ES2224649T3 - Conjugados de poliol-ifn-beta. - Google Patents
Conjugados de poliol-ifn-beta.Info
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Abstract
En la presente invención, se proporcionan conjugados de poliol-IFN-beta, y particularmente conjugados de PEG-IFN-beta, en los que una unidad de poliol. está unida covalentemente a la Cys17. La conjugación específica se obtiene dejando que un agente poliol reactivo con tioles reaccione con el residuo Cys17 del IFN-beta. Es de esperar que tales conjugados muestren una eficacia incrementada in vivo. El objetivo es obtener un incremento en la solubilidad a pH neutro, un incremento en la estabilidad (disminución de la agregación), disminución de la inmunogenicidad, y ninguna pérdida de actividad con respecto al IFN-beta ¿nativo¿. Los resultados de tal conjugación disminuirían el número de dosis para un efecto previsto, simplificarían y estabilizarían la formulación de una composición farmacéutica, y posiblemente incrementarían la eficacia a largo plazo.
Description
Conjugados de
poliol-IFN-\beta.
La invención se refiere a conjugados de
poliol-IFN-\beta en los que la
unidad de poliol está unida covalentemente a la Cys^{17}. Objetos
adicionales de la presente invención son el proceso para su
producción específica de sitio así como su uso en la terapia,
pronóstico o diagnóstico de infecciones bacterianas, infecciones
víricas, enfermedades autoinmunes y enfermedades inflamatorias.
El interferón de fibroblastos humanos
(IFN-\beta) tiene actividad antivírica y puede
estimular también las células citolíticas naturales contra las
células neoplásicas. Es un polipéptido de aproximadamente 20.000 Da
inducido por virus y RNA de doble cadena. A partir de la secuencia
de nucleótidos del gen del interferón de fibroblastos, clonado
mediante la tecnología del DNA recombinante, Derynk et al.
(Nature, 285:542-547, 1980) dedujeron la
secuencia completa de aminoácidos de la proteína. Tiene una
longitud de 166 aminoácidos.
Shepard et al. (Nature, 294
:563-565, 1981) describieron una mutación en la
base 842 (Cys - Tyr en la posición 141) que suprimía su actividad
antivírica, y un clon variante con una deleción de los nucleótidos
1119-1121.
Mark et al. (Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A., 81(18):5662-5666, 1984)
insertaron una mutación artificial reemplazando la base 469 (T) por
(A) causando un cambio de aminoácidos de Cys - Ser en la posición
17. Se comunicó que el IFN-\beta resultante era
tan activo como el IFN-\beta "nativo" y
estable durante un almacenamiento de larga duración (-70°C).
La unión covalente del polímero hidrófilo
polietilenglicol, (PEG), también conocido como poli(óxido de
etileno) (PEO), a moléculas tiene aplicaciones importantes en
biotecnología y medicina. En su forma más común, el PEG es un
polímero lineal que tiene grupos hidroxilo en cada extremo:
HO-CH_{2}-CH_{2}O(CH_{2}CH_{2}O)_{n}CH_{2}CH_{2}-OH
Esta fórmula se puede representar abreviadamente
como HO-PEG-OH, donde se quiere
indicar que -PEG- representa la cadena principal del polímero sin
los grupos terminales:
"-PEG= quiere
decir"-CH_{2}-CH_{2}O(CH_{2}CH_{2}O)_{n}CH_{2}CH_{2}-
El PEG se utiliza habitualmente como
metoxi-PEG-OH,
(m-PEG), en el cual un extremo es el grupo
relativamente inerte metoxi, mientras que el otro extremo es un
grupo hidroxilo que está sujeto a modificación química.
CH_{3}O-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}CH_{2}CH_{2}-OH
Los PEG ramificados son también de uso común. Los
PEG ramificados se pueden representar como
R(-PEG-OH)_{m}
en el cual R representa un resto central a modo de núcleo tal como pentaeritritol o glicerol, y m representa el número de ramificaciones. El número de ramificaciones (m) puede variar de tres a cien o más. Los grupos hidroxilo están sujetos a modificación química.
en el cual R representa un resto central a modo de núcleo tal como pentaeritritol o glicerol, y m representa el número de ramificaciones. El número de ramificaciones (m) puede variar de tres a cien o más. Los grupos hidroxilo están sujetos a modificación química.
Otra forma ramificada, tal como la descrita en la
solicitud de patente PCT WO 96/21469, tiene un único extremo que
está sujeto a modificación química. Este tipo de PEG se puede
representar como
(CH_{3}O-PEG-)_{p}R-X, en donde
p equivale a 2 ó 3, R representa un núcleo central tal como lisina
o glicerol, y X representa un grupo funcional tal como carboxilo
que está sujeto a activación química. Otra forma ramificada más, el
"PEG colgante", tiene grupos reactivos, tales como carboxilo, a
lo largo de la cadena principal de PEG en lugar de en el extremo de
las cadenas de PEG.
Además de estas formas de PEG, el polímero se
puede preparar también con uniones débiles o degradables en la
cadena principal. Por ejemplo, Harris ha mostrado en la solicitud
de patente de EE.UU. 06/026.716 que se puede preparar PEG con
uniones éster en la cadena principal del polímero que están sujetas
a hidrólisis. Esta hidrólisis da como resultado la escisión del
polímero en fragmento de peso molecular menor, de acuerdo con el
esquema de reacción:
-PEG-CO_{2}-PEG-
\;+
\;H_{2}O
\;\rightarrow
\;-PEG-CO_{2}H
\;+
\;HO-PEG-
De acuerdo con la presente invención, el término
polietilenglicol o PEG se pretende que comprenda todos los
derivados anteriormente descritos.
Los copolímeros de óxido de etileno y óxido de
propileno están estrechamente relacionados con el PEG en su
química, y pueden utilizarse en lugar del PEG en muchas de sus
aplicaciones. Tienen la siguiente fórmula general:
HO-CH_{2}CHRO(CH_{2}CHRO)_{n}CH_{2}CHR-OH
en la que R es H o
CH_{3}.
