ES2207248T3 - Componentes de bajo peso molecular del cartilago de tiburon, procesos de obtencion y usos terapeuticos de los mismos. - Google Patents
Componentes de bajo peso molecular del cartilago de tiburon, procesos de obtencion y usos terapeuticos de los mismos.Info
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Abstract
Un proceso para obtener un componente del cartílago que consta de las etapas siguientes: a) tratar material de cartílago con una cantidad de solución que contenga disolvente orgánico para formar una primera mezcla que contenga un componente soluble de cartílago en dicha solución, en el que el disolvente orgánico se elige entre etanol y metanol, y en el que dicho disolvente orgánico está presente en la solución de extracción en una cantidad comprendida entre el 1 y el 100 % en volumen y b) separar dicha primera mezcla para formar un primer extracto líquido que contenga dicho componente soluble y una primera masa de sólidos, en el que dicho componente soluble posee una o varias actividades elegidas entre actividad anti- metaloproteasa de matriz, antitumoral y antiangiogénica.
Description
Componentes de bajo peso molecular del cartílago
de tiburón, procesos de obtención y usos terapéuticos de los
mismos.
Esta invención se refiere a los componentes de
bajo peso molecular extraídos de cartílagos de tiburón y a procesos
para su obtención. Esta invención se refiere además a procesos para
aislar y purificar un extracto de cartílago en diversas condiciones.
Los componentes de bajo peso molecular despliegan actividades por lo
menos de una anti-metaloproteasa de matriz
(anti-MMP), antiangiogénicas y antitumorales.
Los procesos de obtención de extractos de
cartílagos de tiburón y los extractos propiamente dichos se han
descrito en las publicaciones internacionales WO 95/32722, WO
96/23512 y WO 97/16197. Los extractos líquidos de cartílago de
tiburón se han probado en varios ensayos para determinar su
actividad antiangiogénica, anticolagenolítica, directamente
antiproliferante tumoral y antiinflamatoria.
En el documento WO 95/32722 se describe un
proceso para obtener un extracto de cartílago que tiene actividades
antiangiogénicas, directamente antiproliferante tumoral "in
vitro" y antitumorales "in vivo". Esto proceso
consiste en las etapas de mezclar tejido de cartílago de tiburón y
reducir el mismo a un tamaño de partícula de unos 500 \mum en
agua; extraer los componentes activos en agua; y fraccionar los
extractos así obtenidos con el fin de recuperar las moléculas que
tienen pesos moleculares inferiores a unos 500 kDa (fracción
0-500). Se concentra el extracto líquido de
cartílago a través de una membrana que tiene una porosidad nominal
de 1 kDa para formar un extracto líquido concentrado que consta de
moléculas que tienen pesos moleculares inferiores a 500 kDa. Se
enriquece el extracto con moléculas que tienen pesos moleculares
comprendidos entre 1 y 500 kDa. Después se fracciona la fracción
0-500 para obtener un gran número de extractos que
contienen moléculas antiproliferantes tumorales, cuyos pesos
moleculares se extienden de 1 a 120 kDa. En la publicación WO
95/32722 no se describe la recuperación específica de componentes
que tengan pesos moleculares inferiores a 1 kDa. Tampoco se describe
un proceso para la obtención de un extracto de cartílago o
fracciones del mismo en soluciones que contengan disolventes
orgánicos.
En la publicación de patente internacional nº WO
96/23512 se describe un proceso de extracción de componentes
biológicamente activos a partir de cualquier fuente de cartílagos en
soluciones acuosas. En la publicación se describen además otras
actividades biológicas asociadas con el cartílago de tiburón
líquido, a saber, actividades anticolagenolíticas y
antiinflamatorias. En la publicación WO 96/23512 no se describe la
recuperación de componentes que tienen pesos moleculares inferiores
a 1 kDa ni procesos en los que intervengan soluciones que contengan
disolventes orgánicos.
En la publicación de patente internacional WO
97/16197 se describe un proceso para la recuperación de un extracto
acuoso enriquecido con moléculas que tienen pesos moleculares
comprendidos entre 0,1 y 500 kDa. Aunque tal proceso puede recuperar
componentes de pesos moleculares inferiores a 1 kDa, no proporciona
recuperación alguna de componentes específicos de peso molecular
bajo. No se describe componente alguno en forma aislada o
purificada.
En la técnica se acepta de forma general que las
metaloproteasas de matriz intervienen en los procesos de
neovascularización, facilitando el crecimiento de tumores primarios
y en la formación de metástasis. Por consiguiente se piensa que los
compuestos o agentes que despliegan actividades antiangiogénicas y/o
de anti-metaloproteasa de matriz pueden ser útiles
por lo menos para uno de los términos siguientes: inhibir la
neovascularización, inhibir el crecimiento de los tumores, inhibir
la invasión metastásica de las células, inhibir la formación de
metástasis y tratar las enfermedades relacionadas con la
angiogénesis.
Dado el interés por los componentes aislados a
partir de cartílago de tiburón, existe la necesidad de mejorar los
procesos para su obtención y para el aislamiento y purificación de
otros componentes que poseen una actividad biológica no conocida
anteriormente.
La presente invención pretende proporcionar
procesos mejorados de obtención de extractos a partir de cartílago
de tiburón.
En un aspecto, la presente invención proporciona
un proceso definido en la reivindicación 1.
Con el fin de reducir al mínimo la formación de
agregados de los componentes, de mejorar la disolución y de mantener
una forma soluble estable se añaden en una cantidad suficiente
sucrosa y uno o varios estabilizantes idóneos, por ejemplo dextrano,
Ficoll^{TM}, fructosa, gelatina, glucosa, glicina, inositol,
lactosa, manita o sorbita, a cualquiera de las fracciones
0-500, 0-1 y 1-500 o
bien pueden utilizarse en cualquiera de las etapas de fabricación.
Tal como se utiliza en referencia a las fracciones, soluciones o
extractos, la frase "que contiene un 1% p/v de sucrosa"
significa que tal fracción, solución o extracto contiene un 1% en
p/v de sucrosa. Los componentes biológicamente activos de las
fracciones 0-1 y 1-500 poseen
actividades anti-MMP, antiangiogénicas y
antitumorales.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un componente biológicamente activo, obtenible por los
procesos anteriores que se definen en la reivindicación 13 y también
un uso de tal componente biológicamente activo en la fabricación de
un medicamento que posee por lo menos una de las actividades
siguientes: de antimetaloproteasa de matriz, angiogénica o
antitumoral, según se define en la reivindicación 14.
Las figuras siguientes forman parte de la
presente especificación y se incluyen para ilustrar con mayor
detalle ciertos aspectos de la invención. La invención puede
comprenderse mejor con referencia a una o varias figuras en
combinación con la descripción detallada de las formas de ejecución
específicas que se presentan en la memoria.
Las figuras 1a y 1b representan el cromatograma
iónico total así como el cromatograma iónico individual (245 M+1)
obtenido en un sistema de cromatografía HPLC C18 por análisis del
Æ-986 empleando un tampón de formiato amónico (pH 7) y una elución
isocrática.
Las figuras 2a y 2b representan el cromatograma
iónico total así como el cromatograma iónico individual (245 M+1)
obtenido en un sistema de cromatografía HPLC C18 por análisis del
Æ-986 empleando un tampón de formiato amónico (pH 3) y una elución
de gradiente.
Las figuras 3a y 3b representan el cromatograma
iónico total así como el cromatograma iónico individual (245)
obtenido en un sistema de cromatografía HPLC C18 por análisis del
Æ-986 empleando un tampón de formiato amónico (pH 3) y una elución
isocrática.
Las figuras 4a y 4b representan el cromatograma
iónico total así como el cromatograma iónico individual (245)
obtenido en un sistema de cromatografía HPLC NH2 por análisis del
Æ-986 empleando un tampón de formiato amónico (pH 3) y una elución
de gradiente.
La figura 5 representa un espectro de masas EM/EM
del Æ-986 que muestra una pérdida de 18 amu (pico principal m/e en
227,1) que corresponde a la pérdida de una molécula de agua.
La figura 6 representa el espectro de masas EM/EM
de los fragmentos específicos del ion 227 (245 M+1 menos una
molécula de agua).
Las propiedades biológicas de los extractos de
cartílago de tiburón, de las fracciones de los mismos y del
componente Æ-986 se determinan utilizando por lo menos uno de los
ensayos siguientes:
\bullet Ensayo de inhibición de gelatinasa
(EIG): es un ensayo para evaluar la actividad
anti-MMP;
\bullet Ensayo de vascularización embrionaria
(EVE): es un ensayo para evaluar la actividad antiangiogénica; y
\bullet modelo de metástasis de carcinoma
pulmonar de Lewis (CPL) en ratón: es un ensayo para evaluar la
actividad antitumoral.
El ensayo EIG se realiza empleando un kit
comercial (Boehringer Mannheim). Se utiliza el EIG para determinar
la capacidad de los componentes de extractos derivados de cartílago
o de fracciones de los mismos o del componente Æ-986 para inhibir la
actividad de la enzima gelatinasa A (MMP-2).
