ES2199935T3

ES2199935T3 - Pegilacion de polipeptidos.

Info

Publication number: ES2199935T3
Application number: ES92909329T
Authority: ES
Inventors: Robert C. Thompson; Lyman G. Armes; Ronald J. Evans; Michael T. Brewer; Tadahiko Kohno
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1991-03-15
Filing date: 1992-03-13
Publication date: 2004-03-01
Anticipated expiration: 2012-03-13
Also published as: FI934015A0; AU708533B2; FI934015L; CA2288429C; EP0575545A1; CA2106079C; DE69233069D1; EP0575545B1; EP0575545A4; AU1674292A; WO1992016221A1; DE69233069T2; FI113943B; GEP20033082B; CA2106079A1; NO933270D0; NO933270L; DK0575545T3; ATE240740T1; SG89295A1

Abstract

SE PRESENTAN COMPUESTOS QUE TIENEN LA FORMULA GENERAL R1-X-R2, EN DONDE R1 Y R2 SON GRUPOS QUE SON BIOLOGICAMENTE ACTIVOS, AL MENOS UNO DE LOS CUALES ES UN GRUPO POLIPEPTIDICO; X ES UN GRUPO POLIMERICO NO POLIPEPTIDICO; R1 Y R2 PUEDEN SER IGUALES O DIFERENTES. LOS GRUPOS R1 Y R2 MAS ADECUADOS SON ANTAGONISTAS RECEPTORES DE LA INTERLEUQUINA-1, INHIBIDORES DEL TNF 30KDA, RECEPTORES DE LA INTERLEUQUINA-2 Y CR1 Y MUTEINAS DE LOS MISMOS. TAMBIEN SE INCLUYEN ANTAGONISTAS DEL RECEPTOR DE LA INTERLEUQUINA-1 E INHIBIDORES DEL TNF 30KDA SELECTIVAMENTE MODIFICADOS.

Description

Pegilación de polipéptidos.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a polipéptidos que se han unido covalentemente a polímeros de cadena larga tales como metoxi polietilenglicol. Esta invención también describe métodos y reactivos para la reacción de moléculas poliméricas activadas con diversos polipéptidos importantes biologicamente.

Antecendentes de la invención

Se ha encontrado que muchas proteínas que se han identificado y aislado a partir fuentes humanas y animales muestran un potencial médico o terapéutico prometedor. Se han realizado grandes esfuerzos en métodos para identificar y caracterizar tales proteínas en formas relativamente puras y en cantidades relativamente grandes. Según avanza el proceso de desarrollo en relación con la utilización de materiales tan potencialmente valiosos, han surgido muchos obstaculos en la formulación de estos compuestos para su uso en modelos clínicos.

Por ejemplo, se ha encontrado que muchas de estas proteínas tienen una vida media extremadamente corta en el suero sanguíneo. En su mayor parte, las proteínas se eliminan del suero mediante los riñones. La introducción sistemática de cantidades relativamente grandes de proteínas, particularmente aquellas ajenas al sistema humano, pueden dar lugar a reacciones inmunogéncias que, entre otros problemas, puede conducir a una rápida eliminación de la proteína del cuerpo a través de la formación de complejos inmunes. Para otras proteínas, los problemas de solubilidad y agregación también han impedido la formulación óptima de la proteína.

Una de las técnicas más prometedoras para abordar estos problemas ha sido unir covalentemente una o más cadenas de polímeros inertes al polipéptido de interés. El polímero usado más comunmente es el polietilenglicol (PEG), o el monometoxil polietilenglicol (mPEG). Véase, por ejemplo, Davis et al., Biomedical Polymers: Polymeric Materials and Pharmaceuticals for Biomedical Use, páginas. 441-451 (1980). PEG es ideal para estos propósitos debido a sus conocidas propiedades no tóxicas. Otros investigadores han utilizado glicerol polioxietilado (POG) para propósitos similares. Knauf et al., J. of Biolog. Chem. vol. 263, pg 15064 (1988).

Se han descrito numerosos resultados donde la modificación covalente de las proteínas con polietilenglicoles (“pegilación”) ha dado como resultado en la adición de características deseables a la proteína. Por ejemplo, se ha demostrado que la pegilación de IL-2 reduce la eliminación de IL-2 aunque no afecta significativamente a la actividad de la citoquina. Reducir la eliminación conduce a una mayor eficacia sobre el material no pegilado. Katre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. vol. 84, pg. 1487 (1987).

Aumentar la vida media de la Superóxido Dismutasa (SOD) en el suero sanguíneo ha sido una barrera crítica para el uso de SOD para el tratamiento de varios síntomas. Varios estudios han demostrado que la pegilación de SOD dará lugar a una velocidad de eliminación reducida. Véase, por ejemplo, Conforti et al., Pharm. Research Commun. vol. 19, pg. 287 (1987).

La agregación de la Inmunoglobulina G (IgG) se ha postulado como un factor que conduce a efectos secundarios serios en pacientes a los que se le administra IgG de forma intravenosa. Se ha demostrado que la pegilación de IgG reduce la agregación de las proteínas para prevenir este problema. Suzuki et al., Biochem. Biophys. Acta vol. 788, pg.248 (1984).

También se ha demostrado la capacidad de las técnicas de pegilación para afectar la inmunogenicidad de la proteína. Abuchouski et al. han estudiado la inmunogenicidad y la vida en circulación de la Catalasa de Hígado Bovino pegilada. Abuchouski et al., J. Biol. Chem. vol. 252, pg. 3582 (1977).

La adición de grupos PEG a estas proteínas reduce la eliminación debido al incremento el el tamaño molecular de la proteína pegilada. Hasta un cierto tamaño, la velocidad de filtración glomerular de las proteínas es inversamente proporcional al tamaño de la proteína. La capacidad de la pegilación para reducir la eliminación, por lo tanto, no está generalmente en función de la cantidad de grupos PEG unidos a la proteína, sino del peso molecular total de la proteína alterada. Esto se ha confirmado por estudios de eliminación que cambiaban el tamaño de las cadenas laterales de PEG y el número de unidades de PEG unidas al IL-2. Katre, supra.

Los múltiples estudios de proteínas pegiladas en relación a eliminación, inmunogenicidad, agregación y propiedades físicas sugieren que el PEG forma una estructura flexible, hidrófila alrededor de la proteína. Las cadenas de PEG se hidratan altamente y dan a las proteínas pegiladas un peso molecular mayor del que se predeciría, y actuan para proteger cargas en la proteína.

Como se han visto muchos resultados prometedores en este campo, se ha desarrollado un catálogo de procedimientos para el acoplamiento de unidades de PEG a polipéptidos. El elemento clave en estos procedimientos es la "activación" del grupo OH terminal del polietilenglicol. Tal activación es necesaria para cerar un enlace entre el grupo PEG y el polipéptido. La gran mayoría de procedimientos de acoplamineto activan el resto PEG para reaccionar con grupos de aminas primarias de los polipéptidos. La mayoría de estas aminas libres se encuentran en los restos aminoacídicos de lisina.

En la práctica general, se acoplan varios restos PEG a las proteínas. Por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos No. 4.179.337 de Davis et al., se encontró que para suprimir la inmunogenicidad es deseable usar entre 15 y 50 moles de polímero por mol de polipéptido.

Como normalmente varias cadenas de PEG están unidas a cada polipéptido, y como normalmente hay un gran número de restos de lisina en cada proteína, se han realizado pocos esfuerzos para pegilar proteínas para producir productos de reacción homogéneos. Véase, Goodson et al. Biotechnology, vol. 8, pg. 343 (1990); Patente de Estados Unidos No. 4.904.584 de Shaw. Esta carencia de especificidad de reacción da lugar a varias complicaciones. Entre estas, que la pegilación a menudo da como resultado una pérdida significante de actividad de la proteína. Presumiblemente, el acoplamiento a un resto de lisina crítico podría alterar la posición activa de la proteína haciéndola inactiva.

Se ha demostrado en al menos un sistema, que la pegilación puede llevar a posiciones activas impedidas estéricamente. En otras palabras, pueden acercarse a la proteína sustratos relativamente pequeños, mientras que la actividad de las proteínas que reaccionan con sustratos mayores puede verse afectada de forma drástica por la pegilación aleatoria. Davis et al., supra. La pegilación de posición selectiva de tales proteínas podría conducir a materiales modifcados que obtienen los atributos deseables de la pegilación sin la pérdida de actividad. Además, si se tiene pensado usar la proteína pegilada para uso terapéutico, la mezcla de múltiples especies que resulta del uso de pegilación no específica conduce a dificultades en la preparación de un producto con propiedades reproducibles y caracterizables. Esto hace extremadamente dificil evaluar terapias y establecer información de eficacia y dosis.

En ciertos casos, se ha encontrado que la administración de complejos multiméricos que contienen más de un medicamento o polipéptido activo biologicamente puede provocar beneficios sinérgicos. Por ejemplo, un complejo que contiene dos polipéptidos de unión idénticos puede tener una afinidad sustancialmente incrementada al ligando o a la posición activa que une con respecto al polipéptido monomérico. Por esta razón, los complejos multiméricos de proteínas pueden ser deseables para incrementar la afinidad de la proteína a su ligando además de incrementar el peso molecular del complejo.

Las proteínas normalmente consiguen sus efectos biológicos a través de la interacción con otras proteínas. Cuando un complejo simple de dos proteínas es suficiente para conseguir el efecto biológico, se ha probado que es posible imitar la función de las proteínas endógenas administrando proteínas exógenas. Sin embargo, cuando el efecto biológico requiere la formación de un complejo que contiene más de dos proteínas es más dificil imitar la función de las proteínas endógenas con equivalentes exógenos producidos de forma recombinante porque normalmente los complejos de mayor orden no son estables. En tales casos puede ser ventajoso usar especies reticuladas que contienen dos de los componentes del complejo para simular el complejo activo biologicamente.

Posteriormente a la invención descrita en este documento, al menos tres grupos de investiganción han descrito la producción de proteínas reticuladas, donde las porciones extracelulares de uno de los receptores TNF se acopla a la cadena pesada de la igG humana o de ratones, las cuales se reticulan después a través de enlaces disulfuro. Peppel et al. J. Exp. Med. vol. 174, pg 1483 (1991); Ashkenazci et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA vol. 88, pg. 10535 (1991); y Loetscher et al., J. Biol. Chem. vol. 266, pg. 18324 (1991). En cada caso, las proteínas se expresaron en sistemas animales de expresión celular, y resultaron ser sustancialmente más eficaces en la inhibición de TNF que el receptor monomérico soluble sólo. También se han usado procedimientos similares para producir proteínas reticuladas similares de la proteína CD4, (Byrn et al., Nature (London) vol. 344, pg. 667 (1990) la proteína CR1, (Kalli et al., J. Exp. Med. vol. 174 pg. 1451 (1991); Hebell et al., documento WO 91/16437 (1991)) y la proteína CR2. (Hebell et al., Science vol. 254, pg. 102 (1991)).

Estas proteínas reticuladas -compuestas por dos unidades de polipéptidos y una porción del anticuerpo IgG- han demostrado tener futuro como agentes terapéuticos. Las proteínas reticuladas tienen un mayor peso molecular, que actúa para reducir la velocidad de liberación del complejo del cuerpo, además de la mejora aparente de la afinidad de las proteínas con su ligando. Sin embargo, las proteínas reticuladas de esta manera solo se han preparado hasta ahora con sistemas animales de expresión celular mediante la expresión de genes fusionados. Esto se ha necesitado para tener la porción de IgG de la proteína plegada correctamente después de la expresión. Además, la porción de la cadena fija pesadadel anticuerpo IgG que sirve como espaciador o engarce entre las unidades de polipéptido no permite cambiar la longitud, tamaño o geometría del espaciador. Dado el efecto sinérgico aparente conseguido con las proteínas dimericas, es probable que se pueda optimizar el beneficio sinérgico variando la orientación espacial de los polipéptidos. Y finalmente, las proteínas reticuladas pueden ser antigénicas y/o tener solubilidad reducida. La cadena pesada de anticuerpos no es inerte biologicamente.

Se han descrito otros complejos diméricos o “bivalentes”. Un grupo de tales compuestos diméricos se ha designado hirulogos. Estos compuestos se componen de unidades de polipéptidos muy cortas que se unen mediante un espaciador o un engarce de poli-glicina . Una de las unidades de polipéptidos es un inhibidor de trombina -una secuencia de 5 aminoácidos cogida de la proteína de 65 aminoácidos Hirudina- y la otra en un inhibidor de reconocimiento de exocitos enlazantes de aniones (ABE). Véase, Maragonore et al., Biochemistry, vol 29. pg. 7085 (1990); Bourdon et al., FEBS vol. 294. pg. 163 (1991).

La proteína C-reactiva (CRP) es una proteína de fase aguda del suero compuesta de cinco subunidades idénticas de 23 kDa. La CDP puede inducir reacciones de precipitación y aglutinación y también puede reaccionar con Clg para activar el camino clásico de complemento. Se han formado oligómeros reticulados de CRP usando bis(sulfosuccinimidil)suberato o 3,3'- ditio(sulfosuccinimidilpropionato) como agentes de reticulación. Jiang et al., Immunology vol. 74, pg. 725 (1991).

También se ha investigado la formación de ligandos diméricos o bivalentes para dirigirse a receptores opoides. Se ha conectado B-naltrexamina no peptídica o farmacóforos de oximorfamina con espaciadores de óxido de etileno o de glicina cortos. Erez et al., J. Med. Chem. vol. 25, pg. 847 (1982); Portoghese et al., J. Med. Chem. vol. 29, pg. 1855 (1986).

Tambien se han diseñado encefalinas de tetrapéptidos unidas mediante puentes de metileno para dirigirse a receptores opoides, y han demostrado tener mayor selectividad y afinidad por el receptor delta que el ligando delta original. Shimohigashi et al., Nature vol. 197, pg. 333 (1982).

La glicoproteína de superficie celular CD4 tambien se ha producido en formas multiméricas mediante una estrategia de reticulación basada en azúcar. El agente de reticulación utilizado fue el bismaleimidohexano (BMH) Chen et al., J. Biol. Chem. vol 266, pg. 18237 (1991).

El antígeno-3 de función del linfocito asociada (LFA-3) es una glicoproteína de superficie celular ampliamente distribuida que es un ligando para el linfocito T CD2. El LFA-3 con sus lípidos asociados formas micelas de proteínas de ocho monómeros lo que incrementa su capacidad para interactuar con células con CD2 en sus superficies. Dustin et al., J. Exp. Med., vol. 169, pg. 503 (1989).

En una tecnología relacionada de alguna forma, un grupo ha estudiado el efecto inhibidor de un polipéptido sintético que se compone de una unidad de pentapeptidilo que se repite. El polímero se sintetizó por el procedimiento de polimerización con azida de difenil fosforilo a un tamaño de aproximadamente 10.000 daltons. El pentapéptido polimerizado es una de las estructuras esenciales en varias respuestas biológicas. Morata et al., Inst. J. Bio. Macromol. vol. 11, pg. 97 (1989).

El documento US 4.766.106 describe la conjugación de \beta-interferon, interleuquina-2 o una inmunotoxina con un polímero soluble en agua seleccionado entre homopolímeros de polietilenglicol, o polioles polixoetilados. El documento US 4.935.233 describe polipéptidos de función dual que consisten en un interferon gamma o un interferon gamma activo biologicamente modificado, y un interferon beta o un interferon beta activo biologicamente modificado unidos por un segmento de engarce péptido de 1 a 500 restos aminoácidos.

Otro obstaculo en el desarrollo de proteínas exógenas eficaces para aumentar o competir con sustancias endógenas es que las proteínas exógenas deben administrarse sistematicamente más que estar localizadas en el sitio apropiado. Esto puede llevar a una eficacia inferior y a mayores efectos secundarios. Varios grupos han informado dirigir proteínas bioactivas a los sitios apropiados uniendolas a otras proteínas que proceden naturalmente de esos sitios. Estos enlaces se hacen a menudo mediante fusiones genéticas entre la proteína activa y la proteína dirigida.