El PEG es un polímero útil que tiene la propiedad
de alta solubilidad en agua así como alta solubilidad en muchos
disolventes orgánicos. El PEG es también no tóxico y no inmunógeno.
Cuando el PEG está unido químicamente (PEGilación) a un compuesto
insoluble en agua, el conjugado resultante generalmente es soluble
en agua, así como soluble en muchos disolventes orgánicos.
Los conjugados de PEG-proteína se
están usando en la actualidad en terapias de reemplazo de proteínas
y para otros usos terapéuticos. Por ejemplo, la adenosina
desaminasa PEGilada (ADAGEN®) se está utilizando para tratar la
enfermedad de la inmunodeficiencia severa combinada (SCIDS), la
L-asparaginasa PEGilada (ONCAPSPAR®) se están
utilizando para tratar la leucemia linfoblástica aguda (ALL), y el
interferón \alpha PEGilado (INTRON ® A) está en ensayos clínicos
de la Fase III para tratar la hepatitis C.
Para una revisión general de los conjugados de
PEG-proteína con eficacia clínica véase N.L.
Burnham, Am. J. Hosp. Pharm., 15:210-218,
1994.
Se han desarrollado diversidad de métodos para
PEGilar proteínas. La unión de PEG a grupos reaótivos que se hallan
en la proteína se realiza típicamente utilizando derivados de PEG
activados electrófilamente. La unión del PEG a los grupos \alpha
y \varepsilon-amino que se hallan en los residuos
de lisina y al extremo N da como resultado un conjugado que consiste
en una mezcla de productos.
Generalmente, tales conjugados consisten en una
población de varias moléculas de PEG unidas por molécula de
proteína ("PEGmeros") que varían de cero al número de grupos
amino de la proteína. En el caso de una molécula proteica que se ha
modificado en un único punto, la unidad de PEG se puede unir a
numerosos sitios amino diferentes.
Este tipo de PEGilación inespecífica ha dado como
resultado numerosos conjugados que se vuelven casi inactivos. La
reducción de la actividad está causada típicamente por el
apantallamiento del dominio activo de unión de la proteína, como es
el caso con muchas citoquinas y anticuerpos. Por ejemplo, Katre
et al. en la patente de EE.UU. 4.766.106 y la patente de
EE.UU. 4.917.888 describen la PEGilación de
IFN-\beta y lL-2 con un gran
exceso de glutarato de metoxi-polietilenglicolilo y
N-succinimidilo y succinato de
metoxi-polietilenglicolilo y
N-succinimidilo. Ambas proteínas se produjeron en
células microbianas hospedadoras, lo que permitió la mutación
específica de sitio de la cisteína libre para dar una serina. La
mutación era necesario en la expresión mcirobiana del
IFN-\beta para facilitar el plegamiento de la
proteína. En particular, el IFN-\beta utilizado
en estos experimentos es el producto comercial Betaseron®, en el
que el residuo Cys^{17} se reemplaza por una serina.
Adicionalmente, la ausencia de glicosilación redujo su solubilidad
en solución acuosa. La PEGilación inespecífica dio como resultado
un incremento en la solubilidad, pero un problema principal era el
reducido nivel de actividad y rendimiento.
La solicitud de patente europea
EP-593.868, titulada Conjugados de
PEG-Interferón, describe la preparación de
conjugados de PEG-IFN-\alpha. Sin
embargo, la reacción de PEGilación no es específica de sitio, y por
ello se obtiene una mezcla de isómeros posicionales de conjugados
de PEG-IFN-\alpha (véase también
Monkarsh et al., ACS Symp. Ser.,
680:207-216, 1997).
Kinstler et al. en la solicitud de patente
europea EP-675.201 demostraron la modificación
selectiva del residuo N-terminal del factor de
crecimiento y desarrollo de megacariocitos (MGDF) con
mPEG-propionaldehído. Esto permitió una PEGilación y
una farmacocinética reproducibles de lote a lote. Gilbert et
al. en la patente de EE.UU. 5.711.944 demostraron que se podía
producir la PEGilación de IFN-\alpha con un nivel
óptimo de actividad. En este caso se necesitó una etapa laboriosa de
purificación para obtener el conjugado óptimo.
La mayoría de la citoquinas, así como otras
proteínas, no poseen un sitio de unión específico para PEG y, a
parte de los ejemplos anteriormente mencionados, es muy probable
que algunos de los isómeros producidos a través de la reacción de
PEGilación sean parcial o totalmente inactivos, causando así una
pérdida de actividad de la mezcla final.
La mono-PEGilación específica de
sitio es así un objetivo deseable en la preparación de tales
conjugados proteicos.
Woghiren et al. en Bioconjugate
Chem., 4(5):314-318, 1993, sintetizaron
un derivado de PEG selectivo respecto al tiol para tal PEGilación
específica de sitio. Se demostró que un derivado estable de PEG con
un tiol protegido en forma del grupo reactivo disulfuro de
parapiridilo se conjugaba específicamente con la cisteína libre de
la proteína, la papaína. El enlace disulfuro recién formado entre la
papaína y el PEG se podía escindir en condiciones reductoras
moderadas para regenerar la proteína nativa.
La cita de cualquier documento en la presente
memoria no se concibe como una admisión de que tal documento es una
técnica anterior pertinente, o un material considerado respecto a
la patentabilidad de cualquier reivindicación de la presente
solicitud. Cualquier afirmación respecto al contenido o datación de
cualquier documento está basada en la información disponible para
los solicitantes en el momento de la presentación y no constituye
una admisión de la corrección de tal afirmación.
En la presente invención, se proporcionan
conjugados de poliol-IFN-\beta, y
particularmente conjugados de
PEG-IFN-\beta, en los que una
unidad de poliol. está unida covalentemente a la Cys^{17}. La
conjugación específica se obtiene dejando que un agente poliol
reactivo con tioles reaccione con el residuo Cys^{17} del
IFN-\beta. Es de esperar que tales conjugados
muestren una eficacia incrementada in vivo. El objetivo es
obtener un incremento en la solubilidad a pH neutro, un incremento
en la estabilidad (disminución de la agregación), disminución de la
inmunogenicidad, y ninguna pérdida de actividad con respecto al
IFN-\beta "nativo". Los resultados de tal
conjugación disminuirían el número de dosis para un efecto previsto,
simplificarían y estabilizarían la formulación de una composición
farmacéutica, y posiblemente incrementarían la eficacia a largo
plazo.