En resumen, el EIG se lleva a cabo del modo
siguiente. Se incuba un sustrato de gelatina, marcado con biotina,
con gelatinasa A en ausencia o en presencia de extracto líquido de
cartílago o de sus derivados. A continuación se carga la mezcla
reaccionante en una placa de microvaloración recubierta de
estreptavidina. La gelatina marcada con biotina se fija sobre la
placa de microvaloración recubierta de estreptavidina mediante los
restos biotina libres. Si el sustrato, la gelatina, no se soltado
por acción de la gelatinasa, entonces un conjugado de
estreptavidina-peroxidasa (POD) se fija sobre el
complejo de gelatinasa-biotina. Entonces el POD
convierte un sustrato ABTS adicionado en un producto final verde,
que se mide a 405 nm. Sin embargo, si la gelatina marcada con
biotina se suelta por acción de la gelatinasa, entonces se forman
únicamente fragmentos pequeños de gelatina. Estos fragmentos,
después de adherirse a la placa de microvaloración, ya no poseen la
capacidad de fijar conjugados de estreptavidina-POD;
y por lo tanto, no tiene lugar una reacción de color.
\newpage
Una gran actividad de gelatinasa proporciona
señales bajas, mientras que una baja actividad de gelatinasa (p.ej.
por adición de un inhibidor) produce señales elevadas. La actividad
buscada en los componentes de un extracto derivado de cartílago o en
las fracciones derivadas del mismo puede ser una actividad
inhibidora de la gelatinasa o una actividad antagonista que afecte a
la interacción entre la gelatinasa y su sustrato de gelatina (p.ej.
los componentes antagonistas fijan la gelatina).
El ensayo de vascularización embrionaria (EVE) se
realiza para determinar la capacidad de los componentes de los
extractos líquidos de cartílago de tiburón o las fracciones
derivadas de los mismos para inhibir la formación de nuevos vasos
sanguíneos (actividad antiangiogénica).
El desarrollo normal de un embrión de polluelo
supone la formación de un sistema vascular externo, localizado en la
membrana vitelina que aporta nutrientes desde el vitelo (yema del
huevo) hasta el embrión en desarrollo. Cuando se colocan en la
membrana vitelina, las sustancias antiangiogénicas pueden inhibir la
formación de vasos sanguíneos que tiene lugar en la membrana
vitelina.
Se colocan discos de metilcelulosa (una matriz
transparente, sólida e inerte) que contiene diversas cantidades de
componentes de extractos líquidos derivados de cartílago de tiburón
o fracciones derivadas de los mismos o controles apropiados en los
confines externos del perímetro vascular de la membrana vitelina, en
la que tiene lugar el proceso angiogénico. Los controles positivos
son discos de metilcelulosa que contienen 1,5 mg/ml de
2-metoxiestradiol. Se colocan los discos de control
y los discos que contienen muestras en la membrana vitelina de
embriones de 3 días de vida. En esta época solamente invaden el
vitelo los inicios de los vasos sanguíneos principales. Los discos
de metilcelulosa que contienen un control negativo o una cantidad de
los componentes del extracto líquido derivado de cartílago de
tiburón o fracciones derivados del mismo se colocan en la membrana
vitelina del mismo embrión de forma simultánea. Ambos discos se
colocan en posición simétrica con respecto al eje
cefalo-caudal del embrión con el fin de minimizar
las variaciones interindividuales en el momento de comparar la
eficacia de dichos componentes con respecto a la de los controles
negativos. Se evalúa la vascularización 24 horas después de la
colocación del disco y se expresan los resultados en porcentaje de
embriones en los que la formación de vasos sanguíneos haya resultado
afectada. Se considera afectada la formación de vasos sanguíneos
cuando su tramo en crecimiento se desvía, se disminuye o cuando no
se observa crecimiento más allá del disco, por comparación con el
control negativo.
El modelo de carcinoma pulmonar de Lewis (CPL) en
ratón se emplea para determinar la capacidad de los componentes de
extractos líquidos de cartílago de tiburón o de las fracciones
derivadas de los mismos o del Æ-986 para inhibir la formación de
metástasis dentro del pulmón.
El Dr. P. Brodt (Brodt, P., Cancer Res.
46, 2442, 1986) ha establecido el clon M27 de carcinoma
pulmonar de Lewis, provisto de un alto potencial metastásico para el
pulmón. Este modelo está perfectamente descrito y conocido en cuanto
a su correlación predictiva entre actividad "in vitro" e
"in vivo". Se mantienen las células en medio
RPMI-1640 suplementado con un 10% de suero fetal
bovino y un 1% de penicilina-estreptomicina, en un
5% de CO_{2} y se pasan dos veces por semana. Se generan y se
almacenan grupos (stocks) de células en forma de pasajes tempranos.
Todos los ensayos se efectúan empleando el mismo pasaje. Para la
inducción tumoral se cultivan células M27 en un 70% de confluencia
en medio completo y se recolectan empleando una solución de
tripsina-EDTA (0,05% de tripsina, 0,53 mM de
EDTA-4Na en HBSS sin Ca^{++} ni Mg^{++}). A
continuación se centrifugan las células, se lavan y se vuelven a
suspender (1 x 10^{6} células CPL por 200 \mul de PBS exento de
Ca^{++} y de Mg^{+}). Se examina la viabilidad con tinción de
azul de triptófano y solamente se utilizan para la inoculación los
frascos en los que la viabilidad es superior al 95%.
Para inducir tumores de carcinoma pulmonar de
Lewis se utilizan ratones hembra C57BL/10 (de 15 a 20 g de peso)
(Charles River Inc.). Después de una semana de incubación se
trasplantan las células CPL por vía subcutánea (5 x 10^{5} células
viables por 100 \mul) en la región axilar del flanco derecho en el
día 0. Todos los animales se inoculan por el mismo sitio. Se hace el
seguimiento del crecimiento tumoral cada día empleando calibradores.
Se calcula el volumen tumoral relativo mediante la fórmula: longitud
(cm) x [anchura (cm)]^{2}/2, en la que la longitud corresponde al
eje más largo y la anchura corresponde al eje perpendicular más
corto del tumor. Cuando el tumor primario alcanza un tamaño de 0,5 a
1,0 cm^{3} (día 10 después de la inoculación) se asignan de modo
aleatorio los ratones que llevan tumores primarios de tamaño
aproximadamente idéntico a grupos experimentales específicos de 15
animales cada uno y se marcan con números empleando el método de la
punción de la oreja. La intervención quirúrgica se realiza en
condiciones estériles. Después de una pequeña incisión en la piel
(0,5 - 1 cm) se separa cuidadosamente el tumor de los tejidos sanos
adyacentes. Las células CPL (en el estadio inicial de su
crecimiento) forman un tumor bien localizado y es fácil efectuar su
separación sin provocar daños significativos en los tejidos
normales. El examen estereoscópico indica la ausencia de cualquier
tumor macroscópico residual en el sitio donde se ha inoculado el
tumor y no se observa un rebrote del tumor en las condiciones
aplicadas en nuestro ensayo. Después de su extirpación, se pesa el
tumor y se cierra la herida mediante grapas quirúrgicas de acero
inoxidable y se desinfecta con providona-yodo.
El tratamiento con diversas muestras a ensayar
(componentes derivados de extractos líquidos de cartílago de
tiburón, fracciones derivadas de los mismos o Æ-986) se inicia al
día siguiente de la extirpación del tumor (día 11 después de la
inoculación). Se administran diariamente por vía oral durante dos
semanas una solución salina o productos derivados de cartílago. La
administración oral (0,5 ml) se efectúa empleando una aguja curvada
22G. Debido a que en ensayos previos se había observado que un
período de aproximadamente dos semanas después de la extirpación del
tumor primario es suficiente para obtener un promedio de 30 a 50
nódulos en la superficie pulmonar, se sacrifican los animales en
cámara de CO_{2} al cabo de dos semanas. Después de la autopsia se
extraen ambos pulmones, se pesan y se fijan en un 10% de medio
fijador de Bouin. Se realiza el recuento de las metástasis de la
superficie pulmonar empleando un estereomicroscopio (4X).
Se hace un seguimiento del peso corporal cada dos
o tres días hasta el sacrificio.
La presente invención proporciona un método para
la obtención de extracto de cartílago y para obtener, aislar o
purificar los componentes biológicamente activos del mismo, en dicho
método por lo menos una porción del componente biológicamente activo
no es de naturaleza proteica. Sin embargo, en el proceso de la
invención pueden emplearse agentes caotrópicos útiles para extraer
los componentes que contienen proteínas.
Tal como se emplea en esta descripción, el
término "solución que contiene disolventes orgánicos" indica
una solución o una mezcla que contiene por lo menos una porción de
un disolvente orgánico. La solución que contiene disolvente orgánico
puede contener uno o varios disolventes orgánicos y puede contener
además agua. Un disolvente orgánico o una combinación de disolventes
orgánicos empleados en este caso son con preferencia de naturaleza
polar. En una forma de ejecución se emplea por lo menos uno de los
siguientes: metanol o etanol para preparar los extractos líquidos de
cartílago de tiburón. Pueden utilizarse también otros disolventes
orgánicos polares idóneos, por ejemplo acetonitrilo, propanol,
isopropanol y acetona. Los disolventes orgánicos pueden incluir uno
o varios disolventes halogenados, éteres, próticos, apróticos,
polares, apolares, básicos, ácidos, hidrófugos e hidrófilos.
Los disolventes orgánicos halogenados idóneos
incluyen: el cloroformo, el dibromometano, el cloruro de butilo y el
diclorometano.
Los disolventes éteres idóneos incluyen: el
dimetoximetano, el tetrahidrofurano, el éter de dietilo, el éter de
dimetilo del etilenglicol, el éter de dietilo del etilenglicol, el
éter de dietilo del dietilenglicol, el éter de dimetilo del
trietilenglicol, éter de etilo y t-butilo o el éter
de metilo y t-butilo.
