ES2209196T3

ES2209196T3 - Analogos opticamente puros de la camptotecina, producto intermedio de sintesis opticamente puro y su procedimiento de preparacion.

Info

Publication number: ES2209196T3
Application number: ES98941567T
Authority: ES
Inventors: Jean-Bernard Cazaux; Olivier Lavergne; Christine Le Breton; Eric Manginot; Dennis Bigg
Original assignee: Societe de Conseils de Recherches et dApplications Scientifiques SCRAS SAS
Current assignee: Ipsen Pharma SAS
Priority date: 1997-08-29
Filing date: 1998-08-07
Publication date: 2004-06-16
Anticipated expiration: 2018-08-07
Also published as: ATE253069T1; JP2001514261A; CN1440973A; AR016856A1; NZ502862A; NO20000995D0; AU8989698A; HK1031732A1; PL338835A1; CA2301739A1; CN1440972A; IL134437A0; EP1007527B1; BR9811405A; DE69819340T2; AU760863B2; NO20000995L; EP1378512A1; HUP0003429A1; HK1058665A1

Abstract

Análogos ópticamente puros de la camptotecina, producto intermedio de síntesis ópticamente puro y su procedimiento de preparación. Los compuestos de la invención poseen una actividad antitumoral. Se pueden utilizar para el tratamiento de los tumores, por ejemplo de los tumores que expresan una topoisomerasa, en un paciente por administración a este último de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula (II) o de una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de fórmula (II), o también de una mezcla cualquiera de estos últimos. Los ejemplos de tumores o de cánceres comprenden los cánceres de esófago, de estómago, de intestinos, de recto, de cavidad oral, de faringe, de laringe, de pulmón, de colón, de mama, de cérvix uteri, de corpus endometrio, de ovarios, de próstata, de testículos, de vejiga, de riñones, de hígado, de páncreas, de huesos, de tejidos conjuntivos, de piel, de ojos, de cerebro y de sistema nervioso central, así como el cáncer de tiroides, la leucemia,la enfermedad de Hodgkin, las linfomas distintas de las de Hodgkin, las mielomas múltiples entre otros.

Description

Análogos ópticamente puros de la camptotecina, producto intermedio de síntesis ópticamente puro y su procedimiento de preparación.

La camptotecina es un compuesto natural que se aisló por primera vez de las hojas y de la corteza de la planta china denominada camptothecia acuminata (véase Wall y sus colaboradores, J. Amer. Chem. Soc. 88: 3888 (1966)). La camptotecina es un compuesto pentacíclico constituido de un fragmento de indolizina-[1,2-b]-quinolina (ciclos A, B, C y D) fusionado con una \alpha-hidroxilactona de seis eslabones. El carbono en posición 20, que lleva el grupo \alpha-hidroxi, es asimétrico y confiere a la molécula un poder rotativo. La forma natural de la camptotecina posee la configuración absoluta "S" en el carbono 20 y responde a la fórmula siguiente:

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La camptotecina presenta una actividad antiproliferativa en varias razas celulares cancerosas, que comprenden las razas celulares de tumores humanos del colón, del pulmón y de mama (Suffness, M. y colaboradores: The Alkaloids Chemistry and Pharmacology, Bross, A., ed., Vol. 25, pág. 73 (Academic Press, 1985)). Se sugiere que la actividad antiproliferativa de la camptotecina esté en relación con su actividad inhibidora del topoisomerasa I del ADN.

Por otra parte, se indicó que la \alpha-hidroxilactona era una exigencia absoluta a la vez para la actividad in vivo e in vitro de la camptotecina (Camptothecins: New Anticancer Agents, Putmesil, M., y sus colaboradores, ed., pág. 27 (CRC Press, 1995); Wall, M. y sus colaboradores, Cancer Res. 55: 753 (1995); Hertzberg y sus colaboradores, J. Med. Chem. 32: 715 (1982) y Crow y sus colaboradores; J. Med. Chem. 35: 4160 (1992)). Más recientemente, la firma solicitante puso a punto una nueva clase de productos análogos de la camptotecina (véase solicitud de patente internacional WO-97/00876), en los cuales una \beta-hidroxilactona sustituye a \alpha-hidroxilactona natural de la camptotecina o de sus derivados tal como se describen en la patente de EE.UU. 5.459.269.

La invención tiene por objeto un nuevo procedimiento de preparación de un producto intermedio de síntesis enantioméricamente puro, así como nuevos compuestos análogos enantioméricamente puros de la camptotecina.

Por lo tanto, la invención tiene en primer lugar por objeto nuevos compuestos análogos de la camptotecina que difieren de cualquier otro compuesto conocido, caracterizados porque tienen la fórmula (II) que se representa a continuación:

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o porque se trata de sales del compuesto de fórmula (II) tal como, por ejemplo, el de fórmula (III) que se representa a continuación:

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Un producto intermedio clave en la síntesis de este tipo de compuestos ópticamente puros es un producto de fórmula general M anteriormente representada:

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en la cual R representa un radical alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 10 átomos de carbono. Preferentemente, R representa un radical etilo.

El compuesto de fórmula (II) se puede preparar de la siguiente forma:

- se acopla el compuesto de fórmula:

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con un compuesto de fórmula N_{2} que se representa a continuación:

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para dar el compuesto de fórmula 0_{2:}

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la ciclización del compuesto 0_{2} da el compuesto de fórmula (II), el cual puede, después de la salificación, dar el compuesto de fórmula (III).

