ES2210385T3 - P-etoxi-oligonucleotidos liposomales. - Google Patents

P-etoxi-oligonucleotidos liposomales.

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ES2210385T3 ES96929888T ES96929888T ES2210385T3 ES 2210385 T3 ES2210385 T3 ES 2210385T3 ES 96929888 T ES96929888 T ES 96929888T ES 96929888 T ES96929888 T ES 96929888T ES 2210385 T3 ES2210385 T3 ES 2210385T3
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Abstract

SE DESCRIBE UN SISTEMA DE ADMINISTRACION PERFECCIONADO PARA OLIGONUCLEOTIDOS ANTISENTIDO QUE IMPLICA UNA COMPOSICION LIPOSOMICA, QUE INCLUYE UN LIPOSOMA QUE CONSISTE ESENCIALMENTE EN FOSFOLIPIDOS NEUTROS Y UN OLIGONUCLEOTIDO ANTISENTIDO QUE ESTA ATRAPADO EN EL LIPOSOMA Y QUE SE SELECCIONA ENTRE EL GRUPO FORMADO POR OLIGONUCLEOTIDOS DE FOSFODIESTER, OLIGONUCLEOTIDOS DE FOSFOROTIOATO Y OLIGONUCLEOTIDOS DE P - ETOXI.

Description

P-etoxi-oligonucleótidos liposomales.
La presente invención se refiere a formulaciones liposomales de ciertos p-etoxi-oligonucleótidos antisentido. La invención también se refiere a métodos para preparar tales formulaciones y métodos para emplear tales formulaciones en terapia médica.
Se han empleado oligonucleótidos antisentido (oligos), complementarios de regiones específicas del ARNm diana, para inhibir la expresión de genes endógenos. Cuando los oligonucleótidos antisentido se unen al ARNm diana se forma un híbrido ADN-ARN. La formación del híbrido inhibe la traducción del ARNm y, de este modo, la expresión del gen de la proteína. Si la proteína es esencial para la supervivencia de la célula, la inhibición de su expresión puede implicar la muerte celular. En consecuencia, los oligonucleótidos antisentido pueden ser herramientas útiles en terapias anticancerígena y antiviral.
Los principales obstáculos al emplear oligonucleótidos antisentido para inhibir la expresión del gen son inestabilidad celular, captación celular baja, y pobre administración intracelular. Los fosfodiésteres naturales no son resistentes a la hidrólisis por nucleasa; de este modo se necesitan altas concentraciones de oligonucleótidos antisentido antes de que se observe cualquier efecto inhibidor. Se han preparado análogos de fosfodiéster modificado, tales como fosforotioatos, para solventar el problema de la hidrólisis por nucleasa, pero no ha proporcionado una solución satisfactoria completa al problema.
La captación celular de oligonucleótidos antisentido es baja. Para solucionar este problema, se han empleado técnicas físicas tales como precipitación calcio- fosfato, mediación de DEAE dextrano, o electroporación para incrementar la captación celular de oligonucleótidos. Estas técnicas son difíciles de reproducir y son inaplicables in vivo.
Otro análogo de fosfodiéster modificado (PD, por sus iniciales en inglés) que se ha preparado es p-etoxi (pE)-oligos. Las modificaciones de pE-oligos se hacen en el esqueleto de fosfatos de modo que la modificación no interferirá con la unión de estos oligos al ARNm diana. Los pE-oligos se preparan añadiendo un grupo etilo al átomo de oxígeno no unido del esqueleto de fosfatos, convirtiendo de este modo estos oligos en compuestos no cargados. A pesar de su resistencia a las nucleasas, la captación celular y administración intracelular de pE-oligos son todavía bajas porque en la internalización, estos oligos se mantienen secuestrados dentro de las vacuolas endosomales/lisosomales, impidiendo su acceso al ARNm diana.
El documento DE 4110085 describe métodos para la producción de 2'-O-alquil-oligoribonucleótidos y su uso como oligonucleótidos antisentido.
El documento WO 95/03788 describe composiciones de oligonucleótido metil-fosfonato liposomal útil en tratamiento de leucemia mieloidea crónica.