Las unidades de espaciador o engarce de polietilenglicol se han usado para crear superantígenos dirigidos a anticuerpos después de la fecha de la presente invención. Se acopló un anticuerpo monoclonal reactivo a células de carcinoma de colon a la enterotoxina del superantígeno bacteriano staphylococcal. Más que diseñarse para explotar los beneficios asociados con los otros complejos bivalentes (por ejemplo, mayor peso molecular, efectos sinérgicos de bivalencia) estos complejos se diseñan para dirigir a los superantígenos a posiciones específicas. El proceso de pegilación descrito para formar estos superantígenos dirigidos crea un complejo que contiene una gran mezcla de materiales. El acoplamiento del anticuerpo y el superantígeno se consiguió usando 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidil y un espacio de 24 átomos de largo basado en PEG hidrófilo. De acuerdo con este procedimiento se acoplaron de 7 a 18 espaciadores a cada unidad de anticuerpo y se hicieron reaccionar una o dos lisinas en cada uno de los superantígenos. Dohlsten et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA. vol. 88, pg. 9287 (Octubre, 1991). Usando este procedimiento sería imposible aislar una sola especie para optimizar el producto o el proceso.

Dos grupos de materiales proteínicos que tienen aplicaciones significantes para el tratamiento de una amplia variedad de indicaciones medicas son los inhibidores de Factor de Necrosis Tumoral (TNF) y antagonistas del receptor de Interleuquina.1 (Il-1ra). Se ha demostrado que estos materiales tienen efectos beneficiosos en el tratamiento de enfermedades mediadas por TNF e IL-1 respectivamente. Entre las indicaciones que se han identificado como mediadas por TNF o IL-1 están el Síndrome de Insuficiencia Respitaroria en Adultos, Fibrosis Pulmonar, Artritis Reumatoide, Enfermedad de Inflamación Intestinal y Choque Séptico.

El documento EP-A-O 422 339 describe una clase de inhibidores proteínicos de TNF de ocurrencia natural y un método para fabricar una cantidad sustancial de los mismos con un alto grado de pureza. En particular, la solicitud mencionada anteriormente describe en detalle dos subconjuntos de inhibidores de TNF a los que se refiere por inhibidor de TNF 30kDA e inhibidor de TNF 40kDa. Además de la proteína inhibidora de TNF 40kDa, se han producido también dos formas del inhibidor de TNF 40kDa truncadas, aunque biológicamente activas. Estas proteínas, en las cuales se han retirado los aminoácidos terminales carboxilo 51 y 53 de la proteína de longitud completa, se les hace referencia como inhibidor de TNF 40kDA ? 51 e inhibidor de TNF 40 KDA ? 53.

La Patente de Estados Unidos No. 5.075.222 de Arend et al., describe una clase preferida de inhibidores de Il-1 proteínicos de ocurrencia natural y un método para fabricar una cantidad sustancial de los mismos con un alto grado de pureza. En particular, la solicitud describe en detalle tres inhibidores de interleuquina-1 que son antagonistas del receptor de interleuquina-1 (IL-1ra), concretamente IL-1ra\alpha, IL-1ra\beta, y IL-1rax.

Dos clases adicionales de materiales que son potencialmente útiles para el tratamiento de una diversidad de indicaciones médicas son los inhibidores de interleuquina-2 e inhibidores de complemento. Los inhibidores potenciales de interleuquina-2 incluyen receptores de interleuquina-2, la porción extracelular de los receptores de interleuquina-2, antagonistas de receptores de interleuquina-2, anticuerpos que reconocen interleuquina-2, y fragmentos de cualquiera de tales especies que contienen la función de enlace IL-2. Los inhibidores potenciales del sistema de complemento incluyen el receptor CR1, la porción extracelular del CR1, y el fragmento de CR1 que contiene la función de enlace complemento.

Se ha descrito el receptor de interleuquina-2 y se han descrito métodos para su aislamiento en la Patente de Estados Unidos No. 4.578.335 de Urdal et al., y en la Patente de Estados Unidos No. 4.816.565 de Honjo et al., También se ha descrito el gen que codifica el receptor de interleuquina-2 y métodos para su producción recombinante. La Solicitud de Patente Europea No. 89104023.0 de Taniguchi et al.; Solicitud de Patente Europea No. 90104246.6 de Taniguchi et al. Véase también, Honjo et al., Nature vol. 311, pg. 631 (1984); Taniguchi et al. Science vol. 244, pg. 551 (1989).

Podría asumirse que el dominio extracelular soluble de cualquier receptor de interleuquina-2 actuará como inhibidor de la acción de la interleuquina-2 citoquina. La interleuquina-2 es una de las citoquinas mejor caracterizadas, se sabe que tiene un papel pivotal en la proliferación específica de antígeno clonal de los linfocitos T. También se ha demostrado que la interleuquina-2 actúa en una diversidad de otras células en el sistema inmune.

Hay tres formas discretas del receptor de interleuquina-2, compuestas de dos moléculas receptoras distintas designadas cada una de ellas como IL-2r\alpha y IL2r\beta.

El receptor IL-2 de mayor afinidad se compone de dos receptores de IL-2 distintos. Ambos receptores han sido clonados y caracterizados. El receptor de IL-2 de baja afinidad se clonó en 1984 y ha sido bien caracterizado. Nikaido et al., Nature vol. 311, pg. 631 (1984). El dominio extracelular de la molécula tiene un peso molecular de 24.825 y tiene dos posiciones N-enlazadas de glicosilación. La molécula contiene 11 cisteínas, 10 de las cuales están implicadas en los enlaces disulfuro intramoleculares. Los dominios putativos de enlace de IL-2 en la molécula se han proyectado por mutagénesis y por proyección de epítopos. El receptor IL-2 de afinidad intermedia (IL-2r\beta) se clonó en 1989 y no se ha caracterizado de forma tan completa como el IL-2r\alpha. Hatakayama et al., Science vol. 244, pg. 551 (1989). El dominio extracelular del IL-2r\beta tiene un peso molecular de 24.693. La molécula contiene 8 cisteínas y 4 posiciones N-enlazadas de glicosilación. No se conocen los enlaces disulfuro en la molécula. El IL-2r\beta tiene un dominio citoplasmático de 286 aminoácidos.

Se han calculado las constantes de disociación (Kd) para los receptores de IL-2. Son 10^{-8}M para IL-2r\alpha, 10^{-9}M para IL-2r\beta y 10^{-11}M para el receptor de alta afinidad que consiste en un complejo de IL-2r\alpha, IL-2r\beta y IL-2. Los modelos actuales indican que la formación del complejo de alta afinidad se forma uniendo primero el IL-2 al IL-2r\alpha y después al IL-2r\beta. Ogura et al., Mol. Biol. Med. vol. 5, pg 123 (1988).

Un inhibidor de IL-2 puede ser valioso en la prevención de rechazo de transplantes así como en trastornos autoinmunes. Actualmente, se está probando un anticuerpo monoclonal contra IL-2r\alpha que previene la unión con IL-2 en transplantes renales en humanos. Hiesse et al., La presse Mediocle vol. 20, pg. 2036 (1991). En un estudio de 15 pacientes, el anticuerpo, en combinación con inmunosupresores, ha demostrado ser eficaz en la prevención de rechazo de aloinjerto como grupo de control obteniendo dosis mayores de inmunosupresores. Se han detectado niveles altos de IL-2r\alpha soluble circulante en una diversidad de enfermedades, algunas infecciones, así como en transplantes y rechazos. Esto sugiere la implicación del IL-2 en estas enfermedades.

La CR1 es una proteína a la que también se hace referencia como receptor C3b/C4b. La CR1 está presente en los eritrocitos y en una diversidad de otros tipos de células, y específicamente une C3b, C4b e iC3b. La CR1 también puede inhibir las C3/C5 convertasas de camino clásico y alternativo y actuar como un cofactor para la escisión de C3b y C4b con factor 1. Fearon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 75, pg. 5867 (1979). CR1 es una glicoproteína compuesta de una sola cadena de polipéptidos, y tiene cuatro formas alotípicas. Se conoce que CR1 contiene secuencias de códigos repetitivas, y se usa este hecho para explicar la existencia de múltiples alotipos. Krickstein et al., Complement vol. 2, pg 44 (Abst.) (1985).

La expresión reducida de CR1 en los eritrocitos se ha asociado con el lupus sistémico eritomatoso y también se ha encontrado que el número de CR1 está correlacionado inversamente con el nivel en el suero de complejos inmunes. La proteína CR1, el gen CR1 y los métodos para la producción de CR1 se describen en el documento WO 91/05047 y en el documento WO 89/09220 de Fearon et al. También se han descrito especies diméricas que contienen CR1 y porciones de un anticuerpo. WO 91/16437 de Hebell et al.

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Sumario de la invención

La invención se refiere a polipéptidos y muteínas, así como a métodos para la preparación de los polipéptidos y muteínas modificadas de acuerdo con la invención. La invención se refiere además al uso de los polipéptidos modificados como medicamento y a composiciones farmacéuticas que comprenden a los mismos.

Esta invención incluye un compuesto de fórmula R_{1}-X-R_{2} donde uno o los dos de R_{1} y R_{2} son un inhibidor de factor de necrosis tumoral (TNF), un inhibidor de interleuquina 1 (IL-1), un receptor de IL-2 o CR1 o R_{1} es una muteína de cisteína de IL-1ra y R_{2} es hidrógeno; y X es un espaciador polimérico no peptídico, donde R_{1} y/o R_{2} están unidos covalentemente a dicho espaciador polimérico no peptídico. Como se indica en la Figura 19, a los compuestos de fórmula R_{1}-X-R_{2} se les llama "pesas".

En una realización, uno o ambos R_{1} y R_{2} se seleccionan entre los siguientes: un inhibidor de IL-1 seleccionado entre un antagonista del receptor IL-1 o una truncación o un muteína del mismo; o un inhibidor de TNF seleccionado entre inhibidor de TNF 30kDa o una truncación o una muteína del mismo, o de un inhibidor de TNF 40kDa o una truncación o una muteína del mismo.

En otra realización, uno o los dos de R_{1} y R_{2} contienen de forma natural un resto de cisteína o se han modificado para contener al menos un resto de cisteína no nativo. Preferiblemente, uno o los dos de R_{1} y R_{2} se seleccionan entre: antagonista del receptor de IL-1, y dicho resto de cisteína no nativo se encuentra en la posición del resto aminoacídico 0, 6, 8, 9, 84, ó 141; o un inhibidor de TNF 30kDa o una truncación del mismo, y dicho resto de cisteína no nativo se encuentra en la posición del resto aminoacídico 1, 14, 105, 111, ó 161.

En otra realización, uno o los dos de R_{1} y R_{2} son antagonistas del receptor de IL-1 que llevan en resto de cisteína de ocurrencia natural 116 que está unido covalentemente a un espaciador polimérico no peptídico. Preferiblemente, cada uno de R_{1} y R_{2} están unidos covalentemente a dicho espaciador polimérico no peptídico mediante un enlace tio-éter, más preferiblemente mediante un resto cisteína nativo o no nativo.

En otra realización, R_{1} y R_{2} son inhibidores del factor de necrosis tumoral 30 kDa o una truncación del mismo, preferiblemente en el que dicho inhibidor de TNF tiene una cisteína no nativa en la posición del resto aminoacídico 105, y X se define como -Y_{1}-(Z)_{n}-Y_{2}-, donde Y_{1} e Y_{2} representan el resto de los grupos de activación y (Z)_{n} representa polietilenglicol, donde cada uno de R_{1} y R_{2} están unidos covalentemente a X mediante un enlace tio-éter, y donde n es mayor que 6. En una realización alternativa, X se define como -Y_{1}-(Z)_{n}-Y_{2}, donde Y_{1} e Y_{2} representan el resto de grupos de activación y (Z)_{n} representa el grupo base polimérico, donde (Z)_{n} se selecciona entre polietilenglicol, polipropilenglicol, glicerol polioxietilado, dextrano, ácidos colónicos, aminoácidos poli \beta, o polímeros de carbohidratos.

La invención también incluye composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad eficaz de compuesto de acuerdo con la invención en un soporte aceptable farmacológicamente.

Esta invención también incluye un método para la preparación de un compuesto en donde uno o los dos de R_{1} y R_{2} se seleccionan entre un inhibidor de factor de necrosis tumoral (TNF), preferiblemente inhibidor de TNF 30 kDa o una truncación o muteína del mismo, inhibidor de TNF 40 kDa o una truncación o muteína del mismo, o un inhibidor de IL, preferiblemente IL-1ra o una truncación o una muteína del mismo, que preferiblemente contiene naturalmente o se ha modificado para contener una cisteína reactiva; y X es un espaciador polimérico no peptídico que se define como -Y_{1}-(Z)_{n}-Y_{2}, donde Y_{1} e Y_{2} representan el resto de grupos de activación y (Z)_{n} representa el grupo base polimérico, donde (Z)_{n} se selecciona entre polietilenglicol, polipropilenglicol, glicerol polioxietilado, dextrano, ácidos colónicos, aminoácidos poli \beta, o polímeros de carbohidratos, donde R_{1} y R_{2} están unidos covalentemente a dicho espaciador polimérico no peptídico, dicho método consta de: reaccionar R_{1} y R_{2} con X para formar enlaces tio-éter entre X y los restos aminoácidicos cisteína para formar dicho compuesto R_{1}-X-R_{2} y aislar opcionalmente dicho compuesto

\hbox{R _{1} -X-R _{2} ;}

o reaccionar R_{1} con X para formar enlaces tio-éter entre X y los restos aminoacídicos de cisteína para formar un complejo R_{1}-X; reaccionar el complejo R_{1}-X con R_{2} para formar dicho compuesto R_{1}-X-R_{2}; y aislar opcionalmente dicho compuesto R_{1}-X-R_{2}.

Además, la invención incluye una muteína de un polipéptido, modificada para contener al menos un resto de cisteína no nativo, donde dicho polipéptido se selecciona entre: antagonista del receptor IL-1, y dicho resto de cisteína no nativo se encuentra preferiblemente en la posición del resto aminoacídico 0, 6, 8, 9 ,84, ó 141 y la cisteína en la posición 116 se reemplaza con otro aminoácido; o un inhibidor de TNF 30kDa o una truncación del mismo, y dicho resto de cisteína no nativo se encuentra preferiblemente en la posición del resto aminoacídico 1, 14, 105, 111, ó 16; y donde dicha cisteína no nativa de dicha muteína esta unida opcionalmente de forma covalente a un espaciador polimérico no peptídico definido como -Y_{1}-(Z)_{n}-Y_{2}, donde Y_{1} e Y_{2} representan el resto de grupos de activación y (Z)_{n} representa el grupo base polimérico, donde (Z)_{n} se selecciona entre polietilenglicol, polipropilenglicol, glicerol polioxietilado, dextrano, ácidos colónicos, aminoácidos poli \beta, o polímeros de carbohidratos.

La invención también incluye un método para la preparación de tal muteína de un polipéptido, que comprende: alterar la codificación del gen de dicho polipéptido mediante mutagénesis de localización dirigida para crear una codificación genética para una muteína de dicho polipéptido que contiene al menos un resto de cisteína no nativa; expresar dichos genes alterados en un sistema de expresión bacteriana; purificar dicho muteína expresada; plegar dicha muteína en presencia de un compuesto que contiene sulfhidrilo; reducir dicha muteína replegada con un agente reductor suave para liberar dicha cisteína no nativa; y hacer reaccionar dicha muteína con un grupo no peptídico polimérico que contiene un grupo activador que es específico del sulfhidrilo.

El compuesto de acuerdo con la presente invención puede usarse como un medicamento. El uso del compuesto de acuerdo con la invención como medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad mediada por TNF- y/o IL-1 está también incluida en esta invención. Preferiblemente, el compuesto de acuerdo con la invención se usa para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre Síndrome de Insuficiencia Respitaroria en Adultos, Fibrosis Pulmonar, Artritis Reumatoide, Enfermedad de Inflamación Intestinal, y Choque Séptico.

Para mantener la especificidad de posición de la pegilación, los reactivos pegilantes se seleccionan de tal forma que reaccionarán casi exclusivamente con los grupos -SG libres de restos cisteína de polipéptidos. Un ejemplo de un reactivo de pegilación que une covalentemente de forma casi exclusiva a los grupos -SH de la cisteína es 0-(2-maleimido etil)-0' de metilpolietilenglicol.

La pegilación de posición específica puede realizarse en restos de cisteína "libres" de ocurrencia natural de un polipéptido dado, o en cisteínas libres contenidas en muteínas de los polipéptidos de ocurrencia natural. Las cisteínas pueden añadirse a, o insertarse en, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de ocurrencia natural, o pueden sustituirse por otros restos aminoacídicos de es posiciones seleccionadas.

