ES2208676T3 - Factor 10 de crecimiento de fibroblasto. - Google Patents
Factor 10 de crecimiento de fibroblasto.Info
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Abstract
SE PRESENTAN LOS POLIPEPTIDOS HUMANOS FGF-10 Y EL ADN (ARN) QUE CONDIFICA DICHOS POLIPEPTIDOS FGF-10. TAMBIEN SE PROPORCIONA UNA PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCION DE DICHO POLIPEPTIDO MEDIANTE TECNICAS RECOMBINANTES. TAMBIEN SE PRESENTAN METODOS PARA UTILIZAR DICHO POLIPEPTIDO PARA ESTIMULAR LA REVASCULARIZACION, PARA EL TRATAMIENTO DE HERIDAS Y PARA PREVENIR EL DAÑO NEURONAL. TAMBIEN SE PRESENTAN ANTAGONISTAS DE DICHOS POLIPEPTIDOS Y SU USO COMO TERAPEUTICO PARA LA PREVENCION DE LA PROLIFERACION CELULAR ANORMAL, DE LAS ENFERMEDADES HIPERVASCULARES Y DE LA PROLIFERACION DE CELULAS DEL CRISTALINO EPITELIAL. TAMBIEN SE PRESENTAN METODOS DE DIAGNOSTICO PARA LA DETECCION DE MUTACIONES EN LA SECUENCIA QUE CODIFICA EL FGF-10 Y LAS ALTERACIONES EN LA CONCENTRACION DE LA PROTEINA FGF-10 EN UNA MUESTRA OBTENIDA DE UN HUESPED.
Description
Factor 10 de crecimiento de fibroblastos.
Esta invención se refiere a polinucleótidos
recién identificados, a polipéptidos codificados por dichos
polinucleótidos, al uso de tales polinucleótidos y polipéptidos,
así como a la producción de tales polinucleótidos y polipéptidos.
Más en particular, los polipéptidos de la presente invención son
factor 10 de crecimiento de fibroblastos/factor 10 de crecimiento
de unión a la heparina, en lo sucesivo denominado como
"FGF-10". La invención también se refiere a la
inhibición de la acción de tales polipéptidos.
Los factores de crecimiento de fibroblastos son
una familia de proteínas características de la unión a la heparina
y, por tanto, también se denominan factores de crecimiento de unión
a la heparina (HBGF). La expresión de diferentes miembros de estas
proteínas se encuentra en diversos tejidos y están bajo control
temporal y espacial particular. Estas proteínas son potentes
mitógenos de una diversidad de células de origen mesodérmico,
ectodérmico y endodérmico, incluyendo los fibroblastos, células del
endotelio corneal y vascular, granulocitos, células de la corteza
suprarrenal, condrocitos, mioblastos, células del músculo liso
vascular, células epiteliales del cristalino, melanocitos,
queratinocitos, oligodendrocitos, astrocitos, osteoblastos y
células hematopoyéticas.
Cada miembro tiene funciones que solapan con
otras y también tiene su espectro característico de funciones.
Además de la capacidad para estimular la proliferación de células
del endotelio vascular, tanto FGF-1 como 2 son
quimiotácticos para las células endoteliales y el
FGF-2 ha demostrado que permite a las células
endoteliales penetrar e la membrana basal. En concordancia con
estas propiedades, tanto FGF-1 como 2 tienen la
capacidad para estimular angiogénesis. Otra característica
importante de estos factores de crecimiento es su capacidad para
promover la curación de heridas. Muchos otros miembros de la familia
de FGF comparten actividades similares con FGF-1 y 2
tales como promover angiogénesis y la curación de heridas. Se ha
demostrado que varios miembros de la familia de genes FGF inducen
formación mesodérmica y modulan la proliferación de células
neuronales, adipocitos y células del músculo esqueletal.
Aparte de estas actividades biológicas en tejidos
normales, las proteínas FGF se han implicado en la promoción de
tumorigénesis en carcinomas y sarcomas promoviendo la
vascularización tumoral y como proteínas transformantes cuando se
no está regulada su expresión.
La familia FGF comprende en la actualidad de ocho
polipéptidos estructuralmente relacionados. Los genes de cada uno
se han clonado y secuenciado. Dos de los miembros,
FGF-1 y FGF-2, se han caracterizado
con muchos nombres, pero los más frecuencias son factor de
crecimiento de fibroblastos ácido y básico, respectivamente. Los
productos génicos normales influyen en la capacidad de
proliferación general de la mayoría de las células derivadas del
mesodermo y neuroectodermo. Estas pueden inducir angiogénesis in
vivo y pueden desempeñar importantes funciones en el desarrollo
temprano (Burgess, W.H. and Maciag, T., Annu. Rev. Biochem.,
58:575-606, (1989)).
Se ha introducido por transferencia génica en
arterias porcinas un vector de expresión eucariota que codifica una
forma secretada de FGF-1. Este modelo define la
función génica en la pared arterial in vivo. La expresión de
FGF-1 indujo engrosamiento de la capa íntima en
arterias porcinas 21 días después de la transferencia génica
(Nabel, E.G., et al., Nature, 362:844-6
(1993)). También se ha demostrado que el factor de crecimiento de
fibroblastos puede regular el crecimiento de gliomas y la
progresión independiente de su función en angiogénesis tumoral y
que para estas acciones pueden ser necesaria la liberación o
secreción del factor de crecimiento de fibroblastos básico
(Morrison, R.S., et al., J. Neurosci. Res.,
34:502-9 (1993)).
Los factores de crecimiento de fibroblastos,
tales como FGF básico, se han relacionado también con el crecimiento
de células del sarcoma de Kaposi in vitro (Huang, Y.Q.,
et al., J. Clin. Invest., 91:1191-7 (1993)).
Además, la secuencia de cDNA que codifica el factor de crecimiento
de fibroblastos básico humano se ha clonado cadena abajo de un
promotor de transcripción reconocido por el bacteriófago T7 RNA
polimerasa. Los factores de crecimiento de fibroblastos básicos así
obtenidos han demostrado que tienen actividad biológica que no
puede diferenciarse del factor de crecimiento de fibroblastos de la
placenta humana en ensayos de mitogenicidad, síntesis de activador
de plasminógeno y angiogénesis (Squires, C. H., et al., J.
Biol. Chem., 263:16297-302 (1988)).
La patente de Estados Unidos nº 5.155.214
describe factores de crecimiento de fibroblastos básicos de
mamíferos sustancialmente puros y su producción. Se describen las
secuencias de aminoácidos del factor de crecimiento de fibroblastos
básico bovino y humano, así como la secuencia de DNA que codifica
el polipéptido de las especies bovinas.
De la familia de FGF, se han descrito además
FGF-3 (int-2), FGF-4
(HST), el producto de los genes conocidos como
FGF-5 y FGF-6 (Marics, Oncogene 4
(1989), 335), FGF-7 (factor de crecimiento de
queratinocitos, KGF; Finch, Science 245 (1989), 752),
FGF-8 (factor de crecimiento inducido por
andrógenos, Tanaka, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89 (1992), 8928) y
FGF-9 (Miyamato, Mol. Cell, Biol. 13 (1993),
4251).
El polipéptido de la presente invención se ha
identificado supuestamente como miembro de la familia de FGF como
resultado de la homología de secuencia de aminoácidos con otros
miembros de la familia FGF.
Conforme a un aspecto de la presente invención,
se proporcionan nuevos polipéptidos maduros que son
FGF-10, así como sus fragmentos biológicamente
activos útiles en diagnóstico y terapéuticamente. Los polipéptidos
de la presente invención son de origen humano.
Conforme a un aspecto de la presente invención,
se proporcionan moléculas de ácido nucleico aislado que codifican
FGF-10 humano, incluyendo mRNA, DNA, cDNA, DNA
genómico, así como sus análogos antisentido y sus fragmentos
biológicamente activos y útiles para diagnóstico y
terapéuticamente.
Conforme con otro aspecto de la presente
invención, se proporciona un procedimiento para producir dicho
polipéptido por técnicas recombinantes mediante el uso de vectores
recombinantes, tales como plásmidos de clonación y expresión útiles
como reaccionantes en la producción por recombinación de proteínas
de FGF-10, así como las células procariotas y/o
eucariotas hospedadoras recombinantes que comprenden una secuencia
de ácido nucleico de FGF-10 humano.
Conforme a otro aspecto de la presente invención,
se proporciona un procedimiento para usar dicho polipéptido o
polinucleótido que codifica dicho polipéptido, con fines
terapéuticos, por ejemplo, promover la curación de heridas,
quemaduras y úlceras, prevenir la lesión neuronal debida a
trastornos neuronales y prevenir el envejecimiento cutáneo y la
pérdida de cabello.
Conforme a otro aspecto de la presente invención,
se proporcionan anticuerpos contra tales polipéptidos.
Conforme a otro aspecto de la presente invención,
se proporcionan antagonistas contra tales polipéptidos, que se
pueden usar para inhibir la acción de dicho polipéptido, por
ejemplo, en el tratamiento de tumores y enfermedades
hipervasculares.
