ES2208655T3 - Procedimiento in vitro para potenciar la fertilidad en presencia de combinaciones inhibina/activina. - Google Patents

Abstract

SE PROPORCIONA UN METODO PARA INCREMENTAR EL POTENCIAL DE FERTILIZACION DE OOCITOS QUE COMPRENDE CULTIVAR OOCITOS IN VITRO CON UNA CANTIDAD EFECTIVA DE INHIBINA, ACTIVINA, O UNA COMBINACION DE INHIBINA Y ACTIVINA. PREFERIBLEMENTE LOS OOCITOS QUE SE ESTEN CULTIVANDO SON INMADUROS. DESPUES DE LA FASE DE CULTIVO, LOS OOCITOS PUEDEN SER FERTILIZADOS. LOS OOCITOS SON ADECUADAMENTE CRIOPRESERVADOS Y DESHELADOS ANTES DE LA FASE DE CULTIVO.

Description

Procedimiento in vitro para potenciar la fertilidad en presencia de combinaciones inhibina/activina.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

Esta invención se refiere a un procedimiento in vitro para potenciar el potencial de los oocitos para ser fertilizados.

Descripción de la técnica previa y antecedente

La inhibina y la activina son miembros de una familia de factores de crecimiento y diferenciación. El prototipo de esta familia es el factor beta de crecimiento transformante (TGF-\beta). Derynck et al., Nature 316:701-705 (1985); Ying et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 135:950-956 (1986). Otros miembros de la familia del TGF-\beta incluyen la sustancia inhibidora de Mullerian, el complejo de genes decapentaplégicos de la mosca, y el producto del mARN Vg-1 de Xenopus.

La inhibina es una glicoproteína producida por varios tejidos, incluyendo las gónadas, la pituitaria, el cerebro, la médula ósea, la placenta, y la glándula adrenal. Inicialmente se identificó por su capacidad para inhibir la secreción de la hormona estimulante del folículo (FSH) por la pituitaria. De Jong y Sharpe, Nature 263:71-72 (1976); Schwartz y Channing, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5721-5724 (1977). Tal regulación preferente de la secreción de gonadotropina ha generado un gran interés, y ha impulsado muchos laboratorios durante los últimos cincuenta años a intentar aislar y caracterizar esta sustancia a partir de extractos de testículos, espermatozoides, fluido de la red testicular (rete testis), plasma seminal, y fluido del folículo ovárico, usando varios bioensayos. Rivier et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 133:120 (1985); Ling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7217 (1985); Fukuda et al., Mol. Cell Endocrinol. 44:55 (1985). La estructura de la inhibina, caracterizada a partir de varias especies, consiste en dos subunidades unidas por puente de disulfuro: una cadena \alpha y una cadena de \beta_{A} o \beta_{B}.

Después de la identificación de la inhibina, se mostró que existía la activina en el fluido folicular como una sustancia que existía de forma natural. Se halló que la activina era capaz de estimular la liberación de la FSH por parte de células de la pituitaria anterior de rata. Vale et al., Nature 321:776-779 (1986); Ling et al., Nature 321:779-782 (1986); DePaolo et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 198:500-512 (1991); Ying, Endocrine Rev. 9:267-293 (1988). Se halló que la activina recombinante también estimulaba la LH y la FSH de la pituitaria en macacos machos adultos. McLachlan et al., Endocrinol. 125:2787-2789 (1989). La activina consiste en un homodímero o heterodímero de subunidades \beta de la inhibina, las cuales podrían ser subunidades \beta_{A} o \beta_{B}. Vale et al., Recent. Prog. Horm. Res. 44:1-34 (1988). Hay un 95-100% de conservación de aminoácidos de las subunidades \beta entre la activina humana, porcina, bovina y de rata, incluyendo la región prepro. Las subunidades \beta_{A} y \beta_{B} en una especie determinada son aproximadamente un 64-70% homólogas.

Los heterodímeros \alpha\beta_{A} y \alpha\beta_{B} de la inhibina (respectivamente "inhibina A" e "inhibina B") y los homodímeros \beta_{A} y \beta_{B} de activina (respectivamente "activina A" y "activina B") han sido identificados y purificados a partir de fluido folicular, y todas estas moléculas se han clonado y sus genes se han expresado. Mason et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 135:957 (1986); patente estadounidense nº 4.798.885 concedida el 17 de enero de 1989; Mason et al., Mol. Endocrinol. 3:1352-1358 (1989); Schwall et al., Mol. Endocrinol. 2:1237-1242 (1988); Nakamura et al., J. Biol. Chem. 267:16385-16389 (1992). La secuencia completa de la subunidad \beta_{B} se publicó en las Serono Symposium Publications, con el título "Inhibin-Non-Steroidal Regulation of Follicle Stimulating Hormone Secretion", Eds. Burger et al., comunicación de Mason et al., vol. 42, pp. 77-88 (Raven Press, 1987), titulada "Human Inhibin and Activin: Structure and Recombinant Expressión in Mammalian Cells". Se ha mostrado que la molécula de activina recombinante incrementa los niveles en suero de FSH en ratas cuando se administra mediante inyección subcutánea. Schwall et al., Endocrinol. 125:1420-1423 (1989); Rivier y Vale, Endocrinol. 129:2463-2465 (1991).

La activina y la inhibina regulan el crecimiento y funciones de una variedad de tipos celulares. Podrían estar implicadas en diversos procesos biológicos, incluyendo la eritropoyesis, la formación de los huesos, la esteroidogénesis placentaria y gonádica, la supervivencia neuronal, y la inducción mesodérmica embriológica. Además, la activina tiene un efecto sobre la diferenciación de las células granuladas foliculares (Sugino et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:281-288 (1988)), sobre la proliferación espermatogonial (Mather et al., Endocrinol. 127:3206-3214 (1990)); la diferenciación de eritroides (publicación de EP nº 210.461, publicada el 4 de febrero de 1987 [en donde la proteína se denomina BUF-3]; Eto et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 142:1095-1103 (1987) y Murata et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2434-2438 (1988) [en donde la activina se denomina EDF]; Yu et al., Nature 330:765-767 (1987) [en done la activina se denomina FRP]), sobre la estimulación de la secreción de insulina por parte de los islotes pancreáticos (Totsuka et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 156:335-339 (1988))), sobre la potenciación de la proliferación de fibroblastos (Hedger et al., Mol. Cell Endocrinol. 61:133-138 (1989)), sobre la estimulación de la producción de glucosa por parte de hepatocitos (Mine et al., Endocrinology 125:586-591 (1989)), sobre la inducción de un incremento dependiente de la dosis en los inositol fosfatos en células del parénquima hepático de ratas, un efecto también observado con el EGF (Mine et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 186:205-210 (1992)), sobre la modulación de las funciones somatotrofas (Billestrup et al., Mol. Endocrinol. 4:356-362 (1990)), sobre la modulación de la diferenciación de células nerviosas (Schubert et al., Nature 344:868-870 (1990); Hashimoto et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 173:193-200 (1999)), y sobre la inducción del mesodermo. Smith et al., Nature 345:729-731 (1990); Mitrani et al., Cell 63:495-501 (1990).

La expresión de las subunidades de inhibina, codificada cada una por un gen distinto, se demostró en varios tejidos, además de en el ovario. Woodruff et al., Mol. Endocrinol. 1:561-568 (1987). Los mARN de la \alpha, \beta_{A} y \beta_{B} de la inhibina se detectaron en tejidos testiculares, placentarios, pituitarios, adrenales, de médula ósea y cerebrales. Meunier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:247-251 (1988). La expresión de los mARN de las subunidades de inhibina varió en varias veces de una forma específica para el tejido, sugiriendo diferentes funciones para esta proteína dependiendo de su patrón de asociación y de su sitio de producción. Se ha descrito que las células Leydig testiculares procedente de ratas y cerdos inmaduros producen mARN de activina (subunidades \beta_{A} y \beta_{B}), bioactividad, e inmunoactividad. Lee et al., Science 243:396-398 (1989); Lee et al., en Serono Symposium Publications, titulada "The Molecular and Cellular Endocrinology of the Testis", Eds. Cooke y Sharpe, Vol. 50 (Raven Press, Nueva York, 1988), pp. 21-27.

Se aisló una nueva clase de factores proteicos de gónadas, denominados folistatina o proteína supresora de la FSH (FSP), a partir de fracciones secundarias derivadas de la purificación de las inhibinas y activinas de ovario porcinas y bovinas. Ying, Endoc. Rev. 9:267-293 (1988); Ling et al., "Isolation and Characterization of Gonadal Polypeptides that Regulate the Secretion of Follicle Stimulating Hormone", en Eds. Hodgen et al., Non-Steroidal Gonadal Factors: Physiological Roles and Possibilites in Contraceptive Development, Jones Institute Press, Virginia (1988), pp. 30-46. La folistatina se caracterizó inicialmente por su capacidad para suprimir la secreción de FSH a partir de la pituitaria. Por tanto, un efecto biológico de la folistatina es aparentemente similar al de la inhibina, pero estructuralmente las dos proteína son bastante diferentes. Ueno et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8282-8286 (1987); Robertson et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 149:744-749 (1987).

La folistatina es una proteína de cadena sencilla glicosilada, que se halla en formas que tienen pesos moleculares que oscilan desde 31 a 39 kDa. Todas estas formas tienen composiciones de aminoácidos similares e idénticas secuencias de aminoácidos amino-terminales. La clonación molecular del cADN con el gen de la folistatina reveló dos formas, una forma con peso molecular inferior y una forma mayor, las cuales se generan mediante empalme alternativo. La forma más pequeña representa una forma truncada en carboxi-terminal del precursor mayor. Para una revisión sobre la folistatina y la activina, consultar DePaolo et al., Proc. Soc. Exp. Biol. and Med. 198:500-512 (1991). Actualmente se cree que la folistatina es un proteína unidora de la inhibina/activina.