En una realización de esta invención, los polipéptidos para la pegilación se producen mediante tecnología de ADN recombinante a partir de una célula anfitrión bacteriana. En la mayoría de los casos el polipéptido expresado como bacteria debe replegarse para obtener actividad biológica antes de la etapa de pegilación. En ciertas aplicaciones de esta invención, el polipéptido nativo no contiene ningún resto cisteína libre, pero se produce un polipéptido alterado para contener al menos una cisteína libre en el polipéptido biológicamente activo. De acuerdo con este método, el pliegue del polipéptido expresado en forma de bacteria se facilita por la adición, a su vez, de un compuesto que contiene sulfhidrilo tal como cisteína y un compuesto que contiene disulfuro tal como cistina. Después de replegar y purificar, el polipéptido se trata con una cantidad limitada de un agente suave reductor tal como ditiotreitol (“DTT”) para regenerar el grupo sulfhidrilo del resto cisteína del polipéptido alterado. Después de la diálisis bajo condiciones pensadas para prevenir la oxidación, el polipéptido puede reaccionarse con un agente de pegilación específico de cisteína para formar de manera específicamente posicional un polipéptido modificado covalentemente.

Los polipéptidos pegilados preferidos de la presente invención con inhibidores de TNF e inhibidores de IL-1 pegilados de forma específicamente posicional. Más específicamente, esta invención describe inhibidores de TNF 30 kDa pegilados y antagonistas del receptor de IL-1 pegilados. Los inhibidores de TNF pegilados más preferidos incluyen el inhibidor de TNF 30 kDa donde el resto aminoacídico asparagina en la posición 105 de la proteína nativa humana se cambia a cisteína usando mutagénesis in vitro y ha ocurrido pegilación en la cistina libre en la posición 105. Otros derivados pegilados de inhibidores de TNF 30 kDA mutados incluyen mutaciones donde se ha añadido cisteína en las posiciones 1, 14, 111, y 161. Además de las muteínas pegiladas solo una vez, pueden incluirse cualquiera y todas las combinaciones de las distintas mutaciones dentro de una muteína sencilla para crear TNF 30 kDa alterado con mas de un resto de cisteína libre capaz de unirse al polietilenglicol.

El IL-1ra pegilado más preferido incluyen IL-1ra nativo o de ocurrencia natural, que incluye cuatro cisteínas libres. La mono-pegilación del IL-1ra nativo produce pegilación específica de posición en la posición 116. Otros derivados pegilados de IL-1ra mutado incluyen muteínas que tienen cisteína añadida en las posiciones 6, 8, 9, 84, ó 141 y el reemplazo de la cisteína en la posición 116 con serina. Además de las muteínas pegiladas sólo una vez, pueden incluirse cualquiera y todas las combinaciones de las distintas mutaciones dentro de una muteína sencilla para crear IL-1-ra alterado con mas de una cisteína libre capaz de unirse al polietilenglicol.

Otros aspectos y ventajas de la presente invención se harán aparentes con la consideración de la siguiente descripción detallada de la invención, incluyendo ejemplos ilustrativos de la práctica de la invención.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos del IL-1ra nativo.

La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos del inhibidor de TNF 30 kDA.

La Figura 3 muestra la SDS-PAGE con Coomassie de las formas pegiladas y no pegiladas del IL-1ra y la muteína c84s116 IL-1ra. Las bandas 2, 3, 6 y 6 contienen las mezclas de la reacción de pegilación. Las bandas 1 y 4 son las proteínas sin modificar.

Banda 1 - IL-1ra

Banda 2 - IL-1ra mPEG*_{5000}

Banda 3 - IL-1ra mPEG*_{8500}

Banda 4 - IL-1ra c84s116

Banda 5 - IL-1ra mPEG*_{5000} c84s116

Banda 5 - IL-1ra mPEG*_{8500} c84s116

La Figura 4 muestra la cromatografía de intercambio iónico mono S de : Cromatograma A, la mezcla de reacción de pegilación de IL-1ra mPEG_{5000}*, el máximo 1 es el modificado y el máximo 2 en el IL-1ra no modificado; y el Cromatograma B muestra el IL-1ra mPEG_{5000}* purificado.

La Figura 5 muestra un cromatograma de exclusión por tamaño que muestra el perfil de elución de varios patrones de tamaños, y IL-1ra mPEG_{5000}* (fracción 7) e IL-1ra (fracción 13).

La Figura 6 muestra el fraccionamiento HPLC de fase inversa de un producto de digestión tríptico de IL-1ra mPEG_{5000}* alquilado reaccionado con ácido yodoacético tritiado para marcar las cisteínas libres. La separación se realizó en una columna BrownLee C8 (2,1x220 mm) a temperatura ambiente y a una velocidad de flujo de 1000 \mul/min con un gradiente lineal. Disolvente A fue TFA al 0,1% en agua y el disolvente B fue TFA al 0,085% en acetonitrilo al 80% y H_{2}O al 20%.

La Figura 7 muestra el fraccionamiento HPCL de fase inversa de un producto de digestión quimotríptico de péptido 18 en la figura 6. Las condiciones fueron idénticas a las de la figura 6. Los péptidos 5 y 8 contenían cuentas de tritio y el péptido 5 tenía la secuencia de aminoácidos LCTAMEADQPVSL. La cisteína se identificó como el derivado de carboximetilcisteína. Este ciclo fue el único que contenía cuentas. La secuencia de aminoácidos del péptido 8 empezaba con serina 103 de IL-1ra. La redigestion de este péptido con quimotripsina permitió el fraccionamiento de las cuentas de tritio del péptido.

La Figura 8 muestra la concentración de plasma IL-1ra frente a los perfiles de tiempo de IL-1ra maduro, IL-1ra pegilado, y varias muteínas pegiladas de IL-1ra.

La Figura 9 muestra el gel de SDS-PAGE que muestra el inhibidor de TNF 30kDa c105 y mPEG, y la separación de inhibidor de TNF 30kDa sin reaccionar del inhibidor de TNF 30kDa c105 mPEG mediante cromatografía de exclusión por tamaño.

La Figura 10 muestra un gráfico que contiene la concentración de plasma subcutáneo IL-1ra frente a curvas de tiempo para un gran número de especies de IL-1ra pegiladas una vez, especies de IL-1ra pegiladas doblemente, y especies en forma de pesas de IL-1ra.

La Figura 11 muestra un gráfico que contiene la concentración de plasma subcutáneo IL-1ra frente a curvas de tiempo para varias especies de IL-1ra como en la Figura 10.

La Figura 12 muestra un gráfico de niveles de plasma IL-6 frente a tiempo después de la inyectar a ratones con hrTNF.

La Figura 13 compara los niveles de IL-6 inducidos en ratones con 5 relaciones de inhibidor de TNF 30kDA c105 con TNF (A) y cinco relaciones de inhibidor de TNF 30kDa c105 PEG_{2000}db con TNF (B).

La Figura 14 muestra los niveles de plasma IL-6 inducidos en ratones sólo con TNF y relaciones uno a uno de TNF a inhibidor de TNF 30kDA c105 PEG_{3500} y PEG_{\text{10.000}} en forma de pesas.

La Figura 15 muestra el porcentaje de neutrófilos inducidos cambiando las relaciones de TNF con inhibidor de TNF 30kDa c105 PEG_{3500}db(A), inhibidor de TNF 30kDa c105 PEG_{\text{10.000}}db (C); e inhibidor de TNF 30kDa c105 PEG_{\text{20.000}}db (D).

La Figura 16 muestra un gráfico que contiene la concentración de inhibidor de TNF 30kDa en plasma intravenoso frente a curvas de tiempo para inhibidor de TNF 30kDa nativo, inhibidor de TNF 30kDa c105 PEG_{8500}, y PEG_{\text{10.000}}, e inhibidor de TNF 30kDa c105 PEG_{3500}, PEG_{\text{10.000}}, PEG_{\text{20.000}} en forma de pesas.

La Figura 17 muestra un gráfico que contiene la concentración de inhibidor de TNF 30kDa en plasma intravenoso frente a curvas de tiempo para varias especies de inhibidores de TNF 30kDa como en la figura 16.

La Figura 18 muestra la solubilidad de 3 soluciones de IL-1ra nativo e IL-1ra c84 PEG8500 mostrando en el gráfico O.D.405 frente a tiempo.

La Figura 19 muestra la estructura básica de compuestos de esta invención que tienen como fórmula general

\hbox{R _{1} -X-R _{2} }

a los que se hace referencia como compuestos en forma de pesas. Descripción detallada de la invención

Esta invención implica la modificación selectiva de polipéptidos útiles, en particular, inhibidores del Factor de Necrosis Tumoral ("TNF") e inhibidores de interleuquina-1 ("IL-1"). Más específicamente, esta invención describe la modificación selectiva del inhibidor TNF 30kDa y del antagonista del receptor IL-1 ("IL-1ra"). La modificación selectiva sirve para mejorar las propiedades farmacocinéticas de los polipéptidos así como para proporcionar composiciones homogéneas para el uso terapéutico humano.

Polipéptidos adicionales que pueden modificarse selectivamente de acuerdo con los procedimientos de la invención incluyen receptores de interleuquina-2 ("IL-2r") y CR1. Todas las referencias al receptor de interleuquina-2 se entenderá que incluye a las cadenas \alpha y \beta del IL-2r a menos que se indique de otra forma.

En las realizaciones preferidas de la invención los polipéptidos modificados y las secuencias de ADN son humanas. Sin embargo, en caso de que haya suficiente similitud entre las secuencias de péptidos y ADN animales con las formas humanas, también se incluirían dentro del alcance de esta invención.

En una realización, el método de modificación de la presente invención incluye unir covalentemente polímeros de cadena larga con los polipéptidos de interés de una forma específica de la posición. Los polipéptidos seleccionados puede ser los polipéptidos de interés nativos o de ocurrencia natural, o pueden ser las muteínas activas biológicamente de los polipéptidos que se han producido para mejorar el proceso de modificación descrito en este documento. El método de la invención incluye la selección, producción e investigación de las muteínas deseadas que cumplen los objetivos de esta invención. En otras realizaciones de esta invención el método para modificar los polipéptidos solo requiere que la modificación se haga de forma que el producto resultante este disponible en forma sustancialmente purificada como se define este término en este documento.

En ciertas realizaciones, los polipéptidos modificados de la presente invención se unirán a polímeros de cadena larga en posiciones específicas de la secuencia de aminoácidos. Los polipéptidos modificados de la presente invención retendrán una parte sustancial de su actividad biológica. En las realizaciones preferidas, los polipéptidos modificados retendrán al menos una décima parte de la actividad biológica del polipéptido nativo en un análisis de unión al receptor. En una realización más preferida, el polipéptido modificado retendrá al menos una quinta parte de la actividad biológica del polipéptido nativo, y en la realización más preferida se retendrá al menos la cuarta parte de la actividad. Además, el polipéptido modificado servirá para mejorar la actuación farmacocinética del polipéptido nativo en al menos una de las siguientes áreas:

1) incrementar el peso molecular aparente del polipéptido nativo y, por tanto, reducir la velocidad de liberación después de la administración subcutánea o sistémica.

2) incrementar la solubilidad del polipéptido es soluciones acuosas; o

3) reducir la antigenicidad del polipéptido nativo.

En muchas realizaciones de la invención, se conseguirá cada uno de estos objetivos. En las realizaciones preferidas de la invención, el polímero de cadena larga será polietilenglicol o monometoxi polietilenglicol. En este documento se hará referencia a una unidad de polietilenglicol como PEG y a una unidad de monometoxi polietilenglicol como mPEG. El peso molecular aproximado de la unidad polimérica se dará en subíndices. Por ejemplo una unidad de monometoxi polietilenglicol con un peso molecular aproximado de 5.000 se notará como mPEG_{5000} o PEG_{5000}. Otros polímeros de cadena larga incluidos dentro del alcance de esta invención son el polipropilenglicol ("POG"), dextrano, ácidos colónicos u otros polímeros basados en carbohidratos y polímeros de ácidos \beta-amino y derivados de biotina.

En otra realización de la presente invención, la unidad polimérica de cadena larga es polietilenglicol dihidroxi, o HO-(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-H. Cuando se active para unir covalentemente con polipéptido u otros compuestos activos biológicamente como se describe a continuación, el material dihidroxi contendrá dos posiciones reactivas.

En las realizaciones preferidas de la presente invención las unidades poliméricas de cadena larga se unen al polipéptido mediante un enlace covalente con el grupo sulfhidrilo (-SH) de un resto cisteína. Para obtener selectividad de reacción y mezclas de reacción homólogas, es útil utilizar unidades poliméricas funcionalizadas que reaccionarán específicamente con grupos sulfhidrilo. En este documento se hace referencia al grupo funcional o reactivo acoplado al polímero de cadena larga como el grupo de activación. Los grupos de activación incluyen el grupo maleimida, grupo sulfhidrilo, tiol, triflato, tresilato, aziridina, oxirano, y 5-piridilo. Los grupos de activación preferidos son maleimidas.

Los glicoles de dihidroxi polietileno activados, debido a la separación física entre los extremos de la cadena polimérica, son casi igual de reactivos a cada extremo de la molécula. Mediante una selección apropiada de las condiciones de reacción y de los polipéptidos, los glicoles de dihidroxi polietileno - o cualquier otra unidad polimérica de cadena larga multi-activada - reaccionará con polipéptidos para formar complejos en forma de "pesas" donde se unen dos polipéptidos mediante una unidad polimérica de cadena larga.

Utilizadas las diferentes velocidades de reacción que se encontrarían entre el grupo activado polimérico enlazado y varios polipéptidos que contienen cisteína, y por la cinética de estas reacciones, es fácil para los expertos en la técnica producir también complejos en forma de pesas donde puedan formarse compuestos purificados sustancialmente que comprenden dos grupos polipéptidos diferentes, o que comprenden un solo grupo polipéptido y un grupo diferente activo biológicamente. Se proporcionan ejemplos de tales compuestos hetero en forma de pesas a continuación.

El alcance y disponibilidad para la reacción de las cisteínas cambia de forma drástica de polipéptido a polipéptido. Por lo tanto, en la forma activa biológicamente muchos polipéptidos no tienen cisteínas "libres", o cisteínas no unidas a otra cisteína. Además, la existencia de cisteínas "libres" no significa que sean accesibles para el enlace con agentes reactivos. Como la modificación ocurre normalmente en el polipéptido activo o plegado tridimensionalmente, tendrá lugar poca o nula reacción cuando se encuentre una cisteína libre dentro del "interior" de la estructura plegada.

Otra limitación adicional al modificar polipéptidos es el efecto potencial que la modificación pueda tener en la posición activa del polipéptido. La modificación de una cisteína con un cierta relación de proximidad con la posición activa puede efectivamente desactivar el polipéptido. Incluso conociendo mucho sobre el polipéptido seleccionado, es difícil, si no imposible, predecir correctamente cuando se modificarán los restos cisteína.

También existen los mismos factores cuanto se producen polipéptidos mutados que contienen restos de cisteína adicionales. Cuando el polipéptido se produce de forma recombinante mediante expresión bacteriana, las cisteínas no nativas pueden interferir con el replegado adecuado del polipéptido. Además, la cisteína debe ser accesible al agente de pegilación, y la cisteína pegilada no debe interferir significativamente con la posición activa del polipéptido.

La selección de posiciones potenciales dentro de un polipéptido dado para la introducción de una cisteína no nativa puede verse influenciada en base a varias fuentes de información. Por ejemplo, las posiciones de glicosilación pueden ser una buena posición para que una mutación incluya una cisteína libre. A medida que se conozca información sobre la posición de unión o activa de un polipéptido, también puede usarse esa información para seleccionar muteínas potenciales. La adición o sustitución de un resto cisteína en el extremo amino o en el extremo carboxilo del polipéptido es también una posibilidad debido a su emplazamiento. Y finalmente, la mutación de restos lisina a cisteína puede considerarse basándose en la suposición de que las lisinas se encontrarán generalmente en la superficie del polipéptido activo biológicamente.

Aunque pueden seleccionarse una diversidad de muteínas potenciales para un polipéptido dado que puedan cumplir las características deseadas, sólo mediante la síntesis, pegilación y comprobación de tales muteínas alteradas se conocerán cuales de ellas cumplen los objetivos de la presente invención. A la luz de esta invención y el conocimiento y habilidad de los expertos en la técnica, tal síntesis, pegilación y comprobación pueden realizarse sin excesiva experimentación. Debe notarse, que incluso si la pegilación de un polipéptido actúa para reducir la actividad biológica de un polipéptido hasta un cierto punto, la mejora en la actuación farmacocinética del polipéptido puede incrementar en gran medida el valor del polipéptido nativo en diversas aplicaciones terapéuticas.

