ES2206750T3 - Procedimiento de identificacion de agentes farmaceuticos a partir de extractos vegetales. - Google Patents

Procedimiento de identificacion de agentes farmaceuticos a partir de extractos vegetales.

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ES2206750T3 ES97945607T ES97945607T ES2206750T3 ES 2206750 T3 ES2206750 T3 ES 2206750T3 ES 97945607 T ES97945607 T ES 97945607T ES 97945607 T ES97945607 T ES 97945607T ES 2206750 T3 ES2206750 T3 ES 2206750T3
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BEAUFOUR ANNE GILBERTE MARIE
BEAUFOUR HENRI PIERRE ALBERT M
BEAUFOUR HENRI PIERRE ALBERT MARIE
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BEAUFOUR HENRI PIERRE ALBERT MARIE
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACION DE UN AGENTE FARMACEUTICO QUE INCLUYE UNOS COMPUESTOS ENCONTRADOS EN UN EXTRACTO DE PLANTA, EFECTUANDOSE ESTE PROCEDIMIENTO POR UN RASTREO GENOMICO DEL EXTRACTO DE PLANTA.

Description

Procedimiento de identificación de agentes farmacéuticos a partir de extractos vegetales.
Antecedentes de la invención
Los reinos microbiano, vegetal y animal (por ejemplo, invertebrados) constituyen ricos depósitos naturales de ingredientes activos con propiedades fisicoquímicas y medicinales variadas. Las farmacopeas estadounidense y europea están llenas de ejemplos de medicamentos derivados de fuentes naturales. Véase U.S. Pharmacopeia 1995 (United States Pharmacopeial Convention, Inc., 1994) y Martindale, The Extra Pharmacopeia 31 (Royal Pharmaceutical Society, 1996). Muchos agentes antimicrobianos (por ejemplo, penicilinas, cefalosporinas y aminoglicósidos), antifúngicos (por ejemplo, anfotericina B y nistatina), antiparasitarios (por ejemplo, quinina), agentes cardio y vasoactivos (por ejemplo, glucósidos digitálicos cardiacos, alcaloides del ergot, nicotina y oxitocina), agentes antiinflamatorios (por ejemplo, aspirina), muscarínicos (por ejemplo, acetilcolina) y antimuscarínicos (por ejemplo, atropina y escopolamina), agentes neuroactivos (por ejemplo, curare, fisostigmina y opiáceos), anticoagulantes (por ejemplo, heparina), agentes antineoplásicos (por ejemplo, alcaloides de la vinca, taxol y el derivado de la podofilotoxina, etopósido) y hormonas (por ejemplo, estrógenos, andrógenos, progestinas, hormonas peptídicas y factores de crecimiento) se descubrieron como productos naturales. Véase, por ejemplo, Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics (9ª Edición, McGraw-Hill, 1996). Estos ejemplos sugieren que algunos de los componentes activos presentes en los extractos vegetales pueden, además, purificarse y seguir manteniendo su potencial biológico.
En la mayoría de los ejemplos anteriores, las propiedades etnofarmacológicas sobresalientes del compuesto se caracterizaron en sistemas farmacológicos conocidos y se ensayaron solamente sobre el aislamiento del compuesto a partir de la fuente natural. Véase, por ejemplo, Turner, R.A. Screening Methods in Pharmacology (Academic Press, 1965) y Turner, R.A., Peter Hebborn Screening Methods in Pharmacology, (Vol. II, Academic Press, 1971). Mientras que los procedimientos que determinan o corroboran las actividades de los extractos de plantas pueden descubrirse a partir de la investigación de sus componentes individuales; muchos de estos extractos pueden también tener actividades farmacológicas que puedan no manifestarse, si las hubiera, en los antecedentes etnofarmacológicos de los componentes individuales ya conocidos del extracto (por ejemplo, la capacidad de los extractos para afectar a la transducción de señales al núcleo, alterar el tráfico de los receptores de superficie celular y regular sucesos genómicos).