En humanos, los folículos preovulatorios en crecimiento y el corpus luteum secretan inhibina hacia la circulación en respuesta a la estimulación por FSH. Lee y Gibson, Aust. J. Biol. Sci. 38:115-120 (1985); McLachlan et al., Fertil. Steril. 48:1001 (1987). Por tanto, los péptidos relacionados con la inhibina juegan papeles importantes en la modulación de las funciones gonadales a través del bucle de realimentación de la pituitaria. Se ha propuesto que la secreción de inhibina por el corpus luteum suprime la concentración de FSH en la fase luteal del ciclo y, por consiguiente, la inhibición del desarrollo folicular. Baird et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 541:153-161 (1988). Sin embargo, datos recientes sugieren que el corpus luteum no secreta inhibina. Bramley et al., J. Endocrinol. 134:341-352 (1992).

En cultivos primarios de células de testículos de ratas y células tecalintersticiales del ovario, se informa que la inhibina potencia la biosíntesis de andrógenos estimulada por la hormona luteinizante (LH) (Hillier et al., Mol. Cell Endocrinol. 75:R1-R6 (1991)), mientras que la activina suprime la producción de andrógenos. Hillier et al., J. Clin. Endocrinol. Metabol. 72:1206-1211 (1991); Hsueh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5082-5086 (1987). Otros investigadores han sido incapaces de repetir estas observaciones en machos. deKretser y Robertson, Biol. Reprod. 40:33-47 (1989).

Los efectos inhibidores del TGF-\beta sobre la esteroidogénesis de las células Leydig también han sido descritos. Lin et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 146:387 (1987); Fauser y Hsueh, Life Sci. 43:1363 (1988); Avallet et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 146:575 (1987). En las células granuladas, se ha descrito que la activina inhibe (y que el TGF-\beta potencia) la producción de progesterona. Ignotz y Massague, J. Biol. Chem. 261:4337 (1986). En cultivos primarios de células granuladas, se halló que la activina y la inhibina, así como el TGF-\beta, afectan la síntesis y secreción de hormona, cada una de forma diferente. Adashi y Resnick, Endocrinology 119:1879 (1986); Ying et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 136:969 (1986); Hutchinson et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 146:1405 (1987); Mondschein et al., Endocrinology 123:1970 (1988); Feng et al., J. Biol. Chem. 261:14167 (1986). Estas moléculas tienen efectos tanto positivos como negativos sobre la función dependiente de FSH de las células granuladas. Carson et al., J. Reprod. Fert. 85:735-746 (1989). También se ha sugerido que los miembros individuales de la familia del gen del TGF-\beta/inhibina regulan la función ovárica, no sólo mediante acción directa sobre las células del folículo, sino también indirectamente influyendo en la velocidad de producción de otros miembros de esta familia. Zhiwen et al., Molecular and Cellular Endocrinology 58:161-166 (1988).

Se informó que la activina y la inhibina modulan el crecimiento de dos líneas celulares de gónadas, sugiriendo que estas proteínas podrían regular la proliferación así como otras funciones de células gonadales. Gonzalez-Manchon y Vale, Endocrinology 125:1666-1672 (1989).

Un artículo de revisión postula que la inhibina es al menos uno de los factores que determina el número de folículos destinados a ovular, y que la interferencia con la acción de la inhibina podría contribuir a la regulación de la fertilidad. De Jong, Physiol. Rev. 68:555 (1988). Muchos investigadores han especulado que debido a su efecto inhibidor de la FSH a nivel de la pituitaria, la inhibina podría ser útil en la contracepción en machos y hembras. Sheth y Moodbidri, Adv. Contracept. 2:131-139 (1986); Findlay, Fertil. Steril. 46:770 (1986). Otro autor duda de que la inhibina pueda inhibir la espermatogénesis (citando Bremner et al., J. Clin. Invest. 68:1044 (1981)), y afirma que la inhibina podría también tener algunos efectos estimulantes directos sobre la espermatogénesis. Baker et al., Clin. Reprod. and Fert. 2:161-174 (1983). Actualmente se ha mostrado que la inhibina tiene un efecto paracrino al estimular la maduración folicular ovárica. WO 91/10.445.

Cuando se inmunizan ovejas con inhibina, o la cadena \alpha de la inhibina, su velocidad de ovulación se incrementa debido a la inmunoneutralización de la inhibina endógena. Cummins et al., J. Reprod. Fertil. 77:365 (1986); Henderson et al., J. Endocrinol. 102:305-309 (1984); Forage et al., J. Endocrinol. 114:R1 (1987); Al-Obaidl et al., J. Reprod. Fertil. 81:403-414 (1987). El mismo efecto se ha observado en ratas. Rivier y Vale, Endocrinology 125:152 (1989). Además, Rivier y Vale sugirieron que el incremento en FSH solo es suficiente para estimular el crecimiento y desarrollo folicular adicional, y el principal mecanismo a través del cual el tratamiento con suero anti-inhibina incrementa el desarrollo folicular es a través de niveles elevados de FSH en plasma. Otros investigadores informaron que la administración de inhibina a ovejas induce o la anovulación o un incremento en la velocidad de ovulación de acuerdo con el esquema de tratamiento. Franchimont et al., Rev. Fr. Gynecol. Obstet. 83:607 (1988).

La activina se descubre como útil para el tratamiento de la infertilidad en machos (ver patente estadounidense nº 5.166.190), y para tratar la enfermedad ovárica poliquística cuando se administra directamente al ovario. Patente estadounidense nº 5.102.868.

La modulación de los mARN de la subunidad de la inhibina durante el estro de la rata ha sido intensamente estudiada. Woodruff et al., Science 239:1296 (1988). Sólo recientemente se ha elucidado parcialmente la relación de retroalimentación negativa entre la inhibina y activina ovárica y la FSH de la pituitaria. Hasegawa et al., Inhibin: Non-Steroidal Regulation of FSH Secretion, ed. J. Burger et al., 42:119-133 (Nueva York, Raven Press, 1987); Woodruff et al., Science 239:1296-1299 (1988). En resumen, el ovario produce niveles bajos de inhibina al inicio del pro-estro. Woodruff et al., Endocrinol. 2193-2199 (1989). Esto permite que la FSH permanezca elevada a lo largo de la mañana del estro (oleada de FSH secundaria). Rivier et al., Science 234:205-208 (1986). La oleada secundaria de FSH recluta un nuevo conjunto de folículos para el grupo ovulatorio, y es responsable del inicio de la expresión del mARN de la subunidad de inhibina. D'Agostino et al., Endocrinol. 124:310-317 (1989). A consecuencia de la producción de inhibina, se desregula la secreción de FSH por parte de la pituitaria. Los niveles de mARN de inhibina incrementan en los folículos en maduración a medida que progresan a través del ciclo. Los folículos que devienen atréticos (no ovulatorios y altamente esteroidogénicos) tiene poco o ningún mARN de inhibina. Woodruff et al., Growth Factors and the Ovary, Ed. Hirsfield, pp. 291-295 (Nueva York, Plenum Press, 1989). La acumulación de mARN de la subunidad de inhibina alcanza su clímax durante la tarde del pro-estro en los folículos sanos, simultáneamente con las oleadas de FSH y primaria de LH. Woodruff et al., Science, ver más arriba.

Para su maduración dentro del entorno folicular normal, los oocitos necesitan adquirir competencia meiótica, pero permanecer en paro meiótico de profase hasta que son estimulados a retomar la meiosis por parte de la oleada de gonadotropina preovulatoria. El oocito deviene competente, desde el punto de vista del desarrollo a las pocas horas de la ovulación, habiendo progresado hasta la metafase II (MII) y habiendo sufrido cambios en su metabolismo, síntesis de proteínas, y redistribución de orgánulos citoplásmicos. Sathananthan et al., "Maturation of the human oocyte" en Ultrastructure of the Ovary, Eds. Familiari et al. (Morwell, MA; Kluwer Academic Publishers, 1991), capítulo 2, pp. 29-43.

La maduración del oocito es necesaria para una fertilización in vitro (IVF) exitosa. Los estados de maduración preovulatoria oscilan desde la vesícula germinal (GV) inmadura hasta la etapa MII de la meiosis. La maduración incluye ambas, la maduración nuclear y la citoplásmica de la célula germen.

Desde el primer procedimiento exitoso de VF en 1978, se han realizado intentos de emplear drogas u hormonas para inducir el desarrollo múltiple folicular y del oocito. Así, los embarazos mediante IVF podrían resultar en mujeres que seguirían el uso citrato de clomifeno y de la gonadotropina coriónica humana (hCG) para inducir el desarrollo folicular múltiple en pacientes normales desde el punto de vista endocrino. Trounson et al., Science 212:681-684 (1981). Está bien establecido que la aplicación apropiada de gonadotropinas FSH y LH endógenas mezcladas se ha probado eficaz para la inducción de la ovulación, o para una recuperación múltiple de óvulos durante la terapia IVF. Sin embargo, la estimulación ovárica y del oocito in vivo mediante la administración de gonadotropinas exógenas es difícil de gestionar y costosa debido a las grandes cantidades de FSH/LH requeridas para la estimulación, además hay preocupación por la posibilidad de cáncer de ovarios incrementado en pacientes tratadas con gonadotropinas. Whittermore et al., Am. J. Epidemiol. 136:1184-1203 (1992). Otro agente de cierto uso es la FSH sola o en combinación con un antagonista de hormonas liberadoras de gonadotropina, tal como se describe en la patente estadounidense nº 4.845.077.

