ES2208766T3 - Procedimiento de deteccion de mutaciones ki-ras y equipo para llevarlo a cabo. - Google Patents

Procedimiento de deteccion de mutaciones ki-ras y equipo para llevarlo a cabo.

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ES2208766T3 ES96939373T ES96939373T ES2208766T3 ES 2208766 T3 ES2208766 T3 ES 2208766T3 ES 96939373 T ES96939373 T ES 96939373T ES 96939373 T ES96939373 T ES 96939373T ES 2208766 T3 ES2208766 T3 ES 2208766T3
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Abstract

UN METODO PARA DETECTAR MUTACIONES KI-RAS EN EL EXON I, CODON 12 A 13 EN MUESTRAS DE TEJIDO, TEJIDO TUMORAL, SECRECIONES TISULARES, EXCRECIONES, EXPECTORACIONES, SANGRE Y LINFA MEDIANTE DOS AMPLIFICACIONES POR PCR CONSECUTIVAS QUE COMPRENDEN UNA AMPLIFICACION POR PCR NORMAL Y UNA AMPLIFICACION ESPECIFICA PARA EL ALELO Y EN QUE EL PASO DE IDENTIFICACION PUEDE COMPRENDER UN PHAST GEL SSCP, CARACTERIZADO POR QUE LA SELECCION ESPECIFICA DE OLIGOINICIADORES EN LA COMBINACION DE LAS DOS AMPLIFICACIONES POR PCR Y LA IDENTIFICACION POR PHAST GEL O EN COMBINACION CON LA DICHA AMPLIFICACION POR PCR NORMAL Y LA IDENTIFICACION POR PHAST GEL PRODUCE LA DETECCION DIRECTA DE LAS MUTACIONES.

Description

Procedimiento de detección de mutaciones Ki-ras y equipo para llevarlo a cabo.
La invención hace referencia a un procedimiento para la detección de mutaciones en muestras de tejidos y deposiciones mediante amplificación por PCR, utilizando cebadores oligonucleotídicos y un equipo para la realización el procedimiento.
Un creciente número de evidencias implica las mutaciones somáticas como una causa importante en la inducción de cánceres humanos. Estas mutaciones somáticas pueden acumularse en los genomas de células antes normales, pudiendo presentar algunas de ellas los fenotipos asociados con el crecimiento del tumor. Dichas mutaciones oncogénicas pueden incluir diversos tipos distintos de alteraciones en la estructura del DNA, incluyendo deleciones, translocaciones y alteraciones de un solo nucleótido. Estas últimas, también denominadas mutaciones puntuales, pueden intervenir con frecuencia en la carcinogénesis, ya que diversos compuestos químicos mutagénicos inducen dichas mutaciones. Además, dichas mutaciones pueden tener lugar espontáneamente como resultado de errores en la replicación del DNA.
Los avances en la tecnología del DNA recombinante han conducido al descubrimiento de genes celulares normales (proto-oncogenes y genes supresores de tumores) que controlan el crecimiento, el desarrollo y la diferenciación. En ciertos casos, la regulación de estos genes se altera y provoca que las células normales adopten un comportamiento de crecimiento neoplásico. Existen alrededor de unos 100 protooncogenes y genes supresores conocidos en la actualidad, que se incluyen dentro de diversas categorías dependiendo de sus características funcionales. Estos incluyen, (1) los factores de crecimiento y los receptores de los factores de crecimiento, (2) los mensajeros de las vías de transducción de señales intracelulares, por ejemplo, entre el citoplasma y el núcleo y (3) las proteínas reguladoras que influyen sobre la expresión génica y la replicación del DNA.
Las mutaciones puntuales han sido implicadas directamente en la causa de muchos tumores humanos. Algunos tumores portan oncogenes de la familia ras, que difieren de sus homólogos protooncogenes de células normales por la presencia de una mutación puntual en un sitio o en un número limitado de sitios en estos genes. De forma similar, las mutaciones puntuales en las regiones críticas de genes supresores de tumores, como la p53, se detectan a menudo en las células tumorales. Estas mutaciones representan cambios cualitativos en el genoma de la célula tumoral que diferencian estas células de las normales y proporcionan una base para el diagnóstico del origen genético de un tumor a estudio. La identificación de las mutaciones que han generado oncogenes activos puede proporcionar claves importantes para el diagnóstico y pronóstico del desarrollo del tumor. Por ejemplo, se han hallado varias mutaciones que alteran el codón 12 de los oncogenes ras, causando la sustitución de una glicina normalmente presente por cualquier otro residuo aminoacídico alternativo. Dichas sustituciones aminoacídicas crean un alelo transformante potente. En consecuencia, la presencia de una sustitución de un nucleótido determinado puede ser un determinante importante del comportamiento de la célula tumoral (p.ej., su tasa de crecimiento, su capacidad de invasión, etc.). Como resultado, las sondas de DNA de las mutaciones oncogénicas son una promesa como reactivos diagnósticos en la oncología clínica.
Entre los diversos tipos de neoplasmas, algunos de los que se hallan en el tracto gastrointestinal se asocian con mutaciones oncogénicas. Esta asociación es especialmente significativa para el cáncer pancreático y colorrectal. El cáncer colorrectal es el tercer cáncer más común en el mundo, con más de 700.000 casos nuevos previstos en 1996. Sólo en los Estados Unidos, cerca de 70.000 personas fallecerán de un cáncer colorrectal en ese mismo año. Mientras que los pacientes con una enfermedad avanzada tienen un pronóstico muy pobre, los tumores colorrectales diagnosticados en cualquier otro estadio previo a la metástasis pueden extraerse quirúrgicamente o mediante biopsia colonoscópica. Un procedimiento para detectar los tumores reseccionables quirúrgicamente podría, en consecuencia, reducir de forma considerable las muertes por esta enfermedad (Winawer, y col., J. National Cancer Institute, 83:243, 1991).
Un procedimiento para detectar el ácido nucleico de mamífero en las deposiciones se describe en la patente internacional WO 93/20235 (Volgestein, B., & Kinzler, K.). Este procedimiento comprende la purificación de las heces y dos procedimientos distintos para la amplificación de genes ras mutados. El procedimiento 1 se basa en la amplificación por PCR de Ki-ras y el consiguiente clonaje del Ki-ras amplificado en un fago bacteriano, el cultivo del fago y la hibridación con sondas oligonucleotídicas que son específicas para mutaciones únicas en Ki-ras. El procedimiento 2 se basa en la amplificación por PCR, seguido por la electroforesis en gel del producto de PCR, la hibridación del producto con la membrana de nylon y la hibridación específica de los alelos con las sondas marcadas isotópicamente, específicas para cada mutación. Ambos procedimientos son sensibles y específicos. Desafortunadamente, estos procedimientos son a la vez largos y engorrosos, ya que no todas las mutaciones presentes en Ki-ras se detectan mediante un solo procedimiento. En la actualidad, ya se han descrito más de 10 mutaciones de Ki-ras en el exón 1. Los procedimientos anteriores utilizan sondas génicas específicas para cada una de estas mutaciones. Si se ha de rastrear una muestra de deposiciones y no se conoce a priori qué mutación está implicada, se ha de utilizar un gran número de sondas distintas en cada muestra y además cada sonda se ha de marcar radioactivamente.
La amplificación por PCR del DNA de las deposiciones también ha descrito por Smith-Ravin y col., (Gut, 35, 81-86, (1995)). En este proceso, se utilizan de 10-50 g de deposiciones de donde se extrae el DNA, que se purifica y amplifica utilizando cebadores mitocondriales, y se analizan las mutaciones de ras utilizando un procedimiento de detección de desapareamiento específico entre alelos. La tasa total de detección fue de 9 sobre 22, el procedimiento utilizó grandes cantidades de deposiciones y no fue adecuado para el rastreo, ya que fue necesario utilizar sondas de amplificación específica de alelos mutados (MASA) para detectar las mutaciones.
En un artículo de Oncogene, 10, 1441-45, (1995) Hasegawa y col. amplificaron el DNA de 15 de 19 pacientes y utilizando la técnica estándar MASA identificaron 3 mutaciones. A continuación, se generó una técnica MASA especial, que dio como resultado la detección de mutaciones en 10 pacientes. El problema con este procedimiento es una tasa de detección baja y que necesita utilizar una sonda específica para cada mutación. En consecuencia, el procedimiento no es adecuado para el análisis de rastreo.
Suzuki, Y. y col. (Oncogene, 5 (7):1037-43, 1990 describen la detección de mutaciones del gen ras en cánceres de pulmón humanos mediante análisis de polimorfismos de conformación de cadena sencilla (SSCP) de los productos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Sin embargo, este procedimiento no indica la secuencia de las mutaciones.
Los objetivos de la presente invención son producir un procedimiento de rastreo para la detección de mutaciones de Ki-ras en tejidos y deposiciones, con especificidad y simplicidad adecuadas para su realización utilizando pequeñas cantidades de sustrato.
Estos objetivos se obtienen por la presente invención, la cual se caracteriza por las reivindicaciones incluidas.
La presente invención hace referencia a un procedimiento de rastreo para la detección de mutaciones Ki-ras en muestras pequeñas de tejido o deposiciones en las que se utilizan cebadores específicos de acuerdo con la invención para generar un producto de PCR de 221 pares de bases. Este producto muestra patrones de polimorfismos de conformación de cadena sencilla (SSCP) en los que se detecta una mutación y se identifica mediante el análisis de SSCP realizado en geles homogéneos de poliacrilamida al 20% (Phast-gels, Pharmacia).