Los disolventes próticos idóneos incluyen, por
ejemplo pero sin limitarse a ellos: el metanol, etanol,
2-nitroetanol, 2-fluoretanol,
2,2,2-trifluoretanol, etilenglicol,
1-propanol, 2-propanol,
2-metoxietanol, 1-butanol,
2-butanol, alcohol i-butílico,
alcohol t-butílico, 2-etoxietanol,
dietilenglicol, 1-, 2- o 3-pentanol, alcohol
neopentílico, alcohol t-pentílico, monometiléter del
dietilenglicol, monoetiléter del dietilenglicol, ciclohexanol,
anisol, alcohol bencílico, fenol o glicerina.
Los disolventes apróticos idóneos incluye, a
título de ejemplo pero sin limitarse a ellos, la dimetilformamida
(DMF), la dimetilacetamida (DMAC), la
1,3-dimetil-3,4,5,6-tetrahidro-2(1H)-pirimidona
(DMPU), la
1,3-dimetil-2-imidazolidona
(DMI), la N-metilpirrolidona (NMP), la formamida, la
N-metilacetamida, la
N-metilformamida, el acetonitrilo, el sulfóxido de
dimetilo, el propionitrilo, el formiato de etilo, el acetato de
metilo, la acetona, la metiletilcetona, el acetato de etilo, el
sulfolano, la N,N-dimetilpropionamida, la
tetrametilurea, el nitrometano, el nitrobenceno y la
hexametilfosforamida.
Los disolventes básicos incluyen la 2-, 3- o
4-picolina, el pirrol, la pirrolidina, la morfolina,
la piridina y la piperidina.
Los disolventes ácidos idóneos incluyen el ácido
trifluoracético, el ácido acético, el ácido propiónico y el ácido
fórmico.
Los disolventes hidrocarburo idóneos incluyen el
benceno, el ciclohexano, el pentano, el hexano, el tolueno, el
cicloheptano, el metilciclohexano, el heptano, el etilbenceno, el
octano, el indano, el nonano y el naftaleno.
La solución que contiene disolventes orgánicos
puede contener una combinación de disolventes orgánicos y/o una
combinación de disolventes orgánicos y agua. Las combinaciones de
disolventes próticos idóneos con agua pueden incluir, a título de
ejemplo y sin limitarse a ellos, la combinación de
agua-metanol, agua-propanol,
agua-isopropanol y agua-butanol. Las
combinaciones de disolventes apróticos idóneos con o sin agua
incluyen, a título de ejemplo y sin limitarse a ellos, la
combinación de agua-acetonitrilo,
agua-sulfóxido de dimetilo,
metanol-acetonitrilo,
metanol-sulfóxido de dimetilo,
etanol-acetonitrilo y
etanol-sulfóxido de dimetilo.
La cantidad de disolvente orgánico presente en la
invención puede variar en función de la naturaleza y de las
propiedades físicas del componente que quiera extraer del cartílago.
En general, una solución que contenga disolventes orgánicos
contendrá del 1 al 100% en v/v, del 40 al 80% en v/v, por lo menos
el 1% en v/v, por lo menos el 10% en v/v, por lo menos el 25% en
v/v, por lo menos el 50% en v/v, por lo menos el 90% en v/v o por lo
menos el 99% en v/v de disolvente, porcentaje referido al volumen
total de la solución.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona un proceso para la preparación de extractos de cartílago
de tiburón que consta de las etapas siguientes:
a) tratar material de cartílago de tiburón con
una cantidad de solución que contiene disolvente orgánico para
formar una primera mezcla que contenga los componentes solubles de
cartílago de tiburón;
b) separar dicha primera mezcla para formar un
primer extracto líquido que contenga dichos componentes solubles y
una primera masa de sólidos; y
c) eliminar el disolvente orgánico de dicho
primer extracto líquido.
El proceso puede constar además de las etapas
siguientes:
d) eliminar una cantidad suficiente de líquido de
dicho primer extracto líquido para formar una segunda masa de
sólidos, sustancialmente seca;
e) añadir agua a dicha segunda masa de sólidos
para formar una segunda mezcla; y
f) separar dicha segunda mezcla para formar un
primer extracto líquido final y una tercera masa de sólidos.
La primera masa de sólidos, que contiene material
de cartílago de tiburón, puede extraerse una o varias veces más con
una solución orgánica que contenga un disolvente orgánico o agua en
lugar de la solución que contiene disolvente orgánico, con arreglo a
las etapas de a) a c) descritas anteriormente para formar un segundo
y un tercero etcétera extractos líquidos finales que contengan por
lo menos cantidades residuales de componentes solubles de cartílago
de tiburón.
La separación de sólidos y líquidos de la etapa
c) puede realizarse con arreglo a un gran número de métodos ya
conocidos de los expertos en la materia incluidas, a título de
ejemplo y sin limitarse a ellas, la centrifugación, la filtración,
la diafiltración, la ultrafiltración, la microfiltración y la
sedimentación de sólidos y la eliminación del líquido
sobrenadante.
La eliminación del disolvente orgánico, indicada
en la etapa c), puede llevarse a cabo por cualquiera de los muchos
métodos ya conocidos de los expertos en la materia, incluidas, a
título de ejemplo pero sin limitarse a ellas, la evaporación, la
liofilización, la destilación, la desecación, la adición de un
absorbente de disolvente orgánico, la extracción líquido/líquido y
la evaporación en evaporador rotatorio.
El material de tiburón que se utiliza en el
proceso puede ser un sólido, por ejemplo, en forma de polvo, de
granulado, de varillas o de partículas. Antes o durante la etapa a)
puede homogeneizarse el material de tiburón. Tal como se emplean en
esta descripción, los términos "homogeneizar" y
"homogeneización" indican un proceso para aumentar la eficacia
de la extracción de los componentes deseados del material de
cartílago, ya sea a) aumentando el área de la superficie total o
específica del material de cartílago, ya sea b) facilitando la
liberación de los componentes deseados del material de cartílago. La
homogeneización puede llevarse a cabo por uno o varios medios
químicos, medios físicos o combinaciones de ambos.
Los medios químicos de homogeneización de
material de cartílago incluyen uno o varios agentes químicos que
hinchen el material de cartílago, disgreguen o lisen las células o
la matriz extracelular del material del cartílago y/o aumenten la
porosidad del material de cartílago. Los ejemplos típicos no
limitantes de dichos agentes químicos incluyen los detergentes, los
tensioactivos, los agentes iónicos, los agentes no iónicos, los
reductores, los quelantes, los agentes glicosilantes, los agentes
caotrópicos, la urea, la guanidina, los fosfolípidos, los
glicolípidos, el ditiotreitol, el
\beta-mercaptoetanol, el laurilsulfato sódico, la
solución de tritón y otros agentes conocidos de los expertos en la
materia o descritos por ejemplo "A Guide to the Properties and
Uses of Detergents in Biology and Biochemistry", cuya autora es
Judith Neugebauer (Calbiochem-Novabiochem
Corporation, 1988).
Los medios físicos de homogeneización de material
de cartílago producirán en general una reducción del tamaño medio de
partícula del material de tiburón, aumentando de este modo el área
de la superficie específica. La reducción del tamaño de partícula
puede lograrse por uno o varios de los métodos siguientes, citados a
modo de ejemplo: la pulverización, la micronización, la molienda, el
esmerilado, el desmenuzado (trituración), el mezclado a gran
velocidad y otros métodos ya conocidos de los expertos en la materia
para reducir el tamaño de las partículas.
Las soluciones de extracción pueden contener
agentes que mejoren la extracción que permiten extraer mayor
cantidad de los componentes del cartílago. Estos agentes de mejoran
la extracción pueden incluir ácidos inorgánicos u orgánicos, bases
inorgánicas u orgánicas, polímeros, tampones, sales y otros agentes
similares ya conocidos por los expertos.
Según una forma de ejecución, la extracción de
materiales de bajo peso molecular del cartílago puede realizarse de
este modo:
a) tratar el material homogeneizado de cartílago
de tiburón (1 kg) con metanol (1 kg) para formar una primera mezcla
que contenga los componentes solubles de cartílago de tiburón;
b) centrifugar dicha primera mezcla para formar
un primer extracto líquido que contenga dichos componentes solubles
y una primera masa de sólidos;
c) evaporar el metanol de dicho primer extracto
líquido;
d) evaporar una cantidad suficiente de líquido de
dicho primer extracto líquido para formar una segunda masa de
sólidos sustancialmente seca;
e) añadir agua (1 kg) a dicha segunda masa de
sólidos para formar una segunda mezcla; y
f) centrifugar dicha segunda mezcla para formar
un primer extracto líquido final y una tercera masa de sólidos.
Las anteriores etapas c) y d) pueden combinarse
eventualmente para pasar directamente del primer extracto líquido a
la segunda masa de sólidos.
Todos los extractos líquidos resultantes de las
extracciones y extracciones reiteradas de cartílago de tiburón de
las etapas anteriores se analizan para determinar su contenido en
peso seco y concentraciones de proteína (que se determina mediante
un ensayo Bradford estándar de proteínas), que es un indicativo de
la recuperación de los componentes solubles. Se evalúa también la
actividad anti-MMP. El ensayo EIG se realiza en 40
\mul de muestras concentradas 20X. Los resultados se recogen en la
tabla 1.