La Figura 1 muestra el gráfico de Electroforesis
Capilar (EC) del conjugado de
PEG-IFN-\beta antes de la
purificación.
Las Figuras 2A-2C muestran la
purificación del conjugado de
PEG-IFN-\beta llevada a cabo
mediante cromatografía de exclusión por tamaño (Superosa 12): Fig.
2A - primer pase; Fig. 2B - segundo pase; Fig. 2C - tercer pase.
La Figura 3 muestra la cromatografía con
SDS-PAGE del conjugado purificado de
PEG-IFN-\beta del tercer pase de
la cromatografía. Los carriles 1 y 4 son patrones de proteínas de
peso molecular, el carril 2 es IFN-\beta
"nativo", y el carril 3 es conjugado de
PEG-IFN-\beta.
La Figura 4 representa el gráfico de
Electroforesis Capilar (EC) del conjugado purificado de
PEG-IFN-\beta en el que el
IFN-\beta está PEGilado con
mPEG-OPSS_{5K}.
La Figura 5 muestra el espectro de
MALDI-MS del conjugado purificado de
PEG-IFN-\beta.
La Figura 6 muestra una comparación entre la
actividad antivírica del IFN-\beta "nativo"
y el conjungado de PEG-IFN-\beta.
Se incubaron células WISH con las concentraciones indicadas de
muestras de IFN-\beta durante 24 horas antes de
someterlas a dosis citopáticas de virus de la estomatitis vesicular.
El efecto citopático se determinó después de 48 horas adicionales
por conversión de MTT.
La Figura 7 muestra el perfil de unión de
IFN-\beta y PEG-IFN en células
Daudi.
La Figura 8 muestra el perfil farmocinético del
IFN-\beta y el PEG-IFN en ratones
tras la administración intravenosa. Las líneas discontinuas indican
el LOQ (límite inferior de cuantificación) del ensayo para cada
curva patrón.
La Figura 9 muestra el perfil farmocinético del
IFN-\beta y el PEG-IFN en ratones
tras la administración subcutánea. Las líneas discontinuas indican
el LOQ (límite inferior de cuantificación) del ensayo para cada
curva patrón.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de que la unión de un resto de poliol, más
específicamente un resto de PEG, al residuo Cys^{17} del
IFN-\beta humano incrementaba de forma inesperada
(o al menos retenía y no daba como resultado una disminución de) la
actividad biológica del IFN-\beta respecto a la
del interferón-\beta humano nativo. Así, no sólo
el IFN-\beta con un resto de poliol unido al
residuo Cys^{17} exhibe la misma actividad biológica del
IFN-\beta o incrementada sino que este conjugado
de poliol-IFN-\beta proporciona
también las propiedades deseables conferidas por el resto de
poliol, tales como un incremento en la solubilidad.
"IFN-\beta", tal como se
utiliza aquí, quiere decir interferón de fibroblastos humanos,
obtenido por aislamiento a partir de fluidos biológicos u obtenido
por técnicas de DNA recombinante de células hospedadoras
procarióticas o eucarióticas así como sus sales, derivados
funcionales, precursores y fracciones activas, siempre y cuando
contengan el residuo de cisteína que aparece en la posición 17 en la
forma presente en la naturaleza.
El resto de poliol del conjugado de
poliol-IFN-\beta de acuerdo con la
presente invención puede ser cualquier poli(óxido de alquileno)
soluble en agua, mono o bifuncional, que tenga una cadena lineal o
ramificada. Típicamente, el poliol es un
poli(alquilenglicol) tal como poli(etilenglicol)
(PEG). Sin embargo, los expertos en la técnica reconocerán que se
pueden utilizar de forma adecuada otros polioles, tales como, por
ejemplo, poli(propilenglicol) y copolímeros de
polietilenglicol y polipropilenglicol.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "resto de PEG" se pretende que incluya, pero no se
limita a, PEG lineal y ramificado, metoxi-PEG, PEG
degradable hidrolítica o enzimáticamente, PEG colgante, PEG
dendrimérico, copolímeros de PEG y uno o más polioles, y
copolímeros de PEG y PLGA (poli(ácido láctico/glicólico)).
La definición de "sales" tal como se utiliza
en la presente memoria se refiere tanto a sales de grupos carboxilo
como a las sales de las funciones amino de los compuestos
obtenibles mediante métodos conocidos. Las sales de los grupos
carboxilo incluyen sales inorgánicas como, por ejemplo, sales de
sodio, potasio, calcio y sales con bases orgánicas como las
formadas con una amina como trietanolamina, arginina o lisina. Las
sales de los grupos amino incluyen, por ejemplo, sales con ácidos
inorgánicos como el ácido clorhídrico y con ácidos orgánicos como el
ácido acético.
La definición de "derivados funcionales" tal
como se utiliza en la presente memoria se refiere a derivados que
se pueden preparar a partir de los grupos funcionales presentes en
las cadenas laterales de los restos de aminoácidos o en los grupos
de los extremos N o C de acuerdo con métodos conocidos y están
incluidos en la presente invención cuando son farmacéuticamente
aceptables, es decir, cuando no destruyen la actividad de la
proteína o no transmiten toxicidad a las composiciones
farmacéuticas que los contienen. Tales derivados incluyen por
ejemplo ésteres o amidas alifáticas de los grupos carboxilo y
derivados N-acilo de grupos amino libres o
derivados O-acilo de grupos hidroxilo libres y se
forman con grupos acilo como por ejemplo grupos alcanoílo o
aroílo.
Los "precursores" son compuestos que se
convierten en IFN-\beta en el cuerpo humano o de
animales.
