
Patente Europea 422 339, WO 90/13575, Patente Europea 398 327,
Patente Europea 412 486, WO 91/03553, Patente Europea 418 014,
Patente Japonesa 127.800/1991, Patente Europea 433 900, Patente de
los Estados Unidos No. 5.136.021, Patente Europea 512 528, Patente
Europea 526 905, WO 93/07863, Patente Europea 568 928, WO 93/21946,
WO 93/19777, Patente Europea 417 563, Patente Británica 2.246.569,
Solicitud de Patente Provisoria de los Estados Unidos No.
60/021443, presentada el 9 de Julio, 1996; y la Solicitud de Patente
Provisoria de los Estados Unidos No. [aparece un espacio en
blanco], presentada el 6 de Diciembre, 1996.
La Publicación PCT No. WO 92/16221, incorporada a
la presente como referencia, describe formas de TNFbp representadas
mediante la fórmula
R_{1}-X-R_{2} (denominado un
compuesto con forma de campana doble o "dumbbell"), donde
R_{1} y R_{2} son grupos de TNFbp biológicamente activos y X es
un espaciador polimérico no peptídico con por lo menos un grupo
aceptor de Michael, por ejemplo, un PEG activado con sulfona. Un
compuesto particular, denominado forma de campana doble de la
muteína de TNFbp c105, es una forma de dos campanas iguales u
"homodumbbell" donde R_{1} y R_{2} son una muteína de TNFbp
de 30kDa c105, X es bis-vinilsulfona de
polietilenglicol de 20k (PEGbv de 20 kDa), y donde R_{1} y
R_{2} son unidos sitio-específicamente en el
residuo cisteína 105 al PEGbv.
Un problema comúnmente encontrado por los
expertos en la técnica cuando se producen compuestos mono, di, o
polipegilados es que los procedimientos utilizados para sintetizar
la PEGbv de 20kDa, u otro ligante activado, tienen diversas
desventajas, dependiendo del procedimiento de síntesis utilizado.
Por ejemplo, los métodos convencionales para activar el PEG con un
grupo funcional útil como ligantes para unir a diversas moléculas y
superficies generalmente llevan mucho trabajo e insumen mucho
tiempo. Ese tipo de métodos a menudo requieren un procedimiento de
reacción de múltiples pasos para producir el producto deseado. Por
lo tanto, existe la necesidad de brindar métodos eficientes para
producir ligantes activados que se pueden utilizar para formar
conjugados deseados.
Otra desventaja particularmente problemática es
que la PEGbv de 20kDa resultante a menudo contiene impurezas de PEG
de alto peso molecular y especies de PEG
mono-vinilsulfona y PEG
bis-vinilsulfona. Luego, estas impurezas pueden
afectar adversamente el rendimiento total del compuesto deseado.
También existe la necesidad, por ende, de métodos los cuales
purificarían adicionalmente la PEGbv, u otros ligantes activados, y
de ese modo aumentan la pureza general y rendimiento del compuesto
deseado.
Se ha informado de una cantidad de grupos en el
uso de cromatografía de líquidos de alto rendimiento de fase
inversa (rpHPLC, reversed-phase high performance
liquid chromatography) para separar los PEGs de bajo y mediano peso
molecular (<5K) en base al tamaño; véase, por ejemplo, Murphy y
otros, J. Chromat., 211: 160- 165 (1981); Lai y otros, J.
High Res. Chrom. Comm., 7: 494- 496 (1984); Barka &
Hoffman, J. Chromat., 389: 273- 278 (1987). Estas técnicas,
si bien son relativamente efectivas, tienen la desventaja de su
utilización de resinas costosas y disolventes orgánicos. Asimismo,
estos métodos son procedimientos analíticos más que preparativos. No
han habido informes de la separación exitosa de PEGs de peso
molecular más grande utilizando HPLC. Se han analizado PEGs de
mediano y alto peso molecular (1K - 40K) mediante cromatografía de
exclusión por tamaño sobre una variedad de soportes de sílice
derivados; Engelhardt & Mathes, J. Chromat., 185: 305
(1979).
La cromatografía de interacción hidrófoba (HIC,
Hydrophobic interaction chromatography) ha logrado aceptación como
un método de purificación analítico y preparativo para
biomoléculas. Los principios químicos que sirven de fundamento a la
HIC son similares a aquellos involucrados en la precipitación de
sales, y se refieren a aquellos asociados con la cromatografía de
líquidos de fase inversa (RPLC, reversed phase liquid
chromatography), en el sentido de que todas operan sobre la base de
la hidrofobicidad. La HIC es caracterizada por la adsorción de
moléculas a una superficie débilmente hidrófoba a altas
concentraciones de sal, seguido por la elución con un gradiente de
sal en descenso. Por consiguiente, la HIC combina las
características no desnaturalizantes de la precipitación de sales y
la precisión de la cromatografía para proporcionar recuperaciones
de actividad excelentes. Asimismo, debido a que la HIC opera a
energía de enlace inferior, no requiere de la utilización de
disolventes orgánicos costosos en la fase móvil.
Hasta la fecha, no han habido informes
relacionados con el uso de resinas de HIC para separar PEGs,
especialmente PEGs de alto peso molecular. El experto no esperaría
que la HIC sea efectiva en la separación de PEGs basada en tamaño,
ya que los PEGs tienen la misma hidrofobicidad sobre una base
relativa, sin importar el tamaño.
La presente invención provee novedosos métodos
para preparar y purificar ligantes de polietilenglicol activados
útiles para una variedad de propósitos.
De acuerdo con un aspecto de la presente
invención, se provee un método para preparar un ligante de
polietilenglicol activado que comprende los pasos de:
(a) obtener un polímero de polietilenglicol (PEG)
que tiene un grupo oxhidrilo reactivo;
(b) convertir dicho grupo oxhidrilo en un aceptor
de Michael reactivo para producir por lo menos una forma de un
ligante activado;
(c) aplicar dicho ligante activado a una columna
de cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) que utiliza resina
polimérica que tiene un grupo pendiente hidrófobo situado en la
superficie de una estructura de copolímero de vinilo hidrófila,
donde dicho grupo pendiente hidrófobo se selecciona entre octilo,
butilo, fenilo o éter; y
(d) aislar selectivamente una forma de ligante
activado utilizando condiciones de elución las cuales permiten la
separación de diversas formas en base al tamaño y/o funcionalidad
de grupos finales.
De acuerdo con un segundo aspecto de la presente
invención, se provee un proceso para la preparación de una molécula
biológicamente activa pegilada, comprendiendo dicho proceso:
(a) los pasos (a) a (d) antes señalados
(b) hacer reaccionar el PEG purificado mediante
HIC, obtenido de acuerdo con los pasos (a) a (d) antes señalados,
con una molécula biológicamente activa para producir una molécula
biológicamente activa pegilada.
Preferentemente, dicha molécula biológicamente
activa pegilada tiene la fórmula
R_{1}-X-R_{2}, donde: X
comprende un PEG purificado mediante HIC que tiene un primer grupo
reactivo y un segundo grupo reactivo, y donde dicho primer grupo
reactivo es un aceptor de Michael; R_{1} comprende una molécula
que tiene una porción tiol reactiva, estando dicha porción tiol
covalentemente unida con dicho aceptor de Michael; y R_{2}
comprende una molécula o un grupo no biológicamente activo unido a
dicho PEG mediante la reacción con dicho segundo grupo reactivo.
Adicionalmente en forma preferente, X es
bis-vinilsulfona de polietilenglicol y donde
R_{1} y R_{2} es un inhibidor de TNF de 30kDa c105.
Brevemente, los métodos para preparar los
ligantes activados de la presente invención pueden lograrse
obteniendo un PEG que tiene un grupo oxhidrilo reactivo y
convirtiendo el grupo oxhidrilo en un aceptor de Michael reactivo
para formar un ligante activado, con el uso de tetrahidrofurano
(THF) como disolvente para la conversión. El proceso para purificar
los ligantes activados utiliza HIC para separar los ligantes en base
al tamaño y la funcionalidad de los grupos finales.
Más particularmente, la invención se refiere a un
método para preparar y purificar bis-vinilsulfona
de polietilenglicol de 20kDa ("PEGbv de 20kDa", 20kDa
polyethylene glycol bis-vinylsulfone) el cual
utiliza una resina de HIC de Butilo o Fenilo para separar las
impurezas de PEG de alto peso molecular y para separar la
mono-vinilsulfona de PEG de la
bis-vinilsulfona de PEG. Resulta importante que las
purificaciones llevadas a cabo de este modo no requieren de la
adición de disolventes orgánicos. Resulta más importante que los
ligantes activados purificados se pueden utilizar para modificar
diversas proteínas y proporcionar conjugados biológicamente activos
con una pureza y rendimiento general dramáticamente mejorados en
comparación con los conjugados formados con ligantes activados no
purificados.
Los compuestos que tienen un grupo hidroxi
reactivo son polímeros de polietilenglicoles (PEGs). De estos, los
polietilenglicoles que tiene un peso molecular en el rango de 2kDa
a 100kDa daltons son particularmente útiles, especialmente los PEGs
que tienen un peso molecular de 3,4kDa, 5kDa, 10kDa o 20kDa. Ese
tipo de PEGs puede estar en la forma de dioles de PEG.
Los reactivos útiles que tienen un grupo sulfona
reactivo que se pueden utilizar en los métodos incluyen, sin
limitación, vinilsulfona y divinilsulfona. Cuando se utiliza
conjuntamente con un PEG que tiene uno o dos grupo(s) hidroxi
reactivos, los métodos producen PEG-vinilsulfona y
PEG-bis-vinilsulfona,
respectivamente. Ese tipo de ligantes activados puede utilizarse
para preparar compuestos mono-pegilados como así
también compuestos con forma de campana doble y multiméricos en los
cuales los ligantes son capaces de unir más de una porción. La
adición de THF como el disolvente en una relación en el rango de
1:10 a 1:50 (peso/volumen) de PEG a THF se ha encontrado útil en los
métodos de la presente invención. Una relación de 1:30 ha sido
encontrada particularmente útil.