Akhtar et al., Nucleic Acids Research (1991) 19: 5551-5559, describen la interacción de ciertos oligonucleótidos otros que p-etoxi-oligonucleótidos con membranas fosfolipídicas y las características de permeación de ciertos análogos de oligonucleótido a través de tales membranas.
Stein y Cheng, Science (1993) 261: 1004-1012, estudian el uso de oligonucleótidos antisentido como agentes terapéuticos, estudiando en detalle oligonucleótidos metil-fosfonato, fosforotioato y fosfodiéster.
El documento WO 97/04787 describe una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido específico de Raf humano inmovilizado en liposomas estabilizados estéricamente en cuya parte del lípido es un glicolípido, un lípido derivatizado con polímero hidrofílico o un conjugado lípido-polímero.
Existe una necesidad para mejorar composiciones antisentido para uso en tratamiento de enfermedad, y también una necesidad de procedimientos para preparar tales composiciones mejoradas.
Una realización de la presente invención es una composición liposomal de oligonucleótidos antisentido. La composición incluye (a) un liposoma que consiste esencialmente en fosfolípidos neutros y está sustancialmente libre de colesterol y (b) un oligonucleótido antisentido que está inmovilizado en el liposoma y es p-etoxi-oligonucleótido. Los fosfolípidos son preferentemente fosfatidilcolinas. Un fosfolípido especialmente preferido es dioleoil-fosfatidilcolina. Cuando el oligonucleótido antisentido es un p-etoxi-oligonucleótido, la relación molar preferida de fosfolípido a oligo está entre 5:1 y 100:1.
Otra realización de la presente invención es un método para preparar la composición liposomal de oligonucleótidos antisentido. El método comprende las etapas de (a) hidratar una composición liofilizada que consiste esencialmente en fosfolípidos neutros y está sustancialmente libre de colesterol y un oligonucleótido antisentido que es p-etoxi-oligonucleótido, con ello formar una suspensión acuosa que incluye oligonucleótido libre y liposomas que inmovilizan oligonucleótido; y (b) separar el oligonucleótido libre de los liposomas por diálisis. En una realización preferida, la suspensión acuosa se somete al ultrasonidos antes de diálisis.
Las composiciones de la presente invención constituyen un sistema de administración mejorado para oligos antisentido, tales como aquellos empleados en terapia anticancerígena. Además de minimizar la hidrólisis por nucleasa de los oligos, las composiciones liposomales de la presente invención dan como resultado una captación celular incrementada y una administración intracelular de los oligos antisentido, como se ha comparado con las composiciones de la técnica anterior. En consecuencia, cuando tales composiciones se emplean para administrar oligos que inhiben la expresión de un gen encontrado en células cancerosas pero no en células normales, los resultados terapéuticos se incrementan.
Las formulaciones de la presente invención también incrementan la incorporación de oligos en los liposomas, como se ha comparado con formulaciones liposomales de la técnica anterior.
Las Figuras 1A y 1B son fotografías que muestran la captación de (A) pE-oligos libre y (B) liposomales por células ALL-1.
La Figura 2A muestra la extensión de la inhibición de crecimiento que resultó cuando se incubaron células ALL-1 y HL60 con pE-oligos antisentido liposomales específicos del punto de rotura B1/A2 de Bcr-Abl ARNm.
La Figura 2B muestra la extensión de la inhibición de crecimiento que resulta cuando se incubaron células ALL-1 con pE-oligos antisentido liposomales B1/A2 y pE-oligos de control liposomales B2/A2.
La Figura 3A muestra la extensión de la inhibición de crecimiento que resultó cuando se incubaron células BV173 y HL60 con pE-oligos antisentido liposomales que se dirigen específicamente al punto de fractura B2/A2 de Bcr-Abl ARNm.
La Figura 3B muestra la extensión de la inhibición de crecimiento que resultó cuando se incubaron células BV173 con pE-oligos antisentido liposomales que se dirigen específicamente al punto de fractura B2/A2 y con oligos de control que se dirigen específicamente al punto de fractura B1/A2.
La Figura 4A muestra la extensión de la inhibición de crecimiento que resultó cuando se incubaron células K562 y HL60 con pE-oligos antisentido liposomales que se dirigen específicamente al punto de fractura B3/A2 de Bcr-Abl ARNm.