Tal como se utiliza en la tabla 1, "CTRL"
(muestra de control) indica un extracto líquido final obtenido
cuando se emplea agua purificada como disolvente de extracción. El
término "SU-MET" indica un extracto líquido
final, obtenido cuando se emplea metanol como solución que contiene
un disolvente orgánico. El término "SU-ETH"
indica un extracto líquido final, obtenido cuando se emplea etanol
como solución que contiene un disolvente orgánico. Los sufijos
"S1", "S2" y "S3" indican un primer extracto líquido
final, un segundo extracto líquido final y un tercer extracto
líquido final, respectivamente, empleando los disolventes indicados
como soluciones que contienen disolvente o bien agua purificada.
Los resultados demuestran que para recuperar
componentes biológicamente activos del cartílago de tiburón,
provistos de actividad por lo menos anti-MMP, pueden
utilizarse tanto soluciones acuosas como no acuosas que contengan
disolventes orgánicos. Es más, la actividad residual puede extraerse
por reextracciones sucesivas de partículas sólidas del cartílago de
tiburón. No existe una correlación directa aparente entre la
actividad anti-MMP y la cantidad de material
aislado, como se constata por análisis del peso seco y la
recuperación de proteína.
Según la primera forma de ejecución del proceso
de la invención se obtiene el primer extracto líquido en bruto con
agua en una proporción entre cartílago (C) y agua purificada (E) de
aproximadamente 1 kg a 1 litro. El proceso de recuperación de los
componentes consta de las etapas siguientes:
a) homogeneizar el cartílago de tiburón en
solución acuosa hasta que el cartílago quede reducido a partículas
sólidas que tengan un tamaño medio de menos de 500 \mum para
formar un material homogeneizado;
b) equilibrar dicho homogeneizado para extraer
los componentes biológicamente activos en dichas soluciones acuosas
para formar una primera mezcla que contenga una primera masa de
sólidos y un primer extracto líquido (EL) que contenga dichos
componentes biológicamente activos;
c) separar dicho primer extracto líquido de dicha
primera masa de sólidos;
d) someter dicho primer extracto líquido a un
procedimiento de separación para formar un segundo extracto líquido
que contenga moléculas de cartílago con un peso molecular inferior a
500 kDa (EL-0-500);
e) filtrar dicho segundo extracto líquido a
través de una membrana de microfiltración que tenga una porosidad
nominal de 0,22 micras para formar un extracto líquido final
(P-C1-E1 que es sustancialmente
equivalente a la fracción 0-500).
El presente procedimiento se ha llevado a la
práctica empleando las siguientes proporciones entre cartílago y
agua:
| Nombre de fracción | Cantidad de cartílago (kg) | Cantidad de agua purificada (l) |
| *P-C3-E1 | 3 | 1 |
| P-C2-E1 | 2 | 1 |
| P-C1-E1 | 1 | 1 |
| P-C1-E2 | 1 | 2 |
| P-C1-E3 | 1 | 3 |
| *P indica el líquido permeado formado durante la separación. |
Se analiza el contenido en peso seco (sólidos) de
los primeros extractos líquidos obtenidos según los procedimientos y
su actividad anti-MMP. Los resultados se recogen en
la tabla 2.
| Fracción ensayada | Pesos secos (mg/ml) | Conc. proteína (\mug/ml) | EIG* (inhibición, en %) |
| P-C3-E1 | 25,2 | 482,5 | 55 |
| P-C2-E1 | 22,1 | 379,4 | 52 |
| P-C1-E1 | 15,0 | 324,3 | 54 |
| P-C1-E2 | 9,9 | 191,5 | 32 |
| P-C1-E3 | 6,3 | 157,8 | 24 |
| *El EIG se realiza en partes alícuotas de 30 \mul de muestras concentradas 20X. |
Estos resultados indican que por cada kilogramo
de material de partida de cartílago de tiburón pueden recuperarse 20
g de componentes solubles. La recuperación máxima de componentes
solubles en las condiciones indicadas es de 19,8 (9,9 x 2) y 18,9
(6,3 x 3) g de componente soluble por cada kg de cartílago de
tiburón (P-C1-E2 y
P-C1-E3, respectivamente).
Estos resultados indican además que el contenido
en peso seco, el contenido en proteína así como los componentes que
poseen actividad anti-MMP pueden recuperarse con
eficacia empleando diferentes proporciones entre cartílago y agua
purificada.
La primera masa sólida recuperada de la
extracción P-C1-E1 se reextrae dos
veces más empleando la misma proporción entre cartílago y agua
purificada para recuperar las cantidades residuales de componentes
contenidos en el cartílago. El proceso de extracción repetida de la
primera masa de sólidos consta de las etapas siguientes:
f) tratar dicha primera masa de sólidos
recuperada de la etapa c) con agua purificada para formar una
segunda mezcla que se separa para formar un segundo extracto líquido
(P-C1-E1-2) y una
segunda masa de sólidos, dicho segundo extracto líquido puede
tratarse con arreglo a las etapas d) y e); y eventualmente
g) repetir la etapa f) con dicha segunda masa de
sólidos para formar un tercer extracto líquido
(P-C1-E1-3) y una
tercera masa de sólidos, en la que dicho tercer extracto líquido
puede tratarse con arreglo a las etapas d) y e).
En la tabla 3 se recogen la cantidad de agua y de
cartílago de tiburón que se emplean en las anteriores etapas de a) a
g).
| Nombre de fracción | Cantidad de cartílago (kg) | Cantidad de agua purificada (l) |
| P-C1-E1 | 1 | 1 |
| P-C1-E1-2 | masa de sólidos después de recuperar | 1 |
| el P-C1-E1 | ||
| P-C1-E1-3 | masa de sólidos después de recuperar | 1 |
| el P-C1-E1-2 |
Se analiza el contenido en peso seco de todos los
extractos líquidos resultantes del procedimiento anterior así como
su concentración de proteína y su actividad
anti-MMP. Los resultados se recogen en la tabla
4.
| Fracciones ensayadas | Pesos secos (mg/ml) | Conc. de proteína (\mug/ml) | EIG* (inhibición, en %) |
| P-C1-E1 | 15,0 | 324,3 | 54 |
| P-C1-E1-2 | 4,3 | 54,5 | 21 |
| P-C1-E1-3 | 1,3 | 27,0 | 17 |
| *El EIG se realiza en partes alícuotas de 30 \mul de muestras concentradas 20X. |
Estos resultados indican que una o varias
extracciones de cartílago de tiburón según las anteriores etapas de
a) a c) pueden traducirse en una mayor recuperación de componentes
solubles de cartílago de tiburón. Además, después de una segunda y
una tercera extracción de las mismas partículas sólidas todavía
pueden extraerse cantidades residuales de componentes que poseen
actividad anti-MMP.
Los expertos en la materia comprenderán
fácilmente que se pueden introducir modificaciones en los parámetros
de extracción, por ejemplo la temperatura, el número de extracciones
o el disolvente de la extracción, por ejemplo, para optimizar las
cantidades de sólidos, proteínas y componentes biológicamente
activos que pueden recuperarse.
La fracción 0-500 es un extracto
líquido de cartílago de tiburón que consta de componentes que tienen
peso moleculares inferiores a 500 kDa. Los métodos preparativos para
obtener la fracción 0-500 se describen en las
publicaciones de patente internacional nº WO 95/32722, WO 96/23512 y
WO 97/16197. Estos métodos de la técnica anterior constan de las
etapas siguientes:
a) homogeneizar el cartílago de tiburón en una
solución acuosa en condiciones compatibles con la preservación de la
integridad de los componentes biológicamente activos presentes en el
cartílago mientras el cartílago se reduce a partículas sólidas, cuyo
tamaño es inferior a 500 \mum;
b) extraer dichos componentes biológicamente
activos en dicha solución acuosa que da lugar a una mezcla de
partículas sólidas y de un extracto líquido (EL) en bruto que
contiene dichos componentes biológicamente activos;
c) separar dicho extracto líquido de dichas
partículas sólidas;
d) seguir separando el extracto líquido en bruto
de modo que se obtenga un extracto líquido final que contenga
moléculas de peso molecular inferior a 500 kDa
(EL-0-500); y
e) filtrar el
EL-0-500 a través de una membrana de
microfiltración (0,22 micras) y congelar para obtener el extracto
líquido final (fracción 0-500).
La fracción 0-1 es un extracto
líquido de cartílago de tiburón que contiene componentes de peso
molecular inferior a 1 kDa.
La fracción 1-500 es un extracto
líquido de cartílago de tiburón que contiene componentes de peso
molecular comprendido entre 1 y 500 kDa. Las fracciones
0-1 y 1-500 de extracto de cartílago
de tiburón se obtienen mediante un sistema de ultrafiltración
empleando una membrana de peso molecular nominal de corte de 1 kDa.
Empleando este sistema se obtienen las dos fracciones de cartílago
después de un ciclo de purificación (un ciclo de purificación se
define como la interrupción de la etapa de purificación cuando se ha
recuperado el 50% del líquido permeado). La fracción
1-500 comprende el material retenido (R) que, cuando
se reconstituye con agua purificada en un volumen final equivalente
al volumen original del extracto de cartílago empleado para la
purificación, contiene componentes de peso molecular comprendido
entre 1 y 500 kDa en una concentración 1X y componentes de peso
molecular inferior a 1 kDa en una concentración 0,5X con respecto al
extracto original empleado para la purificación. La fracción
0-1 consta del líquido permeado (P) que se compone
únicamente de componentes de peso molecular inferior a 1 kDa en una
concentración de 1X. Empleando el sistema de ultrafiltración se
sigue purificando la fracción 1-500 mediante ciclos
adicionales, que se recogen en la tabla 5.