Como "fracciones activas" de la proteína, la
presente invención hace referencia a cualquier fragmento o
precursor de la cadena polipeptídica del compuesto mismo, solo o en
combinación con moléculas relacionadas o residuos unidos a él, por
ejemplo, residuos de azúcares o fosfatos, o agregados de la
molécula polilpeptídica cuando tales fragmentos o precursores
muestran la misma actividad del IFN-\beta como
medicamento.
Los conjugados de la presente invención se pueden
preparar mediante cualquiera de los métodos conocidos en la
técnica. De acuerdo con una realización de la invención, se hace
reaccionar IFN-\beta con el agente PEGilante en un
disolvente adecuado y el conjugado deseado se aísla y purifica, por
ejemplo, aplicando uno o más métodos cromatográficos.
"Método cromatográfico" quiere decir
cualquier técnica que se utilice para separar los componentes de
una mezcla mediante su aplicación sobre un soporte (fase
estacionaria) a través del cual fluye un disolvente (fase móvil).
Los principios de separación de la cromatografía se basan en la
diferente naturaleza física de la fase estacionaria y móvil.
Algunos tipos concretos de métodos
cromatográficos, que son bien conocidos en la bibliografía,
incluyen: cromatografía líquida, líquida de alta presión, de
intercambio iónico, de absorción, de afinidad, de reparto,
hidrófoba, en fase inversa, de filtración en gel, de
ultrafiltración o de capa fina.
El "agente PEGilante reactivo con tioles",
tal como se utiliza en la presente solicitud, quiere decir
cualquier derivado de PEG que es capaz de reaccionar con el grupo
tiol del residuo de cisteína. Puede ser, por ejemplo, PEG que
contenga un grupo funcional tal como disulfuro de ortopiridilo,
vinilsulfona, maleimido, yodoacetimido, y otros. De acuerdo con una
realización preferida de la presente invención, el agente PEGilante
reactivo con tioles es el derivado disulfuro de ortopiridilo (OPSS)
del PEG.
El agente PEGilante se utiliza en su forma
monometoxilada donde sólo un extremo está disponible para la
conjugación, o en una forma bifuncional donde ambos extremos están
disponibles para la conjugación, tal como por ejemplo para formar un
conjugado con dos IFN-\beta unidos covalentemente
a un único resto de PEG. Preferiblemente tiene un peso molecular
entre 500 y 100.000.
Un esquema típico de reacción para la preparación
de los conjugados de la invención se presenta a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La segunda línea del esquema anterior muestra un
método para escindir la unión PEG-proteína. El
derivado de mPEG-OPSS es altamente selectivo
respecto a los grupos sulfhidrilo y reacciona rápidamente en
condiciones de pH ácido donde el IFN-\beta es
estable. La alta selectividad se puede demostrar a partir de la
reducción del conjugado dando la forma nativa de
IFN-\beta y PEG.
Se ha demostrado que el enlace disulfuro que se
produce entre la proteína y los restos de PEG es estable en la
circulación, pero puede ser reducido al penetrar en el ambiente de
la célula. Por ello, se espera que este conjugado, que no penetra en
la célula, será estable en la circulación hasta que se produzca su
aclaramiento.
Se debería notar que la reacción anterior es
específica de sitio porque los otros dos residuos de Cys que
aparecen en las posiciones 31 y 141 de la forma de
IFN-\beta humano presente en la naturaleza no
reaccionan con el agente PEGilante reactivo con tioles puesto que
forman un puente disulfuro.
También se describe un método para la unión por
etapas de dos o más restos de PEG a un polipéptido. Este método se
basa en el reconocimiento de que un PEG activado de bajo peso
molecular reacciona más completamente con un sitio de reacción
impedido estéricamente de una proteína de lo que lo hace un PEG
activado de alto peso molecular. La modificación con PEG de
proteínas terapéuticas caras debe ser eficaz desde el punto de
vista de los costes con el fin de que la producción del conjugado
de PEG sea práctica. Además, con el fin de reducir la filtración
glomerular y optimizar las propiedades farmacológicas del conjugado
de PEG-proteína, el conjugado debería tener un
tamaño eficaz equivalente al de una proteína con un peso molecular
de 70 kDa. Esto quiere decir que en el caso de una modificación
especifica de sitio donde se unirá un PEG, se une preferiblemente
un derivado de PEG que tiene un peso molecular mayor que 20 kDa. Si
el sitio de modificación está estéricamente muy ocupado, el grupo
reactivo del resto grande de PEG puede tener dificultades para
alcanzar el sitio de modificación y así dará lugar a rendimientos
bajos. Un método mejorado para PEGilar un polipéptido incrementa el
rendimiento de la PEGilación específica de sitio uniendo primero un
resto pequeño de PEG hetero u homobifuncional que, debido a su
tamaño relativamente pequeño, puede reaccionar con sitios
estéricamente muy ocupados. La posterior unión de un derivado de PEG
de peso molecular grande al PEG pequeño da como resultado un alto
rendimiento de la proteína PEGilada deseada.
El método de la unión por etapas de dos o más
restos de PEG en serie a un polipéptido incluye unir primero al
polipéptido un resto de PEG de bajo peso molecular,
heterobifuncional u homobifuncional, y luego unir un resto de PEG
monofuncional o bifuncional al extremo libre del resto de PEG de
bajo peso molecular que está unido al polipéptido. Tras la unión
por etapas de dos o más restos de PEG en serie a un polipéptido,
polipéptido que es preferiblemente IFN-\beta y
donde la Cys^{17}, localizada en un sitio estéricamente muy
ocupado, es el sitio preferido de unión del PEG, el conjugado de
PEG-polipéptido se puede purificar utilizando una o
más técnicas de purificación tales como cromatografía de
intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaño,
cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad,
y cromatografía en fase inversa.
El resto de PEG de bajo peso molecular tiene la
fórmula:
W-CH_{2}CH_{2}O(CH_{2}CH_{2}O)_{n}CH_{2}CH_{2}-X,
donde W y X son grupos que
reaccionan independientemente con un grupo funcional amino,
sulfhidrilo, carboxilo o hidroxilo para unir el resto de PEG de bajo
peso molecular al polipéptido. Preferiblemente W y X se seleccionan
independientemente entre disulfuro de ortopiridilo, maleimidas,
vinilsulfonas, yodoacetamidas, aminas, tioles, carboxilos, ésteres
activos, carbonatos de benzotriazol, carbonatos de
p-nitrofenol, isocianatos, y biotina. El resto de
PEG de bajo peso molecular tiene preferiblemente un peso molecular
en el intervalo de aproximadamente 100 a 5.000
dalton.