La formación del compuesto 0_{2} a partir del compuesto de fórmula general M para el cual R representa un radical etilo y N_{2} se efectúa mediante un tratamiento conocido por el experto en la técnica bajo el nombre de reacción de Mitsunobu (se refiere a Mitsunobu, O. y coll. Synthesis, pág. 1 (1981)). Se trata de desplazar la función hidroxilo del compuesto N por un nucleófilo tal como el compuesto M, o un derivado desprotonado de este último, por un tratamiento con una fosfina, por ejemplo, la trifenilfosfina, y un derivado azodicarboxilato, por ejemplo el azodicarboxilato de dietilo o de diisopropilo, en un disolvente aprótico tal como, por ejemplo, el tetrahidrofurano o la N,N-dimetilformamida. La ciclización del compuesto 0_{2} para dar el compuesto de fórmula (II) se efectúa preferentemente en presencia de un catalizador paladiado (por ejemplo el diacetato de paladio) en condiciones básicas (proporcionadas por ejemplo por un acetato alcalino eventualmente combinado con un agente de transferencia de fase tal como por ejemplo el bromuro de tetrabutilamonio), en un disolvente aprótico tal como el acetonitrilo o la N,N-dimetilformamida, a temperatura comprendida entre 50ºC y 120ºC (R. Grigg y coll., Tetrahedron 46, página 4003 (1990)).

Igualmente, la invención ofrece un compuesto de fórmula general M tal como se define anteriormente. Este producto se puede utilizar para la fabricación de medicamentos.

El compuesto de fórmula M se sintetiza según un nuevo procedimiento que forma parte de la invención y está constituido por las etapas sucesivas siguientes:

-: el éster t-butílico racémico que se representa a continuación:

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(para su preparación, se refiere, en particular, a la solicitud de patente internacional WO97/00876) se trata con ácido trifluoracético durante 18 h a temperatura ambiente para dar el ácido carboxílico correspondiente;

-: se calienta en alcohol isopropílico la sal de quinidina del ácido 3-(3-benciloximetil-2-metoxi-4-piridil)-3-hidroxi-pentanoico a una temperatura superior a 30ºC, y preferentemente a aproximadamente 50ºC, antes de dejar enfriar el medio de reacción hasta la temperatura ambiente, de tal manera que la sal del enantiómero (+) del ácido 3-(3-benciloximetil-2-metoxi-4-piridil)-3-hidroxi-pentanoico cristalice mientras que la sal del isómero (-), cuyo anión está representado a continuación, permanece en solución:

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-: la solución en el alcohol isopropílico de la sal del enantiómero (-) del ácido 3-(3-benciloximetil-2-metoxi-4-piridil)-3-hidroxi-pentanoico se concentra y, se trata con ácido clorhídrico y se agita, para dar el compuesto de fórmula A' que se representa a continuación:

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-: a continuación, el compuesto A' se pone en contacto con paladio sobre carbón húmedo, luego se añade a la mezcla formiato de amonio o el ácido fórmico para dar el producto desbencilado B' que se representa a continuación:

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-: a continuación, se cicliza el compuesto de fórmula B' por la acción de diciclohexilcarbodiimida para obtener el compuesto lactónico de fórmula C' que se representa a continuación:

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-: finalmente, se transforma el grupo -OCH_{3} del compuesto lactónico de fórmula C' en carbonilo, por la acción de yoduro de sodio y cloruro de trimetilsililo, para obtener la (+)-5-etil-5-hidroxi-1,3,4,5,8,9-hexahidro-oxepino-[3,4-c]-piridina-3,9-diona (o (+)-EHHOPD) que se representa a continuación:

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Se puede obtener el compuesto de fórmula N_{2} según el siguiente procedimiento: la anilina de fórmula P_{2} que se representa a continuación:

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se orto-acila por reacción con el cloroacetonitrilo en presencia de tricloruro de boro y de otro ácido de Lewis tal como el tricloruro de aluminio, el tetracloruro de titanio o el cloruro de dietilaluminio en un disolvente aprótico o una mezcla de disolvente aprótico, seguida de una hidrólisis (véase Sugasawa, T y coll. J. Am. Chem. Soc. 100, pág. 4842, 1978)). A continuación, el producto intermedio así obtenido se trata con cloruro de etilmalonilo en un disolvente aprótico tal como el acetonitrilo en presencia de una base como la trietilamina, luego se trata con un alcoholato alcalino, por ejemplo metilato de sodio en metanol, para dar 7-cloro-4-clorometil-6-metil-2-oxo-1,2-dihidro-3-quinolina-carboxilato de etilo. Este último se transforma en 2,7-dicloro-4-clorometil-6-metil-3-quinolinacarboxilato de etilo mediante un tratamiento con oxicloruro de fosforilo. A continuación, se efectúa una sustitución nucleófila por tratamiento con 4-metilpiperidina. A continuación, la función carboxilato de etilo se reduce con el hidruro de diisobutilo de aluminio en un disolvente aprótico tal como el diclorometano para dar el compuesto de fórmula N_{2}. Se puede eventualmente invertir el orden de las dos últimas etapas.

Se describieron compuestos intermedios análogos al compuesto N_{2} en la literatura y en particular en la solicitud de patente internacional vía PCT 95/05427.

El compuesto de fórmula (II) se puede transformar en sal farmacéuticamente aceptable según los métodos usuales. Sales aceptables incluyen, a título de ejemplo y de manera no limitativa, sales de adición de ácidos inorgánicos tales como clorhidrato, sulfato, fosfato, difosfato, bromohidrato y nitrato o sales de ácidos orgánicos tales como acetato, maleato, fumarato, tartrato, succinato, citrato, lactato, metanosulfonato, p-toluenosulfonato, pamoato, salicilato, oxalato y estearato. Para otros ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables, se puede referir a "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66: 1 (1977).