La molécula biológicamente activa contemplada
para utilización puede ser una molécula sintética, de presentación
natural, o de presentación natural modificada.
En un aspecto de la invención, un ligante
activado con PEG, que tiene un peso molecular que oscila entre 2kDa
y 100kDa, es aplicado a, y eluido de, una resina de HIC utilizando
métodos cromatográficos convencionales. En una realización
preferida, el ligante es eluido de la resina utilizando un gradiente
de sales lineal inverso, de modo que las diversas formas de
ligantes se separan en base al tamaño y/o funcionalidad de grupos
finales. Preferentemente, el ligante es un ligante de PEG activado
con sulfona y la resina de HIC comprende una resina de HIC de
Butilo o Fenilo. En una realización particularmente preferida, la
invención se refiere a un proceso para purificar vinilsulfona o
bis-vinilsulfona de polietilenglicol de 20kDa
("PEGbv de 20kDa") utilizando una resina de HIC Toyopearl®
Butyl-650M.
En aun otro aspecto de la invención, el ligante
de PEG, purificado mediante HIC se hace reaccionar con una molécula
biológicamente activa a fin de proporcionar una forma de campana
doble que tiene una pureza y rendimiento general mejorados en
comparación con los compuestos previamente descritos que contienen
la misma molécula. Preferentemente, el ligante polimérico,
purificado con HIC es un PEG activado con sulfona, y la molécula
biológicamente activa se selecciona entre el grupo que consiste en
inhibidores de TNF, antagonistas del receptor de la
interleucina-1 ("IL-1ra's",
interleukin-1 receptor antagonists), péptido exón
seis del factor de crecimiento derivado de plaquetas ("PDGF",
platelet-derived growth factor), e inhibidores y
receptores de interleucina-2
("IL-2") ("IL-2r",
interleukin-2 receptors). En una realización
particularmente preferida, el ligante polimérico purificado por HIC
es PEG vinilsulfona o PEGbv de 20kDa, y la molécula biológicamente
activa es TNFbp.
Las composiciones farmacéuticas que contienen los
compuestos de la presente invención son también incluidas dentro
del alcance de la invención.
La Figura 1 ilustra el perfil de elución de
diversos dioles de PEG a partir de una columna de HIC ToyoPearl®
Butyl 650M. Las fracciones que contienen PEG fueron detectadas con
reactivo de Nessler y los pesos moleculares confirmados mediante
SEC HPLC según lo descrito en el Ejemplo 3.
La Figura 2 ilustra el perfil de elución de PEGbv
de 20kDa y PEGbv de alto peso molecular a partir de una columna de
HIC ToyoPearl® Phenyl 650S (carga de volumen de lecho de 2 mg/ml).
Se determinó la concentración de PEGbv mediante reactivo de Nessler
y se determinó el porcentaje de impureza por los pesos moleculares
mediante SEC HPLC según lo descrito en el Ejemplo 3.
La Figura 3 ilustra el perfil de elución de PEGbv
de 20kDa (carga de volumen de lecho de 2 mg/ml) a partir de una
columna de HIC ToyoPearl® Butyl 650M. Las fracciones que contienen
PEG fueron detectadas con reactivo de Nessler y se midió la
turbidez a 600 nm.
La Figura 4 ilustra el perfil de elución de PEGbv
de 20kDa purificada por HIC a partir de una columna de
SEC-HPLC. Ejemplo comparativo
La Figura 5 ilustra el perfil de elución de PEGbv
de 20kDa purificada mediante HIC a partir de una columna de
SEC-HPLC. Se utilizó una columna de HIC ToyoPearl®
Butyl 650M (carga de volumen de lecho de 8 mg/ml) para la
purificación por HIC.
La Figura 6 ilustra un perfil de elución de
intercambio catiónico POROS^{TM} HS típico para una mezcla de
PEGilación de TNFbp (la mezcla utilizó PEGbv de 20kDa no purificada
mediante HIC). Los diversos picos de TNFbp se muestran según lo
indicado. Ejemplo comparativo.
La Figura 7 ilustra el perfil de elución de
intercambio catiónico POROS^{TM} HS para una mezcla de PEGilación
de TNFbp (Ejemplo comparativo). Se preparó la mezcla de PEGilación
según lo descrito en el Ejemplo 5 y utilizó PEGbv de 20kDa
purificada por HIC ToyoPearl® Butyl 650M.
La Figura 8 ilustra el perfil de elución de
intercambio catiónico POROS^{TM} HS para una mezcla de PEGilación
de TNFbp. Se preparó la mezcla de PEGilación según lo descrito en
el Ejemplo 5 y utilizó PEGbv de 20kDa no purificada por HIC.
Ejemplo comparativo.
La Figura 9 ilustra el perfil de elución del
compuesto con forma de campana doble de la muteína de c105 TNFbp a
partir de una columna SP-Sepharose HP. Se traza la
absorbancia A_{280} vs. tiempo. Ejemplo comparativo. Se preparó la
forma de campana doble de la muteína de c105 TNFbp utilizando PEGbv
de 20kDa purificada por HIC ToyoPearl® Butyl 650M.
La Figura 10 ilustra el perfil de elución de la
forma de campana doble de la muteína de c105 TNFbp a partir de una
columna SP-Sepharose HP. Se traza la absorbancia
A_{280} vs. tiempo. Se preparó la forma de campana doble de la
muteína de c105 TNFbp utilizando PEGbv de 20kDa no purificada por
HIC. Ejemplo comparativo.
La Figura 11 ilustra el perfil de elución de
intercambio catiónico POROS^{TM} HS para una fracción de
"elución temprana" a partir de una purificación por HIC
ToyoPearl® Butyl 650M de PEGbv de 20kDa. La mezcla de PEGilación se
preparó según lo descrito en el Ejemplo 6.
Los métodos para preparar y purificar los
polietilenglicoles activados son descritos con más detalle en la
descripción que sigue y son ilustrados mediante los ejemplos
provistos más adelante. Los ejemplos muestran diversos aspectos de
la invención e incluyen los resultados de la utilización de un
proceso de "un paso" para preparar un PEG activado con
sulfona, vinilsulfona o bis-vinilsulfona de
polietilenglicol de 20 kDa ("PEGbv de 20kDa"), y la utilización
de resinas de HIC de Butilo y/o Fenilo para separar impurezas de
PEG de alto peso molecular. Los resultados fueron sorprendentes en
el sentido de que la HIC también separó la
mono-vinilsulfona de PEG de la PEGbv de 20kDa, y la
PEGbv de 20kDa purificada resultante, cuando se utiliza para
PEGilar TNFbp, proporcionó un conjugado biológicamente activo que
tiene un rendimiento general y pureza dramáticamente mejorados en
comparación con los conjugados preparados utilizando PEGbv de 20kDa
no purificada por HIC, o PEGbv de 20kDa sintetizada utilizando un
procedimiento de múltiples pasos.
Los métodos para preparar los ligantes activados
de la presente invención son logrados obteniendo un PEG que tiene un
grupo oxhidrilo reactivo y convirtiendo el grupo oxhidrilo en un
aceptor de Michael reactivo para formar un ligante activado, con el
uso de tetrahidrofurano (THF) como el disolvente para la
conversión. Opcionalmente, el PEG que tiene un grupo oxhidrilo
reactivo puede ser disuelto, en primer lugar, en tolueno y secado o
evaporado antes de convertir el grupo oxhidrilo en un aceptor de
Michael. Luego, el paso de conversión es logrado agregando THF como
el disolvente al compuesto secado. Si bien se pueden utilizar una
variedad de disolventes, incluyendo diclorometano (DCM),
dimetilformamida (DMF) y DMSO, durante el paso de conversión, el THF
es preferido. Puesto que el THF es un quelante de cationes, su
utilización como un disolvente ayuda a quelar el catión de base
durante la reacción de conversión, dejando el oxígeno cargado
negativamente para la reacción con un reactivo que contiene un
grupo carbonilo, nitrilo o sulfona para formar el aceptor de
Michael. Las bases adecuadas para utilizar en los métodos incluyen,
por ejemplo, piperidina, piridina, trietilamina, hidróxido de
benciltrimetilamonio (Triton B), e hidróxido de potasio. Las bases
fuertes que contienen un catión son preferidas. Ejemplos de ese
tipo de bases fuertes incluyen ter-butóxido de sodio
o de potasio, alcóxidos de sodio o potasio, y amidas metálicas como
así también hidruros de sodio o potasio.
A continuación, se agrega un reactivo que tiene
un grupo carbonilo, nitrilo o sulfona reactivo, seguido por la
adición de una base. Los ligantes activados que son formados
mediante estos métodos pueden ser luego precipitados con la
utilización de un disolvente adecuado y aislados mediante cualquier
medio conocido en la técnica, incluyendo la filtración, para
obtener ligantes activados purificados. Los disolventes adecuados
incluyen, por ejemplo, éteres, particularmente éter dietílico y
éter dipropílico, alcoholes, hexano, xileno y disolventes
similares.
Los métodos para preparar los ligantes activados
de la presente invención son denominados procesos de "un paso"
en comparación con los procesos conocidos los cuales requieren
múltiples pasos. El proceso de un paso que puede ser ilustrado, por
ejemplo, de la siguiente manera:
Un "grupo oxhidrilo reactivo" significa un
grupo -OH en el cual el hidrógeno puede reducir la base, dejando el
oxígeno libre para reaccionar con un reactivo que tiene un grupo
carbonilo, nitrilo o sulfona para formar el aceptor de Michael.
El PEG puede tener cualquier longitud o peso
molecular aunque estas características pueden afectar las
propiedades biológicas. Los pesos moleculares promedios de
polímeros útiles para disminuir los índices de depuración en
aplicaciones farmacéuticas se encuentran en el rango de 2.000 a
35.000 daltons. Los pesos moleculares del PEG particularmente
útiles incluyen 3, 4kDa, 5kDa, 10kDa y 20kDa.