El resto de PEG monofuncional o bifuncional a
unir al extremo libre de un PEG de bajo peso molecular que está
unido al polipéptido tiene preferiblemente un peso molecular en el
intervalo de aproximadamente 100 dalton a 200 kDa y es
preferiblemente metoxi-PEG, PEG ramificado, PEG
degradable hidrolítica o enzimáticamente, PEG colgante, o PEG
dendrimérico. El PEG monofuncional o bifuncional tiene además la
fórmula:
Y-CH_{2}CH_{2}O(CH_{2}CH_{2}O)_{M}CH_{2}CH_{2}-Z,
donde Y es reactivo con un grupo
terminal del extremo libre del resto de PEG de bajo peso molecular
que está unido al polipéptido y Z es -OCH_{3} o un grupo que puede
reaccionar con él para formar un conjugado
bifuncional.
El conjugado de PEG-polipéptido
producido por el método anterior para la unión por etapas de dos o
más restos de PEG se puede utilizar para producir una composición
medicamentosa o farmacéutica para tratar enfermedades o alteraciones
en las que el polipéptido es eficaz como ingrediente activo.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar los conjugados en una forma sustancialmente purificada
con el fin de que sean adecuados para su uso en composiciones
farmacéuticas, como ingrediente activo para el tratamiento,
diagnóstico o pronóstico de infecciones bacterianas o víricas así
como de enfermedades autoinmunes o inflamatorias y tumores. Tales
composiciones farmacéuticas representan un objeto adicional de la
presente invención.
Los ejemplos no limitantes de las enfermedades
anteriormente mencionadas incluyen: choque séptico, SIDA, artritis
reumatoide, lupus eritematoso y esclerosis múltiple.
Las realizaciones y ventajas adicionales de la
invención serán evidentes en la siguiente descripción.
Una realización de la invención es la
administración de una cantidad farmacológicamente activa de los
conjugados de la invención a sujetos en riesgo de desarrollar una
de las enfermedades anteriormente citadas o a sujetos que muestran
ya tales patologías.
Se puede utilizar cualquier ruta de
administración compatible con el principio activo. Se prefiere la
administración parenteral, tal como la inyección subcutánea,
intramuscular o intravenosa. La dosis de ingrediente activo a
administrar depende de las bases de las prescripciones médicas de
acuerdo con la edad, el peso y la respuesta individual del
paciente.
La dosificación puede estar entre 10 \mug y 1
mg diario para un peso corporal medio de 75 kg, y la dosis diaria
preferible está entre 20 \mug y 200 \mug.
La composición farmacéutica para administración
parenteral se puede preparar en una forma inyectable que comprende
el principio activo y un vehículo adecuado. Los vehículos para la
administración parenteral son bien conocidos en la técnica e
incluyen, por ejemplo, agua, solución salina, solución de Ringer y/o
dextrosa. El vehículo puede contener pequeñas cantidades de
excipientes con el fin de mantener la estabilidad y la isotonicidad
de la preparación farmacéutica. La preparación de las soluciones se
puede llevar a cabo de acuerdo con las modalidades ordinarias.
La invención se describirá ahora por medio de los
siguientes Ejemplos.
Se utilizó IFN-\beta
recombinante humano, estable a una concentración de 0,37 mg/ml en
tampón de acetato sódico 50 mM, pH 3,6, para la preparación de un
conjugado de PEG-IFN-\beta. Se
añadió aproximadamente 1,0 ml de urea 6 M a 2 ml de
IFN-\beta a una concentración de 0,37 mg/ml (0,74
mg, 3,7 x 10^{-8} moles). Se añadió
mPEG_{5K}-OPSS en un exceso molar de 50 moles por
mol de IFN-\beta y se dejó que los dos
reaccionaran en un vial de polipropileno durante o bien 2 horas a
37°C o bien 1 hora a 50°C. La mezcla de reacción se analizó con un
gráfico de electroforesis capilar (EC) para determinar el grado de
formación de conjugado de
PEG-IFN-\beta mediante la
reacción de PEGilación antes de cualquier purificación (Fig. 1). Un
rendimiento típico de esta reacción es 50% de
PEG-IFN-\beta. Los productos de
reacción se filtraron de la mezcla de reacción con un filtro de
jeringa de 0,22 mm y se cargó luego la solución filtrada en una
columna de exclusión por tamaño (o de Superosa 12 o de Superdex 75,
Pharmacia) y se eluyeron con un tampón de fosfato sódico 50 mM, NaCl
150 mM, pH 7,0. La Fig. 2A muestra el perfil de elución de la
purificación del conjugado de
PEG-IFN-\beta en una columna de
cromatografía de exclusión por tamaño de Superosa 12. Los picos se
recogieron y se analizaron con SDS-PAGE (Fig. 3). Se
juntaron las fracciones que contenían el conjugado de
PEG-IFN-\beta y luego se cargó de
nuevo el concentrado en la misma columna de exclusión por tamaño
para purificar aún más el conjugado de
PEG-IFN-\beta debido a la estrecha
proximidad del pico del IFN-\beta "nativo"
(Fig. 2B). Este procedimiento se repitió (tercer pase) para
asegurar pureza (Fig. 2C). La Fig. 4 y la Fig. 5 muestran el
gráfico de la electroforesis capilar y el espectro de
MALDI-MS, respectivamente, del conjugado purificado
de PEG-IFN-\beta.
