ES2316693T3

ES2316693T3 - Metodo de diagnostico de la enfermedad de alzheimer sobre la base de un patron de transcripcion genico.

Info

Publication number: ES2316693T3
Application number: ES03075068T
Authority: ES
Inventors: Praveen Sharma; Anders Lonneborg
Original assignee: Diagenic AS
Current assignee: Diagenic AS
Priority date: 1997-04-30
Filing date: 1998-04-30
Publication date: 2009-04-16
Anticipated expiration: 2018-04-30
Also published as: DK1323728T3; HK1026003A1; PT979308E; AU7222698A; WO1998049342A1; DE69840154D1; EP1323728A2; HK1057217A1; NO20040371L; US20130337446A1; DK0979308T3; ATE286143T1; EP1323728B1; JP2001526534A; US6720138B2; US20040121390A1; US20020022222A1; DE69828392T2; DE69828392D1; US20050227286A1

Abstract

Un método de diagnóstico o identificación de la enfermedad de Alzheimer o un estado de la misma en un ser humano, donde dicha enfermedad de Alzheimer o estado de la misma causa una respuesta sistémica en dicho ser humano, que comprende al menos las etapas de: a) aislar ARNm de sangre que ha sido aislada de dicho ser humano, que opcionalmente puede ser sometido a transcripción inversa para obtener el cDNA; b) preparar un kit de sondas patrón de transcritos génicos donde dichas sondas en dicho kit son específicas de la enfermedad de Alzheimer o un estado de la misma en sangre de un ser humano, que comprende al menos las etapas de: i) aislar ARNm de muestras de sangre normal que han sido aisladas de más de un ser humano normal; ii) aislar ARNm de muestras de sangre que han sido aisladas de más de un ser humano que tiene la enfermedad de Alzheimer o un estado de la misma; iii) separar el ARNm de las etapas i) y ii), que opcionalmente puede someterse a transcripción inversa para obtener cDNA; iv) seleccionar 10-500 especies de ARNm o cDNA que están presentes en distintos niveles en las muestras normales y en muestras de seres humanos que tienen la enfermedad de Alzheimer o un estado de la misma; v) aislar las especies de ARNm o cDNA identificadas en la etapa iv); vi) opcionalmente transcribir de forma inversa el ARNm de la etapa iv) o v) a cDNA, a no ser que ésta se haya transcrito anteriormente en la etapa iii); y vii) inmovilizar las sondas de ARNm o cDNA de la etapa v) o vi) sobre uno o más soportes sólidos; c) hibridar el ARNm o cDNA de la etapa a) con el kit preparado en la etapa b); d) valorar la cantidad de ARNm o cDNA que se híbrida a cada una de dichas sondas sobre dicho soporte sólido para producir un patrón característico que refleja la expresión génica de uno o más genes seleccionados que corresponden a las sondas; y e) comparar dicho patrón con un patrón diagnóstico estándar preparado usando muestras de sangre de más de un ser humano que tiene la enfermedad de Alzheimer o un estado de la misma para determinar el grado de correlación indicativo de la presencia de la enfermedad de Alzheimer o un estado de la misma en el ser humano bajo investigación, donde dicho patrón diagnóstico estándar está preparado por un método que comprende al menos las etapas de: i) aislar ARNm de sangre que ha sido aislada de más de un ser humano que tiene la enfermedad de Alzheimer o un estado de la misma, que opcionalmente puede someterse a transcripción inversa para obtener cDNA; ii) preparar un kit de sondas patrón de transcritos génicos según la etapa b) donde dichas sondas en dicho kit son específicas para la enfermedad de Alzheimer o un estado de la misma en la sangre de un ser humano; iii) hibridar el ARNm o cDNA de la etapa i) con el kit preparado en la etapa ii); y iv) valorar la cantidad de ARNm o cDNA que híbrida con cada una de dichas sondas sobre dicho(s) soporte(s) sólido(s) para producir un patrón característico que refleja la expresión génica en la muestra con la enfermedad de Alzheimer o un estado de la misma de uno o más genes seleccionados que corresponden con las sondas.

Description

Método de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer sobre la base de un patrón de transcripción génico.

La presente invención se refiere a métodos para preparar patrones estándar de diagnóstico de transcritos génicos, a métodos para preparar kits de sondas para diagnóstico y a métodos de diagnóstico que utilizan esos kits.

Existen numerosos ejemplos de métodos de diagnóstico que incluyen el examen físico, anatómico y conductual, y/o estudios y/o ensayos bioquímicos, eléctricos o electromagnéticos.

Estos métodos de diagnóstico están perfectamente desarrollados y suelen constituir medios eficientes para identificar muchos estados patológicos. Están basados en descubrimientos e investigaciones recientes, así como en las observaciones, experiencia y datos empíricos registrados por trabajadores sanitarios, concernientes a enfermedades de seres humanos, de otros animales y de plantas durante al menos 6.000 años.

Nunca antes de ahora había sido mayor el arsenal de herramientas de diagnóstico, pero aún así, el diagnóstico incorrecto de dolencias y otros estados, es todavía un hecho frecuente.

Se ha encontrado que muchas enfermedades y estados pueden estar relacionados con cambios o mutaciones ambientales o con otras alteraciones tanto en los agentes activos como en los organismos, así como en el organismo que está expuesto. Además, varias de las sustancias ilegales antiguas y nuevas utilizadas en deportes y por drogadictos no tienen pruebas de diagnóstico apropiadas para detectar su presencia.

Varios estados no se identifican fácilmente con los métodos disponibles y/o la identificación concluyente de una enfermedad o estado puede conseguirse demasiado tarde para un tratamiento corrector adecuado.

Debido al tiempo prolongado con frecuencia encontrado en un procedimiento de diagnóstico completo, un tratamiento antibiótico incorrecto se suele iniciar prematuramente, antes de que se haya alcanzado un diagnóstico concluyente. Esta práctica médica puede agravar el importante desarrollo de cepas bacterianas resistentes a antibióticos.

Así, aunque se han desarrollado un gran número de métodos de diagnóstico diferencial, existe todavía un número considerable de estados estrechamente relacionados, o de combinaciones de estados que se resisten a una identificación rápida, seguro y efectivo a un coste bajo.

Además, varios métodos de diagnóstico dependen de la inyección de fluidos extraños o de otras clases de transferencia de agentes diagnósticos sobre o dentro el organismo en observación, o requieren biopsias. La extracción de muestras de tejidos procedentes de partes de los organismos, a menudo no fácilmente accesibles, puede tener también efectos perjudiciales en el procedimiento de identificación y en el propio procedimiento de curación.

Se sabe que determinadas enfermedades producen como resultado la expresión elevada de diferentes genes que pueden en algunos casos ser responsables de la patogenicidad de la enfermedad o del estado en cuestión. Se ha descrito por ello la realización de escrutinios para detectar la presencia de un tránscrito particular como indicación de la presencia de una enfermedad (véase por ejemplo Enderlin y col., FEBS Letters, (1997), 412, 629-632). Se han descrito métodos para cuantificar los niveles de diferentes transcritos mediante su unión a cDNA derivado de genotecas, o por medio de secuenciación y comparación electrónica con otras genotecas, por ejemplo, en Schena y col., (1996), PNAS USA, 93, 10614-10619; Schena y col., (1995), Science, 270, 467-470), Heller y col., (1997), PNAS, USA, 94, 2150-2155, y solicitud de Patente internacional, n.º WO 95/20681.

Sin embargo, no se ha descrito ningún método rápido y sencillo que utilice el patrón de expresión génica característico durante una enfermedad u otros estados o durante sus fases, como herramienta de diagnóstico y/o pronóstico, en particular un método que no requiera conocimiento alguno de las características de la enfermedad, de los genes implicados o de sus secuencias.

Ahora se ha encontrado de manera sorprendente que un método sencillo de diagnóstico de una enfermedad o estado o de una de sus fases puede realizarse mediante la preparación de un patrón estándar característico de tránscritos génicos o huella genética (patrón estándar de sondas para diagnóstico), correspondiente a esa enfermedad /estado, seguido de la comparación del patrón de transcritos de un paciente u organismo en estudio con ese patrón. El estándar se prepara mediante la identificación de varias sondas específicas e informadoras que se utilizan como un conjunto de marcadores de la enfermedad o estado que ha de ser identificado o de una de sus fases. Estas sondas se unen a un soporte sólido, y luego se hibridan a ARNm, opcionalmente sometido a transcripción inversa y/o a amplificación. La cantidad del material ácido nucleico que se une a las diferentes sondas se valora, y en su conjunto constituye el patrón estándar de transcritos de esa enfermedad o estado o de sus fases.

Así, con el fin de identificar enfermedades, indisposiciones u otros estados causados por otros organismos, toxinas, estrés, envejecimiento, cambios medioambientales, etc., en seres humanos, animales, plantas y otros organismos vivos eucariotas y procariotas, puede prepararse un conjunto de patrones de sondas estándar de la cantidad de transcrito procedente de uno o más genes informadores en relación con un estándar, siendo característico cada de esos patrones de sondas estándar de una única dolencia o estado y/o fase de esa dolencia. Estos patrones de sondas estándar, posteriormente se comparan con un patrón de niveles de los transcritos, utilizando las mismas sondas, preparadas a partir de una muestra reciente de un tejido o fluido corporal recogido de un paciente que ha de ser diagnosticado, siendo dichos patrones específicos del estado actual de ese paciente.

Normalmente las reacciones frente a infecciones, toxinas o deterioros, están acompañadas de cambios en el nivel de actividad de algunos o de muchos genes. Estos niveles de actividad, que pueden ser o relativamente más altos o relativamente más bajos, son en conjunto específicos del tipo de estado que se presenta. La actividad normal y la actividad alterada pueden, en gran medida, medirse por medio de la cantidad de transcritos específicos o del ARNm que está presente. Así, pueden diseñarse sondas estandarizadas para análisis que contienen patrones de actividad que son característicos de cada estado o combinación de estados que ha de ser identificado o diagnosticado. Estas sondas estandarizadas pueden utilizarse para comparar ese patrón de sondas estandarizadas con patrones de transcritos procedentes de las muestras de tejido o fluidos corporales preparadas de manera similar y obtenidas de un paciente vivo o del organismo que ha de ser estudiado.