Los compuestos de la presente invención poseen interesantes propiedades farmacológicas. Es así que los compuestos de la presente invención tienen una actividad inhibidora de la topoisomerasa I y II y una actividad antitumoral. El estado de la técnica sugiere que los compuestos de la invención presenten una actividad antiparasitaria y/o antiviral. Los compuestos de la presente invención se pueden así utilizar en distintas aplicaciones terapeúticas.

A continuación se encontrará, en la parte experimental, una ilustración de las propiedades farmacológicas de los compuestos de la invención.

Los compuestos pueden inhibir la topoisomerasa, por ejemplo de tipo I y II, en un paciente, por ejemplo un mamífero tal como el hombre, por administración a este paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula (I) o de fórmula (II), o de una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de fórmula (II), o también de una mezcla cualquiera de estos últimos.

Los compuestos de la invención poseen una actividad antitumoral. Se pueden utilizar para el tratamiento de los tumores, por ejemplo de los tumores que expresan una topoisomerasa, en un paciente por administración a este último de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula (II) o de una sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de fórmula (II), o también de una mezcla cualquiera de estos últimos. Los ejemplos de tumores o de cánceres comprenden los cánceres de esófago, de estómago, de intestinos, de recto, de cavidad oral, de faringe, de laringe, de pulmón, de colón, de mama, de cérvix uteri, de corpus endometrio, de ovarios, de próstata, de testículos, de vejiga, de riñones, de hígado, de páncreas, de huesos, de tejidos conjuntivos, de piel, de ojos, de cerebro y de sistema nervioso central, así como el cáncer de tiroides, la leucemia, la enfermedad de Hodgkin, las linfomas distintas de las de Hodgkin, las mielomas múltiples entre otros.

Igualmente, se pueden utilizar para el tratamiento de las infecciones parasíticas por la inhibición de los hemoflagelasos (por ejemplo en la tripanosomia o las infecciones leiskmania) o por inhibición del plasmodio (tal como, por ejemplo, en la malaria), pero también para el tratamiento de las infecciones o enfermedades víricas.

Estas propiedades hacen de los productos de fórmula (II) que sean aptos para una utilización farmacéutica. La presente solicitud tiene igualmente por objeto, como medicamentos, los productos de fórmula (II) tal como se definen anteriormente, así como las sales de adición con los ácidos minerales u orgánicos farmacéuticamente aceptables de dichos productos de fórmula (II), tal como por ejemplo la sal de fórmula (III) anteriormente descrita o también una mezcla cualquiera de estos últimos. La invención se refiere incluso a las composiciones farmacéuticas que contienen, como principio activo, uno al menos de los medicamentos tal como se definen anteriormente.

Así, la invención se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen un compuesto de la invención o una sal aditiva de ácido farmacéuticamente aceptable de éste, en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable siguiendo el modo de administración elegido (por ejemplo oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, trans-dérmico o subcutánea). La composición farmacéutica (por ejemplo terapéutica) puede ser en forma sólida, líquida, de liposomas o de micelas lipídicas.

La composición farmacéutica puede ser en forma sólida tal como, por ejemplo, en forma de polvos, píldoras, gránulos, comprimidos, liposomas, cápsulas de gelatina o supositorios. La píldora, el comprimido o la cápsula de gelatina se pueden revestir de una sustancia capaz de proteger la composición de la acción del ácido gástrico o de las enzimas en el estómago del sujeto durante un período de tiempo suficiente para permitir a esta composición pasar sin ser digerida en el intestino delgado de este último. También, el compuesto se puede administrar localmente, por ejemplo en el mismo sitio del tumor. También, el compuesto se puede administrar según el proceso de liberación prolongada (por ejemplo una composición de liberación prolongada o una bomba de infusión). Los vehículos sólidos apropiados pueden ser, por ejemplo, el fosfato de calcio, el estearato de magnesio, el carbonato de magnesio, el talco, los azúcares, la lactosa, la dextrina, el almidón, la gelatina, la celulosa, la celulosa de metilo, la celulosa carboximetilo de sodio, la polivinilpirrolidina y la cera. Las composiciones farmacéuticas que contienen un compuesto de la invención se pueden, por lo tanto, presentar igualmente en forma de líquido tal como, por ejemplo, de soluciones, de emulsiones, de suspensiones o de una formulación de liberación prolongada. Los vehículos líquidos convenientes pueden ser, por ejemplo, el agua, los disolventes orgánicos tal como el glicerol o los glicoles tal como el polietilenglicol, asimismo como sus mezclas, en proporciones variadas, en agua.

Igualmente, la invención tiene por objeto la utilización del producto de fórmula (II) tal como se define anteriormente, o de las sales de adición con los ácidos mineral u orgánicos farmacéuticamente aceptables del producto de fórmula (II), como por ejemplo la sal de fórmula (III) anteriormente descrita, o también de una mezcla de estos últimos, para la preparación de medicamentos destinados inhibir las topoisomerasas, y más particularmente las topoisomerasas de tipo I o de tipo II, de medicamentos destinados a tratar los tumores, de medicamentos destinados a tratar las infecciones parásitas, así como de medicamentos destinados a tratar las infecciones o enfermedades víricas.

La dosis de un compuesto según la presente invención, que hay que prever para el tratamiento de las enfermedades o de los trastornos anteriormente mencionados, varía según el modo de administración, la edad y el peso corporal del sujeto que se debe tratar así como del estado de este último, y se decidirá en definitiva por el médico o el veterinario que le trata. Dicha cantidad determinada por el médico o el veterinario que le trata se denomina aquí "cantidad terapéuticamente eficaz".

