ES2210504T3 - Procedimiento de preparacion del acido 2-hidroxi-4-metiltio-butirico, mediante la utilizacion de una nitrilasa. - Google Patents
Procedimiento de preparacion del acido 2-hidroxi-4-metiltio-butirico, mediante la utilizacion de una nitrilasa.Info
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Abstract
ESTA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO DE PREPARACION DE ACIDO 2 - HIDROXI 4 - METILTIO BUTIRICO Y/O DE SAL AMONICA DEL ACIDO 2 - HIDROXI 4 - METILTIO BUTIRICO POR HIDROLISIS ENZIMATICA DE 2 - HIDROXI 4 METILTIO BUTIRONITRILO CARACTERIZADO PORQUE A) EN UNA PRIMERA ETAPA SE PREPARA UN MATERIAL BIOLOGICO QUE TIENE UNA ACTIVIDAD DE NITRILASA, B) EN UNA SEGUNDA ETAPA, SE LE INMOVILIZA, C) EN UNA TERCERA ETAPA, SE PONE EN PRESENCIA DEL 2 - HIDROXI 4 - METILTIO BUTIRONITRILO CON EL MATERIAL BIOLOGICO ASI INMOVILIZADO, PARA OBTENER LA SAL AMONICA DEL ACIDO 2 - HIDROXI - 4 - METILTIO BUTIRICO, D) EN UNA CUARTA ETAPA, OPCIONALMENTE, SE CONVIERTE LA SAL OBTENIDA EN LA ETAPA C) EN EL ACIDO CORRESPONDIENTE Y E) EN UNA QUINTA ETAPA, SE CONCENTRA EL PRODUCTO OBTENIDO EN LA ETAPA C) O D).
Description
Procedimiento de preparación del ácido
2-hidroxi-4-metiltio-butírico,
mediante la utilización de una nitrilasa.
La presente invención, se refiere a un nuevo
procedimiento de preparación del ácido
2-hidroxi-4-(metiltio)butanóico
(HMTBS) y / o de su sal de amonio (HMBTS).
El ácido
2-hidroxi-4-metiltiobutírico
y sus sales, se utilizan desde hace mucho tiempo, en la
alimentación animal, reemplazando a la metiotina. Éste, o éstas,
presentan la ventaja, sobre ésta última, de presentarse en forma
líquida, lo cual facilita su utilización por parte de las empresas
productoras de alimentos.
Se conoce, desde hace mucho tiempo, el hecho de
preparar el ácido
2-hidroxi-4-(metiltio)butanóico,
por vía química. Se pueden citar, de esta forma, las patentes
europeas EP-142 488, EP-143 000, las
cuales describen la hidrólisis del
2-hidroxi-4-metiltiohidroxibutironilo
(HMTBN), mediante un procedimiento en dos etapas. La primera etapa,
consiste en poner en contacto el
2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo,
con un ácido mineral fuerte, tal como el ácido clorhídrico o
sulfúrico. En una etapa ulterior, después de dilución en agua, la
hidrólisis, se completa a una temperatura más elevada. El ácido
2-hidroxi-4-(metiltio)butanóico,
se extrae, a continuación, con un disolvente orgánico poco miscible
con el agua, tal como una cetona, de una forma preferible, la
metilisobutilcetona y, a continuación, el disolvente, se elimina
mediante evaporación. Este tipo de procedimiento, utilizado a
escala industrial, comporta no obstante algunos inconvenientes. Éste
produce una cantidad molar de sulfato de amonio, por lo menos igual
a la cantidad molar de nitrilo introducida, que debe eliminarse,
generando, de esta forma, un residuo industrial que va en contra de
una política de protección del medio ambiente. Este procedimiento,
necesita, también, la utilización de algunas cantidades importantes
de disolvente, las cuales es absolutamente necesario reciclar.
Otros procedimientos, tales como por ejemplos los
que se describen en las patentes estadounidenses US 3 773 927 y US
4 353 924, consisten en hidrolizar el
2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo,
con ácido clorhídrico y, a continuación, concentrar el medio con
separación del cloruro de amonio formado. La sal obtenida, es tan
difícil de eliminar como la sal precedente y, además, el ácido
obtenido, presenta una fuerte coloración.
Se describe también, todavía, en la patente
europea EP 330 521, un procedimiento de hidrólisis del
metiltiohidroxipropionitrilo, el cual consiste, tal y como
precedentemente, en realizar una hidrólisis en medio sulfúrico. La
mezcla, se neutraliza parcialmente, con amoníaco. Aparece una
separación bifásica. La fase orgánica, contiene la mayoría del
ácido
2-hidroxi-4-metiltiobutírico
y, la fase acuosa, contiene la mayoría del sulfato de amonio
producido. La solución orgánica, después de la evaporación del agua
contenida, se filtra, de tal forma que se recupere el sulfato
amónico disuelto. El ácido
2-hidroxi-4-metiltiltiobutírico,
se diluye, a continuación, con un poco de agua, y solubiliza con un
poco de ácido sulfúrico. La solución acuosa, después de la
eliminación del agua, permite el obtener sulfato de amonio,
directamente comercializable. Este procedimiento, resuelve, en
parte, los inconvenientes de los procedimientos del arte anterior
de esta técnica especializada, en cuanto a lo concerniente al uso
de disolventes orgánicos, pero, no resuelve, en absoluto, los
problemas ligados con los rechazos de las sales minerales.
Entre las patentes relativas a las sales del
ácido el ácido
2-hidroxi-4-metiltiobutírico,
se pueden citar las patentes estadounidenses US 2 745 745, US 2 938
053 y US 3 175 000, las cuales conciernen a las sales de calcio y /
o de amonio. La mezcla obtenida mediante la hidrólisis del
2-hidroximetiltiobutironitrilo, se trata con una
hidróxido o con carbonato de calcio. El sulfato de calcio, se
precipita, entonces, liberando amoníaco, el cual forma la sal de
amonio del ácido
2-hidroxi-4-metiltiobutírico.
Aquí, también, todavía, subsiste el problema de eliminar el sulfato
de calcio.
Se describe, también, todavía, en la solicitud
internacional de patente WO 96 / 01808, un procedimiento, el cual
consiste en practicar una hidrólisis y una extracción mediante un
disolvente orgánico, como en el primer documento, citado,
correspondiente al arte anterior de esta técnica especializada y, a
continuación, una neutralización de la solución orgánica, mediante
amoníaco. Este procedimiento, como la mayoría de procedimientos
anteriormente descritos, tiene como resultado la formación de por lo
menos un mol de sulfato o de cloruro de amonio, por mol de nitrilo
introducido, y exige el reciclado de cantidades importantes de
disolvente orgánico. Éste no permite el obtener una solución de sal
de amonio del ácido el ácido
2-hidroxi-4-metiltiobutírico,
a un coste que sea industrialmente interesante.
Se describe, además, en el documento
internacional de solicitud de patente WO 96 / 09403, la utilización
de una nitrilasa, como catalizador de la hidrólisis de un grupo
nitrilo en grupo carboxílico. El procedimiento descrito en este
documento, no obstante, no es utilizable a escala industrial,
teniendo en cuenta la insuficiencia de microorganismos que
sintetizan estas nitrilasas.
Se ha descubierto ahora, gracias al procedimiento
de la invención, el hecho de que, aplicando varios etapas
específicas, es posible el obtener el ácido
2-hidroxi-4-metiltiobutanóico
y / o su sal de amonio, por vía enzimática, a escala industrial,
con un rendimiento elevado, sin la utilización de disolventes y sin
producción concomitante de sales minerales.
La invención, tiene por objeto un procedimiento
de preparación del ácido
2-hidroxi-4-metiltiobutírico
y / o de la sal de amonio del ácido
2-hidroxi-4-metiltiobutírico,
mediante la hidrólisis enzimática del
2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo,
caracterizado por el hecho de que:
a) en una primera etapa, se prepara un material
biológico, que tiene una actividad nitrilasa,
b) en una segunda etapa, se procede a
inmovilizarlo,
c) en una tercera etapa, se pone en presencia, el
2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo,
con el material biológico de esta forma inmovilizado, para obtener
la sal de amonio del ácido
2-hidroxi-4-metiltiobutírico.
d) en una cuarta etapa, eventualmente, se
convierte la sal obtenida en la etapa c), en el ácido
correspondiente, y
e) en una quinta etapa, se concentra el producto
obtenido en la etapa c) o d).
La invención, se explicará de una forma
detallada, en la descripción que se facilita a continuación, para
la cual, se hará referencia a las figuras anexadas, en las
cuales:
- la figura 1, representa un esquema de una
célula de electrodiálisis, empleada en la etapa facultativa d); la
figura 1 A, representa una célula de electrodiálisis, de membrana
bipolar, de tres compartimentos; la figura 1 B, representa una
célula de electrodiálisis de membrana bipolar, de dos
compartimientos.
- la figura 2, representa un esquema de una
instalación, para la aplicación del procedimiento según la
invención;
- la figura 3, representa la carta de restricción
de los plásmidos pRPA-BCTAT 1 a 5.
- la figura 4, representa la estrategia de
secuenciación del fragmento de 1130 pb, que contiene la secuencia
de ADN (denominada, sobre la figura, como nitB), que codifica al
polipéptido que tiene la actividad nitrilasa según la invención. Los
números, se refieren a la identidad de los cebadores utilizados
para la secuenciación, así como las anotaciones M13FWD y
M13REV.
- la figura 5, representa la tarjeta de
restricción de los plásmidos pRPA-BCAT12 y
pRPA-BCAT13.
- la figura 6, representa la electroforesis sobre
gel de SDS-PAGE a un 10%, que muestra la expresión
de las secuencias de ADN según la presente invención, en las capas
E. coli BL21(DE3)pRPA-BCAT12,
BL21(DE3)pRPA-BCAT13,
BL21(DE3)pRPA-BCAT12 + pXL2331,
BL21(DE3)pRPA-BCAT13 + pXL2231. Cada
pista, corresponde a una cantidad de proteínas solubles de 10
\mug y un volumen equivalente de fracción bruta insoluble.
- la figura 7, representa la electroforesis sobre
gel de SDS-PAGE a un 10%, que muestra la expresión
de las secuencias de ADN según la presente invención, en las capas
E. coli DH5\alpha/pRPA-BCAT3,
DH5\alpha/pRPA-BCAT6,
DH5\alpha/pRPA-BCAT6 + pXL2035,
pRPA-BIOCAT76. Cada pista, corresponde a una
cantidad de proteínas solubles de 10 \mug y un volumen equivalente
de fracción bruta insoluble.
- la figura 8, representa la tarjeta de
restricción del plásmido pRPA-BCAT14.
- la figura 9, representa la electroforesis sobre
gel de SDS-PAGE a un 10%, que muestra la expresión
de las secuencias de ADN según la presente invención, en las capas
P. putida G2081 (pRPA-BCAT14), G2081
(pRPA-BCAT23), G2081 (pRPA-BCAT24),
A. faecalis ATCC8750 (pRPA-BCAT214), A. faecalis
ATCC8750 (pRPA-BCAT23), A. faecalis ATCC8750
(pRPA-BCAT24). Cada pista, corresponde a una
cantidad de proteínas solubles de 10 \mug y un volumen
equivalente de fracción bruta insoluble.
Cada pista, corresponde a una cantidad de
proteínas solubles de 10 \mug, y un volumen equivalente de una
fracción bruta eventualmente soluble.
- la figura 10, representa una tarjeta de
restricción del plásmido pCGL1087.
- la figura 11, representa una tarjeta de
restricción del plásmido pOS48.7.
La primera etapa, consiste en preparar el
material biológico que tiene una actividad nitrilasa.
El material biológico, puede consistir en una
solución enzimática tal cual, o de células enteras o trituradas,
que tienen una actividad nitrilasa.
De una forma ventajosa, se utiliza un
microorganismo que expresa una nitrilasa.