La caracterización de los compuestos naturales activos definidos, ya sean derivados de fuentes naturales o producidos sintéticamente o semi-sintéticamente, constituye la base farmacológica para gran parte de la medicina occidental. El procedimiento de destilación de un extracto vegetal etnofarmacológicamente activo genera un único principio activo, aunque, puede dar como resultado la pérdida de su actividad biológica por varias razones (por ejemplo, un compuesto determinado es inestable durante la extracción o en su forma purificada, el compuesto puede reaccionar con entidades químicas en el extracto durante la purificación, el compuesto se fracciona durante la purificación o, más importante, la base fundamental para la etnofarmacología no reside siempre en un único compuesto activo que esté presente en el extracto sino que es más un resultado de la interacción de dos o más compuestos activos hallados en el extracto). Por lo tanto, la probabilidad de que más de un compuesto activo presente en un extracto vegetal podría contribuir a una respuesta farmacológica neta del extracto, así como a medios genómicos para identificar tales compuestos en un producto natural, es un concepto farmacológico novedoso.
La presente invención proporciona un análisis genómico a través del cual puede caracterizarse un extracto de una planta por sus propiedades biológicas potenciales que pueden estar relacionadas o no, si las hubiera, con las propiedades etnofarmacológicas del extracto ya conocidas. La presente invención representa una aproximación novedosa al análisis del (de los) mecanismo(s) potencial(es) de acción de los extractos vegetales, como la base subyacente para la eficacia terapéutica, y un medio para la identificación de compuestos particulares que muestren la propiedad biológica descubierta con el fin de identificar un nuevo agente farmacéutico o el nuevo uso farmacéutico de un agente farmacéutico existente.
Resumen de la invención
En uno de sus aspectos, la invención caracteriza un procedimiento para identificar un agente farmacéutico, comprendiendo el procedimiento las etapas de: administración de un extracto vegetal a un tipo celular; aislamiento de la proteína o del ARN (por ejemplo, ARN mensajero) a partir del tipo celular tratado con el extracto vegetal; identificación de qué proteína o ARN aislado a partir del tipo celular tratado con el extracto vegetal, no está presente en la misma concentración en el tipo celular sin tratar (por ejemplo, una proteína o ARN que está regulado a la alta, o regulado a la baja, o activado, o silenciado en el tipo celular por el extracto vegetal); administración del(de los) compuesto(s) al tipo celular, en la que el(los) compuesto(s) se halla(n) en el extracto vegetal; aislamiento de la proteína o del ARN a partir del tipo celular tratado con el(los) compuesto(s); e identificación de qué compuesto(s) produce(n) también la expresión o supresión de la proteína o del ARN que no está presente en la misma concentración en el tipo celular sin tratar.
Se entiende por "extracto vegetal" una colección de diferentes compuestos naturales que se aíslan de una planta (por ejemplo, de las hojas, corteza, frutos, flores, semillas o raíces). Un ejemplo de tales extractos es un extracto del árbol ginkgo biloba. Se entiende por "tipo celular" cualquier célula aislada (por ejemplo, derivada de un organismo tal como un humano o un animal) o células contenidas en un tejido o en un órgano de un organismo. El tipo celular puede ser una célula normal o una célula enferma (por ejemplo, una células que es patológica o fisiológicamente diferente de su tipo celular normal, tal como una célula tumoral).
El extracto vegetal y el(los) compuesto(s) puede(n) administrarse al tipo celular bien sea in vitro o in vivo (por ejemplo, a un animal intacto del que, posteriormente, deriva el tipo celular tras el tratamiento con el extracto vegetal o el(los) compuesto(s)): Cuando se administra in vitro, la proteína o el ARN, por ejemplo, pueden aislarse inmediatamente después o hasta un día después de la administración del extracto vegetal y el(los) compuesto(s). Cuando se administra in vivo, la proteína o el ARN, por ejemplo, pueden aislarse inmediatamente después o hasta un día después de la administración del extracto vegetal o de los compuestos al animal. La proteína puede permanecer dentro del tipo celular o secretarse fuera del tipo celular. Ejemplos de tales proteínas incluyen receptores, factores de crecimiento, enzimas o factores de transcripción.