Se preparan múltiples partidas de fracciones
0-1 y 1-500 con arreglo a los
procedimientos anteriores. Con el fin de reducir al mínimo la
formación de agregados y de mejorar la disolución y el mantiene de
una forma soluble estable se utilizar como estabilizante de la
extracción un 1% en p/v de solución acuosa de sucrosa.
Se obtienen las fracciones 0-1 y
1-500 preparando en primer lugar una partida de
extracto líquido de la fracción 0-500 con arreglo a
los métodos de la técnica anterior, descrito anteriormente y en
segundo lugar añadiendo las etapas nuevas siguientes:
e) preparar eventualmente el extracto líquido
EL-0-500 con una solución que
contenga sucrosa hasta un concentración final del 1% (p/v) para
formar la fracción EL-0-500 con un
1% de sucrosa;
f) filtrar el extracto líquido
EL-0-500 o el
EL-0-500 con un 1% de sucrosa a
través de una membrana que tenga un corte nominal de pesos
moleculares en 1 kDa para formar extractos líquidos que contengan
moléculas de cartílago de peso molecular inferior a 1 kDa
(Pn-0-1 y fracción
Pn-0-1 con un 1% de sucrosa,
respectivamente, en las que "n" indica el ciclo de purificación
según la tabla 5) y para formar extractos líquidos de material
retenido (Rn-0-1 y fracción
Rn-0-1 con un 1% de sucrosa,
respectivamente, en los que "n" indica el ciclo de purificación
de la tabla 5) que contengan moléculas de cartílago de peso
molecular mayor que 1 kDa; y
g) microfiltrar los materiales retenidos y los
extractos de líquidos permeados a través de una membrana de
microfiltración que tenga una porosidad de 0,22 micras.
El procedimiento anterior se lleva a cabo sin
incluir la etapa e) con el fin de obtener extractos que estén libres
de sucrosa. Los extractos de líquido retenido pueden ultrafiltrarse
en uno o varios, con preferencia en cuatro o más ciclos de
purificación para formar extractos adicionales líquidos filtrados
que contengan componentes de cartílago de peso molecular inferior a
1 kDa (de P1-0-1 a
P6-0-1) y para formar extractos de
retenidos que tengan componentes de cartílago de pesos molecular
comprendidos entre 1 y 500 kDa
(R6-1-500 y
R6-1-500 con un 1% de sucrosa). Los
extractos líquidos pueden congelarse eventualmente para su
almacenaje.
Se utiliza por tanto el procedimiento recién
descrito para obtener los extractos líquidos siguientes:
1) fracción 0-500 obtenida a
partir del EL-0-500
2) fracción 0-500 con un 1% de
sucrosa, obtenida a partir del
EL-0-500 con un 1% de sucrosa
3) fracción 0-1 obtenida a partir
de P1-0-1
4) fracción 0-1 con un 1% de
sucrosa, obtenida a partir del
P1-0-1 con un 1% de sucrosa
5) fracción 1-500 obtenida a
partir de R6-1-500
6) fracción 1-500 con un 1% de
sucrosa, obtenida a partir de
R6-1-500 con un 1% de sucrosa.
La segunda masa de sólidos obtenida de la
separación de la segunda mezcla que se forma durante el tratamiento
de la primera masa de sólidos con agua puede extraerse repetidamente
con agua para recuperar cantidades adicionales de fracción soluble
de cartílago de tiburón.
Se analiza el peso seco y el contenido en
proteína de los extractos líquidos obtenidos con arreglo al
procedimiento anterior. Además se determinan la actividad
anti-MMP y las actividades antiangiogénicas y
antitumorales de cada fracción. Los resultados se recogen en la
tabla 6.
* El EIG se realiza en partes alícuotas de 30
\mul de muestras concentradas 20X
Los resultados analíticos demuestran que tanto la
fracción 0-1 como la misma fracción con un 1% de
sucrosa, a pesar de contener más del 90% del contenido recuperado en
peso seco, contienen cantidades muy bajas, casi indetectables de
proteínas.
Sin embargo, la actividad
anti-MMP se observa tanto en la fracción
0-1 como en la fracción 1-500,
sugiriendo que 1) por lo menos un componente no proteico es el que
despliega esta actividad y 2) más de un componente puede tener
actividad anti-MMP. El componente activo puede ser y
puede no ser de naturaleza proteica o peptídica.
Además, la actividad antiangiogénica, determinada
con arreglo al ensayo EVE, se observa exclusivamente en la fracción
0-1. Hay que notar que la presencia de sucrosa
provoca una leve recuperación de la actividad antiangiogénica en la
fracción 1-500 en el 1% de sucrosa.
El tratamiento de animales, inoculados con
células tumorales M27 (CPL), se traduce en una reducción
significativa del número de nódulos metastásicos visibles
macroscópicamente en la superficie del pulmón. Tanto la fracción
0-1 como la fracción 0-500 inducen
una reducción significativa del número de nódulos metastásicos (un
30%). Sin embargo, la fracción 1-500 es menos activa
que las fracciones 0-1 y 0-500,
sugiriendo que un componente activo de la fracción
0-1 es el que despliega por lo menos una parte de
esta actividad antitumoral. Estos resultados sugieren además la
presencia de otro componente antitumoral en la fracción
1-500. Unos grupos adicionales de animales se tratan
con las mismas fracciones de pesos moleculares que contienen un 1%
en p/v de sucrosa. Aunque los inventores presentes no han observado
ninguna diferencia significativa entre los grupos, existe con todo
una tendencia entre las fracciones de peso molecular elevado a ser
más activas en presencia de sucrosa (ver tabla anterior). Los
inventores presentes no han observado disminución alguna de peso
corporal en los animales, lo cual sugiere la ausencia de toxicidad
en los extractos de cartílago para el modelo CPL.
Habiendo encontrado que un gran número de
componentes provistos de actividades biológicas útiles están
presentes en la fracción 0-500 y más concretamente
en la fracción 0-1, la etapa siguiente consistió en
aislar los componentes activos de las mismas.
Se han desarrollado cuatro procedimientos
distintos para aislar y purificar los componentes provistos de
actividad anti-MMP de la fracción
0-500.
Procedimiento
1
Etapa
1
Se liofiliza y reconstituye la fracción
0-500 obtenida por el procedimiento descrito
anteriormente (hasta una concentración 20 veces mayor con respecto
al volumen original) en agua purificada. Se somete el material
reconstituido a ultrasonidos durante 15 minutos para optimizar la
solubilización de los componentes biológicamente activos. Después
del procedimiento de separación, por ejemplo la centrifugación a
2200 rpm durante 10 min a 4ºC, se guarda el líquido sobrenadante
para su purificación posterior.
Etapa
2
Se realiza una cromatografía de adsorción
empleando una columna de extracción de fase sólida
(SPE-C18 neutra).
Una columna SPE con 500 mg de relleno de
adsorbente C18 (Supelco nº 5-7012, dimensión: 3 cc)
se acondiciona dos veces en 2 ml de metanol (100%) y tres veces en 2
ml de agua purificada. Se carga en la columna un ml de extracto de
cartílago reconstituido 20X. Las perlas o bolas de adsorbente se
lavan con 1,5 ml de agua purificada y se eluyen los componentes
provistos de actividad anti-MMP con dos porciones de
2,5 ml de agua purificada que se combinan para formar el primer
eluido.
Aproximadamente el 50% de la actividad
anti-MMP inicial se recupera en el primer eluido. El
restante 50% se pierde durante las etapas de carga y lavado de la
columna. Las condiciones neutras parece por tanto que proporcionan
una retención débil de los componentes provistos de actividad
anti-MMP. La débil retención de los componentes
mientras se utiliza este medio cromatográfico es un indicativo del
carácter polar o iónico de los componentes.
Etapa
3
Después de repetir el proceso anterior durante un
gran número de veces con varias muestras de extracto de cartílago
reconstituido 20X, se reúnen los primeros eluidos respectivos y se
concentran por evaporación en una centrífuga Speed Vac. Se
reconstituyen los sólidos obtenidos de los mismos en agua purificada
hasta una concentración 200 veces mayor con respecto al volumen
original de la fracción 0-500 utilizada. Después de
someter a ultrasonidos y centrifugar se guarda el líquido
sobrenadante para la siguiente etapa de purificación.
Etapa
4
Se realiza en condiciones neutras una separación
por cromatografía HPLC semipreparativa de baja resolución de los
componentes biológicamente activos, presentes en el líquido
sobrenadante. Se emplea una columna Novapack C18HR (7,6 x 300 mm;
Waters). La fase móvil que se utiliza es de fosfato sódico (0,01 M,
pH 7)/metanol (92:8). El caudal y la temperatura se mantienen en 2
ml/minuto y 30ºC, respectivamente. La fracción reconstituida 200X
anterior (100 \mul) se inyecta en la columna y se recogen
fracciones de 2 ml empleando condiciones de elución isocrática y una
detección UV (205 nm). La duración de la cromatografía es de 30
minutos. Se encuentran los componentes provistos de actividad
anti-MMP en las fracciones de eluido
correspondientes a las que tiene un tiempo de retención de 11 a 13
minutos.
Etapa
5
Se repite la etapa 4 con varias partes alícuotas
de 100 \mul de la fracción reconstituida de 200X y se reúnen las
fracciones de eluido deseadas, se concentran por evaporación, se
reconstituyen en agua purificada, a una concentración 500X con
respecto al volumen original de la fracción 0-500
empleada, se someten a tratamiento de ultrasonidos y se centrifugan.
Se guarda el líquido sobrenadante para la siguiente etapa de
purificación.