Los tratamientos con FSH o una mezcla de FSH y LH resultaron en niveles en suero de inhibina incrementados durante las fases folicular y luteal temprana del ciclo. McLachlan et al., Lancet 1:1233-1234 (1986); Tsonis et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 66:915 (1988); Tsuchiya et al., Fert. Steril. 52:88 (1989). No obstante, otro investigador ha hallado que, en el momento de la ovulación, ni la actividad de la inhibina ni los niveles foliculares de esteroides o gonadotropinas son criterios adecuados para predecir las prestaciones de los oocitos en un protocolo de IVF. Lefevre et al., Fert. Steril. 46:325 (1986).

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Se ha descrito que la activina A acelera in vitro la rotura de la vesícula germinal (GVBD) de los oocitos inmaduros de ratas. Itoh et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 166:1479-1484 (1990). La inhibina, por otra parte, supuestamente inhibe la maduración meiótica de los oocitos de rata, tal como se muestra mediante la supresión de la GVBD. O et al., Mol. Cell Endo. 62:307-311 (1989).

Rutinariamente, en la IVF, la extracción de oocitos se programa mediante la administración de hGH, a menos que haya un oleada de LH endógena. Típicamente, la maduración se completa cultivando los oocitos con sus células cumulus durante 4-8 horas. Sathananthan y Trounson, Gamete Res. 5:191-198 (1982); Trounson et al., J. Reprod. Fertil. 64:285-294 (1982). Actualmente se usan varios medios de cultivo para ambas, la maduración y fertilización de oocitos. Trounson en Clinical in Vitro Fertilization, Eds. Wood y Trounson, 2ª edición (Londres: Springer-Verlag, 1989), pp. 32-50. Aproximadamente el 40% de los oocitos ya están en la fase MII en el momento de la recolección. Si estos oocitos MII envejecen en el cultivo antes de su inseminación, las probabilidades de fertilización normal y desarrollo embrionario de los oocitos disminuyen considerablemente. La pos-madurez está asociada también con la mortalidad embrionaria y las anormalidades cromosómicas. Osborne y Moor, J. Reprod. Fert. (Suppl.) 36:59-72 (1988). Es más probable que los oocitos en la metafase I (MI), que han sufrido la GVBD, maduren a tiempo para su inseminación, y que los oocitos recuperados en la etapa GV pudieran todavía ser inmaduros en el momento de la inseminación.

Se ha hallado que los oocitos de la GV completarán la maduración meiótica en medio F10 de Ham suplementado con fluido folicular recuperado con oocitos maduros. Cha et al., Fertil. Steril. 55:109-113 (1991). Estos oocitos se fertilizaron a velocidades elevadas, se rompieron normalmente, y fueron capaces de desarrollarse hasta el final (se transfirieron 3 de 5 embriones). Por tanto, aunque es posible que los oocitos de la GV pudieran cultivarse y fertilizarse exitosamente para generar embarazos, y aunque los oocitos inmaduros pudieran presentar maduración espontánea cuando se liberaran de sus folículos ováricos, sería deseable potenciar la velocidad y extensión de la maduración in vitro de oocitos inmaduros de forma que pudiera acumularse un rendimiento superior de oocitos maduros para la fertilización final, tal como mediante IVF. También sería deseable mejorar la calidad de los oocitos que se están fertilizando para incrementar la proporción de éxito en su fertilización y desarrollo.

Más aún, aunque es evidente la ventaja ética de crioconservar oocitos humanos en vez de embriones, los oocitos maduros en MII son sensibles a la crioprotectores, al enfriamiento y a la congelación. Trounson, "Embryo Cryopreservation", en Clinical in Vitro Fertilization, Eds. Wood y Trounson, 2ª edición (Berlín, Springer-Verlag, 1989), pp. 127-142; Trounson y Sathananthan, "Human Oocyte and Embryo Freezing", en Developments in Ultrastructure of Reproduction, Ed. Motta (Nueva York, Alan R. Liss, 1989), pp. 355-366; Sathananthan et al., Hum. Reprod. 3:968-977 (1988). Incluso el enfriamiento rápido hasta temperatura ambiente desde 37ºC alteró irreversiblemente el huso de microtúbulos. Pickering et al., Fertil. Steril. 54:102-108 (1990). También, se ha descrito que la fertilización de oocitos que habían sido congelados y descongelados causaba la dislocación de algunos cromosomas (Sathananthan y Trounson, "Effect of Culture and Cryopreservation on Human Oocyte and Embryo Ultrastructure and Function," en Ultrastructure of Human Gametogenesis and Early Embryogenesis, Eds. Van Blerkom y Motta (Boston, Kluwer, 1989), pp. 181-199; Sathananthan et al., Gamete Res. 16:343-354 (1987)) y poliplodía. Al-Hasani et al., Hum. Reprod. 2:695-700 (1987). Se han congelado oocitos de la GV de ratón y a continuación se han cultivado in vitro hasta su maduración (Van Blerkom, Hum. Reprod. 4:883-898 (1989)); sin embargo, hay una necesidad de un procedimiento más eficiente para conseguir la maduración después de la crioconservación.

En consecuencia, es un objeto de la presente invención incrementar la velocidad de maduración de oocitos in vitro antes de su fertilización y transferencia de embriones.

Es otro objeto incrementar el grado de maduración de los oocitos inmaduros antes de la fertilización, y potenciar la calidad de los oocitos destinados a la fertilización, con objeto de incrementar las posibilidades de fertilización exitosa y desarrollo subsiguiente de un embrión viable.

Es todavía otro objeto utilizar oocitos que de otro modo serían descartados en el contexto de un programa de IVF.

Es todavía otro objeto minimizar la necesidad de utilizar tratamientos caros y que exigen mucho tiempo con gonadotropinas, y minimizar el tiempo necesario para la maduración in vitro.

Es un objeto ulterior conseguir la fertilización exitosa de oocitos crioconservados, salvando de este modo los problemas éticos asociados con los bancos de embriones humanos fertilizados.

Es todavía un objeto ulterior contribuir significativamente al conjunto de oocitos fértiles requerido para la propagación de especies no humanas en peligro, tales como los primates, o para el desarrollo de modelos de enfermedades para investigación médica.

Estos y otros objetos serán evidentes a cualquiera con la formación ordinaria en la técnica.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento para potenciar la fertilidad potencial de oocitos, comprendiendo los oocitos cultivados in vitro, con una cantidad efectiva de una combinación de inhibina y activina. Los ovarios a partir de los cuales se extraen los oocitos preferiblemente no son estimulados, pero podrían estimularse también con, por ejemplo, niveles elevados de gonadotropinas endógenas y exógenas.

En un aspecto ulterior, la invención proporciona un procedimiento para incrementar la velocidad de maduración de oocitos inmaduros, que comprende cultivar los oocitos in vitro con una cantidad efectiva de una combinación de inhibina y activina.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para fertilizar oocitos, comprendiendo la extracción de oocitos de un folículo de un ovario, el cultivo de los oocitos con una cantidad efectiva de una combinación de inhibina y activina, y la mezcla de los oocitos cultivados con espermatozoos que resulta en su fertilización.

En todavía un aspecto ulterior, la invención proporciona un procedimiento para almacenar y a continuación potenciar la fertilización potencial de oocitos, comprendiendo la crioconservación de oocitos inmaduros, la descongelación de los oocitos crioconservados, y el cultivo de oocitos descongelados in vitro con una cantidad efectiva de una combinación de inhibina y activina. Mientras que la crioconservación puede tener lugar por cualquier medio, en un aspecto el procedimiento de la crioconservación implica enfriar oocitos inmersos en una solución crioconservante hasta una temperatura de no más de aproximadamente -60ºC, y almacenar los oocitos enfriados a una temperatura de no más de aproximadamente -60ºC.

La capacidad de cultivar oocitos in vitro para potenciar su capacidad de fertilización, y/o potenciar la velocidad y grado de maduración de oocitos inmaduros podría contribuir sustancialmente al conjunto de gametos si el cultivo culminara en la fertilización y el desarrollo embriónico normal. Se espera que la potenciación de la calidad de los oocitos juegue un papel significativo en las tecnologías de reproducción humana asistida (ART), incluyendo la IVF. Más aún, los oocitos procedentes de varias especies que, de otro modo, se desperdiciarían pueden ahora emplearse, tales como los oocitos inmaduros obtenidos a partir de especies de primates durante su necropsia, los oocitos inmaduros obtenidos durante una intervención quirúrgica, tal como la oforohisterectomía, o los oocitos inmaduros extraídos durante los protocolos de hiperestimulación o en ciclos naturales en el contexto de un programa de IVF. También, estos oocitos pueden extraerse de pacientes con cáncer, tales como aquéllos con cáncer de ovarios, antes de la quimioterapia, y pueden recuperarse oocitos mediante resección encajada (wedge resection oocytes) a partir de mujeres resistentes a la gonadotropina.

Además, el cultivo in vitro de oocitos inmaduros, tal como se practica de acuerdo con esta invención, minimizaría o incluso eliminaría la necesidad de estimulación in vivo con gonadotropina, cara, que requiere mucho tiempo, y potencialmente oncogénica, y podría conducir a conocimientos que mejorarían el resultado de la IVF. En relación a esto, incrementar la calidad del oocito sin el uso de estimulantes tales como el citrato de clomifeno y las FSH/LH podría limitar los nacimientos múltiples, si pudiera conseguirse la fertilización de un oocito de buena calidad, en vez de múltiples oocitos irregulares.

Más aún, puesto que sería complicado o imposible preparar las gonadotropinas FSH y/o FSH/LH a partir de cada especie en peligro de extinción que requiera IVF para la supervivencia de la especie, la mejora de la calidad del oocito ovárico y la potenciación de la velocidad y grado de maduración in vitro, sin estimulación in vivo ovárica y folicular con FSH/LH, podría proporcionar una contribución significativa al conjunto de oocitos fértiles requeridos para la propagación de especies en peligro de extinción, incluyendo los primates no humanos. También será útil para el desarrollo de modelos de enfermedades para investigación médica, y para incrementar el conjunto de genes de especies manipuladas genéticamente, tales como caballos de carreras, que uno quisiera criar.