En otro de sus aspectos, la invención caracteriza un procedimiento para determinar la respuesta genómica de un tipo celular a un extracto vegetal, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
administración del extracto vegetal al tipo celular;
aislamiento de la proteína o del ARN (por ejemplo, ARN mensajero) del tipo celular tratado con el extracto vegetal; y comparación de la proteína o del ARN aislado del tipo celular tratado con el extracto vegetal con la proteína o el ARN aislado del tipo celular sin tratar.
En una de las formas de realización, el procedimiento comprende, además, la etapa de identificación de qué proteína o ARN aislado del tipo celular tratado con el extracto vegetal no está presente en la misma concentración en el tipo celular sin tratar. En una forma más de realización, el procedimiento comprende, además, la secuenciación de la proteína, del ARN o de la proteína codificada por el ARN, identificados a partir del tipo celular tratado con el extracto vegetal, que no está presente en la misma concentración en el tipo celular sin tratar. En otra forma más de realización, el procedimiento comprende, además, la identificación del gen que codifica para la proteína o el ARN identificados a partir del tipo celular tratado con el extracto vegetal, que no está presente en la misma concentración en el tipo celular sin tratar.
En otra forma de realización, el tipo celular se asocia con una diana biológica conocida (por ejemplo, sitio de activación) del extracto vegetal. Por ejemplo, si se sabe que el extracto vegetal sirve para tratar asma, cáncer, circulación o alteraciones neurológicas, entonces el tipo celular usado deriva de pulmón y así, respectivamente.
En la descripción detallada de la invención y en las reivindicaciones se aclararán otras características y ventajas de la presente invención.
Descripción detallada de la invención
Se cree que un experto en la técnica puede, basándose en la descripción de la presente invención, utilizar la presente invención en su máxima extensión. Las formas de realización específicas están, por lo tanto, para que se interpreten como meramente ilustrativas y no limitantes de las demás descripciones de ninguna manera en absoluto.
A menos que se defina de otra forma, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente invención tienen el mismo significado que comúnmente entiende cualquier experto en la técnica a la que pertenece esta invención.
Extractos vegetales y sus compuestos particulares
Los extractos vegetales pueden prepararse mediante técnicas químicas de extracción estándar (por ejemplo, usando agua para extraer los compuestos hidrosolubles, alcoholes y acetona para extraer los compuestos liposolubles, o mezclas de éstos). El extracto puede entonces purificarse para reducir el número de compuestos en el extracto o, incluso, aislar un compuesto único o una clase de compuestos usando técnicas estándar tales como la cromatografía y la cristalización. Véase, por ejemplo, Ginkgolides - Chemistry, Biology, Pharmacology and Clinical Perspectives, editado por P. Braquet (J.R. Prous Editores de Ciencia, Barcelona, España, 1988); Okabe, J.Chem. Soc. (c) pág.2201; y Nakauishi, Pure & Applied Chemistry 19:89 (1967).
Identificación de sucesos genómicos mediante el aislamiento de proteína
Los tipos celulares diana, en cultivo, se recogen antes y después de la exposición a una serie de concentraciones de un extracto vegetal (por ejemplo, un extracto de ginkgo biloba). El procedimiento puede aplicarse de manera similar a las células de un tejido u órgano diana de un organismo que ha sido expuesto a una dosis, o a múltiples dosis, del extracto vegetal. Las células se lisan y las proteínas se solubilizan en tampones con detergentes (por ejemplo, Tween 20^{TM}, SDS^{TM} o NP-40^{TM} disponibles en Sigma Chemicals, St. Louis, MO). Las proteínas se separan en geles de electroforesis bidimensionales, con enfoque isoeléctrico en la primera dimensión y un gel en gradiente de electroforesis en la segunda dimensión. Véase, por ejemplo, Ausubel, A.M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, pág. 10.3.1-10.4.5 (John Wiley & Sons, 1987). Este es un procedimiento muy potente para examinar mezclas complejas de proteínas (por ejemplo, en un único gel 2-D pueden resolverse hasta 1500 proteínas). Véase, por ejemplo, O'Farrell, P.H., J. Biol. Chem. 250:4007-4021 (1975).
