PL190773B1 - Ciągły sposób wytwarzania kwasu 2-hydroksy-4-metylotio-masłowego i/lub jego soli amonowej na drodze hydrolizy enzymatycznej 2-hydroksy-4-metylotiobutyronitrylu, roztwór wodny otrzymany tym sposobem i instalacja do przeprowadzania tego sposobu oraz plazmid pRPA-BCAT3 - Google Patents
Ciągły sposób wytwarzania kwasu 2-hydroksy-4-metylotio-masłowego i/lub jego soli amonowej na drodze hydrolizy enzymatycznej 2-hydroksy-4-metylotiobutyronitrylu, roztwór wodny otrzymany tym sposobem i instalacja do przeprowadzania tego sposobu oraz plazmid pRPA-BCAT3Info
- Publication number
- PL190773B1 PL190773B1 PL332958A PL33295897A PL190773B1 PL 190773 B1 PL190773 B1 PL 190773B1 PL 332958 A PL332958 A PL 332958A PL 33295897 A PL33295897 A PL 33295897A PL 190773 B1 PL190773 B1 PL 190773B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- hydroxy
- acid
- nitrilase
- prpa
- ammonium salt
- Prior art date
Links
- PICCHNWCTUUCAQ-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypentanethioic s-acid Chemical compound CCCC(O)C(O)=S PICCHNWCTUUCAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 89
- 108010033272 Nitrilase Proteins 0.000 claims abstract description 75
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims abstract description 58
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 42
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 39
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims abstract description 32
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 claims abstract description 28
- VWWOJJANXYSACS-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-4-methylsulfanylbutanenitrile Chemical compound CSCCC(O)C#N VWWOJJANXYSACS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 22
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 73
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 43
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 23
- 238000000909 electrodialysis Methods 0.000 claims description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 21
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 16
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 16
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 16
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 16
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 14
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 13
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 13
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 11
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 11
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- XOLXLUGLZJFTDJ-UHFFFAOYSA-N azanium;2-hydroxypentanethioate Chemical compound [NH4+].CCCC(O)C([O-])=S XOLXLUGLZJFTDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims description 8
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims description 8
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 6
- 235000021312 gluten Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 claims description 6
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 claims description 5
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 claims description 5
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 claims description 5
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 5
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 claims description 4
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 claims description 4
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 claims description 4
- 239000000679 carrageenan Substances 0.000 claims description 4
- 229940113118 carrageenan Drugs 0.000 claims description 4
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 claims description 4
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 claims description 4
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 4
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 4
- 241000588986 Alcaligenes Species 0.000 claims description 3
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 claims description 3
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 3
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims description 3
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 claims description 3
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 claims description 3
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 claims description 3
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 3
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000009434 installation Methods 0.000 claims description 3
- 150000002513 isocyanates Chemical class 0.000 claims description 3
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 claims description 3
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 3
- 239000010457 zeolite Substances 0.000 claims description 3
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 claims description 2
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 claims description 2
- 230000005592 electrolytic dissociation Effects 0.000 claims description 2
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 43
- ONFOSYPQQXJWGS-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-4-(methylthio)butanoic acid Chemical compound CSCCC(O)C(O)=O ONFOSYPQQXJWGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 19
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 18
- 241000588813 Alcaligenes faecalis Species 0.000 description 16
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 13
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 13
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 11
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 101100306202 Escherichia coli (strain K12) rpoB gene Proteins 0.000 description 10
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 10
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 10
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 10
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 10
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 10
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 10
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 9
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 8
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 8
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 7
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940005347 alcaligenes faecalis Drugs 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 6
- 230000003134 recirculating effect Effects 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- QENJLXATANVWMR-UHFFFAOYSA-N 2-[(3-amino-3-imino-2-methylpropanethioyl)amino]acetic acid Chemical compound NC(=N)C(C)C(=S)NCC(O)=O QENJLXATANVWMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 5
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 5
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 5
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 4
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 4
- UWBAEAALSITMBX-UHFFFAOYSA-N azanium;2-hydroxy-4-methylsulfanylbutanoate Chemical compound [NH4+].CSCCC(O)C([O-])=O UWBAEAALSITMBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 4
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 4
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 4
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 4
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 4
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 4
- LELOWRISYMNNSU-UHFFFAOYSA-N hydrogen cyanide Chemical compound N#C LELOWRISYMNNSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 4
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 4
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 4
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 4
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000589518 Comamonas testosteroni Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000187398 Streptomyces lividans Species 0.000 description 3
- 241000828254 Streptomyces lividans TK24 Species 0.000 description 3
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- JFDZBHWFFUWGJE-UHFFFAOYSA-N benzonitrile Chemical compound N#CC1=CC=CC=C1 JFDZBHWFFUWGJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 3
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 3
- 235000015927 pasta Nutrition 0.000 description 3
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- 239000010936 titanium Substances 0.000 description 3
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N Diisopropyl ether Chemical compound CC(C)OC(C)C ZAFNJMIOTHYJRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Natural products CCC(C)C(C)=O UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N adipic acid Chemical compound OC(=O)CCCCC(O)=O WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 239000003011 anion exchange membrane Substances 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 235000011132 calcium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000008151 electrolyte solution Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000010439 graphite Substances 0.000 description 2
- 229910002804 graphite Inorganic materials 0.000 description 2
- NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N hexane-1,6-diamine Chemical compound NCCCCCCN NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 125000004356 hydroxy functional group Chemical group O* 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- XTAZYLNFDRKIHJ-UHFFFAOYSA-N n,n-dioctyloctan-1-amine Chemical compound CCCCCCCCN(CCCCCCCC)CCCCCCCC XTAZYLNFDRKIHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910000510 noble metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 238000004313 potentiometry Methods 0.000 description 2
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 2
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 2
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 125000001273 sulfonato group Chemical group [O-]S(*)(=O)=O 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 239000001974 tryptic soy broth Substances 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- ONFOSYPQQXJWGS-BYPYZUCNSA-N (2s)-2-hydroxy-4-methylsulfanylbutanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](O)C(O)=O ONFOSYPQQXJWGS-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;styrene Chemical group C=CC1=CC=CC=C1.C=CC1=CC=CC=C1C=C CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100024341 10 kDa heat shock protein, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- BINDPFUXHYGSSV-UHFFFAOYSA-N 2-(hydroxymethyl)butanethioic s-acid Chemical compound CCC(CO)C(S)=O BINDPFUXHYGSSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WBMXYUCOFYSLOS-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-2-methylsulfanylpropanenitrile Chemical compound CSC(C)(O)C#N WBMXYUCOFYSLOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BOCQEKBKBUOBCR-UHFFFAOYSA-N 4-(2-methyliminohydrazinyl)benzoic acid Chemical compound CN=NNC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 BOCQEKBKBUOBCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AOWCRYHFNODQTG-UHFFFAOYSA-N CSCCC(C#N)O.N Chemical compound CSCCC(C#N)O.N AOWCRYHFNODQTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010059013 Chaperonin 10 Proteins 0.000 description 1
- 108010058432 Chaperonin 60 Proteins 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 244000024675 Eruca sativa Species 0.000 description 1
- 235000014755 Eruca sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000203751 Gordonia <actinomycete> Species 0.000 description 1
- 241000203747 Gordonia terrae Species 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- 108010086093 Mung Bean Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 description 1
- 241000187562 Rhodococcus sp. Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000187391 Streptomyces hygroscopicus Species 0.000 description 1
- NSFFHOGKXHRQEW-UHFFFAOYSA-N Thiostrepton B Natural products N1C(=O)C(C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(C(C)CC)NC(C(C2=N3)O)C=CC2=C(C(C)O)C=C3C(=O)OC(C)C(C=2SC=C(N=2)C2N=3)NC(=O)C(N=4)=CSC=4C(C(C)(O)C(C)O)NC(=O)C(N=4)CSC=4C(=CC)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C(N=4)=CSC=4C21CCC=3C1=NC(C(=O)NC(=C)C(=O)NC(=C)C(N)=O)=CS1 NSFFHOGKXHRQEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000383675 Trama Species 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005299 abrasion Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 1
- 239000001361 adipic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011037 adipic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 235000019728 animal nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 150000001491 aromatic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- MTAZNLWOLGHBHU-UHFFFAOYSA-N butadiene-styrene rubber Chemical group C=CC=C.C=CC1=CC=CC=C1 MTAZNLWOLGHBHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L calcium carbonate Substances [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L calcium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Ca+2] AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000920 calcium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229910001861 calcium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001175 calcium sulphate Substances 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- 150000007942 carboxylates Chemical group 0.000 description 1
- 210000004534 cecum Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- JQXXHWHPUNPDRT-YOPQJBRCSA-N chembl1332716 Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O\C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)/C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C(O)=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CCN(C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-YOPQJBRCSA-N 0.000 description 1
- 230000007073 chemical hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000012824 chemical production Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150087945 cobA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- POLCUAVZOMRGSN-UHFFFAOYSA-N dipropyl ether Chemical compound CCCOCCC POLCUAVZOMRGSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 description 1
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150062015 hyg gene Proteins 0.000 description 1
- 108010002685 hygromycin-B kinase Proteins 0.000 description 1
- 125000001841 imino group Chemical group [H]N=* 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000002440 industrial waste Substances 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- JMMWKPVZQRWMSS-UHFFFAOYSA-N isopropanol acetate Natural products CC(C)OC(C)=O JMMWKPVZQRWMSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940011051 isopropyl acetate Drugs 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-N isovaleric acid Chemical compound CC(C)CC(O)=O GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150109249 lacI gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000622 liquid--liquid extraction Methods 0.000 description 1
- 150000004706 metal oxides Chemical class 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N nalidixic acid Chemical compound C1=C(C)N=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=C1 MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000210 nalidixic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 125000002560 nitrile group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 125000005496 phosphonium group Chemical group 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002239 polyacrylonitrile Polymers 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000011451 sequencing strategy Methods 0.000 description 1
- 238000007493 shaping process Methods 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000007614 solvation Methods 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-O sulfonium group Chemical group [SH3+] RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000003512 tertiary amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- UBCKGWBNUIFUST-YHYXMXQVSA-N tetrachlorvinphos Chemical compound COP(=O)(OC)O\C(=C/Cl)C1=CC(Cl)=C(Cl)C=C1Cl UBCKGWBNUIFUST-YHYXMXQVSA-N 0.000 description 1
- NSFFHOGKXHRQEW-AIHSUZKVSA-N thiostrepton Chemical compound C([C@]12C=3SC=C(N=3)C(=O)N[C@H](C(=O)NC(/C=3SC[C@@H](N=3)C(=O)N[C@H](C=3SC=C(N=3)C(=O)N[C@H](C=3SC=C(N=3)[C@H]1N=1)[C@@H](C)OC(=O)C3=CC(=C4C=C[C@H]([C@@H](C4=N3)O)N[C@H](C(N[C@@H](C)C(=O)NC(=C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2)=O)[C@@H](C)CC)[C@H](C)O)[C@](C)(O)[C@@H](C)O)=C\C)[C@@H](C)O)CC=1C1=NC(C(=O)NC(=C)C(=O)NC(=C)C(N)=O)=CS1 NSFFHOGKXHRQEW-AIHSUZKVSA-N 0.000 description 1
- 229930188070 thiostrepton Natural products 0.000 description 1
- 229940063214 thiostrepton Drugs 0.000 description 1
- NSFFHOGKXHRQEW-OFMUQYBVSA-N thiostrepton A Natural products CC[C@H](C)[C@@H]1N[C@@H]2C=Cc3c(cc(nc3[C@H]2O)C(=O)O[C@H](C)[C@@H]4NC(=O)c5csc(n5)[C@@H](NC(=O)[C@H]6CSC(=N6)C(=CC)NC(=O)[C@@H](NC(=O)c7csc(n7)[C@]8(CCC(=N[C@@H]8c9csc4n9)c%10nc(cs%10)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(=C)C(=O)N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@H](C)NC1=O)[C@@H](C)O)[C@](C)(O)[C@@H](C)O)[C@H](C)O NSFFHOGKXHRQEW-OFMUQYBVSA-N 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000006200 vaporizer Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P11/00—Preparation of sulfur-containing organic compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
- C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
- C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
- C12N11/096—Polyesters; Polyamides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Bakery Products And Manufacturing Methods Therefor (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
1. Ciagly sposób wytwarzania kwasu 2-hydroksy-4-metylotiomaslowego i/lub soli amonowej kwasu 2-hydroksy-4-metylotiomaslowego na drodze hydrolizy enzymatycznej 2-hydroksy-4-mety- lotiobutyronitrylu, który nadaje sie do przemyslowego zastosowania, znamienny tym, ze: a) w pierwszym etapie wytwarza sie material biologiczny majacy aktywnosc nitrylazowa, b) w drugim etapie zostaje on unieczynniony, c) w trzecim etapie kontaktuje sie 2-hydroksy-4-metylotiobutyronitryl z tak unieczynnionym materialem biologicznym, aby otrzymac sól amonowa kwasu 2-hydroksy-4-metylotiomaslowego, d) w czwartym etapie ewentualnie przeksztalca sie sól otrzymana w etapie c) w odpowie- dni kwas, e) oraz w piatym etapie zateza sie produkt otrzymany w etapie c) lub d). PL PL PL PL PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest ciągły sposób wytwarzania kwasu 2-hydroksy-4-metylotio-masłowego i/lub jego soli amonowej na drodze hydrolizy enzymatycznej 2-hydroksy-4-metylotiobutyronitrylu, roztwór wodny otrzymany tym sposobem i instalacja do przeprowadzania tego sposobu oraz plazmid pRPA-BCAT3.
Niniejszy wynalazek dotyczy nowego sposobu wytwarzania kwasu 2-hydroksy-4-(metylotio)butanowego (HMTBA) i/lub jego soli amonowej (HMTBS).
Kwas 2-hydroksy-4-metylotiomasłowy i jego sole są od dawna stosowane do żywienia zwierząt w zastę pstwie metioniny. Kwas i sole wykazują tę zaletę wobec tej ostatniej, ż e wystę pują w postaci ciekłej, co ułatwia ich stosowanie przez towarzystwa produkujące pasze.
Od dawna jest znane wytwarzanie kwasu 2-hydroksy-4-(metylotio)butanowego na drodze chemicznej. Można więc wymienić opisy patentowe EP-142 488, EP-143 000, które opisują hydrolizę 4-metylotio-2-hydroksybutyronitrylu (HMTBN) sposobem dwuetapowym. Pierwszy etap polega na skontaktowaniu 2-hydroksy-4-metylotiobutyronitrylu z mocnym kwasem mineralnym, takim jak kwas chlorowodorowy lub siarkowy. W dalszym etapie po rozcieńczeniu wodą hydrolizę doprowadza się do końca w podwyższonej temperaturze. Następnie ekstrahuje się kwas 2-hydroksy-4-(metylotio)butanowy organicznym rozpuszczalnikiem słabo rozpuszczalnym w wodzie, jak keton, dogodnie keton metylowo-izobutylowy, po czym usuwa się rozpuszczalnik przez odparowanie. Sposób tego typu, używany na skalę przemysłową, zawiera jednak kilka niedogodności. Wytwarza on ilość moli siarczanu amonu, przynajmniej równą ilości moli wprowadzonego nitrylu, który powinno się usunąć, produkuje więc odpad przemysłowy, co sprzeciwia się polityce ochrony środowiska. Sposób ten wymaga też użycia wielkich ilości rozpuszczalnika, co koniecznie wymaga recyklizacji.