Conforme a otro aspecto de la presente invención,
se proporcionan sondas de ácido nucleico que comprenden moléculas
de ácido nucleico de longitud suficiente para hibridar de forma
específica secuencias de FGF-10 humano.
Conforme a otro aspecto de la presente invención,
se proporcionan ensayos diagnósticos para detectar enfermedades o la
susceptibilidad a enfermedades relacionadas con mutaciones en
secuencias de ácido nucleico de FGF-10 o la
sobreexpresión de los polipéptidos codificados por dichas
secuencias.
Conforme a otro aspecto de la presente invención,
se proporciona un procedimiento para usar dichos polipéptidos, o
polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos, con fines in
vitro relacionados con investigación científica, síntesis de
DNA y fabricación de vectores de DNA.
Estos y otros aspectos de la presente invención
serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la
presente memoria descriptiva.
Los siguientes dibujos se presentan únicamente
como ilustraciones de realizaciones específicas de la presente
invención y no pretenden limitarla en modo alguno.
La Figura 1 representa la secuencia de cDNA y la
correspondiente secuencia de aminoácidos deducida de
FGF-10. La secuencia de aminoácidos mostrada
representa la forma madura de la proteína. Se usan las abreviaturas
convencionales de una letra para los aminoácidos. Cuando se intenta
determinar la secuencia de polinucleótidos un problema común es la
inexactitud en la secuenciación. La secuenciación se llevó a cabo
usando un secuenciador de DNA automatizado 373 Automated DNA
(Applied Biosystems, Inc.). Cabe esperar que la exactitud en la
secuenciación sea mayor que 97%.
La Figura 2 ilustra la homología de secuencia de
aminoácidos entre FGF-10 y otros miembros de la
familia de FGF. Los aminoácidos conservados están indicados en
negrita.
La Figura 3 muestra un gel de
SDS-PAGE después de la transcripción/traducción
in vitro de la proteína FGF-10.
Conforme a un aspecto de la presente invención,
se proporcionan moléculas de ácidos nucleicos aislados
(polinucleótidos) que codifican el polipéptido maduro que tiene la
secuencia de aminoácidos deducida de la Figura 1 (SEQ ID Nº 2) o el
polipéptido maduro codificado por el cDNA del clon depositado como
nº de depósito de la ATCC 75696 el 4 de marzo de 1994.
El polinucleótido de esta invención se descubrió
inicialmente en una genoteca de cDNA derivada de tejido humano en
etapa temprana de 8 semanas y posteriormente se encontró el cDNA de
longitud completa en una genoteca derivada de la amígdala humana.
Está estructuralmente relacionado con todos los miembros de la
familia de genes del factor de crecimiento de fibroblastos y
contiene un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido de
181 aminoácidos. Entre las mejores coincidencias se encuentran:
identidad del 37% y similitud de secuencia del 67% con
FGF-9 aislado de cerebro en un tramo de 129
aminoácidos; 2) identidad del 36% y similitud del 64% con
FGF-7 (factor de crecimiento de queratinocitos) en
una región de 121 aminoácidos; 3) identidad del 33% y similitud del
55% con FGF-1 (FGF ácido) en un tramo de 110
aminoácidos. Además, la firma de la familia FGF/HBGF,
GXLX(S,T,A,G)X6(D,E)CXFXE se conserva en
el polipéptido de la presente invención (X significa cualquier
resto aminoacídico); (DE) significa cualquiera de los restos D o E;
X6 significa cualquiera de 6 restos aminoacídicos).
El polinucleótido de la presente invención puede
estar en la forma de RNA o en la forma de DNA, incluyendo el DNA
cDNA, DNA genómico y DNA de síntesis. El DNA puede ser bicatenario
o monocatenario. La secuencia codificante que codifica el
polipéptido maduro puede ser idéntica a la secuencia codificante
mostrada en la Figura 1 (SEQ ID Nº 1) o la del clon depositado o
puede ser una secuencia codificante distinta, como resultado de la
redundancia o degeneración del código genético, codifica el mismo
polipéptido maduro que el DNA de la Figura 1 (SEQ ID Nº 1) o el
cDNA depositado.
El polinucleótido que codifica el polipéptido
maduro de la Figura 1 (SEQ ID Nº 2) o el polipéptido maduro
codificado por el cDNA depositado puede incluir: solo la secuencia
codificante del polipéptido maduro; la secuencia codificante del
polipéptido maduro y otra secuencia codificante tal como la
secuencia guía o secretora o una secuencia proproteína; la secuencia
codificante del polipéptido maduro (y opcionalmente otra secuencia
codificante) y la secuencia no codificante, tal como intrones o la
secuencia 5' y/o 3' no codificante de la secuencia codificante del
polipéptido maduro.
Así, la expresión "polinucleótido que codifica
un polipéptido" incluye un polinucleótido que incluye solo
secuencia codificante para el polipéptido así como un
polinucleótido que incluye otra secuencia codificante y/o no
codificante. La presente invención se refiere además a variantes de
los polinucleótidos descritos en la presente antes que codifican
fragmentos, análogos y derivados del polipéptido que tiene la
secuencia de aminoácidos deducida de la Figura 1 (SEQ ID Nº 2) o el
polipéptido codificado por el cDNA del clon depositado. Las
variantes del polinucleótido pueden ser una variante alélica de
origen natural del polinucleótido o una variante no natural del
polinucleótido.
Así, la presente invención incluye
polinucleótidos que codifican el mismo polipéptido maduro que el
mostrado en la Figura 1 (SEQ ID Nº 2) o el mismo polipéptido maduro
codificado por el cDNA del clon depositado, así como variantes de
tales polinucleótidos, codificando dichas variantes preferiblemente
un fragmento del polipéptido de la Figura 1 (SEQ ID Nº 2) o el
polipéptido codificado por el cDNA del clon depositado. Tales
variantes nucleotídicas incluyen variantes por eliminación,
variantes por sustitución y variantes por adición o inserción.
Como se ha indicado antes en la presente memoria,
el polinucleótido puede tener una secuencia codificante que es una
variante alélica de origen natural de la secuencia codificante
mostrada en la Figura 1 (SEQ ID Nº 1) o de la secuencia codificante
del clon depositado. Como es conocido en la técnica, una variante
alélica es una forma alternativa de una secuencia de polinucleótido
que puede tener una sustitución, eliminación o adición de uno o más
nucleótidos, que no alteran de forma sustancial la función del
polipéptido codificado.
La presente invención incluye también
polinucleótidos, en los que la secuencia codificante del
polipéptido maduro se puede fusionar en el mismo marco de lectura
con una secuencia de polinucleótido que ayude en la expresión y
secreción de un polipéptido por parte de una célula hospedadora, por
ejemplo, una secuencia guía que funcione como secuencia de
secreción para controlar el transporte de un polipéptido en la
célula. El polipéptido que tiene una secuencia guía es una
preproteína y puede tener la secuencia guía escindida por una
célula hospedadora para formar la forma madura del polipéptido. Los
polinucleótidos también puede codificar una proproteína que es la
proteína madura más restos aminoacídicos 5' adicionales. Una
proteína madura que tiene una prosecuencia es una proproteína y es
una forma inactiva de la proteína. Una vez escindida la
prosecuencia queda una proteína madura activa.
Así, por ejemplo, el polinucleótido de la
presente invención puede codificar una proteína madura o una
proteína que tenga una prosecuencia o una proteína que tenga una
prosecuencia y una presecuencia (secuencia guía).
Los polinucleótidos de la presente invención
también pueden tener la secuencia codificante fusionada en el marco
con una secuencia marcadora que permita la purificación del
polipéptido de la presente invención. La secuencia marcadora puede
ser una marca hexahistidina suministrada por un vector
pQE-9 para proporcionar la purificación del
polipéptido maduro fusionado con el marcador en el caso de un
hospedador bacteriano o, por ejemplo, la secuencia marcadora puede
ser una marca hemaglutinina (HA) cuando se usa un hospedador
mamífero, por ejemplo, células COS-7. La marca HA
corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de
la gripe (Wilson, I., et al., Cell, 37:767 (1984)).
La presente invención se refiere además a
polinucleótidos que se hibridan con las secuencias descritas antes
en la presente memoria si existe al menos una identidad del 95%
entre las secuencias. La presente invención se refiere en
particular a polinucleótidos que se hibridan en condiciones de
restricción con los polinucleótidos descritos antes en la presente
memoria. Tal y como se usa en la presente memoria, la expresión
"condiciones de restricción" significa que la hibridación se
producirá solo si hay una identidad entre las secuencias de al
menos 95% y preferiblemente de al menos 97%. Los polinucleótidos que
se hibridan con los polinucleótidos descritos antes en la presente
memoria codifican polipéptidos que retienen sustancialmente la misma
función o actividad biológica que el polipéptido maduro codificado
por el cDNA de la Figura 1 (SEQ ID Nº 1) o el cDNA depositado.