Se proporcionó IFN-\beta humano
recombinante en condiciones estables en solución a 0,36 mg/ml en
tampón de acetato sódico 50 mM, pH 3,6. Se añadieron aproximadamente
36 mg de mPEG_{30K}-OPSS en 3 ml de H_{2}O
desionizada a 3 ml de IFN-\beta a 0,36 mg/ml
(1,08 mg, 4,9 x 10^{-8} moles) y se dejó que los dos reaccionaran
en un vial de polipropileno durante 2 horas a 50°C. Se analizó la
mezcla de reacción con electroforesis capilar para averiguar el
grado de modificación. Los rendimientos típicos de esta reacción
son <30%. Se cargó luego la solución en una columna de exclusión
por tamaño (Superosa 12, Pharmacia) y se eluyó con un tampón de
fosfato sódico 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0. Se recogieron los picos
y se analizaron sus contenidos con SDS-PAGE.
Para evaluar los efectos de la PEGilación sobre
la actividad antivírica del IFN-\beta humano
recombinante, se preincubaron células amnióticas humanas WISH o con
IFN-\beta de reciente preparación (del mismo lote
que el utilizado para la PEGilación) o con el conjugado de
PEG-IFN-\beta. La actividad
antivírica mediada por el IFN-\beta, medida
mediante el ensayo de citopaticidad WISH-VSV, se
determinó de acuerdo con un bioensayo antivírico WISH desarrollado
basándose en el protocolo de Novick et al., J.
Immunol., 129:2244-2247 (1982). Los materiales
utilizados en ese ensayo WISH son como sigue:
Soluciones concentradas de virus de la
estomatitis vesicular (ATCC
V-520-001-522),
almacenadas a -70°C.
IFN-\beta, humano recombinante,
InterPharm Laboratories LTD (tipo 32.075, lote n° 205035), 82 x
10^{6} Ul/ml, actividad específica: 222 x 10^{6} Ul/mg.
Conjugado de
PEG-IFN-\beta preparado como en el
Ejemplo 1 y mantenido en PBS, pH 7,4.
\newpage
Medio de crecimiento WISH (MEM alto en glucosa
con sales de Earls + 10% FBS + 1,0% L-glutamina +
Penicilina/Estreptomicina (100 U/ml, 100 \mug/ml).
Medio del ensayo WISH (MEM alto en glucosa con
sales de Earls + 5% FBS + 1,0% L-glutamina +
Penicilina/Estreptomicina (100 U/ml, 100 \mug/ml).
MTT a 5 mg/ml en PBS, almacenado a menos
70°C.
El protocolo del ensayo WISH es como sigue:
Diluir las muestras de
IFN-\beta hasta 2X la concentración de partida en
medio del ensayo WISH.
Realizar diluciones de tres veces de muestras de
IFN-\beta en medio del ensayo WISH en placas de
96 pocillos de fondo plano de forma que cada pocillo contenga 50
\mul de muestra diluida de IFN-\beta (algunos
pocillos de control reciben sólo 50 \mul de medio del ensayo
WISH).
Recolectar células WISH en fase logarítmica de
crecimiento con una solución de tripsina/EDTA, lavar con medio del
ensayo WISH, y llevar a una concentración final de 0,8 x 10^{6}
células/ml.
Añadir 50 \mul de suspensión de células WISH (4
x 10^{4} células por pocillo) a cada pocillo. La concentración
final de IFN-13 expuesto a las células es ahora
1X.
Después de la incubación durante 24 horas en un
incubador humidificado con CO_{2} al 5%, se añaden 50 \mul de
una dilución 1:10 (en medio del ensayo WISH) de solución
concentrada de VSV (una dosis predeterminada para lisar el 100 por
cien de las células WISH en 48 horas) a todos los pocillos excepto
a los pocillos de control sin virus (estos reciben sólo un volumen
igual de medio de ensayo).
Después de 48 horas adicionales, se añaden 25
\mul de solución con MTT a todos los pocillos, después de lo cual
se incuban las placas durante 2 horas adicionales en un
incubador.
Se retiran los contenidos de los pocillos por
inversión de la placa, y se añaden a los pocillos 200 \mul de
etanol al 100%.
Después de una hora, se leen las placas a 595 nm
utilizando el paquete de software Soft max Pro y un sistema con un
espectrofotómetro Spectramax (Molecular Devices).
Como se demuestra en la Fig. 6 y en la Tabla 1
anterior, el conjugado de
PEG-IFN-\beta mantuvo un nivel de
actividad antivírica superior al del lote precursor de reciente
preparación de IFN-\beta. La observación de que el
conjugado de PEG-IFN-\beta tiene
una bioactividad aproximadamente 4 veces más elevada que la del
IFN-\beta de reciente preparación puede ser
también una consecuencia del incremento en la estabilidad del
conjugado de PEG-IFN-\beta con
respecto al IFN-\beta "nativo" después de la
adición del medio del ensayo de las células WISH.
Se determinó la bioactividad relativa del
PEG[30 kD]-IFN-\beta y
PEG[2 x 20 kD]-IFN-\beta
mediante un ensayo WISH utilizando el protocolo normalizado descrito
en el Ejemplo 2 (Tabla 2). Se llevaron a cabo tres ensayos
independientes por tres individuos diferentes en momentos
separados.
La unión de
PEG-IFN-\beta a su receptor en las
células se evaluó en presencia de una cantidad fija de
^{125}I-IFN-\alpha2a. El
IFN-\alpha2a se marcó radiactivamente con
^{125}I utilizando el método de la cloramina T. El ^{125}I unido
a IFN\alpha2a se separó del yodo libre haciendo pasar los
reactivos a través de una columna de Sephadex G25 y juntando las
fracciones que contenían proteínas (Pharmacia). El
^{125}I-IFN-\alpha2a se
cuantificó mediante un ensayo del IFN-\alpha2a
por ELISA (Biosource, EE.UU.) y se determinó la actividad
específica. Se recolectaron células Daudi en fase exponencial de
crecimiento y se incubaron 2 x 10^{6} células con
^{125}I-IFN-\alpha2a 0,5 nM
durante 3 horas a temperatura ambiente en presencia de diferentes
concentraciones de PEG-IFN-\beta o
IFN-\alpha2a diluido en un tampón de ensayo que
es RPMI 1640 que contiene suero bovino fetal al 2% y ácida sódica al
0,1%. Al final de la incubación, se centrifugaron las células a
través de una capa de aceite de ftalato y se valoró la
radiactividad unida a células en un contador gamma. Además, la
unión del PEG[30
kD]-IFN-\beta y el PEG[2 x
20 kD]-IFN-\beta al receptor fue
muy similar o próxima a la actividad de unión del
IFN-\beta como se muestra en la Fig. 7.