La nitrilasa, puede principalmente proceder de un
microorganismo, de una forma particular, el microorganismo del
género Alcaligenes, Rhodococcus o Gordona, principalmente,
Alcaligenes faecalis, Rodhococcus sp. HT
29-7, Gordona térrea, de una forma preferente, las
cepas descritas en el documento de patente internacional WO 96 /
09403.
Se utiliza, de una forma preferente, un
microorganismo que exprese una actividad nitrilasa obtenida por
transferencia de la información genética que codifica a la
nitrilasa de un microorganismo parental en un microorganismo
huésped. De una forma particular, en el E. coli, se puede
utilizar la co-expresión de las proteínas de
cobertura (de caperuza) Gro ESL, para mejorar el rendimiento o
prestaciones de la cepa recombinante.
A dicho efecto, se utiliza cualquier vector de
expresión apropiado, especialmente, un vector plasmídico.
La secuencia nucleótida utilizada en este caso,
se emplazará, entonces, bajo el control de señales que permitan su
expresión en un huésped celular. El huésped celular utilizado,
puede elegirse entre los sistemas procariótas, como las bacterias
gram positivas o gram negativas, o eucariótas, como las por ejemplo
las levaduras, los hongos, o cualquier otro sistema. Las señales
que controlan la expresión de los polipéptidos, se eligen en
función del huésped utilizado. A dicho efecto, el ADN codificante
para la nitrilasa, puede insertarse en vectores de replicación
autónoma, en el seno del huésped elegido, o en vectores integrantes
del huésped elegido. Tales tipos de vectores, se prepararán según
los procedimientos corrientemente utilizados por parte de la
persona experta en este arte especializado de la técnica y, las
construcciones resultantes, pueden introducirse en un huésped
apropiado, mediante procedimientos standard, tales como la
electroporación.
A título de microorganismo huésped, se pueden
citar, de una forma particular, los Alcaligenes faecalis,
Pseudomonas putida, Escherichia coli, o los microorganismos del
género Bacillus, Corynebacterium, Streptomyces, Saccharomyces,
Kluyveromyces, Penicillium y Aspergillus.
Un vector preferido para la expresión, en los
E. coli, es el plásmido pRTA-BCAT6.
La segunda etapa del procedimiento, consiste en
inmovilizar el material biológico. Esta inmovilización, se hace, de
una forma ventajosa, en presencia de un soporte sólido, y permite
obtener partículas sólidas cuyo tamaño, forma, y resistencia
mecánica, pueden controlarse. Ésta permite también el empleo
simultáneo del polímero de poliazetidina y de otros agentes
reticulantes.
Este procedimiento de inmovilización, puede hacer
intervenir células enteras o permeabilizadas. Éste puede también
aplicarse a una solución enzimática exenta de células.
Las enzimas utilizadas para la inmovilización,
son las nitrilasas.
El procedimiento de inmovilización, consiste en
inmovilizar el material biológico activo sobre un soporte sólido,
de una granulometría principalmente comprendida dentro de unos
márgenes situados entre 1 \mum y 3 mm, de una forma preferente,
comprendida dentro de unos márgenes situados entre 10 \mum y 2 mm,
gracias a agentes químicos que reaccionan con las funciones aminas
(NH_{2}, NH), carboxilo (COOH), hidroxi (OH), tiol (SH) o amida
(CONH_{2}), del agente biológico y del soporte. Estos agentes
químicos, permiten también isolubilizar en agua, el material
biológico y el soporte. La masa obtenida, es muy maleable y puede
ponerse en forma, con el fin de obtener partículas de forma y de
tamaño deseado. La cohesión y la duración de estas partículas, se
obtienen, a continuación, mediante
secado.
secado.
El material biológico a inmovilizar, puede
eventualmente contener igualmente un material biológico inactivo,
presente a razón de un porcentaje del 0 al 200%, en peso. Este
material biológico inactivo, puede corresponder a proteínas
(albúmina, gelatina), o pueden ser polisacáridos (Citasan,
k-carragenano, alginato).
El soporte inerte sobre el cual se deposita el
material biológico y polímero, puede estar compuesto a base de
partículas orgánicas o inorgánicas, porosas o no porosas,
hidrófilas o hidrófobas. Entre estas partículas, se pueden señalar,
de una forma no limitativa:
- -
- las resinas intercambiadoras de iones,
- -
- la alúmina,
- -
- los sílices de síntesis o diatomeas y los geles de sílice,
- -
- las zeolitas,
- -
- los carbones,
- -
- las proteínas insolubles en agua, como el gluten,
- -
- los polisacáridos, como el almidón.
El soporte inerte, puede ajustarse a razón de un
porcentaje comprendido dentro de unos márgenes que van de un 0,01 a
un 500%, en peso, del material biológico y, de una forma preferente,
dentro de unos márgenes que van de un 10 a un 200%.
Los agentes químicos utilizados para
insolubilizar el material biológico, pueden ser polímeros o
moléculas bifuncionales que reaccionan con las funciones amina
(NH_{2}, NH), carboxílica (COOH), hidroxi (OH), tiol (SH) amida
(CONH_{2}). Se pueden citar:
- -
- los polímeros de poliazetidina,
- -
- los polímeros de polietilenimina,
- -
- los polímeros de poliamida,
- -
- los polímeros de isocianatos,
- -
- los geles de alginato,
- -
- los geles de k-carragenano,
- -
- las aminas como la hexametilendiamina,
- -
- los aldehídos como el glutaraldehido,
- -
- los ácidos carboxílicos como el ácido adípico, y
- -
- los isocianatos.
El procedimiento de inmovilización, puede hacer
intervenir uno o varios de estos agentes químicos. El agente
químico, se añade según una concentración comprendida dentro de unos
márgenes correspondientes a un porcentaje situado entre el 1 y el
50%, en peso, con relación al material biológico y al soporte. Se
preferirá una cantidad comprendida dentro de unos márgenes
correspondientes a un porcentaje situado entre el 5 y el 30%, con el
fin de obtener partículas suficientemente sólidas y que conserven
una actividad importante y que no presenten demasiados problemas de
difusión interna.
La duración del tratamiento de reticulación, se
encuentra comprendida dentro de unos márgenes situados entre 0,5 y
24 horas.
La temperatura del procedimiento, se encuentra
generalmente comprendida dentro de unos márgenes situados entre unos
valores de 4 y 65ºC. Se preferirá una temperatura comprendida dentro
de unos márgenes situados entre unos valores de 20 y 40ºC. La
temperatura empleada, durante el procedimiento de inmovilización,
puede también ser muy dependiente de la estabilidad del material
biológico empleado.
El valor pH, durante la fase de inmovilización,
se mantiene a un nivel comprendido dentro de unos márgenes situados
entre 5 y 11. Se preferirá un valor pH comprendido dentro de uno
márgenes situados entre 6 y 10, con una preferencia hacia los
valores pH alcalinos. El valor pH, se elige también en función de la
resistencia del material biológico, y se determinará fácilmente y
con soltura, por parte de las persona especializada en este arte de
la
técnica.
técnica.
La aplicación del biocatalizador, debe permitir
su empleo en un sistema cualquiera, especialmente, en un lecho
fijo.
Un procedimiento de formulación, puede ser el de
la extrusión. Para realizar este cometido, el material biológico y
los soportes, se reticulan mediante la ayuda de uno o varios agentes
químicos. Después del tratamiento, la masa insoluble, se recupera
mediante centrifugación o después de la floculación y filtración.
Una tasa de materia seca, de por lo menos un porcentaje del 10%, es
el que se prefiere. La masa, a continuación, se extrusiona. Mediante
este procedimiento, se obtienen, de una forma preferente, unos
"macarrones" de un diámetro comprendido dentro de unos márgenes
situados entre 0,3 y 0,5 mm, y de una longitud comprendida dentro
de unos márgenes situados entre 1 y 10 mm. Estos "macarrones",
pueden esferizarse en forma de granza. Se procede, a continuación, a
secar las partículas de esta forma obtenidas.
Otro procedimiento de formulación, puede ser el
de la aplicación de una película (recubrimiento mediante proyección
pulverizada - "spray coating"- ). Para realizar este cometido,
el material biológico, se mezcla con uno o varios agentes químicos.
Después de la reacción, al mezcla, se pulveriza sobre el soporte,
bajo forma de una capa fina. Mediante este procedimiento, se
obtienen gránulos de granza, de un diámetro medio comprendido dentro
de unos márgenes situados entre 0,1 y 2 mm.
Las partículas obtenidas, pueden eventualmente
sumergirse, a continuación, en una solución de un agente reductor,
como el borohidruro de sodio, con el fin de reducir las funciones
iminas formadas durante al reticulación.
Las partículas obtenidas, son lo suficientemente
sólidas y resistentes al desgaste por fricción, como para poder
emplearse en un lecho fijo, y lecho fluidificado o un reactor
agitado.
La tercera etapa del procedimiento según la
presente invención, consiste en aplicar el material biológico
inmovilizado, en una o varias columnas o reactores. La finalidad de
esta etapa, es la de poder producir, en continuo, las sal de amonio
del ácido
2-hidroxi-4-metiltiobutírico,
a partir del
2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo.
La columna o columnas, o reactor o reactores, se
alimentan mediante una solución pura o diluida de
2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo
o una mezcla que contenga
2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo
y sal de amonio del ácido
2-hidroxi-4-metiltiobutírico.
La columna o columnas, o reactor o reactores, se
ponen en marcha, de una forma preferente, a una temperatura
comprendida dentro de unos márgenes situados entre 10 y 60ºC, y a
un pH comprendido dentro de unos valores situados entre 5 y 9.
El sistema aplicado, puede estar constituido a
base de varias columnas conectadas la una con la otra, en serie,
según una primera forma de puesta en ejecución de la presente
invención, mediante la alimentación de la solución acuosa del
2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo,
en la cabeza de la primera columna, con una alimentación simultánea
de las otras columnas, con la solución del
2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo,
en una cantidad limitada a la solubilidad de este compuesto, en la
mezcla reactiva; este sistema, se denomina sistema por etapas. Según
una segunda forma de puesta en ejecución de la invención, se
utilizan una o varias columnas conectadas la una con la otra, en
paralelo, en un bucle de circulación. Según esta instalación, el
2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo
en solución acuosa, se alimenta en continuo, en el bucle y, el medio
de reacción, se bombea en continuo, de tal forma que se conserve un
volumen constante en el bucle; este sistema, se denomina sistema de
bucle.
El tipo de reactor utilizado en esta invención,
puede ser del tipo de lecho fijo, de lecho fluidificado, o del tipo
agitado en continuo. Se prefiere utilizar los reactores del tipo de
lecho fijo, debido al hecho de que, éstos, reducen los problemas de
desgaste por fricción, que puedan encontrarse con partículas de
células inmovilizadas. Si el microorganismo se utiliza tal cual, se
preferirá utilizar un reactor agitado, acoplado a un módulo de
ultrafiltración, para separar, de una forma continua, al
microorganismo del producto de interés.
La cuarta etapa, la cual es una etapa
facultativa, consiste en convertir la sal de amonio del ácido
2-hidroxi-4-metiltiobutírico,
en el ácido correspondiente. Esta etapa, puede realizarse según dos
procedimientos:
- o bien ya sea mediante electrodiálisis por
mediación de un electrodializador de dos o de tres
compartimientos,
- o bien ya sea mediante calentamiento de la
solución acuosa, que puede seguirse de una extracción líquido /
líquido.
Según el procedimiento por electrodiálisis, se
empleará un electrodializador de dos o de tres compartimientos. Por
"compartimento", se entiende el espacio comprendido, bien ya
sea entre dos membranas, bien ya sea entre una membrana bipolar y
homopolar, o bien ya sea entre dos membranas homopolares contiguas.
Por "célula", se entenderá un conjunto de dos o de tres
compartimientos. Un apilamiento, comprende entre 5 y 300 células. El
electrodializador, se encuentra compuesto por un apilamiento, y
comporta, por supuesto, un ánodo y un cátodo.
Las membranas homopolares que pueden utilizarse
en el ámbito de la presente invención, se dividen en dos grandes
familias, según su forma de fabricación.
