ES2208121B1 - Anticuerpos y antigenos inmovilizados sobre particulas magneticas de silice como biosensores. - Google Patents

Abstract

Anticuerpos y antígenos inmovilizados sobre partículas magnéticas de sílice como biosensores. La presente invención proporciona partículas magnéticas mejoradas adecuadas para la preparación de biosensores consistentes en anticuerpos y antígenos inmovilizados sobre dichas partículas magnéticas. Las partículas magnéticas de la invención son partículas de óxido de hierro con un tamaño de 5 - 30 nm, cargadas en medio básico, que presentar un recubrimiento de sílice de 30 - 100 nm de espesor, caracterizadas porque se han sometido a un tratamiento térmico de 300 a 800ºC durante 1 a 24 horas. Asimismo, la invención proporciona un método para la preparación de dichas partículas magnéticas. Por otro lado, proporciona los biosensores mencionados así como un método de preparación de los mismos. Por último, proporciona un método de uso de dichos biosensores para la identificación y cuantificación de analitos.

Description

Anticuerpos y antígenos inmovilizados sobre partículas magnéticas de sílice como biosensores.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de los biosensores, concretamente a anticuerpos adecuadamente orientados y antígenos inmovilizados sobre partículas magnéticas. En particular, la invención se refiere a la preparación de dichas partículas magnéticas y de dichos biosensores, así como al uso de dichos biosensores para la identificación y cuantificación de analitos.

Antecedentes de la invención

El uso de anticuerpos y antígenos inmovilizados tiene un gran interés en el campo de la clínica y la química analítica. La gran especificidad de los anticuerpos les permite distinguir entre dos moléculas muy similares dentro de mezclas muy complejas, mientras que la inmovilización de antígenos tendrá un gran interés en clínica, por ejemplo para detectar trazas de anticuerpos frente a un antígeno dado.

La técnica más habitual de utilización de anticuerpos y antígenos como biosensores supone su previa inmovilización, por ejemplo en placas multipocillo. Tras añadir a estas placas la muestra, y lavar, se usa un segundo anticuerpo específico para otra zona del antígeno. Este segundo anticuerpo (o de lectura) suele estar marcado con una enzima u otro tipo de señal que permite cuantificar la cantidad de antígeno presente en la muestra. El ejemplo más representativo de este tipo de ensayos son los famosos inmunoensayos enzimáticos ELISA. En estos ensayos, hay varios factores que determinan la señal conseguida como son la cantidad de anticuerpo y antígeno inmovilizada, la cantidad de anticuerpo correctamente orientado, la posibilidad de tener una "colección" de antígenos con diferentes orientaciones sobre el soporte, o el grado de distorsión de la molécula de antígeno o anticuerpo (figura 1).

El principal problema de la metodología ELISA es el límite de volumen a utilizar, del orden de unos pocos microlitros-mililitros de muestra: si se pretenden detectar trazas muy minoritarias de antígeno (p.e., partes por billón), este tipo de ensayos podría no dar la sensibilidad adecuada.

En este contexto, el uso de partículas magnéticas supone un avance significativo (Giaver, US 4,018,886). Unos pocos miligramos de estas partículas magnéticas pueden suspenderse en grandes volúmenes de muestra, y ser recuperadas posteriormente mediante el empleo de un imán, determinándose posteriormente la cantidad de antígeno. Su empleo permite purificar o concentrar trazas muy minoritarias de antígeno contenidas en grandes volúmenes de líquido (litros o incluso metros cúbicos) o mezclas líquido-sólido, de forma que se puede reducir en gran medida el límite de detección. Este tipo de sistemas permite determinar la presencia de antígenos de interés en situaciones donde una detección precoz del antígeno puede ser crítica para evitar efectos muy negativos del mismo: en biomedicina (presencia de trazas muy minoritarias de proteínas relacionadas con procesos tumorales, infecciones, deficiencias genéticas,...), medioambiente (determinación de la presencia de contaminantes, toxinas de origen biológico en aguas de río o marinas,...), alimentación (determinación de la presencia de toxinas o productos peligrosos,...), etc. En todos estos casos, se puede conseguir analizar un volumen de muestra del orden de mililitros o de litros usando apenas unos microgramos de partículas magnéticas, concentrando y purificando de esta forma el antígeno en cuestión entre miles y millones de veces, lo que se podría traducir en un aumento de la sensibilidad de los mismos ordenes de magnitud (figuras 2-4).

Pero en todos los casos, la orientación del anticuerpo será clave as la hora de conseguir buenas señales.

Los ferrofluidos descubiertos por Elmore hace 50 años (Elmore, W.C. Physical Review, 54, 1092, 1938), son suspensiones estables de partículas ferro o ferrimagnéticas con una estrecha distribución de tamaños de partícula. A principios de la década de los 80 se utilizaban materiales de tipo ferrofluído, que empleaban soluciones acuosas de polímeros o proteínas como surfactantes (Molday R.S, MacKenzie, J.Immunol. Meth. 52, 353, 1982). Estos materiales fueron sintetizados basándose en la adsorción de Fe^{3+} o Fe^{2+} en presencia de un polímero o una proteína, para formar magnetita u otro óxido de hierro menos magnético. Uno de los primeros métodos usados para la preparación de ferrofluídos implicaba la utilización de molinos de bolas, pero requerían tiempos de preparación grandes y la distribución de tamaños de partícula obtenida era amplia.