Con el fin de poner en práctica el método diagnóstico, debe poder disponerse de dos clases de sondas para diagnóstico elaboradas sustancialmente de manera similar, para establecer la comparación.

1. Un patrón estándar de sondas para diagnóstico (SDPP) (del inglés, " Standard Diagnostic Probe Pattern") que es característico de la dolencia de la que se sospecha, elaborado a partir de uno o más organismos que presentan el estado o la enfermedad en cuestión o una de sus fases, y

2. Un patrón de sondas específico de un paciente (PSPP) (del inglés, " Patient Specific Probe Pattern") que se elabora a partir de una muestra de un tejido o fluido corporal de obtención reciente, procedente de un organismo que ha de ser estudiado.

Para aplicar el método a un estado específico, el patrón de un SDPP característico de la dolencia de la que se sospecha o de una de sus fases debe haber sido elaborado de antemano. Además, debe poder disponerse de una muestra de obtención reciente y bien conservada, de un tejido o fluido corporal del paciente, para elaborar el PSPP, para su comparación con un SDPP o con varios SDPP diferentes correspondientes al número de dolencias de las que se sospecha y al de sus diferentes fases.

Para diseñar y elaborar el patrón de los SDPP característicos de una dolencia determinada, pueden utilizarse técnicas conocidas de aislamiento de ARNm, construcción y amplificación de cDNA y selección a través de hibridación diferencial y presentación diferencial.

Se aíslan y amplifican sondas de ARNm o cDNA seleccionadas e informadoras, procedentes de uno o más pacientes a los que se ha diagnosticado la dolencia en cuestión de manera concluyente. Estos SDPP reunidos se usarán para comparar si el PSPP es similar al SDPP. Pueden realizarse varios de estos SDPP característicos que representen diferentes fases de la misma dolencia.

El patrón de estas sondas estándar correspondientes a un gran número de dolencias y a diferentes fases de esas dolencias, puede acumularse en una base de datos y quedar disponible para los laboratorios a petición.

Así, contemplado desde un aspecto, la presente invención proporciona un método de diagnóstico o identificación de la enfermedad de Alzheimer o un estado de la misma en un ser humano, donde dicha enfermedad de Alzheimer o estado de la misma causa una respuesta sistémica en dicho ser humano, que comprende al menos las etapas de:

a) aislar ARNm de sangre, que ha sido aislada de dicho ser humano, que opcionalmente puede someterse a transcripción inversa para obtener cDNA;

b) preparar un kit de sondas patrón de transcritos génicos donde dichas sondas de dicho kit son específicas para la enfermedad de Alzheimer o un estado de la misma en sangre de un ser humano, que comprende al menos las etapas de:

i): aislar ARNm de muestras de sangre normal que han sido aisladas de más de un ser humano normal;

ii): aislar ARNm de muestras de sangre que han sido aisladas de más de un ser humano que tiene la enfermedad de Alzheimer o un estado de la misma;

iii): separar el ARNm de las etapas i) y ii), que opcionalmente puede someterse a transcripción inversa para obtener cDNA;

iv): seleccionar 10-500 especies de ARNm o cDNA que están presentes en distintos niveles en las muestras normales y en muestras de seres humanos que tienen la enfermedad de Alzheimer o un estado de la misma;

v): aislar las especies de ARNm o cDNA identificadas en la etapa iv);

vi): opcionalmente transcribir de forma inversa el ARNm de la etapa iv) o v) a cDNA, a no ser que ésta se haya transcrito anteriormente en la etapa iii); y

vii): inmovilizar las sondas de ARNm o cDNA de la etapa v) o vi) sobre uno o más soportes sólidos;

c) hibridar las sondas de ARNm o cDNA de la etapa a) con el kit preparado en la etapa b);

d) valorar la cantidad de ARNm o cDNA que se híbrida a cada una de dichas sondas sobre dicho soporte sólido para producir un patrón característico que refleja la expresión génica de uno o más genes seleccionados que corresponden a las sondas; y

e) comparar dicho patrón con un patrón diagnóstico estándar preparado usando muestras de sangre de más de un ser humano que tiene la enfermedad de Alzheimer o un estado de la misma para determinar el grado de correlación indicativo de la presencia de la enfermedad de Alzheimer o un estado de la misma en el ser humano bajo investigación, donde dicho patrón diagnóstico estándar está preparado por un método que comprende al menos las etapas de:

i): aislar ARNm de sangre que ha sido aislada de más de un ser humano que tiene la enfermedad de Alzheimer o un estado de la misma, que opcionalmente puede someterse a transcripción inversa para obtener cDNA;

ii): preparar un kit de sondas patrón de transcritos génicos según la etapa b) donde dichas sondas en dicho kit son específicas para la enfermedad de Alzheimer o un estado de la misma en la sangre de un ser humano;

iii): hibridar el ARNm o cDNA de la etapa i) con el kit preparado en la etapa ii); y

iv): valorar la cantidad de ARNm o cDNA que híbrida con cada una de dichas sondas sobre dicho(s) sopor-te(s) sólido(s) para producir un patrón característico que refleja la expresión génica en la muestra con la enfermedad de Alzheimer o un estado de la misma de uno o más genes seleccionados que corresponden con las sondas.

Así, este método incluye un método para preparar un kit de sondas patrón de transcritos génicos para diagnosticar o identificar la enfermedad de Alzheimer o un estado de la misma en seres humanos que comprende al menos las etapas de:

a) aislar ARNm de la sangre de seres humanos normales (muestra normal);

b) aislar ARNm de la sangre de seres humanos que tienen la enfermedad de Alzheimer o un estado de la misma (muestra patológica);

c) separar el ARNm de las etapas a) y b), que opcionalmente puede someterse a transcripción inversa para obtener cDNA, por ejemplo por una técnica de separación no basada en secuencias;

d) seleccionar de 10 a 500 especies de ARNm o cDNA que estén presentes a distintos niveles en las muestras normal y patológica;

e) aislar las especies de ARNm o cDNA identificadas en la etapa d);

f) opcionalmente transcribir de forma inversa el ARNm de la etapa d) o e) a cDNA, a no ser que ésta haya sido realizada anteriormente en la etapa c); y

g) inmovilizar las sondas de ARNm o cDNA de la etapa e) o f) sobre uno o más soportes sólidos.

El método de diagnóstico puede ser utilizado sólo como una alternativa a otras técnicas de diagnóstico o además de dichas técnicas. Por ejemplo, los métodos de la invención o métodos relacionados pueden ser usados como una medida de diagnóstico alternativa o adicional a la diagnosis utilizando técnicas de formación de imágenes, tales como formación de Imágenes por Resonancia Magnética (MRI), formación de imágenes por ultrasonidos, formación de imágenes mediante técnicas nucleares o formación de imágenes por rayos X, por ejemplo, en la identificación y/o diagnóstico de tumores.

Sus "fases" se refiere a las diferentes fases de la enfermedad o del estado (enfermedad de Alzheimer en métodos de la invención) que pueden exhibir o no cambios fisiológicos o metabólicos particulares, pero que sí exhiben cambios a nivel genético, que pueden ser detectados en forma de una expresión génica alterada. Se tendrá en cuenta que durante el transcurso de una enfermedad o estado, puede variar la expresión de diferentes transcritos. Así es que en las diferentes fases, quizá no se exhiba la expresión alterada de transcritos particulares, en comparación con la de las muestras "normales". Sin embargo, las sondas informadoras se seleccionan entre los transcritos que exhiben una expresión alterada en una o más fases durante el transcurso de la enfermedad, y que junto con la información relativa al nivel de otros transcritos, pueden utilizarse para obtener un patrón característico que es indicativo de una fase concreta de la enfermedad. Esas sondas informadoras pueden identificarse comparando los transcritos de muestras normales con transcritos de muestras patológicas de una o más fases de la enfermedad o estado, o comparando entre sí diferentes fases de la enfermedad o del estado, conforme al método anteriormente descrito.

Según aquí se utiliza, el organismo procariota o eucariota puede ser cualquiera de los organismos eucariotas tales como seres humanos, otros mamíferos y animales, aves, insectos, peces y plantas, y cualquiera de los organismos procariotas tales como bacterias. Sin embargo, los métodos de la invención son llevados a cabo sobre muestras humanas.

Según aquí se utiliza, "tejido" puede ser un tejido obtenido durante una intervención quirúrgica, por ejemplo, mediante biopsia, o mediante otros medios. Las "células" incluyen las células aisladas de tejidos o de fluidos corporales o de desechos corporales, o en el caso de organismos procariotas, el propio organismo. Los "fluidos corporales" incluyen orina, sangre, semen, etc. Se tendrá en cuenta sin embargo, que el método de preparación del patrón de transcripción estándar y el método de diagnóstico del invento, son también aplicables al uso sobre partes vivas de organismos eucariotas, tales como líneas celulares y cultivos de órganos y explantes. Los métodos de acuerdo a la invención se realizan sobre muestras de sangre.

"Normal", según aquí se utiliza, se refiere a los organismos o muestras que se utilizan con fines comparativos. Preferiblemente, estos organismos o muestras son normales en el sentido de que no exhiben indicación alguna de, o se cree que no presentan, enfermedad o estado que afecte la expresión génica, en particular en relación con la enfermedad respecto a la que van a utilizarse como estándar. Sin embargo, se tendrá en cuenta que las diferentes fases de una enfermedad o estado pueden ser comparadas y en esos casos, la muestra "normal" corresponde a la etapa más temprana de la enfermedad o estado. Las muestras y organismos "patológicos" incluyen las muestras y organismos que padecen una dolencia o un estado particular, y son aquellos que se sabe que presentan, o que exhiben, la enfermedad o estado en estudio, o una de sus fases. En métodos según la invención, la enfermedad es enfermedad de Alzheimer.