Inne sposoby, jak podane w opisach patentowych US 3 773 927 i 4 353 924, polegają na zhydrolizowaniu 2-hydroksy-4-metylotiobutyronitrylu kwasem chlorowodorowym, potem na zatężeniu środowiska z wydzieleniem utworzonego chlorku amonu. Otrzymana sól jest również trudna do usunięcia jak sól poprzednia i ponadto otrzymany kwas wykazuje silne zabarwienie.
Opisano też w opisie patentowym EP 330 521 sposób hydrolizy chemicznej metylotiohydroksypropionitrylu, który jak poprzednio polega na wykonaniu hydrolizy w środowisku siarkowym. Mieszaninę częściowo zobojętnia się wodą amoniakalną, po czym następuje rozdział dwufazowy. Faza organiczna zawiera większość kwasu 2-hydroksy-4-metylotiomasłowego, a faza wodna zawiera większość wyprodukowanego siarczanu amonu. Roztwór organiczny po odparowaniu zawartej wody przesącza się tak, aby odzyskać rozpuszczony siarczan amonu. Następnie kwas 2-hydroksy-4-metylotiomasłowy rozcieńcza się małą ilością wody i potem stabilizuje małą ilością kwasu siarkowego. Wodny roztwór po usunięciu wody pozwala otrzymać siarczan amonu bezpośrednio nadający się do sprzedaży. Sposób ten częściowo rozwiązuje niedogodności sposobów z poprzedniego stanu techniki, jeśli chodzi o użycie rozpuszczalników organicznych, ale zupełnie nie rozwiązuje problemów związanych z odpadami soli mineralnych.
Spośród opisów patentowych dotyczących soli kwasu 2-hydroksy-4-metylotiomasłowego można wymienić opisy patentowe US 2 745 745, 2 938 053 i 3 175 000, dotyczące soli wapniowych i/lub amonowych. Mieszaninę otrzymaną przez hydrolizę 2-hydroksy-4-metylotiobutyronitrylu traktuje się wodorotlenkiem lub węglanem wapnia. Wytrąca się wtedy siarczan wapnia, uwalniając amoniak, który tworzy sól amonową kwasu 2-hydroksy-4-metylotiomasłowego. Powstaje tu jeszcze problem usuwania utworzonego siarczanu wapnia.
Opisano jeszcze w zgłoszeniu patentowym WO 96/01808 sposób, który polega na wykonaniu hydrolizy i ekstrakcji rozpuszczalnikiem organicznym, jak w pierwszym cytowanym dokumencie z poprzedniego stanu techniki, po czym na zoboję tnieniu organicznego roztworu wodą amoniakalną . Sposób ten, jak większość sposobów poprzednio opisanych, prowadzi do tworzenia co najmniej jednego mola siarczanu lub chlorku amonu na mol wprowadzonego nitrylu i wymaga recyklizacji dużych ilości organicznego rozpuszczalnika.
Nie może on pozwolić na otrzymanie roztworu soli amonowej kwasu 2-hydroksy-4-metylotiomasłowego o interesującym koszcie przemysłowym.
Opisano poza tym w WO 96/09403 zastosowanie nitrylazy jako katalizatora hydrolizy grupy nitrylowej na grupę karboksylową. Sposób opisany w tym dokumencie nie nadaje się jednak do użycia na skalę przemysłową ze względu na niedostateczną aktywność drobnoustrojów, syntetyzujących nitrylazy.
PL 190 773 B1
Obecnie opracowano sposób w wyniku którego, stosując kilka specyficznych etapów, można otrzymać kwas 2-hydroksy-4-metylotiobutanowy i/lub jego sól amonową drogą enzymatyczną na skalę przemysłową z wysoką wydajnością bez użycia rozpuszczalników i bez towarzyszącej produkcji soli mineralnych.
Przedmiotem wynalazku jest ciągły sposób wytwarzania kwasu 2-hydroksy-4-metylotiomasłowego i/lub soli amonowej kwasu 2-hydroksy-4-metylotiomasłowego na drodze hydrolizy enzymatycznej 2-hydroksy-4-metylotiobutyronitrylu, który nadaje się do przemysłowego zastosowania charakteryzujący się tym, że:
a) w pierwszym etapie wytwarza się materiał biologiczny mający aktywność nitrylazową,
b) w drugim etapie zostaje on unieczynniony,
c) w trzecim etapie kontaktuje się 2-hydroksy-4-metylotiobutyronitryl z tak unieczynnionym materiałem biologicznym, aby otrzymać sól amonową kwasu 2-hydroksy-4-metylotiomasłowego,
d) w czwartym etapie ewentualnie przekształca się sól otrzymaną w etapie c) w odpowiedni kwas,
e) oraz w piątym etapie zatęża się produkt otrzymany w etapie c) lub d).
Korzystnie aktywność nitrylazowa jest otrzymana z nitrylazy z Alcaligenes, korzystniej Alcaligenes faecalis.
Korzystnie stosuje się informację genetyczną kodującą nitrylazę, podlegającą ekspresji w mikroorganizmie gospodarza. Korzystniej stosuje się mikroorganizm gospodarza wybrany spośród Escherichia coli lub członka rodzaju Bacillus, Corynebacterium, Streptomyces, Saccharomyces, Kluyveromyces, Penicillum i Aspergillus.
Również korzystnie aktywność nitrylazową otrzymuje się z nitrylazy kodowanej przez gen klonowany w plazmidzie pRPA-BCAT3, zdeponowany w CBS pod numerem CBS 998-96.
Korzystnie nitrylaza ulega koekspresji z białkiem opiekuńczym, przy czym korzystnie jako białko opiekuńcze stosuje się GroESL E. coli.
Korzystnie w ciągłym sposobie według wynalazku materiał biologiczny z etapu a) jest unieczynniany na stałym nośniku. Korzystniej stosuje się stały nośnik o wielkości cząsteczek od 1 μm do 3 mm, korzystniej od 10 μ m do 2 mm i dodaje się go w ilości 0,01-500%, korzystniej 10-200% wagowych materiału biologicznego. Jeszcze korzystniej stosuje się stały nośnik wybrany spośród:
- ż ywic jonowymiennych,
- tlenku glinu,
- krzemionek syntetycznych lub ziemi okrzemkowych i żeli krzemionkowych,
- zeolitów,
- węgli drzewnych,
- białek częściowo rozpuszczalnych w wodzie,
- oraz polisacharydów.
Korzystniej jako stały nośnik stosuje się gluten.
Również korzystnie stosuje się jeden lub kilka środków chemicznych do sieciowania i/lub czynienia nierozpuszczalnymi materiału biologicznego i nośnika. Korzystniej stosuje się środki chemiczne wybrane spośród:
- polimerów poliazetydynowych,
- polimerów polietylenoiminowych,
- polimerów poliamidowych,
- polimerów izocyjanianowych,
- żeli alginianowych,
- żeli k-karageninowych,
- amin,
- aldehydów,
- kwasów karboksylowych
- oraz izocyjanianów.
Korzystnie materiał biologiczny i nośnik są mieszane w obecności środków chemicznych, aby otrzymać pastę, którą wytłacza się a potem suszy.
Korzystnie materiał biologiczny i środki chemiczne są mieszane i potem osadzane na nośniku w postaci cienkiej warstwy.
Korzystnie w sposobie według wynalazku otrzymuje się mieszaninę soli amonowej kwasu 2-hydroksy-4-metylotiomasłowego i kwasu 2-hydroksy-4-metylotiomasłowego, zawierającą co najmniej
PL 190 773 B1
60% kwasu 2-hydroksy-4-metylotiomasłowego, a korzystnie co najmniej 80% kwasu 2-hydroksy-4-metylotiomasłowego, przy czym uzupełnieniem jest sól amonowa kwasu 2-hydroksy-4-metylotiomasłowego, przez dysocjację elektrolityczną odpowiedniej soli amonowej. Korzystniej dysocjację przeprowadza się w elektrodializerze z membranami bipolarnymi, o trzech przedziałach, lub również korzystniej dysocjację wykonuje się w elektrodializerze z membranami bipolarnymi, o dwóch przedziałach.
Korzystnie w sposobie według wynalazku mieszaninę soli amonowej kwasu 2-hydroksy-4-metylotiomasłowego i kwasu 2-hydroksy-4-metylotiomasłowego otrzymuje się przez ogrzewanie roztworu soli amonowej.
Korzystniej uwalniany wodorotlenek amonu destyluje się, zatęża i zawraca do syntezy HCN.
Przedmiotem wynalazku jest także roztwór wodny otrzymany opisanym powyżej sposobem utworzony z mieszaniny kwasu 2-hydroksy-4-metylotiomasłowego i soli amonowej kwasu 2-hydroksy-4-metylotiomasłowego, w którym stosunek wagowy kwasu (kwasu + soli) wynosi 5-99,9%, a korzystnie 10-50%.
Przedmiotem wynalazku jest też instalacja do przeprowadzania powyżej opisanego sposobu zawierająca:
- jeden lub wię cej reaktorów (3, 4) wypełnionych unieczynnionymi enzymami, mającymi aktywność nitrylazową, lub unieczynnionymi mikroorganizmami gospodarza, wykazującymi ekspresję enzymu o aktywności nitrylazowej,
- ewentualnie, jedno lub kilka urzą dzeń do elektrodializy (9),
- urządzenia do zatężania (6, 12) produktu koń cowego.
Przedmiotem wynalazku jest również plazmid pRPA-BCAT3, zdeponowany w CBS pod numerem CBS 998-96.
Wynalazek zostanie objaśniony szczegółowo w następującym opisie z odniesieniami do załączonych figur:
- fig. 1 przedstawia schemat komory do elektrodializy, uż ywanej w fakultatywnym etapie d); fig. 1A przedstawia komorę do elektrodializy z membraną bipolarną o trzech przedziałach; fig. 1B przedstawia komorę do elektrodializy z membraną bipolarną o dwóch przedziałach.
- fig. 2 przedstawia schemat instalacji do przeprowadzania sposobu według wynalazku;
- fig. 3 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidów pRPA-BCAT1 do 5.
- fig. 4 przedstawia strategię sekwencjonowania fragmentu 1130 pz, zawierają c ą sekwencję DNA (nazwaną na fig. nitB) kodującą peptyd mający aktywność nitrylazową użyteczną w realizacji praktycznej wynalazku. Numery odnoszą się do tożsamości starterów stosowanych do sekwencjonowania oraz do zapisów M13FWD i M13REV.
- fig. 5 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidów pRPA-BCAT12 i pRPA-BCAT13.
- fig. 6 przedstawia elektroforezę na 10% żelu SDS-PAGE, pokazując ą ekspresję sekwencji DNA stosowanej w realizacji wynalazku w szczepach E.coli BL21(DE3)/pRPA-BCAT12, BL21(DE3)/pRPA-BCAT13, BL21(DE3)/pRPA-BCA12 + pXL2231, BL21(DE3)/pRPA-BCAT13 + pXL-2231. Każde pasmo odpowiada ilości 10 μg rozpuszczalnych białek i równoważnej objętości frakcji nieprzetworzonej i nierozpuszczalnej.
- fig. 7 przedstawia elektroforezę na 10% żelu SDS-PAGE, wykazującą ekspresję kontrolnej sekwencji DNA użytecznej w realizacji praktycznej wynalazku w szczepach E. coli DH5a/pRPA-BCAT3, DH5a/pRPA-BCAT6, DH5a/pRPA-BCAT6 + pXL2035, RPA-BIOCAT76. Każde pasmo odpowiada ilości 10 μg rozpuszczalnych białek i równoważnej objętości frakcji nieprzetworzonej i nierozpuszczalnej.
- fig. 8 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidu pRPA-BCAT14.
- fig. 9 przedstawia elektroforezę na 10% żelu SDS-PA, wykazującą ekspresję sekwencji DNA użytecznej w realizacji praktycznej wynalazku w szczepach P.putida G2081 (pRPA-BCAT14), G2081 (pRPA-BCAT23), G2081 (pRPA-BCAT24), A.faecalis ATCC8750 (pRPA-BCAT14), A.faecalis ATCC8750 (pRPA-BCAT23), A.faecalis ATCC8750 (pRPA-BCAT24). Każde pasmo odpowiada ilości 10 μg rozpuszczalnych białek i równoważnej objętości frakcji nieprzetworzonej i ewentualnie nierozpuszczalnej.
fig. 10 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidu pCGL1087. fig. 11 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidu pOS48.7.
Pierwszy etap polega na wytworzeniu materiału biologicznego mającego aktywność nitrylazową.
Materiał biologiczny może składać się z roztworu enzymatycznego, takiego jak komórka lub komórki całe lub rozdrobnione, mającego aktywność nitrylazową.
PL 190 773 B1
Korzystnie stosuje się drobnoustroje z ekspresją nitrylazy.
Nitrylaza może pochodzić zwłaszcza z drobnoustroju, w szczególności drobnoustroju z rodzaju Alcaligenes, Rhodococcus lub Gordona, zwłaszcza Alcaligenes faecalis, Rhodococcus sp. HT 29-7, Gordona terrae, jak również z powodzeniem z tych opisanych w WO 96/09403.
Można stosować drobnoustrój z ekspresją aktywności nitrylazowej otrzymanej przez transfer informacji genetycznej kodującej nitrylazę, z drobnoustroju rodzicielskiego do mikroorganizmu gospodarza. W szczególności u E. coli można stosować koekspresję białek opiekuńczych Gro ESL do polepszenia wydajności szczepu rekombinacyjnego.
W tym celu stosuje się każ dy odpowiedni wektor ekspresyjny, zwłaszcza wektor plazmidowy.
Sekwencja nukleotydowa używana w tym wypadku będzie więc umieszczona pod kontrolą sygnałów pozwalających na jej ekspresję w gospodarzu komórkowym. Stosowany gospodarz komórkowy może być wybrany spośród układów prokariotycznych, jak bakterie Gram dodatnie lub Gram ujemne albo eukariotycznych, jak np. drożdże, grzyby lub z każdego innego układu. Sygnały kontrolujące ekspresję polipeptydów wybiera się zależnie od stosowanego gospodarza komórkowego. W tym celu DNA kodujący nitrylazę może ulegać insercji do wektorów replikacji autonomicznej w wybranym gospodarzu lub wektorów integracyjnych wybranego gospodarza. Takie wektory wytwarza się metodami powszechnie używanymi przez fachowca i powstałe konstrukcje można wprowadzić do odpowiedniego gospodarza standardowymi metodami, takimi jak elektroporacja.