Como se utiliza en la presente, el término
"PEG" significa cualquiera de los diversos polímeros de
condensación de etilenglicol. El PEG es también conocido como
polioxietileno, óxido de polietileno, poliglicol y polieterglicol.
El PEG también puede ser preparado como copolímeros de óxido de
etileno y muchos otros monómeros. Los grupos finales del PEG pueden
ser derivados en una variedad de formas para incluir porciones de
vinilsulfona, porciones de aldehído, grupos metoxi, u otros tipos de
grupos finales reactivos o no reactivos. Para muchas aplicaciones
farmacéuticas o biotécnicas, se utilizarán PEG activados con
vinilsulfona sustancialmente lineal, de cadena recta, el cual es
sustancialmente no sustituido excepto por la vinilsulfona.
El grupo oxhidrilo de tales compuestos se hace
reaccionar con un reactivo que tiene un grupo carbonilo, nitrilo o
sulfona reactivo para convertir el grupo oxhidrilo en un aceptor de
Michael. Cualquier reactivo que tiene un grupo carbonilo, nitrilo o
sulfona reactivo conocido por los expertos en la técnica es
contemplado para su utilización en los métodos de la presente
invención. "Carbonilo, nitrilo o sulfona reactivo" significa
un grupo carbonilo, nitrilo o sulfona al cual un grupo de dos
carbonos es unido que tiene un sitio reactivo para el acoplamiento
tiol-específico en el segundo carbono del grupo
carbonilo, nitrilo o sulfona a pH 9 o inferior.
En realizaciones preferidas de la presente
invención, los derivados poliméricos de la presente invención
tienen porciones de sulfona activa. "Sulfona activa" significa
un grupo sulfona al cual se une un grupo de dos carbonos que tiene
un sitio reactivo para el acoplamiento
tiol-específico en el segundo carbono del grupo
sulfona. Ejemplos de sulfonas activas incluyen, aunque sin limitarse
a, vinilsulfona y etilsulfona activada. El polímero activado con
sulfona puede ser adicionalmente sustituido siempre que la
reactividad tiol-específica en el segundo carbono
se mantenga a pH 9 o inferior.
Luego de la adición de ese tipo de reactivos, el
grupo oxhidrilo es convertido en aceptor de Michael reactivo. Los
"aceptores Michael" o "aceptores del tipo Michael" se
utilizan en forma intercambiable y significan grupos funcionales
susceptibles a la adición de Michael. "La adición de Michael"
involucra un ataque nucleófilo en un centro electrófilo el cual es
adyacente a un sistema pi, que tiene un átomo electronegativo.
Ejemplos de sistemas pi que tienen un átomo electronegativo
incluyen sulfóxido, sulfonilo, carbonilo y aromáticos
heterocíclicos. El nucleófilo agrega al centro electrófilo. Los
aceptores Michael pueden ser representados mediante la fórmula:
donde E es un átomo electronegativo. La adición
se produce en la posición 4 para formar lo
siguiente:
donde N_{u} representa el nucleófilo ahora
unido al átomo en la posición 4. Los grupos funcionales de los
aceptores Michael incluyen, aunque sin limitarse a, maleimida y
vinilsulfona. El ligante activado utilizado para formar un compuesto
con forma de campana doble puede contener, aunque no
necesariamente, una especie de vinilsulfona de aceptor de
Michael.
Los ligantes activados de la presente invención
pueden tener más de un grupo reactivo. Los derivados pueden ser
monofuncionales, bifuncionales o multifuncionales. Los grupos
reactivos pueden ser iguales (homofuncionales) o diferentes
(heterofuncionales) siempre que haya al menos una porción sulfona
activa. Dos derivados particularmente útiles homobifuncionales son
PEG-bis-clorosulfona y
PEG-bis-vinilsulfona.
Los ligantes resultantes producidos mediante los
métodos de la presente invención son estables, aislables y
adecuados para las reacciones de acoplamiento
tiol-selectivo. Por ejemplo, La cloroetilsulfona de
PEG es estable en agua a un pH de 7 o menos, no obstante puede
utilizarse para sacar ventaja para las reacciones de acoplamiento
tiol-selectivo en condiciones de pH básico hasta
por lo menos pH 9. A un pH de más de 9, la selectividad de tiol es
reducida y la porción de sulfona se vuelve algo más reactiva con
grupos amino. La ligación formada luego de la reacción con tiol es
también hidrolíticamente estable.
Como se utiliza en la presente,
"hidrolíticamente estable" significa que la ligación entre el
polímero y la porción de sulfona y entre el
sulfona-tiol después de la conjugación no reacciona
con agua a un pH de menos de 11 durante por lo menos tres días. La
estabilidad hidrolítica es conveniente debido a que, si el índice
de hidrólisis es significativo, el polímero puede ser desactivado
antes de producirse la reacción entre el polímero y el tiol de la
molécula biológicamente activa.
Un método general para purificar los ligantes
activados con PEG incluye los siguientes pasos:
(1) sintetizar el ligante activado;
(2) aplicar el ligante activado a una resina de
HIC, de acuerdo con la reivindicación 1, y
(3) aislar la forma de ligante deseada mediante
elución del ligante de la resina de HIC utilizando condiciones, por
ejemplo, gradiente de sales lineal inverso, lo cual permite la
separación de las diversas formas de ligantes en base al tamaño y/o
funcionalidad de grupos finales.
Alternativamente, el paso de purificación por HIC
podría ser incorporado en el procedimiento de síntesis de "un
paso" justo antes del paso de concentración / diafiltración.
La HIC contemplada para utilizar en la presente
invención utiliza resinas poliméricas donde un grupo pendiente
hidrófobo seleccionado entre octilo, butilo, fenilo o éter es
ubicado en la superficie de una resina de estructura de copolímero
de vinilo hidrófila, que incluye, aunque sin limitarse a, una
estructura metacrílica, agarosa, o vinílica. También se podría
utilizar una estructura a base de sílice. Las columnas de HIC
preferidas tendrán un ligando butilo o fenilo en una estructura
metacrílica.
Según lo antes señalado, los ligantes activados
con sulfona, purificados por HIC, pueden unirse a moléculas
biológicamente activas que tienen una "porción tiol reactiva"
para proporcionar conjugados biológicamente activos. Una
"porción tiol reactiva" significa un grupo sulfhidrilo (-SH)
capaz de reaccionar con los ligantes activados según lo descrito en
la presente.
Las moléculas biológicamente activas contempladas
para utilizar en la presente invención incluyen, aunque sin
limitarse a, productos farmacéuticos, vitaminas, nutrientes, ácidos
nucleicos, aminoácidos, polipéptidos, co-factores de
enzimas, esteroides, carbohidratos, especies orgánicas tales como
heparina, agentes que contienen metales, agonistas de receptores,
antagonistas de receptores, proteínas de unión, receptores o
porciones de receptores, proteínas de matriz extracelulares,
moléculas de superficie celular, antígenos, haptenos y agentes
quelantes.
En general, TNFbp útil en la presente invención
tiene la secuencia de TNFbp humana, o sus variantes truncadas o sus
muteínas. Una TNFbp, denominada TNFbp de 30kDa, es la porción
extracelular del receptor p55 TNF. In vivo, la porción
extracelular del receptor esparcida y circula en el torrente
sanguíneo como una proteína glicosilada de 30kDa la cual une TNF.
La purificación y las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos
de esta TNFbp son expuestas en la Patente Europea 393 438 y en la
Patente Europea 422 339. Estas referencias también describen la
producción recombinante de formas glicosiladas y desglicosiladas de
TNFbp de 30kDa. Si bien el peso molecular real de la forma
desglicosilada de este inhibidor es 18kDa, el término "inhibidor
de TNF de 30kDa" incluye las formas glicosiladas y
desglicosiladas.
La purificación y las secuencias de aminoácidos y
ácidos nucleicos de otro inhibidor de TNF, denominado TNFbp de
40kDa, también se exponen en la Patente Europea 393 438 y en la
Patente Europea 422 339. Este inhibidor, en su forma de
presentación natural, es la porción extracelular glicosilada del
receptor de p75 TNF. Si bien el peso molecular de la forma
desglicosilada no es 40kDa, tanto la forma glicosilada como la
forma desglicosilada de esta TNFbp son denominadas "inhibidor de
TNF de 40kDa". Estas referencias también describen la producción
recombinante de las formas glicosilada y desglicosiladas de TNFbp de
40kDa.
Un grupo tiol reactivo puede ser introducido en
una molécula biológicamente activa cuando resulte conveniente. Los
grupos tiol también pueden ser introducidos en una molécula
inactiva para formar una molécula biológicamente activa siempre que
el enlace tiol-sulfona no destruya sustancialmente
la actividad deseada.
Los grupos tiol reactivo pueden ser introducidos
por medios químicos bien conocidos en la técnica. Se puede utilizar
modificación química con polipéptidos o moléculas no peptídicas e
incluye la introducción de tiol solo o como parte de un grupo más
grande, por ejemplo un residuo cisteína, en la molécula. Un ejemplo
de tiol químicamente introducido se encuentra en Jue, R. y otros,
Biochemistry, 17: 5399 - 5406 (1978). También se puede
generar una cisteína libre en un polipéptido reduciendo
químicamente cisteína con, por ejemplo, DTT.
Para crear muteínas de cisteína, se puede
sustituir un aminoácido no esencial con una cisteína o un residuo
cisteína puede agregarse al polipéptido. Los polipéptidos los
cuales son modificados para contener un residuo aminoácido en una
posición donde no había uno presente en la proteína natural antes de
la modificación se denomina una "muteína". Los sitios
potenciales para la introducción de una cisteína no natural
incluyen sitios de glicosilación y la terminal N o C del
polipéptido. La mutación de lisina a cisteína es también apropiada
debido a que los residuos lisina a menudo se encuentran en la
superficie de una proteína en su conformación activa.