Así, de este modo, se pueden emplear membranas
heterogéneas, preparadas a partir de resinas intercambiadoras de
iones, mezcladas a un ligante tal como el poli(cloruro de
vinilo), el polietileno, u otros. El conjunto de este modo formado,
puede inducir una trama, como por ejemplo un tejido de poliéster, o
de poliacrilonitrilo.
Se pueden igualmente utilizar membranas
homogéneas, obtenidas mediante la introducción de un grupo funcional
sobre un soporte inerte, mediante injerto químico o radioquímico. El
procedimiento químico más utilizado, consiste generalmente en
funcionalizar un látex de un polímero que comporta núcleos
aromáticos, tales como los correspondientes a estireno /
divinilbenceno o estireno / butadieno. El látex de esta forma
funcionalizado, puede servir, a continuación, a inducir una trama
como para las mezclas heterogéneas. El procedimiento radioquímico,
comporta generalmente el injerto, bajo la influencia de una
radiación, de un compuesto aromático, tal como el estireno, sobre un
soporte inerte, como una hoja de polietileno o de
politetrafluoroetileno. El núcleo aromático, se funcionaliza, a
continuación, como en el procedimiento químico.
Las membranas intercambiadoras de cationes,
comportan grupos ácidos fuertes, lo mas a menudo, grupos sulfonatos,
o grupos ácidos débiles, a menudo, grupos carboxilatos. Más
raramente, los grupos ácidos, pueden ser grupos PO_{3}^{2-},
HPO_{2}^{-}, AsO_{3}^{2-}, SeO_{3}^{-}.
Las membranas intercambiadoras de aniónes,
comportan grupos básicos fuertes, lo más a menudo, grupos de amonio
cuaternario, o grupos básicos débiles, lo más a menudo, grupos
aminas, Más raramente, los grupos básicos, pueden ser grupos de
fosfónio cuaternario o a grupos de sulfónio.
\newpage
En el presente procedimiento, las membranas
catiónicas, comportan, de una forma preferente, grupos ácidos
fuertes y, entre éstos, de una forma preferente, grupos sulfonatos,
y las membranas aniónicas, comportan, de una forma preferente,
grupos básicos fuertes y, entre éstos, grupos de amonio
cuaternario.
Las membranas bipolares, son un conjunto de dos
membranas, la una catiónica, y la otra aniónica. Cuando la membrana
se somete a un campo eléctrico suficiente, el agua de solvatación en
la interfase de la membrana, se disocia en iones H^{+} y OH^{-},
que migran, respectivamente, hacia el cátodo, atravesando la cara o
fase catiónica, y hacia el ánodo, atravesando la cara o fase
aniónica. Como membranas bipolares, se pueden citar, a título de
ejemplo, las membranas comercializadas por parte de las sociedades
Aqualytics, Tokuyama Soda o FuMaTech.
El ánodo del electrodializador, puede estar
constituido por dos materiales clásicamente utilizados en
electrodiálisis, por ejemplo, grafito, níquel, o titanio, revestido
mediante metales preciosos u óxidos de metales preciosos,
principalmente, de titanio platinado. El cátodo, puede igualmente
estar constituido por materiales clásicamente utilizados en
electrodiálisis, por ejemplo, grafito, acero inoxidable, o
níquel.
El electrodializador, se alimenta con la solución
acuosa a tratar. Es igualmente necesario el hacer circular, en el
ánodo, una solución de un anolíto y, en el cátodo, una solución de
un catolíto. Se puede igualmente emplear una solución única de un
electrolito. En el presente procedimiento, es ventoso el utilizar un
circuito único de electrolito. El rol interpretativo de la solución
de electrolito, es la de asegurar una conductividad suficiente. De
una forma preferente, esta conductividad, será igual o superior a un
valor de 20 milisiemens por centímetro (mS/cm), sin que, éste límite
inferior, deba considerase como crítico para la aplicación del
procedimiento.
El electrolito puesto en ejecución, es un
compuesto iónizable tal como una sal, un ácido o una base. El
electrolito, se elige, de una forma preferente, entre los compuestos
no electroactivos. Así, por ejemplo, es preferible el utilizar sales
neutras, como los sulfatos, ácidos como el ácido sulfúrico, bases
como la sosa.
Las densidades de la corriente aplicada, son, de
una forma general, de un valor comprendido dentro de unos márgenes
situados entre 0,2 y 1,5 kA/m^{2} y, de una forma preferible, de
un valor comprendido dentro de unos márgenes situados entre 0,5 y 1
kA/m^{2}.
La temperatura a la cual se pone en ejecución el
procedimiento de la invención, se sitúa dentro de unos márgenes
correspondientes a unos valores compatibles con la estabilidad de
las membranas. Se opera, de una forma preferente, a una temperatura
comprendida dentro de unos márgenes situados entre 30 y 60ºC.
El electrodializador, puede funcionar de
diferentes formas. Éste puede funcionar, en primer lugar, en
continuo, atravesando la solución a tratar, al apilamiento, en
continuo; se disponen, entonces, varios niveles o zonas en serie, si
el tratamiento a obtener lo exige. Éste puede también funcionar en
discontinuo, recirculando, la solución a tratar, sobre un depósito,
hasta que se haya obtenido el tratamiento obtenido. Finalmente, éste
puede funcionar en paso directo, con recirculación parcial.
Según la primera variable de la invención, la
disociación de la sal de amonio en ácido
2-hidroxi-4-(metiltio)butanóico,
y en amoníaco, puede hacerse en una célula de electrodiálisis, de
membranas bipolares, de tres compartimientos, tal como la que se
representa esquemáticamente en la figura 1 A.
Un aparato de electrodiálisis apropiado para la
puesta en ejecución del procedimiento, está constituido por
diferentes compartimientos, delimitados, respectivamente, por
membranas catiónicas (MC), membranas bipolares (MB) y membranas
aniónicas (MA). Estos compartimientos, se dividen en compartimientos
sal (S), los cuales se empobrecen en compuestos a separar, en
compartimientos base (B) y ácido (A), en donde se concentran,
respectivamente, el ácido y la base regeneradas a partir de la
sal.
La sal de amonio, se introduce en el
compartimiento sal. Bajo la acción del campo eléctrico, el ión
amonio, migra hacia el cátodo, saliendo del compartimiento (S), en
donde éste se encuentra, a través de una membrana intercambiadora de
cationes (marbrana catiónica), y se combina con los iones OH^{-},
procedente de la cara o fase aniónica de la membrana bipolar, en el
seno de la cual, se efectúa la disociación del agua, bajo el efecto
de la carga eléctrica.
Simultáneamente, los iones carboxilato
(2-hidroxi-4-(metiltio)butanoato,
migran hacia el ánodo, saliendo del compartimiento (S), en donde
éstos se encuentran, a través de una membrana intercambiadora de
aniones (membrana aniónica). Después del paso al interior del
compartimiento (A) siguiente, éstos se protonizan mediante el aporte
de iones H^{+}, procedentes del cara o fase catiónica de la
membrana bipolar. Los tres compartimientos (B), (A), (S), contiguos,
forman una célula de electrodiálisis.
En una segunda variante de la invención, la
regeneración del ácido
2-hidroxi-4-(metiltio)butanóico,
puede hacerse en una célula de electrodiálisis de membranas
bipolares, de dos compartimientos, tal como la que se representa en
la figura 1B. Estos dos compartimientos, se encuentran delimitados,
respectivamente, mediante membranas catiónicas y membranas
bipolares. Estos compartimientos, se dividen en compartimento (S/A)
y base (B).
La sal de amonio, se introduce en el
compartimiento sal / ácido. Bajo la acción del campo eléctrico, el
ión amonio, migra hacia el cátodo, saliendo del compartimiento
(S/A), en donde éste se encuentra, a través de una membrana
intercambiadora de iones OH^{-}, procedente de la cara o fase
aniónica de la membrana bipolar, en el seno de la cual se efectúa la
disociación del agua, bajo el efecto del campo eléctrico.
Simultáneamente, el compartimiento S/A, se
acidifica mediante el aporte de los iones H^{+}, procedentes de la
cara o fase catiónica de la membrana bipolar. Los dos
compartimientos (B) y (S/A), contiguos, forman una célula de
electrodiálisis.
Esta configuración, presenta la ventaja de un
mínimo consumo energético, y permite el hacer variar la relación
sal / ácido deseada.
Para obtener un buen funcionamiento del
electrodializador, la conductividad eléctrica del compartimiento de
base (el mismo que el del compartimiento ácido en el caso de la
configuración de tres compartimientos), debe ser suficiente y puede
ajustarse mediante la ayuda de un soporte de electrodiálisis. Así,
de esta forma, la conducitividad de la solución de amoníaco, puede
aumentarse mediante la ayuda de una sal de amonio, como el sulfato
de amonio.
En una variante preferida de la invención, se
utiliza el
2-hidroxi-4-metiltiobutanoato
de amonio.
En una forma de realización particular previsible
en el ámbito de la presente invención, se introduce, en el
compartimiento de sal de una célula de electrodiálisis de tres
compartimentos, una mezcla de sal de amonio del ácido
2-hidroxi-4-metiltiobutírico
y el
2-hidroxi-4-metilbutironitrilo.
La sal, se disociará tal y como precedentemente, en
2-hidroxi-4-mtiltiobutirato,
y migrará o se transformará en ácido
2-hidroxi-4-metiltiobutírico,
el ión amonio, migrará hacia el cátodo, en donde éste se
transformará en amoníaco, en el compartimiento de sal subsistirá el
agua y el
2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo
no transformado, se reciclará hacia la columna de hidrólisis.
Mediante el procedimiento por calentamiento, se
recupera el ácido, procediendo a desplazar el equilibrio sal de
amonio, ácido libre, calentando la solución acuosa rica en HMTBS y
trasegando el amoníaco de esta forma liberado. Puede llegarse a este
resultado, calentando, bajo la acción del vacío, o a presión
atmosférica, con tratamiento de agotamiento o sin él. Con objeto de
facilitar el desplazamiento del equilibrio, puede preverse el empleo
de CO_{2} bajo presión. Se obtiene, de esta forma, una mezcla de
HMBTS y de HMTBA, a razón de una tasa comprendida dentro de unos
márgenes que van del 5 al 99,9% de HMTBA y, de una forma preferible,
a una tasa comprendida dentro de unos márgenes que van del 10 al 50%
de HMBTA, con relación a la suma de HMTBS y HMTBS. La viscosidad de
estas soluciones, se encuentra comprendida dentro de unos márgenes
situados entre 1200 y 30 mm^{2} \cdot s^{-1} (1200 y 30 cSt)
y, de una forma preferente, dentro de unos márgenes situados entre
200 y 50 mm^{2} \cdot s^{-1} (200 y 50 cST) a 25ºC.
Las soluciones acuosas, pueden descompensarse
mediante extracción del ácido, con la utilización de productos
disolventes, parcialmente miscibles, o no, con agua. Existe un gran
número de disolventes posibles para la separación. Los disolventes
preferidos, son las cetonas de C5 a C8, de una forma particular, la
metilisobutilcetona; los éteres como el isopropiléter; los acoholes
como el isopropanol; los ésteres; la aminas terciarias como la
trioctilamina. En el ámbito de la invención, los disolventes
preferidos, son: la acetona, la MIBK, el isopropanol, el acetato de
isopropilo, el éter isobutílico o propílico o el THF, la
trioctilamina. La relación de la fase acuosa y de la fase orgánica,
no es crítica. Mientras tanto, por razones de grado de eficiencia,
no debe descenderse por debajo de una relación mínima de 1/1 y, por
razones de rentabilidad, no ir más allá de una relación de 1/3. Se
prefiere una relación 1 / 1,5 a 2,0.
La extracción, puede realizarse en forma de lotes
(batch), o en continuo, mediante cualquier tipo de tecnología de
extracción líquido - líquido. Se pueden citar, por ejemplo, la
cascada de mezcladores decantadores a co- o a
contra-corriente, los extractores centrífugos, las
colonias guarnecidas o de placas, etc.