Adicionalmente, esta estrategia, cuando se combina con la crioconservación de oocitos inmaduros o maduros y la fertilización en el contexto de un ciclo ART, podría salvar problemas éticos asociados con los bancos de embriones humanos, puesto que se evita la congelación de un ser vivo.

Más aún, típicamente sólo se requiere una pequeña dosis (100 ng/ml o menos) de reactivo para conseguir resultados efectos, y un oocito o más podrían cultivarse en 50 \mul. La maduración in vitro tiene también una ventaja de tiempo, ya que se requiere un día en vez de las típicas 48-72 horas para la maduración in vitro.

Breve descripción de las Figuras

La Figura 1 resume los efectos de varios agentes sobre la evolución temporal de la maduración in vitro de oocitos de mono rhesus, en donde la reanudación por parte del oocito de la maduración meiótica se expresa como el porcentaje de oocitos de la GV intactos que experimentan GVBD con cada tratamiento. Los agentes ensayados fueron controles placebo (23 oocitos de la GV examinados, círculos vacíos), inhibina (26 oocitos de la GV examinados, círculos rellenos), activina (32 oocitos de la GV examinados, rombos), y la combinación de inhibina y activina (16 oocitos de la GV examinados, triángulos), * = p < 0,05, y ** = p < 0,01.

La Figura 2 muestra los efectos de varios agentes sobre la evolución temporal de la maduración in vitro de oocitos de monos rhesus, en donde la reanudación por parte del oocito de la maduración meiótica se expresa como el porcentaje de oocitos de la GV intactos que alcanzan la MII con cada tratamiento. Los agentes ensayados y los valores de p son los descritos en la leyenda de la Figura 1.

La Figura 3 ilustra los efectos de varios agentes sobre la maduración in vitro de oocitos de monos rhesus, en donde la maduración del oocito se expresa como el porcentaje de oocitos de la GV intactos que experimentan la GVBD o alcanzan la MII después de 48 horas de cultivo con los diferentes tratamientos. Los agentes ensayados fueron los descritos en la leyenda de la Figura 1, en donde las columnas rellenas son controles, las columnas vacías son inhibina, las columnas sombreadas son activina, y las columnas con diagonales con la combinación de inhibina y activina.

Las Figuras 4A-4C descubren fotografías de los oocitos de monos rhesus después de 12-36 horas de cultivo. La Figura 4A es una fotografía de un oocito control (no tratado) después de 24 horas de cultivo; la Figura 4B es una fotografía de un oocito GVBD 12 horas después de cultivo en presencia de la combinación de inhibina y activina; y la Figura 4C es una fotografía de un oocito MII 36 horas después de cultivo en presencia de activina sola.

La Figura 5 muestra los efectos de la folistatina (FS) sobre la maduración de los oocitos de mono rhesus, en donde la maduración del oocito se expresa como el porcentaje de oocitos GV que experimentan GVBD o alcanzan la MII después de 48 horas de cultivo con los diferentes tratamientos. Los tratamientos fueron controles (26 oocitos de la GV examinados, barra rellena de la izquierda), FS (24 oocitos de la GV examinados, columnas con diagonales oscura), activina (14 oocitos de la GV examinados, columnas sombreadas), activina más FS (18 oocitos de la GV examinados, columnas con diagonales claras), inhibina más FS (22 oocitos de la GV examinados, columnas vacías), e inhibina más FS (17 oocitos de la GV examinados, columnas rellenas de la derecha).

Descripción de las realizaciones preferidas Definiciones

Tal como se usa en ésta, el término "oocitos" se refiere al gameto procedente del folículo de un animal hembra, tanto vertebrado como invertebrado. Preferiblemente, el animal es una especie en peligro de extinción y/o un mamífero, y más preferiblemente es un animal de deporte, de zoológico, u otro animal cuyos oocitos sería deseable salvar debido a ser una raza mejor, tal como caballos de carreras, una especie de mamífero en peligro de extinción, un primate no humano, o un humano. "Especie en peligro de extinción" para los propósitos en ésta se refiere a una especie de animal que ha sido considerada que está en peligro por el Acta de Especies en peligro de extinción de los Estados Unidos de 1973, o su contrapartida global, la "World Conservation Union". Típicamente, la población de una especie en peligro de extinción está amenazada debido a una sobrecaza, enfermedad, y/o destrucción de su hábitat natural, de forma que no puede sobrevivir en números adecuados para mantener la especie. Los ejemplos de especies en peligro de extinción incluye los búhos moteados del norte, los osos panda, los gorilas de montaña, los orangutanes, los chimpancés, los tigres de Siberia, los elefantes, los macacos de cresta negra, los "golden lion tamarins", etc.

Los oocitos "inmaduros" se refieren a oocitos que son viables pero incapaces de fertilización sin crecimiento adicional o maduración. Los oocitos recuperados a partir de folículos "no estimulados" u ovarios son oocitos naturales obtenidos a partir de folículos u ovarios que no se trataron con ninguna gonadotropina u otras hormonas o agentes para estimular la maduración de los oocitos. Los oocitos recuperados a partir de ovarios estimulados podrían ser maduros o inmaduros. Los criterios subjetivos para estimar la viabilidad y madurez del ovum procedente del folículo incluyen verificar el número y densidad de células granuladas que lo rodean, la presencia o ausencia de la vesícula geminal, y la presencia o ausencia del primer cuerpo polar.

Los oocitos procedentes de ovarios no estimulados generalmente tienen dos o más capas de células granuladas condensadas rodeándolos, una vesícula germinal, y ningún cuerpo polar, mientras que los oocitos procedentes de ovarios estimulados generalmente tienen una capa expandida de células granuladas, denominada el cumulus, ninguna vesícula germinal, y un cuerpo polar. La madurez podría medirse por el número y densidad de células granuladas que lo rodean, la presencia o ausencia del primer cuerpo polar, y el grosor de la zona pelúcida, así como por la reanudación de la maduración meiótica por parte del oocito, tal como se expresa por el porcentaje de oocitos de la GV intactos que experimentan la GVBD y/o que alcanzan la MII después de 48 horas de cultivo. Consultar también, Sathananthan et al., en Ultrastructure of the Ovary, ver más arriba, para otras formas de verificar la maduración nuclear y citoplásmica de oocitos de mamíferos.

Tal como se usa en ésta, la expresión "potenciar el potencial de felicitación de los oocitos" se refiere a incrementar la calidad del oocito, de forma que será más capaz de ser fertilizado y de producir un embrión viable de lo que sería en caso contrario, y también se refiere a incrementar la extensión (grado o porcentaje) de maduración de oocitos inmaduros; tal como se ejemplifica en la Figura 3. La maduración se verifica tal como se describe más arriba, y la calidad puede verificarse por la apariencia de los oocitos a partir de fotografías, tal como se ejemplifica en la Figura 4 y por la proporción de IVF. Los criterios para juzgar la calidad del oocito por medios visuales incluyen, por ejemplo, su forma, la expansión del cumulus, la GVBD, y la extrusión del primer cuerpo polar. Los oocitos de la GV inmaduros usualmente tienen un cumulus compacto y una capaz prieta de células corona, mientras que los oocitos MI en proceso de maduración tienen un cumulus en expansión y los oocitos MII tienen un cumulus expandido. También, los oocitos de la GV tienen usualmente un núcleo excéntrico y no tienen cuerpo polar. Los oocitos en proceso de maduración en MI no tienen núcleo o cuerpo polar, pero tienen un huso. Los oocitos maduros tienen un único cuerpo polar en el espacio perivitelino y un huso de MII. Además, los oocitos inmaduros o atréticos tienen una zona más compacta y lisa, mientras que los oocitos MII tienen una apariencia esponjosa y con forma de red. Los óvulos fertilizados que completan la meiosis tienen dos cuerpos polares en el espacio perivitelino y dos pronúcleos en el ooplasma. Esta última etapa puede medirse usando un microscopio invertido Normarski o microscopio de fase, después de que las células sean retiradas mediante pipeteado suave o disección.

Tal como se usa en ésta, la expresión "incrementando la velocidad de maduración de oocitos inmaduros" se refiere a incrementar la velocidad a la que ocurre la maduración de los oocitos, tanto en la etapa de la GVBD (como en la Figura 1) como en la etapa MII (como en la Figura 2), o ambas.

"Espermatozoides" se refiere a los gametos del macho que pueden utilizarse para fertilizar los oocitos en ésta.

Tal como se usa en ésta, el término "inhibina" se refiere a los heterodímeros de cadenas \alpha y \beta de la inhibina, formas prepro, y formas pro, junto con las variantes de glicosilación y/o secuencia de aminoácidos de los mismos. Después de separarla de la proteína madura, la porción precursora podría estar asociada covalentemente con la proteína madura. La inhibina A se refiere a la inhibina con las cadenas \alpha y \beta_{A}. La inhibina B se refiere a la inhibina con las cadenas \alpha y \beta_{B}.

Tal como se usa en ésta, el término "activina" se refiere a los homo- y heterodímeros de cadenas \beta de inhibina, formas prepro, y formas pro, junto con las variantes de glicosilación y/o secuencia de aminoácidos de los mismos. Después de separarla de la proteína madura, la porción precursora podría estar asociada covalentemente con la proteína madura. La activina A se refiere a la activina con las dos cadenas de \beta_{A}. La activina AB se refiere a la activina con las cadenas \beta_{A} y \beta_{B}. La activina B se refiere a la activina con las cadenas de \beta_{B}.

Preferiblemente, la inhibina y la activina útiles en ésta son la inhibina A o B humana y la activina A, AB o B humana, más preferiblemente la inhibina A humana y la activina A humana o la activina B humana.