El patrón de expresión de proteínas puede visualizarse mediante tinción con Azul de Coomasie (Ausubel, A.M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, pág. 10.6.1 (John Wiley & Sons, 1987)) o con tinción de plata (Ausubel A.M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, pág. 10.6.1-10.6.3 (John Wiley & Sons, 1987)). Las células pueden pulsarse, además, con aminoácidos marcados radiactivamente, por ejemplo, la Metionina-S^{35} (Amershaw Corp., Arlington Heights, IL) se añade al medio de incubación y el patrón de proteína fosforilada en los geles 2-D puede entonces visualizarse mediante autorradiografía. Véase, por ejemplo, Hansen, K. y col., Electrophoresis 14: 112-116 (1993); y Guy, R., Electrophoresis 15: 417-440 (1994). En el último caso, la expresión de la proteína sin marcar puede visualizarse usando anticuerpos contra fosfotirosina o fosfoserina después de la transferencia de los geles a nitrocelulosa. Véase, por ejemplo, Ausubel, A.M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, pág. 10.7.1-10.8.6 (John Wiley & Sons, 1987).
Los sucesos genómicos específicos se detectan mediante la comparación del patrón de expresión de proteínas en células antes y después de la exposición al extracto vegetal. Los puntos específicos de proteína en los geles 2-D que muestran una intensificación o una reducción en la expresión, como se evidencia por la intensidad de la tinción del mapa de proteínas, representan cambios en la actividad genómica inducidos por componentes del extracto vegetal. El procedimiento es enormemente reproducible y puede proporcionar un medio para recoger pequeñas cantidades de proteínas extremadamente puras para el análisis de la secuencia de aminoácidos usando técnicas estándar (es decir, la degradación química amino-terminal de Edman). Véase, por ejemplo, Graven y col., J. Biol. Chem. 269:24446 (1994).
Para proteínas que se expresan en baja cantidad con las que no se puede obtener suficiente material para la secuenciación peptídica, los puntos de proteínas pueden escindirse del gel 2-D y usarse directamente para la inmunización de conejos para la producción de anticuerpos. Véase Harlow, E. & Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, pág. 61. La disponibilidad de un anticuerpo permite la purificación de grandes cantidades de la proteína adecuada para la identificación de la secuencia peptídica.
A partir de la secuencia peptídica, los oligonucleótidos pueden sintetizarse basándose en el código genético redundante o más preferido para usarse como sondas para analizar bibliotecas de ADNc para obtener la secuencia completa codificante del (de los) gen(es). Véase, por ejemplo, Sambrook, J. Y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Libro 2, (2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Identificación de sucesos genómicos mediante el aislamiento del ARNm
Otro procedimiento para detectar cambios en los sucesos genómicos en respuesta a un extracto vegetal es analizar los cambios en el ARN mensajero (ARNm) en una célula (Liang, P. & Pardee, A.B., Science 257:967-971 (1992)). La célula se expondrá a la concentración del extracto vegetal en cultivo, o las células de un tejido u órgano diana de un organismo pueden exponerse de forma local o sistémica a una o múltiples dosis del extracto vegetal durante un periodo definido y posteriormente extraerse.
El ARNm se preparará mediante procedimientos rutinarios extracción del ARN total como se describe en Ausubel, A.M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, pág. 4.1.2-4.3.4 (John Wiley & Sons, 1987). Para esta preparación puede prepararse ARN poli(A^{+}) mediante cromatografía de oligos-dT (Aviv, H. & Leder, P., J. Mol. Biol. 134:743 (1972)) como se describe en Ausubel, A.M. y col., Current Protocols in Molecular Biology, pág. 4.5.1-4.5.3 (John Wiley & Sons, 1987).
Se preparan dos grupos de ARNm, es decir, uno a partir de células antes de la exposición al extracto vegetal y otro, después de ésta. Los sucesos genómicos específicos están representados en ambos grupos dependiendo de si el extracto vegetal induce una supresión o una activación de la expresión génica. En el caso de que un gen se regule a la baja en respuesta al extracto vegetal, el ARNm estará presente en grandes cantidades en el grupo de ARNm que deriva de las células control. En el caso de que un gen se regule a la alta en respuesta al extracto vegetal, el ARNm estará presente en mayor cantidad en el grupo de ARNm obtenido de las células tratadas con el extracto vegetal. Pueden emplearse varias técnicas para identificar las poblaciones de ARNm que están reguladas a la alta o a la baja, por ejemplo, la hibridación sustractiva.