La solución acuosa, empobrecida en ácido libre,
puede tratarse de nuevo y, tantas veces como se desee, hasta el
agotamiento completo del amoníaco, en caso de que se desee.
La fase orgánica, se somete a un tratamiento para
aislar el HMTBA. Esto se realiza, de una forma preferente, mediante
evaporación del disolvente, o mediante una extracción al agua
caliente. Con objeto de evitar una eventual deterioración del HMTBA,
se podrá mantener la solicitación térmica, tan reducida como
posible, mediante la aplicación de vacío.
En estos dos procedimientos de disociación de la
sal de amonio, se genera una solución acuosa de amoníaco. Ésta
última, puede tratarse, con el fin de concentrar el amoníaco. Se
preferirá la destilación y la concentración de amoníaco, en una o
varias etapas, con o sin presión. Puede preverse una etapa previa de
agotamiento. La solución concentrada de amoníaco, puede reenviarse a
la síntesis del ácido cianhídrico, el cual entra en juego, en la
síntesis del
2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo.
En una quinta etapa, se procede a concentrar la
solución acuosa de HMTBS y / o de ácido libre. Esto se realiza, de
una forma preferible, mediante la evaporación de agua.
La invención, tiene igualmente como objeto, una
instalación para la puesta en ejecución del procedimiento según la
invención. Una instalación de este tipo, se ilustra esquemáticamente
en la figura 2, y comprende los conductos 1,2, destinados a
introducir, respectivamente, la cianhidrina del AMTP, y el agua, en
el reactor 3. El reactor 3, es un lecho fijo de recirculación, el
cual se encuentra provisto de las cepas o enzimas inmovilizadas. Una
parte de la solución, se trasiega del reactor 3 y se envía a un
reactor de acabado 4. El reactor de acabado 4, es del tipo de lecho
fijo, provisto de las cepas o enzimas inmovilizadas. Una solución
concentrada en HMBTS, se recupera, a continuación, en la salida del
reactor 4, vía el conducto 5.
Esta solución concentrada en HMBTS, puede seguir
dos tratamientos totalmente independientes, según el tipo de
producto pretendido.
Si se desea recuperar un producto que contiene
una fuerte proporción de HMTBS, la solución del conducto 5, se
conduce al interior de un evaporador 6, el cual permite concentrar
el producto, y se recupera, en el conducto 8, una solución
concentrada principalmente del HMBTS y que contiene un poco de ácido
libre. El agua en exceso, así como una fracción del amoníaco, se
evacuan mediante el conducto 7.
Si se desea recuperar un producto que contiene
una fuerte proporción de ácido libre, la solución concentrada de
HMTBS del conducto 5, se conduce al interior de un sistema de
electrodiálisis bipolar 9. En este aparato, el amoníaco, se separa
más o menos, del ácido, mediante electrodiálisis. La mezcla,
empobrecida en amonio, se recupera en el conducto 11 y, a
continuación, se concentra en el evaporador 12, con el fin de
obtener una solución concentrada compuesta principalmente de ácido
libre, que contiene poco HMTBS, o nada en absoluto. La solución rica
en amoníaco, se trasiega, mediante el conducto 10. El amoníaco, se
recupera, por agotamiento 15.
Este efluente de amoníaco, puede concentrarse
mediante destilación 16, de agua, y recuperarse en 18. La solución
de amoníaco concentrado 17, puede retornarse a la síntesis del
HCN.
Los ejemplos que se presentan a continuación,
ilustran la invención.
Se procedió a purificar la nitrilasa en cuatro
etapas. El resumen de la purificación, se proporciona en la tabla
1.
Las células de Alcaligenes faecalis, se cultivan
durante un transcurso de tiempo de 24 horas, a una temperatura de
30ºC, en un medio mínimo, en presencia de benzonitrilo (0,5 g / l).
Después de la centrifugación del cultivo, la torta residual, se
recoge en un tampón TG (25 mM, Tris-HCl, 10% (peso /
volumen) glicerol, pH 7,5. La suspensión celular, se trata con
ultrasonidos y, a continuación, se centrifuga, con el fin de obtener
el extracto bruto. El extracto bruto, se trata, a continuación, con
sulfato de amonio, hasta un 30% de la saturación. El precipitado
obtenido, se vuelve a suspender en el tampón TG y, a continuación,
se dializa contra 2 litros del mismo tampón, durante el transcurso
de tiempo de una noche. La solución obtenida, se deposita, a
continuación, sobre una columna intercambiadora de aniones del tipo
Q Sepharose Fast Flow HR 26 / 10, previamente equilibrada con tampón
TG. La actividad, se eluye, a continuación, con un gradiente de 0 a
1 M NaCl. Las fracciones activas, se depositan, a continuación,
sobre una columna intercambiadora de aniones del tipo Mono Q HR 5/5,
previamente equilibrada con tampón TG. La nitrilasa, se eluye con la
ayuda de un gradiente de 0 a 1 M NaCL. Para finalizar, las
fracciones que contienen la actividad, se reúnen, la concentración
en sulfato de amonio se conduce, a continuación, a un valor 1 M.
Esta solución, se deposita entonces sobre una columna de
interacciones hidrófobas del tipo Phenyl Superose HR 5/5,
previamente equilibrada con tampón TG, adicionado con 1 M
(NH_{4})_{2}SO_{4}. La actividad, se eluye, a
continuación, mediante un gradiente de 1 M a 0 M en sulfato de
amonio.
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(Tabla pasa a página
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Condiciones operativas: [nitrilo] 50 mM; tampón
fosfato 100 mM pH 7,0; 30ºC.
Los pesos moleculares de la proteína, se
determinan mediante filtración en gel. Éste es de aproximadamente
260kDa. Sobre gel de SDS-PAGE, se observa una única
banda de 43 kDa (pureza del 95%). Es, por lo tanto, probablemente,
una proteína de estructura \alpha, que pesa 43 kDa.
La secuencia NH2 presentada en el ejemplo 1,
presenta una indentidad total con la secuencia del extremo
N-terminal de la nitrilasa de A. faecalis JM3
(Kobayashi y colegas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90:247-251), mientras que, las extremidades
N-terminales de las nitrilasas bacterianas,
presentan de un 35 a un 57% de la identidad sobre 14 residuos. Los
inventores, han emitido la hipótesis de que, la nitrilasa de la
invención, purificada a partir de la cepa ATCC8750, era parecida a
la descrita por parte de kobayashi y colegas (anteriormente citada).
La estrategia de clonación, ha consistido, entonces, en amplificar,
por reacción de PCR, sobre el ADN genómico, de la cepa ATCC8750, el
género de esta nitrilasa, con la ayuda de dos sondas nucleotídicas
determinadas a partir de la secuencia dada por Kobayashi y colegas
(anteriormente citada).
La dos sondas, se sintetizaron, pudiéndose una de
ellas hibridar con la parte 5' de la secuencia dada por Kobayashi y
colegas (anteriormente citada) y, la otra, con la parte 3':
Parte 5' (PCRAF1):
CCGGGAATTCATATGCAGACAAGAAAAATCGTCC
Parte 3' (PCRAF2): TCCTTCTGCGTCCCCGATCCCGCAT
El cebador PCRAF1, comporta 12 nucleótidos en 5',
que permiten introducir, aguas arriba del codón de iniciación ATG,
los sitios de restricción de las enzimas EcoRI de Ndel. El cebador
PCRAF2, permite introducir el sitio de la restricción de la enzima
BamHI. El ADN genómico de la cepa A. faecalis ATCC8750, se
extrajo según el protocolo de CTAB, descrito por parte de Ausubel y
colegas (Current Protocols in Molecular Biology, - Protocoles
actuales en biología molecular, - John Willey & Sons Inc. Ed.
2,4,1-2.4.5) y 100 ng, se utilizaron para cada
reacción de PCR. Con el fin de jugar sobre la especificidad de
amplificación, se procedió a someter a test de ensayo, diferentes
concentraciones de MgCl_{2}, tal como se indica en la obra de
Ausubel y colegas (anteriormente citado), en un volumen total de
muestra de 100 \mul y con 2,5 unidades de Taq DNA polimeresa
(Perkin Elmer). Se realizaron dos reacciones suplementarias, con 1,5
mM MgCl_{2} y 5% DMSO o 5% formamida. Se programó un termociclador
Perking Elmer 9600, con la siguiente programa de coordinación: 5
minutos a 95ºC, 30 ciclos (30 segundos a 95ºC), 30 segundos a
55ºC, 45 segundos a 55ºC, 45 segundos a 72ºC y, 4 minutos a 72ºC.
Los diferentes productos de amplificación, se determinaron sobre gel
de agarosa 0,8%. Una banda mayoritaria, cuya talla correspondía al
tamaño esperado, de 1,15 kb, se amplificó en todas las reacciones,
pero, más específicamente, con 1,5 mM MgCl_{2} y 5% DMSO. Se
retuvieron, a continuación, los productos de la reacción, en estas
condiciones. La muestra, se trató con proteinasa K, precipitada con
etanol, después de una extracción fenol-cloroformo.
La torta residual vuelta a poner en suspensión, se incubó, durante
un transcurso se tiempo de 2 horas, a una temperatura de 37ºC, con
40 unidades de enzima EcoRI y 40 unidades de enzima BamH1. Después
de migración sobre gel de agarosa 0,7%, la banda de 1,15 kb, se
cortó y se extrajo, para clonarse en el vector pBSK^{-}
(Stratagene, La Jolla Usa), abriéndose,
EcoRI-BamHI, mediante procedimientos clásicos.
Cinco clones independientes, denominados pRPA - BCAT 1 a 5, se
analizaron por digestión enzimática del ADN plasmídico, con las
enzimas Ndel, EcoRI, BamHI, BspMI y Bg/II (figura 3). Los perfiles
obtenidos, correspondían a los perfiles de restricción teórica de un
plásmido obtenido por este método, con la secuencia descrita por
Kobayashi y colegas (anteriormente citada). La cepa XL1 Blue
(pRPA-BCAT3), se depositó en la CBS, bajo el
número
CBS 998-96.
CBS 998-96.
El inserto clonado en el plásmido
pRPA-BCAT3, se secuenció por la firma Génome Express
S.A. (Grenoble, Francia), a partir de una preparación de ADN
realizada en el laboratorio (kit Witzzard Midi-prep,
Promega). La estrategia de secuenciación de este fragmento,
realizada según procedimientos clásicos conocidos por parte de la
persona especializada den este arte de la técnica, se indica en la
figura 4. Los diez nucleótidos internos (indetificados por los
números 623 a 629 y 681 a 682, en fa figura 4), se sintetizaron
según la secuencia de la nitrilasa de A faecalis JM3 (Kobayashi y
colegas, anteriormente citada). Este conjunto, se completó mediante
los cebadores universales "Reverse" y "M13 Forward". Cada
región, se iluminó por lo menos una vez, sobre cada hebra del
ADM.
La secuencia de ADN, obtenida, presenta dos
diferencias, con relación a la secuencia publicada: la una, en la
estructura supuesta como sirviendo de terminador de transcripición
y, la otra, en el gen de la nitrilasa, denominado nitB, que conduce
a la sustitución Asn^{127} -> Asp. Estas dos regiones, se
secuenciaron, entonces, en el laboratorio, sobre los plásmidos
pRPA-BCAT1, 2, 4, 5, con dos cebadores específicos
710 y 682 (véase la figura 4). El cambio C->T a la posición 1412
(en conformidad con la numeración de Kobayashi, anteriormente
citada), en el terminador, se encontró en todos los clones. Se trata
de una mutación que diferencia las dos cepas de A. faecalis. El
cambio A->G a la posición 1138, no se encuentra presente más que
en el plásmido pRPA-BCAT3. Se trata, por lo tanto,
de una mutación introducida en el momento de la PCR, mediante la Taq
DNA Polimerasa.