"Cadenas complementarias" se utiliza en sentido convencional para hacer referencia a cadenas de DNA que son complementarias en cada base con el cDNA molde del que derivan. "cDNA" en el sentido en el que aquí se nombra, incluye el cDNA de la primera cadena, producido por transcripción inversa del RNA, y las cadenas complementarias a la del cDNA de la primera cadena, es decir, el cDNA de la segunda cadena.

"Niveles diferentes" de las especies de ácidos nucleicos, se refiere a las diferencias cuantitativas o cualitativas que sugieren la existencia de una expresión diferencial. Una "sonda" puede ser una o más moléculas de ácido nucleico que pueden ser iguales o diferentes (es decir, una mezcla) pero que consideradas en su totalidad se expresan de manera diferencial en las muestras normales y en las muestras patológicas. Cuando se estudian diferentes fases de la enfermedad/estado, debe exhibirse una expresión diferencial de los transcritos correspondientes a las sondas, ya sea en relación con una muestra no patológica, o en relación con una fase diferente de la enfermedad/estado. Generalmente esas sondas son cDNA obtenido por transcripción inversa a partir del ARNm, o sus cadenas complementarias, aunque también puede utilizarse el propio ARNm. Esto podría realizarse por ejemplo utilizando un fragmento de DNA como molde de la sonda, insertándolo en un vector detrás del promotor de T3 o de un promotor similar. Se tendrá en cuenta sin embargo que este material ácido nucleico puede ser modificado sin que se afecte la realización del invento, con la condición de que la hibridación a moléculas de ácidos nucleicos de la muestra sea aún posible. De modo que las moléculas de ácido nucleico a las que aquí se hace referencia, tales como ARNm y cDNA, incluyen moléculas que están modificadas (p. ej., metiladas) o que incluyen bases modificadas o no naturales que pueden utilizarse en la preparación del cDNA o durante la amplificación. Consideraciones similares se aplican a todas las moléculas de ácido nucleico que aquí se describen. Así por ejemplo, los transcritos, presentes en las muestras, pueden estar en forma de RNA o pueden estar en formas alteradas o modificadas de RNA y/o en formas modificadas o no modificadas de DNA y/o en forma de cebadores, anticuerpos u otras moléculas que reconocen y se unen a las sondas diana, en particular mediante una hibridación específica con las sondas diana.

"Valoración" según aquí se utiliza, se refiere tanto a la valoración cuantitativa como a la cualitativa y puede determinarse en términos absolutos o relativos. El "patrón" característico creado por esta técnica se refiere a la información que por ejemplo puede representarse en forma tabular o en forma gráfica y que conlleva información sobre la señal asociada con dos o más sondas.

Según aquí se utiliza, la referencia a los "correspondientes" tejidos, etc., se refiere preferiblemente a los mismos tejidos, células o fluidos, pero también incluye tejidos, células o fluidos que son lo suficientemente similares para los fines de preparar el estándar. Cuando se usa haciendo referencia a genes "correspondientes" a las sondas, se hace referencia a genes que están relacionados por su secuencia (que puede ser complementaria) a la de las sondas aunque las sondas pueden reflejar productos de expresión de corte y empalme diferentes. Por eso es que pueden prepararse dos sondas distintas para una misma enfermedad, que son transcritas por el mismo gen pero que reflejan diferentes eventos de corte y empalme. Aun así se prefiere el uso de sondas que reflejen una expresión génica alterada de dos o más genes distintos.

Esta invención se refiere tanto a un principio de diagnóstico como a un método para identificar la enfermedad de Alzheimer, e implica el método asociado para el diseño y elaboración de sondas para diagnóstico que han de ser utilizadas en las medidas relativas necesarias para obtener un diagnóstico específico o para identificar la enfermedad de Alzheimer o un estado de la misma.

La invención constituye un método rápido y preciso para el diagnóstico la enfermedad de Alzheimer.

La capacidad de diseñar sondas estándar para diagnóstico, para la identificación de estados tradicionales, que en el momento presente son difíciles de identificar, así como la capacidad de adaptar con rapidez el diseño a la preparación de sondas nuevas para la identificación de nuevos estados que puedan aparecer, tan pronto como esos estados se identifican, tendrá por lo tanto de un enorme valor.

A partir de las fases más tempranas de enfermedades causadas por infecciones, sustancias tóxicas, envejecimiento u otros estados que alteran la calidad de vida de organismos eucariotas vivos, el organismo completo responde ante el estado alterado. La respuesta tiene lugar en todo el organismo, incluso aunque sólo una pequeña parte del organismo parezca estar afectada. La respuesta dura hasta que la afección se cura o hasta la muerte del organismo afectado.

Las ventajas de la invención y métodos relacionados son de naturaleza tanto primaria como secundaria. Pueden obtenerse muestras de tejidos o de fluidos corporales de partes del organismo que no están afectadas por el estado en observación. Una única muestra bastará para obtener una identificación completa, con lo que pueden obtenerse grandes reducciones en costes, tiempo y molestias al evitarse la hospitalización durante el intervalo de duración normal de las pruebas de diagnóstico realizadas en pacientes humanos o en otros pacientes animales.

No es necesaria la introducción de sustancias extrañas sobre o dentro del organismo en observación para facilitar la identificación del estado, con lo que el invento reduce el riesgo de reacciones anafilácticas frente a esas sustancias de diagnóstico introducidas.

Los métodos relacionados con los métodos de la invención tienen el potencial de detectar muchas enfermedades y síndromes de carácter somático, psicosomático y mental, así como de detectar el deterioro debido al envejecimiento del organismo. Además el método puede utilizarse para detectar las reacciones del organismo frente a sustancias tóxicas, radiaciones, pesticidas, antibióticos, fármacos, alergenos y combinaciones de algunas de estas situaciones.

La invención y los métodos relacionados además harán posible el detectar enfermedades o estados no deseados en un organismo en fases muy tempranas, incluso años antes de que otros síntomas subjetivos u objetivos puedan aparecer.

Incluso en los casos en los que el paciente fallece a causa de un estado hasta ese momento no identificado y la causa de la muerte no se establece hasta haber realizado un examen forense postmortem, el principio será válido. Si en el intento realizado para diagnosticar al paciente antes de su muerte, se prepara una serie de patrones de sondas específicas del paciente, estas sondas pueden utilizarse para el diseño de nuevos patrones de sondas estándar que pueden ser utilizados para diagnosticar apariciones posteriores de estados similares.

Los instrumentos y equipos analíticos, necesarios para hacer uso del invento son de fácil disponibilidad en laboratorios dedicados a un trabajo bioquímico y biotecnológico estándar.

Para comenzar la preparación del kit de sondas patrón de transcritos génicos, se extrae ARNm de los tejidos, células o fluidos corporales conforme a técnicas conocidas (véase por ejemplo Sambrook y col., (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, 2ª Edición, N. Y.), procedentes de un individuo u organismo normal.

El ARNm también se extrae, preferiblemente de la misma parte del cuerpo de un individuo u organismo correspondiente que presenta la enfermedad o el estado para el que se va a crear el patrón estándar de diagnóstico. En métodos de la invención para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer, se utiliza una muestra de sangre como fuente de ARNm. Debido a las dificultades existentes cuando se trabaja con RNA, el RNA preferiblemente se somete primero a transcripción inversa en esta fase para formar la primera cadena de cDNA, aunque esto puede realizarse después de la separación e identificación de los transcritos de interés si van a generarse sondas de cDNA. La clonación del cDNA o su selec-
ción en, o utilizando, una genoteca de cDNA no es sin embargo necesaria en éste u otros métodos de la invención.

Preferiblemente, se sintetizan las cadenas complementarias a las primeras cadenas de los cDNA, es decir, las segundas cadenas de cDNA, pero esto dependerá de qué cadenas se tiene el propósito de que se utilicen como sondas y de la naturaleza de las moléculas de ácido nucleico presentes en la muestra que va a ser hibridadas con las sondas durante el método de diagnóstico. Las cadenas de las segundas cadenas de cDNA se utilizan preferiblemente para hibridarse como sonda con las cadenas de cDNA que se han producido mediante transcripción inversa del ARNm de la muestra.

Preferiblemente las cadenas de cDNA se amplifican mediante técnicas de amplificación conocidas tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con el uso de cebadores apropiados. Como alternativa, las cadenas de cDNA pueden clonarse con un vector, usado para transformar una bacteria tal como E. coli que puede luego cultivarse para multiplicar las moléculas de ácido nucleico. Cuando las secuencias de los cDNA no son conocidas, los cebadores pueden ir dirigidos a regiones de las moléculas de ácido nucleico que han sido introducidas. Así, por ejemplo, como se describe en los Ejemplos aquí incluidos, pueden ligarse adaptadores a las moléculas de cDNA, y los cebadores pueden ir dirigidos a estas porciones para la amplificación de las moléculas de cDNA. Como alternativa, en el caso de muestras eucariotas, puede sacarse provecho de la cola de poli A y del casquete del RNA para preparar cebadores apropiados.

La separación del ARNm o del cDNA de la muestra normal o de la muestra patológica se realiza independientemente en cada muestra mediante técnicas de separación no basadas en la secuencia, que son todas las técnicas adecuadas que permiten una discriminación entre transcritos o entre sus correspondientes cDNA sin implicar el uso de información sobre la secuencia de los transcritos particulares para discriminar entre los diferentes tránscritos/cDNA. Esto no excluye sin embargo la posibilidad, por ejemplo, de utilizar sondas que portan marcadores que producen señales sobre los transcritos si las sondas están dirigidas a secuencias comunes presentes en todos o en muchos de los transcritos, que no se utilizan con el fin de distinguir los transcritos. Así y convenientemente, el ARNm o cDNA pueden separarse mediante separación electroforética en gel de agarosa o de poliacrilamida o en un gel similar, apropiado para la separación de las moléculas de ácido nucleico. Como alternativa, los productos pueden separarse mediante cromatografía de gases o HPLC o mediante técnicas similares. (Las técnicas de separación basadas en la secuencia, que están excluidas, incluyen por ejemplo la captura con sondas dirigidas a secuencias diferentes mediante hibridación o mediante secuenciación propiamente dicha).