Al seleccionar las muteínas diana, el método preferido para la producción de muteínas es expresar recombinantemente la codificación genética para la muteína. Asumiendo que se conoce la codificación genética para el polipéptido nativo, los genes alterados pueden crearse mediante procedimientos convencionales de mutagénesis de posición específica en el gen nativo, o por construcción de los genes alterados mediante procedimientos convencionales de síntesis genética. Estás técnicas son conocidas para los expertos en la técnica.

La codificación genética para la muteína diana puede expresarse en una diversidad de sistemas, incluyendo animal, de insectos, y bacteriana. A medida que se perfeccionen los sistemas de expresión, pueden usarse para la expresión de los polipéptidos nativos. En las realizaciones preferidas de la invención, la codificación genética para las muteínas genética se producen mediante mutagénesis específica de posición de los genes nativos, y los genes que codifican la muteína se expresan en un sistema de expresión bacteriana. En la Patente de Estados Unidos No. 5.075.222 de Hannum et al., expedida el 24 de Diciembre de 1991, se describen los genes que codifican el IL-1ra nativo y un método para expresar dichos genes en E. Coli. En la Solicitud de Patente de Estados Unidos con el Número de Serie 07/555.274 presentada el 19 de Julio de 1990, se describen los genes que codifican el inhibidor de TNF 30kDA nativo y un método para expresar dichos genes en E. Coli.

Las muteínas y los materiales pegilados de la presente invención incluyen variaciones alélicas en la secuencia de proteínas (variaciones en la secuencia debido a variabilidad natural de individuo a individuo) y proteínas sustancialmente equivalentes. "Sustancialmente equivalentes" como se usa en la especificación y reivindicaciones significa que posee un grado muy alto de homología en los restos aminoácidos (Véase generalmente, M. Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, pg. 124 (1972), National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C. asó como poseer una actividad biológica comparable. También se incluye dentro del alcance de esta invención las muteínas y los polipéptidos pegilados que son versiones truncadas parcialmente del polipéptido nativo.

En una realización preferida del método de la presente invención, cuando la muteína diana se produce mediante tecnología de ADN recombinante en un sistema de expresión bacteriana, se realizan las siguientes etapas:

1) la codificación genética de la muteína diana se crea mediante mutagénesis específica de posición de los genes que codifican el polipéptido nativo;

2) La codificación genética de la muteína diana se expresa en un sistema de expresión bacteriana;

3) La muteína diana se aísla de la bacteria y se purifica;

4) La muteína diana se repliega en presencia de cisteína u otro compuesto que contiene sulfhidrilo.

5) Se aísla y se purifica la muteína diana replegada;

6) La muteína diana purificada y replegada se trata con un agente reductor suave;

7) La mezcla de reacción se dializa en ausencia de oxígeno; y

8) La mezcla de reacción dializada se trata con un polímero de cadena larga que contiene un grupo de activación.

En la realización preferida para la producción de muteínas pegiladas del inhibidor de TNF 30kDa, el agente reductor suave es ditiotreitol ("DTT"). En otra realización, la modificación puede ocurrir antes de replegar la proteína o muteína expresada.

En la realización preferida de la presente invención, las muteínas pegiladas y los polipéptidos pegilados nativos pueden purificarse con métodos convencionales. En una realización alternativa, las muteínas purificadas pueden formularse también en composiciones farmacéuticas.

Los polipéptidos pegilados de la presente invención formados por la reacción de una unidad polimérica de cadena larga desactivada tienen propiedades beneficiosas adicionales. Estas moléculas en forma de "pesas" pueden contener dos de los polipéptidos de interés acoplados con una única unidad polimérica. Esta estructura impone una cierta linealidad a la molécula polimérica y reduce el impedimento estérico inherente en el uso de polímeros hidrófilos grandes tales como el polietilenglicol. El objetivo de obtener moléculas con mayor peso molecular aparente se consigue mientras que se retiene una alta actividad biológica. Están incluidas específicamente dentro del alcance de la invención las moléculas bidentadas donde dos moléculas de IL-1ra o dos moléculas de inhibidor de TNF se acoplan convenientemente a una cadena polimérica sencilla, o donde dos diferentes polipéptidos se acoplan a una cadena polimérica sencilla, es decir, una molécula bidentada sencilla que contiene un inhibidor de TNF y un resto IL-1ra.

Se han pegilado el IL-1ra nativo (figura 1) y diversas muteínas del IL-1ra de acuerdo con la presente invención. La pegilación de IL-1ra nativo en los grupos sulfhidrilo libres, mediante los métodos descritos en los ejemplos a continuación, resulta en la adición de mPEG en el resto cisteína de la posición 116 del IL-1ra (c116). Las otras tres cisteínas no son accesibles para la pegilación en la molécula totalmente nativa. Para acoplar moléculas de mPEG en diferentes posiciones de IL-1ra y para hacer conjugados de mPEG que tienen más de un mPEG, se añaden los IL-1ra en los que se reemplazaron los aminoácidos nativos con cisteína, o con más cisteínas, al extremo amino de la proteína. Para preparar conjugados en los cuales el resto 116 no se una a polietilenglicol el c116 se ha cambiado a serina en varias muteínas. A continuación hay una lista de las muteínas que se han generado para la reacción con mPEG (la numeración de restos se basa en la secuencia dada en la figura 1; c se refiere a cisteína y s se refiere a serina:

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 c0s116 \+ c0c116\cr  c84s116 \+ c84c116\cr  c6s116 \+ c6c116\cr 
c8s116 \+ c8c116\cr  c9s116 \+ c9c116\cr  c141s116 \+
c141c116\cr}

El inhibidor de TNF 30kDA (figura 2) no contiene ningún resto de cisteína libre. Se han preparados las siguientes muteínas del inhibidor de TNF 30kDa (la numeración de restos se basa en la secuencia dada en la Figura 2; c se refiere a cisteína):

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 inhibidor de TNF 30kda\cr  inhibidor de TNF 30kDa C _{1} \cr 
inhibidor de TNF 30kDa c14\cr  inhibidor de TNF 30kDa c111\cr 
inhibidor de TNF 30kDa
c161\cr}

Como se muestra en la Figura 19, se incluye dentro del alcance de esta invención una clase entera de compuestos que puede representarse por la fórmula R_{1}-X-R_{2} en donde e1 y R_{2} son grupos activos biológicamente y al menos uno de R_{1} y R_{2} es polipeptídico, y X es un grupo espaciador o engarce no peptídico polimérico. R_{1} y R_{2} pueden ser el mismo grupo o diferente. Cuando R_{1} y R_{2} son grupos distintos, R_{1} y R_{2} pueden ser polipeptídicos, o R_{1} puede ser polipeptídico y R_{2} puede ser cualquier grupo activo biológicamente. Los compuestos que tienen esta estructura, a los que se ha hecho referencia por compuestos "en forma de pesas", se caracterizan por estar sustancialmente purificados. El término "sustancialmente purificados" en este contexto se define como tener una composición homogénea.

Una composición homogénea consiste en una molécula del espaciador X y una molécula de R_{1} y una molécula de R_{2}. Una composición homogénea incluye, pero no requiere, que los grupos R_{1} y R_{2} activos biológicamente este acoplados al engarce exactamente en la misma posición en los grupos de cada molécula del compuesto. En ciertas realizaciones de esta invención, los grupos activos biológicamente están acoplados específicamente por posición al engarce. Por ejemplo, en el compuesto inhibidor de TNF 30kDa c105 PEG_{3000}db, dos grupos inhibidor de TNF 30kDa c105 se acoplan en el resto cisteína 105 al engarce PEG_{3000}.

Cuando se hace referencia a "composición homogénea" debe entenderse que en unas bases molécula-a-molécula, el compuesto en forma de pesa tampoco es necesariamente homogéneo con respecto a la longitud exacta del grupo espaciador. Los expertos en la técnica deben notar que cualquier proceso de producción que utiliza un intervalo de peso de PEG u otro polímero de alto peso molecular dado comienza con una solución que contiene un peso molecular "medio". Por lo tanto, cuando una unidad de PEG bis-reactiva reacciona con un grupo polipeptídico, la unidad de PEG es por definición polidispersa, y el compuesto en forma de pesa resultante es heterogéneo hasta el punto de que la longitud del engarce está sujeta a la variación que conocen los expertos en la técnica.

En resumen, "sustancialmente purificado" en este contexto se refiere a materiales que están sustancialmente libres de compuestos: 1) que se desvían en la composición de R_{1} o R_{2}; o 2) que están unidos mediante más de un

\hbox{espaciador X.}

R_{1} y R_{2} se definen como grupos activos biológicamente. Los grupos activos biológicamente incluyen cualquier compuesto que puede inducir un efecto biológico o interaccionar con una molécula biológica natural. Los grupos activos biológicamente incluyen proteínas, polipéptidos, esteroides, carbohidratos, especies orgánicas tales como heparina, agentes que contienen metales, vitaminas o cualquier otra especie activa biológicamente. Al menos uno de los grupos R_{1} y R_{2} es polipeptídico. En la realización preferida, R_{1} y R_{2} son polipeptídicos.

Polipeptídico se define como cualquier compuestos que es sustancialmente proteínico en la naturaleza. Sin embargo, un grupo polipeptídico puede contener algunos elementos no peptídicos. Por ejemplo, los polipéptidos glicosilados o las proteínas modificadas sintéticamente se incluyen dentro de la definición.

Los grupos activos biológicamente R_{1} y R_{2} incluyen grupos de enlace y grupos diana. Los grupos de enlace se definen por su afinidad por un ligando biológico dado. Los grupos diana se definen por su capacidad de dirigir la posición de un complejo dentro de un sistema biológico. R_{1} y R_{2} pueden tener afinidad por el mismo ligando, en cuyo caso el compuesto en forma de pesa puede tener una afinidad mejorada para ese ligando. R_{1} y R_{2} pueden tener afinidad a ligandos distintos, entonces R_{1} sirve para dirigir el complejo a una posición donde predomina el ligando para R_{2}.

Los grupos polipeptídicos preferidos son receptores, las porciones extracelulares de los receptores, moléculas de la superficie celular, y moléculas de la matriz extracelular, proteínas de enlace, y antagonistas de los receptores. Los siguientes polipéptidos y fragmentos de los mismos se incluyen entre los grupos polipeptídicos que pueden usarse como R_{1} o R_{2}: inhibidor de IL-1, inhibidor de TNF 30kDa, inhibidor de TNF 40kDa, receptor IL-2, CR1 (todas las referencias a CR1 incluyen cualquier secuencia de repetición en consenso simple o combinación de las mismas). Todas las referencias a receptores incluyen todas las formas del receptor cuando exista más de una forma. Uno o los dos de R_{1} y R_{2} son un inhibidor de factor de necrosis tumoral ("TNF"), un inhibidor de interleuquina 1 (IL-1), un receptor CR1 o IL-2 (las cadenas \alpha y \beta) o R_{1} es una muteína cisteína de IL-1ra y R_{2} es hidrógeno.

En una realización preferida, el espaciador polimérico no peptídico X puede definirse adicionalmente como a continuación: X = -Y_{1}-(Z)_{n}-Y_{2}-, donde Y_{1} e Y_{2} representan el grupo base polimérico. De acuerdo con la presente invención n es mayor que 6 y preferiblemente mayor que 10.

El término "no peptídico" se define como un grupo polimérico que es sustancialmente no peptídico en naturaleza. La inclusión de menos de 50% en peso de restos \alpha-aminoácidos como parte de Y_{1}, Y_{2} y Z se consideraría sustancialmente no peptídico en naturaleza y se consideraría no peptídico. En la realización preferida, el espaciador X no peptídico es no inmunogénico, e inerte biológicamente e hidrófilo. Además, los engarces preferidos son capaces de transmitir propiedades deseables a los grupos polipeptídicos activos biológicamente, -tales como inmunogenicidad reducida, mayor solubilidad, o menor velocidad de liberación del cuerpo- sin reducir significativamente la afinidad de un grupo R_{1} o R_{2} dado con su ligando. En las realizaciones más preferidas, el compuesto R_{1}-X-R_{2} (donde R_{1}=R_{2} y R_{1} y R_{2} son grupos de enlace) tiene una afinidad por su ligando que excede la afinidad que el grupo no derivatizado tiene por el ligando. Por ejemplo, el inhibidor de TNF 30kDa c105 PEG_{3400}db sustancialmente purificado tiene una actividad inhibidora para el TNF que es mayor de 20 veces la actividad inhibidora que el inhibidor de TNF 30kDa c105 tiene para el TNF.

Los grupos de activación Y_{1} e Y_{2} que son parte del espaciador polimérico X pueden comprender cualquiera de los grupos de activación discutidos anteriormente, incluyendo el grupo maleimida, grupo sulfhidrilo, tiol, triflato, tresilato, aziridina, oxirano, y 5-piridilo. Los grupos de activación preferidos son las maleimidas.

El grupo polimérico (Z)_{n} se selecciona preferiblemente entre el grupo compuesto por polietilenglicol, polipropilenglicol, glicerol polioxietilado, dextrano, ácidos colónicos, aminoácidos poli \beta, o polímeros de carbohidratos y derivados de biotina. En las realizaciones preferidas, el grupo polimérico es polietilenglicol. Cualquier grupo peptídico polimérico que cumpliera las funciones descritas en este documento se incluiría también dentro del alcance de esta invención.

Una de las ventajas de la presente invención es la capacidad de cambiar la distancia entre los grupos R_{1} y R_{2} variando la longitud del grupo polimérico que une los dos grupos de enlace. Aunque no está limitada por la teoría, se propone que el incremento en la actividad biológica visto para los compuestos multiméricos de esta invención se atribuya a la naturaleza multimérica de los receptores celulares y ligandos in vivo. Por esta razón, un experto en la técnica puede calcular fácilmente la distancia óptima entre las unidades R_{1} y R_{2} (que normalmente debería ser directamente proporcional a la longitud de la unidad polimérica (Z)_{n}) cambiando el tamaño del espaciador X.

En una realización de la presente invención, los grupos R_{1} y R_{2} son iguales. Sin embargo, en otra realización R_{1} y R_{2} son especies diferentes. Tales compuestos pueden diseñarse para crear un heterodímero en el que R_{1} y R_{2} actúan dentro del mismo sistema biológico general. Por ejemplo, se cree que el antagonista del receptor IL-1 y los inhibidores de TNF interrumpen la secuencia de inflamación. Los complejos difuncionales pueden diseñarse también de forma que R_{1} es una especie "diana" que "dirige" el complejo a una posición específica mediante su afinidad de enlace con un cierto sustrato, y el grupo de enlace opuesto tiene una actividad deseada en la posición localizada.

Un ejemplo de heterodímero que tiene gran potencial para ser un inhibidor de IL-2 satisfactorio es uno en el que R_{1} es IL-2r\alpha y R_{2} es IL-2r\beta. Tal heterodímero imita el complejo receptor con mayor afinidad por IL-2. Véase el Ejemplo XVII. Otro heterodímero que pueden actuar como inhibidor de complemento es el heterodímero en el que R_{1} es el dominio de enlace C3b de CR1 y R_{2} es el dominio de enlace C4b de CR1. Véase Ejemplo XVIII. En otro heterodímero más, R_{1} es el péptido exon 6 de PDGF y R_{2} es IL-1ra. Véase Ejemplo XIX.

En la realización preferida de la invención los procedimientos para producir los complejos R_{1}-X-R_{2} bifuncionales son esencialmente los mismos que los usados para la reacción de posición selectiva de polipéptidos como se ha descrito anteriormente. La síntesis del inhibidor de TNF 30kDa c105 PEG_{3400}db se describe a continuación en el Ejemplo 13. Un grupo polimérico bis-reactivo reacciona con un polipéptido que contiene cisteína, donde el grupo de activación en el grupo polimérico bis-reactivo forma un enlace tio-éter con el resto de cisteína libre seleccionado. Como se ha descrito anteriormente, la cisteína puede ser una cisteína libre de ocurrencia natural en el grupo polipeptídico, o una cisteína no nativa que se ha añadido o sustituido en la secuencia natural. El compuesto bis-reactivo polimérico preferido de la presente invención es \alpha-2(2-maleimido)?-maleimidopoli(oxietileno) o PEG bis-maleimido. La síntesis del PEG bis-maleimido se describe en el Ejemplo 12. De acuerdo con el método preferido, el compuesto de bis-maleimido se prepara con PEG bis-hidroxilo mediante el intermedio bis-amino.