A menos que estén definidos otras maneras, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado que el corrientemente comprendido por un especialista ordinario del campo al cual pertenece esta invención. Del mismo modo, todas las publicaciones, solicitudes de patentes, todas las patentes y todas las referencias mencionadas aquí se incorporan como referencia.

Los ejemplos siguientes se presentan para ilustrar los procedimientos anteriormente citados y no deben en ningún caso ser considerados como un límite del alcance de la invención.

Parte experimental Ejemplo 1 (+)-5-etil-5-hidroxi-1,3,4,5,8,9-hexahidro-oxepino-[3,4-c]-piridina-3,9-d-[(+)-EHHOPD] 1.a. Sal de quinidina del ácido 3-(3-benciloximetil-2-metoxi-4-piridil)-3-hidroxi-pentanoico

Se trata 3-(3-benciloximetil-2-metoxi-4-piridil)-3-hidroxi-pentanoato de terciobutilo (40 g; 100 mmoles) con ácido trifluor-acético (150 ml) y se agita el medio de la reacción durante 18 h a 20ºC. Después de la evaporación del ácido trifluor-acético, se vierte cloruro de metileno (200 ml) y se introduce una solución saturada de bicarbonato de sodio hasta pH = 7,5-8. Después de la decantación, se lava la fase acuosa con 100 ml de cloruro de metileno. Entonces, se lleva el pH de la fase acuosa a 1 por adición de una solución de ácido clorhídrico 6N. A continuación, se extrae el producto de la fase acuosa con cloruro de metileno (2 veces 200 ml). Se seca la solución sobre sulfato de magnesio y se concentra. El ácido 3-(3-benciloximetil-2-metoxi-4-piridil)-3-hidroxi-pentanoico (31,1 g; 90 mmoles) así obtenido, se recoge con alcohol isopropílico (30 ml), se trata con una solución de quinidina (29,2 g; 90 mmoles) en alcohol isopropílico (30 ml) a 50ºC bajo agitación hasta disolución completa. Entonces, se deja que la temperatura vuelva a bajar hasta 40ºC, la agitación se detiene y se deja evolucionar la temperatura hasta 20ºC. Se lleva el medio de la reacción a 0ºC sin agitación luego se mantiene a esta temperatura durante 16 horas. A continuación, se deja la temperatura subir de nuevo hasta 20ºC y se agita hasta la cristalización. Se diluye el medio con alcohol isopropílico y luego se filtra. Se aclara el precipitado con alcohol isopropílico. Se precipita la sal del enantiómero (+) (m = 26,6 g) mientras que la sal del enantiómero (-) permanece en solución en el alcohol isopropílico. Por lo tanto, se recoge el filtrado que se concentra para dar un aceite (34 g) que se introduce sin otra purificación en la etapa siguiente.

Se analizan los productos por HPLC sobre columna tipo CHIRAL AGP 5\mu (10 cm x 4 mm) eluida por una mezcla de alcohol isopropílico/agua/tampón de fosfato, a pH = 6,5: 30/920/50, con un caudal de 1,2 ml/min, detección UV a 280 nm. Los tiempos de retención obtenidos son de 6,4 minutos para el enantiómero (-) y de 2,8 minutos para el enantiómero (+). La relación enantiómero (-)/enantiómero (+) es de 83/17.

1.b. Ácido (-)-3-(3-benciloximetil-2-metoxi-4-piridil)-3-hidroxipentanoico

Se concentra la solución en el alcohol isopropílico de la sal de quinidina del enantiómero (-) del ácido 3-(3-benciloximetil-2-metoxi-4-piridil)-3-hidroxi-pentanoico (etapa 1.a). El concentrado se recupera con 270 ml de cloruro de metileno y 270 ml de una solución de ácido clorhídrico 1N. Se agita el medio de la reacción durante 16 horas a 20ºC. Después de la decantación, se concentra la fase orgánica, se recupera el concentrado con metanol para ser introducido en la fase siguiente.

Se obtienen 13,5 g de producto (rendimiento del 87%) y una proporción enantiómero (-)/enantiómero (+) de 85/15.

los tiempos de retención HPLC (utilizando el mismo protocolo que en 1.a.) son:

- enantiómero (-): 6,4 minutos

- enantiómero (+): 2,8 minutas

1.c. (+)-5-etil-5-hidroxi-1,3,4,5,8,9-hexahidro-oxepino-[3,4-c]-piridina-3,9-diona

Se pone en solución el ácido (-)-3-(3-benciloximetil-2-metoxi-4-piridil)-3-hidroxi-pentanoico (13,5 g; 39 mmoles; etapa 1.b) en 87 ml de metanol. Se vierte esta solución bajo una atmósfera de nitrógeno sobre paladio a 10% sobre carbón húmedo a 50% (27,7 g; 13 mmoles). Se agita el medio de la reacción durante 5 minutos, luego se vierte una solución de formiato de amonio (11,5 g; 183 mmoles) en 135 ml de metanol. Se agita el medio de la reacción durante 30 minutos dejando la temperatura evolucionar, luego se calienta a 40ºC durante 30 minutos. Entonces, se filtra el medio sobre lecho de Clarcel y se concentra. Se vierten 40 ml de tolueno que se evapora; esta operación se repite con el fin de eliminar el metanol. El residuo así obtenido se recupera con 45 ml de THF. A continuación, se vierte una solución de diciclohexilcarbodiimida (7,180 g; 34,5 mmoles) en 20 ml de THF. Se calienta el medio de la reacción a 50ºC durante 1 hora. Se lleva la mezcla a 20ºC luego se filtra la diciclohexilurea. Se concentra el filtrado hasta sequedad. Se pone en solución el residuo en 46 ml de acetonitrilo, se le añaden 6,0 g (40,5 mmoles) de yoduro de sodio luego 5,13 ml (40,5 mmoles) de cloruro de trimetilsililo. Se mantiene el medio de la reacción bajo agitación a temperatura ambiente durante 5 horas. Se introducen entonces 28 ml de acetonitrilo y 5,6 ml de agua. El precipitado obtenido se filtra luego se recupera con 1 ml de agua, y el pH se lleva a 7,5 por adición de una solución de amoníaco. Se filtra el sólido obtenido y se seca. Se obtiene m = 4,2 g del producto final con un rendimiento del 34% y una proporción de enantiómero (+)/enantiómero (-) de 88,4/11,6.