Adicionalmente, un experto en la técnica puede utilizar cualquier
información conocida acerca de la unión o sitio activo del
polipéptido en la selección de sitios de mutación posibles.
Un experto en la técnica también puede utilizar
técnicas de ADN recombinante bien conocidas para crear muteínas de
cisteína. Se puede alterar el ácido nucleico que codifica el
polipéptido natural para codificar la muteína mediante mutagénesis
dirigida al sitio convencional. Ejemplos de las técnicas de
mutagénesis convencionales se encuentran en Kunkel, T.A., Proc. Nat.
Acad. Sci., 82, 488 - 492 (1985) y Kunkel, T.A. y otros, Methods
Enzymol., 154:
67 - 382 (1987), ambos documentos son incorporados a la presente como referencia. Alternativamente, se puede sintetizar químicamente el ácido nucleico que codifica la muteína mediante técnicas bien conocidas en la técnica. Se pueden utilizar máquinas sintetizadoras y se encuentran disponibles, por ejemplo, de Applied Biosystems (Foster City, CA). El ácido nucleico que codifica la muteína deseada puede ser expresado en una variedad de sistemas de expresión, que incluyen sistemas animales, de insectos y bacterianos.
67 - 382 (1987), ambos documentos son incorporados a la presente como referencia. Alternativamente, se puede sintetizar químicamente el ácido nucleico que codifica la muteína mediante técnicas bien conocidas en la técnica. Se pueden utilizar máquinas sintetizadoras y se encuentran disponibles, por ejemplo, de Applied Biosystems (Foster City, CA). El ácido nucleico que codifica la muteína deseada puede ser expresado en una variedad de sistemas de expresión, que incluyen sistemas animales, de insectos y bacterianos.
La ligación entre la molécula biológicamente
activa que tiene un grupo reactivo tiol y el ligante polimérico
activado con sulfona es un enlace covalente, y el método general
para preparar ese tipo de conjugados incluye los siguientes
pasos:
(1) seleccionar la molécula biológicamente activa
deseada;
(2) sintetizar el ligante polimérico activado con
sulfona deseado;
(3) purificar el ligante polimérico activado con
sulfona utilizando una cromatografía HIC, de acuerdo con la
reivindicación 1;
(4) hacer reaccionar el ligante polimérico
activado con sulfona, purificado por HIC con la molécula
biológicamente activa;
(5) aislar el producto de reacción utilizando
técnicas cromatográficas bien conocidas en la técnica; y
(6) determinar la actividad biológica del
conjugado formado utilizando el bioensayo relevante.
Las muteínas de la TNFbp de 30kDa las cuales han
sido preparadas incluyen: la TNFbp de 30kDa c105; TNFbp de 30kDa c1;
TNFbp de 30kDa c14; TNFbp de 30kDa c111; y TNFbp de 30kDa c161.
"c" se refiere a cisteína y "c105" significa que se
insertó una cisteína en la posición 105. Estas muteínas han sido
preparadas según lo expuesto en la Publicación de PCT publicada No.
WO 92/16221 y la numeración se basa en la secuencia de aminoácidos
expuesta en dicho documento.
La Patente Británica 2.246.569 (describe una
TNFbp de 30kDa y/o 40kDa de "Dominio 3", es decir, el cuarto
dominio está truncado); la Solicitud de Patente Provisoria de los
Estados Unidos No. 60/021443, presentada el 9 de julio, 1996
(describe una TNFbp de 30kDa de "Dominio 2.6", es decir, parte
de los Dominios 3 y 4 están truncados); y la Solicitud de Patente
Provisoria de los Estados Unidos No. [aparece un espacio en blanco]
presentada el 6 de Diciembre, 1996, describe una TNFbp de 30kDa y/o
40kDa de "Dominio 2.6", es decir, parte del tercer y cuarto
Dominios están truncados.
Las muteínas de IL-1ra que
también han sido preparadas incluyen: c0s116 IL-1ra;
c84s116 IL-1ra; c8s116 IL-1ra;
c9s116 IL-1ra; y c141s116 IL-1ra. La
preparación y purificación de muteínas de IL-1ra
son también expuestas en la Publicación de Patente PCT publicada
No. WO 92/16221. La numeración de los residuos se basa en la
secuencia expuesta en esa solicitud publicada donde "0" denota
la adición de un aminoácido en la terminal N; "c" se refiere a
cisteína y "s" se refiere a serina. Por ejemplo, "c0s116"
significa que una cisteína fue insertada en la terminal N y que una
serina fue insertada en la posición 116. IL-1ra
natural tiene residuos cisteína libres en las posiciones 66, 69,
116 y 122.
Pueden prepararse composiciones farmacéuticas que
contienen muchos de los conjugados o compuestos (colectivamente, los
"conjugados") preparados de acuerdo con los métodos de la
presente invención. Estos conjugados pueden estar en un portador
farmacéuticamente aceptable para formar las composiciones
farmacéuticas. El término "portador farmacéuticamente
aceptable" como se utiliza en la presente significa un vehículo
no tóxico, generalmente inerte para el ingrediente activo, el cual
no afecta adversamente el ingrediente o al paciente al cual se
administra la composición. Los vehículos o portadores adecuados
pueden encontrarse en textos farmacéuticos estándares, por ejemplo,
en "Remington's Pharmaceutical Sciences", Ed. no. 16, Mack
Publishing Co., Easton, PA (1980). Ese tipo de portadores incluye,
por ejemplo, soluciones acuosas tales como tampones de bicarbonato,
tampones de fosfato, solución de Ringer y solución salina
fisiológica. Adicionalmente, el portador puede contener otros
excipientes farmacéuticamente aceptables para modificar o mantener
el pH, osmolaridad, viscosidad, claridad, color, esterilidad,
estabilidad, índice de disolución, u olor de la formulación.
Las composiciones farmacéuticas se pueden
preparar mediante métodos conocidos en la técnica que incluyen, a
modo de ejemplo, el simple mezclado de reactivos. Los expertos en
la técnica sabrán que la elección del portador farmacéutico y la
preparación apropiada de la composición dependen del uso pretendido
y del modo de administración.
En un ejemplo, se contempla que el portador y el
conjugado constituyen una formulación fisiológicamente compatible,
de liberación lenta. El disolvente primario en ese tipo de portador
puede ser de naturaleza acuosa o no acuosa. Adicionalmente, el
portador puede contener aun otros excipientes farmacológicamente
aceptables para modificar o mantener la estabilidad, el índice de
disolución, liberación o absorción del conjugado. Ese tipo de
excipientes son aquellas sustancias generalmente y habitualmente
empleadas para formular dosificaciones para la administración
parenteral en forma de dosis unitaria o en múltiples dosis.
Una vez que la composición farmacéutica ha sido
formulada, se puede almacenar en frascos estériles como una
solución, suspensión, gel, emulsión, sólido, o polvo deshidratado o
liofilizado. Ese tipo de formulaciones puede almacenarse ya sea en
una forma lista para ser utilizada o en una forma que requiere la
reconstitución inmediatamente antes de la administración. El
almacenamiento preferido de tales formulaciones es a temperaturas
por lo menos tan bajas como 4ºC y preferentemente a -70ºC. También
se prefiere que tales formulaciones que contienen los conjugados
sean almacenadas y administradas a o cerca de pH fisiológico.
Actualmente se cree que la administración en una formulación a un
pH elevado (es decir mayor que 8) o a un pH bajo (es decir, inferior
a 5) es indeseable.
La manera de administrar las formulaciones que
contienen los conjugados para la administración sistémica puede ser
por vía subcutánea, intramuscular, intravenosa, oral, intranasal, o
vaginal o supositorio rectal. Preferentemente, la manera de
administración de las formulaciones que contienen los conjugados
para administración local es por vía intraarticular, intratraqueal,
o instilación o inhalaciones al tracto respiratorio. Por añadidura,
puede ser conveniente administrar los conjugados a porciones
especificadas del canal alimentario ya sea mediante la
administración oral de los conjugados en una formulación o
dispositivo apropiado.
Para la administración oral, el conjugado es
encapsulado. El conjugado encapsulado puede ser formulado con o sin
portadores farmacéuticamente aceptables utilizados habitualmente en
el mezclado de formas de dosificación sólidas. Preferentemente, la
cápsula está diseñada de modo que la porción activa de la
formulación es liberada en ese punto en el tracto gastrointestinal
cuando la biodisponibilidad es maximizada y la degradación
pre-sistémica es minimizada. Los excipientes
adicionales pueden ser incluidos para facilitar la absorción del
conjugado. También pueden emplearse diluyentes, saborizantes, ceras
de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes de
la suspensión, agentes desintegrantes de tabletas y
aglutinantes.
Sin importar la manera de administración, la
dosis específica se calcula de acuerdo con el peso corporal
aproximado del paciente. Otros factores en la determinación de la
dosificación apropiada pueden incluir la enfermedad o condición a
ser tratada o prevenida, la ruta de administración y la edad, sexo y
condición médica del paciente. En ciertas realizaciones, la
dosificación y administración son diseñadas para crear un rango de
concentración preseleccionado del conjugado en el torrente
sanguíneo del paciente. Por ejemplo, se cree que el mantenimiento
de concentraciones en circulación de inhibidor de TNF e inhibidor
de IL-1 de menos de 0,01 ng por cada mL de plasma
puede no ser una composición efectiva, mientras que el mantenimiento
prolongado de niveles circulantes en exceso de 10 ug por cada mL
puede tener efectos secundarios indeseables. El refinamiento
adicional de los cálculos necesarios para determinar la
dosificación apropiada para el tratamiento que involucra cada una
de las formulaciones antes mencionadas es realizado rutinariamente
por los expertos en la técnica y se encuentra dentro del ámbito de
las tareas llevadas a cabo rutinariamente por ellos sin indebida
experimentación, especialmente a la luz de la información sobre la
dosificación y los ensayos descritos en la presente invención.
Estas dosificaciones pueden ser determinadas a través del uso de
los ensayos establecidos para determinar las dosificaciones
utilizadas conjuntamente con los datos de respuesta a la dosis
apropiados.