El(los) depósito(s) citados en la
presente memoria se mantendrán según el Tratado de Budapest sobre
Reconocimiento Internacional de Depósito de Microorganismos a
efectos del procedimiento de la patente. Estos depósitos se
proporcionan únicamente por conveniencia y, no son un reconocimiento
de que se requiera depósito según el artículo 35 U.S.C., \NAK
11.2. La secuencia de los polinucleótidos contenidos en los
materiales depositados, así como la secuencia de aminoácidos de los
polipéptidos codificados por ellos, se incorpora en la presente
memoria como referencia y son determinantes en el caso de cualquier
conflicto con la descripción de las presentes secuencias. Para
preparar, usar o comercializar los materiales depositados puede ser
necesaria licencia y por la presente no se concede dicha
licencia.
licencia.
La presente invención se refiere además a un
polipéptido de FGF-10 que tiene la secuencia de
aminoácidos deducida de la Figura 1 (SEQ ID Nº 2) o que tiene la
secuencia de aminoácidos codificada por el cDNA depositado, así como
a fragmentos dedicho polipéptido. Por otro lado, la presente
invención se refiere a una proproteína que puede activarse por
escisión de la proproteína produciendo un polipéptido maduro
activo.
El término "fragmento" cuando se refiere al
polipéptido de la Figura 1 (SEQ ID Nº 2) o al que es codificado por
el cDNA depositado, se refiere a un polipéptido que retiene
esencialmente la misma función o actividad biológica que dicho
polipéptido. Así, un fragmento incluye un fragmento de una
proproteína generada por escisión de la porción de proproteína para
producir el polipéptido maduro activo.
El polipéptido de la presente invención puede ser
un polipéptido recombinante, un polipéptido natural o un
polipéptido sintético, preferiblemente un polipéptido
recombinante.
El fragmento del polipéptido de la Figura 1 (SEQ
ID Nº 2) o el codificado por el cDNA depositado puede ser (i) uno
en el que uno o más de los restos aminoacídicos están sustituidos
con un resto aminoacídico conservado o no conservado
(preferiblemente un resto aminoacídico conservado) y dicho residuo
aminoacídico sustituido puede o no ser uno codificado por el código
genético, o (ii) uno en el que uno o más de los restos
aminoacídicos incluye un grupo sustituyente, o (iii) uno en el que
el polipéptido maduro se fusiona con otro compuesto, tal como un
compuesto que aumente la semivida del polipéptido (por ejemplo,
polietilenglicol), o (iv) uno en el que los aminoácidos adicionales
se fusionan con el polipéptido maduro, tal como una secuencia guía o
secretora o una secuencia que se emplee para purificar el
polipéptido maduro o una secuencia de proproteína. Se pretende que
tales fragmentos estén dentro del alcance de los expertos en la
técnica a partir de las descripciones de la presente, con tal que
dichos fragmentos retengan sustancialmente la misma función o
actividad biológica que el polipéptido maduro codificado por el
cDNA de la Figura 1 (SEQ ID Nº 1) o el cDNA depositado.
Los polipéptidos y polinucleótidos de la presente
invención se proporcionan preferiblemente en una forma aislada, y
preferiblemente se purifican hasta homogeneidad.
El término "aislado" se refiere a que el
material se retira de su entorno original (por ejemplo, el entorno
natural si es de origen natural). Por ejemplo, un polinucleótido o
polipéptido de origen natural presente en un animal vivo no está
aislado, pero el mismo polinucleótido o DNA o polipéptido, separado
de parte o todos los materiales coexistentes en el sistema natural,
está aislado. Dicho polinucleótido podría ser parte de un vector
y/o dicho polinucleótido o polipéptido podría ser parte de una
composición y estar todavía aislado porque dicho vector o
composición no es parte de su entorno natural.
La presente invención se refiere también a
vectores que incluyen polinucleótidos de la presente invención,
células hospedadoras que se han modificado genéticamente con
vectores de la invención y a la producción de polipéptidos de la
invención por técnicas recombinantes.
Las células hospedadoras pueden estar modificadas
genéticamente (transducidas o transformadas o transfectadas) con
los vectores de esta invención que pueden ser, por ejemplo, un
vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede
estar, por ejemplo, en forma de plásmido, una partícula viral, un
fago o similar. Las células hospedadoras modificadas genéticamente
se pueden cultivar en medios nutrientes convencionales modificados
según convenga para activar promotores, seleccionar transformantes o
amplificar los genes de FGF-10. Las condiciones de
cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las usadas
previamente con la célula hospedadora seleccionada para la
expresión y serán evidentes para los expertos en la técnica.
El polinucleótido de la presente invención se
puede emplear para producir un polipéptido por técnicas
recombinantes. Así, por ejemplo, la secuencia de polinucleótido se
puede incluir en uno cualquiera de una diversidad de vehículos de
expresión, en particular vectores o plásmidos para expresar un
polipéptido. Tales vectores incluyen secuencias de DNA cromosómico,
no cromosómico y sintético, por ejemplo, derivados de SV40;
plásmidos bacterianos; DNA bacteriófago; plásmidos de levadura;
vectores derivados de combinaciones de plásmidos y DNA fago, DNA
viral tal como vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar y
Pseudorabies. No obstante, se puede usar cualquier vector o
plásmido siempre que puedan replicarse y sean viables en el
hospedador.
La secuencia de DNA apropiada se puede insertar
en el vector por una diversidad de procedimientos. En general, la
secuencia de DNA se inserta en un sitio de endonucleasa de
restricción apropiado por procedimientos conocidos en la técnica.
Se considera que tales procedimientos y otros están dentro del
alcance de los expertos en la técnica.
La secuencia de DNA en el vector de expresión
está unida de forma operativa a una secuencia(s) de control
de expresión apropiada (promotor) para dirigir la síntesis de mRNA.
Como ejemplos representativos de tales promotores se pueden citar:
promotor LTR o SV40, lac o trp de E. coli., el promotor
P_{L} fago lambda y otros promotores conocidos por controlar la
expresión de genes en células procariotas o eucariotas o sus virus.
El vector de expresión también contiene un sitio de unión a
ribosomas para iniciar la traducción y un terminador de
transcripción. El vector también puede incluir secuencias
apropiadas para amplificar la expresión.
Además, los vectores de expresión contienen
preferiblemente un gen que proporciona un rasgo fenotípico para la
selección de células hospedadoras transformadas tales como
dihidrofolato reductasa o la resistencia a la neomicina para el
cultivo de células eucariotas, o tales como la resistencia a la
tetraciclina o ampicilina en E. coli.
El vector que contiene la secuencia de DNA
apropiada como se ha descrito antes en la presente memoria, así
como un promotor apropiado o secuencia control, se puede usar para
transformar un hospedador apropiado para permitir que el hospedador
exprese la proteína. Como ejemplos representativos de hospedadores
apropiados se pueden citar: células bacterianas tales como E.
coli, Salmonella typhimurium, Streptomyces; células fúngicas
tales como levadura; células de insectos, tales como Drosophila
S2 y Spodoptera Sf9; células de animales tales como CHO,
COS o melanoma de Bowes; adenovirus; células vegetales y similares.
Se estima que la selección de un hospedador apropiado está dentro
del alcance de los expertos en la técnica a partir de las
descripciones de la presente memoria.
Más particularmente, la presente invención
también incluye construcciones recombinantes que comprenden una o
más de las secuencias que se han descrito más extensamente antes.
Las construcciones comprenden un vector, tal como un vector
plasmídico o viral, en el que se ha insertado una secuencia de la
invención, en una orientación directa o inversa. En un aspecto
preferido de esta realización, la construcción comprende además
secuencias reguladoras, incluyendo, por ejemplo, un promotor, unido
de forma operativa a la secuencia. Se conocen por los expertos en
la técnica un gran número de vectores y promotores adecuados y
están disponibles de forma comercial. A modo de ejemplo se
proporcionan los siguientes vectores. Bacterianos: pQE70, pQE60,
pQE-9 (Qiagen), pBS, phagescript, psiX174,
pBluescript SK, pBsKS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene);
PTR099A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540,
pRIT5 (Pharmacia). Eucariotas: pWLneo, pSV2cat, pOG44, pXTI, pSG
(Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Sin embargo, se
puede usar cualquier otro plásmido o vector con tal que sea
replicable y viable en el hospedador.
Se pueden seleccionar regiones de promotor de
cualquier gen deseado usando vectores CAT (cloranfenicol
transferasa) u otros vectores con marcadores seleccionables. Dos
vectores apropiados son pKK232-8 y pCM7. Promotores
bacterianos citados particularmente incluyen lacl, lacZ, T3, T7,
gpt, lambda P_{R}, P_{L} and trp. Promotores eucariotas
incluyen CMV inmediato anterior, HSV timidina quinasa, SV40
temprano y tardío, LTR de retrovirus y
metalotioneina-I de ratón. La selección del vector y
promotor adecuado es bien conocida por los expertos en la
técnica.
En una realización adicional, la presente
invención se refiere a células hospedadoras que contienen la
construcción anteriormente descrita. La célula hospedadora puede
ser una célula eucariota superior, tal como una célula de mamífero,
o una célula eucariota inferior, tal como una célula de levadura, o
la célula hospedadora puede ser una célula procariota, tal como una
célula bacteriana. La introducción de la construcción en la célula
hospedadora puede efectuarse por transfección en fosfato de calcio,
transfección mediada por DEAE-dextrano o
electroformación de poros (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic
Methods in Molecular Biology, 1986)).