La Figura 4B muestra la extensión de la inhibición de crecimiento que resultó cuando se incubaron células K562 con pE-oligos antisentido liposomales que se dirigen específicamente al punto de fractura B3/A2 y con oligos de control que se dirigen específicamente al punto de fractura B1/A2.
La Figura 5 muestra la extensión de la inhibición de crecimiento que resultó cuando pE-oligos liposomales que contenían Tween 20 se incubaron con células. BV173.
"Liposomas" se emplea en esta patente para significar vesículas que contienen lípidos que tienen una bicapa lipídica, así como otras partículas vehículo de lípido que pueden inmovilizar oligonucleótidos antisentido. Los liposomas pueden estar formados por uno o más fosfolípidos, tantos mientras el material lipídico está sustancialmente no cargado. Es importante que la composición esté sustancialmente libre de fosfolípidos aniónicos y catiónicos y de colesterol. Fosfolípidos adecuados incluyen fosfatidilcolinas y otros que sean bien conocidos por personas expertas en este campo. Los liposomas pueden ser, por ejemplo, unilaminares, multilaminares, o tener una estructura laminar indefinida. Una composición farmacéutica que comprende los liposomas incluirá normalmente, un vehículo o diluyente aceptable farmacéuticamente, tal como agua o solución salina.
"Inmovilizar", "encapsular", e "incorporar" se emplean en esta patente para significar que el oligo está encerrado en al menos alguna porción del espacio acuoso interno (incluidas las regiones interlaminares de la bicapa) del liposoma.
La preparación y el uso de la presente patente se ilustra posteriormente con los ejemplos que siguen.
Ejemplo 1
(Ejemplo comparativo)
Materiales
Los oligonucleótidos fosforotioato y fosfodiéster fueron proporcionados por Genta Incorporated. Los fosfolípidos fueron adquiridos en Avanti Polar Lipids.
Marcaje de oligonucleótido
Los fosfodiésteres se marcaron a 37ºC durante 8h con [^{32}P\gamma]ATP en el extremo 5' por quinasa T4. El oligonucleótido marcado se precipitó con etanol a -20ºC durante toda la noche. Después de lavar con etanol al 70% tres veces, los oligonucleótidos fosfodiéster se filtraron dos veces con filtro Microcon-3 para separar oligonucleótidos marcados de [^{32}P\gamma]ATP libre.
Los fosforotioatos, marcados con ^{35}S, fueron proporcionados por Genta Incorporated.
Preparación de fosfodiéster liposomal
Los oligonucleótidos fosfodiéster disueltos en agua destilada se mezclaron con fosfolípidos en la presencia de exceso de t-butanol para que el volumen final de t-butanol en la mezcla fuera 80-90%. Se añadieron también trazas de éter [^{3}H]colestanil-éter y [^{32}P]fosfodiéster a la mezcla como marcadores de lípido y oligonucleótido, respectivamente. La mezcla se agitó con aparato Vortex antes de congelar en un baño de acetona/hielo seco. La mezcla congelada se liofilizó e hidrató con tampón salino hepes (Hepes 1 mM y NaCl 10 mM) durante toda la noche. Los liposomas se sometieron a ultrasonidos durante 10 min en un baño de ultranosidos.
Preparación de fosforotioato liposomal
Los fosforotioatos liposomales se prepararon similarmente a lo descrito para fosfodiésteres liposomales, excepto que se emplearon fosforotioatos, en vez de fosfodiésteres. También, se emplearon [^{35}S]fosforotioatos, en vez de [^{32}P]fosfodiésteres, como el marcador de oligonucleótido.
Separación de oligonucleótidos libres de los incorporados a liposomas
La separación de oligonucleótidos fosfodiéster o fosforotioato libres de aquellos incorporados a liposomas se hizo al dializar la mezcla contra un exceso de 2500 veces en volumen de medio RPMI a temperatura ambiente durante toda la noche. Se tomaron alícuotas de la preparación antes y después de diálisis para recuento por centelleo líquido para valorar la incorporación de oligonucleótidos fosfodiéster o fosforotioato a liposomas.