Se realiza el análisis HPLC sobre una columna Chiralcel OD 25 cm x 4,6 mm, los eluyentes utilizados son el heptano 600 y el etanol 400 y el caudal es de 1 ml/min a 210 nm. Los tiempos de retención obtenidos son:

- enantiómero (-): 7,1 minutos

- enantiómero (+): 9 minutos.

Se recupera el producto con acetona (40 ml), luego se añade agua (150 ml). Se deja precipitar y se obtienen 3 g de producto con una proporción enantiómero (+)/enantiómero (-) de 99,4/0,6.

RMN ^{1}H (250 MHz, DMSO D6): 0,8 (t, 3H, CH, -CH_{2}); 1,65 (m, 2H, CH_{2}-CH_{3}); 3,00-3,35 (q, 1H + 1H, -CH_{2}-C=0); 5,3 (q, 2H, CH_{2}-O); 5,7 (s, -OH); 6,35 (d, 1H aromático); 7,3 (d, 1H aromático); 11,7 (s, N-H).

Ejemplo 2 (+)-cloruro de 1-[9-cloro-5-etil-5-hidroxi-10-metil-3,15-dioxo-4,5,13,15-tetrahidro-1H,3H-oxepino-[3',4' 6,7]-indo-lizino-[1,2-b]-quinolina-12-il-metil]-4-metil-hexahidropiridinio 2.a. 1-(2-amino-4-cloro-5-metilfenil)-2-cloro-etanona

Se enfría con un baño de hielo 3-cloro-4-metilanilina (44,4 ml; 0,366 moles) en 1,2-dicloroetano (440 ml), bajo una atmósfera de argón. Se añaden, gota a gota, y en el orden esta mezcla: tricloruro de boro (1M en heptano; 400 ml; 0,4 moles), cloroacetonitrilo (28 ml; 0,44 moles) y cloruro de dietilaluminio (1M en heptano: 400 ml; 0,4 moles). Durante la adición, la temperatura se mantiene por debajo de 20ºC. A continuación, se calienta la mezcla resultante a reflujo durante 3 horas, luego se enfría a 10ºC. Se procede entonces con precaución a la hidrólisis del medio de la reacción mediante ácido clorhídrico 2N (240 ml) y se calienta a reflujo durante 1 h. Se añaden agua (1 l) y acetato de etilo
(1 l), se agita la mezcla obtenida durante 15 min antes de separar las fases. Se extrae de nuevo la fase acuosa con acetato de etilo (200 ml), y se lava con agua (500 ml) las fases orgánicas combinadas. Se seca sobre sulfato de magnesio y se concentra la fase orgánica. Se recupera el residuo en éter de petróleo (fracción que tiene un punto de ebullición de 45ºC a 60ºC; 150 ml) y la mezcla así obtenida se deja reposar durante 16 h a 4ºC. Se recupera el precipitado resultante por filtración, se lava con éter de petróleo y se seca bajo presión reducida para dar el producto del título (25 g; 31% de rendimiento). P.f. = 129-130ºC.

RMN ^{1}H (DMSO): 2,20 (s, 3H); 4,98 (s, 2H); 6,90 (s, 1H); 7,15 (pico amplio, 2H); 7,70 (s, 1H).

IR (KBr): 871, 1018, 1183, 1225, 1270, 1533, 1577, 1619, 1662 cm^{-1}.

2.b. 7-cloro-4-clorometil-6-metil-2-oxo-1,2-dihidro-3-quinolinacarboxilato de etilo

Se mezclan el producto de la etapa 3.a (25 g; 0,11 moles) y trietilamina (30,6 ml; 0,22 moles) con acetonitrilo (520 ml). Se añade cloruro de etilmalonilo (28,1 ml; 0,22 moles) a temperatura ambiente y bajo una atmósfera de argón. La mezcla obtenida se agita durante 3 h. A continuación, se añade, gota a gota, etanolato de sodio (preparado por disolución de 3 g, lo que representa 0,13 ml, de sodio en 140 ml de etanol absoluto) y se agita la mezcla resultante a temperatura ambiente durante 16 h. Se recupera el precipitado por filtración, se lava sucesivamente con etanol, con agua, con etanol y con éter. A continuación, se seca bajo presión reducida a 70ºC sobre pentóxido de fósforo para dar el producto del título (28,6 g; 83% de rendimiento) en forma de polvo de color blancuzco.

RMN ^{1}H (DMSO): 1,30 (t, 3H); 2,40 (s, 3H); 4,35 (q, 2H); 4,85 (s, 2H); 7,41 (s, 1H); 7,91 (s, 1H); 12,15 (pico amplio, 1H).

IR (KBr): 879, 1108, 1250, 1288, 1483, 1664, 1721 cm^{-1}.