Se han revisado varios métodos para la conversión de hidroxilos terminales del PEG en los correspondientes grupos amino, Harris et al., J. Polymer Scr. vol. 22, pg. 341 (1984); Harris, Rev. Macromol. Chem. vol. c25(3), pg. 325 (1985). Esto se consigue generando un intermedio reactivo mediante sulfonación, halogenación u oxidación del hidroxilo seguido del desplazamiento del extremo activado con un nucleófilo.

También existen otras alternativas prácticas a la síntesis de PEG bis-maleimida dado en el Ejemplo 12. El intermedio reactivo en la conversión del hidroxilo en amina puede ser el derivado halogenado (por ejemplo, la intermedio \alpha-(bromoetil)-?-bromopoli(oxietileno) (Johannson, Biochim. et Biophy. vol. 222, pg. 381, (1970)) seguido de sustitución directa con amoniaco, (Buckmann et al., Makromol. Chem. vol. 2182, pg. 1379 (1981)) o el intermedio aldehído (Harris, supra). El PEG maleimida no es el único reactiva específico de sulfhidrilo que puede usarse. Glass et al. han desarrollado otro método para el acoplamiento de PEG a sulfhidrilos. Glass et al., J. Biopolymers vol 18, pg. 383 (1979). Sin embargo, la reacción es reversible con tioles. Otro método para el acoplamiento de PEG a sulfhidrilos de cisteína es el derivado PEG bis-4-vinilpiridina.

Harris (supra) también revisa la síntesis de una diversidad de derivados electrófilos de PEG que pueden usarse como reactivos para modificar proteínas. Los reactivos incluyen clorocarbonatos, isocianato, epóxido, succinato de cucinimidilo, cloruro cianúrico, anhídridos mezclados, carbodiimidas y sulfonatos. El último grupo incluye tresilato, tosilato, y mesilatos. Algunos de los reactivos reaccionan selectivamente con aminas (por ejemplo, cloruro cianúrico y carbodiimidas) mientras que otros reaccionan con sulfhidrilos y aminas (por ejemplo, epóxido y tresilatos). Algunos de estos reactivos se han usado para modificar proteínas y pueden resultar en diversos grados de pérdida de actividad.

La preparación preferida de complejos R_{1}-X-R_{2} donde R_{1} y R_{2} son diferentes requiere un proceso de dos etapas donde el grupo bis- reactivo polimérico se hace reaccionar en serie con R_{1} y después con R_{2}. Cualquier experto en la técnica puede conseguir preparar tales heterodímeros sin excesiva experimentación. En algunos casos debe aislarse primero el intermedio R_{1}-X-R_{2} y purificarlo antes de la reacción con R_{2}, y en otras circunstancias puede no ser necesaria la purificación intermedia.

Los dominios extracelulares de IL-2r\alpha e IL-2r\beta pueden clonarse usando PCR y clonarse en un vector capaz de dirigir la expresión en E. Coli. Las proteínas pueden replegarse y purificarse en E. Coli y medir su capacidad para inhibir IL-2 mediante bioanálisis. Puede usarse la mutagénesis in vitro para sustituir restos nativos en las moléculas con cisteína para permitir el acoplamiento dirigido por posición del PEG. Entonces, pueden identificarse las muteínas de IL-2r\alpha e IL-2r\beta que permiten el acoplamiento eficaz de PEG y que no pierden actividad cuando se unen al polietilenglicol. Puede formarse un heterodímero enlazado a PEG uniendo primero el IL-1r\alpha al polietilenglicol en presencia de un exceso de PEG bis-maleimido. El IL-2r\alpha pegilado una vez puede purificarse y añadir IL-2r\beta para reaccionar con el grupo activo maleimida y formar el heterodímero. Esta molécula puede purificarse y evaluarse su actividad. Esta molécula debería imitar al receptor de IL-2 de alta afinidad encontrado en la superficie de las células.

Un complejo en forma de pesa donde R_{1} es IL-2 y R_{2} es IL-2r\beta debería ser útil también como antagonista del receptor de IL-2.g

Ejemplo 1 Síntesis de agentes de glicolación de polietileno

Se describen tres agentes para indicar los diversos medios que pueden usarse para derivatizar polipéptidos. Véase el Apéndice al Ejemplo 1, para las estructuras de Intermedios y reactivos descritos a continuación. Todas las referencias proporcionadas a continuación se incorporan específicamente en este documento por referencia.

A. Síntesis de reactivo 1: mPEG_{x}-ester-maleimida

Se preparó el derivado de éster de succinato del mPEG_{x} (intermedio 1) como se describe en Wie et al., Int. Archs. Allergy App. Immun., vol 64, páginas 84-99 (1981). El producto resultante se pesó y se disolvió en un mínimo de dioxano seco a 60ºC. Después de refrigerar la solución a temperatura ambiente, se añadieron cantidades equimolares de tri-n-butilamina y cloroformiato de isobutilo. La reacción continuó 30 minutos con agitación. Durante este tiempo, se preparó una solución tampón valorando una solución de ácido bórico 0,5 M con 1,6-hexanodiamina. La solución que contenía el anhídrido mezclado se añadió gota a gota a una fracción de la solución tampón de borato que contenía un exceso 10 veces molar de 1,6-hexanodiamina sobre el anhídrido mezclado. La mezcla de reacción se dializó exhaustivamente frente a agua desionizada a 4ºC y se liofilizó. Este intermedio polimérico (intermedio 2) se hizo reaccionar con un exceso 2,5:1 molar de sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidoetil) ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC, Pierce Chemical CO., Rockford, IL) en fosfato sódico 50 mM o en una solución tampón HEPES, pH 7,0, durante dos horas a temperatura ambiente. El polímero resultante se purificó por cromatografía de exclusión de tamaño de la mezcla de reacción en Sephadex G-25 usando fosfato sódico 50 mM (o HEPES) pH 7,0 para eluir a 4ºC. El polímero maleimido (reactivo 1) se eluyó en el volumen vacío de la columna y se detectó controlando su absorbencia a 260 nm. El reactivo se usó para alquilar polipéptidos antes de una hora después de su purificación. Como el mPEG de esta reacción puede eliminarse por hidrólisis, el reactivo es útil para identificar la posición del acoplamiento del mPEG a la proteína.

B. Síntesis de reactivo 2: mPEG_{x}-amida-maleimida

Se preparó el mPEG_{x}-tosilato (intermedio 3) como se describe en Pillai et al., J. Org. Chem. vol 45, páginas 5364-5370 (1980). La cantidad de intermedio sulfonado se calculó espectrofotométricamente como se describe en Nilson and Mosbach, en Methods of Enzymology, vol 104, páginas 56-69, Academic Pres. Inc., N.Y., N.Y. (1984). Este intermedio se convirtió en el derivado ftalimida (intermedio 4) y se redujo posteriormente con hidrato de hidrazina al intermedio mPEG_{x}-NH_{2} (intermedio 5) mediante el procedimiento de Pillai et al., supra. El La capacidad del grupo amino en equivalentes por gramo de producto se cuantificó por microvaloración con ácido clorhídrico. El mPEG_{x}- NH_{2} se hizo reaccionar con sulfo-SMCC en HEPES o solución tampón de fosfato pH 7,2 a temperatura ambiente durante 2 horas. Se comprobó la cantidad de mPEG_{x}-amina frente a sulfo-SMCC con relaciones molares de 5:1 a 1:5.

Para determinar las condiciones óptimas se usó el reactivo final (reactivo 2) en las reacciones de pegilación y se evaluó la cantidad y calidad de mPEG_{x}*IL-1ra (se usará esta notación para el producto pegilado de IL-1ra reaccionado con reactivo 2 y mPEG_{x}IL-1ra para IL-1ra pegilado a partir de una reacción con el reactivo 3 descrito a continuación) obtenida de estas reacciones mediante electroforesis con SDS-gel de poliacrilamida (PAGE). El resultado óptimo se obtuvo con una relación 1:1 de SMCC a mPEG_{x}-NH_{2}. Las proporciones más altas de sulfo-SMCC produjeron múltiples derivados de alto peso molecular de IL-1ra en SDS-PAGE y múltiples máximos en la cromatografía analítica de intercambio iónico y las proporciones inferiores resultaron en una menor producción de proteína pegilada. El reactivo 2 se purificó por cromatografía de exclusión por tamaño usando resina G25 sephadex.

C. Síntesis de reactivo 3: mPEG_{x}-maleimida

El intermedio mPEG_{x}-NH_{2} (intermedio 5) puede modificarse más para dar un derivado de maleimido diferente (reactivo 3). Esto último se consiguió haciendo reaccionar el mPEG_{x}-NH_{2} anhídrido maleico mediante una adaptación del procedimiento de Butler y Hartley, en Methods of Enzymology vol. XXV, páginas 191-199, Academic Press. Inc., NY, NY. (1972) y ciclando este intermedio (intermedio 6) con el correspondiente 0-(2-maleimidoetil)-0'-metilpolietilenglicol usando el método descrito en Wunsch et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler, vol 366, páginas 53-61 (1985).

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Apéndice al ejemplo 1

Síntesis del reactivo 1

Estructuras del material de partida, intermedios, y reactivos de la síntesis 1.

Material de partida

Fórmula generalizada para monometoxipolietilenglicol (mPEG_{x}):

CH_{3}O--(CH_{2}CH_{2}O)_{n}--H

donde x denota el peso molecular medio del polímero en kilodaltons y n es el número medio de grupos de oxietileno que se repiten.

Intermedio 1

CH_{3}O--(CH_{2}CH_{2}O)_{n-1}--(CH_{2}CH_{2})--O--

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

--CH_{2}CH_{2}COOH

Intermedio 2

CH_{3}O--(CH_{2}CH_{2}O)_{n-1}--(CH_{2}CH_{2})--O--

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

--CH_{2}CH_{2}--

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{o}}

--NH--(CH_{2})_{6}-- NH_{2}

Reactivo 1

3

Síntesis del reactivo 2

Estructuras del material de partida, intermedios, y reactivos de la síntesis 2.

Material de partida

Fórmula generalizada para monometoxipolietilenglicol (mPEG_{x}):

CH_{3}O--(CH_{2}CH_{2}O)_{n}--H

Intermedio 3

5

\newpage

Intermedio 4

6

Intermedio 5 (mPEG_{x}-NH_{2})

CH_{3}O--(CH_{2}CH_{2}O)_{n-1}--(CH_{2}CH_{2})--NH_{2}

Reactivo 2

7

Síntesis del reactivo 3

Estructuras del material de partida, intermedios, y reactivos de la síntesis 3.

Material de partida

Intermedio 5

CH_{3}O--(CH_{2}CH_{2}O)_{n-1}--(CH_{2}CH_{2})--NH_{2}

Intermedio 6

CH_{3}O--(CH_{2}CH_{2}O)_{n-1}--(CH_{2}CH_{2})--NH--

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

--CH=CH--COOH

Reactivo 3

0-(2-maleimidoetil)-0'-metil polietilenglicol

9

Ejemplo II Preparación de IL-1ra nativo pegilado

Se probaron diversos parámetros optimizando la reacción de pegilación de IL-1ra nativo con pegilación satisfactoria analizada mediante inspección visual de una única banda a 29 kilodaltons en una SDS-PAGE tintada con Coomasie y un único pico agudo en la cromatografía analítica de intercambio iónico. A menos que se indique otra cosa, las reacciones de pegilación se realizaron a 1 mg/ml de IL-1ra nativo a temperatura ambiente en una solución tampón HEPES pH 7,2 con una relación de reactivo mPEG a IL-1ra de 2:1. El reactivo usado en estos estudios fue mPEG-amido-maleimida (Reactivo 2) y al producto se nota como mPEG_{x}*IL-1ra pero los resultados son aplicables a los tres reactivos.

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A. Tiempo

Se analizaron las reacciones de pegilación a temperatura ambiente de 0,5 a 24 horas. La conversión de IL-1ra a la forma pegilada se completa (80%-90%) en un periodo de 2 a 4 horas y la cantidad total de mPEG_{x}*IL-1ra analizada mediante SDS-PAGE se reduce para tiempos más largos debido a la aparición de bandas adicionales y manchas a mayores pesos moleculares en el gel tintado.

B. Temperatura

Las reacciones de pegilación se incubaron a temperaturas de 4º, 25º, 37º, y 50ºC y después se analizaron en instantes de tiempo de 0,5, 1, 2, 4 y 17 horas. Las reacciones a 25º y 37ºC generaron una gran cantidad de proteína pegilada (aproximadamente 50%-80%) en un tiempo de una a dos horas, pero las incubadas a 4 y 50ºC resultaron en una producción mucho más baja (10%-20%) incluso en tiempos posteriores. La calidad del mPEG_{x}*IL-1ra no parece cambiar significativamente con la temperatura.

C. Concentración de proteína

Las reacciones de pegilación se han realizado con concentraciones de proteína (IL-1ra nativo) entre 50 \mug/ml y 10 mg/ml. Todas las concentraciones probadas funcionaron bien y no hubo diferencia en la calidad del mPEG_{x}*IL-1ra.

D. pH

El IL-1ra se unió al polietilenglicol con las condiciones de reacción indicadas anteriormente entre pH 5,5 y 7,5. La calidad del mPEG_{x}*IL-1ra es ligeramente mejor mediante SDS-PAGE e intercambio iónico a un pH inferior (pH 5,5) pero el porcentaje de conversión es el mismo.

E. Relación de mPEG-Amido-Maleimida A IL-1ra nativo

Probamos relaciones de entre 0,5:1 a 20:1 de mPEG-amido-maleimida frente a IL-1ra nativo. Las relaciones de aproximadamente 2:1 resultan en conversión eficaz de la forma pegilada de IL-1ra (50%-90%). Sin embargo, las relaciones mayores de 5:1 generan mPEG_{x}*IL-1ra de calidad inferior incrementando la cantidad de bandas de peso molecular muy alto en SDS-PAGE reducida y múltiples máximos en la cromatografía de intercambio iónico.

Las condiciones de reacción óptimas para la calidad de mPEG_{x}*IL-1ra obtenido y la cantidad del material, dentro de los parámetros usados, es una relación 2:1 mPEG-amido-maleimida/IL-1-ra a 25ºC durante 2-4 horas usando mPEG-amido-maleimida generada con una relación 1:1 de sulfo-SMCC a mPEG-amina. Con estas condiciones se convierte el 80%-90% del IL-1ra a forma pegilada usando el reactivo sintetizado con mPEG_{5000} o mPEG_{8500} como material de partida (Figura 3).

F. Preparación de formas de pesas de IL-1ra

Los complejos de PEG en forma de pesa que contienen IL-1ra se hacen de acuerdo con los mismos procedimientos que las otras especiales de IL-1ra pegiladas. Se usa un exceso 2-4 molear de PEG bis-maleimido a IL-1ra en una solución tampón HEPES a 7,0. Con IL-1ra, pueden usarse la molécula de tipo natural, que tiene un resto cisteína libre y disponible, o una muteína preparada como se describe en este documento. El IL-1ra está a una concentración de 2-5 mg/ml. La reacción se incuba a temperatura ambiente durante un periodo de 4 a 6 horas. Los compuestos de PEG IL-1ra en forma de pesa se purifican con las especies no pegiladas y pegiladas una vez mediante intercambio de cationes MonoS a pH 5,5 en una solución tampón 20-50 mM MES usando un gradiente de NaCl 0 a 1000 mM. Puede purificarse más mediante cromatografía de exclusión por tamaño usando una columna BioRad TSK 250 o Superdex 75, como se describe a continuación.

Ejemplo III Purificación de IL-1ra pegilado nativo

Puede conseguirse purificar mPEG_{x}*IL-1ra por cromatografía de intercambio de cationes o de exclusión por tamaño. Estos procedimientos son aplicables a los tres reactivos descritos anteriormente.

A. Cromatografía de intercambio catiónico

El mPEG_{x}*IL-1ra puede purificarse usando una columna MonoS (Pharmacia) con una solución tampón 20 mM MES a pH 5,5. Las proteínas se eluyeron de la columna usando un gradiente salino de NaCl 0 a 500mM en la misma solución tampón. Por ejemplo, IL-1ra eluye a NaCl 220mM, la pureza se evalúa mediante diversas técnicas incluyendo cromatografía analítica de intercambio iónico y SDS-PAGE. IL-ra mPEG_{5000} eluye a 160 nM (Figura 4).

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B. Cromatografía de exclusión por tamaño

El mPEG_{5000}*IL-1ra, que corre a aproximadamente 52 kd, y mPEG_{8500}*IL-1ra que corre a aproximadamente 68 kd (basado en la calibración de la columna con patrones de tamaño conocidos), pueden separarse fácilmente del IL-1ra sin modificar (17 kd) mediante cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Superdex 75 (Pharmacia) con técnicas cromatográficas comunes (Figura 5).