Las construcciones en células hospedadoras se
pueden usar de una forma convencional para producir el producto
génico codificado por la secuencia recombinante. Como alternativa,
los polipéptidos de la invención se pueden producir de forma
sintética por secuenciadores de péptidos convencionales.
Las proteínas maduras se pueden expresar en
células de mamífero, de levadura, de bacteria u otras células bajo
el control de promotores apropiados. También se pueden emplear
sistemas de traducción acelulares para producir tales proteínas
usando RNA derivados de las construcciones de DNA de la presente
invención. Los vectores de clonación y expresión apropiados para
usar con hospedadores procariotas y eucariotas se describen por
Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Segunda edición, (Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), cuya descripción
se incorpora en la presente memoria como referencia.
La transcripción de un DNA que codifica los
polipéptidos de la presente invención por eucariotas superiores se
incrementa insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los
potenciadores son elementos de DNA que actúan cis,
normalmente de aproximadamente 10 a 300 pb (pares de bases) que
actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Ejemplos
incluyen el potenciador SV40 en el lado tardío del origen de
replicación (100 a 270 pb), un potenciador del promotor de
citomegalovirus temprano, un potenciador de polioma en el lado
tardío del origen de replicación y potenciadores de adenovirus.
Por lo general los vectores de expresión
recombinantes incluirán orígenes de replicación y marcadores
seleccionables que permitan la transformación de la célula
hospedadora, por ejemplo, el gen de resistencia a la ampicilina de
E. coli y del gen TRP1 de S. cerevisiae y un promotor
derivado de un gen muy expresado para dirigir la transcripción de
una secuencia estructural cadena abajo. Tales promotores se pueden
derivar de operones que codifican enzimas glicolíticas tales como
3-fosfoglicerato quinasa (PGK), factor \alpha,
fosfatasa ácida, o proteínas de schock térmico, entre otras. La
secuencia estructural heteróloga se ensambla en la fase apropiada
con secuencias de traducción, inicio y terminación, opcionalmente,
la secuencia heteróloga puede codificar una proteína de fusión que
incluye un péptido de identificación del extremo
N-terminal que imparte características deseadas, por
ejemplo, estabilización o purificación simplificada del producto
recombinante expresado.
Vectores de expresión útiles para uso bacteriano
se construyen insertando una secuencia de DNA estructural que
codifica una proteína deseado junto con señales de traducción,
inicio y terminación adecuadas en la fase de lectura operable con
un promotor funcional. El vector comprenderá uno o más marcadores
seleccionables fenotípicos y un origen de replicación para
garantizar el mantenimiento del vector y, si se desea, proporcionar
la amplificación en el hospedador. Hospedadores procariotas
adecuados para transformación incluyen E. coli, Bacillus
subtilis, Salmonella typhimurium y diversas especies de los
géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus, aunque también
se pueden emplear otras según se elijan.
Como ejemplo representativo pero no limitante,
vectores de expresión útiles para uso bacteriano pueden comprende
un marcador seleccionable y un origen bacteriano de replicación
derivado de plásmidos disponibles comercialmente que comprenden
elementos genéticos del vector de clonación bien conocido pBR322
(ATCC 37017). Tales vectores comerciales incluyen, por ejemplo,
pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia)
y GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, EEUU). Se combinan estas
secciones pBR322 "esqueleto" con un promotor apropiado y la
secuencia estructural que se va a expresar.
Después de la transformación de una cepa
hospedadora adecuada y el crecimiento de la cepa hospedadora hasta
una densidad celular apropiada, se elimina la represión del
promotor seleccionado por medios apropiados (por ejemplo, cambio de
temperatura o inducción química) y las células se cultivan durante
otro período de tiempo.
Las células se recogen de forma típica por
centrifugación, se descomponen por medios físicos o químicos y el
extracto bruto resultante se retiene para posterior
purificación.
Las células microbianas empleadas en la expresión
de proteínas se pueden descomponerse por cualquier método
conveniente que incluye ciclos de
congelación-descongelación, ultrasonidos,
descomposición mecánica o uso de agentes de lisis celular.
También se pueden emplear diversos sistemas de
cultivo de células de mamífero para expresar la proteína
recombinante. Ejemplos de sistemas de expresión de mamíferos
incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos de riñón
de mono, descritas por Gluzman, Cell, 23:175 (1981), y otras líneas
celulares capaces de expresar un vector compatible, por ejemplo,
las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Vectores de
expresión de mamíferos comprenderán un origen de replicación, un
promotor adecuado y un potenciador, y también cualquier sitio de
unión a ribosoma necesario, sitio de poliadenilación, sitios de
donante y aceptor de corte y empalme, secuencias de terminación de
la transcripción y secuencias no transcritas al lado de 5'. Las
secuencias de DNA derivadas del genoma viral de SV40, por ejemplo,
los origen, promotor, potenciador, corte y empalme y sitios de
poliadenilación de SV40 se pueden usar para proporcionar los
elementos genéticos no transcritos requeridos.
Se puede recuperar y purificar
FGF-10 de cultivos de células recombinantes por
procedimientos usados hasta ahora, incluyendo precipitación en
sulfato de amonio o etanol, extracción en ácido, cromatografía de
intercambio aniónico o catiónico, cromatografía con fosfocelulosa,
cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad,
cromatografía con hidroxiapatita y cromatografía con lectina. Se
pueden usar etapas de replegado de proteínas, si fuera necesario,
para completar la configuración de la proteína madura. Finalmente,
se puede emplear para las etapas de purificación finales
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
Los polipéptidos de la presente invención pueden
ser un producto purificado de forma natural o un producto de
procedimientos de síntesis, o producido por técnicas recombinantes
a partir de un hospedador procariota o eucariota (por ejemplo, por
células bacterianas, de levaduras, de plantas superiores, de
insectos y de mamíferos en cultivo). Dependiendo del hospedador
empleado en un procedimiento de producción recombinante, los
polipéptidos de la presente invención pueden estar glicosilados con
carbohidratos de mamífero u otros eucariotas o pueden estar no
glicosilados. Los polipéptidos de la invención pueden incluir
también un resto aminoácido de metionina inicial.
El polipéptido de la presente invención, como
resultado de la capacidad para estimular el crecimiento celular del
endotelio vascular, se puede emplear en el tratamiento para
estimular la revascularización de tejidos isquémicos debidos a
diversos estados de enfermedad tales como trombosis,
arteriosclerosis y otros estados patológicos
cardiovascula-
res.
res.
También se puede emplear FGF-10
para tratar heridas debidas a lesiones, quemaduras, reparación de
tejido después de cirugía y úlceras puesto que tiene la capacidad
de ser un agente mitógeno para diversos tipos de células, tales
como fibroblastos y células del músculo esqueletal.
También se puede emplear FGF-10
para tratar y prevenir lesión neuronal que se produce en ciertos
trastornos neuronales o estados patológicos neurodegenerativos
tales como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y
el complejo relacionado con el SIDA. FGF-10 tiene la
capacidad de estimular el crecimiento de condrocitos, por tanto,
puede emplearse para potenciar la regeneración ósea y periodontal y
ayudar en transplantes de tejidos o injertos óseos.
También se puede usar FGF-10 para
prevenir el envejecimiento cutáneo debido a quemaduras solares
mediante la estimulación del crecimiento de queratinocitos.
También se puede usar FGF-10 para
prevenir la caída del cabello, puesto que FGF-10
activa las células formadoras de cabello y promueve el crecimiento
de melanocitos. Entre las mismas líneas, FGF-10
estimula el crecimiento y diferenciación de células hematopoyéticas
y células de la médula ósea cuando se usa en combinación con otras
citoquinas. También se puede usar FGF-10 para
mantener órganos antes de un transplante o para el cultivo celular
de soporte de tejidos primarios.
Conforme a otro aspecto más de la presente
invención, se proporciona un procedimiento para usar tales
polipéptidos o polinucleótidos que codifican tales polipéptidos, con
fines in vitro relacionados con la investigación científica,
síntesis de DNA, preparación de vectores DNA y con el objeto de
proporcionar herramientas diagnósticas y terapéuticas para el
tratamiento de enfermedades de los seres humanos.
Se pueden usar fragmentos del gen
FGF-10 de longitud completa como sonda de
hibridación para una genoteca de cDNA para aislar el gen
FGF-10 de longitud completa y aislar otros genes
que tengan una similitud de secuencia con los mismos genes o que
tengan una actividad biológica similar. Las sondas de este tipo
tienen por lo general al menos 20 bases. No obstante, con
preferencia, las sondas tienen al menos 30 bases y por lo general
no superan las 50 bases, aunque pueden tener un mayor número de
bases. La sonda también se puede usar para identificar un clon de
cDNA que corresponda a un transcripto de longitud completa y un
clon genómico o clones que contengan el gen FGF-10
completo que incluyen regiones de regulación y promotoras, exones e
intrones. Un ejemplo de rastreo comprende aislar la región de
codificación del gen FGF-10 usando la secuencia de
DNA conocida para sintetizar una sonda oligonucleotídica. Para
rastrear una genoteca de cDNA humano, DNA genómico o mRNA para
determinar los miembros de la genoteca que se hibridan con la sonda
se emplean oligonucleótidos marcados que tienen una secuencia
complementaria con la del gen de la presente invención.