Las partículas que constituyen los ferrofluídos son generalmente "superparamagnéticas", ya que tienen un momento magnético permanente mucho mayor que las paramagnéticas: en ausencia de un campo magnético externo los momentos magnéticos individuales están orientados al azar, mientras que en presencia de un campo magnético, los momentos individuales se orientan paralelos, dando lugar a una fuerte atracción partícula-partícula transmitida a todo el fluido. Si bien es interesante la posibilidad de que las partículas sean concentradas mediante la aplicación de un campo magnético, no es deseable que las interacciones magnéticas entre partículas sean tan fuertes como para promover una orientación colectiva y una posible agregación/coagulación.

Para obtener un ferrofluído estable bajo un campo magnético moderadamente fuerte, es decir, que la fuerza de atracción entre partículas sea menor que la energía térmica asociada a las partículas, estas deben ser muy pequeñas. El limite superior del tamaño de partícula admitido a temperatura ambiente es de \sim3 nm para hierro y \sim10 nm para Fe_{3}O_{4} (magnetita) y su forma oxidada \gamma-Fe_{2}O_{3} (maghemita). Como se ha comentado, si las partículas son demasiado grandes podrían actuar como núcleos de agregación y crecer desestabilizando la suspensión, por lo que es necesario un tamaño pequeño y una distribución estrecha de tamaños de partícula.

Así pues, los ferrofluídos están constituidos por fases estables de materiales que pueden ser desplazados o controlados por gradientes magnéticos. La magnetita de un tamaño adecuado y monodispersa tiene gran aplicabilidad en este campo.

El principal método directo de obtención de nanopartículas magnéticas de magnetita con estrecha distribución de tamaños es en disolución a partir de sales de hierro (Massart R.C.R. Acad. Sci. Paris. Ser. C, 291,1,1980). También se pueden sintetizar nanopartículas magnéticas mediante métodos de vapor como el láser pirólisis (Veintemillas S., Morales M.P., Serna C.J., Materials Letters, 35,151,1998), si bien da lugar a partículas muy dispersas y de muy pequeña saturación, o el método de la llama (Urakavwa T., Nakzawa T., Inoue H., Shirat T., Fluk E.J. Mater. Sci. Letters 15,1237,1996) que origina partículas polidispersas. Recientemente, se ha utilizado una red de sílice para obtener nanopartículas magnéticas pero con una distribución de tamaño demasiado amplia (Del Monte F., Morales M. P, Levy. D, Fernández A, Ocaña M, O'Grady K, Sema C.J. Langmuir 13,3627, 1997).

En el estado de la técnica se conocen varios métodos de síntesis para obtener nanopartículas esféricas de magnetita en disolución. Según uno de dichos métodos, una suspensión de hidróxido férrico es parcialmente oxidada con diferentes agentes oxidantes. Se han obtenido partículas esféricas de magnetita de una estrecha distribución de tamaños entre 30 y 1100 nm mezclando FeSO_{4} con KOH en presencia de ion nitrato y llevando el gel resultante a 90°C por varias horas (Sugimoto. T, Matijevic E.J. Colloid Interface Sci. 74,227, 1980).

Otro método es el método de Massart, que consiste en el envejecimiento de una mezcla de disoluciones de hidróxido ferroso y férrico en medio acuoso (Massart R., Cabuil. V.J. Chem Phys, 84, 967,1987). Con una estequiometría de Fe(II)/Fe(III)=0,5 se forman partículas muy homogéneas en tamaño y composición química. Además se ha observado que ajustando el pH y la fuerza iónica del medio de precipitación, es posible controlar el tamaño medio de las partículas, en un orden de magnitud en el rango de nanómetros (desde 12,5 a 1,6 nm) (Jolivet J.P., Massart R., Fruchard J.M., Nouv. J. Chim. 7,325,1983). Por lo tanto, el tamaño de partículas decrece conforme aumenta el pH y la fuerza iónica. Ambos factores determinan el cambio isostático de la superficie de las partículas y en consecuencia la composición química de la superficie. Por ejemplo, las partículas esféricas de magnetita de 14 a 8 nm pueden ser obtenidas variando la naturaleza de la base usada en la precipitación: NH_{4}(OH), Na(OH) o K(OH) (Jolivet J.P., Massart R., Fruchard J.M., Nouv. J. Chim. 7,325,1983), y la temperatura. Para la precipitación de estas partículas, se añadieron 50 ml de una solución acuosa 0,33 M in FeCl_{2} y 0,66 M en FeCl_{3} a 450 ml de solución básica (1M) bajo fuerte agitación. Un flujo de N_{2} gas se pasa previamente a través de la solución básica para asegurar que el precipitado final esta constituido solamente por magnetita. Las partículas más pequeñas se obtienen si añadimos a la mezcla de sales de hierro una disolución de K(OH) 1M con un 1% (p/p) de poli(alcohol vinílico) (PVA) a temperatura ambiente según el proceso descrito por Lee et al (Lee J, Isobe T, Senna M.J., Colloid Interface Sci. 177,490, 1996).