Con el fin de confirmar la identificación de la
secuencia de ADN clonada con el gen de la nitrilasa purificada, el
gen nitB, se emplazó sobre el control del promotor del gen \Phi
phago T7 (PT7), según el modo operativo descrito a continuación:
los insertos Ndel-BamHI de 1,13 -kb de los plásmidos
pRPA-BCAT3 y pRPA-BCAT4, se clonaron
en el vector pXL2432, para proporcionar, respectivamente, los
vectores pRPA-BCAT12 y pRPA-BCAT13,
descritos en la figura 5. El vector, pariente, pXL2432, es un
híbrido entre la región del plásmido pET9 (Studier y colegas, 1990,
Methods in Enzymol, 185, 60 - 89), comprendida entre los sitios ACCI
y Eco RI, que engloba el origen de la replicación (ORI) y el
marcador de selección, portador de la resistencia a la kanamicina
(Kan), y la región comprendida entre los sitios EcoRI y AccI del
plásmido pET11a (Nogagen Inc., Madison WI, USA), que engloba la
casete de expresión, el gen del represor IacI y el gen del regulador
del número de copias ROP.
Los cultivos, se realizaron en condición de
inducción, según el modo operativo que se facilita a continuación:
La cepa BL21(DE3) (Novogen Inc., Madison WI, USA), que
contiene el plásmido pRPA-BCAT12, la cepa
BL21(DE3), que contiene el plásmido
pRAP-BACT13, así como la cepa BL21(DE3), que
contiene el plásmido pXL2432, se cultivaron durante un transcurso de
tiempo de 16 horas en medio LB, a una temperatura de 37ºC (Miller,
1972, Expermiments in Molecular Genetics, - Experimentos en
Genética Molecular-, Cold Springer Harbor Laboratory, Cold Springer
Harbor, N.Y.), con un contenido de 50 \mug/ml de kanamicina y, a
continuación, se diluyeron a un valor de 100^{ma} (una centésima
parte), en el mismo medio y a la misma temperatura. Cuando los
cultivos alcanzaron una DO600, comprendida dentro de unos márgenes
situados entre 0,5 y 1, se añadió IPTG, a la concentración final de
1 mmM. Después de un transcurso de tiempo de 6 horas de cultivo, se
procedió a recolectar las bacterias. Se adoptó un modo operativo
similar, para cultivar la cepa BL21(DE3) que contenía los
plásmidos pRPA-BCAT12 y pXL2231, la cepa
BL21(DE3) que contenía los plásmidos
pRPA-BCA13 y pXL2231, así como la cepa
BL21(DE3) que contenía los plásmidos pXL2432 y pXL2231,
añadiendo tetraciclina, al medio de cultivo, a razón de 12 \mug/ml
de medio. El plásmido pXL2231, el cual deriva del vector pxL1635
(Solicitud de patente francesa FR 90/05185 del 24/04/1990),
pertenece al grupo de incompatibilidad IncP, y es por lo tanto
compatible con los plásmidos pRPA-BCAT12 y 13, los
cuales poseen el origen de replicación del plásmido ColE1. Su
marcador de selección, es la resistencia a la tetraciclina, y éste
porta un fragmento EcoRI, HinIII de 2,2 kb, que contiene los genes
GroES y GroEL, que codifican para las caperuzas moleculares de E.
coli (Fayet y colegas, 1986, Mol. Gen. Genet. 202:
435-445).
La expresión de la nitrilasa, se analizó en gel
10% SDS-PA, en la fracción bruta, después de
sonificación de las células y, después de la centrifugación, en la
torta residual, y en el sobrenadante. Los resultados, se presentan
en la figura 6, y muestran un nivel elevado de expresión de la
nitrilasa (NitB), en los extractos de células, en donde, uno de los
plásmidos, contiene por lo menos el inserto nitB; de todos modos,
esta proteína, se encuentra esencialmente en forma de insoluble, si
bien la presencia del plásmido pXL2231, permite aumentar la cantidad
de polipéptido nitrilásico, en la fracción soluble.
Sobre la figura 6, M representa un marcador de
pesos moleculares; éstos se indican en kDa. Por otra parte, las
pistas, tienen los significados que se facilitan a continuación:
- A, D, G, representan las fracciones brutas,
respectivamente de BL21(DE3) +
p/RPA-BCAT12/RPA-BCAT13/XL
2232;
2232;
- B, E, H, representan los sobrenadantes
obtenidos respectivamente a partir de estas mismas cepas;
- C, F, I, representan las tortas residuales
obtenidas respectivamente a partir de estas mismas cepas;
- J, N, Q, representan las fracciones brutas
obtenidas respectivamente a partir de BL21(DE3) + pXL2231 +
p/RPA-BCAT12/RPA-BCAT13/XL2232;
- K, O, R, representan los sobrenadantes
obtenidos respectivamente a partir de estas cepas;
- L, P, S, representan las tortas residuales
obtenidas respectivamente a partir de estas cepas.
La cepa BL21(DE3) /
p/RPA-BCAT12 + pXL2231, se denominó
RPA-BIOCAT 126. La cepa BL21(DE3) /
p/RPA-BCAT13 + pXL2231, se denominó
RPA-BIOCAT 127. La actividad nitrilasa de los
cultivos de RPA-BIOCAT126,
RPA-BIOCAT 127, y RPA-BIOCAT 66, que
corresponde a BL21(DE3) / pXL2432, se determinaron de la
forma que sigue: los cultivos, se condujeron según el protocolo
descrito anteriormente, arriba, procediendo a modificar el volumen
de cultivo (50 ml) y la concentración final de IPTG (0,1 mM). Los
cultivos, se centrifugaron y, las tortas residuales celulares, se
recogieron en 10 ml de tampón fosfato de potasio 100 mM pH 7. La
hidrólisis del HMTBN, se realizó con 500 \mul de esta suspensión
añadida a 500 \mul de solución HMTBN 200 mM pH 7. Se obtuvo una
cinética de hidrólisis, procediendo a mezclar 10 \mul de esta
mezcla a 900 \mul de ácido fosfórico 0,1 N, a intervalos
regulares, durante un transcurso de tiempo de 1 a 4 horas. Las
cantidades de HMTBA producido, se analizaron mediante HPLC, tal y
como de describe en la solicitud de patente internacional WO 96 /
09403. Los resultados, se recopilan en la tabla 2.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
| RPA-BIOCAT | Medio | Inducción | Tiempo de cultivo | 0D660 | Actividad (U) |
| 66 | LB Km | 0,1 mM IPTG | 24 h | 2,5 | 0 |
| 126 | LB Km Tc | 0,1 mM IPTG | 24 h | 2,4 | 15 |
| 127 | LB Km Tc | 0,1 mM IPTG | 24 h | 1,9 | 10 |
| Abreviaciones: | |||||
| Km : \; Kanamicina 60 \mug/ml | |||||
| Tc : \; Tetraclina 12 \mug/ml | |||||
| h : \; \; horas | |||||
| U : \; \; kg de HMTBA formado por hora y por kg de peso seco. |
Con el fin de mejorar la solubilización del
polipéptido nitrilásico expresado, el plásmido
pRPA-BCAT37, se construyó tal y como se describe
posteriormente, a continuación. El plásmido pXL2391, se obtuvo
procediendo a ligar el fragmento de 5,9 kb
EcoRI-PvuII del plásmido pDSK591 (Keen y colegas,
1988, Gene 70: 191-197), tratado con la polimerasa
Klenow, con el fragmento Hindi de 2056 bp, extraído del plásmido
pHP45\OmegaSp (Prentki y Krisch, 1984, Gene 29:
303-313), tratado con Nucleasa Mung Bean. El
plásmido pXL2391, se digirió, a continuación, mediante SmaI y SacI,
y se introdujo el inserto de 2,3 kb, que porta el operón GroESL,
extraído del plásmido pXL2231, digerido mediante HinKK, tratado con
Klenow, y digerido mediante SacI. El plásmido,
pRPA-BACAT 37, es por lo tanto un derivado del
plásmido RSF-1010, de un mayor número de copias que
el plásmido pX2231, compatible con los plásmidos portadores del
origen CoIE1, y que portan un marcador de resistencia de
estreptomicina. Este plásmido, se introdujo en la capa
BL21(DE3) / pRPA-BCAT12, para proporcionar la
cepa RPA-BIOCAT 171. Se procedió a determinar la
actividad de un cultivo conducido según una forma de cultivo similar
a la descrita anteriormente, arriba, pero reemplazando la
tetraciclina por la estreptomicina, a 100 \mug/ml, y ésta, se
recopila en la tabla 3.
| RPA-BIOCAT | Medio | Inducción | Tiempo de cultivo | 0D660 | Actividad (U) |
| 171 | LB Km Sm | 0,1 mM IPTG | 24 h | 3,2 | 14 |
| Abreviaciones: | |||||
| Km : \; Kanamicina 50 \mug/ml | |||||
| Sm : \; Estreptomicina 100 \mug/ml | |||||
| h : \; \; horas | |||||
| U : \; \; kg de HMTBA formado por hora y por kg de peso seco. |
Se procedió a construir el plásmido
pRPA-BCAT6, clonando sobre pBACT3 (véase la figura
3), el fragmento de 0,6 kb Scal-Ndel de pXL2158,
que contenía el promotor Ptrp y el sitio de fijación del ribosoma
RBScII (Levy-Schill y colegas, 1995, Gene 161:
15-20). La expresión, se realizó con la cepa
DH5alpha, que contenía el plásmido pRPA-BCAT6 y / o
el plásmido pXL2035 (Levy-Schill y colegas,
anteriormente citado, arriba), mediante el modo operativo siguiente:
el precultivo, se incubó, durante un transcurso de tiempo de 16 h, a
una temperatura de 37ºC, en medio M9 glucosa (Miller, J. H. 1972,
Experiments in Molecular Genetics, - Experimentos en Genética
Molecular -, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
N.Y.), con un contenido de un 0,4% de casaminoácidos, 100 \mug/ml
de triptofano, 100 \mug/ml de carbenicilina. Para las cepas que
contenían pXL2035, se añadió kanamicina, a razón de 50 mg/l. La
expresión, se hizo después de la dilución a 1/100 de cultivo
saturado, en un medio idéntico, pero sin triptofano e incubación,
durante un transcurso de tiempo de 8 a 16 horas, a una temperatura
de 37ºC.
El análisis de SDS-PAGE de los
extractos de diferentes cepas, se realizó tal y como se describe en
el ejemplo precedente, y se presenta sobre la figura 7.
- L, I, F, C, representan las fracciones brutas
obtenidas respectivamente a partir de las cepas DH5alpha +
p/RPA-BCAT/3,/6,/6 + pXL2035,
RPA-BIOCAT76;
- K, H, E, B, representan los sobrenadantes
obtenidos respectivamente a partir de estas mismas cepas;
- J, G, D, A, representan las tortas residuales
obtenidas respectivamente a partir de estas mismas cepas.
El plásmido pRPA-BACT6, permite
obtener una débil acumulación de un polipéptido de 43 kDa,
mayoritariamente insoluble. La coexpresión de GroE a partir del
plásmido pXL2035, reduce la sobreexpresión, pero, después de tres
trasplantes sucesivos de la cepa DH5alpha
(pRPA-BCAT6 + pXL2035), la cepa
RPA-BIOCAT76 seleccionada, encuentra un nivel
inicial de expresión del polipéptido nitrilásico, siendo, éste
último, completamente soluble. Las dosificaciones de los cultivos
realizados según los modos operativos descritos anteriormente,
arriba, y en el ejemplo precedente, se presentan en la tabla 4.
| Cepa | Medio | Tiempo de | 0D660 | Actividad |
| cultivo | (U) | |||
| DH5alpha (pRPA-BCAT3) | M9 Cb | 24 h | 4 | 0 |
| DH5alpha (pRPA-BCAT6) | M9 Cb | 24 h | 4 | 0,6 |
| DH5alpha Km (pRPA-BCAT6 + pXL 2035) | M9 Cb km | 24 h | 3 | 1,6 |
| RPA-BIOCAT76 | M9 Cb km | 24 h | 3,8 | 5 |
| Abreviaciones: | ||||
| Km : \; Kanamicina 60 \mug/ml | ||||
| Cb : \; Carbenicilina 100 \mug/ml | ||||
| h : \; \; horas | ||||
| U : \; \; kg de HMTBA formado por hora y por kg de peso seco. |
Estos datos, muestran el hecho de que, la
expresión de GroE, permite mejorar la expresión de la nitrilasa y
que, una selección de la cepa clásica por trasplantes sucesivos,
contribuye, también, a la mejora de la actividad recombinante.