Desarrollo de fosfodiésteres liposomales
Se eligieron lípidos dioleoil-fosfatidilcolina (DOPC por sus iniciales en inglés) para la incorporación de fosfodiéster (PD) porque son neutros mientras que PD está cargado negativamente. Al emplear este lípido, se puede reducir la repulsión electrostática (que puede incorporación más baja). No se emplean lípidos cargados positivamente porque pueden inducir toxicidad celular no específica. Los intentos iniciales de incorporar oligonucleótidos PD en liposomas se hicieron empleando métodos de congelado-y-descongelado, y deshidratación-rehidratación.
(A) Método de congelado-y-descongelado (FT por sus iniciales en inglés)
Los lípidos DOPC [^{3}H]marcados se evaporaron de su disolvente orgánico bajo nitrógeno gas para formar una película de lípido. Después de desecación bajo vacío, la película de lípido se hidrató con tampón salino hepes (hepes 1 mM, NaCl 10 mM, pH 8,0) y se sometió a ultrasonidos en un baño de ultrasonidos. Estos liposomas pre-formados se mezclaron luego con oligonucleótidos PD [^{32}P]marcados en una relación molar de 100 ó 1000 a 1. Toda la mezcla se congeló en un baño de acetona/hielo seco durante 5-10 minutos y se descongeló a temperatura ambiente durante 25-30 minutos. Este proceso se repitió tres veces antes de que la muestra se cargara sobre una columna A0,5M BioGel para separación de oligonucleótidos PD libres de PD liposomales. Se tomaron alícuotas antes y después del procedimiento de congelado-descongelado y se enviaron a recuento por centelleo líquido para determinar la incorporación de fosfodiésteres a liposomas.
La incorporación se determinó por
\frac{[^{32}P]PD / \mu mol [^{3}H]DOPC \ después \ de \ congelado-descongelado}{[^{32}P]PD / \mu mol [^{3}H]DOPC \ antes \ de \ congelado-descongelado} X 100%
No hubo incorporación (Tabla 1).
(B) Método de Deshidratación-Rehidratación (DR por sus iniciales en inglés)
Se evaporaron DOPC [^{3}H]marcados de su disolvente orgánico bajo nitrógeno gas para formar una película de lípido. Después de desecación bajo vacío, la película de lípido se hidrató con tampón salino hepes y se sometió a ultrasonidos en un baño de ultrasonidos. Estos liposomas pre-formados se congelaron luego en un baño de acetona-hielo seco y se liofilizaron. Los lípidos secos se rehidrataron luego con agua destilada que contenía oligonucleótidos [^{32}P]fosfodiéster. La relación molar de DOPC a PD fue cualquiera de las dos 100/1 ó 1000/1. La mezcla se cargó sobre una columna A0,5M BioGel para separación de oligonucleótidos PD libres de PD liposomales. Se tomaron alícuotas antes y después de cargar la columna y se enviaron a recuento por centelleo líquido. La incorporación fue <5% (Tabla 1).
TABLA 1 Comparación de métodos Congelado-descongelado (FT) y Deshidratación- rehidratación (DR) sobre la incorporación de PD a liposomas DOPC
Relación molar Métodos % incorporación
100/1 FT 0
DR 2,0
1000/1 FT 0
DR 4,6
Con relaciones molares de 500/1 y 5000/1 de DOPC a PD, se obtuvieron 0 y 5,2% de incorporación, respectivamente.
Se encontró luego que al añadir t-butanol a la mezcla antes de congelación y liofilización, la incorporación se aumentó hasta 11,9%. También, al reducir el volumen de agua destilada durante el procedimiento de rehidratación de 200 a 50 \mul, se obtuvo 11,9 versus 1,8% de incorporación con una relación molar de 1000/1. El efecto de la relación molar sobre la incorporación se midió de nuevo con estas condiciones mejoradas (Tabla 2).
TABLA 2 Efecto de lípido sobre relación molar de oligonucleótidos sobre la incorporación de PD a liposomas
Relación molar % incorporación
1000/1 11,9
2000/1 17,0
3000/1 13,4
4000/1 5,5
5000/1 9,2
El PD disuelto en agua destilada se mezcló con DOPC en la presencia de exceso de t-butanol para que el volumen final de t-butanol en la mezcla fuera de 80-90% antes de congelarse en un baño de acetona/hielo seco y liofilizado. Esto fue para evitar la etapa de preparar liposomas pre-formados. Con este procedimiento, se obtuvo un nivel similar de incorporación (16,2%) a la relación molar de 2000/1.