Esta invención proporciona un procedimiento para
la identificación de los receptores del polipéptido
FGF-10. El gen que codifica el receptor se puede
identificar por numerosos métodos conocidos por los expertos en la
técnica, por ejemplo, Panning de lingandos y clasificación
FACS (Coligan, et al., Current Protocols in Immun.,
1(2), capítulo 5, (1991)). Con preferencia, la clonación con
expresión se emplea cuando el RNA poliadenilado se prepara a partir
de una célula que es sensible a los polipéptidos y se divide una
genoteca de cDNA creada a partir de este RNA en grupos y se usa
para transfectar células COS u otras células que no son sensibles a
los polipéptidos. Las células transfectadas que se reproducen en
platinas de vidrio se exponen a los polipéptidos marcados. Los
polipéptidos se pueden marcar por una diversidad de medios que
incluyen la yodación o inclusión de un sitio de reconocimiento para
una proteínquinasa específica del sitio. Después de la fijación e
incubación, se someten las platinas a análisis autoradiográfico.
Los grupos positivos se identifican y se preparan subgrupos y se
vuelven a transfectar usando un proceso iterativo de
subagrupamiento y nuevo rastreo, que proporciona finalmente un
único clon que codifica el supuesto receptor.
Como técnica alternativa para la identificación
del receptor, los polipéptidos marcados se pueden unir por
fotoafinidad con preparaciones de membrana celular o extractos que
expresan la molécula receptora. El material reticulado se resuelve
por análisis de PAGE y se expone a una película de rayo X. El
complejo marcado que contiene los receptores de los polipéptidos se
puede separar, resolver en fragmentos peptídicos y someter a
microsecuenciado de proteínas. La secuencia de aminoácidos obtenida
a partir del microsecuenciado se usará para diseñar un grupo de
sondas de oligonucleótidos degenerados para rastrear una genoteca
de cDNA con el fin de identificar los genes que codifican los
supuestos receptores.
Esta invención proporciona un procedimiento para
rastrear compuestos para identificar aquellos que modulan la acción
de FGF-10. Un ejemplo de dicho ensayo comprende
combinar una célula de fibroblasto de mamífero,
FGF-10, el compuesto que se va a rastrear y
[^{3}H] timidina en condiciones de cultivo celular en las que
normalmente proliferarían los fibroblastos. Se puede llevar a cabo
un ensayo control en ausencia del compuesto a rastrear y compararlo
con la extensión de la proliferación de fibroblastos en presencia
del compuesto para determinar si el compuesto estimula la
proliferación de queratinocitos determinando la recaptación de
[^{3}H] timidina en cada caso.
Para rastrear antagonistas, se puede preparar el
mismo ensayo y se mide la capacidad del compuesto para prevenir la
proliferación de fibroblastos y se hace una determinación de la
capacidad del antagonista. Se mide la extensión de la proliferación
de fibroblastos por cromatografía de centelleo líquido que mide la
incorporación de [^{3}H] timidina.
En otro procedimiento, se incubará con
FGF-10 marcado en presencia del compuesto una
preparación de célula o membrana de mamífero que exprese el
receptor FGF-10. Se mide entonces la capacidad del
compuesto para mejorar o bloquear esta interacción. De forma
alternativa, se medirá la respuesta de un sistema de segundo
mensajero conocido después de la interacción de
FGF-10 y el receptor y se comparará en presencia o
ausencia de compuesto. Dichos sistemas de segundo mensajero
incluyen, aunque sin quedar limitados a los mismos, cAMP guanilato
ciclasa, canales iónicos o la hidrólisis de fosfoinositida.
Un ejemplo de un posible antagonista de
FGF-10 es un anticuerpo que se une al
polipéptido.
Otro posible antagonista de
FGF-10 es una construcción antisentido preparada
usando tecnología antisentido. La tecnología antisentido se puede
usar para controlar la expresión génica mediante la formación de
una triple hélice o DNA o RNA antisentido, estando ambos métodos
basados en la unión de un polinucleótido a DNA o RNA. Por ejemplo,
la porción que codifica el extremo 5' de la secuencia
polinucleotídica, que codifica los polipéptidos maduros de la
presente invención, se usa para diseñar un oligonucleótido RNA
antisentido de aproximadamente 10 a 40 pares de bases de longitud.
Se diseña un oligonucleótido DNA que será complementario con una
región del gen implicado en la transcripción (triple hélice, véase
Lee et al., Nucl. Acids. Res., 6:3073 (1979) ; Cooney et
al., Science, 241:456 (1988); y Dervan et al., Science,
251: 1360 (1991)), evitando de este modo la transcripción y la
producción de FGF-10. El oligonucleótido RNA
antisentido se hibrida con el mRNA in vivo y bloquea la
traducción de la molécula de mRNA al polipéptido
FGF-10 (Antisense - Okano, J. Neurochem., 56:560
(1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene
Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)). Los oligonucleótidos
descritos antes también se pueden liberar en células de forma tal
que se pueda expresar el RNA o DNA antisentido in vivo para
inhibir la producción de FGF-10.
Los antagonistas de FGF-10 se
pueden emplear para inhibir el crecimiento celular y los efectos
proliferativos de FGF-10 sobre células y tejidos
neoplásicos y, por tanto, retardar o prevenir el crecimiento y
proliferación celular anómalo, por ejemplo, el crecimiento de
tumores.
Los antagonistas de FGF-10
también se pueden usar para prevenir enfermedades hipervasculares y
prevenir la proliferación de células epiteliales del cristalino
después de cirugía de cataratas extracapsular.
Los antagonistas también se pueden emplear en una
composición con un vehículo farmacéuticamente aceptable, por
ejemplo, como se describe en la presente memoria más adelante.
Los polipéptidos y antagonistas de la presente
invención se pueden emplear en combinación con un vehículo
farmacéuticamente adecuado para formar una composición
farmacéutica. Tales composiciones comprenden una cantidad
terapéuticamente eficaz del polipéptido o antagonista y un vehículo
o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dicho vehículo incluye,
aunque sin quedar limitado a los mismos, solución salina, solución
salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones
de los mismos. La formulación se adaptará al modo de
administración.
Los compuestos anteriormente citados se pueden
envasar en un envase o kit farmacéutico que comprenda uno o más
envases llenos con uno o más de los ingredientes de las
composiciones farmacéuticas de la invención. Asociado con dicho
envase o envases puede existir información en la forma prescrita por
una agencia gubernamental que regule la fabricación, uso o venta
de productos farmacéuticos o biológicos, reflejando dicha
información la aprobación por la agencia a la fabricación uso o
venta para administración humana. Además, los polipéptidos y
antagonistas de la presente invención se pueden emplear en
combinación con otros compuestos terapéuticos.
Las composiciones farmacéuticas se pueden
administrar de una forma conveniente tal como por vía oral, tópica,
intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal
o intradérmica. Las composiciones farmacéuticas se administran en
una cantidad que es eficaz para tratar y/o para la profilaxis de la
indicación específica. En general, se administrarán en una cantidad
de al menos aproximadamente 10 \mug/kg de peso corporal y en la
mayoría de los casos, se administrarán en una cantidad que no supere
aproximadamente 8 mg/kg de peso corporal por día. En la mayoría de
los casos, la dosificación variará de aproximadamente 10 \mug/kg a
aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal por día, teniendo en
cuenta las vías de administración, síntomas y factores similares.
En el caso específico de administración tópica, las dosis se
administrarán preferiblemente de aproximadamente 0,1 \mug a
aproximadamente 9 mg por cm^{2}.
Los polipéptidos de FGF-10 y
antagonistas que son polipéptidos se pueden emplear también
conforme a la presente invención por expresión de dicho polipéptido
in vivo, que con frecuencia se denominan "terapia
génica".
Así, por ejemplo, se pueden modificar
genéticamente células con un polinucleótido (DNA o RNA) que
codifique el polipéptido ex vivo, y las células modificadas
genéticamente suministrarse luego a un paciente a tratar con el
polipéptido. Tales procedimientos son bien conocidos en la técnica.
Por ejemplo, las células se pueden modificar genéticamente por
procedimientos bien conocidos en la técnica usando una partícula
retroviral que contenga RNA que codifica el polipéptido de la
presente invención.
De igual forma, se pueden modificar genéticamente
células in vivo para expresión del polipéptido in
vivo, por ejemplo, por procedimientos conocidos en la técnica.