Las partículas magnéticas de tamaño adecuado, sintetizadas por el método anterior tienen un punto isoeléctrico cercano a 7, lo que las hace muy inestables en solución acuosa. Por lo tanto, es necesario recubrirlas de un compuesto que estabilice la suspensión en agua. El recubrimiento puede estar constituido por sustancias orgánicas, como polímeros y dextrano (Hasegawa, U.S. Pat n° 4,101,435) o inorgánicas, principalmente sílice (Ohmori M., Matijevic E.J., Colloid Interface Science. 150, 594, 1992; y Corradi A.R., Ceresa E.M. IEEE Trans Magn. 15,1068, 1979). El recubrimiento con sílice proporciona una gran estabilidad frente a la agregación, reduce considerablemente las interacciones magnéticas (Qingxia L., Zhenghe X., Frinch J.A., Egerton R., Chem Mater. 10, 3936,1998) y, confiere gran resistencia frente a los tratamientos térmicos (Tartaj P., González-Carreño T., Serna C.J. Adv. Mater. 13, 1620, 2001).

Sin embargo, el recubrimiento con sílice tiene como gran inconveniente la baja resistencia mecánica de la capa de sílice en tanques agitados. Por otro lado, este recubrimiento de sílice podría tener lugar sólo sobre unas pocas partículas magnéticas (agregados de unas 5 partículas) (Philipse A.P., van Bruggen M.P.B, Pathmamanoharan C. Langmuir 10, 92, 1994).

Sorprendentemente, los presentes autores han descubierto que al tratar térmicamente nanopartículas de magnetita obtenidas por el método de Massart recubiertas por una capa de sílice, se consigue aumentar la resistencia mecánica de dicha capa de sílice, obteniéndose así suspensiones de nanopartículas magnéticas mejoradas útiles como soporte para biosensores alternativos.

Objeto de la invención

El objeto de la presente invención, por tanto, es proporcionar partículas magnéticas mejoradas adecuadas para la preparación de biosensores consistentes en anticuerpos y antígenos inmovilizados sobre dichas partículas magnéticas.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para la preparación de dichas partículas magnéticas mejoradas que supere los inconvenientes del estado de la técnica mencionados.

Por otro lado, otro objeto de la invención es proporcionar dichos biosensores, así como un método de preparación de los mismos, solucionando fundamentalmente los problemas de orientación de los anticuerpos.

Por último, otro objeto de la presente invención es proporcionar un método de uso de dichos biosensores para la identificación y cuantificación de analitos.

Descripción de la invención

En un aspecto de la invención, se proporcionan partículas magnéticas de óxido de hierro con un tamaño de 5 - 30 nm, cargadas en medio básico, que presentan un recubrimiento de sílice de 30 - 100 nm de espesor, caracterizadas porque dichas partículas han sido sometidas a un tratamiento térmico de 300 a 800°C durante 1 a 24 horas.

En una realización particular, el óxido de hierro empleado presenta una estructura de espinela (magnetita/maghe-
mita), ya que la magnetita es fácil de sintetizar en tamaños de 5 - 30 nm y tiene propiedades magnéticas apropiadas (Ms = 70 emu/g). Estas partículas se sintetizan por co-precipitación de Fe^{3+} y Fe^{2+} en solución alcalina. Las partículas magnéticas así obtenidas tienen un punto isoeléctrico (i.p.e.) cercano a 7, lo que las hace muy inestables en solución acuosa, además la superficie de las partículas no es fácil de funcionalizar (requisito necesario para que sirvan de soporte en biosensores) y podría ser demasiado reactiva para algunas aplicaciones. Por todo lo anterior es necesario recubrir las partículas con sílice. Dicho recubrimiento da lugar a suspensiones estables en agua (i.e.p \sim3), es resistente químicamente, fácil de funcionalizar y permite recubrir agregados constituidos por 20-50 partículas magnéticas. La gran ventaja de tener recubrimientos de sílice constituidos por 20-50 partículas de magnetita es que son fácilmente atraídos en presencia de un campo magnético. Las partículas así obtenidas se someten a tratamiento térmico entre 300-800°C durante 3 horas con el objeto de "anclar" la capa de sílice sobre las partículas magnéticas, aumentando su dureza y resistencia en sistemas agitados.

Así, en otro aspecto de la invención, se proporciona un método para la preparación de las partículas magnéticas de la invención que comprende las etapas de:

a)

preparación de un polvo de partículas magnéticas de óxido de hierro de 5-30 nm de tamaño,

b)

tratamiento del polvo de partículas de tal forma que las partículas queden cargadas en medio básico,

c)

recubrimiento de las partículas cargadas en medio básico con sílice con un espesor de 30 - 100 nm, y

d)

tratamiento térmico del producto obtenido en la etapa c) a una temperatura de 300 a 800 °C durante 1 a 24 horas.

En una realización de dicho método, el tratamiento de la etapa b) de se lleva a cabo con hidróxido de tetrametil amonio.

En otra realización particular de dicho método, el recubrimiento de las partículas con sílice de la etapa c) se lleva a cabo con ortosilicato de tetraetilo.