Se decidió cambiar el método de separación de PD libre de PD liposomal porque la recuperación de lípidos y PD fue <50%. Se emplearon otros dos métodos de separación: filtros Microcon-10 y diálisis (Tabla 3).
TABLA 3 Comparación de diferentes métodos de separación de PD libre de PD incorporados a liposomasª
Método % de Incorporación % recuperación de lípido y PD
Columna 11,9 40-50
Filtro 44,7 60-70
Diálisis 76,7 >90
ªDOPC se empleó para incorporar oligonucleótidos PD en una relación de 1000/1 molar.
Cuando la mezcla liposomal se sometió a ultrasonidos durante 10 min antes del procedimiento de separación por diálisis, se obtuvo un nivel similar de incorporación. Se empleó también otro lípido, dimiristoil-fosfatidilcolina, para la incorporación de PD. Hubo una incorporación >85%.
Desarrollo de fosforotioatos liposomales
Se empleó el protocolo similar de incorporación con fosforotioatos (PT) ya que PT y PD son análogos estructurales. Se emplearon varias relaciones molares de DOPC a PT (Tabla 4). También se estudió el efecto de someter a ultrasonidos la mezcla liposomial (antes de diálisis).
TABLA 4 Efecto de lípido sobre las relaciones molares de oligonucleótido sobre la incorporación de PT a liposomas
Relación molar % de incorporación sin con ultrasonidos
ultrasonidos
10/1 >90 >90
50/1 >90 >90
100/1 45,8 55,5
200/1 44,1 49,1
500/1 27,8 47,0
1000/1 25,1 42,1
Ejemplo 2 Incorporación de p-etoxi-oligos a liposomas
Los pE-oligos se adquirieron en Oligos Therapeutics (Willsonville, OR). Los fosfolípidos se adquirieron en Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, AL).
(a) Marcado de Oligo
Los pE-oligos se marcaron a 37ºC durante 24h con [^{32}P\gamma]ATP en el extremo 5' por quinasa polinucleótido T4, y luego se precipitó con etanol a -20ºC durante toda la noche. Luego se lavaron con etanol al 70% para separar el oligo marcado del [^{32}P\gamma]ATP libre.
(b) Preparación de liposoma
Los pE-oligos disueltos en H_{2}O destilada se mezclaron con fosfolípidos a varias relaciones molares en la presencia de exceso de t-butanol para que el volumen final de t-butanol en la mezcla fuera al menos 95%. Se añadieron también trazas de [^{3}H]colestanil-éter y [^{32}P]pEs a la mezcla como marcadores de lípido y oligo, respectivamente. La mezcla se agitó con aparato Vortex, se congeló en un baño de acetona/hielo seco y luego se liofilizó. La preparación liofilizada se hidrató con tampón salino Hepes (Hepes 1 mM y NaCl 10 mM) a una concentración de oligo final de 10-100 \muM. Los p-etoxi-oligos liposomales se sometieron a ultrasonidos durante 10-20 min en una baño de ultrasonidos.
(c) Separación de pE-oligos libres de aquellos incorporados a liposomas
La separación de pE-oligos libres de aquellos incorporados a liposomas se hizo por diálisis (PM de exclusión = 12-14.000) contra un exceso de 1000 veces de tampón salino Hepes a temperatura ambiente durante toda la noche. Se tomaron alícuotas de pE-oligos lipisomales antes y después de diálisis para recuento por centelleo líquido para valorar la incorporación de pE-oligos a liposomas.
(d) Eficacia de la incorporación
El lípido fosfatidilcolina (PC) se eligió para la incorporación de pE-oligos porque los oligos PC y pE son moléculas neutras por lo que serían compatibles. Entre todos los diferentes PCS, se eligió PC dioleoilo (DOPC) porque tiene una temperatura de transición de fase de fusión de cadena a -15ºC a -20ºC. De este modo, a temperatura ambiente, DOPC está en la fase cristalina líquida que es la fase ideal para preparar liposomas.