Jako drobnoustrój, będący gospodarzem, można wymienić w szczególności Alcaligenes faecalis, Pseudomonas putida, Escherichia coli lub drobnoustroje z rodzaju Bacillus, Corynebacterium, Streptomyces, Saccharomyces, Kluyveromyces, Penicillum i Aspergillus.
Dogodnym wektorem ekspresyjnym w E. coli jest plazmid pRPA-BCAT6.
Drugi etap sposobu polega na unieczynnieniu materiału biologicznego. To unieczynnienie zachodzi dogodnie w obecności stałego nośnika i pozwala na otrzymanie stałych cząstek, których rozmiar, postać i odporność mechaniczną można kontrolować. Pozwala też na jednoczesne użycie polimeru poliazetydynowego i innych środków sieciujących.
Ten sposób unieczynnienia może zachodzić z udziałem komórek całych lub uczynionych przesączalnymi. Można też stosować roztwór enzymatyczny pozbawiony komórek.
Enzymami stosowanymi do unieczynnienia są nitrylazy.
Sposób unieczynnienia polega na unieczynnieniu aktywnego materiału biologicznego na stałym nośniku, o granulometrii od 1 μm do 3 mm, korzystnie od 10 μm do 2 mm, dzięki środkom chemicznym reagującym z grupami aminowymi (NH2, NH), karboksylowymi (COOH), hydroksy (OH), tiolowymi (SH) lub amidowymi (CONH2) czynnika biologicznego i nośnika. Te środki chemiczne pozwalają też uczynić materiał biologiczny i nośnik nierozpuszczalnymi w wodzie. Otrzymana masa jest bardzo ciągliwa i można ją formować, aby otrzymać cząstki o pożądanej postaci i rozmiarze. Kohezję i twardość tych cząstek otrzymuje się następnie przez suszenie.
Unieczynniany materiał biologiczny może ewentualnie też zawierać nieaktywny materiał biologiczny obecny w ilości 0-200% wagowych. Tym nieaktywnym materiałem biologicznym mogą być białka (albumina, żelatyna) lub polisacharydy (chitozan, k-karagenina, alginian).
Obojętny nośnik, na którym jest osadzony materiał biologiczny i polimer może składać się z cząstek organicznych lub nieorganicznych, porowatych lub nieporowatych, hydrofilowych lub hydrofobowych. Wśród cząstek można zasygnalizować nie ograniczająco:
- żywice jonowymienne,
- tlenek glinu,
- krzemionki syntetyczne lub okrzemkowe i żele krzemionkowe,
- zeolity,
- węgle,
- białka nierozpuszczalne w wodzie, jak gluten,
- polisacharydy, jak skrobia.
Obojętny nośnik można dodać w ilości 0,01-500% wagowych materiału biologicznego, a korzystnie 10-200%.
Środki chemiczne stosowane do spowodowania nierozpuszczalności materiału biologicznego mogą być polimerami lub cząsteczkami z dwoma grupami funkcyjnymi, które reagują z grupami aminowymi (NH2, NH), karboksylowymi (COOH), hydroksy (OH), tiolowymi (SH) lub amidowymi (CONH2). Można wymienić:
PL 190 773 B1
- polimery poliazetydynowe,
- polimery polietylenoiminowe,
- polimery poliamidowe,
- polimery izocyjanianowe,
- ż ele alginianowe,
- ż ele k-karageninowe,
- aminy jak heksametylenodiamina,
- aldehydy jak aldehyd glutarowy,
- kwasy karboksylowe jak kwas adypinowy
- oraz izocyjaniany.
Sposób unieczynniania może posługiwać się jednym lub kilkoma tymi środkami chemicznymi. Środek chemiczny dodaje się w stężeniu 1-50% wagowych w stosunku do materiału biologicznego i do no ś nika. Dla otrzymania czą stek dostatecznie trwałych, które zachowują dużą aktywność i które nie wykazują problemów z wewnętrzną dyfuzją dogodnie dodaje się go w ilości 5-30%.
Czas trwania zabiegu sieciowania wynosi 0,5-24 godzin.
Temperatura procesu wynosi generalnie 4-65°C. Zaleca się temperaturę 20-40°C. Temperatura stosowana podczas procesu unieczynniania może też bardzo zależeć od trwałości użytego materiału biologicznego.
W czasie fazy unieczynniania utrzymuje si ę pH 5-11. pH dogodnie wynosi 6-10 z preferencją w kierunku pH alkalicznego. Wartość pH dobiera się takż e w zależ noś ci od odpornoś ci materiału biologicznego i jest łatwo określone przez fachowca.
Ukształtowanie biokatalizatora powinno pozwolić na jego użycie w dowolnym układzie, zwłaszcza w złożu stałym.
Do sporządzania preparatu można zastosować wytłaczanie. Aby to wykonać, materiał biologiczny i nośnik zostają usieciowane przez dodatek jednego lub kilku środków chemicznych. Po zabiegu nierozpuszczalną masę odzyskuje się przez odwirowanie lub po flokulacji i przesączeniu. Odpowiednia zawartość suchej masy wynosi co najmniej 10%. Następnie masę się wytłacza. Przy użyciu tego sposobu otrzymuje się korzystnie postać makaronu o średnicy 0,3-0,5 mm i długości 1-10 mm. Ten makaron można przekształcić w kulki. Następnie suszy się otrzymane cząstki.
Innym sposobem sporządzania preparatu jest nanoszenie warstwy (ang. „spray coating). Aby to wykonać, materiał biologiczny miesza się z jednym lub kilkoma środkami chemicznymi. Po reakcji mieszaninę natryskuje się na nośnik w postaci cienkiej warstwy. Dzięki tej metodzie otrzymuje się granulki o przeciętnej średnicy 0,1-2 mm.
Uzyskane cząstki ewentualnie można następnie zanurzyć w roztworze środka redukującego, jak borowodorek sodu w celu zredukowania grup iminowych utworzonych podczas sieciowania.
Otrzymane cząstki są wystarczająco trwałe i odporne na ścieranie, aby je zastosować w złożu stałym, złożu fluidalnym lub reaktorze z mieszaniem.
Trzeci etap ciągłego sposobu według wynalazku polega na użyciu unieczynnionego materiału biologicznego w jednej lub kilku kolumnach lub reaktorach. Celem tego etapu jest możność ciągłej produkcji soli amonowej kwasu 2-hydroksy-4-metylotiomasłowego z 2-hydroksy-4-metylotiobutyronitrylu.
Kolumna lub kolumny albo reaktory są zaopatrywane przez roztwór czysty lub rozcieńczony 2-hydroksy-4-metylotiobutyronitrylu lub mieszaninę 2-hydroksy-4-metylotiobutyrobutyronitrylu i soli amonowej kwasu 2-hydroksy-4-metylotiomasłowego.
Kolumna lub kolumny albo reaktory pracują dogodnie w temperaturze 10-60°C i przy pH 5-9.
Używany układ może być utworzony z dwóch lub kilku kolumn, połączonych ze sobą szeregowo i z zaopatrzeniem wodnym roztworem 2-hydroksy-4-metylotiobutyronitrylu na szczycie pierwszej kolumny przy jednoczesnym zaopatrzeniu innych kolumn roztworem 2-hydroksy-4-metylotiobutyronitrylu o zawartoś ci ograniczonej rozpuszczalnoś cią tego zwią zku w mieszaninie reakcyjnej; ten układ nosi nazwę układu stopniowego. Można też stosować jedną lub kilka kolumn połączonych ze sobą równolegle w obwód cyrkulacyjny. W tej instalacji 2-hydroksy-4-metylotiobutyronitryl w roztworze wodnym jest dostarczany w sposób ciągły do obwodu, a środowisko reakcyjne pompuje się w sposób ciągły tak, aby zachować stałą objętość w obwodzie; ten układ nosi nazwę układu zamkniętego.
Reaktor stosowany w tym wynalazku może być typu ze złożem stałym, ze złożem fluidalnym lub typu z ciągłym mieszaniem. Dogodnie stosuje się reaktory typu ze złożem stałym, ponieważ zmniejszają one problemy ze ścieraniem, na które można się natknąć przy cząstkach unieczynnionych koPL 190 773 B1 mórek. Jeśli drobnoustrój jest używany jako taki, zaleca się stosować reaktor z mieszaniem sprzężony z modułem do ultrafiltracji do oddzielania w sposób cią gły drobnoustroju od interesują cego produktu.
Etap czwarty, który jest etapem fakultatywnym polega na przekształceniu soli amonowej kwasu 2-hydroksy-4-metylotiomasłowego w odpowiedni kwas. Etap ten można wykonać dwoma sposobami:
- albo przez elektrodializę za pomocą elektrodializera z dwoma lub trzema przedziałami,
- albo przez ogrzewanie wodnego roztworu, po którym moż e nastą pić ekstrakcja ciecz/ciecz.
W sposobie z uż yciem elektrodializy stosuje się elektrodializer z dwoma lub trzema przedziałami.
Przez „przedział rozumie się przestrzeń albo między dwiema membranami, albo między membraną bipolarną i homopolarną, lub między dwiema przyległymi membranami homopolarnymi. Przez „komorę rozumie się zespół dwóch lub trzech przedziałów. Blok zawiera 5-300 komór.
Elektrodializer jest złożony z bloku i obejmuje oczywiście anodę i katodę.
Membrany homopolarne, które można tu również zastosować, dzielą się na dwie wielkie rodziny zależnie od sposobu ich produkcji.
A wię c moż na uż ywać membran heterogennych, wytwarzanych z ż ywic jonowymiennych, zmieszanych ze spoiwem, takim jak polichlorek winylu, polietylen lub inne. Tak utworzoną mieszaniną można powlekać tramę, jak np. tkaninę z poliestru lub poliakrylonitrylu.
Można też stosować membrany homogenne, otrzymane przez wprowadzenie grupy funkcyjnej do obojętnego nośnika, przez szczepienie chemiczne lub radiochemiczne.
Najczęściej stosowana metoda chemiczna polega generalnie na wprowadzeniu grup funkcyjnych do lateksu polimeru zawierającego pierścienie aromatyczne, takie jak styren/diwinylobenzen lub styren/butadien. Taki lateks z grupami funkcyjnymi może służyć następnie do powlekania tramy, jak w wypadku membran heterogenicznych. Metoda radiochemiczna obejmuje generalnie szczepienie związku aromatycznego, takiego jak styren, pod wpływem promieniowania na obojętnym nośniku, jak folia polietylenowa lub politetrafluoroetylenowa. Do pierścienia aromatycznego wprowadza się następnie grupy funkcyjne, jak w metodzie chemicznej.
Membrany kationowymienne zawierają mocne grupy kwasowe, najczęściej grupy sulfonianowe lub słabe grupy kwasowe, często grupy karboksylanowe. Rzadziej grupami kwasowymi mogą być grupy PO3 2-, HPO-2, AsO3 2-, SeO3 -.
Membrany anionowymienne zawierają mocne grupy zasadowe, najczęściej czwartorzędowe grupy amoniowe lub słabe grupy zasadowe, najczęściej grupy aminowe. Rzadziej grupami zasadowymi mogą być czwartorzędowe grupy fosfoniowe lub grupy sulfoniowe.
W niniejszym ci ą głym sposobie, membrany kationowe mogą dogodnie zawierać mocne grupy kwasowe, a wśród nich przede wszystkim grupy sulfonianowe a membrany anionowe mogą zawierać dogodnie mocne grupy zasadowe i wśród nich czwartorzędowe grupy amoniowe.
Membrany bipolarne stanowią zespół dwóch membran, jednej kationowej i drugiej anionowej. Gdy na membranę podziała się wystarczającym polem elektrycznym, woda solwatacyjna na powierzchni granicznej membrany dysocjuje na jony H+ i OH-, które migrują odpowiednio do katody, przekraczając stronę kationową i do anody, przekraczając stronę anionową. Jako membrany bipolarne można wymienić przykładowo membrany komercjalizowane przez towarzystwa Aqualytics, Tokuyama Soda lub FuMaTech.
Anoda elektrodializera może być utworzona z materiałów stosowanych klasycznie w elektrodializie np. z grafitu, niklu lub tytanu, pokrytego metalami szlachetnymi lub tlenkami szlachetnych metali, zwłaszcza z tytanu platynowanego. Katoda może być również utworzona z materiałów stosowanych klasycznie w elektrodializie np. z grafitu, stali nierdzewnej lub niklu.
Elektrodializer jest zaopatrywany wodnym roztworem do obróbki. Potrzebna jest też cyrkulacja roztworu anolitu do anody i roztworu katolitu do katody. Można także stosować jeden roztwór elektrolitu. W niniejszym sposobie jest odpowiedni jeden obieg elektrolitu. Zadaniem roztworu elektrolitu jest zapewnienie wystarczającego przewodnictwa. Dogodnie to przewodnictwo jest równe lub wyższe od 20 milisiemensów na centymetr (mS/cm3), z tym, że dolna granica nie jest krytyczna dla prowadzenia sposobu.
Stosowany elektrolit jest związkiem zdolnym do jonizacji, takim jak sól, kwas lub zasada. Elektrolit wybiera się dogodnie spośród związków nieelektroaktywnych. Tak więc np. zaleca się użycie obojętnych soli jak siarczany, kwasów jak kwas siarkowy, zasad jak wodorotlenek sodu.
Stosowane gęstości prądu wynoszą generalnie 0,2-1,5 kA/m2, a dogodnie 0,4-1 kA/m2.
PL 190 773 B1
Temperatura, w jakiej prowadzi się sposób według wynalazku, znajduje się w zakresie zgodnym ze stabilnością membran. Zaleca się temperatury 30-60°C.
Elektrodializer może funkcjonować w różny sposób. Przede wszystkim może działać w sposób ciągły, przy czym traktowany roztwór przechodzi przez blok w sposób ciągły; kilka stopni jest więc ustawionych szeregowo, jeśli wymaga tego wskaźnik obróbki, który należy uzyskać. Może też funkcjonować w sposób nieciągły, przy czym traktowany roztwór recyrkuluje w zbiorniku do uzyskania pożądanego stopnia obróbki. Może na koniec działać z przejściem bezpośrednim przy częściowej recyrkulacji.
W jednej z postaci realizacji wynalazku dysocjacja soli amonowej na kwas 2-hydroksy-4-(metylotio)butanowy i amoniak może zachodzić w komorze do elektrodializy z membranami bipolarnymi o trzech przedziałach, jaką przedstawiono schematycznie na fig. 1A.