Ejemplo IV Caracterización del mPEG_{x}*IL-1ra

El mPEG_{x}*IL-1ra purificado dio un único pico simétrico al recromatografiarlo en MonoS y parecía puro en SDS-PAGE y mediante cromatografía de exclusión por tamaño (Figuras 3 y 4). Una comparación de los mapas trípticos de IL-1ra y mPEG_{5000}*IL-1ra mostró un pico, que correspondía al péptido que contiene c116 y c122, ausente del mapa de conjugados con la apariencia de un nuevo máximo ancho en este mapa. La subdigestión de este nuevo pico con quimotripsina y posterior análisis de la secuencia de aminoácidos indicó que la c116 se había unido al polietilenglicol en las condiciones empleadas (Figura 6)

Ejemplo V Preparación de muteínas de IL-1ra

Se realizó mutagénesis en ADN monocatenario a partir de los genes de IL-1ra clonados en el bacteriófago M13. Se uso el kit de Mutagene de BioRad que utiliza el procedimiento descrito por Kunket et al., Methods en Enzymology vol. 154 páginas 367-382 (1987). Brevemente, se generó un modelo de ADN monocatenario usando una cepa de E. Coli que contiene las mutaciones dut y ung, dando como resultado un modelo que contiene uracilo en lugar de timidina. Se anelaron olionucleótidos mutagénicos con una longitud de entre 20 y 30 pares de bases al templado, y la segunda cepa se resintetizó usando ADN polimerasa y ADN ligasa. Las mezclas de reacción se usaron para transformar una cepa de E. Coli natural en la que la cepa que contiene uracilo se degrada por los mecanismos de reparación del ADN y se permite que la cepa mutante se replique. El fago mutante se seleccionó y se secuenció mediante técnicas convencionales. El fragmento que contenía los genes mutantes se subclonó en el vector de expresión pT5T (Eisenberg et al., Nature vol. 343, páginas- 341- 346, (1989)) y se transformó en el cepa T7 del sistema de expresión (E. Coli B121DE3). También pueden usarse otros sistemas de expresión de E. Coli.

Los clones de expresión se desarrollaron en Luria Broth suplementado con 15 \mug/ml de tetraciclina a 37ºC. Cuando los cultivos alcanzaron una densidad óptica de 0,8 a 600 nm se pasaron a 30ºC y se añadió IPTG a una concentración final de 1 mM para inducir la expresión de los genes IL-1ra. La acumulación total de la proteína IL-1ra fue máxima después de 4-6 horas y no cambió significativamente hasta 12 horas después de la inducción.

Ejemplo VI Purificación de las muteínas IL-1ra

Los cultivos celulares inducidos como se ha descrito anteriormente se recogieron por centrifugación a 10000g durante 10 minutos. Las células se resuspendieron en una solución tampón de acetato sódico 30 mM pH 5,2 en 20-50 ml. La lisis se consiguió mediante dos pasadas de la célula a través de una prensa French a 18000 psi. El lisado celular se centrifugó a 10000g durante 10 minutos. La parte soluble se cargó en una columna de S-Sepharose y se lavó con la misma solución tampón que contenía NaCl 75 mM. La muteína de IL-1ra eluyó con solución tampón que contenía NaCl 200 mM. Una simple pasada sobre la resina de intercambio iónico resultó en un producto de suficiente pureza (>95%) para los estudios de pegilación. Puede conseguirse más purificación usando otras resinas de intercambio iónico tales como Q-Sepharose o MonoQ. Este procedimiento se usó para varias muteínas de IL-1ra con éxito similar. En algunos casos fue necesario variar ligeramente el pH y/o la concentración de NaCl para purificar muteínas que tenían un pequeña cambio en la carga de proteínas debido al cambio en la secuencia de aminoácidos. Con estas pequeñas variaciones que serían fáciles de realizar por los expertos en la técnica, este procedimiento es aplicable generalmente a todas las muteínas estudiadas.

Ejemplo VII Pegilación de la muteína IL-1ra

Además del IL-1ra nativo, se pegilaron las muteínas c84s116, c84c116, c0s116 y c9s116. Se produjeron y purificaron las formas pegiladas de c84s116 y c84c116 usando las mismas condiciones usadas para el IL-1ra nativo. Como la c84s116 y la c84c116 contienen dos cisteínas reactivas, la pegilación resulta en una proteína de mayor peso molecular a aproximadamente 40 kd en SDS-PAGE. Esta proteína puede purificarse mediante intercambio catiónico o mediante cromatografía por exclusión de tamaño y corre al peso molecular esperado de aproximadamente 68 kd en la última usando PEG_{5000}.

Ejemplo VIII Eficacia del mPEG*IL-1ra

Se probó la eficacia de las moléculas de IL-1ra nativo pegilado usando un análisis competitivo de enlace al receptor usando S^{35}-IL-1ra como ligando. Se usaron células de ratones (EL4) que contenían el receptor de IL-1 de tipo 1 en ratones o células de hámster (CHO) expresando con genes clonados el receptor human de tipo 1 en concentraciones de 1x10^{6} células por pocillo y 1x10^{5} células por pocillo, respectivamente, en placas de microvaloración de 96 pocillos. Se añadió S^{35}-IL-1-ra con una actividad específica de 4000 Ci/mmol a una concentración final de 150 pM. Se añadió ligando frío en una serie de diluciones de 28 mM a 13 pM y se dejó incubar durante 4 horas a 4ºC. Después, las células se filtraron a través de una placa de filtro Milliliter (Millipore, filtro Durapore con tamaño de poro de 0,5 micrómetros), se lavaron para eliminar cuentas unidas de manera no específica, se retiró el filtró y se contaron en un Ambis RadioAnalitical Imaging System. Se calcularon las constantes de disociación de equilibrio (kD) y se usaron para comparar las formas pegiladas y no modificadas del IL-1ra. En nuestro análisis, el IL-1ra no modificado natural y la c84s116 tienen la misma kD de 150-300 pM para el receptor de tipo 1 en ratones. La kd para la forma pegilada de IL-1ra es aproximadamente 400-800 pM y para la c84s116 pegilada, 500-1000 pM la cual es respectivamente 2,5 y 3,5 veces mayor que la de la proteína sin modificar. Las kD para todas las muteínas no pegiladas excepto una (c6s116) están entre el 65%-150% de la proteína nativa, dentro del error normal del análisis. Véase la Tabla 1.

TABLA 1 Análisis de moléculas de IL-1ra pegiladas

		Tamaño (kd)	Análisis de receptor
Muteína
	Natural	17,5	100
	C82S116	17,5	98
	C9S116	17,5	67
	C6S116	17,5	37
	C0S116	17,5	63
	C84C116	17,5	95
PEG*IL-1ra
	Sencillo
	PEG_{5000}c116	50-60	34
	PEG_{5000}c84s116	50-60	28
	PEG_{8500}c116	70-80	30
	PEG_{8500}c84s116	70-80	30
	PEG_{8500}c0s116	ND	22
	PEG_{8500}c9s116	ND	12
	PEG_{12000}c116	78	20

	Doble
	PEG_{5000}c84c116	70-80	11
	PEG_{8500}c84c116	150-200	4
	PEG_{12000}c84c116	175	5

	Forma de pesa
	PEG_{3500}c116	55-65	49
	PEG_{3500}c84	60	49
	PEG_{\text{10.000}}c116	175-200	49
	PEG_{\text{10.000}}c84	200	60
	PEG_{\text{10.000}}c84	>200	24

Los datos se presentan como porcentajes de la actividad exhibida por IL-1ra no modificado. Las desviaciones típica son del 10%.

Ejemplo IX Farmacocinética de muteína de IL-1ra nativo pegilado

Se comprobó el carácter farmacocinético de varias moléculas de IL-1ra nativas pegiladas y muteínas después de la inyección intravenosa de las moléculas en ratas. Se inyectó IL-1ra nativo o pegilado en forma de dosis bolo intravenosa (3 mg/kg). Se recogieron varias muestras de sangre de la vena de la cola y se hicieron análisis de

\hbox{IL-1ra}

nativo o pegilado mediante análisis inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Los perfiles resultantes de concentración de IL-1ra en plasme frente a tiempo (Figura 8) ilustran que la pegilación tiene una influencia notable en la desaparición de IL-1ra del plasma después de la inyección intravenosa. La mejor descripción de la reducción en el IL-1ra en plasma y derivados pegilados del IL-1ra es mediante tres componentes exponenciales. Los datos indican que la pegilación prolonga las vidas medias de estos componentes hasta seis veces en la rata (Tabla 2). Las vidas medias de estos componentes exponenciales aumenta a la vez que aumenta el tamaño de la molécula de PEG (Tabla 2). Además, existe evidencia de que la prolongación de las vidas medias puede ser específica de la posición de pegilación. Se usaron análisis compartimentales convencionales para interpretar los datos de la Figura 8. La prolongación de las vidas medias puede explicarse basándose en la teoría farmacocinética aceptada que afirma que la vida media en el plasma de un medicamento está inversamente relacionada con la eliminación del medicamento del plasma y directamente relacionada con el volumen aparente de distribución del medicamento. El análisis farmacocinético de la desaparición de IL-1ra pegilado del plasma indica que la prolongación de la vida media está inversamente relacionada con una menor eliminación de las moléculas pegiladas, en comparación con el IL-1ra nativo (Tabla 2). La reducción en la eliminación del plasma es consistente con una reducción relacionada con el tamaño anticipada en la filtración glomerular de las moléculas pegiladas en los riñones. También, la prolongación de la vida media mediante la pegilación está relacionada directamente con un aumento de la distribución (estado estacionario Vd, Tabla 2) de la molécula pegilada. El aumento en el volumen de distribución indica mayor penetración de las moléculas pegiladas en el conjunto extravascular. A través de este mecanismo, la pegilación mejora la terapia con IL-1ra aumentando la medida en la que las moléculas activas pasan de la circulación sistémica al compartimento extravascular, un compartimento en el que se espera que estén los receptores IL-1. Debido a la similitud entre ratas y humanos en los mecanismos de eliminación y distribución del IL-1ra, es evidente que la pegilación mejorará de forma similar las propiedades farmacocinéticas de IL-1ra en humanos. 1. Farmacocinética intravenosa adicional del IL-1ra pegilado

Se han caracterizado la farmacocinética intravenosa para 8 muteínas de IL-1ra pegiladas más usando métodos descritos previamente. Se adjunta un gráfico que contiene la concentración de IL-1ra en el plasma intravenoso frene a curvas de tiempo para cada una de las moléculas (Figura 10). La revisión de todos los datos de farmacocinética intravenosa (Tabla 3) indica que según aumenta el tamaño del PEG (sencillo o doble), se reduce la eliminación y por tanto aumentan el tiempo medio de permanencia intravenosa y el tiempo medio de desaparición de IL-1ra del plasma. La posición de pegilación es importante en la determinación de la medida en la que la pegilación reduce la eliminación del plasma y prolonga el tiempo medio de residencia. La adición de dos PEG a IL-1ra prolonga el tiempo medio de permanencia intravenosa 14 veces en comparación con el IL-1ra natural.

2. Farmacocinética subcutánea del IL-1ra pegilado

Se ha caracterizado la absorción farmacocinética de las muteínas de IL-1ra pegiladas después de la inyección subcutánea de las moléculas en ratas. Se recogieron varias muestras de sangre de la vena de la cola y se hicieron análisis de IL-1ra nativo o pegilado mediante análisis inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). En la figura 11 se muestra un gráfico de las concentraciones de IL-1ra en el plasma subcutáneo frente a tiempo. Los datos de farmacocinética subcutánea (Tabla 3) revelan una disponibilidad sistémica variable de las muteínas pegiladas, relacionada con la posición y el tamaño del PEG, y relacionada con la inyección subcutánea en formulaciones no optimizadas. La Tabla 3 también muestra una influencia positiva notable de la pegilación en el tiempo de residencia media para el IL-1ra inyectado de forma subcutánea. Según aumenta el tamaño del PEG, aumenta generalmente el tiempo medio de residencia. Este incremento es probablemente el resultado de una absorción más lenta a través de la circulación linfática relacionada con el tamaño de la molécula (mayor tiempo medio de absorción) así como de una eliminación retrasada después de que la molécula pegilada alcance la circulación sistémica (plasma). Esta prolongación es notable y mejorará el carácter farmacocinético del IL-1ra subcutáneo en humanos.

TABLA 2

	Natural	PEG(8500)	PEG(5000)	PEG(8500)	PEG(5000)
			C116	C84 S116	C84 S116
N	4	1	1	1	1
Vd inicial, ml/kg	24	59	38	58	66
Estado estacionario Vd, ml/kg	110	160	150	240	290
Eliminación del plasma, ml/min/kg	7,4	3,1	7,7	3,0	5,0
Fase inicial t1/2, minutos	1,7	12	2,5	10	6,5
Fase intermedia t1/2, minutos	30	60	29	87	82
Fase terminal t1/2, horas	2,0	12	1,9	7,2	5,0
Tiempo medio de residencia, horas	0,25	0,86	0,32	1,4	0,96

Ejemplo X Preparación de muteínas de inhibidor de TNF 30kDa

Se ha sustituido la cisteína por el resto nativo en el extremo amino y en el extremo carboxilo de la proteína así como las tres posiciones de glicosilación (restos 1, 14, 105, 111 y 161 como se ve en la Figura 2). La mutagénesis se realizó en ADN monocatenario de los genes del inhibidor de TNF 30 kDa clonados en el bacteriófago M13. Este gen se describe en detalle en la Solicitud de Patente de Estados Unidos con Número de Serie 07/555.274 presentada el 19 de Julio de 1990. La mutagénesis se realizó como se describe en Kunkel et al. (1987) (véase el Ejemplo V). El gen mutagenizado se aisló y se subclonó en el vector de expresión pT5T (Eisenberg et al., Nature vol. 343, pg. 341 (1989)) y se transformó en la cepa del sistema de expresión T7 E. Coli BL21DE3. Las muteínas de inhibidor de TNF 30kDa se purificaron y se replegaron como se describe para el inhibidor de TNF 30kDa. Véase, la Solicitud de Patente de Estados Unidos con Número de Serie 07/555.274 presentada el 19 de Julio de 1990. El pliegue incluye la adición de cisteína a la solución que contiene la proteína purificada. La cisteína ayuda en el pliegue y "se une" a la cisteína libre en la muteína.

Ejemplo XI Pegilación de muteínas de inhibidor de TNF 30kDa

Se expuso la muteína de inhibidor de TNF 30kDa c105 a un exceso 6 veces molar de DTT en HEPES 50 mM pH 7,0 durante 30 minutos a temperatura ambiente para retirar una cisteína extra acoplada durante el proceso de repliegue. Después, la proteína se dializó contra HEPES 50 mM pH 7,0 desgasificado durante 2 horas para retirar el DTT. Después. el inhibidor de TNF 30kDa c105 se hizo reaccionar con un exceso 5 veces molar de reactivo de pegilación 1 (véase Ejemplo 1A) durante 2 horas a temperatura ambiente en HEPES 50 mM pH 7,0. Se convirtió aproximadamente 60% de la muteína a la forma pegilada.

La mezcla de reacción de la pegilación c105 se cargó en una columna Superdex-75 FPLC (Pharmacia) a 0,25 ml/min en Tris 50 mM pH 7,0, NaCl 100 mM. Las fracciones que contenían el inhibidor de TNF 30kDa c105-PEG se juntaron y se cargaron en una columna HPLC TSK-2000SW (BioRad) a 0,2 ml/min en la misma solución tampón. Las fracciones que contenían inhibidor de TNF 30kDa c105-PEG esencialmente puro, como se determinó mediante SDS-PAGE tintado con plata, se reunieron y se calculó la concentración de proteína mediante el análisis de proteínas Bio-Rad. Véase la Figura 9.

La actividad se determinó usando el análisis de citotoxicidad de TNF célula L929 murina como se describe en la Solicitud de Patente de Estados Unidos con Número de Serie 07/555.274 presentada el 19 de Julio de 1990.