Para incorporar pE-oligos a liposomas, se mezclaron diferentes relaciones molares de pE-oligos junto con DOPC en la presencia de exceso de t-butanol. Se incluyeron trazas de pE-oligos y DOPC marcados radiactivamente en la mezcla. Las mezclas DOPC/pE-oligos se congelaron en un baño de hielo seco/acetona antes de liofilizarse. El polvo liofilizado de DOPC/pE-oligos se hidrató luego con tampón salino Hepes para que la concentración final de oligo fuera 10 \muM. Los pE-oligos se incorporaron con éxito a liposomas DOPC, en un intervalo entre 28 a 83% de eficacia (Tabla 5). La eficacia de incorporación fue dependiente de las relaciones molares de DOPC a pE-oligos: 10 > 100 > 5 > 1000:1.
TABLA 5 Efecto de la relación molar de DOPC a pE-oligos sobre la incorporación de pE-oligos
Relación molar DOPC: pE-oligos Eficacia de incorporación (%) ª
5:1 45
10: 83
100:1 71
1000:1 28
ªLos valores de eficacia de incorporación se obtuvieron a partir de tres experimentos por separado.
Administración de pE-oligos en células leucémicas
Después de conseguir una eficacia de incorporación alta (>80%) de pE-oligos a liposomas, procedimos luego a ensayar si estos pE-oligos liposomales podían alcanzar el citoplasma en el que se localiza el ARNm. Adquirimos un pE-oligos 16-mer marcado con rodamina en el extremo 5' para que pudiéramos visualizar la localización de pE-oligos por microscopía fluorescente.
(a) Incubación de pE-oligos con células leucémicas
Se emplearon células ALL-1, que son células leucémicas linfocíticas agudas humanas. Se cargaron en placa cincuenta mil células ALL-1/pocillo en una placa de 24 pocillos en 0,3 mL de medio. Después de 2 en placa, se añadieron concentraciones finales de 16 \muM de pE-oligos liposomales o libres conjugados con rodamina a células ALL-1. Después de 24h de incubación, las células se lavaron tres veces con tampón salino fosfato antes de verse bajo microscopio de escaneo láser confocal. Véase la Figura 1 (Captación de pE-oligos (A) libres o (B) liposomales por células
ALL-1).
Nuestros datos indican que cuando se incorporaron a liposomas, se aceptaron grandes cantidades de pE-oligos por las células. Los liposomas fueron capaces de administrar los pE-oligos al citoplasma.
Inhibición del crecimiento de pE-oligos liposomales en células leucémicas
Luego procedimos a ensayar si los pE-oligos liposomales podían inhibir específicamente el crecimiento de células leucémicas. Empleamos tres tipos diferentes de líneas celulares leucémicas humanas: ALL-1 (leucemia linfocítica humana), BV173 y K562 (ambas son de leucemia mielógena crónica). Todas las tres líneas celulares contienen el cromosoma Philadelphia reordenado (Ph) que surge de una translocación recíproca de los cromosomas 9 y 22. Esta translocación da como resultado el reordenamiento del proto-oncogen c-Abl a partir del cromosoma 9 sobre el extremo 3' de la región de agrupamiento del punto de rotura (Bcr por sus iniciales en inglés) del cromosoma 22, por lo que se produce un gen híbrido Bcr-Abl. Los puntos de rotura donde se fusionan los genes Bcr y el Abl son diferentes en las tres líneas celulares. En las células ALL-1, el punto de rotura es exon 1 Bcr/exon 2 Abl. En células BV173, el punto de rotura es exon 2 Bcr/exon 2 Abl. En células K562, el punto de rotura es exon 3 Bcr/exon 2 Abl. Todos estos genes híbridos producen una nueva proteína de fusión Bcr-Abl, que ha mejorado la actividad de tirosina quinasa que se ha ligado a la patogénesis de las leucemias. Por lo tanto, la inhibición de la producción de la proteína Bcr-Abl puede conducir a la inhibición del crecimiento de células leucémicas e incluso muerte celular. Para inhibir específicamente la producción de la proteína Bcr-Abl, se decidió dirigir las secuencias antisentido contra los puntos de rotura del ARNm Bcr-Abl que se encontró únicamente en células positivas a cromosoma Ph, pero no a células normales. Esta vía, esperábamos que indujera efectos secundarios tóxicos no específicos mínimos de modo que solo afectará el crecimiento de células leucémicas, no normales.