Además, se determinó la actividad relativa en un
ensayo antiproliferación de células Daudi (linfoma de células B
humanas) (Tabla 3). Se prepararon todos los IFN a una concentración
2x de 200 ng/ml. Las muestras se diluyeron tres veces a lo largo de
la longitud de la placa hasta un volumen final de 100 \mul. Se
añadieron a cada pocillo 1x 10^{5} células/pocillo (100 \mul) y
se incubaron durante un total de 72 horas a 37°C en un incubador
humidificado con CO_{2}. Después de 48 horas, se añadió timidina
tritiada (^{3}H) a 1 \muCi/pocillo en 20 \mul. Al final de la
incubación de 72 horas, se procedió a la recolección en la placa
con el recolector de placas Tomtek. Los resultados mostrados en la
Tabla 3 indican que no se observó ninguna pérdida detectable de
actividad del IFN procedente de la PEGilación. De hecho, se
encontró que la actividad era algo superior que la del
IFN-\beta libre. Esto se puede deber a la
formación de agregados inactivos en el IFN libre o a las
diferencias en los métodos de cuantificación (análisis de
aminoácidos en el caso de las muestras de PEG-IFN y
RP-HPLC en el caso del
IFN-\beta).
Se inyectaron a ratones 100 ng de
IFN-\beta, PEG[30
kD]-IFN-\beta o PEG[2 x 20
kD]- IFN-\beta y se extrajo sangre en los tiempos
indicados posteriormente. Se determinaron las concentraciones de
IFN-\beta en suero mediante ELIAS específico para
IFN-\beta (Toray Industries) y los resultados se
muestran en la Fig. 8. Se separaron veintiocho ratones hembra de la
estirpe B6D2F1 (6-8 semanas) (de aproximadamente 20
g cada uno) en cuatro grupos como sigue: el Grupo 1 contenía nueve
ratones a los que se había inyectado mediante una única inyección
intravenosa rápida 200 \mul de IFN-(3 humano a 500 ng/ml (dosis
final de 100 ng/ratón); el Grupo 2 (nueve ratones) recibió 200
\mul de una masa equivalente de
PEG30kD-IFN-\beta; el Grupo 3
recibió 200 pi de una masa equivalente de PEG(2 x 20
kD)-IFN-\beta; y el Grupo 4 es un
grupo de tres ratones sin inyectar que sirvió como control
negativo. Se recogieron muestras de sangre (aproximadamente 200
\mui/muestra) en los nueve tiempos indicados por rotura del plexo
venoso retroorbital con un tubo capilar. Se dejó que las muestras de
sangre coagularan durante 1 hora a temperatura ambiente, se
separaron de las paredes del tubo con ayuda de una varilla y se
microcentrifugaron. Los sueros retirados de ellas se almacenaron a
-70°C hasta que se recogieron todas las muestras. En los sueros se
ensayó la presencia de IFN-\beta humano bioactivo
utilizando el ensayo de Toray. Los resultados indican que el área
bajo la curva (ABC) se incrementa marcadamente en las muestras de
PEG-IFN respecto al IFN-beta libre y
que la de las muestras de PEG-IFN frente al
IFN-\beta y la del PEG[2 x 20
kD]-IFN-\beta es superior a la del
PEG[30 kD]-IFN-\beta.
Se inyectaron subcutáneamente a ratones
IFN-\beta y PEG-IFN (100
ng/ratón). La Figura 9 demuestra que el área total bajo la curva
(ABC) se incrementa dramáticamente en el caso de las muestras de
PEG-IFN comparadas con el
IFN-\beta libre. Los estudios farmacocinéticos
son consistentes con que las muestras de PEG-IFN
tengan una semivida más larga y una ABC incrementada.
Se proporcionó interferón-\beta
humano recombinante en solución a 0,33 mg/ml en un tampón de
acetato sódico 50 mM, pH 3,8. Se añadieron aproximadamente 3,6 mg
(exceso de 40 moles por mol de proteína) del reactivo de PEG
heterobifuncional,
OPSS-PEG_{2K}-hidrazida, en 2 ml
de agua desionizada a 3 ml de IFN-\beta a 0,33
mg/ml (0,99 mg) y se dejó que los dos reaccionaran en un vial de
polipropileno durante 1 hora a 45°C. Se analizó entonces la mezcla
de reacción con electroforesis capilar para determinar el grado de
modificación. Los rendimientos típicos variaban entre
90-97% dependiendo de la pureza del interferón
\beta y el reactivo de PEG. A continuación se cargó la solución
en una columna de exclusión por tamaño (Superdex 75, Pharmacia) y
se eluyó con un tampón de fosfato sódico 5 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0.
Se recogieron los picos y se analizaron con
SDS-PAGE. Las fracciones de
interferon-\beta monoPEGilado se juntaron y se
utilizaron en una etapa adicional de modificación con PEG de alto
peso molecular.
Se proporcionó interferón-\beta
humano recombinante en solución a 0,33 mg/ml en un tampón de
acetato sódico 50 mM, pH 3,8. Se añadieron aproximadamente 6,1 mg
(exceso de 40 moles por mol de proteína) del reactivo de PEG
homobifuncional, (OPSS)_{2}-PEG_{3400},
en 2 ml de agua desionizada a 3 ml de
interferón-\beta a 0,33 mg/ml (0,99 mg) y se dejó
que los dos reaccionaran en un vial de polipropileno durante 2
horas a 50°C. Se siguió el desarrollo de la reacción con
SDS-PAGE no reductora y se analizó la mezcla final
de reacción con electroforesis capilar para determinar el grado de
modificación. Las modificaciones típicas en esta reacción con
interferón-\beta fueron >95%. Se cargó después
la solución en una columna de exclusión por tamaño (Superdex 75,
Pharmacia) y se eluyó con un tampón de fosfato sódico 50 mM, NaCl
150 mM, pH 7,0. Se recogieron los picos y se analizaron sus
contenidos con SDS-PAGE. Se combinaron las
fracciones de interferon-\beta monoPEGilado.