Debería señalarse que las formulaciones de
conjugados descritas en la presente pueden ser utilizadas para la
preparación de medicamentos para veterinaria como así también para
seres humanos y que el término "paciente" no debería ser
interpretado en forma limitativa. En el caso de aplicaciones
veterinarias, los rangos de dosificación deberían ser iguales a lo
antes especificado.
Los conjugados de la presente invención pueden
utilizarse para una variedad de propósitos incluyendo, aunque sin
limitarse a, ensayos de diagnóstico in-vitro
y la preparación de composiciones farmacéuticas. Los conjugados que
contienen TNFbp, IL-1ra, solos o en combinación
pueden utilizarse para tratar enfermedades tales como el síndrome
de insuficiencia respiratoria en adultos, fibrosis pulmonar,
artritis, soriasis, leucemias mielógenas y otras leucemias,
isquemia/ reperfusión, asma, caquexia/ anorexia, diabetes, choque
séptico, enfermedad del intestino inflamatoria, esclerosis
múltiple, ataque apoplético, Enfermedad de Crohn, rechazo al injerto
y trauma hemorrágico. Los conjugados también pueden utilizarse para
una cantidad de propósitos in vitro, incluyendo
cromatografía de afinidad (particionamiento) y usos de diagnóstico,
los cuales son fácilmente conocidos por los expertos en la técnica.
Por ejemplo, ese tipo de conjugados pueden estar unidos a una
superficie sólida y pueden ser utilizados para purificar o detectar
ligandos que se unen específicamente a receptores acoplados a los
ligantes activados.
Los siguientes ejemplos ilustrarán en forma más
detallada los diversos aspectos de la presente invención.
Este ejemplo describe la preparación del ligante
activado, PEGbv de 20kDa, utilizando el procedimiento de síntesis de
"un paso".
Se adquirió polietilenglicol
(PEG-DIOL^{TM}) de Shearwater Polymers Inc.
(Birmingham, AL). Se obtuvo divinilsulfona,
t-butóxido de potasio 1M (en tetrahidrofurano
(THF)), tolueno (anhidro, sello seguro),
di-i-propiléter (99+%, inhibido con
25 ppm de hidroxitolueno butilado (BHT)), y tetrahidrofurano
(anhidro que contiene 0,025% de BHT como inhibidor, sello seguro) de
Aldrich Chemical Company (Milwaukee, Wisconsin). El diclorometano
(Omni Solvent) y el éter dietílico (EM) fueron comprados en VWR
Scientific Company (Denver, Colorado). El polvo de sulfato de sodio
anhidro fue adquirido en J. T. Baker (Phillipsburg, Nueva
Jersey).
Un frasco de fondo redondo de cuatro cuellos (una
unión 45/50 y tres 24/40) de 22 L fue equipado con un termómetro,
condensador, un septum de caucho y un agitador mecánico de
velocidad variable y sumergido en un baño de agua que contiene un
calentador de agua de inmersión. El frasco se mantuvo bajo presión
de argón positiva. El condensador se conectó a un frasco de fondo
redondo de dos cuellos a través del cual se unió una línea de
vacío. Se pesó el polietilenglicol (20 kDa, 300g, 15 mmol) y se
transfirió al frasco de 22 L a través de un embudo y se canularon
tres litros de tolueno anhidro mientras que la mezcla estaba en
agitación. La temperatura del baño de agua se fijó a 45ºC y la
agitación continuó hasta que la solución se aclaró (\sim1 h). El
disolvente se evaporó bajo vacío (7999,5 Pa) (\sim60 mm de Hg)
hasta sequedad. El residuo sólido se disolvió en nueve litros de
tetrahidrofurano anhidro (agregado por medio de una cánula). La
temperatura del baño de agua se fijó en 25ºC. Se continuó la
agitación hasta que la temperatura de la solución llegó a 25ºC. Se
agregó divinilsulfona (6 ml, 59,97 mmol) de una jeringa durante 15
min. La mezcla se agitó (75 rpm) durante 10 min. Se agregó
t-butóxido de potasio (1M en THF, 3 ml, 3 mmol)
desde un embudo cuentagotas durante un período de 25 min.
Después de la adición de la base, la mezcla de
reacción se agitó a 25ºC durante seis horas. Luego, se calentó el
baño de agua hasta 40ºC y se evaporó el THF (4,67 . 10^{4} Pa)
(350 mm de Hg). Se agregó un litro de mezcla 1:1 de diclorometano y
tetrahidrofurano al residuo sólido y se agitó hasta formarse una
solución transparente. La solución se enfrió hasta 25ºC y se
refrigeró (-20ºC). Se agregó
di-i-propiléter (1 x 5 litro) a la
solución desde un embudo cuentagotas mientras se continuó con la
agitación. La conexión con el condensador fue retirada del frasco.
Se conectó un embudo de filtro a presión al frasco a través de una
aguja flexible y el precipitado fue transferido por medio de la
aguja flexible y filtrado a través del embudo de filtro (1 L,
70-100u) bajo vacío. El precipitado fue separado en
dos porciones, transferido a Erlenmeyers de 2 L y se dejó agitando
(agitador magnético) con un litro (cada uno) de
i-propiléter durante tres horas. El precipitado se
filtró (2 L, 70-100u), se lavó con 800 ml de éter
dietílico y se secó bajo vacío (1199,9 Pa) (5 mm de Hg) en una
desecadora durante 72 h. Se determinó el rendimiento como de 278,6
g (91,6% de recuperación en base al peso del polietilenglicol).
El producto fue transferido a un frasco de
erlenmeyer (2 L) y se agregó 1 L de diclorometano (Disolvente Omni).
Después de que la totalidad del producto se había disuelto, la
solución (en forma de jarabe) fue transferida a un frasco redondo
de goteo de 5 L equipado con un agitador mecánico. El frasco de
Erlenmeyer se enjuagó con otros 500 ml de diclorometano y la
solución se agregó al frasco de fondo de goteo. Luego, la solución
se agitó durante 5 min (65 rpm). Se agregó cloruro de sodio
saturado (1 L) y se agitó durante 5 min (75 rpm). La mezcla se dejó
asentar hasta que las dos capas se diferenciaron. La capa orgánica
se retiró y se mantuvo en un envase por separado. Este proceso se
repitió tres veces y todas las capas orgánicas se combinaron.
Luego, la solución se separó en dos porciones (3
L cada una) y se transfirió a dos frascos de Erlenmeyer (4 L) y se
agitó durante 16 horas con 500 g de polvo de sulfato de sodio
anhidro (J. T. Baker, Phillipsburg, Nueva Jersey), a temperatura
ambiente, utilizando un agitador magnético (durante este proceso
cada frasco se cubrió completamente con hoja de aluminio). La
solución se filtró a través de un embudo de filtro (2 L,
70-100u) y el filtrado fue transferido a un frasco
de cuatro cuellos de 22 L, habiéndose colocado el frasco en un baño
de agua (40ºC). El disolvente fue evaporado bajo vacío (285 - 360
mbar) y el residuo (líquido muy viscoso) se redisolvió en una mezcla
1:1 de diclorometano y THF (1 L). La solución se precipitó luego,
se filtró y se secó según lo descrito previamente. Se determinó el
rendimiento como de 221,0 g (72,67% de recuperación en base al peso
del polietilenglicol).
Este ejemplo describe una serie de experimentos
de carga y elución diseñados para ensayar la capacidad de las
resinas de HIC de Butilo, Fenilo y Éter para unir PEGbv de
20kDa.
Se detectaron fracciones que contienen PEG con
reactivo de Nessler (Sigma/Aldrich). Típicamente, se agrega 0,01 mL
de reactivo de Nessler a una alícuota de 0,25 mL de una fracción de
columna en un tubo de ensayo de vidrio. Las fracciones que
contienen PEG formaron un precipitado lechoso luego de la adición
del reactivo de Nessler.
Se agregó reactivo de Nessler (1,5 ml) a un tubo
de ensayo de vidrio, seguido por 18,75 microlitros de la muestra
que se va a ensayar. Los tubos de ensayo se sometieron a vórtice,
se dejaron en reposo durante 10 - 15 minutos, y se leyó la turbidez
a 600 nm versus un testigo que contenía reactivo de Nessler solo
(Beckman DU 70 Spectrofotómetro). Luego el PEG fue cuantificado a
partir de una curva estándar hecha a partir de 1,5, 1,0, 0,75, 0,50
y 0,25 mg/ml de patrón de PEG.
Se utilizaron columnas de HIC Butyl, Phenyl y
Ether 650C de ToyoPearl® preempaquetadas de 5 ml (TosoHaas,
Montgomeryville, PA). Las columnas se cargaron con 10 mg (volumen
de lecho de 2 mg/ml) de PEGbv de 20 kDa en diversas concentraciones
de NaCl o sulfato de sodio, y luego se eluyeron con agua por
gravedad. Todos los experimentos se llevaron a cabo a temperatura
ambiente, y las fracciones de 0,5 - 1,0 mL se recogieron a mano en
tubos de ensayo de vidrio de 13 X 100 mM. Se determinó el PEG
mediante el ensayo de Nessler. La Tabla 1 muestra las
concentraciones de sales necesarias para una completa unión (es
decir, ninguna cantidad de PEGbv detectable en el pasaje) de PEGbv
de 20kDa a las diversas resinas de HIC.
| Resina | Conc. de NaCl | Conc. de Sulfato de Sodio |
| Phenyl 650C | 2,25 M | 0,35 M |
| Butyl 650C | 1,75 M | 0,25 M |
| Ether 650C | >> 2 M | >> 0,5 M |
Según lo indicado en la Tabla 1, la resina de HIC
Butyl 650C tiene una afinidad ligeramente mayor para PEG que la
resina de HIC Phenyl 650C, mientras que la resina de HIC Ether 650C
no unió ninguna cantidad de PEG cuando se cargó a ya sea NaCl 2 M o
sulfato de sodio 0,5 M.