Aparat do elektrodializy nadający się do wykonania sposobu jest utworzony z różnych przedziałów, odpowiednio ograniczonych membranami kationowymi (MC), membranami bipolarnymi (MB) i membranami anionowymi (MA). Te przedziały dzielą się na przedział soli (S), który staje się coraz uboższy w związki rozdzielane, na przedział zasadowy (B) i kwasowy (A), gdzie rośnie stężenie odpowiednio kwasu i zasady, regenerowanych z soli.
Sól amonową wprowadza się do przedziału soli. Pod wpływem pola elektrycznego jon amonowy migruje do katody, opuszczając przedział (S), gdzie się znajduje, przez membranę kationowymienną (membranę kationową) i łączy się z jonami OH-, pochodzącymi ze strony anionowej membrany bipolarnej, w której zachodzi dysocjacja wody pod wpływem pola elektrycznego.
Jednocześnie jony karboksylanowe (2-hydroksy-4-(metylotio)butanianowe) migrują do anody, opuszczając przedział (S), gdzie się znajdują, przez membranę anionowymienną (membranę anionową). Po przejściu przez następny przedział (A) są one protonowane przez wprowadzone jony H+, pochodzące ze strony kationowej membrany bipolarnej. Trzy przyległe przedziały (B), (A), (S) tworzą komorę do elektrodializy.
W innej z postaci realizacji wynalazku regeneracja kwasu 2-hydroksy-4-(metylotio)butanowego może zachodzić w komorze do elektrodializy z membranami bipolarnymi o dwóch przedziałach, jaką przedstawiono na fig. 1B. Te dwa przedziały są ograniczone odpowiednio membranami kationowymi i membranami bipolarnymi. Przedziały te dzielą się na przedział sól/kwas (S/A) i zasadowy (B).
Sól amonową wprowadza się do przedziału sól/kwas. Pod wpływem pola elektrycznego jon amonowy migruje do katody, opuszczając przedział (S/A), gdzie się znajduje, przez membranę kationowymienną (membranę kationową) i łączy się z jonami OH-, pochodzącymi ze strony anionowej membrany bipolarnej, w której zachodzi dysocjacja wody pod wpływem pola elektrycznego.
Jednocześnie przedział S/A zakwasza się przez wprowadzone jony H+, pochodzące ze strony kationowej membrany bipolarnej. Dwa przyległe przedziały (B) i (S/A) tworzą komorę do elektrodializy.
Taki układ daje korzyść, polegającą na zmniejszeniu zużycia energii i pozwala na zmienianie żądanego stosunku sól/kwas.
Aby uzyskać dobre działanie elektrodializera przewodnictwo elektryczne w przedziale zasadowym (tak samo jak w przedziale kwasowym w wypadku układu o trzech przedziałach), powinno być wystarczające i można je wyregulować przez dodatek elektrolitu podstawowego. Tak więc przewodnictwo roztworu amoniaku można zwiększyć, dodając sól amonową, jak siarczan amonu.
W zalecanym wariancie wynalazku można stosować 2-hydroksy-4-metylotiobutanian amonu.
W szczególnej postaci realizacji, do przedziału soli komory do elektrodializy o trzech przedziałach wprowadza się mieszaninę soli amonowej kwasu 2-hydroksy-4-metylotiomasłowego i 2-hydroksy-4-metylotiobutyronitrylu.
Sól dysocjuje jak poprzednio, na 2-hydroksy-4-metylotiomaślan i będzie migrować do anody, gdzie przekształca się w kwas 2-hydroksy-4-metylotiomasłowy, a jon amonowy będzie migrować do katody, gdzie przekształci się na amoniak, w przedziale solnym będzie istnieć woda i nieprzekształcony 2-hydroksy-4-metylotiobutyronitryl, który zawraca się na kolumnę hydrolityczną.
Według sposobu z ogrzewaniem, odzyskuje się kwas, przesuwając równowagę soli amonowej i wolnego kwasu, ogrzewają c wodny roztwór bogaty w HMTBS i odprowadzają c tak uwolniony amoniak. Można go ogrzewać pod zmniejszonym ciśnieniem lub pod ciśnieniem atmosferycznym z obróbką przez stripping lub bez niej. Można brać pod uwagę użycie CO2 pod ciśnieniem dla ułatwienia przesunięcia równowagi.
PL 190 773 B1
Otrzymuje się mieszaninę HMTBS i HMBTA o zawartości 5-99,9% HMBTA, dogodnie 10-50% HMBTA w stosunku do sumy HMBTA i HMTBS. Lepkość tych roztworów wynosi 1200-30 mm2. s-1 (1200-30 cSt), a dogodnie 200-50 mm2.s-1 (200-50 cSt) w temperaturze 25°C.
Roztwory wodne można rozkładać przez ekstrakcję kwasu z użyciem produktów, będących rozpuszczalnikami częściowo lub wcale niemieszalnych z wodą. Istnieje duża ilość rozpuszczalników nadających się do rozdzielania. Zalecanymi rozpuszczalnikami są ketony o C5 do C8, w szczególności keton metylowo-izobutylowy; etery jak eter izopropylowy; alkohole jak izopropanol; estry; aminytrzeciorzędowe jak trioktyloamina. Zalecanymi rozpuszczalnikami są: aceton, MIBK, izopropanol, octan izopropylu, eter izobutylowy lub propylowy albo THF, trioktyloamina. Stosunek fazy wodnej do fazy organicznej nie jest krytyczny. Jednak ze względu na stopień skuteczności nie powinno się zmniejszać poniżej stosunku minimalnego 1/1, a ze względu na opłacalność nie przekraczać stosunku 1/3. Zaleca się stosunek 1/1,5 do 2.
Ekstrakcję można prowadzić metodą okresową lub ciągłą przy dowolnym typie technologii ekstrakcji ciecz-ciecz. Można np. wymienić kaskadę mieszalników z dekantowaniem we współprądzie lub przeciwprądzie, ekstraktory wirówkowe, kolumny z wypełnieniem lub półkowe itd.
Roztwór wodny, zubożony w wolny kwas można przerabiać od nowa tyle razy, ile się chce, aż do całkowitego wyczerpania amoniaku, jeżeli jest to wskazane.
Fazę organiczną poddaje się przerobowi dla wydzielenia HMTBA. Realizuje się to dogodnie przez odparowanie rozpuszczalnika lub przez ekstrakcję gorącą wodą. W celu uniknięcia ewentualnego pogorszenia jakości HMTBA można utrzymywać możliwie małe obciążenie termiczne przy zastosowaniu zmniejszonego ciśnienia.
W tych dwóch sposobach dysocjacji soli amonowej tworzy się wodny roztwór amoniaku. Moż na go przerabiać w celu zatężenia wody amoniakalnej. Zaleca się destylację i zatężenie wody amoniakalnej jedno- lub kilkustopniowe pod ciśnieniem lub bez niego. Można przewidzieć wstępny etap strippingu. Zatężony roztwór amoniaku można skierować do syntezy kwasu cyjanowodorowego, który bierze udział w syntezie 2-hydroksy-4-metylotiobutyronitrylu.
W pią tym etapie zatęża się wodny roztwór HMTBS i/lub wolnego kwasu. Wykonuje się to dogodnie przez odparowanie wody.
Przedmiotem wynalazku jest też instalacja do przeprowadzania sposobu według wynalazku. Instalację taką objaśniono schematycznie na fig. 2 i obejmuje przewody 1,2 przeznaczone do wprowadzenia cyjanohydryny z AMTP i wody do reaktora 3. Reaktor 3 ma złoże stałe z recyrkulacją, które zawiera unieczynnione szczepy lub enzymy. Część roztworu jest wyprowadzona z reaktora 3 i przesłana do reaktora końcowego 4. Reaktor końcowy 4 jest typu ze złożem stałym, zawierającym unieczynnione szczepy lub enzymy. Zatężony roztwór HMTBS odzyskuje się następnie przy wyjściu z reaktora 4 przez przewód 5.
Ten zatężony roztwór HMTBS można poddać dwóm zupełnie niezależnym zabiegom zgodnie z żą danym typem koń cowego produktu.
Gdy chce się uzyskać produkt mający dużą zawartość HMTBS, roztwór z przewodu 5 kieruje się do odparowalnika 6, który pozwala na zatężenie produktu i odzyskuje się w przewodzie 8 stężony roztwór złożony głównie z HMTBS, zawierający mało wolnego kwasu. Nadmiar wody oraz frakcję amoniakalną odprowadza się przewodem 7.
Gdy chce się uzyskać produkt mający dużą zawartość wolnego kwasu, stężony roztwór HMBTS z przewodu 5 wprowadza się do układu elektrodializy bipolarnej 9. W tym aparacie amoniak jest mniej lub bardziej oddzielony od kwasu przez elektrodializę. Mieszaninę zubożoną w amon odzyskuje się w przewodzie 11, po czym zatęża w odparowalniku 12 w celu otrzymania stężonego roztworu złoż onego głównie z wolnego kwasu i zawierającego mało lub wcale HMTBS. Roztwór bogaty w amoniak odprowadza się przewodem. Amoniak odzyskuje się przez stripping 15.
Ten odpad amoniaku można zatężyć przez destylację 16, wodę odzyskuje się w 18. Stężony roztwór amoniaku 17 można zawrócić do syntezy HCN.
Wynalazek objaśniają następujące przykłady.
P r z y k ł a d y
P r z y k ł a d 1: Oczyszczanie i sekwencjonowanie Nter nitrylazy
Nitrylazę oczyszczono w czterech etapach.
Podsumowanie oczyszczania podano w tabeli 1.
Komórki Alcaligenes faecalis hodowano przez 24 godziny, w temperaturze 30°C, w pożywce z minimum benzonitrylu (0,5 g/litr). Po odwirowaniu hodowli, osad wprowadzono do buforu TG (25 mM
PL 190 773 B1
Tris-HCl, 10% (ciężar/ciężar) glicerolu, pH 7,5). Zawiesinę komórkową potraktowano ultradźwiękami, po czym odwirowano w celu otrzymania surowego ekstraktu. Surowy ekstrakt potraktowano następnie siarczanem amonu do 30% nasycenia. Otrzymany osad znów zawieszono w buforze TG, po czym dializowano 2 litrami tego samego buforu przez noc. Uzyskany roztwór umieszczono następnie na kolumnie anionowymiennej Q Sepharose Fast Flow HR 26/10, uprzednio doprowadzonej do równowagi buforem TG. Substancję aktywną eluowano potem gradientem 0-1M NaCl. Frakcje aktywne umieszczono następnie na kolumnie anionowymiennej Mono Q HR 5/5, uprzednio doprowadzonej do równowagi buforem TG. Nitrylazę eluowano z użyciem gradientu 0-1M NaCl. Na koniec zebrano frakcje z substancją aktywną i stężenie siarczanu amonu doprowadzono do 1M. Potem ten roztwór umieszczono na kolumnie z interakcjami hydrofobowymi Phenyl Superose HR 5/5, uprzednio doprowadzonej do równowagi buforem TG z dodatkiem 1M (NH4)2SO4. Substancję aktywną eluowano potem gradientem od 1M do 0M siarczanu amonu.
T a b e l a 1
Podsumowanie oczyszczania nitrylazy
| Frakcja | Produkt ogółem (mg) | Aktywność całkowita Umol/h) | Aktywność specyficzna Umol/h.mg) | Wydajność białka (%) | Stopień oczyszczenia |
| Komórki całe | 955 | 4300 | 4,5 | 100 | 1 |
| Ekstrakt Nie przetworzony | 2400 | ||||
| Siarczan amonu | 650 | ||||
| QSHL26/10 | 3 | 360 | 120 | 0,3 | 27 |
| MonoQHR5/5 | 1,5 | 240 | 160 | 0,15 | 35 |
| Phenyl sepharose | 1 | 120 | 110 | 0,1 | 24 |
Warunki operacyjne: [nitryl] = 50 mM; bufor fosforanowy 100 mM, pH 7,0; 30°C.
Masę cząsteczkową białka oznaczono na drodze filtracji żelowej. Wyniosła ona około 260 kDa.
Na żelu SDS-PAGE obserwowano jedyne pasmo o 43 kDa (czystość 95%). Jest to prawdopodobnie białko o strukturze α6 z α ważącym 43 kDa.
P r z y k ł a d 2: Klonowanie nitrylazy Alcaligenes faecalis ATCC8750
Terminalna sekwencja NH2 przedstawiona w przykładzie 1 wykazuje całkowitą identyczność z sekwencją z koń ca N-terminalnego nitrylazy A.faecalis JM3 (Kobayashi i in.,1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90,247-251), podczas gdy końce N-terminalne nitrylaz bakteryjnych wykazują 35-57% identyczności w 14 resztach. Wynalazcy postawili hipotezę, że oczyszczona nitrylaza według wynalazku ze szczepu ATCC8750 była podobna do opisanej przez Kobayashi i in. (cytowany wyżej). Strategia klonowania polegała więc na powieleniu genu tej nitrylazy przez reakcję PCR na DNA genomowym szczepu ATCC8750, przy użyciu dwóch oznaczonych sond nukleotydowych z sekwencji podanej przez Kobayashi i in. (cytowany wyżej).
Zsyntetyzowano dwie sondy, jedną, która może się hybrydyzować z częścią 5' sekwencji podanej przez Kobayashi i in. (cytowany wyżej) i drugą z częścią 3':
Część 5' (PCRAF1): CCGGGAATTCATATGCAGACAAGAAAAATCGTCC
Część 3' (PCRAF2): TCCTTCTGCGTCCCCGATCCCGCAT
Starter PCRAF1 zawiera 12 nukleotydów w 5', pozwalających na wprowadzenie powyżej kodonu inicjacji ATG miejsc restrykcji enzymów EcoRI i Ndel. Starter PCRAF2 pozwala na wprowadzenie miejsca restrykcji enzymu BamHI.
Genomowy DNA szczepu A. faecalis ATCC8750 wyekstrahowano według protokołu CTAB opisanego przez Ausubela i in. (Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons Inc. Ed, 2.4.1-2.4.5) i użyto 100 ng do każdej reakcji PCR. Dla wykorzystania specyfiki powielania testowano różne stężenia MgCl2, jak podano u Ausubela i in. (cytowany wyżej) w całkowitej objętości próbki 100 μΐ i z 2,5 jednostki polimerazy DNA Taq (Perkin Elmer). Wykonano dwie uzupełniające reakcje z 1,5mM MgCl2 i 5% DMSO lub 5% formamidu. Aparat termocykliczny Perkin Elmer 9600 zaprogramowano na następujący ciąg cykli: 5 minut w temperaturze 95°C, 30 cykli (30 sek w temperaturze 95°C, 30 sek w temperaturze 55°C, 45 sek w temperaturze 72°C) i 4 minuty w temperaturze 72°C.