Para aumentar la cantidad de producto de PCR es posible realizar posteriormente una PCR semi-anidada en la que se utiliza un oligonucleótido extra en el extremo 5', mientras que el cebador oligonucleotídico específico de la primera etapa se utiliza en el extremo 3'. En el siguiente ciclo de PCR, se utilizan los dos cebadores de la primera etapa, lo que da como resultado un producto de PCR de 221 pares de bases. En este producto, las mutaciones se detectan mediante SSCP con el Phast-gel al igual que antes.
De acuerdo con la invención, se puede obtener un incremento adicional de la sensibilidad mediante una tercera etapa, utilizando una amplificación específica de alelo o una extensión del cebador específico para la mutación. Esta etapa implica la utilización de sondas que contengan un desapareamiento respecto al gen de tipo salvaje en las últimas bases en el extremo 3' y un desapareamiento adicional en la base segunda o tercera desde el extremo 3'. Esta estrategia incrementa de modo sorprendente la sensibilidad del procedimiento. Así, utilizando el procedimiento de acuerdo con la invención, se detectaron mutaciones de Ki-ras en 8 de 12 pacientes en una PCR doble, y en otro estudio, se detectaron mutaciones de Ki-ras en 6 de 7 pacientes mediante la etapa primera, mientras que se detectaron mutaciones en los 7 combinando la etapa 1 y la 2. En consecuencia, la tasa de detección fue del 90% con una PCR sencilla y del 100% con una PCR combinada.
A continuación, la invención se describe con mayor detalle junto con los ejemplos y las figuras.
La Fig. 1 muestra los análisis de SSCP del exón 1 de Ki-ras. Carril 1: tipo salvaje (la secuencia de tipo salvaje de los codones 12 y 13 es GGT y GGC, respectivamente). Carril 2 a 7: muestras heterocigotas para la secuencia de tipo salvaje y las mutaciones del codón 12: en el carril 2, AGT; en el carril 3, CGT; en el carril 4, TGT; en el carril 5, GAT; en el carril 6, GCT y en el carril 7, GTT. Carril 9: muestra heterocigota para tipo salvaje y mutación en el codón 13, GAC. Carril 9: muestra heterocigota para tipo salvaje y una mutación doble rara del codón 12, TTT.
La Fig. 2 muestra el análisis de PCR-SSCP del exón 1 del gen de Ki-ras de especímenes quirúrgicos. Todas las muestras fueron heterocigotas, excepto la muestra en el carril 1. El codón 12 de tipo salvaje es GGT y el codón 13 de tipo salvaje es GGC. La electroforesis se migró en un PhastGel homogéneo al 20%.
Las mutaciones del codón 12 se muestran en los carriles siguientes: 1) AGT (el alelo de tipo salvaje está ausente); carril 2) CGT; carril 3) TGT; carril 4) GAT; carril 5) GCT; carril 6: GTT; carril 8) TTT. El carril 7 muestra una mutación del codón 13, GAC.
La Fig. 3 muestra las frecuencias de las mutaciones distintas halladas en los tumores.
La Fig. 4 muestra el análisis de secuencia del adenoma 1 del paciente C-05. El análisis de la secuencia del DNA del exón 1 de Ki-ras muestra las dos transiciones G a T en el codón 12 (flecha).
La Fig. 5 muestra los productos de PCR en la electroforesis en gel del análisis ASA (PCR discriminatoria) del DNA purificado procedente de las deposiciones. Las señales muestran una mutación positiva GTT. 1 y 2: paciente C-04; 3 y 4: paciente C-23, 5 y 6: control positivo, 7: control positivo diluido a 1:100, 8 y 9: control negativo (deposiciones de un paciente con otra mutación que la analizada ), 12: control negativo (sin adición de DNA).
De especial significación en la presente invención es la detección del oncogen Ki-ras mutado.
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Con el fin de analizar los especímenes de deposiciones de acuerdo con el procedimiento de la invención, es necesario separar el ácido nucleico de mamífero presente en el espécimen. Hay dos problemas principales asociados con la preparación de ácido nucleico de mamífero de deposiciones. En primer lugar, el ácido nucleico de mamífero debe liberarse de las células de mamífero y separarse de las células bacterianas. Esta etapa se complica además por el hecho de que es deseable evitar la liberación de ácido nucleico de las bacterias, ya que existe un enorme exceso de ácido nucleico bacteriano en comparación con el ácido nucleico eucariota en el espécimen de deposición. En segundo lugar, una vez liberado, el ácido nucleico puede protegerse de la concentración relativamente alta de nucleasas que están presentes en la deposición y que puede degradar el ácido nucleico de mamífero liberado y en consecuencia impedir el análisis. En la presente invención, se ha hallado que dichos criterios estrictos pueden lograrse incubando la deposición en un tampón de lisis disponible comercialmente que contiene una gran concentración de tampón de por lo menos 500 mM, a un pH de por lo menos 8,0, con un agente quelante como el EDTA y una concentración de sal relativamente baja, preferentemente menos de 10 mM.
El tampón de lisis de deposiciones minimiza la degradación del ácido nucleico gracias al pH y a las propiedades quelantes, lisa las células eucariotas, pero no las bacterias, y es adecuado para el posterior procesamiento para purificar y/o concentrar el ácido nucleico eucariota. Después del tratamiento con el tampón de lisis, se procesa el espécimen (p.ej., mediante centrifugación) para eliminar las bacterias y otros residuos. La fracción no particulada del lisado se incuba a continuación con una proteinasa (por ejemplo proteinasa K a 0,5 \mug/ml) en SDS (1%) para degradar las nucleasas y otras proteínas. El ácido nucleico en la muestra puede separarse posteriormente mediante medios químicos, como por ejemplo uniendo el ácido nucleico cargado negativamente a columnas de intercambio iónico y a continuación eluyendo el DNA purificado/concentrado y/o concentrando a continuación el DNA mediante precipitación con etanol.
Además, se ha hallado que las deposiciones también pueden contener inhibidores que han de eliminarse preferentemente si la secuencia nucleotídica mutante presente en el DNA de las deposiciones debe amplificarse, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Uno de estos inhibidores interfiere con la amplificación del DNA por la Taq polimerasa. Este inhibidor puede eliminarse uniendo el ácido nucleico de la deposición a una matriz inmóvil en presencia de sales caotrópicas, como el yoduro sódico 0,6 M o el perclorato sódico. Sorprendentemente, se ha hallado que el vidrio es la matriz preferida para este propósito. Especialmente preferidas son las versiones comerciales de vidrio de Prep-A-Gene™ (BioRad) y Spin-Bind™ (FMC).
El otro inhibidor presente en las deposiciones evita la unión del ácido nucleico con el vidrio. Se ha hallado que este segundo inhibidor puede eliminarse uniendo el inhibidor a una resina de intercambio iónico (p.ej., de Quiagen) en presencia de concentraciones de sal elevadas, por ejemplo de por lo menos 1,0 M. Los expertos en la materia pueden idear diversas maneras para modificar los procesos descritos anteriormente de concentración y/o purificación del DNA de mamífero de deposiciones, una vez demostrado que el ácido nucleico de mamífero puede obtenerse selectivamente a partir de especímenes de deposiciones. Alternativamente, los expertos en la materia pueden determinar, sin experimentaciones excesivas, los reactivos y condiciones alternativas que son funcionalmente equivalentes a los descritos aquí, ahora que se sabe que dichos procedimientos son practicables con los especímenes de deposiciones. Dichas modificaciones y funciones equivalentes se abarcan dentro de la presente invención.
Los aminoácidos aquí referidos se pueden identificar de acuerdo con las abreviaciones siguientes de tres o una letra:
Amino Abreviaciones de tres letras Abreviación de una sola letra
L-alanina Ala A
L-arginina Arg R
L-asparraguina Asn N
L-ácido aspártico Asp D
L-cisteína Cys C
L-glutamina Gln Q
L-ácido glutámico Glu E
L-glicina Gly G
L-histidina His H
L-isoleucina Ile I
L-leucina Leu L
L-lisina Lys K
L-metionina Met M
L-fenilalanina Phe F
L-prolina Pro P
L-serina Ser S
(Continuación)
Amino Abreviaciones de tres letras Abreviación de una sola letra
L-treonina Thr T
L-triptófano Trp W
L-tirosina Tyr Y
L-valina Val V
Cuando se desee amplificar la secuencia nucleotídica mutante antes de la detección, esto se puede lograr utilizando oligonucleótido(s) que sean cebadores para la amplificación. Estos cebadores oligonucleotídicos únicos se basan en la identificación de las regiones flanqueantes contiguas a la secuencia nucleotídica mutante. Por ejemplo, en el caso de Ki-ras, estos cebadores oligonucleotídicos comprenden la secuencia que es capaz de hibridar con la secuencia nucleotídica flanqueante 5'-GGTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACCTTATGT-3' (Sec Id. Nº 1) y/o
5'-AATGGTCCTGCACCAGTAAT-3' (Sec (Id. Nº 2) y las secuencias complementarias.
Los cebadores que pueden utilizarse de acuerdo con la invención abarcan los oligonucleótidos de longitud suficiente y secuencia adecuada para proporcionar la iniciación de la polimerización de un número significativo de moléculas de ácido nucleico que contengan el ácido nucleico diana. De este modo, es posible amplificar selectivamente la secuencia de ácido nucleico diana específica que contenga el ácido nucleico de interés. Específicamente, el término "cebador", tal como se utiliza aquí, hace referencia a una secuencia que comprende dos o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, preferentemente por lo menos 8, cuya secuencia es capaz de iniciar la síntesis de un producto de extensión de cebador, que es esencialmente complementario con una cadena de ácido nucleico diana. El cebador oligonucleotídico contiene típicamente de 15-22 o más nucleótidos, aunque también puede contener menos.