\newpage
Etapa
6
Con el líquido sobrenadante obtenido en la etapa
5 se realiza una cromatografía HPLC semipreparativa de alta
resolución en condiciones neutras. El procedimiento empleado para la
HPLC semipreparativa de alta resolución es igual a la de la etapa 4,
excepto en que como fase móvil se emplea tampón fosfato (0,01 M, pH
7)/metanol (97:3). Se encuentran los componentes provistos de
actividad anti-MMP en las fracciones de eluido
correspondientes a las que tienen un tiempo de retención entre 23 y
27 minutos.
Etapa
7
Se repite la etapa 6, se recogen las
correspondientes fracciones de eluido que contienen los componentes
activos y se evapora el disolvente, obteniéndose un residuo
sustancialmente sólido, se reconstituye el residuo en agua, hasta
una concentración de 500 a 2000X con respecto al volumen original de
la fracción 0-500 empleada y se somete a tratamiento
de ultrasonidos y se centrifuga y se guarda para el posterior
análisis de peso molecular y la posterior determinación de su
actividad anti-MMP. Al componente biológicamente
activo se le da el nombre de "Æ-986".
Procedimiento
2
Se constata que en general se logra una mejor
retención del Æ-986 en el medio de cromatografía en fase C18 a pH 3.
Por lo tanto se modifica el procedimiento SPE (anterior etapa 2) y
el sistema cromatográfico semipreparativo (etapa 4 y 6 anteriores).
Las condiciones posteriores permiten utilizar una solución de lavado
más fuerte en el procedimiento SPE, resultando de ello un extracto
final más limpio y la eliminación de una de las etapas de
purificación semipreparativa (etapa 4 del procedimiento 1).
Se repiten por ejemplo las etapas de 1 a 3 del
procedimiento 1. La etapa 4 se sustituye por la siguiente:
Etapa
4
Se utiliza la misma columna SPE
C-18 empleada en la anterior etapa 2, pero el medio
cromatográfico se acondiciona tres veces con 2 ml de formiato
amónico (0,01 M, pH 3). Se carga en la columna un ml de extracto
reconstituido 200X, obtenido en la etapa 3 (pH ajustado a 3 con
ácido fórmico antes de cargar las muestras). Se lava el lecho
adsorbente tres veces con 2 ml de formiato amónico/metanol (90:10, a
pH 3). La elución del Æ-986 se efectúa con 1 ml de metanol (100%).
Los expertos en la materia comprenderán fácilmente que las
fracciones obtenidas por elución metanólica de la columna contienen
agua. Por consiguiente, el disolvente de elución de esta etapa puede
ser otro disolvente orgánico, con preferencia un disolvente orgánico
polar y/o miscible con agua, y el disolvente eluyente puede contener
agua.
Etapa
5
Se repite la etapa 5 del procedimiento 1, excepto
en que la concentración de la fracción anti-MMP
reconstituida es de 4000X.
Etapa
6
Esta etapa es idéntica a la etapa 6 del
procedimiento 1, excepto en que la fase móvil es formiato
amónico/metanol (75:25, pH 3).
Etapa
7
La etapa 7 es la misma que la etapa 7 del
procedimiento 1, excepto en que se mantiene la concentración de
4000X descrita en la etapa 6 precedente.
Procedimiento
3
Este procedimiento es básicamente igual que el
procedimiento 2, excepto en que en la etapa 6 se cambia el pH del
tampón formiato de ácido (pH 3) a neutro (pH 7).
Procedimiento
4
En este procedimiento de purificación se emplea
una fase móvil ácida desde el principio.
Etapa
1
El pH de la fracción 0-500
original (en una concentración 1X) se ajusta a pH 3 con ácido
fórmico y después se centrifuga durante 10 minutos a una velocidad
de 2200 rpm. Se utiliza el líquido sobrenadante en la etapa 2.
\newpage
Etapa
2
Se carga el líquido sobrenadante en un cartucho
SPE C-18 (Supelco # 5.-7136; dimensión: 60 cc,
relleno: 10 g de soporte de fase sólida) que se ha acondicionado
previamente en condiciones ácidas. Se acondiciona la columna con 120
ml de metanol (100%) y 120 ml de ácido fórmico (0,01 M, pH 3). Se
cargan en la columna quinientos ml de extracto de cartílago 1X
acidificado y se eluyen con seis volúmenes de 100 ml de ácido
fórmico (0,01 M, pH 3)/metanol (90:10). Los componentes
biológicamente activos se obtienen en las fracciones de eluido 3, 4
y 5.
Etapa
3
Se reúnen las fracciones eluidas 3, 4 y 5 de la
etapa 2 y se evapora el disolvente hasta casi sequedad. A
continuación se diluyen las fracciones hasta una concentración de
4000X del original, para formar una solución que contiene Æ-986.
Etapa
4
Se purifica el Æ-986 en una columna HPLC
preparativa en tampón ácido fórmico, pH 3. Se acondiciona la columna
(Prodigy OSD-prep, 10u, 250 x 50 mm, de Phenomenex)
y se hace funcionar a temperatura ambiente. La composición de la
fase móvil es ácido fórmico (0,01 M, pH 3)/metanol (70:30) y el
caudal de 45 ml/min. Se inyectan en la columna cuatro ml de la
fracción SPE C-18 de concentración 4000X y se eluyen
en la columna en modo isocrático, empleando una detección UV (205
nm). Se recogen las fracciones a intervalos de un minuto durante 60
minutos. Se eluyen las fracciones del Æ-986 que tiene actividad
anti-MMP entre los 33 y los 36 minutos.
Etapa
5
Se reúnen las fracciones provistas de actividad
anti-MMP y se concentran por evaporación,
obteniéndose una fracción de concentración 10000X.
Etapa
6
Esta etapa es idéntica a la etapa 6 del
procedimiento 2, salvo en que la fase móvil es ácido fórmico (0,01
M, pH 3)/metanol (75:25). Se cargan en la columna partes alícuotas
de quinientos \mul de la fracción de concentración 10000X. Se
eluyen los componentes provistos de actividad
anti-MMP entre 21 y 23 minutos.
Etapa
7
La etapa 7 es la misma que la etapa 7 del
procedimiento 1. Se alcanza la misma concentración 4000X que en la
etapa 6 precedente.
Los inventores presentes demuestran por primera
vez que una fracción purificada por HPLC (la fracción resultante del
procedimiento 1 descrito anteriormente) tiene componentes provistos
de actividad anti-MMP. Los componentes purificados
de este modo tienen actividad antitumoral, como se demuestra con el
modelo CPL "in vivo" descrito anteriormente. Se
determina la actividad antitumoral tratando animales con 3
concentraciones distintas de la fracción purificada por HPLC. Se
observa una curva de respuesta a las dosis en forma de campana, con
una eficacia máxima en torno al 50% (p < 0,005) para la dosis de
concentración 2,5X (la concentración se basa en una recuperación del
100% durante las etapas de purificación y se refiere al volumen
original del extracto de cartílago).
Dado que la actividad angiogénica y de
metaloproteasa de matriz están íntimamente relacionadas con la
proliferación tumoral y la progresión de las metástasis, la fracción
purificada por HPLC que contiene un componente
anti-MMP puede desplegar la actividad antitumoral.
Por consiguiente, los componentes provistos de estas actividades son
agentes terapéuticos potenciales para el tratamiento del cáncer
(Tolnay, E. y col., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 123,
652-658, 1997; Skobe, M. y col., Nature Medicine
3, 1222-1227, 1997).
Las fracciones de esta sección se obtienen con
arreglo al procedimiento 4, excepto en que las etapas 2) y 3) se
realizan del modo siguiente.
Etapa
2
Se carga el líquido sobrenadante en un cartucho
SPE C-18 (Supelco # 5.-7012; dimensión: 3 cc,
relleno: 500 g de soporte de fase sólida) que se ha acondicionado
previamente en condiciones ácidas. Se acondiciona la columna con 4
ml de metanol (100%) y 6 ml de ácido fórmico (0,01 M, pH 3). Se
cargan en la columna, lavada tres veces con 1,0 ml de ácido fórmico
(0,01 M, pH 3)/metanol (90:10), diez ml de extracto de cartílago 1X
acidificado y se eluyen los componentes biológicamente activos con
1,0 ml de metanol.
\newpage
Etapa
3
La fracción eluida de la etapa 2, que contiene
los componentes biológicamente activos, se concentra a sequedad.
Después se diluyen las fracciones hasta una concentración 40X o 20X
del original para formar una solución que contiene Æ-986.
Se analiza la actividad anti-MMP
de los extractos líquidos resultantes de este procedimiento. Los
resultados se recogen en la tabla 7.
| Fracciones ensayadas | EIG (inhibición, en %) |
| CTRL-S1* | 57 |
| CTRL-S2* | 16 |
| CRTL-S3* | 4 |
| SU-MET-S1* | 55 |
| SU-MET-S2* | 15 |
| SU-MET-S3* | 0 |
| SU-ETH-S1* | 14 |
| SU-ETH-S2* | 1 |
| SU-ETH-S3* | 0 |
| fracción 0-500** | 64 |
| fracción 0-1** | 56 |
| fracción 1-500** | 16 |
| fracción 0-500 en 1% sucrosa** | 74 |
| fracción 0-1 en 1% sucrosa** | 40 |
| fracción 1-500 en 1% sucrosa** | 16 |
| P-C3-E1* | 57 |
| P-C2-E1* | 60 |
| P-C1-E1* | 46 |
| P-C1-E2* | 39 |
| P-C3-E3* | 17 |
| P-C1-E1-2* | 16 |
| P-C1-E1-3* | 4 |
| * El ensayo EIG se realiza con partes alícuotas de 80 \mul de muestras concentradas 20X | |
| ** El ensayo EIG se realiza con partes alícuotas de 80 \mul de muestras concentradas 40X. |
De este modo, al proceso de la invención
proporciona un método de obtención de fracciones específicas de
cartílago de tiburón, provistas de actividad
anti-MMP. Además, para obtener extractos de
cartílago provistos por lo menos de actividad
anti-MMP pueden utilizarse tanto soluciones acuosas
como soluciones que contengan disolventes orgánicos. Aunque tanto la
fracción 0-500 como la 1-500 tienen
actividad anti-MMP, los componentes
anti-MMP purificados por el procedimiento de la
presente invención están contenidos principalmente en la porción de
0-1 kDa. Se han observado resultados similares en
las fracciones equivalentes que contienen un 1% en p/v de sucrosa.