Para producir la nitrilasa, en la Pseudomonas
putida y A. faecalis, se utilizó el sistema de expresión
descrito en el ejemplo 5. Se procedió a introducir el fragmento de
1,14 kb de NdeIl-XbaI de pRPA-Bact6,
que contenía el gen nitB, en los sitios NdeI-XbaI
del vector pXL1289. El vector pXL1289, es un derivado de pKT230
(Bagdasarian y colegas, 1981, Gene 15; 237-247) que
porta el origen de replicación (oriV)
multi-huésped, en las bacterias
Gram-negativas y que contiene un fragmento
EcoRI-NdeI de 120 bp portador del promotor Ptrp y
del RBScII de pXL534 (Latta y colegas, 1990, DNA T Cell Biology, 9:
129-137), un inserto Ndel-Xbal
codificante para el gen cobA (Crouzet y colegas, 1990, J. Bacteriol.
172:59689-5979) y un inserto
Xbal-BamHI de 500 bp, que contiene el terminador
TrmB de pXl534 (Latta y colegas, 1990, DNA T cell Biology, 9:
129-137). El plásmido obtenido
pRPA-BCAT14, es por lo tanto un derivado de pKT230,
que contiene un gen que confiere la resistencia a la kanamicina
(Kan) y el gen nitB, bajo el control de Ptrp:RBScII (figura 8).
En el momento de la introducción de este plásmido
en la cepa de E. coli DH5alpha, se seleccionó un clon
particular: éste expresaba una nitrilasa, cuyo peso molecular, sobre
gel SDS-PA, es de 44 kDa, en lugar de 43 kDa. El
plásmido hospedado por el clon, presenta el mismo perfil de
restricción que el pRPA-BACT14, y se denominó
pRPA-BCAT24. Finalmente, se construyó el plásmido
pRPA-BACT-23, según el mismo modo
operativo que el utilizado para pRPA-BACT14, pero
con la siguiente modificación: el fragmento de 136 pb
StuI-BsmI de pRPA-BACT6, se
reemplazó por el fragmento StuI-BsmI, de
pRPA-CAT4. El plásmido pRPA-BACT23,
expresa, por lo tanto, una nitrilasa NitB, con un residuo Asn en la
posición 279.
Se procedió a introducir los plásmidos
pRPA-Bact-14, 23 y 24, mediante
electroporación, en la cepa Pseudomonas putida G2081. La cepa G2081,
se deriva de la cepa KT2440 (Bagdasarian y Timmis, 1981, en
Hofschneid y Goebel, Topics in Microbiology and Immunology, -
Tópicos en Microbiología e Inmunología -, 47, Springer Verlag,
Berlin), mediante selección de la resistencia espontánea al ácido
nalidíxico, y a la rifampicina. Como plásmido de control, se utilizó
el vector pK230.
Los plásmidos pRPA-BCAT14,
pRPA-BCAT23, pRPA-BCAT24 y pK230, se
extrajeron, entonces, de la cepas de P. putida, para introducirse,
mediante electroporación, en la cepa de A. faecalis ATCC8750 (=
RPA-BIOCat1).
Las cepas G2081 (pRPA-BCAT14),
G2081 (pRPA-BCAT23), G2081
(pRPA-BCAT24), G2081 (pK230) y
RPA-BIOCAT1 (pRPA-BCAT14),
RPA-BIOCAT1 (pRPA-BCAT23),
RPA-BIOCAT1 (pRPA-BCAT24),
RPA-BIOCAT1 (pKT230), se cultivaron, durante el
transcurso de toda la noche, a una temperatura de 30ºC, en medio LB,
que contenía 50 mg/l de Kanamicina. Estos precultivos, se diluyeron
a 1/100, en medio M9, que contenía 50 mg/l de kanamicina, y se
incubaron, durante un transcurso de tiempo de 20 horas, a una
temperatura de 30ºC.
Después de sonificación de la células, se
procedió a medir la expresión de la nitrilasa, sobre un gel 10%
SDS-PA, en la fracción bruta, después de
sonificación de las células, y después de centrifugación en la torta
residual y en el sobrenadante. Los resultados, se presentan en la
figura 9. Para las cepas RPA-BIOCAT1 (pKT230) y
G2081 (pK230), solamente se depositaron los extractos brutos (pistas
A e I, respectivamente). En esta figura, M, representa el marcador
de pesos moleculares: éstos se indican en kDa. Por otra parte, las
pistas, tienen los significados que se facilitan a continuación:
- B, D, F, representan las fracciones brutas
obtenidas respectivamente a partir de las cepas y
RPA-BIOCAT1 (pRPA-BCAT14),
RPA-BIOCAT1 (pRPA-BCAT23),
RPA-BIOCAT1 (pRPA-BCAT24);
- C, E, G, representan los sobrenadantes
obtenidos respectivamente a partir de estas mismas cepas;
- H, representa la torta residual obtenida a
partir de RPA-BIOCAT1
(pRPA-BCAT24);
- J, L, O, representan las fracciones brutas
obtenidas respectivamente a partir de las cepas G2081
(pRPA-BCAT14), G20081 (pRPA-BCAT23),
G20181 (pRPA-BCAT24);
- K, N, P, representan los sobrenadantes
obtenidos respectivamente a partir de estas mismas cepas;
- Q, representa la torta residuales obtenida a
partir de G20081 (pRPA-BCAT24).
Esta experiencia, muestra el hecho de que, las
cepas de P. putida, expresan cantidades importantes de los tres
polipéptidos nitrisilásicos solubles y que, únicamente el
polipéptido nitrilásico de 44 kDa, se sobreexpresa mediante la cepa
A. faecalis. Las dosificaciones de actividad de estos cultivos,
realizados según el protocolo descrito en el ejemplo 4, muestran el
hecho de que, las cepas G2081 (pRPA-BCAT23), G20081
(pRPA-BCAT24), y RPA-BIOCAT1
(pRPA-BCAT24), tienen una actividad nitrilásica
sobre el HMTBN.
Se procedió a realizar la expresión de la
nitrilasa, en la cepa CGL 1010 (= ATCC 12752), con la ayuda de PcspB
(Peyret y colegas, 1993, Molecular Microbiol.
9:97-109). Se Amplificó un fragmento de 530 bp, que
contenía el promotor PcspB, a partir del plásmido pCGL815 (Peyret y
colegas, anteriormente citado, arriba), con la ayuda de los
cebadores KS1 y KS2 siguientes:
KS1:
5'-ACGCGTCGACCAGATCGTCAAGTTGTGG-3'
KS2:
5'-CATAGAGGCGAAGGCTCCTTG-3'
Después de la digestión mediante Sal I, el
fragmento de 530 bp amplificado, se clonó en el plásmido pBSK
(Statagene, La Jllla USA), abierta mediante Sal I, y EcoRV, para
proporcionar el plásmido pCGL1084. Se procedió a fabricar un
adaptador EcoNI y NdeI, hibridando los dos oligonucleótidos KS8 y
KS9 siguientes.
KS8:
5'-TCAAGGAGCCTTCGCCTCA-3'
KS9:
5'-TATGAGGCGAAGGCTCCTTG-3'
Se procedió a extraer el gen de la nitrilasa, del
plásmido pRPA-BCAT6, en forma de un fragmento
Ndel-Xbal de 1,1 kb. Éste se introdujo en pCGL1084,
abierto con EcoNI y Xbal, utilizando el adaptador EcoNI/NdeI,
descrito a continuación, para proporcionar el plásmido pCGL1086. El
fragmento de Sal I-BamHI de pCGL1086 que contenía
PcspB:nitB, se clonó, a continuación, en el vector pCGL482 (Peyret y
colegas, anteriormente citado, arriba), en los sitios Sal I y BamHI,
conduciendo al plásmido pCGL1087. El plásmido pCGL1087 (figura 10),
es por lo tanto un vector vehículo a base de pBI1 (Santamaría y
colegas. 1984, J. Gen. Microbiol. 130: 2237-2246),
que contenía el origen de replicación de pACYC 184, reconocido en
E. coli, un gen que confería la resistencia al cloranfelicol
(Cm) y la fusión PcspB::nitB.
Los plásmidos pCGL1087 y pCGL 482, se
introdujeron, por electroporación, en CGL 1010, tal y como se
describe por parte de Bonnamy y colegas, 1990 (FEMS Microbiol.
Lett. 66:263-270). Después de un transcurso de
tiempo de 20 horas de cultivo, a una temperatura de 30ºC, en medio
Brain Heart Infusión 3,7% (Daifco Laboratories, Detroit USA),
adicionado de cloranfelicol 5 mg/l, se realizaron actividades
nitrilasa sobre muestras de cultivo, tal y como se ha descrito en el
ejemplo 4. Los resultados obtenidos, muestran el hecho de que, la
cepa CGL 1010 (pCGL1087) posee una actividad nitrilasa, mientras
que, la cepa CG1010 (pCGL482), no la tiene.
Se procedió a realizar la expresión de la
nitrilasa, en la cepa de S. Lividans TK24 (Hopwood y colegas, 1985,
Genetic Manipulation of Streptomyces; A laboratory Manual, -
Manipulación genética de Streptomyces; un manual de laboratorio -,
The John Innes Foundation, Norwich)), con la ayuda del plásmido
plJ6021 (Talano y colegas, 1995, Gene 166; 133-137),
utilizando el promotor PtipA (Holmes y colegas, 1993, EMO J.
123:3183-3191).
El plásmido pUC19 (Yanisch-Perron
y colegas, 1985, Gene; 103-119) se modificó,
procediendo a dividir el fragmento Tfi I de 140 bp, mediante
digestión Thi I, tratamiento mediante Klenow y ligadura del vector
sobre sí mismo. El plásmido obtenido, se abrió con EcoRI y BamHI,
con el fin de clonar el fragmento de 1,15 kb
EcoRI-BamHI de pRPA-BCAT3, que
contiene el gen nitB. El plásmido obtenido pOS48.4, de esta forma
obtenido, posee un sitio único Tfi I situado entre el gen nitB y el
sitio BamHI. Este sitio, se utilizó para injerir un fragmento
\Omegahyg de 2,3 kb extraído del plásmido pHP45\Omegahyg
(Blondelet-Rouault y colegas, Gene, submitted),
después de digestión mediante BamHI y tratamiento mediante Klenow.
El fragmento \Omegahyg, contiene el género de la higromicina
fosfotransferasa (hyg), de Streptomices hygroscopicus
(Zalacain y colegas, 1986, Nucl. Acids Res., 14:
1565-1581) y confiere a S. Lividans, una resistencia
a la higromicina. El plásmido pOS48,5 de esta forma obtenido, se
utilizó para aislar un fragmento NdeI y BamHI, de 3,45 kb, que
contiene el gen de la nitrilasa, seguido del gen hyg, el cual se
clonó en el plásmido pIJ6021 (Talano y colegas, anteriormente
citado, arriba), abierto mediante NdeI y BamHI. Al no replicarse el
plásmido pIJ6021, más que en Streptomyces, la mezcla de ligación, se
transformó en S. Lividans TK24, mediante procedimientos clásicos
(Hopwood y colegas, anteriormente citado, arriba), seleccionando los
clones que resisten a 200 mg/l de higromicina (Boehringer Manheim).
Los ADN plasmídicos de estos clones, se extrajeron mediante
procedimientos clásicos (Howood y colegas, anteriormente citado,
arriba) y sus perfiles de restricción, correspondían correctamente a
la construcción esperada, la cual se denominó pOS48,7 (figura
11).