Las condiciones experimentales que conducen a la síntesis incluyen la presencia de nucleótidos trifosfato y de un agente para la polimerización, como la DNA polimerasa, y una temperatura y pH adecuados. El cebador es preferentemente de cadena sencilla. Si fuera de cadena doble, el cebador se trata en primer lugar para separar ambas cadenas antes de ser utilizado para preparar los productos de extensión. Preferentemente, el cebador es un oligodesoxirribonucleótido. El cebador debe ser suficientemente largo para cebar la síntesis de los productos de extensión en presencia del agente inductor de la polimerización. La longitud exacta del cebador dependerá de muchos factores, incluyendo la temperatura, el tampón y la composición de nucleótidos.
Los cebadores utilizados de acuerdo con el procedimiento de la invención se diseñaron para ser "esencialmente" complementarios con cada cadena de secuencia nucleotídica mutante a ser amplificada. El término "esencialmente complementario" significa que los cebadores deben ser suficientemente complementarios con sus respectivas cadenas en condiciones que permitan funcionar el agente de polimerización. En otras palabras, los cebadores deberían ser suficientemente complementarios con las secuencias flanqueantes para hibridar con éstas y permitir la amplificación de la secuencia nucleotídica mutante. Preferentemente, el extremo del cebador que se extiende tiene una complementariedad de bases perfecta con la cadena flanqueante complementaria.
Los cebadores oligonucleotídicos utilizados de acuerdo con la invención se utilizan en cualquier proceso de amplificación que produzca cantidades crecientes del ácido nucleico diana. Típicamente, un cebador es complementario con la cadena negativa (-) de la secuencia nucleotídica mutante y el otro es complementario con la cadena positiva (+). El anillamiento de los cebadores con el ácido nucleico seguido de la extensión con una enzima, como la DNA polimerasa termoestable o Taq, y nucleótidos o ligasas, da como resultado las cadenas + y - sintetizadas de nuevo que contienen el ácido nucleico diana. Ya que estos ácidos nucleicos sintetizados de nuevo son también moldes, ciclos repetidos de desnaturalización, anillamiento de cebadores y extensión dan como resultado productos exponenciales de la región (es decir, la secuencia nucleotídica mutante) definida por el cebador. El producto de la reacción de amplificación es un dúplex de ácido nucleico discreto, correspondiendo sus extremos terminales con los extremos de los cebadores específicos utilizados. Los expertos en la materia conocerán otras metodologías de amplificación que también pueden utilizarse para incrementar el número de copias del ácido nucleico diana.
Un modo útil para aumentar el número de copias del producto de PCR es utilizar el procedimiento denominado PCR semi-anidada. Utilizando esta aproximación, uno de los cebadores originales se utiliza como un cebador nuevo, p.ej., enmarcando la región 3' del primer producto de PCR. Otro cebador cadena arriba, p.ej., 5'-AACTTAATGTGTGACATGTTCTAAT-3' (Sec. Id. Nº 3) puede utilizarse a continuación en la región marcada opuesta para generar un nuevo y más pequeño producto de PCR que contiene la región mutada positiva dentro del nuevo producto de PCR.
Los cebadores oligonucleotídicos a utilizar en la invención pueden prepararse utilizando cualquier procedimiento conocido, como por ejemplo los procedimientos convencionales del fosfotriéster y fosfodiéster o las realizaciones automatizadas de lo mismo. En una realización automatizada, se utilizan las dietilfosforamiditas como materiales de inicio y pueden sintetizarse tal como se describe en Beaucage y col. (Tetrahedron Letters, 22:1859-1862, 1981). Un procedimiento para la síntesis de oligonucleótidos en un soporte sólido modificado se describe en la patente americana 4.458.066. Un procedimiento de amplificación que puede utilizarse de acuerdo con la presente invención es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) descrita en la patente americana U.S. 4.683.202 y 4.683.195.
Se puede utilizar cualquier ácido nucleico de especímenes de deposiciones, en forma purificada o no, como el ácido o ácidos nucleicos de partida, siempre que contenga, o se sospeche que contiene, la secuencia de ácido nucleico específica con el ácido nucleico diana. En consecuencia, el proceso puede utilizar, por ejemplo, DNA o RNA, incluyendo RNA mensajero, en donde el DNA o el RNA puede ser de cadena sencilla o doble. En el caso de que se utilice RNA como molde, se utilizarían las enzimas y/o las condiciones óptimas para la transcripción inversa del molde en DNA. Además, se puede utilizar un híbrido DNA-RNA que contiene una cadena de cada uno. También se puede utilizar una mezcla de ácidos nucleicos, o los ácidos nucleicos producidos en una reacción de la amplificación anterior, utilizando los mismos o distintos cebadores. La secuencia nucleotídica mutante a amplificar, puede ser una fracción de una molécula mayor o puede estar presente inicialmente como una molécula discreta, de modo que su secuencia específica constituye el ácido nucleico completo. No es necesario que la secuencia a amplificar esté inicialmente presente en una forma pura; puede ser una fracción menor de una mezcla compleja, como la contenida en el DNA completo humano.
Si la secuencia nucleotídica mutante diana de la muestra contiene dos cadenas, es necesario separar las cadenas del ácido nucleico antes de utilizarlo como molde. La Separación de cadenas se puede realizar bien como una etapa separada o simultáneamente con la síntesis de los productos de extensión del cebador. La separación de cadenas se puede conseguir utilizando diversas condiciones desnaturalizantes adecuadas, incluyendo medios físicos, químicos o enzimáticos; el término "desnaturalizante" incluye todos esos medios. Un procedimiento físico de separación de cadenas de ácido nucleico implica calentar el ácido nucleico hasta su desnaturalización. La desnaturalización térmica típica puede implicar temperaturas del orden de 80º a 105ºC durante tiempos desde 1 a 10 minutos. La separación de cadenas puede también inducirse por una enzima de la clase de enzimas conocidas como las helicasas o por la enzima RecA, que tiene actividad helicasa y que en presencia de riboATP se sabe que desnaturaliza el DNA. Las condiciones de reacción adecuadas para la separación de cadenas de ácidos nucleicos con helicasas se describen por Huhn Hoffmann-Berling (CSH-Quantitative Biology, 43:63, 1978) y las técnicas de utilización de RecA se revisan en C. Radding (Ann. REv. Genetics, 16:405-437, 1982).
Si el ácido nucleico que contiene el ácido nucleico diana a amplificar es de cadena sencilla, su complementario se sintetiza añadiendo uno o dos cebadores oligonucleotídicos. Si se utiliza un solo cebador, el producto de extensión del cebador se sintetiza en presencia del cebador, un agente para la polimerización y cuatro nucleósidos trifosfatos, que se describen más adelante. El producto será complementario con el ácido nucleico de cadena sencilla e hibridará con un ácido nucleico de cadena sencilla para formar un dúplex de cadenas de longitud desigual, que puede separarse a continuación en cadenas sencillas para producir dos cadenas complementarias separadas. Alternativamente, se pueden añadir dos cebadores al ácido nucleico de cadena sencilla y la reacción se lleva a cabo tal como se describe.
Cuando se separan las cadenas complementarias del ácido nucleico, independientemente de que el ácido nucleico original sea de cadena sencilla o doble, las cadenas separadas están listas para ser utilizadas como un molde en la síntesis de cadenas adicionales de ácido nucleico. Esta síntesis se realiza en condiciones que permitan la hibridación de los cebadores con los moldes. En general, la síntesis tiene lugar en una solución acuosa tamponada, preferentemente a un pH de 7-9, más preferentemente a aproximadamente 8. Preferentemente, se añade un exceso molar (para el ácido nucleico, generalmente de 10^{8}:1 de cebador:molde) de los dos cebadores oligonucleotídicos en el tampón que contiene las cadenas de molde separadas. Se sobreentenderá, sin embargo, que la cantidad de cadenas complementarias puede que no sean conocida si el procedimiento de la invención se utiliza para aplicaciones diagnósticas, de modo que la cantidad de cebador relativa a la cantidad de cadena complementaria no puede determinarse con certitud. En la práctica, sin embargo, la cantidad de cebador añadido estará generalmente en exceso respecto a la cantidad de cadena complementaria (molde) cuando la secuencia a amplificar esté contenida en una mezcla complicada de cadenas de ácido nucleico de cadena larga. Es preferible un exceso molar para mejorar la eficiencia del proceso.
En algunas realizaciones de amplificación, los sustratos, por ejemplo, los desoxirribonucleótidos dATP, dCTP, dGTP y dTTP se añaden a la mezcla de síntesis, bien de forma separada o juntamente con los cebadores en una cantidad adecuada. Y la solución resultante se calienta a aproximadamente 90-100ºC durante unos 10 minutos, preferentemente de 1 a 4 minutos. Después de este periodo de calentamiento, se deja enfriar la solución a temperatura ambiente, que es conveniente para la hibridación del cebador. A la mezcla enfriada, se añade un agente para realizar la extensión por cebador (denominado aquí "agente de polimerización") y se deja que la reacción tenga lugar en condiciones conocidas en la materia. El agente para la polimerización puede también añadirse junto con otros reactivos si es estable al calor. Esta reacción de síntesis (o amplificación) puede tener lugar desde la temperatura ambiente hasta una temperatura por encima de la cual el agente de polimerización deja de funcionar. En consecuencia, por ejemplo, si la DNA polimerasa se utiliza como el agente, la temperatura no será generalmente superior a aproximadamente 40ºC. De forma más conveniente, la reacción tiene lugar a temperatura ambiente.