(a) Secuencias de pE-oligos antisentido (escrito del extremo 5' a 3')
antisentido contra exon 1 Bcr/ exon 2 Abl (B1/A2) encontrado en células ALL-1
GAAGGGCTTCTGCGTC
antisentido contra exon 2 Bcr/ exon 2 Abl (B2/A2) encontrado en células BV173
CTGAAGGGCTTCTTCC
\newpage
antisentido contra exon 3 Bcr/ exon 2 Abl (B3/A2) encontrado en células K562
GGGCTTTTGAACTCTGCT
(b) Administración de pE-oligos liposomales en células leucémicas
Se sembraron diez mil células ALL-1 o BV173 o cinco mil células K562 por pocillo en una placa de 96 pocillos en 100 \muL de medio RPMI que contenía suero de ternera fetal al 10%. Después de 2 horas de sembrado, se añadieron concentraciones finales de 0-10 \muM de pE-oligos liposomales a células leucémicas. Las células se incubaron con pE-oligos liposomales durante 5 días. Se emplearon células HL60, una línea celular promielocítica humana que no tiene el cromosoma Philadelphia, como células de control. Se sembraron bajo las mismas condiciones de diez mil células/pocillo.
(c) Determinación de la viabilidad de las células leucémicas
Al final de la incubación, se añadieron 100 \muL de medio a cada pocillo que hacía el volumen final de cada pocillo de 200 \muL. Luego se alicuotaron 50 \muL de células y se añadieron a placas de 96 pocillos que contenían 130 \muL de medio y 20 \muL de colorante alamarBlue. Las células se incubaron durante 4-8 horas a 37ºC antes de leerse directamente sobre un lector de microplacas (Molecular Devices, Menlo Park, CA) a 570 y 595 nm. El colorante alamarBlue incorpora un indicador de oxidación-reducción que cambia el color como respuesta a la reducción química del medio de crecimiento que resulta del crecimiento celular. La diferencia en absorbancia entre 570 y 595 nm se tomará como el valor de absorbancia total de las células leucémicas. Las viabilidades de células leucémicas tratadas con pE-oligos liposomales se compararán con aquellas de las células de control no tratadas.
Cuando las células ALL-1 y HL60 se incubaron con pE-oligos antisentido liposomales específicos del punto de rotura B1/A2 de ARNm Bcr-Acl, se observó una inhibición del crecimiento dependiente de la dosis de células ALL-1, pero no de HL60 (Fig. 2A). Se observó una inhibición de crecimiento similar con células BV173 y K562 cuando se incubaron con pE-oligos antisentido liposomales que se dirigen específicamente a los puntos de rotura B2/A2 y B3/A2 de ARNm Bcr-Abl, respectivamente (Fig. 3A, 4A). Bajo idénticas condiciones, no se inhibió el crecimiento de células HL60.
Para asegurar que los efectos inhibidores del crecimiento eran dependientes de la secuencia, las líneas celulares positivas al cromosoma Ph se incubaron con pE-oligos liposomales de control y antisentido. Cuando las células ALL-1 se incubaron con los pE-oligos antisentido liposomales B1/A2 y pE-oligos de control liposomales B2/A2, se indujo la inhibición del crecimiento. (Fig. 2B). Sin embargo, los oligos antisentido B1/A2 indujeron un efecto inhibidor mucho mayor. Similarmente, se encontraron efectos inhibidores más altos sobre células BV173 y K562 con los correspondientes pE-oligos antisentido liposomales que con los oligos de control (Fig. 3B, 4B).