En otra realización particular, el método para la preparación de las partículas magnéticas de la invención previamente descrito comprende adicionalmente las siguientes etapas:

a)

tratamiento de las partículas magnéticas de la invención obtenidas mediante el método previamente descrito con un derivado de trietoxisilano, en particular con glicidoxipropil trietoxisilano;

b)

tratamiento del producto obtenido en la etapa a) con etilendiamina; o bien, transformación de los grupos epóxido del producto obtenido en la etapa a) en grupos aldehído, seguida de un tratamiento con etilendiamina (para inmovilizar los anticuerpos via la cadena de azucares oxidada) (figura 5);

c)

tratamiento del producto obtenido en la etapa a) con iminodiacetico y posterior adicción de metales, para inmovilizar los anticuerpos en soportes mixtos epoxido-metalicos por la zona mas rica en His (figura 6).

Tratando las partículas magnéticas de la invención con un trietoxisilano se obtienen silanoles de la sílice cuyos enlaces silano permiten la activación de la superficie de dichas partículas para la inmovilización de proteínas. En concreto, el tratamiento de dichos silanoles de la sílice con dietilamina tiene como objetivo introducir grupos aminados, modificación cuya principal ventaja es que produce unos grupos amino primario de pK muy bajo (del orden de 7), lo que les convierte en grupos químicamente muy reactivos en condiciones de reacción suave, y unos grupos amino secundario de pK relativamente elevado (en torno a 10), que les convierte en buenos intercambiadores
aniónicos.

De este modo, la superficie de las partículas magnéticas queda funcionalizada de tal forma que permite inmovilizar de forma orientada las partículas de antígeno o anticuerpo sobre ella, con las consiguientes ventajas de posibilitar la exposición de diferentes epitopos, o de evitar impedimentos estéricos o distorsiones de la molécula de anticuerpo (que se inmovilizará por los azucares oxidados).

Las partículas magnéticas así obtenidas son estables en suspensión durante un largo periodo de tiempo y se concentran rápidamente en fracciones adecuadas mediante la aplicación de un campo magnético, redispersándose fácilmente al retirar el campo magnético con una suave agitación. Dicha propiedad permite su utilización como biosensores, de acuerdo con lo expuesto previamente.

Así pues, la presente invención proporciona biosensores que consisten en una partícula magnética como la descrita previamente, la cual presenta al menos un tipo de anticuerpo o al menos un tipo de antígeno inmovilizado en su superficie.

En una realización particular, dichos biosensores presentan adicionalmente sobre su superficie una enzima inmovilizada que sea capaz de emitir señales que permitan la cuantificación de las partículas magnéticas capturadas. Preferiblemente, dicha enzima está seleccionada entre el grupo formado por beta galactosidasa, lipasa, penicilina G acilasa y otras hidrolasas.

La co-inmovilización en las partículas magnéticas de una enzima capaz de reconocer un sustrato que libere el mismo tipo de compuesto fácilmente detectable (por absorción en Vis-UV, por flourescencia) coloreado que la enzima ligada al anticuerpo de lectura pero a partir de un sustrato diferente, aprovechando la especificidad de dicha enzima, permite cuantificar exactamente el número de partículas unidas y la señal específica obtenida con esas partículas. Para dicho fin son especialmente útiles la penicilina G acilasa y las galactosidadas puesto que no reconocen los sustratos de forma cruzada. Como alternativa, se podrían usar marcajes fluorescentes con distintas sondas.

En otra realización particular, dichos biosensores presentan un recubrimiento adicional con polímeros heterofuncionales para evitar adsorciones inespecíficas de biomacromoléculas. Preferiblemente, dicho recubrimiento adicional es de dextrano-aspártico-aldehído.

El uso de dichos polímeros dificulta los procesos de adsorción no deseados evitando así la adsorción del anticuerpo de lectura (es decir, la aparición de falsos positivos), o de otras proteínas de la muestra (es decir el enmascaramiento de la adsorción del antígeno). Estos polímeros deberán de ser capaces de unirse selectivamente al soporte sin alterar al anticuerpo único a la partícula magnética.

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona también un método para la preparación de dichos biosensores que comprende la inmovilización de al menos un antígeno o al menos un anticuerpo en la superficie de las partículas magnéticas obtenidas según el método que se ha descrito previamente.

En una realización particular, dicho método para la preparación de los biosensores de la invención comprende adicionalmente la inmovilización de una enzima en la superficie de la partícula que sea capaz de emitir señales que permitan la cuantificación de las partículas magnéticas capturadas. Preferiblemente, dicha enzima está seleccionada del grupo formado por beta galactosidasa, lipasa, penicilina G acilasa y otras hidrolasas.

En otra realización particular, dicho método para la preparación de los biosensores de la invención comprende, además, un tratamiento con polímeros heterofuncionales para evitar adsorciones inespecíficas de biomacromoléculas. Dicho polímero heterofuncional es preferiblemente dextrano-aspártico-aldehído.

En otro aspecto, la presente invención proporciona también el uso de los biosensores de la invención para la identificación y cuantificación de analitos. Para ello, proporciona un método para la identificación y cuantificación de analitos presentes en una muestra líquida, que comprende las siguientes etapas:

a)

puesta en contacto de dicha muestra líquida con los biosensores de la invención de tal manera que los analitos presentes en la muestra líquida interaccionen con dichos biosensores;

b)

recuperación de los biosensores de la muestra líquida mediante la aplicación de un campo magnético local a dicha muestra líquida, de tal forma que los biosensores se adhieran a la superficie de dicho campo magnético local;

c)

cuantificación de los biosensores que han sido recuperados y de los analitos que han interaccionado con dichos biosensores recuperados en la etapa b).