2.c. 2,7-dicloro-4-clorometil-6-metil-3-quinolinacarboxilato de etilo

Se calienta durante 4 horas el producto de la etapa 3.b (28,4 g; 90 mmoles) a reflujo en oxicloruro de fósforo (400 ml). La mezcla obtenida se concentra bajo presión reducida (20 mm de Hg) a 80ºC. Se recupera de nuevo el residuo en diisopropiléter (400 ml). Se recupera el precipitado resultante por filtración, se lava con éter y con éter de petróleo, luego se seca bajo presión reducida para dar el producto del título (25,4 g; 85% de rendimiento) en forma de polvo de color blancuzco (P.f. = 126-127ºC).

RMN ^{1}H (DMSO): 1,37 (t, 3H); 2,58 (s, 3H); 4,49 (q, 2H); 5,14 (s, 2H); 8,16 (s, 1H); 8,35 (s, 1H).

IR (KBr): 874, 1006, 1163, 1243, 1278, 1577, 1723 cm^{-1}.

2.d. 2,7-dicloro-4-clorometil-6-metil-3-quinolilmetanol

Se mezcla, bajo una atmósfera de argón, el producto de la etapa 3.c (25,2 g; 76,5 mmoles) con dicloroetano (630 ml). Se añaden, gota a gota, hidruro de diisobutilaluminio (1M en diclorometano; 307 ml; 307 mmoles) mientras que la mezcla de la reacción se agita y la temperatura se mantiene por debajo de 20ºC. A continuación, la mezcla de la reacción se agita a temperatura ambiente durante 3 horas, luego se vierte en una solución acuosa de tartrato de potasio (concentrada a 20% en peso; 1,5 l). La emulsión así obtenida se agita vigorosamente durante 1 h, se filtra sobre celita y las dos fases entonces se separan. Se extrae la fase acuosa con acetato de etilo (200 ml) y se lavan las fases orgánicas combinadas con una solución acuosa de cloruro de sodio (concentrada a 20% en peso; 500 ml). Se seca la fase orgánica obtenida sobre sulfato de magnesio, se filtra y se concentra bajo presión reducida. Se recupera el residuo con dietiléter (50 ml) y se recupera el precipitado resultante por filtración. Por secado bajo presión reducida, se obtiene el producto del título (18,3 g; 93% de rendimiento) en forma de polvo de color blancuzco (P.f. = 169-170ºC).

RMN ^{1}H (DMSO): 2,57 (t, 3H); 4,84 (s, 2H); 5,36 (s, 2H); 8,06 (s, 1H); 8,27 (s, 1H).

IR (KBr): 870, 1022, 1102, 1304, 1482, 1567 cm^{-1}.

2.e. 2,7-dicloro-6-metil-4-(4-metilpiperidinametil)-3-quinolilmetanol

Se trata una solución del producto de la etapa 3.d (16,2 g; 55,7 mmoles) en THF (70 ml) con una solución de 4-metilpiperidina (23 ml; 195 mmoles). La mezcla obtenida se agita a temperatura ambiente durante 2 h. Se añaden agua (200 ml) y dicloroetano (200 ml). Se lava la fase orgánica con una solución acuosa de cloruro de sodio (concentrada a 20% en peso; 100 ml), se seca sobre sulfato de magnesio y se concentra bajo presión reducida. Por cristalización del residuo en dietiléter, se obtiene el producto del título (18,3 g; 93% de rendimiento) en forma de un sólido cristalino de color blanco (P.f. = 170- 171,5ºC).

RMN ^{1}H (CDCl_{3}): 0,88 (d, 3H); 1,17 (m, 2H); 1,42 (m, 1H); 1,60 (m, 2H); 2,19 (t, 2H); 2,56 (s, 3H); 2,82 (d, 2H); 4,02 (s, 2H); 4,93 (s, 2H); 6,36 (pico amplio; 1H); 7,95 (s, 1H); 8,02 (s, 1H).

IR (KBr): 971, 1013, 1105, 1293, 1479, 1559 cm^{-1}.

2.f. (+)-8-[2,7-dicloro-6-metil-4-(4-metilpiperidinametil) -3-quinolilmetil]-5-etil-5-hidroxi-1,3,4,5,8,9-hexahidro-oxepino-[3,4-c]-piridina-3,9-diona

Se trata sucesivamente bajo una atmósfera de argón, una suspensión de (+)-EHHOPD (obtenida en la etapa 1.c; 1,56 g; 7,0 mmoles) en dioxano anhidro (70 ml) con el producto de la etapa 3.e (2,47 g; 7,0 mmoles), de trifenilfosfina (2,02 g; 7,7 mmoles) y de diisopropil azodicarboxilato (1,07 ml; 10,5 mmoles). Se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 16 h. A continuación, se evaporan las sustancias volátiles bajo presión reducida. Se purifica el residuo por cromatografía sobre columna de sílice (eluyente: acetato de etilo). Se recupera el sólido obtenido con dietiléter, se filtra y se seca, para dar el producto del título (1,96 g; 50% de rendimiento) en forma de un sólido de color blancuzco (P.f. = 182ºC).

RMN ^{1}H (DMSO): 0,89 (m, 8H); 1,23 (m, 1H); 1,41 (t, 2H); 1,64 (m, 2H); 2,09 (q, 2H); 2.59 (m, 5H); 3,15 (dd, 2H); 4,06 (dd, 2H); 5,31 (dd, 2H); 5,35 (dd, 2H); 5,75 (s, 1H); 6,29 (d, 1H); 7,17 (d, 1H); 8,06 (s, 1H); 8,46 (s, 1H).