(a) Hibridación sustractiva
Las técnicas de hibridación sustractiva (Lee, S.W. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 88:2825 (1991)) se han desarrollado en donde el ARNm de uno de los dos grupos se convierte en la primera cadena de ADNc (antisentido) mediante el uso de cebadores oligo-dT, unidos a bolitas de celulosa o como cebadores libres, y transcriptasa inversa. Véase, por ejemplo, Sambrook, J. y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Libro 2, pág. 10.46 (2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). En el caso de que la primera cadena esté unida a bolitas de celulosa, la cromatografía sustractiva de ARNm puede efectuarse pasando el segundo grupo de ARNm a través de la columna. El ARNm adecuado de ambos grupos hibridará (es decir, el ARNm del segundo grupo hibridará con el ADNc antisentido de la columna y quedará retenido en la columna). El flujo que pasa a través, que no hibrida en la columna, contendrá las especies de ARNm que sean resultado de una alteración en la actividad genómica por el efecto del extracto vegetal sobre las células. Entonces, puede prepararse una biblioteca de bacteriófagos de ADNc con el ARN, de la fracción que eluye de la columna. Véase, por ejemplo, Sambrook, J. y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Libro 2, pág. 8.11-8.45 (2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Si la biblioteca se analiza con sondas con marcaje terminal P^{32} generadas a partir del primer grupo, los clones específicos que no están representados en el primer grupo de ARNm se identifican como placas "no hibridantes". También se han descrito otras estrategias comparables a ésta (Sambrook, J. y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Libro 2, pág. 10.41, 10.42 (2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)).
Los genes implicados se identificarán mediante la secuenciación del ADN de los clones de ADNc. Véase, por ejemplo, Sambrook, J. y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Libro 2, pág. 13.3-13.20 (2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
(b) Visualización diferencial de ARNm
Este procedimiento se halla bien descrito en la técnica. Véase, Liang, P. & Pardee, A.B., Science 257:967-970 (:,992); Callard, D. y col. BioTechniques 16:1096-1103 (1994); Chen, Z. Y col., BioTechniques 16:1003-1006 (1994); y Zhao, S. y col., BioTechniques 20:400-404 (1996). Se preparan mediante transcripción inversa secuencias parciales de ADNc del ARNm preparado a partir de las células tratadas con el extracto vegetal o sin tratar. Véase, por ejemplo, Sambrook, J. y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Libro 2, pág. 10.46 (2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) y se amplifican mediante la reacción en cadena de la polimerasa, por ejemplo, usando como cebador 3' un 5'-T_{11}CA y un cebador 5' corto (de 6-7 bases). La reacción de amplificación emplea un marcaje de dATP-\alphaS^{35}. A continuación, se fraccionan los fragmentos cortos marcados, amplificados mediante PCR, de cada grupo de ARNm (por ejemplo, visualizados) sobre un gel de secuenciación de ADN. Las bandas que no presentan la misma intensidad en un grupo o en el otro, se escinden del gel, se reamplifican y se usan como sondas para analizar una biblioteca de ADNc, como se describió anteriormente, para identificar los genes que se regulan con el extracto vegetal.
Uso
De esta forma, un perfil genético para un tipo celular específico en respuesta a la exposición a un extracto vegetal particular de interés farmacológico, puede catalogarse sin conocer los componentes reales del extracto vegetal. La utilidad del extracto vegetal, entonces, puede convertirse con la función descrita de algunos de estos genes, en procesos biológicos específicos. De esta forma, el potencial terapéutico del producto puede extenderse más allá de sus propiedades etnofarmacológicas conocidas, o su propiedad etnofarmacológica conocida puede verificarse genómicamente. Además, los compuestos individuales que actúan de manera similar en el extracto pueden, posteriormente, identificarse como agentes terapéuticos basándose en la actividad del extracto sobre un conjunto determinado de sucesos genómicos.