Finalmente, la actividad anti-MMP puede recuperarse
con eficacia empleando diferentes proporciones entre cartílago y
agua purificada.
Se desarrollan cinco sistemas cromatográficos
multidimensionales para facilitar la determinación del peso
molecular de las fracciones de cartílago de tiburón por
cromatografía líquida (LC) y espectrometría de masas (EM). Cada uno
de los cinco sistemas se presenta en las siguientes tablas de 8 a
12.
Los ensayos consiste en el escaneo EM del líquido
eluido de la columna cromatografía con una división (split) de (7:1)
así como en la recogida de fracciones de la cromatografía CL para su
ulterior utilización en las determinaciones de la actividad
anti-MMP. Esta asociación entre EM y actividad
biológica anti-MMP identifica la fracción eluida y
también el tiempo de retención del compuesto de interés para cada
uno de los sistemas cromatográficos empleados.
Para la detección de iones negativos en la EM se
añade al líquido eluido de la columna una solución de hidróxido
amónico (al 0,75% en v/v a razón de 0,15 ml/min) antes de
introducirlo en la fuente de iones de la EM. El pH resultante de la
mezcla deberá situarse entre 8 y 10, lo cual mejora la formación y
detección de iones negativos en la EM.
Se evalúa la actividad anti-MMP
de las fracciones recogidas.
Se evalúa actividad anti-MMP de
las fracciones recogidas.
(Tabla pasa a página
siguiente)
Se evalúa la actividad anti-MMP
de las fracciones recogidas.
(Tabla pasa a página
siguiente)
Se evalúa actividad anti-MMP de
las fracciones recogidas.
(Tabla pasa a página
siguiente)
Se evalúa la actividad anti-MMP
de las fracciones recogidas.
Los ensayos cromatográficos multidimensionales se
realizan inyectando 100 \mul de 500 a 1000X de la fracción final
fosfato purificada (obtenida en la etapa 7 del procedimiento de
purificación 1). En esta concentración no se detecta una señal
intensa y clara del Æ-986 en el modo de escaneo EM (iones totales).
Los picos de interés se detectan en el seguimiento posterior de
todas las señales iónicas individuales (100-1000
amu) en la región de interés (fracciones activas).
La inyección de las fracciones purificadas con
concentraciones de hasta 2000X presentan un pico pequeño en el
cromatograma de iones totales así como en el cromatograma de picos
de base correspondiente al Æ-986.
En el modo de detección de iones positivos (tabla
13) solamente se detectan con claridad los iones 245 M+1 y 227 en la
región de interés (Æ-986). Por el diseño y por el funcionamiento de
la CL-EM, la observación de iones correspondientes a
la pérdida de una molécula de agua y por el ion molecular (M+1) es
habitual y frecuente para un analito que contenga un grupo funcional
alcohol. El perfil de co-elución de los iones 245
M+1 y 227 así como la diferencia de 18 amu correspondiente a la
pérdida de una molécula de agua (H_{2}O), sugieren con fuerza la
presencia de un componente único de interés, de peso molecular 244,
siendo el 245 equivalente a la especie M+1 en el modo de ion
positivo.
En las figuras de 1 a 4 se presentan ejemplos de
cromatogramas de ion total (TIC) así como cromatogramas de ion único
(m/e 245 M+1) obtenidos por inyección del Æ-986 semipurificado en
distintos sistemas cromatográficos. Los análisis posteriores de
estos cromatogramas indican la presencia del ion 245 (M+1) en cada
una de las fracciones recogidas en los distintos sistemas
cromatográficos, que contienen componentes provistos de actividad
anti-MMP.
En la figura 1 se presenta el cromatograma de ion
total y el cromatograma de ion único (245 M+1) obtenidos por
análisis del Æ-986 aislado en el sistema C18 de HPLC (formiato
amónico neutro, pH 7, modo isocrático). El Æ-986 se detecta en
fracciones recogidas entre 13,5 y 15,0 minutos, correspondientes a
un tiempo de retención de 14,14 minutos para la elución del pico m/e
245 M+1.
En la figura 2 se presenta el cromatograma de ion
total y el cromatograma de ion único (245 M+1) obtenidos por
análisis del Æ-986 aislado en el sistema C18 de HPLC (formiato
amónico ácido, pH 3, elución de gradiente). El Æ-986 se detecta en
fracciones recogidas entre 16,5 y 17,0 minutos, correspondientes a
un tiempo de retención de 16,62 minutos para la elución del pico m/e
245 M+1.
\newpage
En la figura 3 se presenta el cromatograma de ion
total y el cromatograma de ion único (245) obtenidos por análisis
del Æ-986 aislado en el sistema C18 de HPLC (formiato amónico ácido,
pH 3, modo isocrático). El Æ-986 se detecta en fracciones recogidas
entre 16 y 18 minutos, correspondientes a un tiempo de retención de
16,79 minutos para la elución del pico m/e 245 M+1.
En la figura 4 se presenta el cromatograma de ion
total y el cromatograma de ion único (245) obtenidos por análisis
del Æ-986 aislado en el sistema NH2 de HPLC (formiato amónico ácido,
pH 3, elución de gradiente). El Æ-986 se detecta en fracciones
recogidas entre 14 y 16 minutos, correspondientes a un tiempo de
retención de 14,28 minutos para la elución del pico m/e 245.
Solamente en el modo negativo (tabla 14) se
detectan iones 243 y 289 en la región de interés (Æ-986) de todos
los sistemas cromatográficos evaluados. La perfecta
co-elución de estos dos iones sugiere de nuevo la
formación de un aducto formiato del ion 243. Este fenómeno se
observa con frecuencia en iones negativos cuando se emplea como
tampón de la fase móvil el formiato amónico. Esto se demuestra
sustituyendo el tampón formiato amónico por acetato amónico en el
mismo pH. La fase móvil de acetato amónico se alcaliniza después de
la columna con una solución de hidróxido amónico antes de la
detección EM. Ambos sistemas presentan una señal clara para el ion
243, pero el ion 289 solamente se detecta en el sistema formiato y
en el segundo sistema cromatográfico se detecta un nuevo ion (303)
correspondiente al aducto acetato. Por ello se cree que el
componente Æ-986 tiene un peso molecular de 244 amu (243 equivalente
a la especie M-1 en el modo de ion negativo).
(Tabla pasa a página
siguiente)
Determinación de la fórmula empírica por
CL-EM: se emplea la espectrometría de masas para
obtener información relativa a la estructura del Æ-986. En la tabla
15 se recogen las condiciones empleadas en los análisis
CL-EM del Æ-986.
La determinación de la porción isotópica de 247,
246 y 245 se realiza en modo escaneo ampliado (zoom scan) para
aumentar la presión de la lectura de la señal débil de estos iones.
Las porciones isotópicas obtenidas para el ion 246/245 (tipo A+1) y
247/245 (tipo A+2) se representan en la tabla siguiente.
La porción de 5,9% de las alturas de los picos
m/e 247/245 (porción isotópica A+2) sugieren con fuerza la presencia
de un átomo de azufre y pocos átomos de oxígeno en la molécula.
La porción isotópica de 11,8% para los elementos
A+1 (altura de pico m/e 246/245) puede favorecer la hipótesis de la
presencia de hasta 10 carbonos o de una mezcla de carbono, nitrógeno
y azufre (1) en la molécula.
Si el peso molecular es de 244 amu, entonces
solamente es posible la presencia de un número par de átomos de
nitrógeno (0, 2, 4) en la molécula.
Se realiza una elucidación parcial de la
estructura del Æ-986 por espectrometría de masas en tándem.
Los ensayos de espectrometría de masas en tándem
(EM/EM) que se realizan con iones positivos del ion molecular m/e
245 (M+1) indican pérdidas de 18 amu (m/e 227,1) y 36 amu (m/e 209)
(menor). Estas pérdidas corresponden a la pérdida de una o dos
moléculas de agua (-H_{2}O y -2H_{2}O, respectivamente),
indicando la presencia de un resto alcohol y/o un diol en el Æ-986.
El espectro actual EM/EM se presenta en la figura 5.
El ensayo EM/EM realizado con el ion m/e 227 da
lugar a un espectro complejo con muchos fragmentos característicos
de la estructura química del Æ-986. Los fragmentos que se observan
en el espectro pueden ser el resultado de una o dos fragmentaciones
del ion m/e 227 o de la fragmentación de otros iones intensos que
aparecen en el espectro (es decir, el m/e 166 resulta de la
fragmentación del ion 209). Por lo tanto se realizan otros ensayos
EM/EM con fragmentos seleccionados del ion m/e 227. El espectro
EM/EM resultante se presenta en la figura 6.