Breve descripción de las figuras

Figura 1- Esquema de la reacción que ocurre entre anticuerpos y antígenos en un inmunoensayo enzimático de ELISA.

Figura 2- Sistema ideal: anticuerpos correctamente orientados sobre partículas magnéticas inertes y coinmovilización con enzimas marcadoras para cuantificar partículas magnéticas.

Figura 3- Esquema representando la orientación correcta e incorrecta del anticuerpo sobre partículas magnéticas inertes.

Figura 4- Esquema representando el proceso de concentración y purificación de un antígeno en una muestra, utilizando anticuerpos inmovilizados sobre partículas magnéticas.

Figura 5- Esquema representando la inmovilización de los anticuerpos a través de sus cadenas glicosiladas sobre soportes aminados y el recubrimiento posterior de la superficie de la partícula con dextranos para hacerla inerte y aumentar la estabilidad de los anticuerpos.

Figura 6- Esquema representando la inmovilización de los anticuerpos a través de la zona más rica en His de la cadena pesada mediante el uso de soporte epoxido-quelato y el tratamiento posterior con dextrano para hacer inerte la superficie de las partículas como en la figura 5.

Figura 7- Esquema de fraccionamiento de la suspensión de nanopartículas de magnetita preparada según la invención.

Figura 8- Variación de la movilidad fónica frente al pH de las partículas magnéticas de la invención.

Figura 9- Estudio de las tres fracciones de la suspensión de nanopartículas de magnetita mediante microscopía óptica

Figura 10- Micrografía realizada por microscopía electrónica de transmisión mostrando la microestructura de las partículas de la fracción útil de la suspensión de nanopartículas de magnetita.

Ejemplos Ejemplo 1 Síntesis de partículas magnéticas

Se prepara una suspensión magnética compuesta por nanopartículas de magnetita (Fe_{3}O_{4}) de tamaño uniforme, recubiertas de una capa de sílice. El recubrimiento de sílice tiene lugar sobre un agregado inicial de partículas magnéticas, resultando en una suspensión magnética con propiedades definidas. Mediante la aplicación de un campo magnético se puede fraccionar la suspensión de partículas Fe_{3}O_{4}/SiO_{2} preparada, de forma que se obtengan fracciones adecuadas para su utilización como biosensores cumpliendo propiedades muy restrictivas: deben ser estables en suspensión durante un largo periodo de tiempo y concentrase rápidamente mediante la aplicación de un campo magnético, redispersándose fácilmente al retirarle el campo magnético con una suave agitación.

Se toman 40 mg de magnetita (Fe_{3}O_{4}) sintetizada por el método de Massart y se muelen en un mortero de ágata hasta conseguir un polvo muy fino. En este mismo mortero se añaden 1,12 mg de hidróxido de tetrametil amonio (OH(CH_{3})_{4} NH_{4}) gota a gota mezclándose bien con la magnetita inicial. Por otro lado se prepara una disolución de 16 ml de H_{2}O y 2 ml de NH_{4} (OH) (29%), que se incorpora al mortero poco a poco, a la vez que se va retirando la suspensión y añade a un matraz Erlenmeyer de vidrio que contiene 50 ml de alcohol isopropílico. Cuando toda la suspensión haya sido depositada en el matraz se añaden otros 250 ml de alcohol con agitación.

Durante este proceso la reacción que tiene lugar se puede expresar como:

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El matraz Erlenmeyer completamente protegido por una película de parafina se sumerge en un baño ultrasónico durante 30 min asegurándose que transcurrido ese tiempo el baño haya adquirido la temperatura de 40 °C. Después de ese tiempo, se añade a la suspensión 0,8 ml de ortosilicato de tetraetilo (TEOS).

La reacción que ha tenido lugar puede expresarse como:

(C_{2}H_{5}O)_{4} Si + H_{2}O \rightarrow SiOH + C_{2}H_{5}OH

Mediante esta reacción las partículas de magnetita se recubren de sílice durante una hora, y posteriormente se baja la temperatura hasta condiciones normales. Con objeto de anclar mas fuertemente la sílice sobre las partículas de magnetita la muestra lavada y seca es sometida a temperaturas entre 300-800°C durante 1-24 horas en atmósfera controlada. En la figura 2 se da la variación de la movilidad iónica frente al pH, mostrándose que la parte externa de las partículas está constituida por sílice. Cuando la suspensión se haya enfriado se filtra por succión a través de un filtro de 0,2 micrómetros, se lava con alcohol isopropílico y a continuación con agua.

El residuo sólido obtenido se dispersa en un tubo con 16 ml de agua y la solución se fracciona de acuerdo con el esquema de la figura 7.