Como es bien conocido en la técnica, se puede administrar a un
paciente una célula productora para producir una partícula
retroviral que contenga RNA que codifica el polipéptido de la
presente invención para modificar genéticamente células in
vivo y expresar el polipéptido in vivo. Estos y otros
procedimientos para administrar un polipéptido de la presente
invención por tales procedimientos serán evidentes para los
expertos en la técnica a partir de las descripciones de la presente
invención. Por ejemplo, el vehículo de expresión para las células
modificadas genéticamente puede ser distinto de una partícula
retroviral, por ejemplo, un adenovirus, que se puede usar para
modificar genéticamente células in vivo después de la
combinación con un vehículo de liberación adecuado.
Esta invención también se refiere al uso del gen
FGF-10 como parte de un ensayo diagnóstico para
detectar enfermedades o susceptibilidad a enfermedades relacionadas
con la presencia de mutaciones en las secuencias del ácido nucleico
de FGF-10.
Se pueden detectar individuos que tengan
mutaciones en el gen FGF-10 a nivel de DNA por una
diversidad de técnicas. Los ácidos nucleicos para el diagnóstico se
pueden obtener a partir de células del paciente, tales como sangre,
orina, saliva, material de biopsia de tejidos y autopsia. El DNA
genómico se puede usar directamente para la detección o se puede
amplificar enzimáticamente usando PCR (Saiki et al., Nature,
324:163-166 (1986)) antes del análisis. También se
pueden usar RNA o cDNA con el mismo propósito. Como ejemplo, se
pueden usar cebadores de PCR complementarios con el ácido nucleico
que codifica FGF-10 para identificar y analizar
mutaciones en FGF-10. Por ejemplo, se pueden
detectar eliminaciones o inserciones por un cambio en el tamaño del
producto amplificado en comparación con el genotipo normal. Se
pueden identificar mutaciones puntuales por hibridación de DNA
amplificado con RNa de FGF-10 o, como alternativa,
secuencias de DNA antisentido de FGF-10
radiomarcado. Se pueden distinguir secuencias que coincidan
perfectamente de cadenas dobles no coincidentes por digestión con
RNAasa o por diferencias en las temperaturas de fusión.
El ensayo genético basado en las diferencias de
secuencias del DNA se puede conseguir por detección o alteración en
la movilidad electroforética de fragmentos de DNA en geles con o
sin agentes desnaturalizadores. Se pueden visualizar pequeñas
eliminaciones e inserciones en la secuencia por electroforesis en
gel de alta resolución. Se pueden distinguir fragmentos de DNA de
diferentes secuencias en geles con gradientes de formamida
desnaturalizantes en los que se retardan las movilidades de
diferentes fragmentos de DNA en el gel en diferentes posiciones de
acuerdo con su temperatura de fusión específica o parcial (véase,
por ejemplo, Myers et al., Science, 230:1242 (1985)).
También pueden revelarse cambios de secuencia en
posiciones específicas por ensayos de protección de nucleasa, tales
como protección de RNasa y S1 o el procedimiento de escisión
química (por ejemplo, Cotton et al., PNAS, USA,
85:4397-4401 (1985)).
Así, la detección de una secuencia específica de
DNA se puede conseguir por procedimientos tales como hibridación,
protección con RNasa, escisión química, secuenciación de DNA
directa o el uso de enzimas de restricción (por ejemplo,
Polimorfismo de Longitud en Fragmentos de Restricción, del inglés
"Restriction Fragment Length Polymorphisms" (RFLP)) y
transferencia Southern de DNA genómico. Además de la electroforesis
en gel convencional y la secuenciación de DNA, las mutaciones
también se pueden detectar por análisis in situ.
La presente invención también se refiere a un
ensayo diagnóstico para detectar niveles alterados de proteína
FGF-10 en diversos tejidos puesto que una
sobreexpresión de las proteínas comparadas con muestras de tejido
control normales puede detectar la presencia de una enfermedad o
susceptibilidad a una enfermedad, por ejemplo, un tumor. Son bien
conocidos por los expertos en la técnica ensayos usados para
detectar niveles de proteína FGF-10 en una muestra
derivada de un hospedador e incluyen radioinmunoensayos, ensayos de
unión competitiva, análisis por transferencia Western, ensayos
ELISA y ensayos tipo "sandwich". Un ensayo ELISA (Coligan,
et al., Current Protocols in Immunology, 1(2),
capítulo 6, (1991)) comprende inicialmente preparar un anticuerpo
específico para el antígeno de FGF-10,
preferiblemente un anticuerpo monoclonal. Además, se prepara un
anticuerpo testigo contra el anticuerpo monoclonal. Se une al
anticuerpo testigo un reaccionante detectable tal como
radiactividad, fluorescencia o, en este ejemplo, una enzima
peroxidasa de rábano picante. Se extrae una muestra de un
hospedador y se incuba en un soporte sólido, por ejemplo, una placa
de poliestireno, que une las proteínas a la muestra. Se cubren a
continuación todos los sitios de unión de proteína libre en la
placa incubando con una proteína no específica como albúmina sérica
bovina. Seguidamente, se incuba el anticuerpo monoclonal en la
placa, tiempo durante el cual los anticuerpos monoclonales se unen a
cualquiera de las proteínas de FGF- 10 unidas a la placa de
poliestireno. Se elimina por lavado con tampón todo el anticuerpo
monoclonal no unido. El anticuerpo testigo unido a peroxidasa de
rábano picante se coloca ahora en la placa dando lugar a la unión
del anticuerpo testigo con todo el anticuerpo monoclonal unido a
FGF-10. Se elimina seguidamente por lavado el
anticuerpo testigo no unido. Se añade entonces sustrato para
peroxidasa a la placa y la intensidad de color desarrollado en un
período de tiempo dado es una medida de la cantidad de proteína
FGF-10 presente en un volumen dado de muestra de
paciente cuando se compara frente a una curva patrón.
Se puede emplear un ensayo de competición en el
que anticuerpos específicos frente a FGF-10 se unen
a un soporte sólido y FGF-10 marcado y se hace
pasar una muestra derivada del hospedador sobre el soporte sólido y
se puede relacionar la cantidad de marcador detectado, por ejemplo,
por cromatografía de centelleo líquido, con una cantidad de
FGF-10 en la muestra.
Un ensayo tipo "sandwich" es similar a un
ensayo ELISA. En un ensayo tipo "sandwich" se hace pasar
FGF-10 sobre un soporte sólido y se une a anticuerpo
unido a un soporte sólido. Se une a continuación un segundo
anticuerpo a FGF-10. Se hace pasar entonces un
tercer anticuerpo que está marcado y es específico para el segundo
anticuerpo sobre el soporte sólido y se une al segundo anticuerpo y
se puede cuantificar la cantidad.
Las secuencias de la presente invención también
son valiosas para la identificación de cromosomas. La secuencia se
dirige de forma específica a, y se puede hibridar con, una posición
particular en un cromosoma humano particular. Por otro lado, existe
en la actualidad la necesidad de identificar sitios particulares en
el cromosoma. Pocos reaccionantes que marquen cromosomas basados en
datos de secuencia actuales (polimorfismos repetidos) están
disponibles actualmente para marcar la posición cromosómica. El
mapeo de DNA a cromosomas conforme a la presente invención es una
primera etapa importante en la correlación de las secuencias con
genes asociados con enfermedad.
En pocas palabras, se pueden mapear secuencias a
cromosomas preparando cebadores para PCR (preferiblemente de 15 a 25
pb) a partir de cDNA. El análisis por ordenador de la región no
traducida 3' se usa para seleccionar rápidamente cebadores que no
se extienden más allá de un exon en el DNA genómico, complicando
así el proceso de amplificación. Estos cebadores se usan entonces
para el rastreo por PCR de híbridos de células somáticas que
contienen cromosomas humanos particulares. Solo los híbridos que
contienen el gen humano que corresponde al cebador proporcionarán
un fragmento amplificado.
El mapeo por PCR de híbridos de células somáticas
es un procedimiento rápido para asignar un DNA particular a un
cromosoma particular. Usando la presente invención con los mismos
cebadores oligonucleótidos, se puede conseguir la sublocalización
con paneles de fragmentos de cromosomas específicos o grupos de
grandes clones genómicos de una forma análoga. Igualmente otras
estrategias de mapeo que se pueden usar para mapear a su cromosoma
incluyen hibridación in situ, rastreo previo con cromosomas
clasificados por flujo y preselección por hibridación para
construir genotecas de cDNA específicas de los cromosomas.
Para mejorar una localización de cromosomas
precisa en una etapa se puede usar hibridación con fluorescencia
in situ (FISH) de un clon de cDNA con una difusión de
cromosomas en la metafase. Esta técnica se puede usar con cDNA de
tan solo 500 ó 600 bases; sin embargo, clones mayores que 2.000 pb
tienen una mayor posibilidad de unión a una única localización
cromosómica con una intensidad de señal suficiente para la
detección simple. FISH requiere el uso de clones a partir de los
cuales se derive el marcador de secuencia expresado (un fragmento
del gen de la presente invención) y será mejor cuanto más grande
sea. Por ejemplo, 2.000 pb es bueno, 4.000 es mejor y más de 4.000
no es probablemente necesario para conseguir buenos resultados un
porcentaje razonable de veces. Puede encontrarse una revisión de
esta técnica en Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of
Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988).