También encontramos que al incluir el detergente Tween 20 en la mezcla de pE-oligo liposomal, se incrementó la potencia de los efectos inhibidores de los pE-oligos liposomales. Añadimos Tween 20 al 5% (en peso de pE-oligos) en la mezcla de pE-oligo liposomal. Luego la mezcla se agitó con aparato Vortex, se congeló en un baño de acetona/hielo seco antes de liofilizarse. La mezcla seca se hidrató luego y se sometió al ultrasonidos según se indicó previamente. Cuando se añadieron los pE-oligos liposomales que contenían Tween 20 a células BV173, se observó una inhibición de crecimiento del 100% a 5 \muM (Fig. 5) mientras que bajo las mismas condiciones, se observó de inhibición de crecimiento del 100% con pE-oligos liposomales normales (no Tween 20) a 10 \muM en su lugar.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: Board of Regents, The
\hskip3.3cm
University of Texas System 
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: FOSFODIÉSTER LIPOSOMAL,
FOSFOROTIOATO, Y p-ETOXI-OLIGONUCLEÓTIDOS
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 3
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
ATENCIÓN DE: Arnold, White & Durkee
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CALLE: 750 Bering Dr., Ste. 400
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Houston
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
ESTADO: TX
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
PAÍS: EE.UU.
\vskip0.333000\baselineskip
(F)
ZIP: 77057-2158
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
FORMA LEÍBLE DE ORDENADOR
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible IBM
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
PROGRAMA INFORMÁTICO: PatentIn Release # 1,0, Versión # 1,30
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD DE PATENTE EN CURSO
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE APLICACIÓN: 08/520.385
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.666000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DE ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Goodman, Kenneth D.
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 30,460
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/ SIGNATURA: UTFC433P-
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: 713/787-1460
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
FAX: 713/789-2679
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA NO ID SEC: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: SI
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO ID SEC: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAAGGGCTTC TGCGTC 
\hfill
16 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA NO ID SEC: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: SI
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO ID SEC: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGAAGGGCT TCTTCC 
\hfill
16 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA NO ID SEC: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 18 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: SI
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NO ID SEC: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGCTTTTGA ACTCTGCT 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip

Claims (9)

1. Una composición liposomal de oligonucleótidos antisentido, que incluye (a) un liposoma que se compone de uno o más fosfolípidos sustancialmente no cargados y sustancialmente libre de colesterol, y (b) un oligonucleótido antisentido que está inmovilizado en el liposoma y es un p-etoxi-oligonucleótido; en el que la relación molar de fosfolípido a oligo está entre 5:1 y aproximadamente 100:1.
2. La composición de la reivindicación 1, en la que los fosfolípidos son fosfatidilcolinas.
3. La composición de la reivindicación 1, en la que los fosfolípidos son dioleoil-fosfatidilcolina.
4. La composición de la reivindicación 1, en la que el oligonucleótido antisentido es un p-etoxi-oligonucleótido que consiste esencialmente en una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia GAAGGGCTTCTGCGTC.
5. La composición de la reivindicación 1, en la que el oligonucleótido antisentido es un p-etoxi-oligonucleótido que consiste esencialmente en una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia CTGAAGGGCTTCTTCC.
6. La composición de la reivindicación 1, en la que el oligonucleótido antisentido es un p-etoxi-oligonucleótido que consiste esencialmente en una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia GGGCTTTTGAACTCTGCT.
7. Un método in vitro para inhibir el crecimiento de células tumorales, que incluye administrar una cantidad eficaz para inhibir el crecimiento de células tumorales de una composición que incluye (a) un liposoma que se compone de uno o más fosfolípidos sustancialmente no cargados y sustancialmente libre de colesterol, y (b) un oligonucleótido antisentido que está inmovilizado en el liposoma y es un p-etoxi-oligonucleótido.
8. Un método para preparar una composición liposomal de oligonucleótidos antisentido de acuerdo con la reivindicación 1, que incluye las etapas de:
(a)
hidratar una composición liofilizada que se compone de uno o más fosfolípidos sustancialmente no cargados y sustancialmente libre de colesterol, y un oligonucleótido antisentido que es un p-etoxi-oligonucleótido;
con ello formar una suspensión acuosa que incluye oligonucleótido libre y oligonucleótido inmovilizado en liposomas; y
(b)
separar el oligonucleótido libre de los liposomas por diálisis.
9. El método de la reivindicación 8, en el que la suspensión acuosa se somete a ultrasonidos antes de diálisis.
ES96929888T 1995-08-29 1996-08-26 P-etoxi-oligonucleotidos liposomales. Expired - Lifetime ES2210385T3 (es)

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