En primer lugar, se hace una separación de la fracción magnética. Para ello, se coloca un imán (1 Tesla) bajo el tubo que contiene la suspensión (1) y se deja reposar hasta que el líquido tenga apariencia blanca. Sin retirar el imán, se decanta el líquido blanco constituido sobre todo por sílice (2). Posteriormente, se repone el líquido decantado con agua. Se coloca el imán en el lateral del tubo, situado mas o menos a la mitad de altura ocupada por el líquido (3), se espera un minuto y sin apartar el imán se decanta el líquido. Esta operación se repite hasta que el líquido que se recoge sea transparente. Esta suspensión recogida constituye la fracción no magnética. (4) Se deja el tubo en reposo durante 10 min, tras lo cual se separan las otras dos fracciones. Se vierte el líquido del tubo en otro tubo acercando en el último momento el imán al fondo del primer tubo para poder retener el sedimento creado durante el reposo. El líquido vertido es la fracción útil (5). El sedimento constituye la fracción gruesa (6). En la figura 9, se muestra un estudio de las tres fracciones mediante microscopía óptica. En la figura 10, se da una micrografía realizada por microscopía electrónica de transmisión mostrando la microestructura de las partículas de la fracción útil.

Ejemplo 2 Capacidad de carga de proteína de las partículas. Inmovilización de proteínas (penicilina G acilasa, PGA) 2.1- Silanización de las partículas magnéticas

-Desecación de las partículas magnéticas: Aproximadamente 10 mg de partículas magnéticas se resuspenden en 5 ml de acetona. Se realizan varios lavados (x3) cuyo objetivo es eliminar el agua de la superficie de la partícula, ya que la silanización se realiza en medio orgánico.

-Tratamiento con \gamma-aminopropiltrietoxisilano: Este se realiza en tolueno. Se resuspenden las partículas en tolueno en presencia de 10% de \gamma-aminopropiltrietoxisilano. Se mantienen a temperatura ambiente durante 24 horas con agitación suave. Posteriormente se procede realizando varios lavados (con volúmenes iguales) para eliminar los disolventes, el primer lavado es con tolueno (x4), benceno (x4), acetona (x4), realizándose varios lavados con agua.

2.2- Activación con glutaraldehído:

Se resuspenden las partículas magnéticas (concentración 10 mg/ml), ya silanizadas, en tampón fosfato 200 mM, pH 8. Se procede a la activación con glutaraldehído al 10% manteniéndose durante una noche (O/N) a temperatura ambiente con agitación suave. Posteriormente se procede a lavados con agua hasta desaparición total del olor a glutaraldehído. Se procede a la incubación con la PGA (prepurificada previamente por varios intercambiadores aniónicos y catiónicos).

Se adicionan aproximadamente 25 ml de PGA (purificada) (300 UE/ml) a las partículas resuspendidas en 25 ml de tampón fosfato 25 mM pH 8. Se mantienen con agitación suave a temperatura ambiente durante 24 horas.

Transcurrido este tiempo se procede a la reducción con borohidruro sódico. Se adicionan a la suspensión aproximadamente 2 ml de tampón carbonato 500 mM pH 10,5, con esto se sube el pH de la suspensión, se le adiciona 1 mg/ml de borohidruro sódico y se mantiene durante 60 min a +4 °C. Luego se realizan varios lavados con tampón fosfato 100 mM pH 7, y con agua. Después se resuspenden en tampón fosfato 25 mM pH 7.

Se consiguen inmovilizar 7000 UI de PGA/g de partícula, lo que sugiere una capacidad de carga muy elevada, derivada del bajo tamaño de las partículas, superior a la capacidad de carga de otras partículas magnéticas comerciales (p.e., 5200 UI en partículas carboxilo-Estapor)

Ejemplo 3 Inmovilización orientada de anticuerpos 3.1- Inmovilización orientada de anticuerpos sobre partículas magnéticas

Se utilizan partículas magnéticas silanizadas según el ejemplo 2 que presentan grupos amino en su superficie. Este grupo amino interaccionará con los grupos carbonilo, generados en la región Fc de la IgG por oxidación con peryodato de los grupos glucídicos presentes en la región Fc del anticuerpo. Se formará una base de Schiff entre el grupo amino y el carbonilo.

La oxidación de las IgG se realiza en las siguientes condiciones:

20 mg/ml IgG antiperoxidasa

+10mM IO_{4}^{-}+

+tampón fosfato 5 mM pH 7.

en agitación magnética a +4 °C durante 90 min.

Posteriormente se procede a realizar una diálisis frente a agua (en una relación de volumen 1/100) para eliminar el formaldehído generado en la oxidación de los grupos de azúcares de la IgG.

Se procede a la inmovilización de las IgG oxidadas sobre partículas silanizadas con grupos amino en su superficie. Esta se realiza en las siguientes condiciones:

5 mg de partículas magnéticas-NH_{2} +

+30 mg/ml de anticuerpo oxidado +

+150 mM Trimetilaminoborano +

+Tampón fosfato 100 mM pH 8 +

con agitación suave a temperatura ambiente, O/N.

Posteriormente se procede a la reducción de la Base de Schiff generada entre los grupos carbonilo y amino. La reducción se realiza en las siguientes condiciones:

Adición de Tampón Carbonato 500mM pH 10,5 +

+1 mg/ml de NaBH_{4} +

durante 60 min a +4°C.

Transcurrido este tiempo se procede al lavado de las partículas con tampón fosfato 100 mM pH 7, y se resuspenden las partículas en tampón fosfato 25 mM pH 7.