La prepro aislada intacta, o el prodominio, o la \beta_{A}, \beta_{B} maduras, y las secuencias \alpha se sintetizan convenientemente por varios medios, incluyendo los medios sintéticos y/o recombinantes, pero se sintetizan preferiblemente en cultivos celulares recombinantes, por ejemplo, según se describe en la patente estadounidense nº 4.798.885, ver más arriba.

Se halla dentro del ámbito de ésta emplear inhibina y/o activina procedentes de animales distintos de los humanos, por ejemplo, fuentes porcinas y bovinas, para tratar oocitos humanos, particularmente ya que la inhibina y activina están conservadas (90-100% de identidad de secuencia) entre especies. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos y deducida de aminoácidos de la cadena \alpha de la inhibina porcina se hallan en la patente estadounidense nº 4.798.855, ver más arriba, y las de la cadena \beta de la activina porcina se hallan en las Figuras 2A y 2B de la patente estadounidense nº 4.798.885, ver más arriba. De igual modo, si se desea tratar los oocitos procedentes de otras especies, tales como animales en peligro de extinción o domésticos y de granja, y animales de zoológicos, de deporte o de compañía, se emplean de forma conveniente la inhibina y/o activina humana, así como con inhibina y/o activina procedentes de otras especies.

Generalmente, las variantes de la secuencia de aminoácidos serán sustancialmente homólogas con la porción relevante de las secuencias de las cadenas \alpha y \beta de mamíferos detalladas, por ejemplo, en la patente estadounidense nº 4.798.885, ver más arriba. "Sustancialmente homólogas" significa que más del aproximadamente el 60% de la secuencia de aminoácidos primaria del polipéptido homólogo se corresponde con la secuencia de la cadena de inhibina o activina cuando se alinea para maximizar el número de emparejamientos de aminoácidos entre las dos proteínas. El alineamiento para maximizar los emparejamientos de residuos incluye el desplazamiento de los extremos carboxi y/o amino-terminales, la introducción de discontinuidades según se requiera, y/o suprimir residuos presentes como insertos en la candidata. Típicamente, las variantes de secuencias de aminoácidos serán más de a aproximadamente el 70% homólogas con la correspondientes secuencias nativas.

Mientras que el sitio para introducir una variación de secuencia está predeterminado, es innecesario que la mutación per se esté predeterminada. Por ejemplo, para optimizar las prestaciones de una mutación en un sitio determinado, podría realizarse mutagénesis aleatorio en el codón o región diana, y examinarse los mutantes de inhibina o activina expresados en busca de la combinación óptima de actividad deseada. Las técnicas para hacer mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en ADN que tiene una secuencia conocida son bien conocidas, por ejemplo, la mutagénesis con cebador M13.

La mutagénesis se realiza haciendo inserciones de aminoácidos, usualmente en el orden de aproximadamente desde 1 hasta 10 residuos de aminoácidos, o supresiones de aproximadamente desde 1 hasta 30 residuos. Las sustituciones, supresiones, inserciones, o cualquier subcombinación, podrían combinarse para llegar a una construcción final. Sin embargo, preferiblemente se realiza la mutagénesis de sustitución. Obviamente, las mutaciones en el ADN codificante no deben colocar la secuencia fuera de la pauta de lectura, y preferiblemente no crearán regiones complementarias que pudieran producir estructura secundaria en el mARN.

Las modificaciones covalentes de la inhibina y activina se incluyen dentro del ámbito de la invención, e incluyen conjugados covalentes o de agregación con otras porciones químicas. Los derivados covalentes se preparan mediante el enlace de funcionalidades a grupos que se hallan en las cadenas laterales de los aminoácidos de la inhibina o activina, o en los extremos N- o C-terminales, por medios conocidos en la técnica. Por ejemplo, estos derivados incluirán: ésteres alifáticos o amidas de extremo carboxílico o de residuos que contengan cadenas laterales carboxílicas, por ejemplo, residuos aspartilo; los derivados O-acilo de residuos que contengan grupos hidroxilo, tales como arilo o alanilo; y los derivados N-acilo del aminoácido amino-terminal o de residuos que contengan grupos amino, por ejemplo, lisina o arginina. El grupo acilo se selecciona de entre el grupo de porciones alquílicas (incluyendo alquilos normales C3 a C10), formando de ese modo especies alcanoilo, y compuestos carbocíclicos o heterocíclicos, formando de este modo especies aroilo. Los grupos reactivos preferiblemente son compuestos difuncionales conocidos per se para su uso en el entrecruzamiento de proteínas a matrices insolubles a través de grupos reactivos laterales, por ejemplo, éster m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida. Los sitios de derivación preferidos son los residuos de histidina.

Modos de llevar a cabo la invención

La presente invención concierne, por sí misma, con el uso de una combinación de inhibina con activina para potenciar la fertilidad potencial de oocitos de animales, especialmente aquéllos de mamíferos, incluyendo animales de deportes, de zoológicos, de compañía y de granja, tale como perros, gatos, terneras, cerdos, caballos, monos, y ovejas, especies en peligro de extinción, y humanos. Además, la presente invención se refiere a usar una combinación de inhibina y activina para incrementar la velocidad de maduración de los oocitos, combinación que se haya trabaja mejor que uno de los dos agentes solo.

Los procedimientos de esta invención implican primero extraer los oocitos, preferiblemente oocitos inmaduros, de los folículos en el ovario. Esto se consigue convenientemente mediante técnicas convencionales, por ejemplo, usando el ciclo natural tal como se describe más abajo, usando procedimientos anovulatorios, durante una intervención quirúrgica tal como la ooforohisterectomía, durante los protocolos de hiperestimulación en el contexto de un programa de IVF, o mediante necropsia. En el ciclo natural, cuando el programa de sucesos ováricos progresa como se espera, se puede observar, mediante ultrasonidos o laparoscopia, que un folículo en vías de expansión sobre la superficie del ovario, cerca del ciclo medio tiene vasos distendidos y una translucidez sustancial. Esta es la apariencia familiar del folículo dominante cerca de la ovulación. Se pasa una aguja hacia el interior del folículo, y su contenido, que podría ser un único oocito, se aspira. La extracción de oocitos y su recuperación se realiza convenientemente por medio de aspiración folicular transvaginal ultrasónicamente guiada. A continuación de la evacuación, el folículo se colapsa. Después de aspirar el folículo, se recupera el óvulo y se examina microscópicamente para comprobar su estado. A su vez, podrían aspirarse folículos adicionales más pequeños. Los criterios subjetivos para estimar la normalidad del óvulo incluyen verificar su madurez por el número y densidad de células granuladas que lo rodean, la presencia o ausencia del primer cuerpo polar, y el grosor de la zona pelúcida, así como otros criterios mencionados más arriba.

Sin embargo, tal como se ha declarado más arriba, la invención no se limita al uso de oocitos inmaduros. Por tanto, los oocitos apropiados incluyen aquéllos que proceden de ovarios estimulados mediante la administración a la donante de óvulos de un agente de fertilidad o potenciador del agente de fertilidad, de forma que los oocitos están en un mayor estado de madurez que los oocitos procedentes de ovarios no estimulados. Los ejemplos de agentes usados para inducir tal maduración folicular múltiple controlada incluyen la administración de inhibina directamente al ovario (WO 91/10.445, ver más arriba), el citrato de clomifeno, o gonadotropinas menopáusicas humanas, por ejemplo, la FSH tal como se describe en la patente estadounidense nº 4.845.077, o una mezcla de FSH y LH, y/o gonadotropinas coriónicas humanas.

Podría administrarse un antagonista de hormona liberadora de gonadotropina para disminuir la acusada variabilidad individual de la respuesta a la terapia con gonadotropina menopáusica humana. Antagonistas típicos de la hormona liberadora de gonadotropina son descritos en Rees et al., J. Med. Chem. 17:1016 (1974); Coy et al., Peptides 1976 (Ed. Loffed, Editions de l'Université de Bruxelles, 1977), p. 436; Beattle et al., J. Med. Chem. 18:1247 (1975); Channabasavaiah et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 86:1266 (1979); y las patentes estadounidenses nº 4.317.815 y 4.431.635. Estos incluyen las (Ac-pClPhe^{1}, pClPhe^{2}, DTrp^{3}, DArg^{6}, DAla^{10})GnRH HCl, [D-Phe^{2}]-LHRH, [D-Phe^{2}, D-Phe^{6}]-LHRH, [D-Phe^{2}, Phe^{3}, D-Phe^{6}]-LHRH, [D-Phe^{2}, D-Trp^{3}, D-Phe^{6}]-LHRH, [D-p-F-Phe-D-Ala^{6}]-LHRH, y [Ac-D-Phe^{1}, D-Phe^{2}, D-Trp^{3,6}]-LHRH.

Estos agentes de fertilizad se usan en las cantidades típicamente empleadas para tales agentes. Por ejemplo, si se usa la FSH, preferiblemente, la cantidad efectiva administrada a la hembra antes de la extracción de los oocitos es una cantidad diaria de aproximadamente 70 a 220 I.U./kg, más preferiblemente 1,5 a 4,0 I.U./kg. Si se usa un antagonista de la hormona liberadora de gonadotropina en conjunción con la FHS, preferiblemente, la cantidad diaria de antagonista de la hormona liberadora de gonadotropina es aproximadamente de 1,0 a 4,0 mg/kg, más preferiblemente de 1,5 a 2,5 mg/kg. En la patente estadounidense nº 4.845.077 pueden hallarse más detalles sobre la administración de estos últimos agentes.