PL 190 773 B1
Różne produkty powielenia analizowano na 0,8% żelu agarozowym. Pasmo przeważające, którego rozmiar odpowiadał oczekiwanemu rozmiarowi 1,15 kb, było powielone we wszystkich reakcjach, ale bardziej specyficznie z 1,5mM MgCl2 i 5% DMSO. Produkty reakcji w tych warunkach zatrzymano więc do dalszego użytku. Próbkę potraktowano proteinazą K, wytrącono etanolem po ekstrakcji fenolchloroform. Osad w zawiesinie inkubowano w ciągu 2 godzin w temperaturze 37°C z 40 jednostkami enzymu EcoRI i 40 jednostkami enzymu BamHl. Po migracji na 0,7% żelu agarozowym, pasmo o 1,15 kb wycięto i ekstrahowano w celu klonowania w wektorze pBSK- (Stratagene, La Jolla, USA) otwartym EcoRI-BamHI metodami klasycznymi. Pięć niezależnych klonów nazwanych pRPA-BCAT1-5, analizowano przez trawienie enzymatyczne plazmidowego DNA enzymami Ndel, EcoRI, BamHI, BspMI i BgΛ1 (fig. 3). Otrzymane profile odpowiadały profilom teoretycznej restrykcji plazmidu otrzymanego tą metodą z sekwencją opisaną przez Kobayashi i in. (cytowany wyżej). Szczep XLI Blue (pRPA-BCAT3) złożono w CBS pod numerem CBS 998-96.
P r z y k ł a d 3: Sekwencjonowanie fragmentu 1130 p.z. zawierającego DNA kodujący polipeptyd mający aktywność nitrylazową.
Insert klonowany w plazmidzie pRPA-BCAT3 został sekwencjonowany przez towarzystwo Genome Ekspress S.A. (Grenoble, Francja) z preparatu DNA wykonanego w laboratorium (zestaw Wizzard Midi-prep, Promega).
Strategię sekwencjonowania tego fragmentu, wykonaną klasycznymi metodami znanymi fachowcowi, podano na fig. 4.
Dziesięć starterów nukleotydowych wewnętrznych (identyfikowanych przez numery 623-629 i 681-682 na fig. 4) syntetyzowano po sekwencji nitrylazy A.faecalis JM3 (Kobayashi i in. cytowany wyżej). Ten zespół uzupełniono starterami uniwersalnymi „Reverse i „M13 Forward. Każdy region został odczytany co najmniej jeden raz na każdej nici DNA.
Otrzymana sekwencja DNA wykazuje dwie różnice w stosunku do opublikowanej sekwencji: jedną w strukturze przypuszczalnie służącej jako terminator transkrypcji i drugą w genie nitrylazy, nazwanym nitB, prowadzącym do podstawienia Asn279-->Asp. Te dwa regiony zostały więc sekwencjonowane w laboratorium na plazmidach pRPA-BCAT1, 2, 4, 5 z dwoma starterami specyficznymi 710 i 682 (porównaj fig. 4). Zmiana C->T w pozycji 1412 (zgodnie z numeracją Kobayashi, cytowanym wyżej) w terminatorze została odnaleziona we wszystkich klonach. Chodzi o mutację, która różnicuje dwa szczepy A.faecalis. Zmiana A->G w pozycji 1138 jest obecna tylko w plazmidzie pRPA-BCAT3. Chodzi więc o mutację wprowadzoną podczas PCR przez polimerazę DNA Taq.
P r z y k ł a d 4: Ekspresja nitrylazy w E. coli BL21 (DE3)
Celem potwierdzenia identyfikacji klonowanej sekwencji DNA z genem oczyszczonej nitrylazy, gen nitB umieszczono pod kontrolą promotora genu Φ10 faga T7 (PT7) według procedury operacyjnej opisanej niżej: inserty Ndel-BamHI o 1,13-kb plazmidów pRPA-BCAT3 i pRPA-BCAT4 sklonowano w wektorze pXL2432, aby uzyskać odpowiednio wektory pRPA-BCAT12 i pRPA-BCAT13 opisane na fig. 5. Wektor rodzicielski pXL2432 jest hybrydą między regionem plazmidu pET9 (Studier i in.,1990, Methods In Enzymol., 185,60-89), zawartym między miejscami AccI i EcoRI, który wiąże początek replikacji (ORI) i marker selekcji niosący odporność na kanamycynę (Kan) oraz regionem zawartym między miejscami EcoRI i AccI plazmidu pET11a (Novagen Inc., Madison WI, USA), który wiąże kasetę ekspresji, gen represorowy lacI i gen regulatorowy liczby kopii ROP.
Hodowle prowadzono w warunkach indukcji według poniższej procedury operacyjnej: Szczep BL21 (DE3) (Novagen Inc., Madison WI, USA), zawierający plazmid pRPA-BCAT12, szczep BL21 (DE3), zawierający plazmid pRPA-BCAT13 oraz szczep BL21 (DE3), zawierający plazmid pXL2432 hodowano 16 godzin w pożywce LB w temperaturze 37°C (Miller, 1972, Experiments in Molecular Genetics - Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.), zawierającym 50 μg/ml kanamycyny, potem rozcieńczonym 100-krotnie w tej samej pożywce i tej samej temperaturze. Gdy hodowle osiągnęły DO600 wynoszące 0,5-1, dodano IPTG do końcowego stężenia 1 mM. Po 6 godzinach hodowli zebrano bakterie. Podobną procedurę operacyjną przystosowano do hodowli szczepu BL21 (DE3), zawierającego plazmidy pRPA-BCAT12 i pXL2231, szczepu BL21 (DE3), zawierającego plazmidy pRPA-BCAT13 i pXL2231 oraz szczepu BL21 (DE3), zawierającego plazmidy pXL2432 i pXL2231, dodając do środowiska hodowli tetracyklinę w ilości 12 μg/ml pożywki.
Plazmid pXL2231, który pochodzi od wektora pXL1635 (Demande FR 90/05185 z 24/04/1990) należy do grupy niezgodności IncP i jest więc zgodny z plazmidami pRPA-BCAT12 i 13, które posiadają początek replikacji plazmidu CoIE1. Jego markerem selekcji jest oporność na
PL 190 773 B1 tetracyklinę i niesie on fragment EcoRI-Hindlll o 2,2 kb, zawierający geny GroES i GroEL, kodujące czapeczki cząsteczkowe E. coli (Fayet i in., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 435-445).
Ekspresję nitrylazy analizowano na 10% żelu SDS-PA w L surowej frakcji po poddaniu komórek działaniu dźwięków, i po odwirowaniu w osadzie i supernatancie. Wyniki przedstawiono na fig. 6, pokazują one wysoki poziom ekspresji nitrylazy (NitB) w ekstraktach komórek, których co najmniej jeden plazmid zawiera insert nitB; jednakże to białko jest zasadniczo w postaci nierozpuszczalnej, chociaż obecność plazmidu pXL2231 pozwala na zwiększenie ilości polipeptydu nitrylazowego w rozpuszczalnej frakcji.
Na fig. 6 M oznacza marker mas cząsteczkowych; są one podane w kDa. Poza tym pasma mają poniższe znaczenia:
- A, D, G oznaczają frakcje nie przetworzone odpowiednio BL21 (DE3) + p/RPA-BCAT12/RPA-BCAT13/XL2432;
- B, E, H oznaczają supernatanty otrzymane odpowiednio z tych samych szczepów;
- C, F, I oznaczają osady otrzymane odpowiednio z tych samych szczepów;
- J, N, Q oznaczają surowe frakcje otrzymane odpowiednio z BL21 (DE3) + pXL2231 + p/RPA-BCAT12/RPA-BCAT13/XL2432;
- K, O, R oznaczają supernatanty otrzymane odpowiednio z tych szczepów;
- L, P, S oznaczają osady otrzymane odpowiednio z tych szczepów.
Szczep BL21(DE3) / pRPA-BCAT12 + pXL2231 nazwano RPA-BIOCAT126. Szczep BL21(DE3) / pRPA-BCAT13 + pXL2231 nazwano RPA-BIOCAT127. Aktywność nitrylazowa hodowli RPA-BIOCAT126, RPA-BIOCAT127 i RPA-BIOCAT66, który odpowiada BL21(DE3) / pXL2432 oznaczono jak następuje: hodowle prowadzono według protokołu opisanego powyżej, zmieniając objętość hodowli (50 ml) i stężenie końcowe ITPG (0,1 mM). Hodowle odwirowano i osady komórkowe wprowadzono do 10 ml 100 mM buforu z fosforanu potasu o pH 7. Hydrolizę HMTBN wykonano z 500 μΐ tej zawiesiny dodanej do 500 μl 200 mM roztworu HMTBN o pH 7. Kinetykę hydrolizy osiągnięto, mieszając 100 tej mieszaniny z 900 μl 0,1N kwasu fosforowego w regularnych odstępach w ciągu 1-4 godzin. Ilości wytwarzanego MTBA analizowano na drodze HPLC, jak opisano w zgłoszeniu patentowym WO 96/09403. Wyniki zgrupowano w tabeli 2.
T a b e l a 2
Aktywności szczepów RPA-BIOCAT66, 126 i 127
| RPA-BIOCAT | Pożywka | Indukcja | Czas hodowli | OD660 | Aktywność (U) |
| 66 | LB Km | 0,1 mM ITPG | 24 h | 2,5 | 0 |
| 126 | LB Km Tc | 0,1 mM ITPG | 24 h | 2,4 | 15 |
| 127 | LB Km Tc | 0,1 mM ITPG | 24 h | 1,9 | 10 |
Skróty: Km: Kanamycyna 50 μg/ml; Tc: tetracyklina 12 μg/ml; h: godziny; U: kg HMTBA utworzony na godzinę i na kg suchej masy.
Dla polepszenia rozpuszczalności polipeptydu nitrylazowego powstałego w wyniku ekspresji, skonstruowano jak niżej plazmid pRPA-BCAT37. Otrzymano plazmid pXL2391 przez ligację fragmentu o 5,9 kb EcoRI-PvuII plazmidu pDSK519 (Keen i in., 1988, Gene 70,191-197), traktowanego polimerazą Klenowa, z fragmentem Hindlll o 2056 pz ekstrahowanym z plazmidu pHP45ΩSp (Prentki i Krisch, 1984, Gene 29, 303-313) traktowanym nukleazą Mung Bean. Plazmid pXL2391 trawiono następnie przez Smal i SacI i wprowadzono tam insert o 2,3 kb, niosący operon GroESL, ekstrahowany z plazmidu pXL2231 trawionego przez Hindlll, traktowany Klenowem i trawiony przez SacI. Plazmid pRPA-BCAT37 jest więc pochodną plazmidu RSF1010 o większej liczbie kopii, niż plazmid pXL2231, zgodny z plazmidami nośnikami początku CoIE1 i niosący marker oporności na streptomycynę. Ten plazmid wprowadzono do szczepu BL21(DE3)/pRPA-BCAT12, uzyskując szczep RPA-BIOCAT171. Aktywność hodowli prowadzonej zgodnie procedurą operacyjną podobną do opisanej powyżej, ale zastępując tetracyklinę streptomycyną o 100 μg/ml oznaczono i przedstawiono w tabeli 3.
PL 190 773 B1
T a b e l a 3
Aktywność szczepu RPA-BIOCAT171
| RPA-BIOCAT | Pożywka | Indukcja | Czas hodowli | OD660 | Aktywność (U) |
| 171 | LB Km Sm | 0,1 mM ITPG | 24 h | 3,2 | 14 |
Skróty: Km: Kanamycyna 50 μg/ml; Sm: streptomycyna 100 μg/ml; h: godziny; U: kg HMTBA utworzony na godzinę i na kg suchej masy.
P r z y k ł a d 5: Ekspresja nitrylazy w E. coli DH5a
Plazmid pRPA-BCAT6 skonstruowano, klonując na pBCAT3 (porównaj fig. 3) fragment o 0,6 kb Scal-Ndel z pXL2158, zawierający promotor Ptrp i miejsce przyłączenia rybosomu RBScII (Levy-Schill i in.,1995, Gene 161, 15-20). Ekspresję zrealizowano przy użyciu szczepu DH5a, zawierającego plazmid pRPA-BCAT6 i/lub plazmid pXL2035 (Levy-Schill i in. przytoczony uprzednio) przy następującej procedurze operacyjnej: hodowlę wstępną inkubowano 16 godzin w temperaturze 37°C w pożywce M9 glukozy (J.H.Miller, 1972, Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.), zawierającej 0,4% casaminokwasów (casaminoacides), 100 μg/ml tryptofanu, 100 μg/ml karbenicyliny. Do szczepów, zawierających pXL2035, dodano kanamycynę w ilości 50 μg/ml. Ekspresja zachodzi po rozcieńczeniu do 1/100 hodowli nasyconej w identycznej pożywce, ale bez tryptofanu i inkubacji 8-16 godzin w temperaturze 37°C.
Analizę na SDS-PAGE ekstraktów różnych szczepów wykonano jak opisano w poprzednim przykładzie i przedstawiono na fig. 7.
Na tej fig. M oznacza marker mas cząsteczkowych; są one podane w kDa. Z drugiej strony pasma mają poniższe znaczenia:
- L, I, F, C oznaczają surowe frakcje otrzymane odpowiednio ze szczepów DH5a + pRPA-BCAT/3, /6, /6 + pXL2035, RPA-BIOCAT76;
- K, H, E, B oznaczają supernatanty otrzymane odpowiednio z tych samych szczepów;
- J, G, D, A oznaczają osady otrzymane odpowiednio z tych samych szczepów.
Plazmid pRPA-BCAT6 pozwala na otrzymanie małej akumulacji polipeptydu o 43 kDa, przeważnie nierozpuszczalnego. Koekspresja GroE z plazmidu pXL2035 redukuje nadekspresję, ale po trzech kolejnych przeszczepieniach szczepu DH5a (pRPA-BCAT6 + pXL2035) wyselekcjonowany szczep RPA-BIOCAT76 odnajduje początkowy poziom ekspresji polipeptydu nitrylazowego, przy czym jest on prawie całkowicie rozpuszczalny. Oznaczenia aktywności hodowli wykonane zgodnie z procedurami operacyjnymi opisanymi wyżej i w przykładzie poprzednim przedstawiono w tabeli 4.
T a b e l a 4
Aktywność szczepów DH5a (pRPA-BCAT3), DH5a (pRPA-BCAT6), DH5a (pRPA-BCAT6 + pXL2035),
RPA-BIOCAT76
| Szczep | Środowisko | Czas hodowli | OD660 | Aktywność (U) |
| DH5a (pRPA-BCAT 3) | M9 Cb | 24 h | 4 | 0 |
| DH5a (pRPA-BCAT6) | M9 Cb | 24 h | 4 | 0,6 |
| DH5a (pRPA-BCAT6 + pXL2035) | M9 Cb Km | 24 h | 3 | 1,6 |
| RPA-BIOCAT76 | M9 Cb Km | 24 H | 3,8 | 5 |
Skróty: Km: Kanamycyna 50 μg/ml; Cb: Karbecylina 100 μg/ml; h: godziny; U: kg HMTBA utworzony na godzinę i na kg suchej masy.