Se determina mediante el método de Bradford la cantidad de proteína inmovilizada sobre las partículas magnéticas, siendo el ensayo:

1 ml Líquido Coomassie+

+20 \mul de muestra+

a 595 nm se determina la absorbancia

La cantidad de proteína inmovilizada sobre las partículas magnéticas (aproximadamente 5 mg) es de 9,3 mg.

Una vez inmovilizadas las IgG sobre las partículas magnéticas a través de grupos presentes en la región Fc, se comprueba que estos anticuerpos son biológicamente activos al presentar su capacidad de adsorción del antígeno, demostrando así la inmovilización orientada de IgG sobre las partículas magnéticas. Para ello se determina la presencia de peroxidasa (antígeno) en las partículas magnéticas. Ese ensayo se realiza en fuerza iónica que impida la posibilidad de adsorción iónica de la peroxidasa sobre las partículas aminadas.

3.2- Determinación de la actividad biológica de IgG inmovilizada sobre partículas magnéticas:

Una vez comprobada la inmovilización de la proteína, se comprueba que la inmunoglobulina inmovilizada es biológicamente activa. Para ello, se realiza una incubación con el antígeno (peroxidasa) correspondiente a las IgG inmovilizadas. Esta incubación se realiza con antígeno en exceso y a una alta fuerza iónica para evitar la adsorción iónica de la peroxidasa (antígeno) sobre la superficie aminada de las partículas magnéticas. Para ello, se ha obtenido una preparación de extracto de peroxidasa de alta carga enzimática, 25 mg/ml en tampón fosfato 100 mM pH 7.

Se determina la cantidad de actividad peroxidasa (valorando espectrofotométricamente) con el siguiente ensayo enzimático:

Tampón fosfato 100 mM pH 7,5

+ 50 \mug/ ml o-fenilendiamina+

+ 100 \mul H_{2}O_{2} 125 mM

\lambda 420 nm Tª 25°C

Los anticuerpos inmovilizados son capaces de reconocer una molécula de peroxidasa por molécula de anticuerpo, como los anticuerpos libres.

Ejemplo 4 Recubrimiento de la superficie aminada de partículas magnéticas activadas con \gamma-aminopropil-trietoxisilano

Las partículas magnéticas tratadas con \gamma-aminopropiltrietoxisilano poseen en su superficie la presencia de un grupo NH_{2} primario con un pK elevado, lo cual supone que a pH usuales de trabajo se encuentra cargado positivamente. Esto implica que la superficie de las partículas magnéticas es un intercambiador catiónico, por lo que un elevado número de proteínas se adsorberán iónicamente en condiciones normales. El recubrimiento con dextrano-aspártico-aldehído tiene por objetivo hacer inerte la superficie de las partículas. La presencia de grupos carboxilos (cargas negativas) provoca que se absorba iónicamente el dextrano-aspártico-aldehído, así quedan aproximados el grupo amino del soporte y el grupo aldehído del dextrano, forzando de esta forma la generación de una base de Schiff entre estos grupos, evitando así el inconveniente que se produce por el elevado pK del grupo amino en la generación de la base de Schiff.

Se preparan polímeros dextrano-aspártico-aldehído de distintos tamaños (6000 Da y 20000 Da) con un porcentaje del 20% de aspártico y el 80% restante de grupos aldehído. La concentración final del dextrano-aspártico-aldehído es aproximadamente de 10 mg/ml.

Se procede a la inmovilización de dextrano-aspártico-aldehído sobre las partículas magnéticas en las siguientes condiciones:

1 mg de partículas magnéticas aminadas+

+19 ml de dextrano-aspártico-aldehído (20000)+

+1 ml tampón fosfato 500 mM pH 7 +

+150 mM trimetilaminoborano+

+ 24 horas a temperatura ambiente

Posteriormente se procede a la reducción con 1 mg/ml de NaBH_{4} a pH alcalino. Se realizan varios lavados con H_{2}O y se procede a la incubación con el extracto proteico de E.coli a baja fuerza fónica y pH 7.

Se incuban las partículas (recubiertas con esta primera capa de dextrano-aspártico-aldehído) y partículas aminadas con extracto de E.coli de concentración 10 mg/ml. Esta se realiza en tampón fosfato 5 mM pH 7. Se determina mediante método de Bradford la cantidad de proteína adsorbida iónicamente sobre las partículas.

Los datos de absorbancia demuestran que un 18% de proteínas se han adsorbido sobre las partículas magnéticas recubiertas de dextrano-aspártico-aldehído; mientras que sobre las partículas aminadas (sin recubrir) se adsorbe iónicamente el 81% de las proteínas presentes en el extracto.

Los resultados anteriores llevan a pensar que sería conveniente un segundo recubrimiento de dextrano-aspártico-aldehído ya que con el primer recubrimiento no se han bloqueado todas las cargas positivas presentes en la superficie de la partícula magnética.

Se procede a la inmovilización de una segunda capa de dextrano- áspártico-aldehído con las siguientes condiciones:

1 mg de partículas magnéticas (1 capa)+

+19 ml de dextrano-aspártico-aldehído (6000 Da)+

+150 mM trimetilaminoborano+

+1 ml tampón fosfato 500 mM pH 7+

+ 24 horas a temperatura ambiente.