Una vez de han aislado los oocitos deseados (por ejemplo, oocitos viables seleccionados mediante examen microscópico), se cultivan convenientemente de acuerdo con esta invención o se crioconservan para almacenamiento en un banco de gametos o de células para su cultivo futuro. Se no se han de congelar primero, los oocitos no deberían cultivarse más allá de las 48 horas posteriores a su aspiración a partir del folículo, o hasta la liberación del primer cuerpo polar. Si se han congelado, cuando se desea usarlos, se descongelan y entonces se cultivan mediante el procedimiento de la invención descrito en ésta. El desarrollo de una metodología crioconservante requiere la optimización de cada componente individual en el proceso, a través de un estudio independiente, seguida por una estrategia integrada, combinando componentes óptimos para identificar el proceso final. Se identifican los procedimientos óptimos de congelación, almacenamiento, descongelación y aclarado que son compatibles con mantener la máxima viabilidad. Puede usarse cualquier procedimiento para congelar los oocitos. Por ejemplo, puede emplearse una técnica de congelación ultrarápida, tal como se describen en Trounson et al., Fertil. Steril. 48:843-850 (1987) y Vasuthevan et al., Fertil. Steril. 58:1250-1253 (1992). En las patentes estadounidenses nº 5.145.770 y 5.145.769 se describen protocolos específicos para crioconservar láminas epiteliales y vasos sanguíneos que podrían ser útiles en la presente invención. Más adelante se describe un procedimiento detallado para la crioconservación de oocitos, al cual se le pueden hacer modificaciones según sea necesario para ajustarse al tratamiento individual.

Primero, los oocitos se equilibran en una solución de crioconservación durante un tiempo suficiente para permitir que el crioconservante se mezcle a fondo con y/o desplace el agua dentro y entre los oocitos. Segundo, los oocitos se enfrían al menos hasta aproximadamente -60ºC, preferiblemente hasta aproximadamente -180ºC a -195ºC, a una velocidad lo suficientemente lenta para las células crioconservadas, para evitar la formación de cristales de hielo intracelulares y su consiguiente daño. Los oocitos congelados podrían almacenarse durante períodos prologados a aproximadamente -180ºC, o durante períodos mas cortos a temperaturas superiores, por ejemplo, tal elevadas como -60 a -65ºC. Tercero, antes de su uso, los oocitos se calientan hasta temperatura ambiente en aire u otro gas, y a continuación se descongelan completamente mediante calentamiento rápido en, por ejemplo, un baño de agua. Cuarto, se retira el crioprotector de los oocitos mediante aclarado en un tampón isotónico, tal como la solución de Ringer con lactato, o en el medio de cultivo a emplearse para potenciar el potencial de fertilización de los oocitos.

El medio crioprotector estándar está compuesto por una solución salina fisiológica equilibrada (por ejemplo, medio de cultivo de células), suplementada con suero bovino y un crioprotector como el glicerol, propanodiol, o dimetilsulfóxido, agentes penetrantes de la célula, agentes formadores de vidrio. Estos crioprotectores se han usado exitosamente para crioconservar células en suspensión, incluyendo embriones fertilizados. Además, podrían añadirse agentes que no penetran las células, agentes formadores de vidrio, tal como se describe en la patente estadounidense nº 5.145.770, ver más arriba, así como el crioconservante mencionado en la patente estadounidense nº 5.145.769, ver más arriba.

El proceso de crioconservación, en general, requiere sumergir los oocitos a congelar en medio crioprotector durante un tiempo suficiente para permitir el equilibrado de las células con el crioprotector. Generalmente, el tiempo de equilibrado es de hasta aproximadamente dos horas o más en crioprotector antes de congelar sin afectar la viabilidad de las células. El equilibrado se realiza más típicamente durante aproximadamente 20-30 minutos, a aproximadamente 17ºC hasta aproximadamente 30ºC, típicamente a temperatura ambiente, en una solución crioprotectora, en una placa de almacenamiento poco profunda.

A continuación del equilibrado, los oocitos y la solución crioprotectora se transfieren a un tubito o vial, el cual se sella de forma que sea hermético a gases y agua. Los oocitos en el contenedor sellado se enfrían al menos hasta aproximadamente -60ºC (por ejemplo, con nieve carbónica), preferiblemente por debajo de -120ºC, y para promover el almacenamiento a largo plazo, hasta desde aproximadamente -180ºC hasta aproximadamente -196ºC. La velocidad de enfriamiento es preferiblemente lenta (por ejemplo, no más de aproximadamente 1ºC/minuto) desde aproximadamente 0ºC hasta al menos -30ºC. Esto sirve para evitar la formación de cristales de hielo. Preferiblemente, el enfriamiento se realiza, en su inicio, en un aparato de enfriamiento con velocidad controlada, tal como un congelador de células programable comercial (Cryomed Inc., No 1010/2700) hasta una temperatura de aproximadamente -30ºC hasta -100ºC, preferiblemente aproximadamente -80ºC hasta -85ºC, y a continuación se transfiere a un recipiente de almacenamiento en nitrógeno líquido, y se mantiene en vapores de nitrógeno líquido para reducir aún más su temperatura.

El protocolo de congelación preferido enfría los oocitos en el contenedor sellado hasta que los oocitos están aproximadamente a 4ºC. Entonces se enfrían los oocitos a aproximadamente 1ºC por minuto hasta aproximadamente -6 ó -7ºC, y se añade la solución. Después de un período de equilibrado de aproximadamente 10 minutos, se enfría la mezcla a aproximadamente 0,3ºC por minuto. Una vez que la temperatura de los oocitos alcanza al menos aproximadamente -30ºC, y preferiblemente al menos aproximadamente -85ºC, el contenedor se transfiere a un refrigerador de nitrógeno líquido y se almacena a aproximadamente -180ºC (vapores de nitrógeno) o aproximadamente -196ºC (nitrógeno líquido).

La descongelación de los oocitos se consigue convenientemente retirando el contenedor sellado del refrigerador de nitrógeno líquido y, preferiblemente manteniéndolo a temperatura ambiente en aire durante aproximadamente 1 minuto, y hasta 3 a 5 minutos. Esto produce una velocidad de calentamiento de entre aproximadamente 20ºC/min y aproximadamente 100ºC/min. Los oocitos podrían calentarse a continuación hasta temperatura ambiente sin importar la velocidad de calentamiento. Preferiblemente, la última etapa se realiza sumergiendo el contenedor sellado en un baño de agua hasta que los oocitos están descongelados. Esto impide que se rompa la zona pelúcida que rodea los oocitos congelados. Alternativamente, se elimina el baño de agua y los oocitos se descongelan a temperatura ambiente; sin embargo, esto lleva más tiempo que el baño de agua y a menudo tiene el efecto de reducir la viabilidad celular.

Una vez se han descongelado los oocitos, el contenedor se abre convenientemente y la solución crioconservante se remplaza con una solución tamponada, isotónica, a pH fisiológico (aproximadamente 6,8 a 7,4), preferiblemente medio FAD, o solución de Ringer con lactato, o el medio de cultivo a usar para potenciar el potencial de fertilización de los oocitos, para eliminar mediante dilución el crioprotector. No todas las soluciones tamponadas, isotónicas, a pH fisiológico, podrían ser aceptables para la dilución del crioprotector. Las solución salida tamponada con fosfato y la solución salina estándar podrían reducir la viabilidad significativamente. Los oocitos descongelados se equilibran preferiblemente a aproximadamente la temperatura ambiente en tampón de lavado o medio de cultivo, preferiblemente durante aproximadamente 15 minutos, y podrían permanecer en éstos durante hasta aproximadamente 4 horas. La visualización microscópica directa puede usarse para determinar si los oocitos son todavía viables en comparación con los oocitos control, no congelados, no almacenados.

Después de colocarlos en la solución de lavado durante un período de tiempo suficiente, los oocitos pueden a continuación cultivarse tal como se describe en esta.

Alternativamente, después de retirarlos del folículo, los oocitos se cultivan y a continuación se congelan antes de llevar a cabo su fertilización, tal como se describe más abajo. El cultivo tiene lugar en un medio de cultivo apropiado, que incluye una combinación de inhibina y activina en una cantidad efectiva para potenciar el potencial de fertilidad de los oocitos en general, y para potenciar la velocidad y alcance de la maduración de los oocitos inmaduros y la calidad de los oocitos en particular. El medio de cultivo en esta es generalmente uno que contiene sales fisiológicamente equilibradas, fuentes de energía, y antibióticos, y que es apropiado para las especies cuyos oocitos están siendo tratados. Los ejemplos de medios apropiados para ciertas especies tales como humanos y monos incluyen el fluido tubal humano (HTF), tal como se obtiene según Quinn et al., Fertil. Steril. 44:493 (1985), suplementado con un 10% de suero de cordón fetal o maternal desactivado con calor, el cual se usa típicamente para IVF y cultivo de embriones, TALP tal como se obtiene según Boatman, en In Vitro Growth of Non-Human Primate Pre- and Peri-Implantation Embryos, Ed. Bavister, pp. 273-308 (Nueva York, Plenum Press, 1987), medio F-10 de Ham, medio B'' de Menezo (BioMerieux S.A., Francia), medio de Earles (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), etc. Las revisiones generales que describen estos tipos de medios incluyen la de Menezo y Khatchadourian, "The Laboratory Culture Media", Assisted Reproduction Reviews 1:136 (1991), y la de Leese, "Metabolism of the Preimplantation Mammalian Embryo",
Oxford Reviews of Reproductive Biology 13:35-72 (1991), Ed. S. R. Milligan, Oxford University Press. El practicante será capaz de trazar el medio necesario apropiado para la especie. El pH del medio de cultivo es generalmente de 7 a 8, más preferiblemente aproximadamente 7,2-7,6.