IR (KBr): 878, 1053, 1275, 1474, 1572, 1648, 1747 cm^{-1}.

2.g. (+)-9-cloro-5-etil-5-hidroxi-10-metil-12-(4-metil-piperidinametil)-4,5,13,15-tetrahidro-1H,3H-oxepino-[3',4';6,7]-indolizino-[1,2-c]-quinolina-3,15-diona

Se agita una mezcla del producto de la etapa 3.f (3,80 g; 6,80 mmoles), de bromuro de tetrabutilamonio (2,42 g; 7,5 mmoles), de acetato de potasio (1,00 g; 10,2 mmoles), trifenilfosfina (890 mg; 3,4 mmoles) y de acetato de paladio (II) (220 mg; 0,68 mmoles) bajo una atmósfera de argón en acetonitrilo anhidro (85 mg) a reflujo durante 24 h. Después del enfriamiento a temperatura ambiente, se recupera el precipitado resultante por filtración y se lava sucesivamente con acetonitrilo, con agua, con acetona y con dietiléter para dar, después del secado a presión reducida, el producto del título (2,5 g; 70% de rendimiento) en forma de un polvo de color blancuzco.

RMN ^{1}H (DMSO): 0,86 (m, 6H); 1,12 (q, 2H); 1,36 (m, 1H); 1,56 (d, 2H); 1,84 (q, 2H); 2,12 (t, 2H); 2,56 (s, 3H); 2.83 (dd, 2H); 3,26 (dd, 2H); 4,03 (dd, 2H); 5,28 (dd, 2H); 5,45 (dd, 2H); 6,04 (s, 1H); 7,34 (s, 1H); 8,14 (s, 1H); 8,38 (s, 1H).

IR (KBr): 870, 1058, 1208, 1280, 1477, 1593, 1655, 1749 cm^{-1}.

2.h. (+)-cloruro de 1-[(5R)-9-cloro-5-etil-5-hidroxi-10-metil-3,15-dioxo-4,5,13,15-tetrahidro-1H, 3H-oxepino-[3',4':6,7]-indolizino-[1,2-c]-quinolina-12-il-metil]-4-metil-hexahidropiridinio

Se somete una mezcla de producto de la etapa 3.g (2,3 g; 7,7 mmoles) y de etanol absoluto (300 ml) durante 2 minutos a ultrasonidos. Se agita la suspensión lechosa obtenida y se trata con ácido clorhídrico (solución 1N; 13,2 ml; 13,2 mmoles) para dar una solución de color amarillo claro que, después del reposo, forma un precipitado de tipo gel. Se recupera el precipitado por filtración sobre Büchner y se lava sucesivamente con etanol y con éter, luego se seca bajo presión reducida para dar el producto del título (2,1 g; 85% de rendimiento).

RMN ^{1}H (DMSO): 0,87 (m, 6H); 1,59 (m, 5H); 1,84 (q, 2H); 2,64 (s, 3H); 3,28 (dd, 2H); 3,45 (s, 2H); 4,93 (s, 2H); 5,47 (dd, 2H); 5,61 (s, 2H); 6,04 (pico amplio, 1H); 7,41 (s, 1H); 8,28 (s, 1H); 8,63 (s, 1H); 10,30 (pico amplio, 1H).

IR (KBr): 1043, 1212, 1479, 1585, 1655, 1751 cm^{-1}.

Estudio farmacológico de los productos de la invención Ensayo sobre la proliferación celular

Se utilizan cinco razas de células tumorales en este estudio: SW620 (adenocarcinoma de colón humano), OVCAR-5 (adenocarcinoma de ovario humano), PC-3 y DU 145 (raza celular de próstata humana) y NCl-H69 (adenocarcinoma de pulmón humano). Estas razas proceden del NCl/Frederick Cancer Research and Development Center (Frederick, MD). Se cultivan en medio completo que comprende el medio RMPI-1640 enriquecido con 10% de suero de feto de ternera y con 2 mM de L-Glutamina. Se incuban a 37ºC en una atmósfera húmeda con 5% de CO_{2}. Se despegan las células adherentes mediante un tratamiento con una solución de 0,25% de tripsina y con 0,2% de EDTA (Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ) durante 5 minutos a 37ºC. El recuento de las células se hace con la ayuda de un contador tipo Coulter Z1 (Coulter Corp., Hialeah, FL). Se evalúa la viabilidad coloreando las células con yoduro de propidio luego contándolas con el citómetro con flujo EPICS Elite (Coulter).

Se disuelve el compuesto del ejemplo 2 que hay que ensayar a 5 mM en una solución de N,N-dimetilacetamina (DMA, Aldrich). Se efectúan las diluciones posteriores con el medio del cultivo. Las concentraciones molares finales ensayadas son: 1.10^{-6}, 2.10^{-7}, 4.10^{-8}, 8.10^{-9}, 1,6.10^{-9}, 3,2.10^{-10}, 6,4.10^{-11}, 11,28.10^{-11}, 2,56.10^{-12}, y 5,12.10^{-13}. Se ensaya cada concentración sobre ocho pocillos. Se efectuaron algunos controles sobre la influencia del DMA sobre todas las razas celulares. Resulta de estos controles que a concentración máxima utilizada (0,02%) la DMA no tienen efecto. La doxorubicina con concentraciones de 1.10^{-7} M y 2.10^{-7} M se utiliza como control positivo.