Posteriormente se procede a la reducción de las bases de Schiff generadas con 1 mg/ml de NaBH_{4} a pH alcalino. Se realizan varios lavados con agua y se procede a la incubación con el extracto de E.coli a baja fuerza iónica (Tampón fosfato 5 mM pH 7).

Se incuban las partículas en las mismas condiciones de antes, determinando igualmente por el método de Bradford la cantidad de proteína que se ha adsorbido iónicamente sobre la partícula. En esta ocasión los valores de absorbancia demuestran que la cantidad de proteína adsorbida sobre las partículas magnéticas con un doble recubrimiento de dextrano-aspártico-aldehído es de un 1% en comparación con el 80% que presentan las partículas aminadas en las mismas condiciones.

Claims (18)

1. Partícula magnética de óxido de hierro con un tamaño entre 5 - 30 nm, cargada en medio básico, que presenta un recubrimiento de sílice entre 30 - 100 nm de espesor, caracterizada porque la partícula ha sido sometida a un tratamiento térmico de 300 a 800°C durante 1 a 24 horas.

2. Partícula magnética según la reivindicación 1 caracterizada porque la partícula de óxido de hierro presenta una estructura de espinela (magnetita/maghemita).

3. Biosensor que consiste en una partícula magnética según las reivindicaciones 1-2 la cual presenta al menos un anticuerpo o al menos un antígeno inmovilizado en su superficie.

4. Biosensor según la reivindicación 3 caracterizado porque la partícula magnética presenta adicionalmente sobre su superficie una enzima inmovilizada que sea capaz de emitir señales que permitan la cuantificación de las partículas magnéticas capturadas.

5. Biosensor según la reivindicación 4 caracterizado porque la enzima está seleccionada entre el grupo formado por beta galactosidasa, lipasa, penicilina G acilasa y otras hidrolasas.

6. Biosensor según las reivindicaciones 3-5 caracterizado porque la partícula magnética presenta un recubrimiento adicional con polímeros heterofuncionales para evitar adsorciones inespecíficas de biomacromoléculas.

7. Biosensor según la reivindicación 6 caracterizado porque el recubrimiento adicional es de dextrano-aspártico-aldehído.

8. Método de preparación de una partícula magnética que comprende:

a)

preparación de un polvo de partículas magnéticas de óxido de hierro de 5-30 nm de tamaño,

b)

tratamiento del polvo de partículas de tal forma que las partículas queden cargadas en medio básico.

c)

recubrimiento de las partículas cargadas en medio básico con sílice con un espesor de 30 - 100 nm, y

d)

tratamiento térmico del producto obtenido en la etapa c) a una temperatura de 300 a 800°C durante 1 a 24 horas.

9. Método según la reivindicación 8 caracterizado porque el tratamiento de la etapa b) se lleva a cabo con hidróxido de tetrametil amonio.

10. Método según las reivindicaciones 8-9 caracterizado porque el recubrimiento de las partículas con sílice de la etapa c) se lleva a cabo con ortosilicato de tetraetilo.

11. Método según las reivindicaciones 8-10 que adicionalmente comprende:

a)

tratamiento del producto obtenido en las reivindicaciones 8-9 con un derivado de trietoxisilano, en particular con glicidoxipropil trietoxisilano;

b)

tratamiento del producto obtenido en la etapa a) de esta reivindicación con etilendiamina; o bien, transformación de los grupos epóxido del producto obtenido en la etapa a) en grupos aldehído, seguida del tratamiento con etilendiamina.

12. Método para la preparación de un biosensor que comprende la inmovilización de al menos un antígeno o al menos un anticuerpo en la superficie de las partículas magnéticas obtenidas según la reivindicación 11.

13. Método según la reivindicación 12 que adicionalmente comprende la inmovilización de una enzima en la superficie de la partícula que sea capaz de emitir señales que permitan la cuantificación de las partículas magnéticas capturadas.

14. Método según la reivindicación 13 caracterizado porque la enzima está seleccionada del grupo formado por beta galactosidasa, lipasa, penicilina G acilasa y otras hidrolasas.

15. Método según las reivindicaciones 13-14 que adicionalmente comprende un tratamiento con polímeros heterofuncionales para evitar adsorciones inespecíficas de biomacromoléculas.

16. Método según la reivindicación 15 caracterizado porque el polímero heterofuncional es dextrano-aspártico-aldehído.

17. Método para la identificación y cuantificación de analitos presentes en una muestra líquida, que comprende las siguientes etapas:

a)

puesta en contacto de dicha muestra líquida con biosensores según las reivindicaciones 3-7 de tal manera que los analitos presentes en la muestra líquida interaccionen con dichos biosensores;

b)

recuperación de los biosensores de la muestra líquida mediante la aplicación de un campo magnético local a dicha muestra líquida, de tal forma que los biosensores se adhieran a la superficie de dicho campo magnético local;

c)

cuantificación de los biosensores que han sido recuperados y de los analitos que han interaccionado con dichos biosensores recuperados en la etapa b).

18. Uso de los biosensores según las reivindicaciones 3-7 para la identificación y cuantificación de analitos.