El agente para la polimerización puede ser cualquier compuesto o sistema que funcionará para lograr la síntesis de productos de extensión de cebador, incluyendo las enzimas. Las enzimas adecuadas para este propósito incluyen, por ejemplo, la DNA polimerasa I de E. coli, la Taq polimerasa, el fragmento Klenow de la polimerasa I de E. coli, la T4 DNA polimerasa, otras DNA polimerasas disponibles, transcriptasas inversas, muteínas de polimerasas, ligasas y otras enzimas incluyendo las enzimas termoestables (es decir, las enzimas que realizan la extensión del cebador después de someterse a temperaturas suficientemente elevadas para causar la desnaturalización). Las enzimas adecuadas facilitarán la combinación de los nucleótidos en la manera adecuada para realizar los productos de extensión por cebador que son complementarios con cada cadena nucleotídica mutante. En general, la síntesis se iniciará en el extremo 3' de cada cebador y proseguirá en la dirección 5' a lo largo de la cadena molde, hasta finalizar la síntesis, produciendo moléculas de longitudes diversas. Sin embargo, puede haber agentes para la polimerización, que inicien la síntesis en el extremo 5' en la otra dirección, utilizando el mismo proceso que el descrito anteriormente. En cualquier caso, el procedimiento de la invención no se limita a las realizaciones de amplificación que se describen aquí.
La cadena nucleotídica mutante sintetizada de nuevo y su cadena de ácido nucleico complementaria formarán una molécula de doble cadena en las condiciones de hibridación descritas anteriormente y dicho híbrido se utilizará en las siguientes etapas del proceso. En la etapa siguiente, la molécula de cadena doble sintetizada de nuevo se somete a condiciones desnaturalizantes utilizando cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente para proporcionar moléculas de cadena sencilla.
El proceso anterior se repite con las moléculas de cadena sencilla. Si fuera necesario, se pueden añadir agente de polimerización, nucleótidos y cebadores adicionales, para que la reacción tenga lugar en las condiciones descritas anteriormente. De nuevo, la síntesis se iniciará en un extremo de cada uno de los cebadores oligonucleotídicos y continuará a lo largo de las cadenas sencillas del molde para producir el ácido nucleico adicional. Después de esta etapa, la mitad del producto de extensión consistirá en la secuencia de ácido nucleico específico enmarcado por los dos cebadores.
Las etapas de desnaturalización y de síntesis de los productos de extensión se pueden repetir tanto como sea necesario, para amplificar la secuencia nucleotídica mutante diana en la cantidad necesaria para su detección. La cantidad de secuencia nucleotídica mutante producida se acumulará de forma exponencial.
El producto amplificado puede detectarse e identificarse mediante análisis de polimorfismos conformacionales de cadena sencilla utilizando el Phast System de Pharmacia para electroforesis controlada por temperatura y tinción con plata automáticas. En dicho proceso, por ejemplo, una muestra pequeña de DNA amplificado se somete a la desnaturalización y luego a una electroforesis en un gel pre-polimerizado de Phast-gel, por ejemplo los suministrados por Pharmacia. En un gel de estas características, un fragmento de DNA de cadena sencilla migrará dependiendo de su conformación. La conformación es dependiente de la secuencia básica de nucleótidos, con lo que las secuencias que varían en uno o varios nucleótidos tendrán una conformación única y específica.
En una realización de la invención, los fragmentos nucleotídicos de deposiciones después de la amplificación se separan en fragmentos de conformación distinta mediante electroforesis en geles Phastgel de Pharmacia. Después de la electroforesis el gel se expone a una mezcla que contiene plata para teñir los diversos fragmentos nucleotídicos, con lo que se detectan e identifican los diversos tipos de fragmentos nucleotídicos mutantes.
Ejemplo 1 Detección e identificación de las mutaciones de Ki-ras en el exón-1 mediante análisis en minigel de conformación de los polimorfismos de cadena sencilla
El análisis de los polimorfismos de conformación de cadena sencilla (SSCP) es un procedimiento muy útil cuando se trata de detectar mutaciones (40). El procedimiento se basa en el hecho de que la conformación asumida por un fragmento de DNA de cadena sencilla en condiciones no desnaturalizantes, y por tanto de su movilidad electroforética, depende de su secuencia precisa. Normalmente, con los SSCP, las mutaciones continúan sin estar identificadas aún después haber sido detectadas. Sin embargo, en el caso del oncogen Ki-ras, hay un número limitado de mutaciones descritas, correspondiendo la mayoría de ellas a los codones 12 y 13 del exón 1. Por tanto, siempre que cada variante mutacional tenga un patrón característico de SSCP, se proporcionará la base para su posterior identificación. Este aspecto ha sido señalado en algunos artículos anteriores sobre Ki-ras (18, 41, 42).
Este estudio describe un protocolo de SSCP en el que es posible detectar e identificar todas las variantes mutacionales publicadas más frecuentemente del exon 1 de Ki-ras. Además, se identificaron dos variantes adicionales, cuya existencia no había sido anteriormente descrita en material de biopsias quirúrgicas. El protocolo utiliza geles de poliacrilamida previamente polimerizados, un aparato de electroforesis y un instrumento de tinción (Phast System, Pharmacia, Sweden). No se utiliza marcaje isotópico del DNA.
Las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) se llevaron a cabo en un termociclador Perkin Elmer TC1 mediante un programa con dos etapas; 94ºC, 15 s, 58ºC, 30 s, durante 30-40 ciclos dependiendo de la cantidad inicial de DNA molde. Este programa fue precedido por una etapa de 2 min a 94ºC, y se finalizó con 5 min a 72ºC. Los cebadores utilizados fueron: 5'-AACCTTATGTGTGACATGTTCTAAT-3' (Sec. Id. Nº. 5) (del extremo 5' de la secuencia) y
5'-AATGGTCCTGCACCAGTAAT-3' (Sec. ID. Nº. 2) (del extremo 3' de la secuencia). La mezcla de la reacción de PCR consistió en Tris-Cl 10 mM a pH 9,0, KCl 50 mM, MgCl_{2}1,5 mM, gelatina al 0,01% (w/v), Tritón al 0,1%, 125 \muM de cada dNTP, 0.2 \muM de cada cebador y 0,2 \muM de Taq polimerasa (Supertaq, HT Biotechnology Ltd., UK) en un volumen total de 100 \mul. El tamaño del producto fue de 221 bp.
Protocolo de SSCP: Un volumen de 4 \mul de cada producto de PCR se desnaturalizó al mezclarlo con un volumen igual de formamida ionizada y calentando brevemente a 80ºC. Para mantener el DNA en estado desnaturalizado, no fue necesario realizar a continuación un enfriamiento rápido en hielo. Las muestras se cargaron en un gel homogéneo de poliacrilamida al 20% (Phast gel) utilizando tiras de tampones que contenían L-Alanina 0,88 M, Tris 0,25 M a pH 8,8 y seguidamente se migraron según el siguiente programa: prerrecorrido: 400 V, 10 mA, 2,5 W, 15ºC, 100 Vh; carga: 400 V, 1mA, 2,5 W, 15ºC, 3 Vh; separación: 400 V, 10 mA, 2,5 W, 15ºC, 300 Vh. Después de la electroforesis, los geles se tiñeron con plata según las instrucciones del fabricante. Con este procedimiento se pudieron analizar 24 muestras en dos horas.
Todas las mutaciones descritas más comunes del exón 1 de Ki-ras (7) y la doble mutación poco común (Codón 12; GGT a TTT) se detectaron e identificaron con el método presentado aquí (Fig. 1). Cuando se realizó un rastreo en diversas biopsias de tumores de pulmón, colon y páncreas (n>400) se pudieron hallar todas las mutaciones. La identificación de las mutaciones se realizó mediante secuenciación de al menos dos muestras representativas de un patrón de bandas de tipo individual. Además, como control, se analizó un número adicional de muestras con la técnica de la amplificación alelo-especifíca (ASA) (20). En cada caso, las mutaciones se observaron como dos bandas (o algunas veces más, debido a bandas secundarias que probablemente representan conformaciones meta-estables) además de las bandas salvajes. Esto se interpretó como que ambas cadenas sencillas mutadas migraban de manera diferente a las cadenas de tipo salvaje. Se pudo por tanto distinguir entre diferentes variantes mutacionales y bandas inespecíficas producidas de manera ocasional en la PCR en relación con las dos bandas específicas de tipo salvaje. Ello se consideró un requisito para aceptar como correcta la identificación.
La proporción mínima del DNA mutado respecto al normal necesaria para la detección de una mutación se comprobó tal como se detalla a continuación: El DNA genómico con una mutación homocigota AGT se mezcló con el DNA genómico normal en las siguientes proporciones: 1:10, 1:20, 1:40, 1:80 y 1:160, con las cantidades combinadas fijas e iguales a 250 ng. Estas mezclas se utilizaron a continuación para realizar una reacción de PCR de 35 ciclos. Posteriormente, se realizó el análisis de SSCP de los productos. La señal de la mutación se detectó en todos los casos y solamente con dificultad cuando la proporción de la mezcla (DNA mutante/DNA normal) fue de 1:160 (resultados no mostrados).