Claims (13)

1. Un procedimiento para identificar un agente farmacéutico, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
administración de un extracto vegetal a un tipo celular; aislamiento de la proteína o del ARN de dicho tipo celular tratado con el extracto vegetal;
identificación de cuál de dichas proteínas aisladas o ARN aislados a partir de dicho tipo celular tratado con el extracto vegetal, no está presente en la misma concentración en el tipo celular sin tratar;
administración del (de los) compuesto(s) a dicho tipo celular, en la que dicho(s) compuesto(s) se halla(n) en dicho extracto vegetal;
aislamiento de la proteína o del ARN de dicho tipo celular tratado con el(los) compuesto(s); e
identificación de cuál de dicho (de dichos) compuesto(s) produce(n), además, la expresión o supresión de dicha proteína o ARN que no está presente en la misma concentración en dicho tipo celular sin tratar, por lo que se excluye la administración a seres humanos.
2. Un procedimiento para determinar la respuesta genómica de un tipo celular a un extracto vegetal, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de;
administración de dicho extracto vegetal a dicho tipo celular;
aislamiento de la proteína o del ARN de dicho tipo celular tratado con el extracto vegetal; y
comparación de dicha proteína o ARN aislado de dicho tipo celular tratado con el extracto vegetal con la proteína o el ARN aislado del tipo celular sin tratar, por lo que se excluye la administración a seres humanos.
3. Un procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho procedimiento comprende el aislamiento de la proteína de dicho tipo celular tratado con el extracto vegetal y, en el caso del procedimiento de la reivindicación 1, de dicho tipo celular tratado con el(los) compuesto(s).
4. Un procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho procedimiento comprende el aislamiento del ARN de dicho tipo celular tratado con el extracto vegetal y, en el caso del procedimiento de la reivindicación 1, de dicho tipo celular tratado con el(los) compuesto(s); y en el que dicho ARN sea, preferiblemente, ARN mensajero.
5. Un procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho extracto vegetal y dicho(s) compuesto(s) se administra(n) in vitro; o en el que dicho extracto vegetal y dicho(s) compuesto(s) se administra(n) in vivo.
6. Un procedimiento de la reivindicación 2 y 3, en el que dicho procedimiento comprende además la etapa de identificación de cuál de dichas proteínas aisladas de dicho tipo celular tratado con el extracto vegetal no está presente en la misma concentración en el tipo celular sin tratar.
7. Un procedimiento de la reivindicación 6, en el que dicho procedimiento comprende, además, la secuenciación de dicha proteína identificada de dicho tipo celular tratado con el extracto vegetal, que no está presente en la misma concentración en dicho tipo celular sin tratar.
8. Un procedimiento de la reivindicación 7, en el que dicho procedimiento comprende, además, la identificación del gen que codifica para dicha proteína identificada de dicho tipo celular tratado con el extracto vegetal, que no está presente en la misma concentración en dicho tipo celular sin tratar.
9. Un procedimiento de las reivindicaciones 2 y 4, en el que dicho procedimiento comprende, además, la etapa de identificación de cuál de dichos ARN aislados a partir de dicho tipo celular tratado con el extracto vegetal no está presente en la misma concentración en el tipo celular sin tratar.
10. Un procedimiento de la reivindicación 9, en el que dicho procedimiento comprende, además, la secuenciación de dicho ARN identificado a partir de dicho tipo celular tratado con el extracto vegetal que no está presente en la misma concentración en dicho tipo celular sin tratar.
11. Un procedimiento de la reivindicación 10, en el que dicho procedimiento comprende, además, la identificación del gen identificado mediante dicho ARN aislado a partir de dicho tipo celular tratado con el extracto vegetal que no está presente en la misma concentración en dicho tipo celular sin tratar, o
en el que dicho procedimiento comprende además la secuenciación de la proteína codificada mediante dicho ARN identificado a partir de dicho tipo celular tratado con el extracto vegetal que no está presente en la misma concentración en dicho tipo celular sin tratar.
12. Un procedimiento de reivindicación, en el que dicho tipo celular se asocia con una diana biológica conocida de dicho extracto vegetal.
13. Un procedimiento de la reivindicación 4, en el que dicho ARN es ARN mensajero.
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