Se cultivaron dos clones de S. Lividans, que
contenían pOS48,7, así como un clon que contenía el plásmido
pKJ6021, en 50 ml de medio TSB (Trytic Soy Broth, Difco), a una
temperatura de 30ºC, durante un transcurso de tiempo de 72 horas,
con una selección de kanamicina 5 mg/l y, a continuación, se añadió
thiostrepton, a una concentración de 5 mg/l y, el cultivo, se
prolongó, todavía, durante un transcurso de tiempo de 18 horas,
según las condiciones descritas (Hopwood y colegas, anteriormente
citado, arriba). El cultivo, se recolectó y, la dosificación de
actividad, la cual se realizó en las condiciones descritas en el
ejemplo 4, mostraba el hecho de que, la cepa S. Lividans TK24
(pOS48,7), expresaba una actividad nitrilasa, contrariamente a la
cepa TK24(pIJ6021).
La secuencia primaria de la nitrilasa de
Comamonas testosteroni sp, descrita en Levy-Schill y
colegas 1995 (anteriormente citado, arriba), presenta un 31% de
identidad con la secuencia primaria de la nitrilasa descrita en esta
invención. La cepa recombinante de E. coli TG1 (pXL2158,
pXL2035), la cual expresa la nitrilasa de C. Testosteroni, se
cultivó en las condiciones descritas por parte de
Levy-Schil y colegas (anteriormente citada arriba),
y se incubó una torta celular, en un tampón fosfato 100 mM a pH 7,
con 50 mM HMTBN, a una temperatura de 30ºC. La actividad medida, era
de 2,3 kg/h CS. Como la nitrilasa de la invención, la nitrilasa de
C. testosterni, es capaz de hidrolizar el HMTBN.
Además, los datos presentados en el ejemplo 4,
con los plásmidos pBCAT12 y pBCAT13, muestran el hecho de que, la
sustitución Asn279 ->Asp279 sobre la nitrilasa de A. faecalis
ATCC8750, permite el conservar la actividad sobre HMTBN.
Se procedió a añadir 5 g de células secas a 20 g
de agua, ajustada a un valor pH de 7,0. Se añadió la cantidad de
soporte (CELITE 545, Prolabo, Francia) indicada y, a continuación,
después de una perfecta homogeneización, se procedió a reticular la
suspensión, mediante la adición de un 15% de glutaraldehido, basado
en la masa seca total, seguido de un 10% de polietilenimina
(SEDIPUR, BASF, Alemania). La suspensión, se agita durante un
transcurso de tiempo de 1 hora, a la temperatura ambiente.
Se procede, a continuación, a flocular la
suspensión, mediante la ayuda de un 0.001% de un floculante
aniónico. Superfloc A100. La masa reticulada, se recupera mediante
filtración.
Esta masa, se retícula de nuevo, mediante la
adición de un 10% de poliazetidina (KYMENE 557, Hércules, USA),
basado en la masa seca total. La masa, todavía húmeda, se
extrusiona, a continuación, a través de un orificio de 0,5 mm de
diámetro, y se seca.
La actividad de las partículas obtenidas, se
determina, a continuación, siguiendo un procedimiento descrito en la
patente internacional WO 96 / 09403.
| g de soporte | Actividad (en %) |
| 0 | 100 |
| 2,5 g | 215 |
| 5 g | 250 |
La adición de soporte, para las células, mejora
notablemente la actividad.
Se procede a repetir la experiencia, sustituyendo
la CELITE por gluten de trigo (Roquette, Francia), parcialmente
soluble en agua, o gelatina (SBI, Francia), totalmente soluble en
agua.
| g de soporte | Actividad (en %) |
| 0 | 100 |
| 5 g de gluten | 160 |
| 5 g de gelatina | nd* |
| * La suspensión celular, no flocula, y no es filtrable. |
Este ejemplo, muestra el hecho de que, el gluten,
puede solubilizarse con CELITE. Como contrapartida, si la adición es
gelatina (totalmente soluble), el procesado para dotar de forma al
catalizador, es imposible, mediante la técnica descrita
anteriormente, arriba (extrusión).
Se procedió a mezclar 10 g de Escherichia coli
BIOCAT171, del ejemplo 4, preparados mediante un cultivo aeróbio, en
un medio LB, con 10 g de CLAREL 78 (CECA, Francia), en 500 g de
tampón fosfato 100 mM pH 7,0. Después de la homogeneización, se
procedió a añadir 6 g de glutaraldehido 25% y, la suspensión, se
agitó durante un transcurso de tiempo de 15 minutos, a la
temperatura ambiente. Se añadieron, a continuación, 2 g de
polietilenimina, así como 6 g de glutaraldehído, a un 25%. Se
procedió a añadir la totalidad, durante un transcurso se tiempo de
una hora, a la temperatura ambiente. EL conjunto, se floculó, con la
ayuda de 5 ml de una solución de SUPERFLOC A 100, a un 0,2% (CYTEC,
Francia). La masa, se filtró y, la pasta obtenida, se mezcló con 16
g de poliazetidina, a un 12,5% (KYMENE 557, Hercules) y, a
continuación, se extrusionó a través de un orificio de matriz, de
0,5 mm de diámetro. Los "macarrones" obtenidos, se secaron a
una temperatura de 35ºC, en una estufa y, a continuación, se
sumergieron, durante un transcurso de tiempo de 30 minutos, en un
baño de NaBH_{4}, a un 1%, preparado en un tampón borato 50 mM,
pH 10,0. Se procedió, a continuación, a lavar el biocatalizador, con
agua destilada. El catalizador, se conservó, a una temperatura de
5ºC, o a la temperatura ambiente, en un tampón fosfato 500 mM, pH
8,0.
Se procedió a llenar una columna provista de
termostato, de 3 cm de diámetro interior, y de 45 cm de altura, con
100 g de biocatalizador. Esta columna, se llenó con una bomba, vía
un bucle de recirculación. El volumen total del reactor, era de 430
ml. La boca, se llenó con una solución de sal de amonio del ácido
hidroximetiltiobutírico, a un 25%. La solución, se alimentó, por la
parte superior de la columna, hacia abajo, a un caudal horario,
correspondiente a 20 l/h. El agua que circulaba a través de la doble
pared de la columna y en el intercambiador térmico, permite el
mantener la temperatura a 35ºC. El agua desmineralizada, se añadió,
al bucle, a un caudal de 80 g/h. Se procedió a añadir el
2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo,
a un caudal de 20 g/h. El excedente de volumen del medio de
reacción, se evacuó por la parte de abajo, de la columna, de tal
forma que, el volumen del bucle, permaneciera constante. Así, de
esta forma, se obtuvo un flujo continuo, con una tasa de
transformación del nitrito, del 95%. Además de ello, la
concentración de la solución acuosa de sal de amonio del ácido
2-hidroxi-4-metiltiobutírico
obtenida en la salida del reactor, era del 25%.
El electrodializador utilizado, se encontraba
constituido por un conjunto consistente en un apilamiento, de 9
células, de 2 dm^{2} de superficie activa, compuestas, cada una de
ellas, de 2 compartimientos designado de la forma que sigue:
- compartimiento sal / ácido: limitado del lado
del cátodo, mediante una membrana intercambiadora de cationes CMB de
Toluyama Soda y, del lado del ánodo, mediante la cara catiónica de
una membrana bipolar Aqualytics.
- compartimiento base: limitado del lado del
ánodo, mediante la membrana catiónica y, del lado del cátodo,
mediante la cara aniónica de la membrana bipolar.
El ánodo, se encuentra constituido de titanio
platinado. El cátodo, es en acero inoxidable.
El electrolito, se encuentra constituido por una
solución acuosa de sulfato de sodio, que tiene una conductividad de
100 mS/cm, a una temperatura de 40ºC. El caudal de circulación, en
los electrodos, es de 2 x 100 l/b. El volumen, es de 5 l.
El compartimiento "base", se llenó,
inicialmente, con 5 litros de una solución de sulfato de amonio a un
1%.
El compartimiento "sal / ácido", se llenó,
inicialmente, con 5 litros de una solución de 1,44 mol/litro de sal
de amonio del ácido
2-hidroxi-4-(metitio)butanóico.
El caudal de recirculación de las soluciones, se
fijó, inicialmente, a 130 l/h, para el compartimiento sal / ácido, y
a 190 l/h, para el compartimiento base.
La electrodiálisis, se efectúa de forma
discontinua (funcionamiento en recirculación), a una temperatura
media de 40ºC. La intensidad, se impone a un valor de 9 A, es decir,
a una densidad de corriente de 0,45 kA/m^{2}.
Después de un transcurso de tiempo
funcionamiento, de 155 minutos, la conductividad del compartimiento
sal / ácido, pasa de 59 a 7,8 mS/cm.
El compartimiento sal / ácido, contenía 1,35
mol/l de ácido
2-hidroxi-4-(metiltio)butanoico,
a un 100%, en forma de ácido.
El rendimiento farádico, se estimó en un 71% y,
el consumo energético, ara de 0,53 kW/h, por kg de ácido
formado.
El electrodializador utilizado, se encontraba
constituido por un conjunto consistente en un apilamiento, de 8
células, de una configuración idéntica a la del ejemplo 12.
El compartimiento "base", se llenó,
inicialmente, con 5,27 litros de una solución de sulfato de amonio a
un 1%.
El compartimiento "sal / ácido", se llenó,
inicialmente, con 4,85 litros de una solución de 1,39 mol/litro de
sal de amonio del ácido
2-hidroxi-4-(metitio)butanoico.
El caudal de recirculación de las soluciones, se
fijó, inicialmente, a 60 l/h, para el compartimiento sal / ácido, y
a 150 l/h, para el compartimiento base.
La electrodiálisis, se efectuó de forma
discontinua (funcionamiento en recirculación), a una temperatura
media de 40ºC. La intensidad, se impuso a un valor de 9 A, es decir,
a una densidad de corriente de 0,45 kA/m^{2}.
Después de un transcurso de tiempo
funcionamiento, de 172 minutos, la conducitividad del compartimiento
sal / ácido, pasa de 59 a 9,5 mS/cm.
El volumen final del compartimiento sal / ácido,
era de 4,67 litres.
La composición, era la siguiente:
- ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butírico: 1,24 mol/l
- 2-hidroxi-4-(metiltio)butanoato de amonio: 0,149 mol/l
La tasa de transformación, era de un 86%. El
producto final, era de un 89%, en forma de ácido.
El rendimiento farádico, se estimó en un 74%. El
consumo energético, era de 0,53 kW/h, por kg de ácido formado.
Se utiliza un dispositivo análogo al utilizado en
el ejemplo 13.
El compartimiento "base", se llenó,
inicialmente, con 5,46 litros de una solución de sulfato de amonio a
un 1%.
El compartimiento "sal / ácido", se llenó,
inicialmente, con 5,23 litros de una solución de 1,24 mol/litro de
sal de amonio del ácido
2-hidroxi-4-(metitio)butanóico.
El caudal de recirculación de las soluciones, se
fijó, inicialmente, a 90 l/h, para el compartimiento sal / ácido, y
a 150 l/h, para el compartimiento base.
La electrodiálisis, se efectuó de forma
discontinua (funcionamiento en recirculación), a una temperatura
media de 40ºC. La intensidad, se impuso a un valor de 14 A, es
decir, a una densidad de corriente de 0,7 kA/m^{2}.
Después de un transcurso de tiempo
funcionamiento, de 105 minutos, la conductividad del compartimiento
sal / ácido, pasa de 57,6 9,8 mS/cm.
La composición final de compartimiento sal /
ácido, era la siguiente:
- ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butírico: 1,28 mol/l
- 2-hidroxi-4-(metiltio)butanoato de amonio: 0,14 mol/l
El producto final, era, por lo tanto, de un 90%,
en forma de ácido.
Se utilizó un dispositivo análogo al del ejemplo
13.
El ensayo, se realizó con el contenido de
compartimiento base obtenido a la salida del ejemplo 14.