Las condiciones requeridas para cultivar los oocitos dependen de, por ejemplo, el tipo y número de oocitos que se están tratando. Típicamente, la temperatura de cultivo están en el rango de aproximadamente 36-39ºC, aunque las temperaturas fuera de este rango también podrían considerarse apropiadas, por ejemplo, aproximadamente 35-40ºC. El tiempo de cultivo es al menos de aproximadamente 1 hora, preferiblemente aproximadamente de 4 a 100 horas, y más preferiblemente aproximadamente de 12 a 36 horas. Típicamente, el entorno del cultivo contiene aproximadamente un 95-100% de humedad, un 5% de CO_{2}, un 5% de O_{2}, y un 90% de N_{2}. Los frascos de cultivo de tejidos de plástico que son útiles para realizar el cultivo incluyen los tubos de ensayo, los viales, las placas de cultivo de órganos, las placas de petri, o las placas de ensayo de microvaloraciones.

La cantidad efectiva de inhibina y activina contenida en el medio de cultivo tendrá en consideración, por ejemplo, la especie de la que se extrajo el oocito, el número de oocitos que se está tratando, la toxicidad o efectos indeseables de usar un exceso de la inhibina y/o activina, y otros factores conocidos por los practicantes.

Como propuesta general, la cantidad farmacéuticamente efectiva de cada una de inhibina o activina en el medio de cultivo será de al menos aproximadamente 0,01 ng/ml de medio de cultivo, más preferiblemente al menos 0,1 ng/ml, todavía más preferiblemente en el rango de aproximadamente 1 ng/ml hasta aproximadamente 100 mg/ml de medio de cultivo, aún más preferiblemente desde aproximadamente 10-100 ng/ml hasta aproximadamente 10 mg/ml de medio de cultivo, aunque, tal como se ha destacado más arriba, esto estará sometido a un buen grado de discreción terapéutica. El factor clave al seleccionar una dosis apropiada es el resultado obtenido, por ejemplo, la potenciación de la velocidad y/o alcance de la maduración del oocito, o la potenciación de la calidad de los oocitos, cada uno de los cuales debe verificarse mediante los criterios proporcionados más arriba, o mediante otros criterios, según sea considerado apropiado por el practicante. Puesto que se emplea una combinación de inhibina y activina, las cantidades de cada agente pueden ser algo inferiores que las cantidades dadas más arriba, y esto será a la discreción y formación del practicante médico.

Para el tratamiento de los oocitos, la inhibina o activina, solas o en combinación de inhibina y activina, se formulan generalmente mezclándolas separadamente o juntas con el grado de pureza deseado, en una forma tal como una solución, suspensión, o emulsión, con un portador farmacéuticamente aceptable, es decir, uno que no es tóxico para los oocitos en las dosis y concentraciones empleadas, y que es compatible con otros ingredientes del medio de cultivo. Por ejemplo, el portador para la inhibina y/o activina preferiblemente no incluye agentes oxidantes y otros compuestos que se sabe son perjudiciales para los polipéptidos.

La inhibina y la activina se añaden convenientemente al medio de cultivo por medios separados o por el mismo. En general, la inhibina y/o activina están presentes antes de añadir los oocitos.

Una vez que los oocitos han madurado o están estimulados hasta el punto de ser capaces de fertilización, tal como se indica mediante uno o más de los factores mencionados más arriba, u otros, se mezclan con los espermatozoides apropiados procedentes de la misma especie, lo que resulta en su fertilización. La fertilización con esperma podría realizarse in vitro mediante técnicas conocidas, incluyendo la inyección de esperma, o in vivo, incluyendo aquéllas indicadas más abajo y tecnologías más nuevas para efectuar la fertilización.

Los ejemplos de fertilización in vitro de humanos y los procedimientos de transferencia de embriones que podrían llevarse a cabo exitosamente usando el procedimiento de esta invención incluyen, por ejemplo, la fertilización in vitro y la transferencia de embrión (IVF-ET) (Quigly et al., Fertil. Steril. 38:678 (1982)), la transferencia intrafalopio del gameto (GIFT) (Molloy et al., Fertil. Steril. 47:289 (1987)), y la transferencia tual en el estado pronuclear (PROST). Yovich et al., Fertil. Steril. 48:851 (1987). El éxito de tales procedimientos está positivamente correlacionado con el número de oocitos extraídos y el número de embriones viables transferidos.

En IVT-ET, los oocitos se inseminan con espermatozoides lavados y emigrados (típicamente de 100.000 a 200.000 por oocito). La fertilización se verifica típicamente de a las 12 a 18 horas después de la inseminación, y los oocitos se transfieren a medio de cultivo, tal como HTF, F-10 de Ham, o Earles. Sólo se transfieren embriones normales a las pacientes, en la etapa de 2 a 8 células, típicamente a las 48 a 56 horas después de su extracción.

Los protocolos generales para la IVF incluyen aquéllos descubiertos por Trounson et al., ver más arriba; Trounson y Leetoin, en Eds. Edwards y Purdy, Human Conception in Vitro , (Nueva York, Academic Press, 1982), y Trounson, en Eds. Crosignani y Rubin, In Vitro Fertilization and Embryo Transfer, p. 315 (Nueva York, Academic Press, 1983).

La amenaza de fase luteal no inducida por hormona por deficiencia hormonal, que pudiera ocurrir en la IVF, podría mejorarse mediante la administración de progesterona.

Para el protocolo PROST, todos los procedimientos para la aspiración del oocito, potenciación del potencial de fertilización, preparación de la suspensión de semen, e inseminación se realizan usando el mismo procedimiento que en el programa de IVF. Después de la verificación de la fertilización del oocito, se transfieren oocitos pronucleares a la trompa de falopio usando el mismo procedimiento que en el programa GIFT, en donde la trompa de falopio está cateterizada tal como describen Molloy et al., Fertil. Steril. 47:289 (1987).

Otro procedimiento y aparato para la IVF se halla en la WO 92/20.359, publicada el 26 de noviembre de 1992, en donde los oocitos a fertilizar se colocan en cámaras para oocitos, individuales, de pequeño volumen, dispuestas aproximadamente en la periferia de una microgota de medio de fertilización. A continuación se coloca una muestra de esperma, particularmente una muestra de esperma sin fraccionar, en el centro de la microgota. El esperma con motilidad tiende a moverse rápidamente hacia la periferia de la microgota, resultando en la separación in situ del esperma móvil del no móvil. Una vez en la periferia, la fertilización por esperma que entra en las cámaras de oocitos es fácil, a causa del pequeño volumen de la cámara.

La invención se entenderá más completamente por referencia a los ejemplos siguientes. Éstos no deberían, sin embargo, considerarse como limitantes del ámbito de la invención.

Ejemplo 1

El propósito de este ejemplo fue investigar el efecto de la inhibina, activina, o una combinación de inhibina y activina sobre la maduración in vitro de oocitos de mono rhesus, y sobre la calidad de los oocitos tratados de ese modo.

Se recuperaron oocitos inmaduros a partir de ovarios extraídos de cuatro monos rhesus hembra con ciclos menstruales regulares (5-13 años de edad) procedentes del Oregon Regional Primate Research Center en Beaverton, Oregon. Las monas se sometieron a ooforectomía (extracción quirúrgica de los ovarios). Los ovarios se extrajeron de animales anestesiados mediante laparotomía pélvica paramediana. Las monas recibieron preoperativamente atropina (0,3 mg, intramuscularmente, Eli Lilly, Indianapolis, IN) y cloruro de succinilcolina (20 mg, intravenosamente, marca Quelicina™ de Abott Labs, Chicago, IL), seguidas inmediatamente por la intubación y anestesia con 1,0 a 1,5% de halotano (Halocarbon Labs, Hackensack, N.J.) vaporizado con N_{2}O:O_{2} (1:4). Los ovarios se recolectaron en medio de cultivo TALP que contenía HEPES (ácido 4-[2-hidroxietil]-1-piperazinoetanosulfónico), medio de cultivo con heparina (25 IU/ml), pH 7,4, a 37ºC. Los medios de cultivo TALP y TALP-HEPES se prepararon inmediatamente usando la técnica descrita por Boatman, en In Vitro Growth of Non-Human Primate Pre- and Peri-Implantation Embryos, ver más arriba). Tanto TALP como TALP-HEPES estaban a pH 7,4 y a una osmolalidad de 285-295 mOsm.

Dentro de los 10 minutos posteriores a la ooforectomía, bajo un microscopio de disección, se seccionaron los ovarios en cuartos. Los ovarios procedentes de cada hembra formaron un replicado. Todas las manipulaciones se realizaron en TALP-HEPES a 37ºC. Los folículos antrales se separaron individualmente, y se pincharon con una aguja de 25 gauge. Los oocitos liberados se recolectaron y juntaron a intervalos en gotas de 500 \mul de TALP-HEPES bajo 6 ml de aceite mineral estéril, equilibrado con TALP (Sigma, St. Louis, MO), a 37ºC. En el momento de la recolección, los oocitos se midieron usando un ocular micrométrico. Los oocitos más pequeños de 100 \mum de diámetro vitelino, con menos de dos capas condensadas de células granuladas, u oocitos que estaban obviamente degenerados (citoplasma vacuolado, citolisis, necrosis, o pérdida de la forma esférica) se excluyeron de este estudio.

Dentro de los 60 minutos siguientes a la recolección, los complejos de oocito-cumulus (OCC) se asignaron aleatoriamente a una de cuatro condiciones de cultivo in vitro: medio de cultivo TALP solo, obtenido tal como se describió más arriba (control) o medio TAL que contenía 100 ng/ml de inhibina A humana recombinante, 100 ng/ml de activina A humana recombinante, o 100 ng/ml de cada una de inhibina A humana recombinante y activina A humana recombinante. Las formas recombinantes de la activina A humana y de la inhibina A humana empleadas en ésta se describen en la patente estadounidense nº 4.798.885, ver más arriba. Están también disponibles de Genentech, Inc., South San Francisco, CA, como reactivos de investigación pre-clínica. Ambos reactivos se producen como reactivos estériles, libres de endotoxinas.