Te dane pokazują, że koekspresja GroE pozwala na poprawę ekspresji nitrylazy i że selekcja klasycznego szczepu przez kolejne przeszczepiania powoduje też polepszenie aktywności rekombinantów.
P r z y k ł a d 6
Ekspresja nitrylazy w Pseudomonas putida i Alcaligenes faecalis
PL 190 773 B1
System ekspresji opisany w przykładzie 5 użyto do produkcji nitrylazy u Pseudomonas putida i A. faecalis. Fragment o 1,14 kb NdeI-XbaI z pRPA-BCAT6, zawierają cy gen nitB wprowadzono do miejsc NdeI-XbaI wektora pXL1289. Wektor pXL1289 jest pochodną pKT230 (Bagdasarian i in., 1981, Gen 15, 237-247), niosącą początek replikacji (oriV) u wielu gospodarzy, bakterii Gram-ujemnych, która zawiera fragment EcoRI-Ndel o 120 pz, nośnik promotora Ptrp i RBScII z pXL534 (Latta i in.,1990, DNA and Cell Biology, 9, 129-137), insert NdeI-XbaI kodują cy gen cobA (Crouzet i in.,1990, J.Bacteriol. 172, 5968-5979) oraz insert Xbal-BamHI o 500 pz, zawierający terminator TrrnB z pXL534 (Latta i in.,1990, DNA and Cell Biology, 9, 129-137). Otrzymany plazmid pRPA-BCAT14 jest więc pochodną pKT230, zawierającą gen nadający odporność na kanamycynę (Kan) i gen nitB pod kontrolą Ptrp:RBScII (fig. 8).
Podczas wprowadzania tego plazmidu do szczepu E. coli DH5a, wyselekcjonowano szczególny klon: wykazywał on ekspresję nitrylazy, której ciężar cząsteczkowy na żelu SDS-PA wynosi 44 kDa zamiast 43 kDa. Plazmid przyjęty przez ten klon wykazuje ten sam profil restrykcji jak pRPA-BCAT14 i został nazwany pRPA-BCAT24. Na koniec skonstruowano plazmid pRPA-BCAT23 według tej samej procedury, jak pRPA-BCAT14 z następującą modyfikacją: fragment o 136 pz StuI-BsmI z pRPA-BCAT6 zastąpiono fragmentem StuI-BsmI z pRPA-BCAT4. Plazmid pRPA-BCAT23 wykazuje więc ekspresję nitrylazy NitB z resztą Asn w pozycji 279.
Plazmidy pRPA-BCAT14, 23 i 24 wprowadzono przez elektroporację do szczepu Pseudomonas putida G2081. Szczep G2081 pochodzi od szczepu KT2440 (Bagdasarian and Timmis, 1981, in Hofschneid and Goebel, Topics in Microbiology and Immunology, 47, Springer Verlag, Berlin) przez selekcję samorzutnej odporności na kwas nalidyksynowy (nalidixique) i rifampicynę. Wektora pKT230 użyto jako plazmidu kontrolnego.
Plazmidy pRPA-BCAT14, pRPA-BCAT23, pRPA-BCAT24 i pKT230 ekstrahowano wtedy ze szczepów P.putida, aby je wprowadzić przez elektroporację do szczepu A. faecalis ATCC8750 (= RPA-BIOCAT1).
Szczepy G2081 (pRPA-BCAT14), G2081 (pRPA-BCAT23), G2081 (pRPA-BCAT24), G2081 (pKT230) i RPA-BIOCAT1 (pRPA-BCAT14), RPA-BIOCAT1 (pRPA-BCAT23), RPA-BIOCAT1 (pRPA-BCAT24), RPA-BIOCAT1 (pKT230) hodowano przez noc w temperaturze 30°C w pożywce LB, zawierającej 50 mg/ml kanamycyny. Te wstępne hodowle rozcieńczono do 1/100 w pożywce M9, zawierającej 50 mg/ml kanamycyny i inkubowano 20 godzin w temperaturze 30°C.
Po sonifikacji komórek zmierzono ekspresję nitrylazy na 10% żelu SDS-PA w surowej frakcji po sonifikacji komórek, i po odwirowaniu w osadzie i w supernatancie. Wyniki przedstawiono na fig. 9. Dla szczepów RPA-BIOCAT1 (pKT230) i G2081 (pKT230) naniesiono same surowe ekstrakty (pasma odpowiednio A i I). Na tym fig. M oznacza marker ciężarów cząsteczkowych; są one podane w kDa. Poza tym pasma mają poniższe znaczenia:
- B, D, F oznaczają surowe frakcje otrzymane odpowiednio ze szczepów RPA-BIOCAT1 (pRPA-BCAT14), RPA-BIOCAT1 (pRPA-BCAT23), RPA-BIOCAT1 (pRPA-BCAT24);
- C, E, G oznaczają supernatanty otrzymane odpowiednio z tych samych szczepów;
- H oznacza osad otrzymany z RPA-BIOCAT1 (pRPA-BCAT24);
- J, L, O oznaczają surowe frakcje otrzymane odpowiednio ze szczepów G2081 (pRPA-BCAT14), G2081 (pRPA-BCAT23), G2081 (pRPA-BCAT24);
- K, N, P oznaczają supernatanty otrzymane odpowiednio z tych samych szczepów;
- Q oznacza osad otrzymany z G2081 (pRPA-BCAT24).
To doświadczenie pokazuje, że szczepy P.putida wykazują ekspresję dużej ilości trzech rozpuszczalnych polipeptydów nitrylazowych i że pojedynczy polipeptyd nitrylazowy o 44 kDa ulega nadekspresji w szczepie A. faecalis. Oznaczenie aktywności tych hodowli wykonane według protokołu opisanego w przykładzie 4, pokazuje, że szczepy G2081 (pRPA-BCAT23), G2081 (pRPA-BCAT24) i RPA-BIOCAT1 (pRPA-BCAT24) mają aktywność nitrylazową wobec HMTBN.
P r z y k ł a d 7: Ekspresja nitrylazy w Corynebacterium glutamicum
Ekspresję nitrylazy realizowano w szczepie CGL1010 (= ATCC 14752) za pomocą promotora PcspB (Peyret i in.,1993, Molecular Microbiol. 9,97-109). Fragment o 530 pz, zawierający promotor PcspB został powielony z plazmidu pCGL815 (Peyret i in. przytoczony wyżej) za pomocą następujących starterów KS1 i KS2:
KS1: 5'-ACGCGTCGACCAGATCGTCAAGTTGTGG-3'
KS2: 5'-CATAGAGGCGAAGGCTCCTTG-3'
PL 190 773 B1
Po trawieniu przez SalI powielony fragment o 530 p.z. sklonowano w plazmidzie pBSK (Stratagene, La Jolla, USA) otwartym przez SalI i EcoRV, uzyskując plazmid pCGL1084.
Adaptator EcoNI/Ndel wyprodukowano, hybrydyzując dwa następujące oligonukleotydy
KS8 i KS9:
KS8: 5'-TCAAGGAGCCTTCGCCTCA-3'
KS9: 5'-TATGAGGCGAAGGCTCCTTG-3'
Gen nitrylazowy ekstrahowano z plazmidu pRPA-BCAT6 w postaci fragmentu NdeI-XbaI o 1,1 kb. Wprowadzono go do pCGL1084 otwartego przez EcoNI i Xbal, stosując adaptator EcoNI/Ndel opisany wyżej, uzyskując plazmid pCGL1086. Fragment SalI-BamHI z pCGL1086, zawierający PcspB::nitB sklonowano następnie w wektorze pCGL482 (Peyret i in.przytoczony wyżej) w miejscach SalI i BamHI, prowadząc do plazmidu pCGL1087. Plazmid pCGL1087 (fig. 10) jest więc wektorem przenoszącym w oparciu o pBI1 (Santamaria i in., 1884, J.Gen.Microbiol.130,2237-2246), zawierającym początek replikacji pACYC 184, rozpoznany u E. coli, gen nadający odporność na chloramfenikol (Cm) i połączenie PcspB::nitB.
Plazmidy pCGL1087 i pCGL482 wprowadzono przez elektroporację do CGL1010, jak opisano przez Bonnamy i in., 1990(FEMS Microbiol.Lett.66,263-270). Po 20 godzinach hodowli w temperaturze 30°C w 3,7% pożywce Brain Heart Infusion (Difco Laboratories, Detroit, USA) z dodanym chloramfenikolem 5 mg/ml, wykonano oznaczenie aktywności nitrylazowej w próbkach hodowli, jak opisano w przykładzie 4. Wyniki pokazują, że szczep CGL1010 (pCGL1087) posiada aktywność nitrylazową, natomiast szczep CGL1010 (pCGL482) jej nie wykazuje.
P r z y k ł a d 8
Ekspresja nitrylazy w Streptomyces lividans
Ekspresję nitrylazy realizowano w szczepie S. lividans TK24 (Hopwood i in.,1985, Genetic Manipulation of Streptomyces; A laboratory Manual, The John Innes Foundation, Norwich) za pomocą plazmidu pIJ6021 (Takano i in.,1995, Gene 166,133-137), stosując promotor PtipA (Holmes i in.,1993 EMBO J. 12,3183-3191).
Plazmid pUC19 (Yanish-Perron i in., 1985, Gene 33,103-119) zmodyfikowano, poddając delecji fragment Tfil o 140 pz przez trawienie Tfil, traktowanie Klenowem i ligację wektora z nim. Otrzymany plazmid został otwarty przez EcoRI i BamHI w celu sklonowania fragmentu o 1,15 kb EcoRI-BamHI z pRPA-BCAT3, zawierającego gen nitB. Plazmid pOS48.4 tak otrzymany posiada jedno miejsce Tfil położone między genem nitB i miejscem BamHI. To miejsce użyto do insercji fragmentu Ωhyg o 2,3 kb ekstrahowanego z plazmidu p HP45Ωhyg (Blondelet-Rouault i in.,Gene, submitted) po trawieniu przez BamHI i traktowaniu Klenowem.
Fragment Ωhyg zawiera gen fosfotransferazy higromycynowej (hyg) ze Streptomyces hygroscopicus (Zalacain i in.,1986, Nucl.Acids Res.,14,1565-1581) i nadaje S. lividans odporność na higromycynę. Tak otrzymany plazmid pOS48. 5 użyto do oddzielenia fragmentu Ndel-BamHI o 3,45 kb, zawierającego gen nitrylazy, po którym następuje gen hyg, który sklonowano w plazmidzie pIJ6021 (Takano i in., przytoczony wyżej) otwartym przez Ndel i BamHI. Plazmid pIJ6021 replikuje się tylko w Streptomyces i mieszaninę ligacyjną transformowano do S. lividans TK24 metodami klasycznymi (Hopwood i in., przytoczony wyżej), selekcjonując klony oporne na 200 mg/litr higromycyny (Boeringer Manheim). Plazmidowe DNA tych klonów ekstrahowano metodami klasycznymi (Hopwood i in., przytoczony wyżej) i ich profile restrykcji dobrze odpowiadały oczekiwanej konstrukcji, którą nazwano pOS48.7 (fig. 11).
Dwa klony S. lividans zawierające pOS48.7 oraz klon zawierający plazmid pIJ6021 hodowano w 50 ml pożywki TSB (Tryptic Soy Broth, Difco) w temperaturze 30°C w ciągu 72 godzin z selekcją kanamycyny 5 mg/litr, po czym dodano tiostrepton do stężenia 5 mg/litr i kontynuowano hodowlę jeszcze 18 godzin w opisanych warunkach (Hopwood i in., przytoczony wyżej). Zebrano hodowlę i oznaczenie aktywności wykonane w warunkach opisanych w przykładzie 4, pokazało, że szczep S. lividans TK24 (pOS48.7) wykazuje ekspresję aktywności nitrylazowej w przeciwieństwie do szczepu TK24 (pIJ6021).
P r z y k ł a d 8: Hydroliza HMTBN innymi nitrylazami
Sekwencja pierwotna nitrylazy w Comamonas testosteroni sp., opisana u Levy-Schil i in., 1995 (przytoczony wyżej) wykazuje 31% identyczności z sekwencją pierwotną nitrylazy opisaną w tym wynalazku. Szczep rekombinacyjny E. coli TG1 (pXL2158, pXL2035), który wykazuje ekspresję nitrylazy w C. testosteroni, hodowano w warunkach opisach przez Levy-Schila i in., (przytoczony wyżej) i osad komórkowy inkubowano w 100 mM buforze fosforanowym o pH 7 z 50 mM HMTBN w temperaturze
PL 190 773 B1
30°C. Mierzona aktywność wyniosła 2,3 kg/h.kg CS. Jak nitrylaza z wynalazku, nitrylaza z C. testosteroni jest zdolna do hydrolizowania HMTBN.
Ponadto dane przedstawione w przykładzie 4 z plazmidami pBCAT12 i pBCAT13 pokazują, że podstawienie Asn279->Asp279 w nitrylazie z A. faecalisATCC8750 pozwala na zachowanie aktywności wobec HMTBN.
P r z y k ł a d 10: Wprowadzenie nośnika g suchych komórek dodano do 20 g wody doprowadzonej do pH 7,0. Następnie wprowadzono podaną ilość nośnika (Celite 545, Prolabo, France) i po dokładnej homogenizacji, zawiesinę usieciowano przez dodatek 15% aldehydu glutarowego w stosunku do całkowitej suchej masy i następnie 10% polietylenoiminy (Sedipur, BASF, Niemcy). Zawiesinę mieszano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
Zawiesinę następnie poddano flokulacji, dodając 0,001% flokulanta anionowego Superfloc A100. Usieciowaną masę odebrano przez filtrację
Tę masę potem znów sieciowano, dodając 10% poliazetydyny (Kymene 557, Herkules, USA) w stosunku do całkowitej suchej masy. Następnie jeszcze wilgotną masę wytłoczono przez otwór o średnicy 0,5 mm i wysuszono.
Aktywność otrzymanych cząstek oznaczono następnie zgodnie z procedurą opisaną w opisie patentowym WO 96/09403.
| g nośnika | Aktywność (%) |
| 0 | 100 |
| 2,5 g | 215 |
| 5 g | 250 |
Dodatek nośnika do komórek poprawia znacznie aktywność.
Doświadczenie powtórzono, zastępując Celite glutenem z pszenicy (Roquette, Francja) częściowo rozpuszczalnym w wodzie lub żelatyną (SBI, Francja) całkowicie rozpuszczalną w wodzie.
| Nośnik | % aktywności |
| 0 | 100 |
| 5 g glutenu | 160 |
| 5 g żelatyny | nd* |
* Zawiesina komórkowa nie flokuluje i nie jest przesą czaIna.
Przykład ten pokazuje, że gluten może zastąpić Celite. Przeciwnie, jeśli dodaje się żelatynę (całkowicie rozpuszczalną) nadanie kształtu katalizatorowi jest niemożliwe metodą opisaną poprzednio (wytłaczanie).