A las fracciones combinadas de
IFN-S-S-PEG_{2K}-hidrazida
del Ejemplo 5 se les añadió mPEG_{30K}-ALD en un
exceso de 20 moles por proteína. Se llevó a cabo la reacción a
temperatura ambiente (25°C) durante 4 horas y se añadió una muestra
a una columna de exclusión por tamaño (Superosa 6, Pharmacia) para
determinar el rendimiento de modificación. El rendimiento de
modificación de esta reacción era típicamente >80% dependiendo
de la pureza del reactivo de PEG y las condiciones de reacción.
Habiendo descrito ahora por completo esta
invención, los expertos en la técnica apreciarán que la misma se
puede llevar a cabo dentro de un amplio margen de parámetros,
concentraciones, y condiciones equivalentes sin apartarse del
espíritu y alcance de la invención y sin experimentación
indebida.
Aunque esta invención se ha descrito en conexión
con realizaciones específicas de la misma, se comprenderá que es
susceptible de modificaciones adicionales. Esta solicitud está
prevista para que cubra cualesquiera variaciones, usos, o
adaptaciones de las invenciones siguiendo, en general, los
principios de la invención e incluyendo tales desviaciones de la
presente descripción como parte intengrante de la práctica conocida
o habitual dentro de la técnica a la que pertenece la invención y a
la que se pueden aplicar las características esenciales citadas
anteriormente en la presente memoria expuestas como sigue en el
alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Todas las referencias citadas en la presente
memoria, incluyendo artículos o resúmenes de publicaciones
periódicas, solicitudes de patentes, publicadas o sin publicar, de
los EE.UU. o extranjeras, patentes hechas públicas en los EE.UU. o
el extranjero, o cualesquiera otras referencias, están incorporadas
enteramente como referencia en la presente memoria, incluyendo
todos los datos, tablas, figuras, y texto presentado en las citadas
referencias. Adicionalmente, los contenidos completos de las
referencias citadas dentro de las referencias citadas en la presente
memoria también están incorporadas enteramente como referencia.
La referencia a etapas de métodos conocidos,
etapas de métodos convencionales, métodos conocidos o métodos
convencionales no es en modo alguno una admisión de que cualquier
aspecto, descripción o realización de la presente invención esté
descrito, enseñado o sugerido en la técnica relevante.
La descripción previa de las realizaciones
específicas revelará tan por completo la naturaleza general de la
invención que otros pueden, aplicando conocimientos incluidos
dentro de la práctica de la técnica (incluyendo los contenidos de
las referencias citadas en la presente memoria), modificar
fácilmente y/o adaptar tales realizaciones específicas a diversas
aplicaciones, sin experimentación indebida, sin apartarse del
concepto general de la presente invención. Por ello, tales
adaptaciones y modificaciones se pretende que estén dentro del
significado y rango de equivalentes de las realizaciones descritas,
basándose en las enseñanzas y orientaciones presentadas en la
presente memoria. Ha de entenderse que la fraseología o
terminología de la presente memoria tiene el propósito de la
descripción y no de la limitación, de forma que la terminología o
fraseología de la presente memoria descriptiva ha de ser
interpretada por el experto en la técnica a la luz de las enseñanzas
y orientaciones presentadas en la presente memoria, en combinación
con el conocimiento de un experto corriente en la técnica.
Claims (13)
1. Un conjugado de
poliol-interferón-\beta que tiene
un resto de poliol unido covalentemente a la Cys^{17} del
interferón-\beta humano.
2. El conjugado de
poliol-interferón-\beta de acuerdo
con la reivindicación 1, en el que dicho resto de poliol es un
resto de polialquilenglicol.
3. El conjugado de
poliol-interferón-\beta de acuerdo
con la reivindicación 2, en el que dicho resto de
polialquilenglicol es un resto de polietilenglicol (PEG).
4. El conjugado de
poliol-interferón-\beta de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el
que el conjugado de
poliol-interferón-\beta tiene la
misma actividad como interferón-\beta o superior
que el interferón-\beta humano nativo.
5. Un proceso para producir el conjugado de
poliol-interferón-\beta de la
reivindicación 1, que comprende las etapas de:
hacer reaccionar el
interferón-\beta con un agente poliol reactivo con
tioles para unir de manera específica de sitio y covalente un resto
de poliol a la Cys^{17} del interferón-\beta
humano produciendo así un conjugado de
poliol-interferón-\beta; y
recuperar el conjugado de
poliol-interferón-\beta
producido.
6. El proceso de acuerdo con la reivindicación 5,
en el que el agente poliol reactivo con tioles es un agente
PEGilante reactivo con tioles.
7. El proceso de acuerdo con la reivindicación 5
o la reivindicación 6, en el que el agente poliol reactivo con
tioles está monometoxilado.
8. El proceso de acuerdo con la reivindicación 5
o la reivindicación 6, en el que el agente poliol reactivo con
tioles es bifuncional.
9. El proceso de acuerdo con la reivindicación 5
o la reivindicación 6, en el que el agente poliol reactivo con
tioles es un derivado de poliol que tiene un grupo funcional
seleccionado del grupo que consiste en disulfuro de ortopiridilo,
vinilsulfona, maleimida y yodoacetamida.
10. El proceso de acuerdo con la reivindicación 5
o la reivindicación 6, en el que el agente poliol reactivo con
tioles es un derivado de disulfuro de ortopiridilo de un poliol
monometoxilado.
11. El proceso de acuerdo con la reivindicación
5, en el que la etapa reactiva se lleva a cabo a un pH ácido donde
el interferón-\beta es estable.
12. Una composición farmacéutica, que comprende
un conjugado de
poliol-interferón-\beta de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, como
ingrediente activo, y un vehículo, excipiente o agente auxiliar
farmacéuticamente aceptable.
13. Una composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 12, para su uso en un método para tratar
infecciones, tumores y enfermedades autoinmunes e
inflamatorias.
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