Además de las mutaciones mencionadas más arriba, una mutación en la última base del codón 19: TTG a TTT, hallada en una biopsia de cáncer de colon, fue también detectada y distinguible de otras mutaciones (resultados no mostrados).
Se debería precisar que la utilización de SSCP para identificar mutaciones es posible únicamente en los casos especiales en los que se ha descrito que existe un espectro limitado de mutaciones específicas. En el caso presentado, la heterogeneidad demostrada por los patrones de SSCP facilita una detección rápida, sencilla y sensible y una identificación de las mutaciones en el exón 1 de Ki-ras sólo por SSCP.
Ejemplo 2 Detección mediante PCR de las mutaciones de Ki-ras en las heces de pacientes con tumores colorrectales II Materiales y métodos Selección de pacientes
En el estudio se incluyeron 25 pacientes admitidos durante agosto y noviembre de 1994 en el Departamento de Cirugía del Hospital de la Universidad de Bergen (Haukeland Hospital), Noruega. Se distribuyeron en dos grupos diferentes con la idea de poder valorar la sensibilidad de los procedimientos utilizados. El primer grupo (A) estaba formado por 10 pacientes sometidos a investigación colonoscópica por sospecha de tumores colorrectales y en los que en consecuencia se halló un tumor maligno colorrectal (carcinoma) o un tumor benigno (adenoma) con un tamaño superior a 1 cm. El otro grupo (B), constituido por 15 pacientes, comprendió paciente sometidos a resección quirúrgica de carcinomas colorrectales o adenomas con un tamaño superior a 1 cm. Los pacientes (10 hombres, 15 mujeres) tenían edades comprendidas entre los 49 y los 90 años (edad media, 70) en el momento de la extirpación del tumor.
Recogida de tumores y heces
La recogida de las muestras del tejido tumoral de cada paciente se realizó, en la mayoría de los casos, directamente después de la cirugía y colonoscopía colorrectal. En último el caso, el tejido se obtuvo a través de la biopsia o la polipectomia. El Departamento de Patología del Haukeland Hospital suministró los bloques de tejido incluidos en parafina correspondientes a 5 pacientes. En total, se obtuvieron 27 especímenes de tumores colorrectales correspondientes a 25 pacientes. De dos pacientes se obtuvieron un total de cuatro tumores distintos, que cumplían con los criterios impuestos; estos tumores se hallaron concomitantemente con los especímenes resectados quirúrgicamente. De los 27 tumores, 15 fueron carcinomas y 12 adenomas, según el informe patológico.
Las muestras de deposiciones se obtuvieron durante la colonoscopia, en la recogida del fluido de lavado, o antes de la cirugía. Las muestras se guardaron a -80ºC.
Preparación de DNA de muestras tumorales
El DNA genómico se extrajo de las muestras tumorales utilizando dos métodos estándares que se describen a continuación^{10}.
Aproximadamente 25 mg de tejido tumoral se recogió en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Para la lisis celular, la muestra se disolvió en 300 \mul de tampón TE (Tris-HCl 10 mM a pH 8,0 y EDTA 1 mM), 30 \mul de proteinasa XIV (10 mg/ml), 30 \mul de SDS (sodio-dodecil-sulfato) al 10% y 30 \mul de tampón THE (Tris-HCl 100 mM a pH 8,0, NaCl 1,5 M y EDTA 100 mM a pH 8,0). Las muestras se incubaron toda la noche a 37ºC.
Para la extracción de proteína y contaminantes de las muestras, se realizaron extracciones con fenol/cloroformo: a cada muestra se añadió 1 volumen de fenol, se agitó mediante vórtex y centrifugó a 4ºC y 13000 g durante 5 min. A continuación, se transfirió la fase superior a un nuevo tubo añadiéndose seguidamente 1 vol de cloroformo, la solución se agitó mediante vórtex y se centrifugó 5 min. La fase acuosa superior se transfirió a un nuevo tubo y se añadieron 2,5 volúmenes de etanol al 96%. Seguidamente, la muestra se precipitó a -20ºC durante al menos 1 hora y se centrifugó durante 10 minutos y a continuación se extrajo cuidadosamente el sobrenadante que fue descartado. El precipitado se lavó con etanol al 70% y se secó al aire. Por último, el DNA se resuspendió en 100 \mul de tampón TE.
El DNA de los bloques incluidos en parafina se extrajo según un método descrito recientemente^{11}.
Se cortó una sección de 20 \mum del bloque de tejido. La sección se depositó en tampón Tris-HCl 10 mM a pH 9,0 que contenía la resina Chelex-100 (Bio Rad Laboratories Hercules, California, USA) al 5% y se hirvió durante 10 minutos.
Procedimientos de la reacción en cadena de la polimerasa
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se ha consolidado como una de las técnicas más ampliamente utilizadas de la biología molecular. Las razones se basan en lo siguiente: es un medio rápido, poco costoso y sencillo para producir microgramos a partir de cantidades mínimas de DNA obtenidas a partir del material de origen. La técnica de la PCR se basa en el conocimiento de al menos parte de la secuencia de DNA de alrededor de la región de interés. En primer lugar, se describirán brevemente los principios básicos de la PCR, antes de empezar con los procedimientos llevados a cabo en este estudio.
En la PCR, el fragmento de DNA cadena de doble que va a ser amplificado (molde) se mezcla con dos fragmentos cortos de cadena sencilla (cebadores) complementarios con las secuencias de ambos extremos de la secuencia a amplificar. La mezcla de reacción también contiene una polimerasa de DNA estable al calor y los cuatro nucleótidos requeridos para la síntesis de DNA.
La mezcla se calienta a 95ºC aproximadamente para desnaturalizar el molde de DNA de cadena doble en dos cadenas sencillas y a continuación se enfría a unos 60ºC para permitir el anillamiento de cada cebador con su secuencia complementaria en los moldes de DNA de cadena sencilla. Seguidamente, la temperatura se ajusta a 72ºC, temperatura óptima para la síntesis de una nueva cadena por la polimerasa, a través de la extensión de cada cebador mediante sucesivas adiciones de nucleótidos. Cada cadena de DNA sintetizada de nuevo contiene un lugar de unión para el otro cebador y por tanto sirve como un molde adicional en el siguiente ciclo. El ciclo se repite un número determinado de veces, duplicándose cada vez la cantidad de producto. Para tener una idea de la capacidad de amplificación de la PCR, 20 ciclos producen un millón de copias de una molécula de DNA^{12-13}.
El exón 1 de Ki-ras se amplificó mediante PCR en las siguientes condiciones: 2 \mul de DNA disuelto se amplificaron en un volumen total de 100 \mul, conteniendo Tris-HCl 100 mM (pH 9,0 a 25ºC), KCl 50 mM, MgCl_{2}1,5 mM, gelatina al 0,01% (p/v), Tritón X-100 al 0,1%, 125 \muM de cada desoxinucleótido trifosfato y 0,5 \muM de cada cebador, añadiéndose 0,2 unidades de Taq DNA polimerasa (Supertaq) obtenida de HT Biotechnology (Cambridge, England).
Las reacciones se llevaron a cabo en un termociclador (Perkin-Elmer Cetus, CT, USA) mediante un proceso en dos etapas: 94º durante 15 segundos (desnaturalización), 60ºC durante 30 segundos (hibridación/extensión), durante 40 ciclos. El proceso fue precedido por una etapa de 2 minutos a 94ºC (paso de desnaturalización simple) y una extensión final durante 4 minutos a 72ºC. Los cebadores fueron los siguientes: cebador del extremo 5' de la secuencia, 5'-AAC CTT ATG TGT GAC ATG TTC T-3' (Sec. Id. Nº.5) (designada R1) y cebador del extremo 3' de la secuencia, 5'-AAT GGT CCT GCA CCA GTA AT-3' (Sec. Id. Nº. 2) (R2). Los cebadores utilizados generaron un producto de 221 pares de bases (pb) de longitud.
Identificación de mutaciones de Ki-ras en muestras tumorales
Existen varios procedimientos para determinar la presencia de un único cambio de una base en un DNA amplifi-
cado^{(14-21)}. Entre ellos, se ha escogido para la presente invención un procedimiento que ha demostrado ser rápido y sensible, denominado análisis de los polimorfismos de conformación de cadena sencilla (SSCP)^{(22-24)}.
El DNA es un heteropolímero cargado negativamente que se mueve hacia el polo positivo cuando se coloca en un campo eléctrico. En este principio está basada la técnica de la electroforesis de DNA.
En el laboratorio, se emplea frecuentemente el principio de cribaje molecular. Con esta estrategia es posible separar y seleccionar diferentes moléculas, por ejemplo diferentes fragmentos de DNA forzándolos a moverse en un entramado de polímeros orgánicos hidratados, denominado gel. Las velocidades de desplazamiento en el gel de los fragmentos de DNA sufrirán un determinado retardo en función de su tamaño y/o de su forma.