El compartimiento "sal / ácido", se llenó,
inicialmente, con 5,2 litros de una solución de 1,44 mol/litro de
sal de amonio del ácido
2-hidroxi-4-(metitio)butanoico.
El caudal de recirculación de las soluciones, se
fijó, inicialmente, a 50 l/h, para el compartimiento sal / ácido, y
a 150 l/h, para el compartimiento base.
La electrodiálisis, se efectuó de forma
discontinua (funcionamiento en recirculación), a una temperatura
media de 42ºC. La intensidad, se impuso a un valor de 19 A, es
decir, a una densidad de corriente de 0,95 kA/m^{2}.
Después de un transcurso de tiempo
funcionamiento, de 53 minutos, la conductividad del compartimiento
sal / ácido, pasa de 59 a 27 mS/cm.
El volumen final del compartimiento sal / ácido,
era de 4,85 litres.
La composición, era la siguiente:
- ácido 2-hidroxi-4-(metiltio)butírico: 0,87 mol/l
- 2-hidroxi-4-(metiltio)butanoato de amonio: 0,56 mol/l
La tasa de transformación, era de un 56%. El
producto final, era de un 61%, en forma de ácido.
El rendimiento farádico, era de un 83%. El
consumo energético, se estimó en 0,7 kW/h, por kg de ácido
formado.
Se procedió a concentrar, en batch, (en lote)
200,1 g de solución de HMBTS, a 1,5 M, en un evaporador rotativo. La
temperatura del baño, era de aproximadamente 45 \pm 5ºC. La
presión, se reguló en las proximidades de 2,5 \cdot 10^{3} Pa
(25 mbar). La temperatura, en el hervidor, evolucionó, desde un
valor de 25ºC, en el inicio de la destilación, hasta un valor de
40ºC, en el final de la destilación. Al cabo de un transcurso de
tiempo de 3 horas, se recuperaron 41,9 g de un medio viscoso,
amarillo, cuyas características, son las siguientes:
\newpage
| Viscosidad a 25ºC | 1150 |
| (mm^{2} \cdot S^{-1}) | |
| % HMTBA (Br/BrO_{3}-) | 83,3 |
Después de ajuste del título (dilución con
H_{2}O), se obtiene un producto, cuyas características, son las
siguientes:
| Viscosidad a 25ºC | 396 |
| (mm^{2} \cdot S^{-1}) | |
| % HMTBA (Br/BrO_{3}-) | 79,5 |
Mediante potenciometría, se obtuvo el reparto
másico siguiente:
| % HMBTS | 81,6 |
| % HMTBA | 6,0 |
Se procedió a medir, mediante CLHP, la relación
de las superficies monómero o dímeros (monómero + dímeros).
monómero / (monómero + dímeros) 100
dímeros (monómero + dímeros) (*) 0
(*) Dímeros no detectados
Se procedió a concentrar, en "batch" (en
lote), 200, g de solución de HMBTS, a aproximadamente 1,5 M, en un
evaporador rotativo. La temperatura del baño, era de 121 \pm 5ºC.
La presión, se reguló en las proximidades de 9,5 \cdot 10^{4} Pa
(25 mbar). La temperatura, en el hervidor, evolucionó, desde un
valor de 100ºC, en el inicio de la destilación, hasta un valor de
113ºC, en el final de la destilación. Al cabo de un transcurso de
tiempo de 3 horas, se recuperaron 41,5 g de un medio viscoso,
marrón, cuyas características, son las siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
| Viscosidad a 25ºC | - |
| (mm^{2}\cdotS^{-1}) | |
| % HMTBA (Br/BrO_{3}-) | 90,7 |
Después de ajuste del título (dilución con
H_{2}O), se obtiene un producto, cuyas características, son las
siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
| Viscosidad a 25ºC | 117 |
| (mm^{2} \cdot S^{-1}) | |
| % HMTBA (Br/BrO_{3}-) | 78,8 |
Mediante potenciometría, se obtuvo el reparto
másico siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
| % HMBTS | 52,2 |
| % HMTBA | 28,7 |
Se procedió a medir, mediante CLHP, la relación
de las superficies monómero o dímeros (monómero + dímeros).
monómero / monómero + dímeros) 95,0
dímeros (monómero + dímeros(*) 5,0
Se procede a añadir, a 100,0 g del medio descrito
en el ejemplo nº 17, 40,0 g de H_{2}O. El medio, se extrae, con
75,,0 g de éter isopropílico. Después de la separación de las fases,
se recuperan, en la fase orgánica, después de evaporación, 25,6 g de
HMTBA, cuyas características son las siguientes:
| Determinación | |
| Monómero/(monómero + dímeros) (% de superficie) | 97,0 |
| Dímeros /(monómero + dímeros) (% de superficie) | 3,0 |
| Viscosidad a 25º (mm^{2} \cdot s^{-1}) | 55 |
| Ejemplo nº16 | Ejemplo nº 17 | Ejemplo nº18 | |
| Duración del almacenaje a 25º | 40 días | 40 días | 100 días |
| Viscosidad (mm^{2} \cdot s^{-1}) | 387 | 116 | 66 |
| Monómero/(monómero + dímero) | 100,0 | 95,0 | 82 |
| Dímeros/(monómero + dímeros) | 0,0 | 5,0 | 18 |
Los volúmenes de los ejemplos 16 y 17, no
evolucionaron en su contenido en dímeros, después de un tiempo de
almacenaje de 40 días.
Claims (23)
1. Procedimiento de preparación del ácido
2-hidroxi-4-metiltiobutírico
y / o de la sal de amonio del ácido
2-hidroxi-4-metiltiobutírico,
mediante la hidrólisis enzimática del
2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo,
caracterizado por el hecho de que:
a) en una primera etapa, se prepara un material
biológico, que tiene una actividad nitrilasa,
b) en una segunda etapa, se procede a
inmovilizarlo,
c) en una tercera etapa, se pone en presencia, el
2-hidroxi-4-metiltiobutironitrilo,
con el material biológico de esta forma inmovilizado, para obtener
la sal de amonio del ácido
2-hidroxi-4-metiltiobutírico.
d) en una cuarta etapa, eventualmente, se
convierte la sal obtenida en la etapa c), en el ácido
correspondiente, y
e) en una quinta etapa, se concentra el producto
obtenido en la etapa c) o d).
2. Procedimiento, según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que, la actividad nitrilasa, se
obtiene a partir de una nitrilasa de Alcaligenes, de una forma
preferible, faecalis.
3. Procedimiento, según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, caracterizado por el hecho de que se
utiliza la información genética que codifica a la nitrilasa, la cual
se expresa en un microorganismo huésped.
4. Procedimiento, según la reivindicación 3,
caracterizado por el hecho de que, el microorganismo huésped,
se elige de entre Escherichia coli, o un miembro del género
Bacillus, Corynebacterium, Streptomyces, Saccharomyces,
Kluyveromices, Penicillium y Aspergillus.
5. Procedimiento, según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que, la actividad nitrilasa, se
obtiene a partir de la nitrilasa codificada por el gen clonado en el
plásmido pRPA-BCATT3, depositado en la CBS, con el
número CBS998-96.
6. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 3 a 5, caracterizado por el hecho de que, la
nitrilasa, se co-expresa con una proteína de
cobertura.
7. Procedimiento, según la reivindicación 6,
caracterizado por el hecho de que, la proteína, es GroESL en
E. coli.
8. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado por el hecho de
que, el material biológico, de la etapa a), se inmoviliza sobre un
soporte sólido.
9. Procedimiento, según la reivindicación 8,
caracterizado por el hecho de que, el soporte sólido, tiene
una granulometría comprendida dentro de unos márgenes situados entre
1 \mum y 3 mm, de una forma preferente, comprendida dentro de unos
márgenes situados entre 10 \mum y 2 mm, y por el hecho de que,
éste, se añade a razón de un porcentaje comprendido dentro de unos
márgenes que van de un 0,01 a un 500%, de una forma preferente, a
razón de un porcentaje comprendido dentro de unos márgenes que van
de un 10 a un 200%, en peso, del material biológico.
10. Procedimiento, según la reivindicación 8,
caracterizado por el hecho de que, el soporte sólido, se
elige entre:
- -
- las resinas intercambiadoras de iones,
- -
- la alúmina,
- -
- los sílices de síntesis o diatomeas y los geles de sílice,
- -
- las zeolitas,
- -
- los carbones,
- -
- las proteínas parcialmente solubles en agua, y,
- -
- los polisacáridos.
11. Procedimiento, según la reivindicación 10,
caracterizado por el hecho de que, el soporte sólido, es el
gluten.
12. Procedimiento, según la reivindicación 8,
caracterizado por el hecho de que se utilizan uno o varios
agentes químicos, para reticular y / o insolubilizar el material
biológico y el soporte.
\newpage
13. Procedimiento, según la reivindicación 12,
caracterizada por el hecho de que, los agentes químicos, se
eligen entre:
- los polímeros de poliazetidina,
- los polímeros de polietileninimina,
- los polímeros de poliamidas,
- los polímeros de isocianatos,
- los geles de alginato,
- los geles de k-carragenano,
- las aminas,
- los aldehídos,
- los ácidos carboxílicos, y
- los isocianatos.
14. Procedimiento, según las reivindicaciones 10
a 13, caracterizado por el hecho de que, el material
biológico, y el soporte, se mezclan en presencia de agentes
químicos, para obtener una pasta que se extrusiona y, a
continuación, se seca.
15. Procedimiento, según las reivindicaciones 10
a 13, caracterizado por el hecho de que, el material
biológico y los agentes químicos, se mezclan y, a continuación, se
depositan sobre el soporte, en forma de una capa fina.
16. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 13, caracterizado por el hecho de que,
se obtiene una mezcla del ácido
2-hidroxi-4-metiltiobutírico
y del ácido
2-hidroxi-4-metiltiobutírico,
que contiene por lo menos un 60% de ácido
2-hidroxi-4-metiltiobutírico
y, de una forma preferente, por lo menos un 80% del ácido
2-hidroxi-4-metiltiobutírico,
siendo, el complemento, sal de amonio del ácido
2-hidroxi-4-metiltiobutírico,
por disociación electrolítica de la sal de amonio
correspondiente.
17. Procedimiento, según la reivindicación 16,
caracterizado por el hecho de que, la disociación, se realiza
en un electrodializador de membranas bipolares, de tres
compartimientos.
18. Procedimiento, según la reivindicación 16,
caracterizado por el hecho de que, la disociación, se realiza
en un electrodializador de membranas bipolares, de dos
compartimientos.
19. Procedimiento, según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, caracterizado por el hecho de que se
obtiene una mezcla de sal de amonio del ácido
2-hidroxi-4-metiltiobutírico
y del ácido
2-hidroxi-4-metiltiobutírico,
mediante calentamiento de una solución de sal de amonio.
20. Procedimiento, según las reivindicaciones 1 a
19, caracterizado por el hecho de que, el amoníaco liberado,
se destila, se concentra y se recicla en la síntesis de HCN.
21. Solución acuosa, obtenida según las
reivindicaciones 16 a 19, constituida por una mezcla del ácido
2-hidroxi-4-metiltiobutírico
y sal de amonio del ácido
2-hidroxi-4-metiltiobutírico,
en donde, la relación ponderal ácido / (ácido + sal), es de un
porcentaje comprendido dentro de unos márgenes que van de un 5 a un
99,9% y, de una forma preferente, de un porcentaje comprendido
dentro de unos márgenes que van de un 10 a un 50%.
22. Instalación para la puesta en ejecución del
procedimiento según la presente invención, el cual comprende:
- uno o varios reactores (3,4), provistos de
enzimas inmovilizadas que tienen una actividad nitrilasa, o de
microorganismos huésped inmovilizados, que expresan una enzima de
actividad nitrilasa,
- eventualmente, uno o varios medios de
electrodiálisis (9),
\newpage
- medios de concentración (6/12), del producto
final.
23. Plásmido pRPA-BACT3,
depositado en la CBS, bajo el número CBS 998-96.
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