Ejemplo XII La preparación de PEG BIS-Maleimido

La síntesis del derivado del PEG ?-aminopoli(oxietileno) de \alpha-(2-aminoetilo) (de aquí en adelante PEG bisamino) consistió en tres etapas: 1) sulfonación del grupo hidroxilo usando cloruro de tresilo como se describe en Nilson y Mosback (Nilson et al., Methods in Enzymology vol 104, pg 56, Academic Press, Inc., N.Y., N.Y. (1984)), 2) sustitución del intermedio tresilado con ftalimida (Pillai et al., J. Org. Chem. vol. 45, pg. 5364 (1980)), y 3) reducción del intermedio ftalimida a amina con hidrato de hidrazina (Pillai, supra.). Las estructuras del material de partida, intermedios, y productos se muestra en el Apéndice 1 a este Ejemplo. Las condiciones óptimas permitieron una conversión de aproximadamente 80% del hidroxilo a amina como se calcula mediante el análisis de ácido 2,4,6-trinitrobenceno sulfónico (TNBSA). El PEG bisamino puede purificarse con la mezcla de reacción mediante cromatografía de intercambio iónico. Esta es una etapa clave para retirar los subproductos reactivos que pueden interferir con la formación de dímeros.

El PEG bisamino se aciló usando anhídrido maleico (Butler et al., Methods in Enzymology vol. 25, pg.191 Academic Press, Inc. N.Y., N.Y. (1972)) y el intermedio resultante se cicló para producir \alpha-(2-maleimidoetil-?-maleimidopoli(oxietileno) (Winsch et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler vol. 336, pg. 53 (1985)). Este derivado reacciona con sulfhidrilos mediante una adición de Michael para formar un tioéter estable.

Apéndice al ejemplo XII

Material de partida

Fórmula generalizada para el polietilenglicol PEG_{x}

HO--(CH_{2}CH_{2}O)_{n}--H

donde x denota el peso molecular medio del polímero en kilodaltons y n es el número de grupos oxietileno que se repiten.

Intermedio 1

F_{3}--CH_{2}--SO_{2}--O--(CH_{2}CH_{2}O)_{n-1}-- (CH_{2}CH_{2})--O-SO_{2}--CH_{2}--F_{3}

Intermedio 2

10

Intermedio 3

H_{2}N--(CH_{2}CH_{2}O)_{n-1}--(CH_{2}CH_{2})--NH_{2}

Intermedio 4

HOOC--CH=CH--

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

--NH--(CH_{2}CH_{2}O)_{n-1}-- (CH_{2}CH_{2})--NH--

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

-CH=CH-COOH

O-(2-maleimidoetil)-O^{1}-metil-polietilenglicol

12

Ejemplo XIII Resultados in vivo para complejos de PEG de inhibidor de TNF 30kDA C105

Se probaron in vivo los efectos inhibitorios de cuatro especies de inhibidores de TNF 30kDa c105 pegilados in vivo en dos acciones fisiológicas diferentes estimuladas con TNF. Un final fue la aparición de IL-6 en el plasma de ratones que se habían inyectado de forma intravenosa con TNF humano recombinante. El segundo final fue un incremento en la migración de neutrófilos en la cavidad peritoneal después de la administración intraperitoneal de TNF humano recombinante.

Experimento uno

La administración intravenosa de inhibidor de TNF 30kDa c105 (PEG_{\text{2.000}}, PEG_{\text{3.500}}, PEG_{\text{10.000}}) simultánea con TNF humano recombinante inhibe la inducción de IL-1 en el plasma de ratones.

Se usaron ratones hembra BALB/C con un peso de 20 a 23 g para medir la inducción de niveles de IL-6 en el plasma con TNF humano recombinante. En un experimento preliminar, se dibujó el curso de tiempo de la aparición de IL-6 en el plasma después de la administración intravenosa por la vena de la cola de dos dosis de TNF humano recombinante (Figura 12). Ocurrieron dos niveles máximos de IL-6 a las dos horas después de la estimulación con 10 ó 20 \mug de TNF humano recombinante por ratón. La dosis inferior se usó en experimentos posteriores.

Se comparó la potencia del inhibidor de TNF 30kDa c105 PEG_{2000} en forma de pesa con la del inhibidor de TNF 30kDa c105 no pegilada. Se inyectó de forma intravenosa TNF humano recombinante a una dosis de 10 \mug por ratón, sólo o con otros inhibidores de TNF. Se probaron cuatro reacciones diferentes de inhibidores de TNF (Figura 13). Las relaciones se calcularon en base a su contenido proteínico. Se probaron tres ratones para cada dosis. Se extrajo sangre dos horas después de las inyecciones intravenosas. Los niveles de IL-1 se midieron mediante ELISA.

El inhibidor de TNF 30kDa c105 y el inhibidor de TNF 30kDa c105 PEG_{2000} en forma de pesa provocaron una inhibición casi completa de los niveles de IL-6 cuando se administraron en relaciones de 10:1 y 5:1 de inhibidor con TNF. A relaciones de 1:1, el inhibidor de TNF 30kDa c105 PEG_{2000} en forma de pesa causó una reducción del 95% de los niveles de IL-6 estimulado sólo por NTF, mientras que el inhibidor de TNF 30kDa c105 redujo sólo en un 70% el nivel de IL-6. Los resultados de este experimento indican que en las relaciones probadas, el inhibidor TNF 30kDa c105 y el inhibidor de TNF 30kDa c105 PEG_{2000} en forma de pesa eran buenos inhibidores de este parámetro fisiológico estimulado por TNF. A una relación de 1:1, el inhibidor de TNF 30kDa c105 PEG_{2000} en forma de pesa provocó un porcentaje de inhibición mayor que el inhibidor no unido a polietilenglicol.

Se probaron otras dos especies de inhibidor de TNF 30kDa c105. Se probaron los efectos inhibitorios de inhibidor de TNF 30kDa c105 PEG_{3500} en forma de pesa y inhibidor de TNF 30kDa c105 PEG_{\text{10.000}} en forma de pesa en la inducción de IL-6 en plasma. Los inhibidores se administraron mediante inyección intravenosa simultáneamente con TNF humano recombinante en relaciones de 1:1 (inhibidor de TNF en forma de pesa: TNF) (Figura 14). Se probaron tres ratones en cada uno de los dos grupos tratados con inhibidor. Se inyectaron diez ratones sólo con TNF. Cuando se administró en relaciones 1:1, no se detectó IL-6 en el plasma de ratones inyectados con inhibidor de TNF 30kDa c105 PEG_{3500} en forma de pesa o inhibidor de TNF 30kDa c105 PEG_{\text{10.000}} en forma de pesa, aunque si se provocó un respuesta a IL-6 significante en ratones inyectados sólo con TNF humano recombinante.

Los resultados de los dos experimentos muestran que inhibidor de TNF 30kDa c105 PEG_{2000}, PEG_{3500}, PEG_{\text{10.000}}, en forma de pesas son buenos inhibidores de la inducción de IL-6 en plasma con TNF humano recombinante cuando se administra en una relación baja (1:1) en relación al estímulo.

Experimento dos

La administración subcutánea de inhibidor de TNF 30kDa c105 (PEG_{3500}, PEG_{\text{10.000}}, PEG_{\text{20.000}}) simultáneamente con la inyección intraperitoneal de TNF humano recombinante inhibe la migración de neutrófilos en la cavidad peritoneal.

Se usaron ratones hembra BALB/C con un peso de 20 a 23 g para medir la migración de neutrófilos en la cavidad peritoneal después de la estimulación con TNF humano recombinante. La técnica usada es la de Kim McIntyre et al., (J. Exp. Med. vol. 173, pg. 931 (1991)) y se describe brevemente en este documento. A los ratones se les inyecta un volumen de TNF de 0,1 ml directamente en la cavidad peritoneal. Cuatro horas después, los ratones se matan y se realiza un lavado post mortem inmediato de la cavidad peritoneal. Se inyectan 4 ml de Solución Salina Equilibrada de Hank (HBS) (sin calcio ni magnesio) en la cavidad peritoneal. Se masajea suavemente el abdomen. Se recupera el líquido peritoneal aspirando con una aguja y una jeringa. Se cuenta el número total de células en un contador Coulter. Se seca una fracción de la suspensión celular en una superficie inclinada y se tinta con tinte Diff-Kwik. Se realiza un recuento diferencial de las céllas mediante examen microscópico directa. Se examinan cien células y se clasifican como neutrófilos, linfocitos o macrófagos.

En un experimento anterior, se comparó el tipo de células del líquido del lavado después de la administración intraperitoneal de solución salina sin pirógenos o 7,5 ng de TNF humano recombinante. El TNF causó un incremento en el porcentaje de neutrófilos y en el número absoluto de neutrófilos presentes en el líquido del lavado peritoneal. En los ratones tratados con solución salina, se recuperaron 9,4x10^{4} neutrófilos del líquido peritoneal que eran sólo el 2,3% del total de células peritoneales. En ratones tratados con 7,5 ng de TNF, el número total de neutrófilos aumentó a 12,9x10^{5} y el porcentaje de neutrófilos aumentó a 19,7%.

También se comparó la potencia de inhibidor de TNF 30kDa c105 no pegilado con tres especies pegiladas de inhibidor TNF 30kDa c105 (PEG_{3500}, PEG_{\text{10.000}} y PEG_{\text{20.000}} en forma de pesas). Manteniendo el estímulo de TNF constante a 7,5 ng por ratón, los inhibidores se probaron en relaciones de 100:1, 10:1, y 1:1 (especie de inhibidor de TNF 30kDa c105:TNF). Las relaciones se calcularon en base al contenido proteínico. Los ratones se inyectaron de forma subcutánea con el inhibidor de TNF 30kDa c105 simultáneamente con la administración intraperitoneal de TNF. Se probaron seis ratones en cada grupo de dosis. Cuatro horas después, se recogió y se analizó el líquido del lavado peritoneal. Los valores mostrados en la Figura 15 son los porcentajes de neutrófilos en el líquido del lavado peritoneal. La relación más baja a la que el inhibidor de TNF 30kDa c105 no pegilado y el inhibidor de TNF 30kDa c105 PEG_{3500} en forma de pesa inhibieron significativamente la migración de neutrófilos es de 100:1. El inhibidor de TNF 30kDa c105 PEG_{\text{10.000}} y PEG_{2000} en forma de pesas inhibieron significativamente la migración de neutrófilos a una relación de 10:1.

Los resultados de este experimento muestran que los inhibidores de TNF 30kDa PEG_{3500}, PEG_{\text{10.000}} y PEG_{\text{20.000}}, son buenos inhibidores de la migración de los neutrófilos a la cavidad peritoneal estimulada por el TNF. Los inhibidores de TNF 30kDa c105 PEG_{\text{10.000}} y PEG_{\text{20.000}} en forma de pesas fueron más potentes que el inhibidor de TNF 30kDa c105 no pegilado y el inhibidor de TNF 30kDa c105 PEG_{3500}.

Ejemplo XIV Preparación y bioactividad de inhibidor de TNF 30kDa c105 PEG DB

Síntesis

Se trata inhibidor de TNF 30kDa c105 recombinante 2-3 mg/ml con un exceso 4 veces molar de DTT durante 2 horas a temperatura ambiente. Después, el inhibidor de TNF se dializa frente a HEPES 50 mM desgasificado, pH 7,0, durante 3 horas a 4ºC. Para crear el compuesto en forma de pesa unido con PEG, el inhibidor de TNF se hace reaccionar con diferentes relaciones molares del PEG bis-maleimido en HEPES 50 mM pH 7,0. El inhibidor TNF se hace reaccionar con una relación equimolar de PEG bis-maleimido. Las reacciones se incuban durante 3-12 horas a temperatura ambiente. Después de la incubación, el compuesto en forma de pesa de inhibidor de TNF unido con PEG se purifica de inhibidor de TNF no pegilado o pegilado de forma sencilla usando MONO-S FPLC en HOAc 50 mM, pH 4,0, usando un gradiente por etapas de 260 mM, 310 mM, y 350 mM de NaCl. La forma de pesa del inhibidor de TNF unido con PEG eluye en la etapa de NaCl 310 mM. Se retira cualquier resto de inhibidor de TNF no pegilado mediante cromatografía en una Superdex 75.

Adición del reactivo por etapas

Después del tratamiento con DTT y diálisis en HEPES 50 mM, pH 7,0, se añade una cantidad equimolar de PEG bis-maleimido, y se añade otra cantidad equimolar después de 1,5 de incubación. Esto se incuba durante 1,5 horas. Esto lleva a una nivel optimizado de formación de la forma de pesa unida con PEG. Después, se añade un exceso doble de reactivo PEG, dando una relación final de PEG-inhibidor TNF de 4:1. Esto se incuba durante 2 horas y la mezcla se dializa en acetato 50 mM, pH 4,0 para cromatografía Mono-S. Esto produce una mezcla que es en su mayoría dímero unido con PEG e inhibidor de TNF pegilado de forma sencilla. Esto permite una purificación más eficaz de la forma de pesa con PEG ya que hay una mayor separación entre inhibidor de TNF pegilado de forma sencilla y la forma de pesa que entre la forma de pesa y el inhibidor de TNF no pegilado.

Este procedimiento optimizó la formación de la forma de pesa, y permitió una purificación más eficaz.

Reacción de etapa

Después del tratamiento con DTT y diálisis en HEPES 50 mM pH 7,0 se añade un exceso 8 veces molar de PEG bis-maleimido. Esto se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente. Se convierte esencialmente todo el inhibidor de TNF a la forma pegilada de forma sencilla. Se separa el inhibidor de TNF pegilado de forma sencilla del reactivo PEG y cualquier resto no reaccionado de inhibidor de TNF usando HPLC MONO-S en acetato 50 mM pH 4,0 con un gradiente de NaCl. El material pegilado de forma simple se diafiltra en HEPES 50 mM, pH 7,0 y se concentra a 2-4 mg/ml. Después, se añade inhibidor de TNF tratado con DTT para permitir la formación de la forma de pesa unido a PEG. Después de 2 horas, la forma de pesa unida a PEG se purifica usando HPLC Mono-Este método puede usarse para formar un hetero en forma de pesas unido a PEG añadiendo un segundo compuesto proteínico distinto.

Este procedimiento optimiza la formación de la forma de pesa y puede usarse para la formación de compuestos de hetero en forma de pesas. Sin embargo, este procedimiento es laborioso y largo.

Bioactividad de formas de pesas de inhibidor de TNF unidos a PEG

Se midió la capacidad de la forma de pesa del inhibidor de TNF 30kDa c105 para inhibir la citotoxicidad de TNF\alpha en el análisis de citotoxicidad celular de murina L929. Esto ha permitido el cálculo de un ED_{50} para estas moléculas.

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Inhibidor de rTNF natural \+ 220 ng/ml\cr  Formas de pesa unidas a
BMH \+ 220 ng/ml\cr  Formas de pesa -PEG PM 1900 \+ 4,1 ng/ml\cr 
Formas de pesa -PEG PM 3500 \+ 4,8 ng/ml\cr  Formas de pesa -PEG PM
10.000 \+ 4,6 ng/ml\cr  Formas de pesa -PEG PM 20.000 \+ 4,2
ng/ml\cr}

Las formas de pesa de inhibidores de TNF también tienen una mayor actividad en la inhibición de la citotoxicidad de TNF\beta en el bioanálisis L929. Los valores ED_{50} contra TNF\beta son los que se indican a continuación:

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Inhibidor de rTNF natural \+ 70  \mu g/ml\cr  Formas de
pesa-PEG PM 3400 \+ 80 ng/ml\cr  Formas de
pesa-PEG PM 20.000 \+ 22
ng/ml\cr}

Ejemplo XV Farmacocinética del inhibidor de TNF 30kDa pegilado 1. Farmacocinética intravenosa del inhibidor de TNF 30kDa pegilado

Se determinó el carácter farmacocinético de varias moléculas de inhibidor de TNF 30kDa pegilado después de la administración intravenosa de las moléculas a ratas. Se inyectó inhibidor de TNF nativo o pegilado en forma de dosis bolo intravenosa. Se tomaron muestras de sangre de la cola de la vena y se analizaron para inhibidor de TNF no pegilado o pegilado mediante análisis inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Las concentraciones de inhibidor de TNF en plasma intravenoso frente a perfiles de tiempo (Figura 16) indican que la pegilación tiene una influencia notable en la desaparición de inhibidor de TNF del plasma después de la inyección intravenosa. Se usó la teoría del momento estadístico (el área bajo la curva [AUC] y el área bajo la curva del primer momento [AUMC]) para interpretar los datos de la Figura 16. Los datos indican que la pegilación prolonga el tiempo medio de residencia intravenosa del inhibidor de TNF en las ratas hasta 50 veces (Tabla 4). El tiempo medio de residencia aumenta según aumenta el tamaño de la molécula PEG acoplada (Tabla 4). Aunque no limitado por la teoría, la prolongación de los tiempos medios de residencia pueden explicarse en base a la teoría farmacocinética convencional que afirma que el tiempo medio de residencia para un medicamento está inversamente relacionado con la eliminación del plasma del medicamento y directamente relacionado con el volumen aparente de distribución del medicamento.