P r z y k ł a d 11 g Escherichia coli BIOCAT171 z przykładu 4 wytworzone w hodowli tlenowej w pożywce LB zmieszano z 10 g Clarcelu 78 (Ceca, Francja) w 500 g 100 mM buforu fosforanowego o pH 7,0. Po homogenizacji dodano 6 g 25% aldehydu glutarowego i zawiesinę mieszano przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodano 2 g polietylenoiminy oraz 6 g 25% aldehydu glutarowego. Całość mieszano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Całość flokulowano, dodając 5 ml 0,2% roztworu Superfloc A100 (Cytec, Francja). Masę odsączono i otrzymaną pastę zmieszano z 16 g 12,5% poliazetydyny (Kymene 557, Hercules), po czym wytłaczano przez otwór o średnicy 0,5 mm. Otrzymany produkt w postaci makaronu wysuszono w temperaturze 35°C w suszarce, po czym zanurzono na 30 minut w kąpieli 1% NaBH4 wytworzonej w 50 mM buforze boranowym o pH 10,0. Następnie biokatalizator przemyto wodą destylowaną. Katalizator przechowywano w temperaturze 5°C lub w temperaturze pokojowej w 500 mM buforze fosforanowym o pH 8,0.
Kolumnę termostatowaną o średnicy wewnętrznej 3 cm i 45 cm wysokości wypełniono 100 g biokatalizatora. Kolumna była połączona z pompą poprzez obwód recyrkulacyjny. Całkowita pojemność reaktora wynosiła 430 ml. Obwód był wypełniony 25% roztworem soli amonowej kwasu hydroPL 190 773 B1 ksymetylotiomasłowego. Roztwór dostarczano na górę kolumny w kierunku podstawy z przepływem w czasie 20 litrów/godzinę. Woda, obiegająca w podwójnym płaszczu kolumny i w wymienniku ciepła pozwalała na utrzymanie temperatury 35°C. Do obwodu dodawano wodę demineralizowaną w ilości 80 g/godzinę. 2-Hydroksy-4-metylotiobutyronitryl dodawano w ilości 20 g/godzinę. Nadwyżkę objętości środowiska reakcji usuwano u dołu kolumny tak, aby objętość w obwodzie była stała. Otrzymano tak ciągły przepływ ze wskaźnikiem przekształcenia nitrylu 95%. Ponadto stężenie wodnego roztworu soli amonowej kwasu 2-hydroksy-4-metylotiomasłowego otrzymane przy wylocie z reaktora wyniosło 25%.
P r z y k ł a d 12
Stosowany elektrodializer był utworzony z bloku 9 komór o 2 dm2 aktywnej powierzchni, z których każda składała się z 2 przedziałów oznaczonych, jak następuje:
- przedział sól/kwas: ograniczony od strony katody membraną kationowymienną Neosepta CMB z Tokuyama Soda, od strony anody przez powierzchnię kationową membrany bipolarnej Aqualytics,
- przedział zasadowy: ograniczony od strony anody membraną kationową i od strony katody przez powierzchnię anionową membrany bipolarnej.
Anoda była utworzona z platynowanego tytanu. Katoda była ze stali nierdzewnej.
Elektrolit składał się z wodnego roztworu siarczanu sodu o przewodności 100 mS/cm w temperaturze 40°C. Natężenie przepływu cyrkulacji do elektrod wyniosło 2x100 litrów/godzinę. Objętość wynosiła 5 litrów.
Przedział „zasadowy był początkowo wypełniony 5 litrami 1% roztworu siarczanu amonu. Przedział „sól/kwas był początkowo wypełniony 5 litrami roztworu o 1,44 mol/litr soli amonowej kwasu 2-hydroksy-4-(metylotio)butanowego.
Natężenie przepływu recyrkulacji roztworów początkowo ustalono na 130 litrów/godzinę dla przedziału sól/kwas i na 190 litrów/godzinę dla przedziału zasadowego.
Elektrodializę prowadzono w sposób nieciągły (działanie z recyrkulacją), w średniej temperaturze 40°C. Ustalono natężenie na 9 A czyli gęstość prądu na 0,45 kA/m2.
Po 155 minutach działania przewodnictwo w przedziale sól/kwas zmieniło się od 59 do 7,8 mS/cm.
Przedział sól/kwas zawierał 1,35 mola/litr kwasu 2-hydroksy-4-(metylotio)butanowego w 100% postaci kwasu.
Wydajność faradyczną oceniono na 71% i zużycie energii na 0,53 kWh na kg utworzonego kwasu.
P r z y k ł a d 13
Stosowany elektrodializer był utworzony z bloku 8 komór o układzie identycznym jak w przykładzie 12.
Przedział „zasadowy był początkowo wypełniony 5,27 litra 1% roztworu siarczanu amonu. Przedział „sól/kwas był początkowo wypełniony 4,85 litra roztworu o 1,39 mol/litr soli amonowej kwasu 2-hydroksy-4-(metylotio)butanowego.
Natężenie przepływu recyrkulacji roztworów początkowo ustalono na 60 litrów/godzinę dla przedziału sól/kwas i na 150 litrów/godzinę dla przedziału zasadowego.
Elektrodializę prowadzono w sposób nieciągły (działanie z recyrkulacją), w średniej temperaturze 40°C. Ustalono natężenie na 9 A czyli gęstość prądu na 0,45 kA/m2.
Po 172 minutach działania przewodnictwo w przedziale sól/kwas zmieniło się od 59 do 9,5 mS/cm.
Końcowa objętość w przedziale sól/kwas wyniosła 4,67 litra.
Skład był następujący:
Kwas 2-hydroksy-4-(metylotio)butanowy: 1,24 mola/litr.
2-Hydroksy-4-(metylotio)butanian amonu: 0,148 mola/litr
Wskaźnik przekształcenia wyniósł 86%. Końcowy produkt miał w 89% postać kwasu.
Wydajność faradyczną oceniono na 74%. Zużycie energii oceniono na 0,58 kWh na kg utworzonego kwasu.
P r z y k ł a d 14
Używano analogicznego urządzenia jak w przykładzie 13.
Przedział „zasadowy był początkowo wypełniony 5,46 10 litra 1% roztworu siarczanu amonu. Przedział „sól/kwas był początkowo wypełniony 5,23 litra roztworu o 1,24 mol/litr soli amonowej kwasu 2-hydroksy-4-(metylotio)butanowego.
PL 190 773 B1
Natężenie przepływu recyrkulacji roztworów początkowo ustalono na 90 litrów/godzinę dla przedziału sól/kwas i na 150 litrów/godzinę dla przedziału zasadowego.
Elektrodializę prowadzono w sposób nieciągły (działanie z recyrkulacją), w średniej temperaturze 40°C. Ustalono natężenie na 14 A czyli gęstość prądu na 0,7 kA/m2.
Po 105 minutach działania przewodnictwo w przedziale sól/kwas zmieniło się od 57,6 do 9,8 mS/cm.
Końcowy skład w przedziale sól/kwas był następujący:
Kwas 2-hydroksy-4-(metylotio)butanowy: 1,28 mola/litr
2-Hydroksy-4-(metylotio)butanian amonu: 0,14 mola/litr
Produkt ma więc w 90% postać kwasu.
P r z y k ł a d 15
Używano analogicznego urządzenia jak w przykładzie 13.
Próbę prowadzono z zawartością przedziału zasadowego otrzymaną z przykładu 14.
Przedział „sól/kwas był początkowo wypełniony 5,2 litra roztworu o 1,44 mol/litr soli amonowej kwasu 2-5 hydroksy-4-(metylotio)butanowego.
Natężenie przepływu recyrkulacji roztworów początkowo ustalono na 50 litrów/godzinę dla przedziału sól/kwas i na 150 litrów/godzinę dla przedziału zasadowego.
Elektrodializę prowadzono w sposób nieciągły (działanie z recyrkulacją), w średniej temperaturze 42°C. Ustalono natężenie na 19 A czyli gęstość prądu na 0,95 kA/m2.
Po 53 minutach działania przewodnictwo w przedziale sól/kwas zmieniło się od 59 do 27 mS/cm.
Końcowa objętość w przedziale sól/kwas wyniosła 4,85 litra.
Skład był następujący:
Kwas 2-hydroksy-4-(metylotio)butanowy: 0,87mola/litr
2-Hydroksy-4-(metylotio)butanian amonu: 0,56 mola/litr
Wskaźnik przekształcenia wynosi 56%.
Końcowy produkt ma w 61% postać kwasu.
Wydajność faradyczną oceniono na 83%. Zużycie energii oceniono na 0,7 kWh na kg utworzonego kwasu.
P r z y k ł a d 16
Zatężono partiami 200,1 g roztworu HMTBS do około 1,5 M w wyparce obrotowej. Temperatura łaźni wynosiła 45+/-5°C. Ciśnienie regulowano do około 2,5.103 Pa (25 mbarów). Temperatura w parowalniku zmienia się od 25°C na począ tku destylacji do 40°C na koń cu. Po upływie 3 godzin uzyskano 41,9 g żółtego lepkiego środowiska o następujących właściwościach:
| Lepkość w25°C (mm2. s-1) | 1150 |
| % HMTBA (Br-/BrO3-) | 83,3 |
Po regulacji miana (rozcieńczenie H2O) otrzymano produkt o następujących właściwościach:
| Lepkość w 25°C (mm2. s-1) | 396 |
| % HMTBA (Br-/BrO3-) | 79,5 |
Na drodze potencjometrycznej określono następujący rozkład masowy:
| % HMTBS | 81,6 |
| % HMTBA | 6,0 |
PL 190 773 B1
Przez HPLC zmierzono stosunek powierzchni monomer lub dimery/(monomer+dimery): monomer/(monomer+dimery) 100 dimery/(monomer+dimery)(*) 0 (*) nie wykryto dimerów
P r z y k ł a d 17
Zatężono partiami 200,0 g roztworu HMTBS do około 1,5 Mw wyparce obrotowej. Temperatura łaźni wynosiła 121+/-5°C. Ciśnienie regulowano do około 9,5.104 Pa. Temperatura w parowalniku zmieniała się od 100°C na początku destylacji do 113°C na końcu. Po upływie 3 godzin uzyskano 41,5 g brązowego lepkiego środowiska o następujących właściwościach:
| Lepkość w25°C (mm2. s-1) | - |
| % HMTBA (Br-/BrO3-) | 90,7 |
Po regulacji miana (rozcieńczenie H2O) otrzymano produkt o następujących właściwościach:
| Lepkość w 25°C (mm2. s-1) | 117 |
| % HMTBA (Br-/BrO3-) | 78,8 |
Na drodze potencjometrycznej określono następujący rozkład masowy:
| % HMTBS | 52,2 |
| % HMTBA | 28,7 |
Przez HPLC zmierzono stosunek powierzchni monomer lub dimery/(monomer+dimery): monomer/(monomer+dimery) 95,0 dimery/(monomer+dimery) 5,0
P r z y k ł a d 18
Do 100 g środowiska opisanego w przykładzie 17 dodano 40,0 g H2O. Ekstrahowano środowisko 75,0 g eteru izopropylowego. Po rozdzieleniu faz odzyskano w fazie organicznej po odparowaniu 25,6 g HMTBA o następujących właściwościach:
| Oznaczenie | |
| monomer/(monomer + dimery) (% powierzchni) | 97,0 |
| dimery/(monomer + dimery) (% powierzchni) | 3,0 |
| Lepkość w 25OC (mm2.s-1) | 55 |
P r z y k ł a d 19: Starzenie roztworów opisanych w poprzednich przykładach
| Przykład 16 | Przykład 17 | Przykład 18 | |
| Czas przechowania w 25°C | 40 dni | 40 dni | 100 dni |
| Lepkość (mm2.s-1) | 387 | 116 | 66 |
| monomer/(monomer + dimery) | 100,0 | 95,0 | 82 |
| dimery/(monomer + dimery) | 0,0 | 5,0 | 18 |
Roztwory z przykładów 16 i 17 nie zmieniły swej trwałości, jeśli chodzi o dimery po 40 dniach przechowywania.
Claims (23)
1. Ciągły sposób wytwarzania kwasu 2-hydroksy-4-metylotiomasłowego i/lub soli amonowej kwasu 2-hydroksy-4-metylotiomasłowego na drodze hydrolizy enzymatycznej 2-hydroksy-4-metylotiobutyronitrylu, który nadaje się do przemysłowego zastosowania, znamienny tym, że:
a) w pierwszym etapie wytwarza się materiał biologiczny mający aktywność nitrylazową,
b) w drugim etapie zostaje on unieczynniony,
c) w trzecim etapie kontaktuje się 2-hydroksy-4-metylotiobutyronitryl z tak unieczynnionym materiałem biologicznym, aby otrzymać sól amonową kwasu 2-hydroksy-4-metylotiomasłowego,
d) w czwartym etapie ewentualnie przekształca się sól otrzymaną w etapie c) w odpowiedni kwas,
e) oraz w piątym etapie zatęża się produkt otrzymany w etapie c) lub d).
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że aktywność nitrylazowa jest otrzymana z nitrylazy z Alcaligenes, korzystnie faecalis.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że używa się informacji genetycznej kodującej nitrylazę, podlegającej ekspresji w mikroorganizmie gospodarza.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się mikroorganizm gospodarza wybrany spośród Escherichia coli lub członka rodzaju Bacillus, Corynebacterium, Streptomyces, Saccharomyces, Kluyveromyces, Penicillum i Aspergillus.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że aktywność nitrylazową otrzymuje się z nitrylazy kodowanej przez gen klonowany w plazmidzie pRPA-BCAT3, zdeponowany w CBS pod numerem CBS 998-96.
6. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że nitrylaza ulega koekspresji z białkiem opiekuńczym.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako białko opiekuńcze stosuje się GroESL w E. coli.
8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że materiał biologiczny z etapu a) jest unieczynniony na stałym nośniku.
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że stosuje się stały nośnik o wielkości cząsteczek od 1 μm do 3 mm, korzystnie od 10 μm do 2 mm i dodaje się go w ilości 0,01-500%, korzystnie 10-200% wagowych materiału biologicznego.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że stosuje się stały nośnik wybrany spośród:
- żywic jonowymiennych,
- tlenku glinu,
- krzemionek syntetycznych lub ziemi okrzemkowych i żeli krzemionkowych,
- zeolitów,
- węgli drzewnych,
- białek częściowo rozpuszczalnych w wodzie,
- oraz polisacharydów.
11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że jako stały nośnik stosuje się gluten.
12. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że stosuje się jeden lub kilka środków chemicznych do sieciowania i/lub czynienia nierozpuszczalnymi materiału biologicznego i nośnika.