Este ejemplo describe un experimento diseñado
para ensayar la capacidad de una resina de Butyl HIC para separar
diversos dioles de PEG en base al tamaño. Las fracciones que
contienen PEG se determinaron utilizando el ensayo de PEG descrito
anteriormente y el peso molecular de los PEGs se confirmó mediante
SEC HPLC.
Se llevó a cabo cromatografía de exclusión por
tamaño de las fracciones de PEG purificadas mediante HIC utilizando
una columna TosoHaas G3000_{swxl} (Synchrom, Inc., Linden, NJ).
Se inyectó una muestra de 100 - 200 ul a
0,5 - 1,0 mg/ml. La columna se llevó a cabo a temperatura ambiente y luego se equilibró en tampón de fosfato de sodio 10 mM, NaCl 150 mM, 0,004% de dodecilsulfato de sodio (SDS), pH 6,5. El PEG fue eluido de la columna utilizando un tampón que contenía fosfato de sodio 10 mM, NaCl 150 mM y 0,004% SDS, pH 6,5. En algunos experimentos, se utilizó un detector del Índice de Refracción (BioRad, Hercules, CA) para controlar la elución del PEG. En otros experimentos, el PEG fue primero derivado con ácido o-tiobenzoico de modo que el eluido pudo ser controlado mediante absorbancia de UV a 254 nm.
0,5 - 1,0 mg/ml. La columna se llevó a cabo a temperatura ambiente y luego se equilibró en tampón de fosfato de sodio 10 mM, NaCl 150 mM, 0,004% de dodecilsulfato de sodio (SDS), pH 6,5. El PEG fue eluido de la columna utilizando un tampón que contenía fosfato de sodio 10 mM, NaCl 150 mM y 0,004% SDS, pH 6,5. En algunos experimentos, se utilizó un detector del Índice de Refracción (BioRad, Hercules, CA) para controlar la elución del PEG. En otros experimentos, el PEG fue primero derivado con ácido o-tiobenzoico de modo que el eluido pudo ser controlado mediante absorbancia de UV a 254 nm.
Se cargó una columna de HIC Butyl 650M de
ToyoPearl® (1,5 X 11 cm) con una total de 3 mg de PEG diol por cada
mL de volumen de lecho de la columna. La columna se equilibró en
NaCl 4M. El volumen de carga fue de 9,7 mL y contenía diol de PEG
de 2,97kDa, 11,9kDa, 20kDa y 50kDa, cada uno a 1,5 mg(ml (los
dioles de PEG de 2,97kDa y 11,9kDa fueron adquiridos en Polymer
Laboratories y los dioles de PEG de 20kDa y de 50kDa fueron
adquiridos en Shearwater Polymers). Después de la carga, la columna
se lavó con 2 volúmenes de columna de NaCl 4 M, y se eluyó con un
gradiente de volumen de columna 15 lineal de NaCl 3 M a 1 M. El
índice de flujo para los pasos de carga, lavado y elución fue de 2,5
mL/min. Se recogieron fracciones de tres minutos (7,5 mL) y se
analizaron las fracciones para determinar el PEG. En la Figura 1 se
muestra el perfil de elución. Los pesos moleculares de los cuatro
picos fueron confirmados mediante cromatografía HPLC de exclusión
por tamaño y son mostrados según lo indicado.
Para completar estos experimentos iniciales, la
PEGbv que eluyó en el pasaje de NaCl 2 M y en el eluido de agua de
la columna Phenyl 650C descrito en el Ejemplo 2 se analizó en el
ensayo de SEC HPLC. Los datos de la SEC HPLC revelaron que el
material en el pasaje de NaCl 2 M fue enriquecido para PEGbv de
20kDa, mientras que el material en el eluido de agua contenía PEGbv
predominantemente de alto peso molecular. Esta información confirma
que puede utilizase HIC; en particular, Phenyl y/o Butyl HIC, para
separar los dioles de PEG y PEGbv de 20 kDa en base al tamaño.
Este ejemplo describe una serie de experimentos
de HIC donde se ensayaron diversas condiciones de cargas de PEGbv de
20kDa y donde se utilizaron diversos gradientes de NaCl lineales
para eluir la PEGbv de las resinas de Butyl o Phenyl HIC. Todos los
experimentos se llevaron a cabo a temperatura ambiente y
generalmente de la manera descrita en el Ejemplo 2.
Pasada 1
La Pasada 1 utilizó una columna ToyoPearl® Phenyl
650S HIC (1,5 x 6,5 cm). La resina 650S difiere de la resina 650C en
cuanto a que el tamaño de partícula es de 20 - 50 um (20 - 50
micrones) más que de 50 - 150 um (50 - 150 micrones). La columna fue
equilibrada en NaCl 3 M, y se cargó PEGbv de volumen de lecho de 2
mg/mL sobre la columna. La PEGbv fue eluida utilizando un gradiente
de NaCl lineal de volumen de 10 columnas (NaCl 3 M a NaCl 0 M) y un
índice de flujo de 1,5 mL/ minuto. Se recogieron fracciones de dos
minutos (3,0 ml) y se ilustra el perfil de elución en la Figura 2.
El % de rendimiento de PEGbv de 20kDa fue luego determinado
utilizando el ensayo descrito en el Ejemplo 3 (véase la Tabla
2).
Pasada 2
La Pasada 2 utilizó una columna ToyoPearl® Butyl
650M HIC (1,5 x 11,4 cm). La resina 650M difiere de la resina 650C
en cuanto a que el tamaño de partícula es de 40 - 90 um (40 - 90
micrones) más que de 50 - 150 um (50 - 150 micrones). La columna fue
equilibrada en NaCl 2 M y se cargó PEGbv de volumen de lecho de 2
mg/mL sobre la columna. La PEGbv fue eluida utilizando un gradiente
de NaCl lineal de volumen de 10 columnas (NaCl 2 M a NaCl 0 M) y un
índice de flujo de 1,5 mL/ minuto. Se recogieron fracciones de tres
minutos (4,5 ml) y se ilustra el perfil de elución en la Figura 3.
El % de rendimiento de PEGbv de 20kDa fue luego detterminado
utilizando el ensayo descrito en el Ejemplo 3 (véase la Tabla
2).
Pasada 3
La Pasada 3 utilizó una columna ToyoPearl® Butyl
650M HIC (3,2 x 18,0 cm). La columna fue equilibrada en NaCl 2,5 M,
y se cargó PEGbv de volumen de lecho de 1,8 mg/mL sobre la columna.
La PEGbv fue eluida utilizando un gradiente de NaCl lineal de
volumen de 10 columnas (NaCl 2 M a NaCl 0,5 M) y un índice de flujo
de 9,6 mL/ minuto. Se recogieron fracciones de 2,5 minutos (24 ml).
El % de rendimiento de PEGbv de 20kDa fue luego determinado
utilizando el ensayo descrito en el Ejemplo 3 (véase la Tabla
2).
Pasada 4
La Pasada 4 utilizó una columna ToyoPearl® Butyl
650M HIC (1,5 x 11,5 cm). La columna fue equilibrada en NaCl 5 M y
se cargó PEGbv de volumen de lecho de 8 mg/mL sobre la columna. Se
llevó a cabo la carga de volumen de lecho en aumento a fin de
aproximar en forma más cercana las condiciones operativas a gran
escala. Debido a la aumentada carga, fue necesaria una concentración
de NaCl más alta (5 M contra 2 M) para la completa unión de PEGbv
sobre la columna. La PEGbv fue eluida utilizando un gradiente de
NaCl lineal de volumen de 10 columnas (NaCl 3,5 M a NaCl 1 M) y un
índice de flujo de 2,0 mL/ minuto. Se recogieron fracciones de 1,5
minutos (3 ml). El % de rendimiento de PEGbv de 20kDa fue luego
determinado utilizando el ensayo descrito en el Ejemplo 3 (véase la
Tabla 2).
Pasada 5
La Pasada 5 utilizó una columna ToyoPearl® Butyl
650M HIC (1,5 x 11,5 cm). La columna fue equilibrada en NaCl 5 M y
se cargó PEGbv con un volumen de lecho de 8 mg/mL sobre la columna.
La PEGbv fue eluida utilizando un gradiente de NaCl lineal con
volumen de 15 columnas (NaCl 2 M a NaCl 0,5 M) y un índice de flujo
de 2,1 mL/ minuto. Se recogieron fracciones y se ilustra el perfil
de elución en la Figura 3. El perfil de resolución no fue tan bueno
para esta pasada como el obtenido utilizando una carga de 2 mg/ml;
sin embargo, se determinó la pureza por SEC HPLC obtenida de la
pasada y es representada en las Figuras 4 y 5. Los datos de las
Figuras 4 y 5 demuestran que, a pesar de la resolución más pobre,
se logró la adecuada remoción de la PEGbv de alto peso
molecular.
Pasada 6
La Pasada 6 utilizó una columna ToyoPearl® Butyl
650M HIC (7,0 x 14 cm). La columna fue equilibrada en NaCl 4,5 M y
se cargó PEGbv con un volumen de lecho de 8 mg/mL sobre la columna.
La PEGbv fue eluida utilizando un gradiente de NaCl lineal con
volumen de 17 columnas (NaCl 3,5 M a NaCl 1,0 M) y un índice de
flujo de 55 mL/minuto.
| Pasada #Resina | Carga (mg de PEGbv/ml de | % de rendimiento |
| volumen de lecho) | PEGbv de 20kDa | |
| 1 Phenyl 650S | 2 mg/ml | 75% |
| 2 Butyl 650 M | 2 mg/ml | 73% |
| 3 Butyl 650 M | 1,8 mg/ml | 64% |
| 4 Butyl 650 M | 8 mg/ml | 72% |
| 5 Butyl 650 M | 8 mg/ml | No determinado |
| 6 Butyl 650 M | 8 mg/ml | No determinado |
Según lo indicado por la información antes
proporcionada, el uso de gradientes de NaCl lineales en las
separaciones de Phenyl y/o Butyl HIC es efectivo para la resolución
de PEGbv de alto peso molecular de la PEGbv de 20kDa.