El análisis farmacocinético de la desaparición del inhibidor de TNF pegilado del plasma indica que la prolongación de la vida media está inversamente relacionada con una menor eliminación de las moléculas pegiladas, en comparación con el inhibidor de TNF no pegilado (Tabla 4). La reducción en la eliminación del plasma es consistente con una reducción relacionada con el tamaño anticipada en la filtración glomerular de las moléculas pegiladas en los. Debido a la probable similitud cualitativa entre ratas y humanos en los mecanismos de eliminación del plasma del inhibidor de TNF, es evidente que la pegilación mejorará de forma similar las propiedades farmacocinéticas del inhibidor de TNF en humanos.

2. Farmacocinética subcutánea del Inhibidor de TNF 30kDa pegilado

Se ha caracterizado la absorción farmacocinética de las muteínas de Inhibidor de TNF pegiladas después de la inyección subcutánea de las moléculas en ratas. Se recogieron varias muestras de sangre de la vena de la cola y se hicieron análisis de inhibidor de TNF pegilado o no pegilado. En la figura 17 se muestra un gráfico de las concentraciones de inhibidor de TNF frente a tiempo. Los datos de farmacocinética subcutánea (Tabla 4) revelan una disponibilidad sistémica variable de las moléculas pegiladas, relacionada con la posición y el tamaño del PEG, y relacionada con la inyección subcutánea en formulaciones no optimizadas. La Tabla 4 también muestra una influencia positiva notable de la pegilación en el tiempo medio de residencia para el inhibidor de TNF inyectado de forma subcutánea. Según aumenta el tamaño del PEG, aumenta generalmente el tiempo medio de residencia. Este incremento es probablemente el resultado de una absorción más lenta a través de la circulación linfática relacionada con el tamaño de la molécula (mayor tiempo medio de absorción) así como de una eliminación retrasada después de que la molécula pegilada alcanza el plasma. Esta prolongación es notable y mejorará el carácter farmacocinético del Inhibidor de TNF subcutáneo en humanos.

Ejemplo XVI Solubilidad de proteínas pegiladas IL-1ra

Se muestran los resultados de un estudio de solubilidad en la Figura 18. Se muestran las curvas de solubilidad para tres preparaciones diferentes de IL-1ra y IL-1ra c84 PEG_{8500}. Los experimentos se realizaron a 37 ºC en una placa de microvaloración con todas las proteínas a 160 mg/ml. La placa se cerro herméticamente con una tapa y se leyó en un lector de placas a 405 nm en varios instantes de tiempo. Un incremento en la absorbencia en una indicación de precipitación de la proteína. Hay claramente una reducción en la cantidad de proteína que sale de la solución para la muestra pegilada en relación con el IL-1ra nativo.

Inhibidor de TNF 30kDa

El inhibidor de TNF 30kDa no puede concentrarse más de 5 mg/ml. Después de la pegilación, la solubilidad aumentó al menos 5 veces.

Ejemplo XVII Preparación de hetero con forma de pesas de inhibidor de IL-2

Puede formarse un hetero en forma de pesas unido a PEG pegilando primero IL-2r\alpha en presencia de un exceso de PEG bis-maleimido. El IL-2r\alpha pegilado simple puede purificarse y se puede añadir IL-2r\beta para reaccionar con el grupo maleimido reactivo restante para formar el heterodímero.

Las posiciones potenciales para la pegilación de IL-2r\alpha incluyen los restos terminales amino y carboxilo, las dos posiciones N-unidas de glicosilación, asó como el resto cisteína nativo libre en la molécula. Se ha identificado que el resto cisteína 192 en el dominio soluble extracelular de IL-2r\alpha no está implicado en los enlaces disulfuro. (Miedel et al., BBRC, vol. 154, pg. 372 (1988)). Este resto cisteína está en un epítopo de un anticuerpo monoclonal anti-IL-2r\alpha que no afecta el enlace IL-2 al IL-2r\alpha (Lorenzo et al., J. Immunology, vol. 147, pg. 2970 (1991)). Esto indica que este resto es un candidato probable para la pegilación sin afectar la actividad del IL-2r\alpha.

Para el IL-2r\beta, las posiciones potenciales incluyen los extremos amino y carboxilo, las 4 posiciones N-unidas de glicosilación y una región (a.a. #108-118) que es similar a una región de importancia biológica en el receptor de murina eritropoyetina (Yoshimura, Longmore y Lodish, Nature, vol. 348, pg. 647 (1990)). El análisis mutacional de otros restos en los receptores puede permitir identificar otras posiciones de pegilación que producen propiedades óptimas en la molécula hetero en forma de pesas.

Ejemplo XVIII Preparación de hetero en forma de pesas que inhiben el camino clásico de un sistema de complemento

Se han identificado y clonado muchas proteínas que regulan el sistema complemento. Algunas de ellas son proteínas de membrana. Una de las proteínas de membrana se llama CR1 (receptor de complemento 1). Se ha examinado la forma soluble de CR1 en modelos in vivo de enfermedades. El inhibidor de complemento inhibe la inflamación post-isquémica del miocardio y la necrosis (Weisman et al., Science, vol. 149, pg. 145-151, 1990), reacción de artus inversa (Yet et al. J. Immunology, vol. 146, pg. 250-256 (1991)) y el rechazo aloinjerto (Pruitt et al. J. Surgical Research, vol. 50, páginas. 350-355 (1991)).

La CR1 se une a C3b y C4b. Consiste en 30 secuencias cortas consenso (SCR) que se repiten. La mayoría de las SCR contiene una posición de glicosilación posible y cuatro cisteínas. Es probable que todas las cisteínas estén implicadas en los enlaces disulfuro. Se ha encontrado que las SCR 1-4 están implicadas en la unión a C4b. Dos partes separadas de CR1, SCR 8-11 y SCR 16-18, está implicadas en la unión con C3b (Klickstein et al. J. Exp. Med., vol. 168, páginas. 1699-1717 (1988); Kalli et al. J. Exp. Med. vol. 174, páginas. 1451-1460 (1991). De acuerdo con esta invención, es posible producir un hetero en forma de pesas que contiene el dominio de enlace C4b y el dominio de enlace C3b de CR1.

Las SCR que contienen los dominios de unión C4b y C3b serán las SCR de 1 a 5 (unión C4b) y las SCR de 8 a 12 (unión C3b). Los genes que codifican estas SCR pueden clonarse en un vector de expresión E. Coli. Las proteínas expresadas en E. Coli pueden replegarse y purificarse. El éxito del pliegue puede analizarse por la capacidad de unirse a poliC3b o poliC4b. Puede realizarse la mutagénesis in vitro de estos genes para sustituir los restos aminoácidos nativos con cisteína. Estas cisteínas pueden usarse para unir la molécula PEG. Las posiciones posibles para la pegilación serán la posición de glicosilación o el resto carboxilo terminal de la SCR 5 y 12. Los dominios de unión C4b y C3b que contienen una cisteína extra al resto carboxilo terminal podrían construirse y usarse para la unión de la molécula PEG. El hetero en forma de pesas unido a PEG puede producirse mediante el proceso de dos etapas del Ejemplo XIV. La purificación puede realizarse mediante cromatografía de intercambio iónico.

Ejemplo XIX Síntesis de un hetero en forma de pesas PPEG IL-1ra BIS-Maleimida - Péptido de factor de crecimiento derivado de plaqueta

El péptido del factor de crecimiento derivado de la plaqueta (PDGF) YGRPRESGKKRKRKRLKPT se describe en Khachigian, L. et al. J. Biol. Chem, vol. 267, `g. 1660-1666 (19919: Se añadió una C terminal para permitir el acoplamiento a la maleimida.

El hetero en forma de pesas se sintetizó en dos etapas. En la primera etapa, se mezclaron 1,6 nanomoles de IL-1ra suspendidos en 3 \mul de solución tampón HEPES 0,05 M, pH 7,5, con 6,4 nanomoles de PEG_{1900} bis-maleimido disueltos en 11 \mul de la misma solución tampón. Este reacción se realizó durante 30 minutos a 20ºC. En la segunda etapa, se añadieron 32 nanomoles del péptido PDGF disuelto en 3 \mul de solución tampón de fosfato sódico 0,2 M, pH 7,0 a los productos de la primera reacción. La reacción se dejó progresar durante 1 hora a 20ºC. Después la reacción se terminó con la adición de un volumen igual de una muestra de solución tampón SDS-PAGE que contenía 30 \mumoles de 2-mercaptoetanol.

Se separaron muestras de los productos de la primera etapa de la reacción y los productos de la reacción de dos etapas completa, asó como marcadores de peso molecular apropiado, mediante SDS-PAGE en gel de poliacrilamida al 15% que se había tintado con azul de Coomasie. La reacción de dos etapas dio una banda adicional consistente con el tamaño predecid del hetero en forma de pesas. Mediante la reacción de dos etapas se convirtió aproximadamente el 33% del IL-1ra de partida en el hetero en forma de pesas.

Los productos de la primera etapa de la reacción pueden aislarse mediante cromatografía de intercambio catiónico en la resina S-Sepharose. El heterodímero puede aislarse por cromatografía de intercambio catiónico debido a la abundancia de aminoácidos básicos en el péptido.

100

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Claims

1. Un compuesto de fórmula R_{1}-X-R_{2} donde:

uno o los dos de R_{1} y R_{2} son un inhibidor del factor de necrosis tumoral (TNF), un inhibidor de interleuquina-1 (IL-1), un receptor IL-2 o CR1, o R_{1} es una muteína cisteína de IL-1ra y R_{2} es hidrógeno; y

X es un espaciador polimérico no peptídico

donde R_{1} y/o R_{2} están unidos covalentemente a dicho espaciador polimérico no peptídico.

2. El compuesto de la reivindicación 1, donde uno o los dos de R_{1} y R_{2} se seleccionan entre los siguientes:

un inhibidor de IL-1 seleccionado entre un antagonista del receptor IL-1 o una truncación o un muteína del

\hbox{mismo; o}

un inhibidor de TNF seleccionado entre un inhibidor de TNF de 30kDa o una truncación o una muteína del mismo, o entre un inhibidor de TNF de 40kDa o una truncación o una muteína del mismo.

3. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que uno cualquiera o los dos de R_{1} y R_{2} contienen de forma natural un resto de cisteína o se han modificado para contener al menos un resto de cisteína no nativo.

4. El compuesto de la reivindicación 3 en el que uno cualquiera o los dos de R_{1} y R_{2} se seleccionan entre:

un antagonista del receptor de IL-1, y dicho resto de cisteína no nativo se encuentra en la posición del resto aminoacídico 0, 6, 8, 9, 84, ó 141; o

un inhibidor de TNF de 30kDa o una truncación del mismo, y dicho resto de cisteína no nativo se encuentra en la posición del resto aminoacídico 1, 14, 105, 111, ó 161.

5. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde uno o los dos de R_{1} y R_{2} son antagonistas del receptor de IL-1 que llevan el resto 116 de cisteína producido de forma natural que está unido covalentemente a un espaciador polimérico no peptídico.

6. El compuesto de la cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde cada uno de R_{1} y R_{2} está unido covalentemente a dicho espaciador polimérico no peptídico mediante un enlace tio-éter.

7. El compuesto de la cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde cada uno de R_{1} y R_{2} se une a dicho espaciador peptídico no polimérico mediante un resto cisteína nativo o no nativo.

8. El compuesto de la cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde:

R_{1} y R_{2} son inhibidores del factor de necrosis tumoral de 30 kDa o una truncación del mismo, donde dicho inhibidor de TNF tiene una cisteína no nativa en la posición del resto aminoacídico 105, y

X se define como -Y_{1}-(Z)_{n}-Y_{2}-, donde Y_{1} e Y_{2} representan el resto de los grupos de activación y (Z)_{n} representa polietilenglicol, donde cada uno de R_{1} y R_{2} están unidos covalentemente a X mediante un enlace tio-éter, y donde n es mayor que 6.

9. El compuesto de la cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde X se define como -Y_{1}-(Z)_{n}-Y_{2}, donde Y_{1} e Y_{2} representan el resto de grupos de activación y (Z)_{n} representa el grupo base polimérico, donde (Z)_{n} se selecciona entre polietilenglicol, polipropilenglicol, glicerol polioxietilado, dextrano, ácidos colónicos, aminoácidos poli \beta, o polímeros de carbohidratos.

10. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz del compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en un vehículo farmacológicamente aceptable.

11. Un método para la preparación de un compuesto de acuerdo con la fórmula de la reivindicación 1 donde:

uno o los dos de R_{1} y R_{2} se seleccionan entre un inhibidor del factor de necrosis tumoral (TNF), preferiblemente un inhibidor de TNF de 30 kDa o una truncación o muteína del mismo, un inhibidor de TNF de 40 kDa o una truncación o muteína del mismo, o un inhibidor de IL, preferiblemente IL-1ra o una truncación o una muteína del mismo, que preferiblemente contiene de forma natural o se ha modificado para contener una cisteína reactiva; y

X es un espaciador polimérico no peptídico que se define como -Y_{1}-(Z)_{n}-Y_{2}, donde Y_{1} e Y_{2} representan el resto de grupos de activación y (Z)_{n} representa el grupo base polimérico, donde (Z)_{n} se selecciona entre polietilenglicol, polipropilenglicol, glicerol polioxietilado, dextrano, ácidos colónicos, aminoácidos poli \beta, o polímeros de carbohidratos,

donde R_{1} y R_{2} están unidos covalentemente a dicho espaciador polimérico no peptídico, constando dicho método de:

hacer reaccionar R_{1} y R_{2} con X para formar enlaces tio-éter entre X y los restos aminoácidicos de cisteína para formar dicho compuesto R_{1}-X-R_{2} y aislar opcionalmente dicho compuesto R_{1}-X-R_{2}; o

hacer reaccionar R_{1} con X para formar enlaces tio-éter entre X y los restos aminoacídicos de cisteína para formar un complejo R_{1}-X; hacer reaccionar el complejo R_{1}-X con R_{2} para formar dicho compuesto R_{1}-X-R_{2}; y aislar opcionalmente dicho compuesto R_{1}-X-R_{2}.

12. Una muteína de un polipéptido, modificada para contener al menos un resto de cisteína no nativo, donde dicho polipéptido se selecciona entre: el antagonista del receptor IL-1, y dicho resto de cisteína no nativo se encuentra preferiblemente en la posición del resto aminoacídico 0, 6, 8, 9, 84, ó 141 y la cisteína en la posición 116 se reemplaza con otro aminoácido; o

un inhibidor de TNF de 30kDa o una truncación del mismo, y dicho resto de cisteína no nativo se encuentra preferiblemente en la posición del resto aminoacídico 1, 14, 105, 111, ó 16; y

donde dicha cisteína no nativa de dicha muteína esta unida opcionalmente de forma covalente a un espaciador polimérico no peptídico definido como -Y_{1}-(Z)_{n}-Y_{2}, donde Y_{1} e Y_{2} representan el resto de grupos de activación y (Z)_{n} representa el grupo polimérico base, donde (Z)_{n} se selecciona entre polietilenglicol, polipropilenglicol, glicerol polioxietilado, dextrano, ácidos colónicos, aminoácidos poli \beta, o polímeros de carbohidratos.

13. Un método para la preparación de una muteína de un polipéptido, que comprende:

alterar la codificación del gen de dicho polipéptido mediante mutagénesis de localización dirigida para crear una codificación genética para una muteína de dicho polipéptido que contiene al menos un resto de cisteína no nativa;

expresar dichos genes alterados en un sistema de expresión bacteriana; purificar dicha muteína expresada;

replegar dicha muteína en presencia de un compuesto que contiene sulfhidrilo;

reducir dicha muteína replegada con un agente reductor suave para liberar dicha cisteína no nativa; y

hacer reaccionar dicha muteína con un grupo no peptídico polimérico que contiene un grupo activador que es específico del sulfhidrilo.

14. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso como medicamento.

15. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad mediada por TNF- y/o IL-1

16. El uso de un compuesto de la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre Síndrome de Insuficiencia Respitaroria en Adultos, Fibrosis Pulmonar, Artritis Reumatoide, Enfermedad Inflamatoria del Intestinol, y Choque Séptico.