13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że stosuje się środki chemiczne wybrane spośród:
- polimerów poliazetydynowych,
- polimerów polietylenoiminowych,
- polimerów poliamidowych,
- polimerów izocyjanianowych,
- żeli alginianowych,
- żeli k-karageninowych,
- amin,
- aldehydów,
- kwasów karboksylowych
- oraz izocyjanianów.
14. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że materiał biologiczny i nośnik są zmieszane w obecności środków chemicznych, aby otrzymać pastę, którą wytłacza się a potem suszy.
PL 190 773 B1
15. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że materiał biologiczny i środki chemiczne są zmieszane i potem osadzone na nośniku w postaci cienkiej warstwy.
16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że otrzymuje się mieszaninę soli amonowej kwasu 2-hydroksy-4-metylotiomasłowego i kwasu 2-hydroksy-4-metylotiomasłowego, zawierającą co najmniej 60% kwasu 2-hydroksy-4-metylotiomasłowego, a korzystnie co najmniej 80% kwasu 2-hydroksy-4-metylotiomasłowego, przy czym uzupełnieniem jest sól amonowa kwasu 2-hydroksy-4-metylotiomasłowego, przez dysocjację elektrolityczną odpowiedniej soli amonowej.
17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że dysocjację przeprowadza się w elektrodializerze z membranami bipolarnymi, o trzech przedziałach.
18. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że dysocjację wykonuje się w elektrodializerze z membranami bipolarnymi, o dwóch przedziałach.
19. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mieszaninę soli amonowej kwasu 2-hydroksy-4-metylotiomasłowego i kwasu 2-hydroksy-4-metylotiomasłowego otrzymuje się przez ogrzewanie roztworu soli amonowej.
20. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że uwalniany wodorotlenek amonu destyluje się, zatęża i zawraca do syntezy HCN.
21. Roztwór wodny otrzymany sposobem jak określono w zastrz. 1 utworzony z mieszaniny kwasu 2-hydroksy-4-metylotiomasłowego i soli amonowej kwasu 2-hydroksy-4-metylotiomasłowego, w którym stosunek wagowy kwasu/(kwasu+soli) wynosi 5-99,9%, a korzystnie 10-50%.
22. Instalacja do przeprowadzania sposobu określonego w zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera:
- jeden lub więcej reaktorów (3, 4) wypełnionych unieczynnionymi enzymami, mającymi aktywność nitrylazową, lub unieczynnionymi mikroorganizmami gospodarza, wykazującymi ekspresję enzymu o aktywności nitrylazowej,
- ewentualnie, jedno lub kilka urządzeń do elektrodializy (9),
- urządzenia do zatężania (6,12) produktu końcowego.
23. Plazmid pRPA-BCAT3, złożony w CBS pod numerem CBS 998-96.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9613077A FR2755143B1 (fr) | 1996-10-25 | 1996-10-25 | Procede de preparation de l'acide 2-hydroxy-4-methylthio-butyrique par utilisation d'une nitrilase |
| PCT/FR1997/001913 WO1998018941A1 (fr) | 1996-10-25 | 1997-10-24 | Procede de preparation de l'acide 2-hydroxy 4-methylthio butyrique par utilisation d'une nitrilase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL332958A1 PL332958A1 (en) | 1999-10-25 |
| PL190773B1 true PL190773B1 (pl) | 2006-01-31 |
Family
ID=9497056
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL332958A PL190773B1 (pl) | 1996-10-25 | 1997-10-24 | Ciągły sposób wytwarzania kwasu 2-hydroksy-4-metylotio-masłowego i/lub jego soli amonowej na drodze hydrolizy enzymatycznej 2-hydroksy-4-metylotiobutyronitrylu, roztwór wodny otrzymany tym sposobem i instalacja do przeprowadzania tego sposobu oraz plazmid pRPA-BCAT3 |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6180359B1 (pl) |
| EP (2) | EP1411126B1 (pl) |
| JP (1) | JP4350801B2 (pl) |
| KR (1) | KR100557404B1 (pl) |
| CN (1) | CN1181204C (pl) |
| AT (2) | ATE253638T1 (pl) |
| AU (1) | AU738160B2 (pl) |
| BR (1) | BR9712558A (pl) |
| CA (1) | CA2268869A1 (pl) |
| CZ (1) | CZ298403B6 (pl) |
| DE (2) | DE69736961T2 (pl) |
| DK (2) | DK0934419T3 (pl) |
| ES (2) | ES2210504T3 (pl) |
| FR (1) | FR2755143B1 (pl) |
| HU (1) | HU226148B1 (pl) |
| IL (3) | IL129395A0 (pl) |
| NZ (1) | NZ335332A (pl) |
| PL (1) | PL190773B1 (pl) |
| PT (2) | PT934419E (pl) |
| RU (1) | RU2216594C2 (pl) |
| WO (1) | WO1998018941A1 (pl) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5905171A (en) | 1995-06-22 | 1999-05-18 | Novus International, Inc. | Process for the preparation of 3-(methylthio)propanal |
| JPH10179183A (ja) * | 1996-12-20 | 1998-07-07 | Daicel Chem Ind Ltd | カルボン酸の製造方法 |
| WO1998031816A1 (en) | 1997-01-17 | 1998-07-23 | Regents Of The University Of Minnesota | Dna molecules and protein displaying improved triazine compound degrading ability |
| FR2780416B1 (fr) * | 1998-06-10 | 2002-12-20 | Rhone Poulenc Nutrition Animal | Procede industriel de production de proteines heterologues chez e. coli et souches utiles pour le procede |
| FR2787121B1 (fr) * | 1998-12-11 | 2003-09-12 | Aventis Cropscience Sa | Nouvelle methode d'isolement et de selection de genes codant pour des enzymes, et milieu de culture approprie |
| FR2791668B1 (fr) * | 1999-04-02 | 2001-05-04 | Rhone Poulenc Animal Nutrition | Procede de preparation d' beta-hydroxy acides |
| US6368804B1 (en) * | 1999-07-12 | 2002-04-09 | E. I. Du Pont De Nemours & Company | Method for stabilizing nitrilase activity and preserving microbial cells |
| FR2800749B1 (fr) * | 1999-11-08 | 2004-07-16 | Rhone Poulenc Animal Nutrition | Procede de modulation de la selective des nitrilases, nouvelles nitrilases obtenues par ce procede et leur utilisation |
| AU2001231155A1 (en) * | 2000-01-25 | 2001-08-07 | Hugh Mctavish | Microbes and methods for remediation |
| EP1167521A1 (en) * | 2000-06-30 | 2002-01-02 | Aventis Animal Nutrition S.A. | Coated enzyme-containing catalyst |
| FR2824823A1 (fr) * | 2001-05-21 | 2002-11-22 | Aventis Animal Nutrition Sa | Procede de preparation d'acides carboxyliques aliphatiques par hydrolyse enzymatique de composes nitriles aliphatiques |
| JP4884863B2 (ja) * | 2006-07-18 | 2012-02-29 | 国立大学法人岐阜大学 | ニトリラーゼおよびニトリラーゼを用いるカルボン酸の製造方法 |
| JP5143838B2 (ja) * | 2007-07-25 | 2013-02-13 | 日本曹達株式会社 | α−ヒドロキシ酸アンモニウム塩からのα−ヒドロキシ酸の製造方法 |
| EP2338987A1 (en) | 2009-11-16 | 2011-06-29 | ZYRUS Beteiligungsgesellschaft mbH & Co. Patente I KG | Whole cell biocatalyst |
| CN103429748B (zh) * | 2010-12-30 | 2016-01-06 | 代谢探索者公司 | 甲硫氨酸羟基类似物(mha)的发酵产生 |
| CN102517274B (zh) * | 2011-12-13 | 2013-12-25 | 重庆大学 | 一种制备固定化腈水解酶的方法 |
| CN103933861B (zh) * | 2013-08-02 | 2017-04-26 | 浙江赛特膜技术有限公司 | 一种双极膜电渗析制备蛋氨酸和氢氧化钠的方法 |
| CN103497131B (zh) * | 2013-10-08 | 2015-05-13 | 重庆紫光化工股份有限公司 | 2-羟基-4-甲硫基丁酸金属螯合物的制备方法 |
| CA3025792A1 (en) * | 2016-06-24 | 2017-12-28 | Novus International Inc. | Hydroxy methionine analog formulations suitable for specialty chemical applications |
| CN113274882B (zh) * | 2021-06-09 | 2022-05-17 | 温州大学新材料与产业技术研究院 | 基于高温双极膜电渗析的己二酸铵废液回收方法及其装置 |
| CN115975999B (zh) * | 2022-12-07 | 2025-06-03 | 万华化学集团股份有限公司 | 一种腈水解酶及其在2-羟基-4-甲硫基丁酸合成中的应用 |
| EP4600368A1 (en) | 2024-02-09 | 2025-08-13 | Adisseo France S.A.S. | A method for enzymatic production of an amide compound |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5356385A (en) * | 1976-10-29 | 1978-05-22 | Ajinomoto Co Inc | Preparation of immobilized |
| US4732851A (en) * | 1982-03-16 | 1988-03-22 | Purification Engineering, Inc. | Immobilization of cells with a polyazetidine prepolymer |
| DK152764C (da) * | 1985-06-14 | 1988-10-03 | Novo Industri As | Fremgangsmaade til fremstilling af et immobiliseret enzymprodukt |
| DE3542861A1 (de) * | 1985-12-04 | 1987-06-11 | Huels Chemische Werke Ag | Verfahren zur gewinnung von l-aepfelsaeure |
| US4800162A (en) * | 1987-04-01 | 1989-01-24 | Sepracor, Inc. | Method for resolution of steroisomers in multiphase and extractive membrane reactors |
| DK589389D0 (da) * | 1989-11-23 | 1989-11-23 | Novo Nordisk As | Immobiliseret enzympraeparat |
| US5629190A (en) * | 1992-08-10 | 1997-05-13 | Rhone-Poulenc Chimie | Polypeptides possessing a nitrilase activity and method of converting nitriles to carboxylates by means of said polypeptides |
| ATE195347T1 (de) * | 1992-10-02 | 2000-08-15 | Res Corp Technologies Inc | Methoden der erhöhung der sekretion von überexpremierten proteinen |
| EP0782629B1 (fr) * | 1994-09-22 | 1998-12-02 | Rhone-Poulenc Nutrition Animale | Hydrolyse enzymatique des 4-methylthiobutyronitriles |
| US5763652A (en) * | 1995-03-08 | 1998-06-09 | Daicel Chemical Industries, Ltd. | Process for producing a carboxylic acid |
-
1996
- 1996-10-25 FR FR9613077A patent/FR2755143B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-10-24 EP EP03078492A patent/EP1411126B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-24 DK DK97912254T patent/DK0934419T3/da active
- 1997-10-24 PT PT97912254T patent/PT934419E/pt unknown
- 1997-10-24 US US08/957,621 patent/US6180359B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-24 CA CA002268869A patent/CA2268869A1/fr not_active Abandoned
- 1997-10-24 PL PL332958A patent/PL190773B1/pl unknown
- 1997-10-24 DK DK03078492T patent/DK1411126T3/da active
- 1997-10-24 WO PCT/FR1997/001913 patent/WO1998018941A1/fr not_active Ceased
- 1997-10-24 CN CNB971990255A patent/CN1181204C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-10-24 RU RU99111763/13A patent/RU2216594C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-10-24 NZ NZ335332A patent/NZ335332A/xx unknown
- 1997-10-24 ES ES97912254T patent/ES2210504T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-24 DE DE69736961T patent/DE69736961T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1997-10-24 DE DE69725999T patent/DE69725999T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1997-10-24 IL IL12939597A patent/IL129395A0/xx active IP Right Grant
- 1997-10-24 CZ CZ0145499A patent/CZ298403B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-10-24 AT AT97912254T patent/ATE253638T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-10-24 EP EP97912254A patent/EP0934419B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-24 BR BR9712558-0A patent/BR9712558A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-10-24 ES ES03078492T patent/ES2277027T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-24 KR KR1019997003532A patent/KR100557404B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1997-10-24 HU HU9904513A patent/HU226148B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1997-10-24 AT AT03078492T patent/ATE345384T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-10-24 JP JP52011298A patent/JP4350801B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-24 PT PT03078492T patent/PT1411126E/pt unknown
- 1997-10-24 AU AU49513/97A patent/AU738160B2/en not_active Ceased
-
1999
- 1999-04-11 IL IL129395A patent/IL129395A/en not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-01-26 IL IL173394A patent/IL173394A0/en unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL190773B1 (pl) | Ciągły sposób wytwarzania kwasu 2-hydroksy-4-metylotio-masłowego i/lub jego soli amonowej na drodze hydrolizy enzymatycznej 2-hydroksy-4-metylotiobutyronitrylu, roztwór wodny otrzymany tym sposobem i instalacja do przeprowadzania tego sposobu oraz plazmid pRPA-BCAT3 | |
| JP3710497B2 (ja) | Ｄ−パント酸、ｄ−パントテン酸およびそれらの塩の製造法 | |
| JP3438890B2 (ja) | 耐熱性の向上したデカルバミラーゼをコードするｄｎａおよびその用途 | |
| PT1412226E (pt) | Processo de isolamento acústico de um corpo oco como, por exemplo, uma parte da carroçaria de um veículo automóvel | |
| JP3827420B2 (ja) | 微生物を用いたアミド化合物の製造方法 | |
| CN108239664B (zh) | 一种制备4-羟基-l-苏氨酸的工艺 | |
| WO2001053253A1 (en) | Method of purifying amide compound | |
| KR20000052815A (ko) | 디-아스파르트산의 제조방법 및 이의 제조를 위한 조성물 | |
| CN109402188B (zh) | 一种来自短小芽孢杆菌的ω-转氨酶及在生物胺化中的应用 | |
| EP0775748B1 (en) | Preparation of D-alpha-amino acids, using bacteria transformed with the carbamoylase-hydantoinase operon | |
| CN105925520A (zh) | 一株高效转化延胡索酸为l-天冬酰胺的重组大肠杆菌及其构建方法与应用 | |
| CN113061590B (zh) | 藻毒素降解酶及复合材料与应用 | |
| MXPA99003403A (en) | Method for preparing 2-hydroxy 4-methylthio butyric acid using a nitrilase | |
| HK1022170B (en) | Method for preparing 2-hydroxy 4-methylthio butyric acid using a nitrilase | |
| KR100589121B1 (ko) | 효소반응을 이용한 ｌ-오르니틴의 제조방법 | |
| DE19913741A1 (de) | Rekombinante L-N-Carbamoylase aus Arthrobacter aurescens, Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren mittels dieser | |
| JP4405627B2 (ja) | 新規なポリペプチド、そのポリペプチドをコードするｄｎａ及びそれらの用途 | |
| CN116949116A (zh) | 一种高效蔗糖磷酸化酶及其在生产甘油葡糖苷中的应用 | |
| KR20030043799A (ko) | 피복 효소 함유 촉매 |