Adicionalmente, se obtuvo un rendimiento de aproximadamente 65% -
75% utilizando una carga de volumen de lecho de 2 mg/mL o una carga
de volumen de lecho de 8 mg/mL bajo condiciones apropiadas.
Finalmente, los datos indican que, si bien el perfil de resolución
no es tan bueno para las pasadas con una carga de 8 mg/mL en
comparación con las pasadas con carga de 2 mg/mL, la carga de 8
mg/ml no logra una adecuada remoción de la PEGbv de alto peso
molecular.
Este ejemplo describe la preparación de un
conjugado biológicamente activo (forma de dos campanas iguales o
"homodumbbell") que comprende TNFbp y PEGbv de 20kDa
purificada por HIC. El rendimiento general, la pureza y la actividad
biológica del conjugado se comparan con los conjugados de TNFbp
previamente descritos.
La muteína de TNFbp de 30 kDa c105 utilizada en
este ejemplo se puede preparar según lo descrito en la Publicación
PCT publicada No. WO 92/16221. Alternativamente, la muteína c105 es
preparada de la siguiente manera. Células de E. Coli que
expresan la muteína c105 son cosechadas mediante centrifugación. Se
ajusta el lodo celular a aproximadamente 40% de sólidos en peso
húmedo mediante la adición de agua purificada. Luego, la mezcla es
adicionalmente diluida con un volumen igual de tampón de ruptura
(Trometamina 50 mM, EDTA 4 mM, pH 7,2) para dar una suspensión con
aproximadamente 20% de sólidos en peso húmedo. El lodo celular se
hace pasar cinco veces a través de un homogeneizador de alta
presión que funciona a 5515,8 kPa (8.000 psi) para producir el
homogenado celular. El homogenado es enfriado hasta menos de o
igual a 10ºC antes de cada pasada a través del homogeneizador. El
homogenado fue centrifugado y la fracción de sólidos que contenía el
c105 es retenida. Los sólidos son diluidos y centrifugados
nuevamente para dar cuerpos de inclusión lavados.
Luego, los cuerpos de inclusión lavados son
disueltos mediante la adición de urea 8 M y cisteína 150 mM en TRIS
50 mM, pH 9,5. Esta mezcla se deja agitar durante dos horas a
temperatura ambiente antes del replegamiento. Bajo estas
condiciones, la muteína c105 es desnaturalizada y reducida.
La muteína c105 desnaturalizada reducida es
replegada mediante dilución con urea 1,1 M, Tris 50 mM para dar una
solución de replegamiento final compuesta por 200 ug/ml de muteína
c105, urea 1,5 M, cisteína 7,5 mM, Tris 50 mM, pH 9,7. La mezcla de
replegamiento se mantiene a 6-10ºC durante dos días.
La eficiencia de replegamiento es controlada mediante HPLC de fase
inversa y HPLC de intercambio de cationes.
Luego, la mezcla de replegamiento se lleva hasta
un pH de 5,0 mediante la adición de ácido acético y HCl. La mezcla
de replegamiento es cargada sobre una columna de intercambio de
cationes (resina de perlas grandes S-Sepharose)
previamente equilibrada en acetato de sodio 25 mM, NaCl 65 mM, pH 5
a 4ºC. Después de la carga, la columna se lava con el mismo tampón
de equilibración. La columna es eluida con un gradiente de NaCl de
65 a 350 mM en acetato de sodio 25 mM, pH 5. La muteína c105 es
eluida a aproximadamente NaCl 200 mM y se recoge en una
agrupación.
La agrupación recogida que contiene la muteína
c105 es diluida con 1,5 volúmenes de NaCl 5 M, fosfato de sodio 40
mM, se ajusta hasta pH 6, y se carga sobre una columna de
interacción hidrófoba (columna Toyo Butyl 650 M), previamente
equilibrada en NaCl 3 M, fosfato de sodio 20 mM, pH 6. Al final de
la carga, la columna es lavada con tampón de equilibración. La
muteína c105 es eluida utilizando un gradiente de sales en descenso
de ocho volúmenes de columna que opera de 3 M a 1 M de NaCl, en
fosfato de sodio 20 mM, a pH 6. La muteína c105 es recogida en una
agrupación. Luego, la agrupación es concentrada hasta
aproximadamente 3 g/L de muteína c105 y luego diafiltrada contra
fosfato de sodio 20 mM, pH 6,0 hasta una conductividad final
inferior a 4 mmho (aproximadamente seis volúmenes).
La agrupación diafiltrada es cargada sobre una
columna de alto rendimiento SP-Sepharose
equilibrada en fosfato de sodio 20 mM, pH 6,0. Después de la carga,
la columna es lavada con tampón de equilibración adicional y es
eluida con un gradiente de combinación de pH/sal de fosfato de
sodio 20 mM; NaCl 50 mM, pH 6,0 a fosfato de sodio 20 mM, NaCl 50
mM, pH 6,5. La muteína c105 eluye en la mitad posterior del
gradiente a aproximadamente NaCl 35 mM. La muteína c105 puede ser
almacenada congelada en este punto.
La PEGbv de 20kDa utilizada en el ejemplo fue
sintetizada utilizando el procedimiento de "un paso" según lo
descrito en el Ejemplo 1 antes brindado. Una porción de la PEGbv de
20kDa sintetizada fue luego purificada por HIC según lo descrito en
el Ejemplo 4, Pasada 5. Luego, tanto PEGbv no purificada por HIC
como purificada por HIC de 20kDa se utilizó para preparar conjugados
de PEGbv:TNFbp. Los conjugados fueron preparados de la siguiente
manera: la muteína de TNFbp de 30kDa c105 fue expuesta a un exceso
molar 1,3 veces de DTT en fosfato 20 mM, pH 7,6, durante
5-6 horas a 15ºC a fin de eliminar una cisteína
extra adherida a c105 durante el proceso de replegamiento. El pH se
ajustó a 6,0 y la muestra se cargó sobre una columna
S-Sepharose Fast Flow (a 4 - 6 mg/ml de volumen de
lecho), se lavó con 3 volúmenes de columna de tampón de fosfato 20
mM, pH de 6,0 (para eliminar DTT) y se eluyó con fosfato 20 mM, NaCl
70 mM, pH de 6,0.
La solución de muteína de TNFbp de 30kDa en c105
reducida (\sim4,7 mg/ml) fue luego ajustada hasta pH 7,4 - 7,5 con
NaOH 1M. Se agregó PEGbv de 20kDa purificada por HIC o no
purificada por HIC (0,9 mg por mg de TNFbp) a la TNFbp en c105
reducida con mezclado. Después del mezclado, la solución se dejó en
reposo a temperatura ambiente durante 12 - 18 horas.
La conversión de TNFbp en la forma de campana
doble PEGbv:TNFbp de 20kDa se cuantificó utilizando una columna de
HPLC de intercambio de cationes POROS^{TM} HS/H 4,6/50
(Perseptive Biosystems, Cambridge, MA). Se cargó una muestra de 50
ul sobre la columna y se utilizó un gradiente de 10 minutos,
acetato de sodio 20 mM, pH 3,75, NaCl 0 - 1M para eluir la muestra
de la columna. Un perfil de elución representativo para una forma
de campana simple o "monobell" de la muteína de TNFbp de 30kDa
de c105, es decir, PEGbv con TNFbp de 30kDa de c105 adherida
solamente en un extremo, forma de campana doble de la muteína TNFbp
de 30kDa c105, y una muestra de muteína de TNFbp de 30kDa c105 no
pegilada se ilustró en la Figura 6. La forma de campana simple de la
muteína TNFbp de 30kDa de C105 eluyó primero, seguido por la forma
de campana doble de la muteína TNFbp de 30kDa de C105 y la muteína
TNFbp de 30kDa de C105 no PEGilada.
El porcentaje de conversión a la forma de campana
doble de la TNFbp para el material purificado por HIC era de 66,7%,
sin "prepico" detectable (véase la Figura 7). La PEGbv no
purificada por HIC del mismo lote dio solamente un 52,9% de
conversión y tenía un 6,7% de "prepico" (véase la Figura 8).
Este "prepico" distintivo es la forma de campana doble de la
TNFbp que es generada con impurezas de PEGbv de alto peso
molecular.
Luego, las mezclas de PEGilación fueron cargadas
sobre columnas de 1,5 x 10 cm SP-Sepharose HP
(volumen de lecho de 4 mg/mL) equilibrado en fosfato de sodio 50
mM, pH 3,1. Después de la carga, la columna se lavó con tampón de
equilibración y luego la forma de campana doble de la TNFbp eluyó
utilizando 20 volúmenes de columna de un gradiente de fosfato de
sodio 50 mM, NaCl 0,25M, pH 3,1 - fosfato de sodio 50 mM, NaCl
0,5M, pH 3,1. Los perfiles de elución se muestran en las Figuras 9
y 10. El agrupamiento se realizó de diversas maneras diferentes
para cada pasada. La Tabla 3 muestra el % de rendimiento y % de
pureza de la forma de campana doble de la TNFbp para los diversos
criterios de agrupamiento utilizados.
| Muestra de la forma | Fracciones | % de Rendimiento | % de pureza |
| de campana doble de | Agrupadas | PEGbv de 20kDa | PEGbv de 20kDa |
| TNFbp | |||
| PEGbv purificada | 31 - 36 | 53,70% | 96,90% |
| por HIC | |||
| 32 - 46 | 53,30% | 97,40% | |
| 31 - 50 | 58,00% | 97,10% | |
| PEGbv sin purificar | 23 - 44 | 55,30% | 83,50% |
| 28 - 44 | 50,70% | 90,60% | |
| 33 - 44 | 35,50% | 97,30% |
Los datos de la Tabla 3 muestran un claro
beneficio de la purificación por HIC de PEGbv sobre la pureza de la
forma de campana doble de la TNFbp subsecuente y sobre los
rendimientos. Por ejemplo, a fin de obtener un 97% de pureza con la
PEGbv no purificada por HIC, solamente un 37% de la forma de campana
doble de la TNFbp pudo ser recuperado en
SP-Sepharose HP; mientras que tanto como un 58%
pudo ser recuperado con el material purificado por HIC, es decir, la
purificación por HIC de PEGbv de 20kDa puede aumentar la
recuperación de la forma de campana doble de la TNFbp en tanto como
1,5 - 1,6 veces.