La técnica de SSCP utiliza una propiedad determinada de los fragmentos pequeños (100-400 pb) de DNA de cadena sencilla: cuando se les permite plegarse sobre ellos mismos, forman distintas estructuras (conformaciones). Estas conformaciones vienen determinadas por interacciones intramoleculares y en consecuencia por su secuencia. Por ello, una mutación puntual se reflejará por un cambio en la conformación que, en condiciones favorables de tampón y tamaño de poro del gel, dará como resultado un cambio en la movilidad durante la electroforesis. Ya que las cadenas complementarias tienen conformaciones diferentes, los fragmentos de DNA de tipo salvaje (normal, sin cambios) aparecen como dos bandas en el gel. Una mutación puntual ocasionará la aparición de dos bandas adicionales^{25}. En la práctica, las bandas adicionales a menudo aparecen como consecuencia de conformaciones alternativas. En este estudio, la electroforesis de productos de PCR se realizó en minigeles prepolimerizados de poliacrilamida (PhastGels), utilizando el sistema de Pharmacia Phast System (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweeden).
Protocolo de SSCP: Los productos de PCR se desnaturalizaron mezclando con formamida y calentando a 80º durante 1 minuto. Las muestras se cargaron en un gel de poliacrilamida homogéneo al 20% con las tiras de tampón nativo de Phast gel que contenían L-Alanina 0,88 M, Tris 0,25 M a pH 8,8, y se migraron con el siguiente programa: prerrecorrido a 400 V, 10 mA, 2,5 W, 100 Vh; carga a 400 V, 1 mA, 2,5 W, 3 Vh; separación a 400 V, 10 mA, 2,5 W, 300 Vh. Después de la electroforesis, los geles se tiñeron con plata según las instrucciones del fabricante y por último se secaron.
Con el procedimiento descrito, cada mutación de Ki-ras en los codones 12 y 13 presentó una patrón de bandas distinto en el Phast gel. La identidad de cada mutación se había establecido previamente mediante secuenciación directa y extensión del cebador específico para la mutación (del inglés Mutation specific primer extension o MSPE, que se describe más adelante)^{26}. En este estudio, estos patrones se usaron como referencia para establecer el tipo de mutación en las muestras tumorales.
Todas las muestras procedentes de tumores se analizaron para la presencia de mutaciones en el exón 1 de Ki-ras. De aquellos pacientes cuyos tumores contenían una mutación, se analizaron a continuación las muestras de heces.
Preparación de DNA de muestras de heces
El DNA genómico de las heces se purificó mediante el equipo Quiagen para cultivos celulares (Quiagen Inc., Chatsworth CA, USA).
Se mezclaron aproximadamente 10 mg de heces con 1 ml de tampón G2. De un lavado colonoscópico se obtuvo una muestra de 500 \mul y a la que se añadió la misma cantidad de tampón G2. Este tampón lisa los núcleos y desnaturaliza todo tipo de proteínas. La mezcla de tampón de lisis de deposiciones se mezcló mediante vórtex y se clarificó por centrifugación a 13000 g durante 10 minutos a 4ºC. El sobrenadante se transfirió a continuación a un tubo nuevo, añadiéndose seguidamente 25 \mul de proteinasa K (20 mg/ml). La proteinasa digiere las proteínas desnaturalizadas en fragmentos más pequeños. A continuación se desnuda el DNA de todas sus proteínas unidas. Después de una incubación a 50ºC durante 60 minutos, los extremos de las columnas genómicas de Quiagen se colocaron en un recipiente colector de fluidos de deshecho y se equilibraron con 1 ml de tampón QBT. Luego, se aplicaron las muestras a las columnas genómicas de Quiagen equilibradas, después de lo cual se lavaron las columnas con 4x1 ml de tampón QC de lavado. Las columnas se colocaron en tubos de recogida limpios y se añadió un volumen adecuado de tampón de elución QF. El DNA se precipitó con 0,7 volúmenes de isopropanol, se mezcló manualmente, se centrifugó a 4ºC durante 10 minutos a 13000 g y el sobrenadante se eliminó cuidadosamente. El DNA se lavó con etanol al 70% y luego se resedimentó por centrifugación. Las muestras se secaron al aire durante 10 minutos y por último el sedimento se resuspendió con 50 \mul de tampón TE.
Detección de mutaciones de Ki-ras en muestras de heces
Para comprobar las mutaciones esperadas en los codones 12 ó 13 del gen Ki-ras, se utilizó la extensión de cebador específico para la mutación (MSPE), también denominada amplificación alelo-específica (ASA)^{27-30}.
El procedimiento de MSPE depende del diseño de un cebador que, en la PCR, amplificará preferentemente una secuencia respecto a otra, incluso si las secuencias difieren en sólo una base. Esto se consigue si el cebador se aparea completamente con la secuencia deseada (que contiene la mutación), pero no con la otra secuencia (que no porta la mutación), en o cerca del extremo 3'. El desapareamiento entre el molde de DNA normal (no mutado) y el oligonucleótido dará como resultado una amplificación pobre de este fragmento normal.
Se puede lograr una mayor precisión en la especificidad de MSPE si el cebador específico de la mutación se desestabiliza mediante desapareamientos deliberados adicionales cerca del extremo 3', de modo que la probabilidad de elongación (por tanto de amplificación), a pesar del desapareamiento, es todavía más reducida^{31}.
Los cebadores de desapareamiento se seleccionaron con la ayuda de un programa informático comercial (Oligo 4.0, National Biosciences, Inc., USA), incluyendo un desapareamiento adicional, a unos pocos pares de bases del extremo 3'. Todos los cebadores utilizados en este estudio fueron adquiridos comercialmente.
Para MSPE, se utilizaron procedimientos de PCR (semi)anidada y las bolitas AmpliWax Gems.
En la PCR anidada, la sensibilidad y la especificidad de la amplificación del DNA se mejoraron de forma conside-
rable^{32-34}. El proceso implica dos PCRs consecutivas. La primera PCR contiene un par de cebadores externos, mientras que la segunda contiene dos cebadores anidados que son internos al primer par de cebadores (PCR anidada), o uno de los primeros cebadores y un solo cebador anidado (semi-anidada). El fragmento mayor producido por la primera reacción se utilizó como molde para la segunda PCR.
Las bolitas PCR Ampliwax Gems (Perkin Elmer) facilita la utilización de la técnica de inicio de la PCR en caliente o "hot start". Esta técnica evita mezclar completamente los reactivos de PCR hasta que la reacción no alcance una temperatura que minimice los anillamientos inespecíficos de los cebadores con secuencias de DNA que no sean la diana. Como resultado, se incrementa la especificidad y la sensibilidad del proceso de PCR y se reduce el riesgo de dimerización de cebadores (anillamiento cebador-cebador) 35-36.
Procedimientos de PCR
En la primera tanda de PCR, se amplificaron 5 \mul de DNA disuelto en la misma mezcla de reacción que las muestras tumorales, con concentraciones de cebador de 0,2 \muM. La secuencia del cebador del extremo 5' de la secuencia fue: 5'-GGT GGA GTA TTT GAT AGT GTA TTA ACC TTA TGT-3' (R3) (Sec Id Nº1). El cebador del extremo 3' de la secuencia fue R2 (Sec Id Nº 2). Estos cebadores dieron como resultado fragmentos de 244 pb de longitud. Después de la desnaturalización durante 2 min a 94ºC, se realizó la PCR durante 16 ciclos (94ºC durante 15 s, 60ºC durante 15 s).
En cada muestra, se verificó la amplificabilidad del molde antes de realizar el MSPE.
Se reamplificó 1 \mul del producto de PCR de la primera tanda mediante PCR, utilizando los cebadores R1 (Sec Id Nº 5) y R2 (Sec Id Nº 2) (0,5 \muM), durante 40 ciclos (94ºC durante 15 s, 60ºC durante 30 s). Se analizaron alícuotas de 15 \mul mediante electroforesis en un gel de agarosa NuSieve GTG (FMC BioProducts) al 3%. Las muestras del primer ciclo que demostraron ser amplificables se sometieron a MSPE.
Se incorporaron las bolitas AmpliWax Gems y se utilizó la técnica del "hot start" en la segunda tanda de PCR. Un \mul del producto de PCR de la primera tanda de PCR se reamplificó con la combinación del cebador R3 (0,2 \muM) y el cebador de desapareamiento específico para la mutación. Los cebadores de desapareamiento tenían las secuencias siguientes:
GCT: 5'- AAG GCA CTC TTG CCT ACG CTA G-3' (R4); (SEC ID Nº 11);
GTT: 5'-AAG GCA CTC TTG CCT ACG CTA A-3' (R5) (SEC ID Nº 6);
GAT: 5'-AAG GCA CTC TTG CCT ACG CTA T-3' (R6) (SEC ID Nº 7);
GAC:5'-CGT-CAA GGC ACT CTT GCC TAC CT-3' (R7) (SEC ID Nº 9);
AGT:5'-AGG CAC TCT TGC CTA CGC TAT T-3' (R8) (SEC ID Nº 9);
TGT: 5'-GCA CTC TTG CCT ACG CCA TA-3' (R9) (SEC ID Nº 10).
Las combinaciones de R3 (Sec Id Nº 1) con los cebadores de desapareamiento rindieron productos de 143 pb (TGT) a 150 (AGT) pb. La PCR se realizó durante 40 ciclos (94ºC durante 15 s, 60ºC durante 30 s), siendo las concentraciones de cebadores de 0,2 \muM (R4, R5) (Sec Id Nº 11; Sec Id Nº 6) o 0,4 \muM (R6-R9) (Sec Id Nº 7-10). Para verificar la mutación TTT hallada en un tumor se analizó también el desapareamiento para GTT y TGT en la muestra de heces; únicamente cuando ambas series produjeron resultados positivos, se pudo concluir que en las heces se hallaban células tumorales que contenían la mutación TTT.