Se siembran las células a 5.10^{3} células por pocillo sobre una microplaca de 96 pocillos (Costar Corporation, Cambridge, MA). Se incuban las células durante 24 h a 37ºC con el fin de permitir una recuperación de la multiplicación celular. A continuación, se añade el compuesto de los ejemplos 2 y 3 que hay que ensayar a las concentraciones anteriormente indicadas y se incuban las células a 37ºC en una atmósfera húmeda con 5% de CO_{2} durante 3 días para las células adherentes (SW620, OVCAR-5, PC-3 y DU 145) y durante 5 días para las células en suspensión (NCl-H69).

Se ensayan las células adherentes por el procedimiento SRB (descrito por L. V. Rubenstein, R. H. Shoemaker, K. D. Paull, R. M. Simon, S. Tosini, P. Skehan, D. A. Scudiero., A. Monks, y M. R. Boyd "Comparison of in vitro anticancer-drug-screening data generated with tetrazolium assay versus a protein assay against a diverse panel of human tumor cell lines", J. Nat. Cancer Inst., 82: 1113-1118, 1990). Después de tres días de incubación se eliminan los sobrenadantes y se añaden 200 \mul de RPMI-1640 libres de suero de feto de ternera. Se fijan las células por adición de 50 \mul de ácido tricloro-acético a 50% (concentración final de ácido tricloroacético de 10%) y se incuban a 4ºC durante 1 hora. Se lavan los pocillos 5 veces con agua luego se colorean con 50 \mul de una solución al 0,4% de sulforhodamina B (SRB, Sigma) en ácido acético al 1% a temperatura ambiente durante 10 minutos. El tinte se solubiliza con
100 \mul de tampón TRIS a 10 mM; pH = 10, durante alrededor de 5 minutos con agitación, se leen las microplacas por espectrofotometría a 570 nm.

Se ensayan las células en suspensión mediante el procedimiento XTT (descrito par D. A. Scudiero, R. H. Shoemaker; K. D. Paull, A. Monks, S. Tiemey, T. H. Nofziger, M. J. Currens, D. Seniff et M. R. Boyd: "Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines", Cancer Research 48: 4827-4833, 1988). Después de la incubación en presencia del compuesto de los ejemplos 2 y 3 que hay que ensayar, se añaden XTT [sal sódica de 2,3-bis-(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-2H-tetrazolio-5-carboxanilida, (Sigma)] y metoxisulfato de fenazina (PMS, Sigma) en solución en el tampón fosfato salino a los cultivos, y se incuban las células durante 4 horas a 37ºC en una atmósfera con 5% de CO_{2}. Las concentraciones finales de XTT y PMS son respectivamente de 50 y 0,38 \mug/pocillo. Se detiene la producción de formazan por adición de 10 \mul de dodecilsulfato de sodio a 10% (Sigma) y se lee la absorbancia por espectrofotometría a 450 nm con un filtro de referencia a 600-650 nm.

Resultados

Las concentraciones molares de los compuestos del ejemplo 2 que inhiben el 50% de la proliferación celular se compilan en la tabla siguiente:

Raza celular	Ejemplo 2
SW620	3.10^{-8}
OVCAR-5	4.10^{-8}
PC-3	3.10^{-8}
DU 145	7.10^{-9}
NCl-H69	1.10^{-9}

Claims

1. Productos caracterizado porque tiene como fórmula la fórmula (II) que se representa a continuación:

15

o porque se trata de sales del compuesto de fórmula (II)

2. Producto según la reivindicación 1 caracterizado porque la sal del compuesto de fórmula (II) es el compuesto de fórmula (III):

16

3. Producto de fórmula general M que se representa a continuación:

17

en la cual R representa un radical etilo.

4. Procedimiento de preparación de un producto de fórmula general M que se representa a continuación:

18

en que R representa un radical etilo,

caracterizado porque está constituido de las etapas sucesivas siguientes:

-: el éster t-butílico racémico que se representa a continuación:

19

se trata con ácido trifluoracético durante 18 h a temperatura ambiente para dar el ácido carboxílico correspondiente;

-: a continuación, se calienta en alcohol isopropílico la sal de quinidina del ácido obtenido anteriormente a una temperatura superior a 30ºC, antes de dejar enfriar el medio de reacción hasta la temperatura ambiente, de tal manera que la sal de uno de los enantiómeros del ácido mencionado anteriormente cristalice mientras que la sal del otro enantiómero, cuyo anión está representado a continuación, permanece en solución:

20

-: la solución en el alcohol isopropílico de la sal del enantiómero que no haya cristalizado se concentra y se trata con ácido clorhídrico y se agita, para dar el compuesto de fórmula general A que se representa a continuación:

21

-: a continuación, el compuesto de fórmula general A se pone en contacto con paladio sobre carbón húmedo, luego se añade formiato de amonio o ácido fórmico a la mezcla para dar el producto desbencilado de fórmula general B que se representa a continuación:

\vskip1.000000\baselineskip

22

\vskip1.000000\baselineskip

-: a continuación, se cicliza el compuesto de fórmula B por la acción de la diciclohexilcarbodiimida para obtener el compuesto lactónico de fórmula general C que se representa a continuación:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

23

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-: finalmente, se transforma el grupo -OCH_{3} del compuesto lactónico de fórmula general C en carbonilo, por la acción de yoduro de sodio y de cloruro de trimetilsililo, para obtener un compuesto de fórmula general M que se representa a continuación:

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24

\vskip1.000000\baselineskip

5. Como medicamento, un producto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, o también una mezcla cualquiera de estos últimos.

6. Composición farmacéutica que contiene, como principio activo, uno al menos de los compuestos de la reivindicación 5.

7. Utilización de un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 para la preparación de medicamentos antitumorales.

\newpage

8. Utilización de un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 para la preparación de medicamentos antivíricos.

9. Utilización de un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 para la preparación de medicamentos antiparasitarios.