Dichos métodos ofrecen la ventaja de que las sondas que van a utilizarse en los métodos del invento se identifican y seleccionan entre toda la población de transcritos o de cDNA, debido a que la selección no se realiza sobre la base de sus secuencias antes de la separación, p. ej. mediante hibridación a un ácido nucleico inmovilizado procedente de muestras de control. Por lo tanto, la identificación de los transcritos no sufre sesgos hacia la selección de transcritos particulares entre un subgrupo de los transcritos totales.

Para permitir la comparación entre las muestras, la separación de los tránscritos/cDNA debe realizarse en las muestras normales y en las muestras patológicas lo más simultáneamente posible, p. ej. con desarrollos consecutivos o sobre el mismo gel.

Para identificar los diferentes transcritos o cDNA, es necesario identificar una señal que corresponda a cada uno de los tránscritos/cDNA. Esto puede conseguirse convenientemente con el uso de un marcador radiactivo o de otro marcador que pueda ser incorporado durante la producción de cDNA o durante la amplificación.

Los marcadores apropiados son los que permiten directa o indirectamente la detección o medida de la presencia de los tránscritos/cDNA. Esos marcadores incluyen por ejemplo, marcadores radiactivos, marcadores químicos, por ejemplo cromóforos o fluoróforos (p. ej. colorantes tales como fluoresceína o rodamina), o reactivos de alta densidad electrónica tales como ferritina, hemocianina u oro coloidal. Como alternativa, el marcador puede ser una enzima, por ejemplo, peroxidasa o fosfatasa alcalina, en cuyo caso la presencia de la enzima se visualiza mediante su interacción con una entidad adecuada, por ejemplo, un sustrato. El marcador también puede formar parte de un par de señalización, en cuyo caso el otro miembro del par se encuentra en, o está próximo a, la sonda diana a la que el tránscrito/cDNA se une, por ejemplo, pueden utilizarse un compuesto fluorescente y a sustrato fluorescente de extinción. El marcador también puede suministrarse en una entidad diferente, tal como un anticuerpo, que reconoce un resto peptídico unido a los tránscritos/cDNA, por ejemplo, unido a una base utilizada durante la síntesis o la amplificación.

Puede obtenerse una señal mediante la introducción de un marcador antes, durante o después de la etapa de separación. Así por ejemplo, un gel sobre el que se han separado los transcritos, podría ponerse a hibridar con oligonucleótidos marcados con poli T, o los cDNA podrían hibridarse con oligonucleótidos marcados con poli A o con oligonucleótidos marcados, dirigidos a una secuencia que se introduce mediante ligación y/o amplificación. Como alternativa, la presencia de los transcritos podría identificarse por medio de otras propiedades físicas, tales como su absorbancia, si para la separación se utilizan técnicas tales como la cromatografía de gases o HPLC.

Dependiendo de la técnica utilizada en la separación, las señales de transcritos diferentes o de sus cDNA pueden solaparse y no resolverse totalmente. Aunque pueden producirse sondas que contengan una mezcla de transcritos o sus cDNA (con la condición de que la mezcla en su totalidad exhiba una expresión diferencial en las muestras normales y en las muestras patológicas), opcionalmente, la mezcla de tránscritos/cDNA puede extraerse y someterse a técnicas de separación repetidas o alternativas para aislar una población más pequeña de tránscritos/cDNA que exhiba la expresión alterada.

Se identifican especies de ácidos nucleicos que exhiben una expresión diferencial en las muestras normales frente a la de las muestras patológicas, o en al menos una de las fases de dicha enfermedad. Esto requiere la comparación entre las señales producidas por las muestras normales y las muestras patológicas. Los transcritos y los cDNA de interés son los que tienen una expresión diferencial en las diferentes muestras, manifestada por diferentes cantidades de señal. Ésta puede corresponder a una especie presente en la muestra patológica y no en la muestra normal o viceversa. De esta manera se reflejan tanto la expresión génica que está activada como la expresión génica que está desactivada. Esto ofrece ventajas significativas sobre métodos de la técnica anterior en los que la expresión génica alterada se identifica en relación con la de muestras normales (en las que el cDNA procedente de genotecas normales se utiliza como el molde de hibridación al que el ARNm de la muestra se une, y se mide la diferencia relativa entre la muestra "normal" y la muestra "patológica"). El método del invento es por lo tanto capaz de identificar genes que no se expresan de manera constitutiva o que se expresan sólo a niveles muy bajos en las muestras normales, pero que están activados en la enfermedad/estado en cuestión, o en al menos en una de sus fases.

Pueden utilizarse tránscritos/cDNA que reflejan una variación en el grado de la expresión, pero es preferible utilizar las especies que reflejan diferencias señaladas, p. ej. la ausencia o presencia de un tránscrito/cDNA.

Una vez identificadas, se aíslan las especies de ARNm o de cDNA (que pueden constituir una mezcla de moléculas que tengan secuencias diferentes). Para preparar un patrón estándar de diagnóstico, pueden aislarse dos o más especies (sondas) que reflejen una expresión génica alterada en al menos una de las etapas de dicha enfermedad o estado. Aunque en algunos casos solamente dos sondas pueden ser suficientes para producir un patrón estándar de diagnóstico de un estado o enfermedad particular o de una de sus fases, se tendrá en cuanta que incrementar el número de sondas evitará la posibilidad de un diagnóstico erróneo por comparación con otras enfermedades que pudieran alterar de manera similar la expresión de los genes particulares en cuestión. Por eso para el aislamiento se seleccionan preferiblemente entre 2 y 1.000 especies de sondas, de manera especial preferiblemente entre 10 y 500, de manera particular preferiblemente entre 50 y 100, por ejemplo 70 especies de sondas. Estas sondas reflejan los genes que presentan una expresión alterada en las enfermedades o estados en cuestión, o en sus etapas particulares, y se consideran "informadoras" con respecto a esa enfermedad particular en el organismo en estudio, y solamente se seleccionan las sondas que poseen esta propiedad informadora.

El aislamiento puede hacerse mediante selección de las fracciones apropiadas si por ejemplo la separación se realizó en una columna, o puede hacerse mediante una extracción física de la matriz utilizada en la separación, por ejemplo mediante la excisión de trozos de gel que contienen la especie de ácido nucleico de interés. Las moléculas de ácido nucleico contenidas en los trozos se aíslan luego y se purifican si es necesario para las siguientes etapas, preferiblemente con amplificación.

En los casos en los que se han separado y aislado los transcritos propiamente dichos, éstos pueden entonces convertirse en cDNA, preferiblemente con amplificación.

Las especies de sondas de ARNm o cDNA producidas según el método anterior, se inmovilizan luego cada una de ellas sobre un soporte sólido para producir el kit de sondas correspondiente a la enfermedad o al estado o el kit de sondas patrón de transcritos génicos (o huella genética). Numerosos soportes sólidos adecuados como restos inmovilizadores de moléculas de ácidos nucleicos son muy conocidos en la técnica y se encuentran ampliamente descritos en la literatura y en términos generales, el soporte sólido puede ser cualquiera de los soportes sólidos o matrices perfectamente conocidos que en la actualidad son ampliamente utilizados o propuestos para la inmovilización, separación, etc. en procedimientos químicos o bioquímicos. Así por ejemplo, los restos inmovilizadores pueden tener forma de partículas, láminas, geles, filtros, membranas, tiras de microfibra, tubos o placas, fibras o capilares, hechos por ejemplo de un material polimérico, p. ej. de agarosa, celulosa, alginato, teflón, látex o poliestireno. Generalmente se prefieren los materiales en partículas, p. ej. bolitas. Según convenga, el resto inmovilizador puede contener partículas magnéticas, tales como partículas supermagnéticas.

La unión de las moléculas de ácido nucleico al soporte sólido puede hacerse directa o indirectamente. Por ejemplo, cuando se utiliza un filtro, la unión puede realizarse mediante reticulación inducida por luz ultravioleta. Como alternativa, la unión puede realizarse indirectamente mediante el uso de un resto de unión portado por las moléculas de ácido nucleico y/o por el soporte sólido. Así por ejemplo, puede utilizarse una pareja de miembros de una unión por afinidad, tales como avidina, estreptavidina o biotina, DNA o una proteína de unión a DNA (p. ej. o la proteína represora de lac I o la secuencia del operador lac a la que esta proteína se une), anticuerpos (que pueden ser monoclonales o policlonales), fragmentos de anticuerpos o los epítopos o haptenos de anticuerpos. En estos casos, uno de los miembros del par de unión está unido al soporte sólido (o es parte inherente del mismo) y el otro miembro del par está unido a las moléculas del ácido nucleico (o es parte inherente de las mismas).

La unión de grupos funcionales apropiados al soporte sólido puede realizarse mediante métodos muy conocidos en la técnica, que incluyen por ejemplo, la unión a través de grupos hidroxilo, carboxilo, aldehído o amino, que pueden proveerse tratando el soporte sólido para que proporcione recubrimientos superficiales adecuados. La unión de grupos funcionales adecuados a las moléculas de ácido nucleico del invento puede realizarse por ligación o esos grupos pueden ser introducidos durante la síntesis o amplificación, por ejemplo utilizando cebadores que portan un resto apropiado, tal como biotina, o una secuencia particular para la captura.