Como controles negativos, se utilizó DNA de heces de pacientes con tumores colorrectales sin mutación en los codones 12 y 13 de Ki-ras. Se eligieron las muestras con la mejor amplificabilidad, para minimizar la probabilidad de obtener resultados falsos positivos. Como controles positivos, se utilizó DNA de tumores en los que se había determinado el tipo de mutación Ki-ras mediante SSCP y se había confirmado mediante secuenciación. Los productos MSPE se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa NuSieve al 3%. Para designar una señal como positiva fue necesario que la señal fuera claramente más intensa que los controles negativos.
Resultados
Se elaboró una aproximación experimental en dos etapas. Se analizaron en primer lugar los tumores colorrectales por su presencia de mutaciones Ki-ras. Si éstas estaban presentes, entonces se analizaron las heces de estos pacientes. Los resultados se resumen en la Tabla 1.
TABLA 1 Características de los pacientes y tumores estudiados para las mutaciones de Ki-ras
1
\alm{1} Los tumores se clasificaron de acuerdo de acuerdo con el sistema clásico de tres estadios de Dukes de CRC (A: tumor confinado a la capa muscularis propria; B: extensión por la muscularis propria, pero confinada al colon; C: metástasis a nódulos linfáticos de la región).
\alm{2} Las muestras de heces se obtuvieron durante la colonoscopía (I) o antes de la cirugía (II). Del paciente C-01, se analizaron muestras de heces I y II.
Las mutaciones tumorales se determinaron mediante polimorfismos de conformación de cadena sencilla y electroforesis en PhastGel. Las mutaciones se determinaron en las heces mediante extensión con un cebador específico para la mutación.
Se analizó el DNA genómico de 27 tumores para la presencia de mutaciones en los codones 12 y 13 del gen Ki-ras mediante la técnica de PCR-SSCP. Tanto la electroforesis en geles de poliacrilamida y la tinción con plata se realizaron utilizando el sistema PhastSystem. Los patrones de bandas se muestran en la Figura 2.
Se detectaron mutaciones puntuales en 13 muestras de tumores (48%), que se habían obtenido de 12 pacientes (4 del grupo A, 8 del grupo B). Las mutaciones se detectaron en 4 de 12 adenomas (33%, todos del tipo velloso) y 9 de 15 carcinomas (60%). La mayoría de las mutaciones se localizaron en el colon sigmoide y el recto.
De los 15 pacientes mujeres que entraron en el estudio, 8 (53%) presentaron una mutación en ki-ras, mientras que sólo 4 de 10 hombres (40%) estaban afectados. En un paciente (C-05), se halló que las muestras obtenidas de dos adenomas distintos contenían mutaciones distintas.
El espectro de mutación de los tumores se muestra en la Figura 3. La mutación más frecuente fue el cambio GGT a GAT (glicina a ácido aspártico) en el codón 12, que se observó en 5 casos. Las otras mutaciones que se hallaron en el mismo codón fueron: el cambio de GGT a GTT (glicina a valina, 3 casos), GGT a GCT (glicina a alanina, 2 casos) y GGT a AGT (glicina a serina, 1 caso). Se halló 1 caso de una mutación en el codón 13, concretamente GGC a GAC (glicina a ácido aspártico).
Un tumor (C-05, adenoma 1) produjo un patrón de bandas inusual que se asemeja a un patrón asociado anteriormente con una mutación doble en el codón 12 (GGT a TTTT). El análisis de secuencia del producto de PCR confirmó esta doble mutación (Figura 4).
Se analizaron las muestras de heces de 12 pacientes cuyos tumores contenían una mutación. Un paciente del grupo A, (C-01), fue operado poco después de la colonoscopia, por lo que se obtuvo una muestra pre-quirúrgica además de la muestra colonoscópica.
Después de la purificación de DNA de las heces, se amplificó el exón 1 de Ki-ras mediante PCR. Pronto fue evidente que las muestras de colonoscopia contenían más DNA humano que las muestras de pre-cirugía. El efecto mecánico de un líquido de lavado alrededor del tumor durante la colonoscopia provocó, aparentemente, la liberación de células en el lumen. En consecuencia, la cantidad total de células y de la fracción de células derivadas del tumor fue en general superior en las muestras obtenidas durante la colonoscopía.
Una PCR de una sola etapa con 40 ciclos, que es normalmente suficiente para cualquier cantidad de material de inicio, fue aparentemente insuficiente para algunas de las muestras de heces, posiblemente debido a los "factores de inhibición" en las heces. Se esperó aumentar la eficiencia de la PCR diluyendo estos factores al realizar la PCR anidada. Ello también incrementaría la cantidad de molde para MSPE.
Con esta estrategia de PCR en dos etapas, todas las muestras de heces de ambos grupos, A y B, demostraron ser amplificables y en consecuencia adecuadas para MSPE. El molde para MSPE fue 1 \mul del producto de PCR procedente de la primera tanda de PCR. Se incorporaron las bolitas AmpliWax Gems y se introdujo la técnica de inicio en caliente. Se incluyeron también controles negativos y positivos.
De este modo, se confirmaron las mutaciones halladas en los tumores respectivos, en las 4 muestras de las heces del grupo A. En las muestras de heces obtenidas del grupo B (más el caso C-01), se identificó la mutación en 5 de 9 casos. Los tumores proximales al igual que los distales (paciente C-08, colon ascendente) dieron resultados positivos. Se detectaron cuatro tipos de mutaciones distintas: GCT, GTT, GAT y GAC.
Para resultados óptimos, la concentración de los cebadores específicos de las mutaciones han de ser ajustadas a valores dentro del intervalo de 0,2 a 0,4 \muM.
Los resultados representativos de la detección de las mutaciones de Ki-ras en las heces con MSPE se muestran en la Figura 5.
Discusión
En este estudio se investigó la posibilidad de detectar mutaciones de Ki-ras en las heces de pacientes con tumores colorrectales. En 27 tumores (12 adenomas y 15 carcinomas), se hallaron mutaciones de Ki-ras en 13 tumores: 4 en adenomas (33%) y en 9 carcinomas (60%). Estas frecuencias están de acuerdo con los informes iniciales^{4,5}. Este resultado confirma el papel potencial de las mutaciones de Ki-ras como un marcador relativamente temprano de la neoplasia colorrectal.
Recientemente, se ha observado que las mujeres tienen una mayor prevalencia de mutaciones de Ki-ras en el cáncer colorrectal que los hombres^{8}. Se ha propuesto que esta diferencia está relacionada con el tiempo de contacto con, y la concentración de, los carcinógenos determinados en las heces. Se ha publicado que la prevalencia del tiempo de tránsito en el intestino como del estreñimiento son superiores en las mujeres^{38}. Un reflejo de esta diferencia entre sexos es visible en presente material, en donde en el 53% de los tumores en mujeres y en el 40% de los tumores en hombres se halló que presentaban una mutación.
También se halló que la mayoría de mutaciones (12 de 14, considerando TTT como dos mutaciones) tienen lugar en la posición 2 de los codones 12 y 13. Esto también se había observado con anterioridad^{2,3,6}.
Aunque el número de tumores investigados en este estudio es pequeño, la frecuencia total de las tres mutaciones, que se cree son las más comunes (CAC, GAT y GTT) es sorprendentemente cercana a la frecuencia hallada en series mayores^{7,8}.
Algunas mutaciones puntuales se han asociado con localizaciones anatómicas distintas^{40}. En este sentido, los presentes resultados con la mutación GCT están de acuerdo con la observación de que dicha mutación parece estar restringida al recto.
La correlación de ciertos tipos de mutaciones de Ki-ras con el estadio clínico, como la reciente descripción de que la mutación GAT está restringida a los tumores de estadio B de Dukes^{9}, no pudo ponerse en evidencia en el material procedente de los pacientes de este estudio. De hecho, de los cinco tumores con una mutación GAT, dos se clasificaron como Dukes C.
Se analizaron muestras de heces de 12 pacientes (de un paciente, se analizó una muestra colonoscópica y una pre-quirúrgica), cuyos tumores presentaban una mutación de Ki-ras. No fue posible identificar la mutación de Ki-ras correspondiente en 9 de 13 muestras de deposiciones (4 colonoscópicas y 9 pre-quirúrgicas). La identificación se logró en las 4 muestras colonoscópicas y en 5 de las 9muestras pre-quirúrgicas. Únicamente las últimas muestras son de valor diagnóstico. Las muestras colonoscópicas proporcionaron información valiosa para la evaluación del procedimiento.
Aunque se demostró la amplificabilidad de todas las muestras de heces, el MSPE no dio resultados positivos en cada muestra. Como posible explicación, se podrían enunciar diversos problemas. En primer lugar, tal como se mencionó en un principio, seguramente las muestras de heces difieren en gran manera con respecto al contenido total de células de la mucosa y de la fracción de células derivadas del tumor. En segundo lugar, la purificación de células humanas a partir de las heces se ve impedida por la presencia de células bacterianas. Otro problema hace referencia a que las células humanas están sometidas a una concentración relativamente elevada de enzimas degradantes en las heces. Además, se ha hallado que las heces contienen ciertos inhibidores que interfieren con la amplificación del DNA en la PCR^{1}. Al unir DNA a una resina de intercambio iónico (p.ej., Quiagen, utilizado en este estudio), estos inhibidores podrían eliminarse, por lo menos en parte.