Los OOC se colocaron individualmente en gotas de 50 \mul de uno de los cuatro cultivos anteriores, en un medio de cultivo bajo 5 ml de aceite mineral estéril, equilibrado con TALP, y se incubaron en una atmósfera humidificada de 5% de CO_{2} en aire, a 37ºC. Los OOC se examinaron y evaluaron periódicamente sobre un microscopio invertido Nikon Diaphot-TMD™, usando ópticas Hoffman™, a 400\times, a las 6, 12, 24, 30, 36 y 48 horas de cultivo. Los parámetros evaluados fueron: expansión y mucificación del cumulus, presencia de la GV o ausencia (GVBD), y presencia o ausencia del cuerpo polar. La ausencia de una GV y la presencia de un cuerpo polar fueron la medida de una maduración nuclear completa (MII). Después de 24 horas de cultivo, las células cumulus se dispersaron de los oocitos mediante pipeteado suave a través de pipetas de vidrio, convenientemente dimensionadas, bombeadas a mano.

Los datos para las Figuras 1-3 procedían de cuatro experimentos. En la Figura 3 los datos se expresan como el porcentaje de la media \pm SE, y los diferentes superíndices (a, ab, bc, c y b) varían significativamente p < 0,05 dentro de la etapa. Los datos para la Figura 4 procedían de tres experimentos y se expresaron como el porcentaje de la media \pm SE. Los análisis estadísticos para las Figuras 1 y 2 se realizaron usando el test exacto de Fisher, y para las Figuras 3 y 4 se realizaron usando análisis de la variancia de una vía (ANOVA) para mediciones repetidas.

La Figura 1 indica que la potenciación en la velocidad de maduración del oocito de mona rhesus con inhibina o activina solas no era estadísticamente significativa, tal como indicaba una GVBD después de 12 y 20 horas de incubación. Sin embargo, la incubación con la combinación de inhibina-activina significativamente acelera la maduración del oocito (es decir, incrementó la velocidad de maduración) respecto los valores del control en un 44% y 48% (p < 0,01) después de, respectivamente, 12 y 20 horas de incubación. La Figura 2 indica que la combinación de inhibina-activina significativamente potenció la velocidad de maduración meiótica del oocito hasta la etapa MII, tal como indica la extrusión del primer cuerpo polar. A las 12, 20 ó 30 horas de incubación, la combinación inhibina-activina elevó la maduración del oocito hasta MII respecto los valores control en, respectivamente, un 25%, 43% y 50% (p < 0,05). Esta potenciación en la velocidad de maduración hasta MII no se observó con ninguna de inhibina o activina solas.

La Figura 3 indica que 36 ó 48 horas de incubación con inhibina sola, con activina sola, y con la combinación de inhibina-activina, en todos los casos incrementó significativamente el alcance de la maduración de los oocitos. Por tanto, el porcentaje de oocitos de monas rhesus que experimentaron la GVBD incrementó desde el 39,3% para el grupo control hasta, respectivamente, el 57%, 63%, y 82% (p < 0,01). También se observaron incrementos significativos en los porcentajes de oocitos que maduraron hasta la MII usando inhibina o activina solas, en comparación con los oocitos control, y se observó un incremento de más de dos veces en el porcentaje de oocitos inmaduros que alcanzaban la MII en presencia de la combinación de inhibina-activina respecto los oocitos control (62,2% vs. 27,4%, respectivamente).

La Figura 4 muestra fotografías (400\times, ópticas Hoffman™) de los oocitos control cultivados durante 24 horas (Figura 4A), así como de los oocitos cultivados, tal como se ha descrito más arriba, usando una combinación de inhibina y activina durante 12 horas (Figura 4B) y usando activina sola durante 36 horas (Figura 4C). La calidad de los oocitos se verificó subjetivamente mediante criterios tales como la forma de los oocitos, la expansión del cumulus, la GVBD, la extrusión del primer cuerpo polar.

A partir de las fotografías puede observarse que en el oocito control la vesícula germinal estaba todavía intacta y las células granuladas estaban densamente pegadas al oocito. El oocito tratado con la combinación de inhibina-activina durante 12 horas experimentó la GVBD, y las células del cumulus se expandieron. El oocito tratado con activina sola durante 36 horas mostró un espacio perivitelino preciso y un primer cuerpo polar. Por tanto, está claro, a partir de la apariencia de los oocitos en las fotografías, que la calidad de los oocitos tratados con activina y la combinación es significativamente mejor que las de los oocitos control. La calidad de los oocitos tratados con inhibina sola es la misma que la de los oocitos tratados con activina o la combinación después de un período de cultivo comparable.

Ejemplo 2

La folistatina humana (FS), que bioneutraliza ambas, la inhibina y la activina, se usó en una serie de experimentos para evaluar si los efectos de la activina, y de la combinación inhibina-activina, sobre la velocidad y grado de maduración in vitro de los oocitos de primates eran específicos.

Tal como se describió en el Ejemplo 1, se recuperaron oocitos inmaduros a partir de ovarios extraídos de monas rhesus con ciclos menstruales regulares (N = 3), se cultivaron in vitro, bien en medio de cultivo TALP solo (control), o en presencia de 100 ng/ml de activina, 100 ng/ml de cada una inhibina y activina, 100 ng/ml de FS, 100 ng/ml de cada una activina y FS, o 100 ng/ml de cada una de inhibina, activina y FS. La FS humana recombinante purificada empleada en este ejemplo se obtuvo mediante procedimientos estándares de expresión recombinante, tal como describieron Esch et al., Mol. Endocrinol. 1:849-855 (1987) y Shimasaki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4218-4222 (1988).

Los resultados, proporcionados en la Figura 5, en la que los diferentes superíndices (a, c, ad, cd, ab, abc y d) varían significativamente (p < 0,05) con la etapa, mostraron que la FS negaba el efecto potenciador de la activina y de la combinación inhibina-activina (p < 0,05) sobre la velocidad y grado de maduración del oocito. Cuando se añadió al medio de cultivo que contenía activina o la combinación inhibina-activina, la FS disminuyó el porcentaje de oocitos inmaduros que experimentaban la GVBD hasta un nivel similar al del grupo FS o al del grupo control (37,4%, 28,5%, 65%, 44,4%, 62,9%, y 35,8% respectivamente para los grupos control, la FS sola, la activina sola, la activina+FS, la inhibina+activina, y la inhibina+activina+FS).

Ejemplo 3

Se cultivaron oocitos inmaduros con inhibina, activina, o una combinación de inhibina y activina, tal como se describió en el Ejemplo 1. Los oocitos cultivados que alcanzaron la etapa MII fueron desafiados con esperma de monos rhesus, y se fertilizaron in vitro usando técnicas estándares conocidas en la técnica. La velocidad de fertilización de los oocitos MII tratados con inhibina (51%), activina (45%), y la combinación de inhibina y activina (68%) se incrementó por encima de la de los oocitos control (no tratados) (23%). Estos resultados muestran que la calidad mejorada de los oocitos tratados se traduce en un incremento en la velocidad de fertilización para los oocitos tratados.

Esta invención demuestra por primera vez que la inhibina, activina, y la combinación de inhibina y activina son estimulantes potentes de la reanudación del oocito meiótico, tanto desde una perspectiva cualitativa como cuantitativa. Estos agentes incrementan sustancialmente el alcance de la maduración y la calidad de los oocitos en general, incrementando, de ese modo, la capacidad de fertilización. Más aún, el uso de la combinación potencia sustancialmente la velocidad de maduración in vitro de los oocitos inmaduros.

Claims (16)

1. Procedimiento para incrementar el número de oocitos maduros en un cultivo in vitro de oocitos, que comprende cultivar oocitos inmaduros con una cantidad de una combinación de inhibina y activina que es efectiva para incrementar el número de oocitos maduros.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde los oocitos que están siendo cultivado se extrajeron de ovarios no estimulados.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde los oocitos son oocitos de mamíferos.

4 El procedimiento de la reivindicación 3, en donde el mamífero es un especie en peligro de extinción o un animal de deporte o de granja.

5 El procedimiento de la reivindicación 3, en donde el mamífero es primate no humano o un humano.

6 El procedimiento de la reivindicación 3, en donde el mamífero es humano.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en donde la inhibina es inhibina humana y la activina es activina humana.

8. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además mezclar los oocitos cultivados in vitro con espermatozoides, resultando en su fecundación.

9. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde la cantidad efectiva de cada una de inhibina y activina en el medio de cultivo es de al menos aproximadamente 0,01 ng/ml de medio de cultivo.

10. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además la crioconservación de los oocitos cultivados.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, que comprende además descongelar los oocitos crioconservados para producir oocitos intactos, viables, capaces de fertilización.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, que además comprende fertilizar in vitro los oocitos descongelados.

13. Procedimiento para incrementar la velocidad de maduración de oocitos inmaduros, que comprende cultivar los oocitos in vitro con una cantidad de una combinación de inhibina y activina efectiva para incrementar su velocidad de maduración.

14. Procedimiento para fertilizar oocitos extraídos de un folículos, que comprende cultivar los oocitos in vitro con una cantidad de una combinación de inhibina y activina efectiva para incrementar el número de oocitos maduros en el cultivo, y fertilizar los oocitos cultivados in vitro.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, en donde el paso de fertilización comprende mezclar los oocitos cultivados con espermatozoides.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en donde el paso de fertilización comprende inyectar esperma en los oocitos cultivados.

17. Procedimiento que comprende crioconservar oocitos inmaduros, descongelar los oocitos crioconservados, y cultivar los oocitos descongelados in vitro con una cantidad de una combinación de inhibina y activina efectiva para incrementar el número de oocitos maduros en el cultivo, para producir oocitos intactos, viables, capaces de fertilización.

18. El procedimiento de la reivindicación 17, en donde los oocitos se extraen de ovarios no estimulados.

19. El procedimiento de la reivindicación 17, que comprende además fertilizar in vitro los oocitos cultivados.