En este ejemplo, se evaluó la capacidad de la
resina de HIC para separar PEGs en base a la funcionalidad de grupo
final.
El material de "elución temprana" del
ejemplo 4, Pasada 3 se analizó en el ensayo de PEGilación.
El material de "elución temprana" era
aquellas fracciones las cuales eluyeron justo adelante de las
fracciones las cuales fueron agrupadas para proporcionar la PEGbv
de 20kDa. Y, según lo mostrado en la Figura 11, este material,
cuando se utiliza para preparar conjugados, hizo principalmente
monobell de TNFbp. Esto indica que el material de "elución
temprana" contiene predominantemente monovinilsulfona de 20kDa
de PEG, y así demuestra la capacidad de la resina de Butyl HIC de
separar PEGbv de 20kDa en base a la funcionalidad de los grupos
finales.
En este ejemplo, se estudió la estabilidad de la
ligación entre la muteína de TNFbp de c105 y
PEG-bis-vinilsulfona. Se incubaron
cantidades conocidas de la forma de campana doble de la TNFbp de
c105 en PBS, pH 7,4, a 37ºC durante hasta una semana con alícuotas
retiradas en intervalos para el análisis por SDS PAGE. No se
observó esencialmente descomposición alguna de la forma de campana
doble de la TNFbp de c105. A un pH de 10 a 37ºC durante 1 semana,
solamente se observó un 5-10% de degradación del
conjugado. En estudios de estabilidad adicionales, los ligantes de
PEG activados preparados mediante el método de un paso del Ejemplo
1 se compararon con los ligantes de PEG activados preparados
mediante el método de múltiples pasos según lo descrito en
PCT/US95/07555.
En primer lugar, los ligantes activados en un
paso y en múltiples pasos fueron derivados con ácido
2-mercaptobenzoico para determinar la estabilidad de
los ligantes utilizando UV. Se agregó 3,0 ml de un ácido
2-mercaptobenzoico 1 mM (ácido ortotiolbenzoico) a
0,5 ml de cada solución de ligante (20 mg de ligante se disolvieron
en 0,5 ml de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5) y se mezclaron
brevemente por vórtice. Luego, la solución se incubó a temperatura
ambiente durante un mínimo de 18 horas. Tiempos de incubación más
largos a temperatura ambiente (hasta 48 horas) son aceptables.
Luego, las soluciones de ligantes derivadas se
diluyeron 1:10 en PBS y se trataron con calor a 90ºC durante 1
hora. Las soluciones de ligantes tratadas con calor se retiraron
del calor y se inyectaron 100 ul a 200 ul de las soluciones sobre
una columna BIO SIL^{TM} 250-5 (BioRad, Hercules,
California) y se hizo funcionar en fosfato de sodio 10 mM, NaCl 150
mM, SDS 0,004%, pH 6,5, a un índice de flujo de 0,5 ml/min.
Las muestras recogidas se midieron mediante UV a
una D.O. de 254 nm. Las Tablas 4 y 5 proveen los resultados de las
mediciones de UV. En estas tablas, el % de cambio en el pico de UV
del producto se calcula en base a la pureza por UV del patrón, el
cual no fue tratado térmicamente, menos la pureza de la muestra
tratada térmicamente a 90ºC. Se calculó la pureza como el área pico
media dividida por el área pico total. La variabilidad del ensayo
fue del 2%.
| I.D. de Muestra | Porcentaje de Cambio en el Pico de UV | |
| del Producto | ||
| 1 | -1,91 | |
| 2 | 1,70 | |
| 3 | 0,82 | |
| 5 | 1,59 | |
| 6 | 0,71 | |
| 7 | 0,04 | |
| 8 | -0,51 | |
| 9 | 0,30 | |
| 10 | 1,09 | |
| 11 | 1,61 | |
| 12 | 3,72 | |
| Promedio | 0,83 | |
| Desviación Estándar | 1,43 |
| I.D. de Muestra | Porcentaje de Cambio en el Pico de UV | |
| del Producto | ||
| 002 | 9,28 | |
| 006 | 10,75 | |
| 007 | 13,33 | |
| 008 | 13,95 | |
| 009 | 20,58 | |
| 010 | 14,41 | |
| 014 | 11,37 | |
| 015 | 9,85 | |
| Promedio | 12,94 | |
| Desviación Estándar | 3,62 |
Según lo mostrado en la comparación de los
resultados de las Tablas 4 y 5, el ligante de un paso es más
estable que el ligante de múltiples pasos. Los resultados también
muestran que el cambio en la estabilidad del ligante de un paso
está dentro de la variabilidad del ensayo del 2%, mientras que el
cambio en la estabilidad del ligante de cuatro pasos es mayor que
la variabilidad del ensayo del 2%.
La descripción que antecede de la invención es
ejemplificativa y tiene propósitos ilustrativos y
explicativos.
Claims (22)
1. Un método para preparar un ligante de
polietilenglicol activado que comprende los pasos de:
(a) obtener un polímero de polietilenglicol (PEG)
que tiene un grupo oxhidrilo reactivo;
(b) convertir dicho grupo oxhidrilo en un aceptor
de Michael reactivo para producir por lo menos una forma de un
ligante activado;
(c) aplicar dicho ligante activado a una columna
de cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) que utiliza resina
polimérica que tiene un grupo pendiente hidrófobo situado en la
superficie de una estructura de copolímero de vinilo hidrófila,
donde dicho grupo pendiente hidrófobo se selecciona entre octilo,
butilo, fenilo o éter; y
(d) aislar selectivamente una forma de ligante
activado utilizando condiciones de elución las cuales permiten la
separación de diversas formas en base al tamaño y/o funcionalidad
de grupos finales.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
donde el paso (b) comprende:
(i) agregar THF como el disolvente al compuesto
que tiene una grupo hidroxi reactivo;
(ii) agregar un reactivo que tiene un grupo
carbonilo, nitrilo o sulfona reactivo; y
(iii) agregar una base para formar el aceptor de
Michael reactivo.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
donde las condiciones de elución comprenden la utilización de un
gradiente de cloruro de sodio 5 - 0M lineal.
4. El método de acuerdo con las reivindicaciones
1-3, donde dicho PEG tiene un peso molecular en el
rango de 2kDa a 100kDa.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4,
donde dicho PEG tiene un peso molecular de 3,4kDa, 5kDa, 10kDa o
20kDa.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 5,
donde dicho PEG tiene un peso molecular de 20kDa.
7. El método de acuerdo con las reivindicaciones
1-6, donde dicho PEG es diol de PEG.
8. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 7, donde THF es agregado en una relación en el
rango de 1:10 a 1:50 peso/volumen de PEG a THF.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 8,
donde dicha relación es 1:30.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 2,
donde el reactivo que tiene un grupo sulfona reactivo es
vinilsulfona.
11. El método de acuerdo con la reivindicación 2,
donde dicha base es ter-butóxido de potasio.
12. El método de acuerdo con la reivindicación 2,
donde el reactivo que tiene un grupo sulfona reactivo es
divinilsulfona.
13. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
que comprende además después del paso (a): disolver el PEG que
tiene un grupo hidroxi reactivo en tolueno; y secar dicha solución
de tolueno antes del paso (b).
14. El método de acuerdo con las reivindicaciones
1-13; donde dicha HIC comprende un ligando de
butilo o fenilo en una estructura metacrílica.
15. Un proceso para la preparación de una
molécula biológicamente activa pegilada, comprendiendo dicho
proceso:
(a) los pasos (a) a (d) de la reivindicación
1;
(b) hacer reaccionar el PEG purificado por HIC
del paso (a) en esta reivindicación con una molécula biológicamente
activa para producir una molécula biológicamente activa
pegilada.
16. Un proceso de acuerdo con la Reivindicación
15, donde dicho paso de reacción comprende: mezclar dicho PEG
purificado mediante HIC con dicha molécula biológicamente activa; y
permitir que dicha mezcla repose a temperatura ambiente durante 12
- 18 horas.
17. Un proceso de acuerdo con la Reivindicación
15, donde dicha molécula es un inhibidor del factor de necrosis
tumoral (TNF, tumor necrosis factor).
18. Un proceso de acuerdo con la Reivindicación
17, donde dicho inhibidor del TNF se selecciona entre el grupo que
consiste en un inhibidor de TNF de 30kDa, un inhibidor de TNF de
40kDa, o sus variantes o muteínas truncadas.
19. Un proceso de acuerdo con la Reivindicación
18, donde dicho inhibidor del TNF es una muteína del inhibidor de
TNF.
20. Un proceso de acuerdo con la Reivindicación
19, donde dicha muteína del inhibidor del TNF es el inhibidor del
TNF de 30kDa c105.
21. Un proceso de acuerdo con la Reivindicación
15, donde dicha molécula biológicamente activa pegilada tiene la
fórmula R_{1}-X-R_{2},
donde:
X comprende un PEG purificado mediante HIC que
tiene un primer grupo reactivo y un segundo grupo reactivo, y donde
dicho primer grupo reactivo es un aceptor de Michael;
R_{1} comprende una molécula biológicamente
activa que tiene una porción tiol reactiva, estando dicha porción
tiol covalentemente unida con dicho aceptor de Michael; y
R_{2} comprende una molécula o un grupo no
biológicamente activo unido a dicho PEG mediante la reacción con
dicho segundo grupo reactivo.
22. Un proceso de acuerdo con la Reivindicación
21, donde X es
polietilenglicol-bis-vinilsulfona y
donde R_{1} y R_{2} es inhibidor de TNF de 30kDa c105.
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