Una vez que se ha mapeado una secuencia a una
posición cromosómica exacta, la posición física de la secuencia se
puede correlacionar en el cromosoma con datos del mapa genético.
(Tales datos se encuentran, por ejemplo, en V. McKusick, Mendelian
Inheritance in Man (disponible en línea en la biblioteca Johns
Hopkins University Welch Medical Library). La relación entre genes y
enfermedades que se ha mapeado con la misma región cromosómica se
identifica entonces a través de análisis de enlaces (herencia común
de genes físicamente adyacentes).
A continuación, es necesario determinar las
diferencias en el cDNA o secuencia genómica entre individuos
afectados y no afectados. Si se observa una mutación en alguno o
todos los individuos afectados pero no en los individuos normales,
entonces la mutación es posiblemente el agente causante de la
enfermedad.
Con las técnicas actuales de resolución de mapeo
físico y mapeo genético, un cDNA localizado de forma precisa en una
región cromosómica asociada con la enfermedad podría ser uno de
entre 50 y 500 genes causantes posibles. (Esto supone una
resolución de mapeo de 1 megabase y un gen por 20 kb).
Los polipéptidos, sus fragmentos o células que
los expresen se pueden usar como inmunógenos para producir
anticuerpos para los mismos. Estos anticuerpos pueden ser, por
ejemplo, anticuerpos policlonales o monoclonales. La presente
invención también incluye anticuerpos quiméricos, de cadena sencilla
y humanizados, así como fragmentos Fab, o el producto de una
genoteca de expresión de Fab. Para la producción de dichos
anticuerpos o fragmentos se pueden usar diversos procedimientos
conocidos en la técnica.
Se pueden obtener anticuerpos generados contra
los polipéptidos que corresponden a una secuencia de la presente
invención por inyección directa de los polipéptidos en un animal o
administrando los polipéptidos a un animal, preferiblemente no
humano. El anticuerpo así obtenido se unirá entonces a los propios
polipéptidos. De este modo, incluso se puede usar una secuencia que
codifique solo un fragmento de los polipéptidos para generar
anticuerpos que se unen a los polipéptidos nativos completos. Tales
anticuerpos se pueden usar entonces para aislar el polipéptido del
tejido que expresa dicho polipéptido.
Para la preparación de anticuerpos monoclonales,
se puede usar cualquier técnica que proporcione anticuerpos
producidos por cultivos de líneas celulares continuos. Ejemplos
incluyen la técnica de hibridomas (Kohler and Milstein, 1975,
Nature, 256:495-497), la técnica de trioma, la
técnica de hibridoma de células B humanas (Kozbor et al.,
1983, Immunology Today 4:72) y la técnica de hibridoma con EBV para
producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole, et al.,
1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss,
Inc., páginas 77-96).
Las técnicas descritas para la producción de
anticuerpos de cadena sencilla (patente de Estados Unidos
4.946.778) se pueden adaptar para producir anticuerpos de cadena
sencilla contra los productos polipéptidos inmunógenos de esta
invención. Además, se pueden usar ratones transgénicos para expresar
anticuerpos humanizados frente a productos polipéptidos inmunógenos
de esta invención.
La presente invención se describirá con más
detalle con referencia a los siguientes ejemplos; sin embargo, se
sobreentiende que la presente invención no está limitada a tales
ejemplos. Todas las partes o cantidades, a no ser que indique de
otro modo, están en peso.
Con el fin de facilitar la comprensión de los
siguientes ejemplos, se describirán ciertos procedimientos y/o
términos que aparecen con frecuencia.
Los "plásmidos" se designan por una p
minúscula precedida y/o seguida por letras mayúsculas y/o números.
Los plásmidos de partida en la presente memoria están disponibles
comercialmente, disponibles públicamente de forma no restringida o
se pueden construir a partir de plásmidos disponibles de acuerdo
con procedimientos publicados. Además, se conocen en la técnica
plásmidos equivalentes a los descritos y serán evidentes para los
expertos en la técnica.
"Digestión" de DNA se refiere a la escisión
catalítica de DNA con una enzima de restricción que actúa solo en
ciertas secuencias en el DNA. Las diferentes enzimas de restricción
usadas en la presente memoria están disponibles de forma comercial
y sus condiciones de reacción, cofactores y otros requerimientos se
usaron tal y como son conocidos por los expertos en la técnica. Con
fines analíticos, se usa de forma típica 1 \mug de plásmido o
fragmento de DNA con aproximadamente 2 unidades de enzima en
aproximadamente 20 \mul de solución tampón. A efectos del
aislamiento de fragmentos de DNA para la construcción de plásmidos,
se someten a digestión de forma típica de 5 a 50 \mug de DNA con
20 a 250 unidades de enzima en un volumen mayor. Las cantidades de
tampón y sustrato apropiadas para las enzimas de restricción
particulares son las especificadas por el fabricante. Normalmente se
usan tiempos de incubación de aproximadamente 1 hora a 37ºC, aunque
pueden variar de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Después de la digestión, se somete la reacción a electroforesis
directamente en un gel de poliacrilamida para aislar el fragmento
deseado.
La separación por tamaños de los fragmentos
escindidos se lleva a cabo usando gel de poliacrilamida al 8 por
ciento descrito por Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res.,
8:4057 (1980).
"Oligonucleótidos" se refiere a
polidesoxinucleótido de cadena sencilla o dos cadenas de
polidesoxinucleótidos complementarias que pueden sintetizarse
químicamente. Dichos oligonucleótidos sintéticos no tienen fosfato
5' y así no se ligarán a otro oligonucleótido sin añadir un fosfato
con un ATP en presencia de una quinasa. Un oligonucleótido
sintético se ligará a un fragmento que no se ha
desfosforilado.
"Ligación" se refiere a un proceso de formar
enlaces fosfodiéster entre dos fragmentos de ácido nucleico
bicatenarios (Maniatis, T., et al., Id., pág. 146). A no ser
que se indique de otro modo, la ligación se puede llevar a cabo
usando tampones y condiciones conocidas con 10 unidades de DNA
ligasa T4 ("ligasa") por 0,5 \mug de cantidades
aproximadamente equimolares de los fragmentos de DNA a ligar.
A no ser que se indique de otro modo, la
transformación se llevó a cabo como se describe por el
procedimiento de Graham, F. and Van der Eb, A., Virology,
52:456-457 (1973).
Para analizar la expresión de mRNA de
FGF-10 se llevó a cabo un análisis Northern con 2
ug de poli A^{+} mRNA de varios tejidos de adultos humanos usando
como sonda cDNA de FGF-10 completo marcado
radiactivo. Los resultados indican que se expresa un mensaje de 1,4
kb más abundantemente en el músculo esqueletal, a nivel intermedio
en el corazón, cerebro, placenta, riñón y páncreas, y a nivel
inferior en el hígado. En el corazón también están presentes otros
3 fragmentos con tamaños de 4,4 kb, 2,4 kb y 0,5 kb. Es posible que
este tamaño diferente de mRNA en el corazón se origine por un corte
y empalme alternativo. En el cerebro, también está presente mRNA de
4,4 kb. De Clontech Laboratories, Inc. Palo Alto, CA se obtuvo una
transferencia en nylon con 2 ug de poli A+ mRNA de varios tejidos
de adultos humanos unidos a la membrana. Se hibridó la
transferencia con el cDNA de FGF-10 completo marcado
con dCT radiactivo por marcado mediante exposición al azar. La
hibridación se llevó a cabo en SDS al 7%, NaPO_{4} 0,5 M, pH 7,2,
y BSA al 1% a 65ºC durante una noche. Después de 2 x 30 minutos de
lavado en 0,2 x SSC, SDS al 0,1% a 65ºC, se expuso la transferencia
a película de rayos X con intensificación de la pantalla durante
una noche.
Se realizó la transcripción y traducción de cDNA
de FGF-10, ATCC nº 75696 para determinar el tamaño
del polipéptido traducible codificado por cDNA de
FGF-10 de longitud completa y parcial. Los insertos
de cDNA de longitud completa y parcial de FGF-10 en
el vector pBluescript SK se amplificaron por PCR con tres parejas de
cebadores, 1) cebadores M13 inverso y directo; 2) cebador M13
inverso y cebador P20 de FGF; 3) cebador M13 inverso y cebador P22
de FGF. La secuencia de estos cebadores fue la siguiente.
Cebador inverso M13-2:
5'-ATGCTTCCGGCTCGTATG-3'
(SEQ ID Nº 3)
Esta secuencia se localiza cadena arriba del
extremo 5' del inserto de cDNA de FGF-10 en el
vector pBluescript y está en una orientación antisentido con
respecto a cDNA. Entre este cebador y el cDNA de
FGF-10 está localizada una secuencia de promotor
T3.
Cebador directo M13-2:
5'-GGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'
(SEQ ID Nº 4)
Esta secuencia se localiza cadena abajo del
extremo 3' del inserto de cDNA de FGF-10 en el
vector pBluescript y está en una orientación antisentido con
respecto al inserto de cDNA.