Las sondas individuales forman módulos del kit y pueden estar presentes en uno o más soportes sólidos. Los soportes sólidos de los diferentes módulos están asociados físicamente y de manera conveniente aunque las señales de cada una de las sondas deben de poder determinarse por separado. Así por ejemplo, como soporte sólido pueden utilizarse placas con múltiples pocillos que contienen diferentes sondas en los diferentes pocillos, o regiones de un soporte sólido pueden comprender los diferentes módulos, por ejemplo, las diferentes sondas de ARNm o cDNA pueden estar unidas a un filtro en sitios discretos.

Por lo tanto, en un aspecto preferido, el método de diagnóstico de la presente invención incluye preparar un kit de sondas patrón de transcritos génicos, que diagnostique o identifique la enfermedad de Alzheimer o un estado de la misma en un ser humano, que comprende al menos las etapas de:

a) aislar ARNm de muestras de sangre de seres humanos normales (muestra normal);

b)aislar ARNm de muestras de sangre de seres humanos que tienen la enfermedad de Alzheimer o un estado de la misma (muestra patológica);

c) transcribir de forma inversa el ARNm de las etapas a) y b) a cDNA;

d) opcionalmente amplificar dichas cadenas, incorporando opcionalmente un marcador en dichas cadenas;

e) separar el cDNA de la etapa d) por ejemplo mediante una técnica de separación no basada en la secuencia;

f) seleccionar 10-500 especies de cDNA que estén presentes a diferentes niveles en las muestras normal y patológica;

g) aislar las especies de cDNA identificadas en la etapa f); e

h) inmovilizar las sondas de cDNA de la etapa g) sobre uno o más soportes sólidos.

Los kits de sondas patrón de transcritos génicos patrón preparados según el método de más arriba o métodos relacionados son utilizados en métodos de diagnóstico o identificación de una enfermedad/estado particular o estado de la misma en un individuo/organismo en particular, o para preparar un patrón estándar de diagnóstico de transcritos génicos.

El kit de sondas patrón de transcritos génicos, que se prepara comprende al menos lo siguiente:

a) uno o más soportes sólidos que portan 50-100 especies de sondas tal como se describe en la presente memoria, correspondientes a los transcritos que reflejan la expresión génica de uno o más genes seleccionados, característicos en la enfermedad de Alzheimer o un estado de la misma en un ser humano.

Opcionalmente el kit puede contener también información relativa a las señales generadas por las muestras normales o por las muestras patológicas, materiales de estandarización, p. ej. ARNm o cDNA procedentes de muestras normales y/o de muestras patológicas con fines comparativos, marcadores para incorporación a cDNA, adaptadores para introducir secuencias de ácidos nucleicos con fines de amplificación, cebadores para amplificación y/o enzimas, tampones y disoluciones apropiadas.

Dichos kits se utilizan para preparar un patrón estándar de diagnóstico de transcritos génicos.

El método de diagnóstico de la presente invención incluye un método para preparar un patrón estándar de diagnóstico de transcritos génicos, característico de la enfermedad de Alzheimer o un estado de la misma en un ser humano, que comprende al menos las etapas de:

a) aislar ARNm de una muestra líquida de sangre de seres humanos que tienen la enfermedad de Alzheimer o un estado de la misma, que opcionalmente puede someterse a transcripción inversa para obtener cDNA,

b) hibridar el ARNm o cDNA de la etapa a) con las sondas de ARNm o cDNA de un kit tal como se describe en la presente memoria específico para la enfermedad de Alzheimer o un estado de la misma en un ser humano; y

c) valorar la cantidad de ARNm o cDNA que se hibrida con cada una de dichas sondas sobre dicho soporte(s) sólido, para producir un patrón característico que refleja la expresión en la muestra con enfermedad de Alzheimer, o un estado de la misma, de uno o más genes seleccionados que se corresponden con las sondas.

Para producir el patrón estándar de diagnóstico de transcritos génicos o huella genética correspondiente a una enfermedad o estado particular o a una de sus fases (enfermedad de Alzheimer o un estado de la misma de acuerdo con la invención), el kit de sondas anteriormente producido se utiliza para hibridar con sondas el ARNm o cDNA de una muestra patológica, de manera que se produce una señal de la hibridación a cada especie de sonda particular unida al soporte sólido, es decir, los módulos del kit. Un patrón estándar de transcritos génicos de control puede prepararse si se desea utilizando ARNm procedente de una muestra normal. Así, el ARNm total aislado de la misma manera anteriormente descrita, o su cDNA (dependiendo de la complementariedad de las especies de sondas dispuestas sobre el módulo del kit de sondas) de una muestra patológica (que corresponde con la enfermedad a la que las sondas están dirigidas) (opcionalmente también de una muestra normal), se hibrida en las condiciones apropiadas con las especies de sondas dispuestas sobre los módulos del kit de sondas. Cuando ambas muestras se someten a la hibridación con las sondas, ésta puede realizarse de manera consecutiva sobre los mismos módulos del kit de sondas, hibridándolas simultáneamente con los módulos de un kit de sondas correspondientes.

Para obtener una indicación del número de tránscritos/moléculas de cDNA que quedan unidas a los módulos del kit de sondas, la señal producida cuando los transcritos se hibridan se detecta (p. ej., mediante una detección de moléculas de ácido nucleico bicatenarias o mediante la detección del número de moléculas que quedan unidas, después de separar las moléculas no unidas, p. ej., mediante lavado). En este último caso, preferiblemente como muestra se utilizan moléculas de ARNm/cDNA marcadas, por ejemplo incorporando bases marcadas radiactivamente durante la transcripción inversa, la preparación de las cadenas complementarias de cDNA o durante la amplificación. La cantidad de señal se valora luego para cada módulo del kit de sondas. La valoración puede ser cuantitativa o cualitativa y puede estar basada en la unión de una sola especie de transcrito a cada sonda, de una combinación de transcritos, o de formas representativas de los transcritos tales como cDNA o moléculas de ácido nucleico modificadas según se ha descrito anteriormente. Se tendrá en cuenta que los resultados cuantitativos proporcionarán una mayor información de la huella genética de los transcritos de la enfermedad cuyos datos están siendo compilados. Esos datos pueden expresarse en forma de valores absolutos o pueden determinarse con respecto al resultado de un estándar particular o del módulo de sondas. El valor de la señal de la muestra normal puede substraerse del de la señal de la muestra patológica, en los casos en los que se determina la primera de estas señales, aunque preferiblemente los resultados de las muestras del ensayo se comparan con la huella genética no estandarizada de la enfermedad, que es producida.

Además se tendrá en cuenta que el patrón estándar de diagnóstico de transcritos génicos puede prepararse utilizando los resultados de una o más muestras patológicas y/o muestras normales para identificar las sondas del kit de sondas, y una o más de las muestras patológicas (y de las muestras normales si se utilizan) pueden usarse para llevar a cabo la etapa de hibridación para obtener el patrón estándar de diagnóstico de transcritos génicos.

Dichos kits y de estos patrones estándar de diagnóstico de transcritos génicos de la invención o kits y patrones relacionados pueden ser usados con el fin de la identificación o diagnóstico de una enfermedad o condición o estado particular de la misma en un organismo particular.

Una vez se ha determinado el patrón o huella genética estándar de diagnóstico correspondiente a una enfermedad o estado particular, utilizando las especies de sondas seleccionadas, esta información puede utilizarse para identificar la presencia, ausencia o alcance de esa enfermedad o estado en un organismo o individuo diferente.

Contemplado así desde otro aspecto, la presente invención proporciona un método para diagnosticar o identificar la enfermedad de Alzheimer o un estado de la misma en un ser humano donde dicha enfermedad de Alzheimer o estado de la misma causa una respuesta sistémica en dicho ser humano, que comprende al menos las etapas de:

a) aislar ARNm de sangre que ha sido aislada de dicho ser humano, que opcionalmente puede someterse a transcripción inversa para obtener cDNA;

b) preparar un kit de sondas patrón de transcritos génicos donde dichas sondas en dicho kit son específicas para la enfermedad de Alzheimer o un estado de la misma en sangre de un ser humano, que comprende al menos las etapas de:

v): aislar las especies de ARNm o cDNA identificadas en la etapa iv);

d) valorar la cantidad de ARNm o cDNA que se hibrida a cada una de dichas sondas sobre dicho soporte sólido para producir un patrón característico que refleja la expresión génica de uno o más genes seleccionados que corresponden a las sondas y

El grado de correlación que se requiere para confirmar la presencia, ausencia o alcance de una enfermedad o estado, necesariamente tiene en cuenta el intervalo de valores que se obtienen de muestras normales y de muestras patológicas. Aunque este intervalo puede establecerse obteniendo las desviaciones estándar de varias muestras representativas que se unen a las sondas para elaborar el estándar, se tendrá en cuenta que muestras individuales pueden ser suficientes para generar el patrón estándar que identifica una enfermedad, si la muestra del ensayo exhibe una correlación los suficientemente ajustada con ese estándar.

El método de diagnóstico puede utilizarse para identificar, cuantificar o diagnosticar una enfermedad, estado o dolencia, o una de sus fases, o su progresión, por ejemplo un cáncer en seres humanos y la encefalopatía espongiforme bovina en ganado vacuno. El método también puede utilizarse para controlar el estado/condiciones de las plantas, por ejemplo para vigilar los efectos de la polución, o en el caso de organismos procariotas, para controlar su estado durante procedimientos tales como la fermentación o el procesamiento de aguas negras.