Un ensayo EM/EM del ion m/e 209
(M+1-2H_{2}O) da lugar a una pérdida de 60 amu,
obteniéndose el m/e 149 que es característico de la pérdida de un
resto ácido carboxílico (-CH_{3}COOH).
A continuación se vuelve a analizar el ion m/e
149 (M+1-2H_{2}O-CH_{3}COOH) por
EM/EM y se obtienen los fragmentos siguientes: m/e 105, 115, 116 y
134. La pérdida de 15, de 149 a 134, se debe muy probablemente a la
pérdida de CH_{3}. Las pérdidas de 33 y de 34 son características
de las pérdidas de SH y H_{2}S que sugieren con fuerza la
presencia de un grupo que contiene azufre (tiol o tioéter) en el
Æ-986. La pérdida de 44, desde m/e 149 a 105, se debe a las pérdidas
de diferentes grupos.
Se somete el Æ-986 a las condiciones empleadas
habitualmente para esterificar ácidos carboxílicos, del modo
descrito seguidamente.
Para metilar las fracciones purificadas, los
inventores presentes concentran por evaporación 15 \mul de una
fracción purificada (4000X) del Æ-986 y le añaden 100 \mul de una
mezcla de HCl (12 N)/MeOH (1:99) en un vial que cierran
seguidamente. Se incuba la mezcla a 45ºC durante
60-90 min, después se concentra por evaporación a
sequedad y se disuelve en 100 \mul de agua. Se inyecta esta
solución en las condiciones cromatográficas utilizadas para elucidar
la estructura por CL/EM.
Para metilar las fracciones purificadas, los
inventores presentes concentran por evaporación 15 \mul de una
fracción purificada (4000X) del Æ-986 y le añaden 100 \mul de una
solución de BF_{3}/metanol en un vial que cierran seguidamente. Se
incuba la mezcla a 45ºC durante 60-90 min, después
se concentra por evaporación a sequedad y se disuelve en 100 \mul
de agua. Se inyecta esta solución con arreglo a las condiciones
cromatográficas empleadas para elucidar la estructura por CL/EM.
Para verificar la recuperación de la
derivatización, los inventores presentes diluyen 15 \mul de una
fracción purificada (4000X) del Æ-986 en 85 \mul de agua. Se
analiza la solución diluida con arreglo a las condiciones
cromatográficas empleadas para la elucidación por CL/EM.
La derivatización del componente Æ-986 con
BF_{3}/metanol o con HCl/metanol a 45ºC durante una hora se
traduce en la desaparición de más del 95% de su señal
cromatográfica, según se constata por la intensidad de la señal en
el tiempo de retención esperado del Æ-986. Estas dos reacciones son
perfectamente conocidas para transformar un ácido carboxílico en su
correspondiente éster metílico. La metilación produce un aumento del
peso molecular del Æ-986 y un aumento de su tiempo de retención en
el sistema cromatográfico. La concentración de los derivados de
Æ-986 obtenidos en los ensayos no permite detectar el producto
derivatizado.
La presencia de un grupo funcional ácido débil,
como es un ácido carboxílico, en el Æ-986 se confirma con el aumento
de su tiempo de retención en la columna C18 de cromatografía HPLC,
cuando el pH del tampón formiato disminuye de 7 a 3. Esto sugiere
con fuerza que en el Æ-986 está presente un resto que posee un pKa
en torno a 4 o más.
Si en el Æ-986 está presente un grupo funcional
tiol o tioéter, como sugieren los datos EM/EM, esto afectará la
recuperación del Æ-986 de la fracción 0-500 y del
cartílago. Es probable que solamente pueda extraerse la porción tiol
libre del Æ-986 con arreglo al proceso descrito, debido a que los
tioles tienden a formar enlaces disulfuro (S=S) con otras moléculas
que contengan azufre (por ejemplo proteínas, péptidos, aminoácidos)
en solución. La formación de un aducto disulfuro altera por lo
general las propiedades físico-químicas de las
moléculas que contienen grupos tiol y afecta su recuperación por
extracción. Es posible que un aducto disulfuro del Æ-986 no pueda
aislarse por extracción directa de la fracción 0-500
(20X). La formación de aductos disulfuro del Æ-986 puede reducirse a
un mínimo tratando las soluciones que lo contienen con
tributilfosfamina a pH 7 y temperatura ambiente durante 15 minutos
antes de efectuar las extracciones, en especial las que se realizan
a pH 3 (SPE C18, pH 3). Para reducir al mínimo la formación de
aductos disulfuro del Æ-986 pueden utilizarse otros reactivos que
rompen el enlace disulfuro, por ejemplo el ditiotreitol o el
\beta-mercaptoetanol.
Los procesos anteriores para la recuperación y el
aislamiento de actividades biológicas del cartílago de tiburón
pueden adaptarse a cualquier fuente de suministro de cartílago (1)
para extraer fracciones provistas de las actividades biológicas
deseadas y (2) para extraer los componentes específicos dotados de
dichos actividades biológicas.
Dado que la presente invención informa de que
pueden extraerse componentes biológicamente activos del cartílago en
un gran número de disolventes hidrófilos, los procesos anteriores
pueden adaptarse a la extracción de componentes biológicamente
activos de cartílagos de diferentes especies. Cualquier componente
aislado de un material de tipo cartílago, con preferencia de
cartílago de tiburón y 1) provisto de un perfil de actividades
biológicas similar o igual al que tiene el componente Æ-986; y/o 2)
provisto de un peso de 244 amu, se considera comprendido dentro del
alcance de la presente invención.
La invención se ha descrito en las páginas
anteriores, con referencia a formas de ejecución específicas. El
experto en la materia comprenderá fácilmente que se pueden
introducir modificaciones sin apartarse del ámbito descrito. Estas
modificaciones están comprendidas dentro del alcance de la invención
que se define en las reivindicaciones adjuntas.
Claims (14)
1. Un proceso para obtener un componente del
cartílago que consta de las etapas siguientes:
a) tratar material de cartílago con una cantidad
de solución que contenga disolvente orgánico para formar una primera
mezcla que contenga un componente soluble de cartílago en dicha
solución, en el que el disolvente orgánico se elige entre etanol y
metanol, y en el que dicho disolvente orgánico está presente en la
solución de extracción en una cantidad comprendida entre el 1 y el
100% en volumen y
b) separar dicha primera mezcla para formar un
primer extracto líquido que contenga dicho componente soluble y una
primera masa de sólidos, en el que dicho componente soluble posee
una o varias actividades elegidas entre actividad
anti-metaloproteasa de matriz, antitumoral y
antiangiogénica.
2. El proceso según la reivindicación 1, que
consta además de las etapas siguientes:
a) eliminar una cantidad suficiente de líquido de
dicho primer extracto líquido para formar una segunda masa de
sólidos, sustancialmente seca;
b) tratar con agua dicha segunda masa de sólidos
para formar una segunda mezcla; y
c) separar dicha segunda mezcla para formar un
extracto líquido final y una tercera masa de sólidos, en el que
dicho extracto líquido final contiene dicho componente soluble.
3. El proceso de la reivindicación 1, que consta
además de la etapa siguiente:
eliminar fundamentalmente todos los disolventes
orgánicos de dicho primer extracto líquido.
4. El proceso de la reivindicación 1, en el que
se separa dicha primera mezcla por uno o varios de los métodos
siguientes: centrifugación, filtración, diálisis y sedimentación de
sólidos, seguidas por la eliminación del líquido sobrenadante.
5. El proceso de la reivindicación 2, en el que
dicha eliminación de líquido se lleva a cabo por uno o varios de los
métodos siguientes: concentración por evaporación, liofilización,
destilación, destilación azeotrópica, desecación, extracción
líquido/líquido, adición de un absorbente de disolventes orgánicos y
evaporación con rotación.
6. El proceso de la reivindicación 1 que consta
además de la etapa siguiente:
homogeneizar dicho material de cartílago antes,
durante o después del tratamiento de dicho material de cartílago con
la solución que contiene disolvente orgánico.
7. El proceso de la reivindicación 6 en el que
dicha homogeneización se realiza mediante uno o varios medios
físicos o químicos.
8. El proceso de la reivindicación 8, que consta
además de las etapas siguientes:
a) tratar dicha primera masa de sólidos con una
cantidad de solución que contenga disolvente orgánico para formar
una segunda mezcla que contenga un componente soluble de cartílago
y
b) separar dicha segunda mezcla para formar un
segundo extracto líquido que contiene dicho componente soluble y una
segunda masa de sólidos.
9. El proceso según la reivindicación 8 que
consta además de las etapas siguientes:
a) tratar dicha segunda masa de sólidos con una
cantidad de solución que contenga disolvente orgánico para formar
una tercera mezcla que contenga un componente soluble de cartílago
y
b) separar dicha tercera mezcla para formar un
tercer extracto líquido que contiene dicho componente soluble y una
tercera masa de sólidos.
10. El proceso según la reivindicación 9 que
consta además de la etapa siguiente:
reunir dichos primer, segundo y tercer extractos
líquidos para formar un extracto líquido total.
11. El proceso de la reivindicación 1, en el que
dicho componente soluble se aisla de dicho primer extracto
líquido.
12. El proceso según una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 11, en el que dicho material de cartílago es
cartílago de tiburón.
13. Un componente biológicamente activo que puede
obtenerse por el proceso de la reivindicación 12.
14. El uso de un componente biológicamente
activo, definido en la reivindicación 13, en la fabricación de un
medicamento que posea por lo menos una de las actividades
siguientes: actividad antimetaloproteasa de matriz, actividad
antiangiogénica y actividad antitumoral.
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