Cebador P20 de FGF:
5'-GTGAGATCTGAGGGAAGAAGGGGA-3'
(SEQ ID Nº 5)
Esta secuencia de 15 pb de este cebador en el
sitio de cebado 3' es antisentido a los pb 780-766
de la secuencia de cDNA de FGF-10, que está 12 pb
cadena abajo del codon de terminación.
Cebador P22 de FGF:
5'-CCACCGATAATCCTCCIT-3'
(SEQ ID Nº 6)
Esta secuencia se localiza en el cDNA de
FGF-10 en una orientación antisentido y está
aproximadamente 213 pb cadena abajo del codon de terminación.
La reacción PCR con los tres pares de cebadores
produce productos amplificados con la secuencia del promotor T3
delante del inserto de cDNA. Las tres parejas de cebadores producen
productos de PCR que codifican el polipéptido
FGF-10 de longitud completa.
Se usó aproximadamente 1 ug del producto de PCR
de esta primera pareja de cebadores, 0,3 ug de la segunda pareja de
cebadores, 0,3 ug de la tercera pareja de cebadores para la
transcripción/traducción in vitro. La reacción de
transcripción/traducción in vitro se llevó a cabo en un
volumen de 25 ul, usando T_{N}T™ Coupled Reticulocyte Lysate
Systems (Promega, nº CAT L4950). De forma específica, la reacción
contiene 12,5 ul de lisado de reticulocitos de ratón T_{N}T, 2
\mul de tampón de reacción T_{N}T, 1 \mul de polimerasa T3, 1
\mul de mezcla de aminoácidos 1 mM (menos metionina), 4 \mul de
^{35}S-metionina (>1000 Ci/mmol, 10 mCi/ml), 1
\mul de 40 U/\mul; inhibidor de ribonucleasa RNasin, 0,5 ó 1
\mug de productos de PCR. Se añadió agua exento de nucleasa para
llevar el volumen hasta 25 ul. La reacción se incubó durante 2
horas a 30ºC. Se analizaron cinco microlitros del producto de
reacción en un gel de SDS-PAGE con un gradiente de
4-20%. Después de fijar en isopropanol al 25% y
ácido acético al 10% se secó el gel y se expuso a una película de
rayos X durante una noche a 70ºC.
Como se muestra en la Figura 3, los productos de
PCR que contienen el cDNA de FGF-10 de longitud
completa y el cDNA que pierde aproximadamente 340 pb y
aproximadamente 140 pb en la región no traducida 3' (3'RNT),
produjeron la misma longitud de los productos traducidos, cuyos
pesos moleculares se estima que son aproximadamente 19 kd (carriles
2-4).
A la vista de las anteriores descripciones son
posibles numerosas modificaciones de la presente invención y, por
tanto, dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, la
invención se puede llevar a la práctica de otros modos diferentes a
los descritos de forma particular.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: HU, ET AL.
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Factor-10 de Crecimiento de Fibroblastos
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 6
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: CARELLA, BYRNE, BAIN, GILFILLAN, CECCHI, STEWART & OLSTEIN
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 6 BECKER FARM ROAD
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: ROSELAND
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: NEW JERSEY
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: USA
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 07068
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: DISQUETE DE 3,5 PULGADAS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PS/2
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: WORD PERFECT 5.1
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: Simultánea
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE UNA SOLICITUD ANTERIOR
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/207.412
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 8 MARZO DE 1994
\vskip0.666000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN SOBRE EL AGENTE/REPRESENTANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: FERRARO, GREGORY D.
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 36.134
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- Nº DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 325800-347
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 201-994-1700
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FAX: 201-994-1744
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1121 PARES DE BASES
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: SENCILLA
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAR
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 181 AMINOÁCIDOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: AMINOÁCIDOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAR
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 PARES DE BASES
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: SENCILLA
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAR
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 3:
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATGCTTCCGG CTCGTATG
\hfill18
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 PARES DE BASES
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: SENCILLA
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAR
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 4:
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGTTTTCCC AGTCACGAC
\hfill19
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 PARES DE BASES
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: SENCILLA
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAR
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 5:
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGAGATCTG AGGGAAGAAG GGGA
\hfill24
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 6:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 PARES DE BASES
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: SENCILLA
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAR
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 6:
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCACCGATAA TCCTCCTT
\hfill18
Claims (22)
1. Un polinucleótido seleccionado del grupo
formado por
- (a)
- polinucleótidos que codifican el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de SEQ ID Nº 2;
- (b)
- polinucleótidos que tienen la secuencia codificante que se muestra en SEQ ID Nº 1;
- (c)
- polinucleótidos que codifican el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el cDNA contenido en ATCC 75696;
- (d)
- polinucleótidos que tienen la secuencia codificante de cDNA contenida en ATCC 75696;
- (e)
- polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento de un polipéptido codificado por un polinucleótido de uno cualquiera de (a) a (d), teniendo dicho fragmento la actividad biológica del factor 10 de crecimiento de fibroblastos (FGF-10); y
- (f)
- polinucleótidos cuya cadena complementaria se hibrida en condiciones de restricción con un polinucleótido como el definido en uno cualquiera de (a) a (e) y que codifica un polipéptido con la actividad biológica del factor 10 de crecimiento de fibroblastos (FGF-10);
o la cadena complementaria de dicho
polinucleótido.
2. El polinucleótido de la reivindicación 1, que
es DNA.
3. El DNA de la reivindicación 2, que es DNA
genómico.
4. El polinucleótido de la reivindicación 1, que
es RNA.
5. Un vector que contiene el polinucleótido de
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. El vector de la reivindicación 5, en el que el
polinucleótido está unido de forma operativa a secuencias control de
expresión que permiten la expresión en células hospedadoras
procariotas o eucariotas.
7. Una célula hospedadora modificada
genéticamente con el vector de la reivindicación 5 ó 6.
8. Un procedimiento para producir un polipéptido
que comprende: cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 7
y recuperar del cultivo el polipéptido codificado por dicho
polinucleótido.
9. Un procedimiento para producir células que
pueden expresar un polipéptido que comprende células modificadas
genéticamente con el vector de la reivindicación 5 ó 6.
10. Un polipéptido codificado por un
polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o que
puede obtenerse por el procedimiento de la reivindicación 8.
11. Un anticuerpo que se une de forma específica
al polipéptido de la reivindicación 10.
12. Un compuesto eficaz como antagonista contra
el polipéptido de la reivindicación 10, siendo dicho compuesto un
anticuerpo según la reivindicación 11 o siendo dicho compuesto una
construcción antisentido que se hibrida de forma específica con un
polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
13. Una molécula de ácido nucleico que se hibrida
de forma específica con un polinucleótido de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4.
14. Una composición farmacéutica que comprende el
polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el
polipéptido de la reivindicación 10 y/o el compuesto de la
reivindicación 12 y, opcionalmente, un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
15. Una composición de diagnóstico que comprende
el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,
la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 13 o un
anticuerpo de la reivindicación 11.
16. Uso de un polipéptido de la reivindicación 10
o de un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
4 para la preparación de una composición farmacéutica para la
estimulación de la revascularización de tejidos isquémicos, para el
tratamiento de heridas, úlceras o lesión neuronal, para potenciar la
regeneración ósea y periodontal, para la prevención del
envejecimiento cutáneo o la pérdida del cabello o para el
mantenimiento de órganos antes de un transplante.
17. Uso de la reivindicación 16, en el que la
lesión neuronal se debe a un trastorno neuronal o estado patológico
neurodegenerativo.
18. Uso de la reivindicación 17, en el que el
estado patológico neurodegenerativo es enfermedad de Parkinson,
enfermedad de Alzheimer o complejo relacionado con el SIDA.
19. Uso del compuesto de la reivindicación 12
para la preparación de una composición farmacéutica para retardar o
prevenir el crecimiento y proliferación celular anómalos o para
prevenir enfermedades hipervasculares o para prevenir la
proliferación de células epiteliales del cristalino después de
cirugía de cataratas extracapsular.
20. Un procedimiento para identificar compuestos
activos como agonistas y antagonistas de FGF-10, que
comprende:
- (a)
- combinar FGF-10, un compuesto que se va a rastrear y una mezcla de reacción que contiene células en condiciones en las que las células son estimuladas normalmente por FGF-10, conteniendo dicha mezcla de reacción un marcador incorporado en las células cuando éstas proliferan; y
- (b)
- determinar el grado de proliferación de las células para identificar si el compuesto es un agonista o antagonista eficaz.
21. Un procedimiento para diagnosticar una
enfermedad o una susceptibilidad a una enfermedad relacionada con
la subexpresión del polipéptido de la reivindicación 10 que
comprende:
determinar una mutación en la secuencia de ácido
nucleico que codifica dicho polipéptido.
22. Un procedimiento diagnóstico que
comprende:
analizar la presencia del polipéptido de la
reivindicación 10 en una muestra derivada de un hospedador.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US207412 | 1994-03-08 | ||
| US08/207,412 US5817485A (en) | 1994-03-08 | 1994-03-08 | Nucleic acids and cells for recombinant production of fibroblast growth factor-10 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2208676T3 true ES2208676T3 (es) | 2004-06-16 |
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ID=22770445
Family Applications (1)
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