Debido a los efectos que determinados factores exógenos o algunas enfermedades ejercen sobre la totalidad de las partes del cuerpo, los efectos sobre la expresión génica no están restringidos a las áreas en las que la enfermedad se manifiesta, y por ello partes del cuerpo alejadas del sitio de interés, p. ej., un tumor, pueden ser analizadas. Por eso las muestras pueden obtenerse para los ensayos de una manera no invasiva, tal como por ejemplo de un fluido corporal, como la sangre. Ya que las muestras pueden tener su origen en diferentes partes del cuerpo que pueden exhibir algunas diferencias en sus productos de transcripción, las muestras utilizadas para preparar el estándar y las muestras del ensayo deben preferiblemente corresponderse. En los métodos de diagnóstico de la presente memoria están implicadas tres muestras diferentes que pueden derivar de fuentes diferentes. Son las muestras utilizadas para preparar las sondas, la muestra patológica utilizada para preparar el patrón estándar de diagnóstico, y la muestra del ensayo. Preferiblemente, todas las muestras derivan de fuentes comparables, pero preferiblemente de manera especial, al menos la muestra patológica utilizada para preparar el patrón estándar y la muestra del ensayo derivan de una fuente que se corresponde. En métodos de acuerdo con la invención, esta muestra es sangre.

Los siguientes ejemplos se proporcionan únicamente a modo de ilustración y las Figuras que en ellos se mencionan son las siguientes:

La Figura 1 muestra un patrón estándar de diagnóstico de expresión génica, en forma gráfica, correspondiente a una enfermedad en Arabidopsis; y

La Figura 2 muestra la extensión de la unión del cDNA aislado de Picea abies expuesta a diferentes tipos de estrés con respecto a 7 sondas diferentes.

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Ejemplo 1 Diagnóstico del síndrome de Alzheimer

Se recoge una muestra de sangre de un paciente del que se sospecha que padece esa dolencia. La muestra inmediatamente se conserva en nitrógeno líquido para prevenir la degradación del ARNm de la muestra.

La muestra se transfiere para su análisis, el ARNm se convierte en cDNA, éste se amplifica por PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) y se marca con nucleótidos radiactivos adecuados.

El cDNA marcado se hibrida con varias sondas de DNA de diagnóstico que están inmovilizadas sobre un filtro.

Las señales radiactivas procedentes del filtro de PSPP se cuantifican utilizando un Instant Imager y se determina el valor de la señal relativa de cada una de las diferentes sondas.

Los valores relativos de las diferentes sondas crearán todos juntos un patrón que es específico de la dolencia del paciente, el PSPP.

Este patrón específico del paciente se compara con los SDPP característicos del síndrome de Alzheimer en sus diferentes fases. Si los patrones del SDPP y del PSPP coinciden, la dolencia y su fase se diagnostican con gran certeza.

Si los patrones no coinciden, la dolencia puede ser descartada y ese mismo PSPP puede compararse manual o automáticamente con cualquier número de los SDPP disponibles hasta que se encuentra una correspondencia.

Ejemplo 2 Diagnóstico de demencia senil

Se recoge la muestra específica del paciente, se conserva, y el ARNm se convierte en cDNA, éste se amplifica y se marca mediante el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 1.

La hibridación comparativa se realiza con un conjunto diferente de SDPP que se ha preparado para distinguir entre diferentes clases y fases de demencia senil.

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Ejemplo 3 Estado de salud de amplio espectro

Los cebadores utilizados para detectar un conjunto de transcritos se utilizan para el marcaje.

Las muestras marcadas se separan a través de electroforesis en gel y todos los fragmentos de DNA se detectan y se cuantifican.

El patrón resultante específico del paciente, PSPP, se compara posteriormente con los SDPP de varias enfermedades diferentes. En cada falta de correspondencia que aparezca, la dolencia asociada puede ser descartada.

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Ejemplo 4 Diagnóstico de una enfermedad/estado en Arabidopsis

El diagnóstico puede dividirse en dos etapas:

- elaboración de un patrón de expresión reproducible (huella genética) típico de la enfermedad/estado que ha de ser diagnosticado.

- aplicación del método elaborado a una muestra procedente de un paciente u organismo no diagnosticado y comparar el patrón de expresión con el de patrones elaborados para la enfermedad/estado.

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4.1 Elaboración de un patrón de expresión reproducible, típico de la enfermedad/estado que ha de ser diagnosticado 4.1.1 Extracción del RNA total de hojas de Arabidopsis

Se recogen muestras de 15 g de hojas, cada una de ellas de plantas con una enfermedad diagnosticada y de plantas sanas, y se congelan inmediatamente en nitrógeno líquido. Cada muestra se divide en dos partes alícuotas.

Las hojas de una de las dos partes alícuotas de cada muestra, se muelen con maza y mortero en nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino. La segunda parte alícuota de cada muestra se almacena a -70ºC.

Las hojas molidas se transfieren inmediatamente a un vaso de precipitados de 500 ml que contiene 150 ml del tampón de molido (Tris-HCl 0,18 M, pH 8,2, LiCl 0,09 M, EDTA 4,5 mM, dodecilsulfato sódico (SDS) al 1% más 50 ml de fenol equilibrado con TLE (TLE = Tris-HCl 0,2 M, pH 8,2, LiCl 0,1 M, EDTA 5 mM)).

La mezcla se homogeneiza con un homogeneizador Polytron durante 2 min a una velocidad moderada (posición 5-6). Se añaden 50 ml de cloroformo y se mezclan en el homogeneizado utilizando el homogeneizador Polytron. La suspensión se vierte en una botella de centrífuga y se calienta durante 20 min a 50ºC. Esta botella se centrifuga luego durante 20 min a 17.700xg, 4ºC.

Después de la centrifugación, se extrae la mayor cantidad posible de capa acuosa, sin remover la interfase, y en una botella de centrífuga nueva esta fase se mezcla con 50 ml de fenol equilibrado con TLE mediante agitación. Se añaden luego 50 ml de cloroformo y la botella se agita con fuerza y luego se centrifuga a 17.700xg, 15 min, 4ºC.

Después de la centrifugación, la fase acuosa se retira y se extrae de nuevo con fenol equilibrado con TLE hasta que ya no se obtiene interfase. La fase acuosa se extrae una vez con cloroformo.

La fase acuosa se transfiere a una botella de centrífuga limpia y se añade LiCl 8 M hasta alcanzar una concentración final de LiCl 2 M. El RNA se precipita durante toda la noche a 4ºC.

La botella se centrifuga luego durante 20 min, a 15.300xg, 4ºC. El sedimento se lava con unos cuantos ml de LiCl 2 M. El sedimento se resuspende en 5 ml de agua y se transfiere a un tubo de centrifuga. Se añade LiCl 8 M hasta alcanzar una concentración final de LiCl 2 M y el RNA se precipita durante 3 h a 4ºC. El RNA se sedimenta por centrifugación durante 20 min, a 12.100xg, 4ºC. El sedimento se lava con LiCl 2 M y se resuspende en 2 ml de agua. Se añaden 200 ml de acetato sódico 3 M y 5,5 ml de etanol al 100% y el RNA se precipita a -20ºC durante la noche.

El RNA se sedimenta durante 15 min a 17.700xg, 4ºC. El sedimento se seca y se resuspende en 1 ml de agua.

Se calcula la concentración de RNA y se valora la pureza en una dilución 1:100 del material de reserva utilizando la absorbancia a 260 nm, 280 nm, 230 nm y 320 nm. El pH se ajusta con Na_{2}HPO_{4} concentrado hasta pH 1 antes de la lectura.

Aproximadamente 1 mg de cada una de las muestras se separa en un gel de agarosa para determinar el grado de contaminación por DNA detectable y el de degradación de RNA. Las muestras se guardan a -70ºC.

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4.1.2 Síntesis de la 1ª cadena de cDNA

Se aísla el ARNm procedente de 4 mg del RNA total utilizando bolitas paramagnéticas (DYNAL A.S., Oslo, Noruega) conforme a las instrucciones del fabricante.

A cada muestra se añaden 20 ml de agua y el ARNm se eluye de las bolitas a 65ºC durante 2 min. El sobrenadante se recoge en un tubo nuevo y la elución se repite. Los dos eluidos se reúnen.

Se mezclan entre sí 1 ml de Oligo dT_{(12-18)} (500 ng), 5 ml de ARNm (procedente de \geq1 mg del RNA total) y agua hasta completar 12 ml. La mezcla se calienta a 70ºC durante 10 min, se enfría inmediatamente en hielo y se centrifuga brevemente para separar la disolución condensada de las paredes del tubo.

Se añaden 4 ml de tampón para la primera cadena (Tris-HCl 250 mM, pH 8,3, KCl 375 mM y MgCl_{2} 15 mM), 2 ml de ditiotreitol 0,1 mM y 1 ml de mezcla de los dNTP (una concentración 10 mM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP). Esto se mezcla con cuidado y se incuba durante 2 min a 37ºC. Se añade 1 ml de transcriptasa inversa (200 U), i. e. Superscript, y se incuba durante 1 h a 37ºC. Los tubos se colocan luego en hielo.

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4.1.3 Síntesis de la 2ª cadena de cDNA

A las muestras se añaden 91,8 ml de agua, 32 ml de tampón para la 2ª cadena (Tris-HCl 100 mM, pH 7,5 , KCl 500 mM y MgCl_{2} 25 mM, albúmina de suero bovino en concentración de 0,25 mg/ml y (NH_{4})_{2}SO_{4} 500 mM), 3 ml de mezcla de los dNTP, 6 ml de ditiotreitol 0,1 M, 2 ml de DNA-ligasa de E. coli (10 U/ml), 4 ml de DNA-polimerasa de E. coli (10 U/ml), y 0,7 ml de RNasa H de E. coli (1 U/ml). Se incuba durante 2 h a 16ºC y a continuación se añaden 2 ml de DNA-polimerasa de T4 (10 U/mg). Se incuba durante otros 5 min a 16ºC.

Esto se extrae luego una vez con 1 vol. de fenol saturado con agua y después otra vez con 0,5 vol. de fenol y 0,5 vol. de cloroformo:alcohol isoamílico (39:1). Se añade acetato sódico 3 M, pH 5,2 hasta alcanzar una concentración final 0,3 M y se mezcla con cuidado. Se añaden 2,5 volúmenes de etanol al 96% (-20ºC) y la mezcla se centrifuga a 10.000xg, a 4ºC durante 30 min.