El procedimiento MSPE como tal parece muy adecuado para la detección de mutaciones de Ki-ras en las heces. El análisis de muestras de heces ha de detectar las secuencias mutadas de ki-ras derivadas de las células tumorales entre una abundancia de ki-ras de tipo salvaje de células normales. Los experimentos para establecer la sensibilidad del procedimiento demostraron que el MSPE podía detectar por lo menos el 0,01% de células mutadas en una población de células heterogénea (resultados no publicados). Otra característica de MSPE es que el procedimiento es relativamente insensible a la contaminación pre-PCR "portada por el aire" (p.ej., DNA humano liberado por el pelo, la piel, etc.).
Se necesitan otros estudios para mejorar la eficiencia del procedimiento, por ejemplo intentar equilibrar la cantidad inicial de molde para el MSPE. Experimentos recientes en nuestro laboratorio indican que esto puede lograrse con el ajuste de una PCR de tres tandas. Otra mejora puede realizarse mediante "enriquecimiento" de la muestra con células mutantes antes del análisis, por ejemplo mediante purificación preferencial de las células mutantes respecto a las células de tipo salvaje.
El rastreo de diversas mutaciones en un análisis podría ser posible utilizando varios cebadores simultáneamente. También sería valiosa la investigación adicional del ensayo denominado "PCR multiplex". Por último, sería necesario realizar una evaluación posterior de una aplicación posible de la técnica en un análisis de rastreo. Dicho análisis, probablemente con una elevada especificidad, podría proporcionar un valor de predicción positivo, superando los de detección de sangre en heces.
Recientemente, las mutaciones de Ki-ras también se han identificado en heces de pacientes con adenocarcinomas pancreáticos y en sus presuntas lesiones precursoras^{39}. Este hallazgo amplía aún más el intervalo potencial de análisis de Ki-ras en heces. Por lo tanto, la detección de Ki-ras en las heces podría ser una estrategia de rastreo rápido y no invasivo, no sólo para la detección precoz de cánceres colorrectales sino también para otros procesos malignos gastrointestinales y pancreáticos.
Ejemplo 3 Análisis del oncogen Ki-ras en el diagnóstico preciso de lesiones malignas en el páncreas
La activación del oncogen Ki-ras mediante mutaciones puntuales específicas en el codón 12 sucede una frecuencia muy marcada en los adenocarcinomas ductales del páncreas y es probablemente un suceso importante en la patogénesis de este cáncer. Las mutaciones del oncogen Ki-ras son también detectables en el jugo pancreático de pacientes con lesiones malignas. Esta activación específica de un gen puede ayudar, en consecuencia, en el diagnóstico de cánceres pancreáticos, en el diagnóstico diferencial contra la pancreatitis crónica y también para separar la enfermedad quística benigna de la maligna del páncreas.
En la presente invención, se ha desarrollado un ensayo de SSCP no-radioactivo y rápido para la detección e identificación de mutaciones de Ki-ras con un límite de sensibilidad de 0,02 (células con un alelo mutado/células normales). Dicha técnica se aplicó a diversas muestras procedentes de 30 pacientes, que habían sido operados de una lesión maligna del páncreas. Los 30 pacientes presentaban una mutación en el codón 12 en el tumor. El jugo pancreático que se recogió de 12 pacientes mostró la presencia de mutación en 9 casos. Tres pacientes con enfermedades quísticas que se clasificaron originalmente como no-malignas, presentaron mutación en Ki-ras en el fluido quístico y en las biopsias de las paredes quísticas, confirmándose la histología maligna después de la operación. El fluido del peritoneo, recogido en tres pacientes, mostró la presencia de la misma mutación que la hallada en el tumor.
La presencia de mutaciones GAT y GTT parece estar asociada con un mejor pronóstico post-operatorio que la presencia de las otras mutaciones. Se concluye que el análisis para mutaciones de Ki-ras en lesiones pancreáticas puede ayudar tanto al diagnóstico como al pronóstico y puede conducir a un diagnóstico precoz para esta enfermedad devastadora cuya única esperanza de supervivencia es el diagnóstico precoz y la cirugía radical.
Ejemplo 4 Asociación de mutaciones específicas del gen Ki-ras con la supervivencia de pacientes en adenocarcinomas pancreáticos
Se sabe que los adenocarcinomas pancreáticos tienen una elevada incidencia de mutaciones del gen Ki-ras. En el presente estudio, se examinó material tumoral fijado en formalina e incluido en parafina procedente de 73 pacientes con adenocarcinomas primarios para la presencia de mutaciones puntuales activadoras en el exón 1 de Ki-ras, utilizando el procedimiento de los polimorfismos de conformación de cadena sencilla. Cuarenta y nueve (72%) de los 68 carcinomas, que se amplificaron con éxito, presentaron una o varias mutaciones puntuales.
El análisis de supervivencia no mostró una correlación entre la ausencia o la presencia de una mutación de Ki-ras y la supervivencia del paciente y tampoco se observaron diferencias entre los casos con una o varias mutaciones. Sin embargo, la presencia de dos mutaciones específicas (tripletes GTT y GAT en el codón 12), se asoció significativamente con una mejor supervivencia del paciente cuando se comparó con todos los otros tipos de mutaciones o con la ausencia de mutación (p = 0,0038). En un análisis de multivarianza de la supervivencia (procedimiento de Cox), atendiendo a la edad del paciente en el momento del diagnóstico, el diámetro del tumor y la localización del tumor, el tipo de mutación de Ki-ras mostró una importancia de pronóstico fuerte e independiente (p = 0,03).
En consecuencia, la presencia de mutaciones GTT y GAT en el exón 1 de Ki-ras define un subgrupo de pacientes con adenocarcinomas pancreáticos en los que el pronóstico se mejora significativamente. El análisis molecular de Ki-ras podría ser un marcador de gran ayuda para seleccionar pacientes que probablemente sacarán mayor provecho de un tratamiento de cirugía extensiva.
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Claims (9)

1. Procedimiento para la detección de mutaciones de Ki-ras en los codones 12 a 13 del exón 1 en muestras de tejido, tejido tumoral, secreciones tisulares, excreciones, expectoraciones, en donde el procedimiento comprende:
(a) purificar y separar el DNA de la muestra:
(b) llevar a cabo por lo menos una amplificación de PCR utilizando un cebador oligonucleótido flanqueante en el extremo 5' de la secuencia, 5'-AAC CTT ATG TGT GAC ATG TTC TAA T-3' (R1) (Sec Id Nº5), y un cebador oligonucleotídico flanqueante en el extremo 3' de la secuencia, 5'-AAT GGT CCT GCA CCA GTA AT-3' (R2) (Sec Id Nº 2), para producir un producto de PCR específico que comprende las mutaciones; y
(c) llevar a cabo una etapa de identificación que comprende un SSCP en Phast Gel®, en donde como resultado de la utilización de una combinación específica de cebadores oligonucleotídicos para la amplificación por PCR la detección directa de las mutaciones se realiza mediante el análisis de bandas en el Phast Gel®.
2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque entre la etapa (a) y la (b) se realiza otra amplificación por PCR utilizando el cebador oligonucleotídico flanqueante en el extremo 5' de la secuencia 5'-GGT GGA GTA TTT GAT AGT GTA TTA ACC TTA TGT-3' (R3) (Sec Id Nº 1) y el cebador oligonucleotídico flanqueante en el extremo 3' de la secuencia 5'-AAT GGT GCA CCA GTA AT-3' (R2) (Sec Id Nº 2).
3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que además comprende una etapa de amplificación específica por PCR que se lleva a cabo después de la etapa (b), utilizando un cebador oligonucleotídico 5'-GGT GGA GTA TTT GAT AGT GTA TTA ACC TTA TGT-3' (R3) (Sec Id Nº 1) en combinación con por lo menos un cebador de desapareamiento específico para la mutación seleccionado a partir de:
GCT: 5'-AAG GCA CTC TTG CCT ACG CTA G-3' (R4) (Sec Id. Nº 11); GTT: 5'-AAG GCA CTC TTG CCT ACG CTA A-3' (R5) (Sec Id. Nº 6); GAT: 5'- AAG GCA CTC TTG CCT ACG CTA T-3' (R6) (Sec Id Nº 7); GAC: 5'-CGT CAA GGC ACT CCT GCC TAC CT-3' (R7) (Sec Id. Nº 8); AGT: 5'-AGG CAC TCT TGC CTA CGC TAT T-3' (R8) (Sec Id Nº 9); TGT: 5'- GCA CTC TTG CCT ACG CCA TA-3' (R9) (Sec Id. 10).
4. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la muestra se obtiene del colon, el recto, los pulmones y el páncreas.
5. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las muestras utilizadas en el procedimiento son frescas, están congeladas o embebidas en parafina.
6. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la muestra comprende deposiciones, jugo pancreático, fluido quístico del páncreas, biopsias del colon y del recto.
7. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la cantidad de deposiciones utilizada como material de partida en el procedimiento está dentro de un intervalo de 5-100 mg, preferentemente 10 mg.
8. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la cantidad de tejido tumoral utilizado como material de partida en el procedimiento está en un intervalo de 2-50 mg, preferentemente 25 mg.
9. Equipo para la realización de un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque contiene productos químicos para realizar las reacciones de PCR, un cebador oligonucleotídico que tiene la secuencia 5'-AAC CTT ATG TGT GAC ATG TTC TAA T-3' (R1) (Sec Id Nº 5), un cebador oligonucleotídico que tiene la secuencia 5'-AAT GGT CCT GCA CCA GTA AT-3' (R2) (Sec Id Nº 2) y los geles y sistemas de detección adecuados para analizar los productos de PCR.
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