El sobrenadante se desecha y al sedimento se añaden 100 ml de etanol al 75% (-20ºC). Esta mezcla se centrifuga a 10.000xg, a 4ºC durante 5 min. El sobrenadante se desecha y el sedimento se mantiene a temperatura ambiente hasta que se seca. El sedimento se resuspende luego en 15 ml de agua.

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4.1.4 Reasociación de los adaptadores

Se premezclan 5 pmoles/ml de los dos adaptadores que llevan el sitio TaqI y 5 pmoles/ml de los dos adaptadores que llevan el sitio AseI.

1

Esta mezcla se calienta durante 2 min a 70ºC y se enfría lentamente hasta 30ºC.

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4.1.5 Ligación de los adaptadores al cDNA

Las dos muestras de cDNA (preparadas según la anterior etapa 4.1.3) se digieren con TaqI y AseI. Un volumen de 15 ml de la muestra se mezcla con 3 ml de tampón (Tris-HCl 50 mM, pH 7,9 , MgCl_{2} 10 mM, NaCl 50 mM, ditiotreitol 1 mM), 0,3 ml de albúmina de suero bovino (10 mg/ml), 1 ml de AseI (10 U) y 1 ml de TaqI^{a} (10 U). La mezcla se incuba a 37ºC durante al menos 2 h.

El material condensado se sedimenta y se incuba a 65ºC durante al menos 1,5 h. Se añaden 1 ml de adaptador que lleva el sitio AseI (5 pmoles), 1 ml de adaptador que lleva el sitio TaqI (50 pmoles), 4 ml de tampón para ligasa (Tris-HCl 50 mM, pH 7,8 , MgCl_{2} 10 mM, ditiotreitol 10 mM y albúmina de suero bovino en concentración de 25 mg/ml), 3 ml de agua y 1 ml de DNA-ligasa de T4 (1 U). Se incuba a 37ºC durante 3 h. La mezcla se diluye luego hasta un volumen de 500 ml con TE, 8,0 (Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM).

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4.1.6 Preamplificación

Muestras de 5 ml procedentes de la etapa anterior se mezclan cada una de ellas con 2,5 ml del tampón de la amplificación (Tris-HCl 0,1 M, pH 8,3 , KCl 0,5 M, MgCl_{2} 15 mM y gelatina al 0,1% (p/v)), 1 ml (5 ng) del cebador de preamplificación que lleva el sitio AseI, 1 ml (30 ng) del cebador de preamplificación que lleva el sitio TaqI, 1 ml de la mezcla de los dNTP, 13,5 ml de agua y 1 ml (1 U) de la DNA-polimerasa TaqI.

2

Un ciclo de temperaturas de 94ºC durante 30 s, 56ºC durante 30 s y 72ºC durante 1 min se ejecuta durante 25 ciclos.

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4.1.7 Amplificación

Un volumen de 5 ml de las muestras procedentes de la etapa de preamplificación se mezclan cada una de ellas con 1 ml de cebador con AseI (5 ng), 1 ml de cebador con TaqI (30 ng), 0,2 ml de la Taq polimerasa (1 U), 4 ml del tampón de amplificación, 0,4 ml de mezcla de los dNTP y 8,4 ml de agua. Los cebadores están marcados en sus extremos con g^{32}P-ATP.

3

(La N indica cualquiera de los cuatro desoxinucleótidos).

Un ciclo de temperaturas se ejecuta con una disminución de 0,7º en la primera etapa durante los primeros 11 ciclos, comenzando a 65ºC durante 30 s, 72ºC durante 1 min y 94ºC durante 30 s. Después de los 11 ciclos iniciales, la repetición de ciclos se continúa durante 23 ciclos adicionales con 65ºC durante 30 s, 72ºC durante 1 min y 94ºC durante 30 s. Las muestras se almacenan a 4ºC.

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4.1.8 Presentación diferencial

Se vierte un gel de poliacrilamida del tipo para secuenciación al 6% y el aparato de secuenciación en gel se pone en marcha. Se ejecuta un pre-desarrollo del gel hasta que éste alcanza los 55ºC.

Se mezclan 5 ml de cada una de las muestras con 5 ml de colorante para la muestra de secuenciación (Formamida al 95%, EDTA 20 mM, Azul de Bromofenol al 0,05% y xileno cianol FF al 0,05%). Las muestras se calientan a 75ºC-80ºC durante 2 min e inmediatamente se cargan en el gel. Las muestras se sitúan cerca unas de otras en el gel.

El desarrollo del gel se efectúa a 55ºC hasta que la banda de xileno cianol FF eluye fuera. El gel se seca y se coloca un autorradiograma sobre la superficie del gel. La película se expone toda la noche en oscuridad. Tanto la película como el gel seco se marcan para hacer posible obtener un ajuste exacto de los procedimientos posteriores. La película se revela.

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4.1.9 Selección de clones de cDNA que presentan expresión diferencial para utilizarlos como sondas

Se hace una comparación del patrón entre las dos muestras (la muestra normal y la muestra patológica) y se seleccionan las muestras que claramente están presentes en una de las muestras pero no en la otra. La película se coloca de manera precisa sobre el gel seco. El trozo de gel que corresponde a un fragmento seleccionado (que representa a un transcrito) sobre la película, se recorta y se recoge en un tubo mediante adición de 2 ml de agua al tubo y de 0,5 ml de agua a cada uno de los fragmentos de gel seleccionados dentro de las líneas recortadas y con el uso de un bisturí para raspar el fragmento y transferir el fragmento al tubo. De este modo pueden recogerse entre uno y diez fragmentos por cada reacción con un cebador específico. Debido a que los dos nucleótidos indicados con una N en cada uno de los cebadores de la amplificación pueden ser uno de los cuatro nucleótidos posibles, existen 4^{4} ó 256 combinaciones posibles que pueden utilizarse en la amplificación. Ya que pueden elegirse de uno a 10 fragmentos por amplificación individual utilizando solamente un único cebador, en total pueden elegirse entre 256 y 2.560 fragmentos por muestra utilizando todas las permutaciones del cebador de la amplificación.

Se ejecuta un ciclo de temperaturas como el anterior utilizando los cebadores de amplificación no marcados, a excepción de que la concentración de los cebadores se aumenta a 1 mM y la mezcla de los dNTP se aumenta a 200 mM y se llevan a cabo 40 ciclos.

A un filtro Hybond N se aplican 30 ng de los fragmentos amplificados (sondas) utilizando un aparato de transferencia de puntos. Se producen al menos dos réplicas del filtro. El DNA se fija al filtro por reticulación inducida por luz UV.

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4.1.10 Hibridación del cDNA de la muestra del ensayo a un filtro que lleva las sondas de cDNA

Las segundas partes alícuotas de las hojas procedentes de las plantas en las que se ha diagnosticado la enfermedad y de las plantas sanas, se utilizan para aislar RNA de la manera previamente descrita. Se prepara cDNA de la primera cadena de la manera previamente descrita, con la excepción de que se añaden 5 ml de [^{32}P]adCTP (actividad específica = 10 mCi/ml) en lugar de 5 ml de agua para crear el DNA de la muestra marcado.

El filtro se prehibrida en una disolución de SSC 4,8X (NaCl al 4,2% (p/v), citrato sódico al 2,1% (p/v), pH 7,0), Denhardt 1X (Ficoll 400 al 0,02% (p/v), poli(vinilpirrolidona) 40 al 0,02% (p/v), albúmina de suero bovino, Fracción V, al 0,02% (p/v)), Formatted al 50% (p/v), Tris-HCl 0,2 M, pH 7,6, sulfato de dextrano al 5% (p/v), dodecilsulfato sódico al 0,1%, a 42ºC durante al menos 2 h en una estufa de hibridación. El DNA de la muestra marcado se hierve durante 3 min e inmediatamente se añade a la disolución de prehibridación. Ésta se incuba a 42ºC en la estufa de hibridación durante al menos 6 h o durante toda la noche.

El filtro se lava luego dos veces en SSC 2X, SDS al 0,1%, a 50ºC, 10 min, después se lava dos veces en SSC 1X, SDS al 0,1%, a 50ºC, 15 min, después se lava dos veces en SSC 0,1X, SDS al 0,1%, a 50ºC, 30 min. La película se expone en un Instant Imager.

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4.1.11 Creación del estándar

Una de las señales (resultante de la unión de una de las muestras a una de las sondas hibridadas en el filtro) se considera como el estándar. La proporción de las demás señales presentes en el filtro se determina con respecto a esta señal estándar.

Las proporciones de las correspondientes señales entre las plantas que presentan la enfermedad y las plantas que no presentan esa misma enfermedad se comparan.

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Resultados

En la Figura 1 se muestran los resultados correspondientes a 9 cDNA seleccionados. Se ha usado P1 como el estándar. "Salud" se refiere a la muestra de las plantas sanas y "Dolencia" se refiere a la muestra de las plantas con la enfermedad en cuestión.

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4.2 Aplicación del método elaborado a una planta no diagnosticada

Se recoge una muestra de 2 g de hojas de la planta en estudio e inmediatamente se congela en dos partes alícuotas de 1 g. Se extrae el RNA de la manera anteriormente descrita, a partir de una de las partes alícuotas. Se sintetiza la 1ª cadena de cDNA de la manera anteriormente descrita y se marca incluyendo [^{32}P]adCTP en la síntesis.

La muestra marcada se hibrida en un filtro que porta las sondas de cDNA seleccionadas, se lava, y las señales se detectan en un Instant Imager de la manera previamente descrita.

El patrón de señales relativas de las diferentes sondas presentes en el filtro se compara con los patrones resultantes de las plantas sanas y de las plantas con la enfermedad y se hace un diagnóstico de la presencia o ausencia de esta enfermedad en la nueva planta.

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Ejemplo 5 Diagnóstico de una enfermedad/estado en seres humanos

El diagnóstico puede dividirse en dos etapas:

- Aplicación del método elaborado a una muestra de un paciente y comparación del patrón de expresión con los patrones elaborados correspondientes a la enfermedad/estado.

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5.1 Elaboración de un patrón de expresión reproducible, típico de la enfermedad/estado que ha de ser diagnosticado 5.1.1 Extracción del RNA total de la sangre

Se recogen 10 ml de sangre de un paciente al que se le ha diagnosticado la enfermedad de interés y de un paciente sin esta enfermedad pero que por lo demás es lo más parecido posible con respecto a la edad, sexo y demás factores que pueden influir en el resultado. Cada muestra se divide en dos partes alícuotas que se congelan inmediatamente en nitrógeno líquido.

Usando una sola parte alícuota de cada una de las muestras, una vez descongeladas las partes alícuotas, se centrifugan a 10.000xg durante 5 min para sedimentar las células. Los sedimentos se resuspenden en 1 ml de la Disolución A (tiocianato de guanidina 4 M, citrato sódico 25 mM, pH 7,0, N-laurilsarcosina al 0,5% (p/v), 2-mercaptoetanol 0,1 M) y el lisado se hace pasar por una pipeta 7-10 veces. Se añaden 0,1 ml de acetato sódico 2 M, pH 4, y se mezclan completamente mediante inversión. Se añade 1 ml de fenol saturado con agua y se mezcla completamente. Se añaden 0,2 ml de cloroformo/bromocloropropano 49:1 y se mezclan completamente, y se incuba durante 15 min a de 0ºC a 4ºC. Esta mezcla se centrifuga durante 20 min a 10.000xg y la capa acuosa superior se transfiere a un tubo limpio.

El RNA se precipita añadiendo 1 ml (1 vol.) de isopropanol al 100% y las muestras se incuban durante 30 min a -20ºC, seguido de centrifugación durante 10 min a 10.000xg, 4ºC.

El sedimento de RNA se disuelve en 0,3 ml de la Disolución A. El RNA se precipita luego con 0,3 ml (1 vol.) de isopropanol al 100% a -20ºC durante 30 min. Se centrifuga durante 10 min a 10.000xg, 4ºC y el sobrenadante se desecha.

El sedimento de RNA se resuspende en etanol al 75%, se agita en vórtice y se incuba durante 10-15 min a temperatura ambiente. Se centrifuga 5 min a 10.000xg, 4ºC, y el sobrenadante se desecha. El sedimento se seca a temperatura ambiente, aproximadamente durante 10-15 min. El sedimento se resuspende en 100 ml de agua y se incuba de 10 a 15 min, de 55ºC a 60ºC.

La concentración de RNA se calcula y la pureza se valora en una dilución 1:100 del material de reserva utilizando la absorbancia a 260 nm, 280 nm, 230 nm y 320 nm. El pH se ajusta con Na_{2}HPO_{4} concentrado hasta 1 mM antes de la lectura.

Aproximadamente 1 mg de cada muestra se separa en un gel de agarosa para determinar el grado de contaminación de DNA y de degradación de RNA detectables. Las muestras se almacenan a -70ºC.

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5.1.2 Síntesis de cDNA de la 1ª cadena para la selección de clones de cDNA que presentan expresión diferencial para utilizarlos como sondas

Estas etapas se llevan a cabo según se ha descrito en los apartados anteriores desde el 4.1.2 hasta el 4.1.9.

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5.1.3 Hibridación del cDNA de la muestra del ensayo a un filtro que lleva las sondas de cDNA

La segunda parte alícuota de las sangres procedentes del paciente normal y del paciente enfermo se usan para aislar RNA, se prepara el cDNA de la primera cadena marcado, se realiza la hibridación en el filtro que porta las sondas y la película se expone según se ha descrito en el párrafo 4.1.10.

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5.1.4. Creación del estándar

Los resultados se estandarizan con respecto a una sola señal, según se ha descrito en el anterior apartado 4.1.11.

Las proporciones de las señales correspondientes entre el paciente con la enfermedad y el paciente sin esa misma enfermedad se comparan.

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Resultados

Se obtienen resultados similares a los ilustrados en la Figura 1.

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5.2 Aplicación del método desarrollado a un paciente no diagnosticado

Se recoge una muestra de sangre de 2 ml procedente del paciente e inmediatamente se congela en dos partes alícuotas de 1 ml. Se extrae el RNA de la manera anteriormente descrita, a partir de una de las partes alícuotas una vez descongelada. Se sintetiza el cDNA de la 1ª cadena de la manera anteriormente descrita y se marca incluyendo [^{32}P]adCTP en la síntesis.

El patrón de señales relativas de las diferentes sondas presentes en el filtro se compara con los patrones resultantes del paciente sano y del paciente con la enfermedad y se hace un diagnóstico de la presencia o ausencia de esta enfermedad en el nuevo paciente.

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Ejemplo Patrón de expresión diferencial relativa de 7 sondas seleccionadas, encontradas en raíces del abeto de Noruega (Picea abies) expuesta a diferentes tipos de estrés Métodos

1. Siete sondas informadoras diferentes de cDNA se unieron a una membrana de nylon. Muchos de los clones se habían aislado de una genoteca de cDNA substraída de raíces del abeto de Noruega infectadas con el hongo patógeno Pythium dimorphum (de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 4), mientras que los demás clones se habían aislado mediante métodos similares del abeto de Noruega expuesto a otros tipos de estrés. La genoteca substraída se preparó conforme al método descrito en Lönneborg y col. (1995), PCR Meth. Applic., 4, pS168-S177. Se sabía que todos estos clones habían sido inducidos mediante, al menos, un tipo de estrés.

2. Se cultivaron abetos de Noruega durante 2 meses en una cámara de cultivo con un ciclo de día/noche de 12 h/12 h intensidad de luz de 500 mmoles x m^{-2} x s^{-1}, riegos con nutrición óptima una vez al día. Las plantas se expusieron luego o a la nutrición anteriormente mencionada (control), o a un medio con maltosa, o a 24 mg (en peso fresco) de Pythium dimorphum, o a 24 mg (en peso fresco) de Rhizoctonia sp. Las plantas se expusieron durante 4 y 8 días. Después de la exposición, las raíces y la parte más superior se congelaron inmediatamente.

3. El resto de las etapas de 4 a 10 se realizaron esencialmente como se describe en el Ejemplo 4.

4. El RNA se extrajo de las raíces y partes superiores y se verificó su calidad y rendimiento.

5. La primera y segunda cadena de cDNA se sintetizaron utilizando un cebador de poli T y un cebador basado en la presencia de un casquete en 5'. De este modo solamente se sintetizaron clones de longitud completa, evitándose el riesgo de una síntesis sesgada debida a múltiples sitios de hibridación de los cebadores.

6. Todo el cDNA se amplificó usando la técnica de PCR y usando el mismo conjunto de cebadores.

7. El cDNA reunido se marcó usando la sonda de poli T.

8. Los filtros, que portaban cada uno de ellos las 7 sondas, se sometieron a una prehibridación a 65ºC durante 6 horas y las muestras de cDNA marcadas se añadieron cada una a un filtro y los filtros inmovilizados se dejaron hibridar durante la noche a 65ºC.

9. Los filtros se lavaron para retirar todo el marcador hibridado de manera inespecífica.

10. Se realizó el recuento de las señales radiactivas de las sondas individuales en cada filtro utilizando un Instant Imager y se calcularon las señales relativas.

Resultados

El patrón creado por los filtros con raíces del control (día 4), maltosa (días 4 y 8), Pythium dimorphum (días 4 y 8), Rhizotonia sp. (día 4), y espículas del control (día 4) y de Pythium dimorphum (día 4) se presentan en la Figura 2. En el caso de la maltosa en el día 4, se realizaron dos experimentos duplicados independientes que indicaron la reproducibilidad del experimento.

Los resultados muestran que cada una de estas exposiciones crea patrones distintos usando este conjunto de sondas. También puede observarse que los estrés inducen a las plantas de manera sistemática, permitiendo el uso de diferentes partes de las plantas para el análisis. Además, también puede observarse la expresión diferencial de transcritos particulares en las diferentes fases del estrés.

Claims

1. Un método de diagnóstico o identificación de la enfermedad de Alzheimer o un estado de la misma en un ser humano, donde dicha enfermedad de Alzheimer o estado de la misma causa una respuesta sistémica en dicho ser humano, que comprende al menos las etapas de:

a) aislar ARNm de sangre que ha sido aislada de dicho ser humano, que opcionalmente puede ser sometido a transcripción inversa para obtener el cDNA;

b) preparar un kit de sondas patrón de transcritos génicos donde dichas sondas en dicho kit son específicas de la enfermedad de Alzheimer o un estado de la misma en sangre de un ser humano, que comprende al menos las etapas de:

v): aislar las especies de ARNm o cDNA identificadas en la etapa iv);

c) hibridar el ARNm o cDNA de la etapa a) con el kit preparado en la etapa b);

2. Un método tal como se reivindica en la reivindicación 1, donde en la etapa b) el ARNm o cDNA de la etapa v) o etapa vi) es amplificado antes de su inmovilización en la etapa vii).

3. Un método tal como se reivindica en la reivindicación 1 o 2, donde en la etapa b) el ARNm de las etapas i) y ii), o en la etapa e) el ARNm de la etapa i), es sometido a transcripción inversa para obtener cDNA.

4. Un método tal como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho cDNA es amplificado en la etapa b) o e).

5. Un método tal como se reivindica en la reivindicación 3 o 4, donde en la etapa b) dicho cDNA producido a partir del ARNm de las etapas i) y ii), o en la etapa e) dicho cDNA a partir del ARNm de la etapa i), incorpora un marcador.

6. Un método tal como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde entre 50 y 100 sondas de ARNm o cDNA son aisladas en la etapa b).

7. Un método tal como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde en la etapa b) dicha técnica de separación en la etapa ii) es electroforesis en gel.

8. Un método tal como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde dicho soporte sólido es un filtro.