ES2210635T3 - Derivados polimericos solubles en agua y complejos que los contienen. - Google Patents

Derivados polimericos solubles en agua y complejos que los contienen.

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Yoko Hirakawa
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Abstract

DERIVADO POLIMERICO BIFUNCIONAL SOLUBLE EN AGUA QUE TIENE UN REACTIVO PARCIAL CON UNA PARTE DE GRUPO AMINO Y DE UN GRUPO TIOL, O UNA PARTE DE GRUPO TIOL LATENTE.

Description

Derivados poliméricos solubles en agua y complejos que lo contienen.
La presente invención se refiere a un derivado de polímero hetero-bifuncional como un espaciador al que se puede unir un ligando (por ejemplo, una proteína tal como un antígeno o un anticuerpo, o una hormona) y una sustancia activa seleccionada desde un liposoma, y a un complejo así obtenido, a una composición farmacéutica o de diagnóstico que contiene el citado complejo y a un método para producir tal complejo. El complejo obtenido por la presente invención es útil como vehículo para un fármaco, o para diagnóstico o examen.
En los últimos años, se han realizado investigaciones y desarrollos en varios campos para impartir especificidad por unión de un ligando tal como una hormona o una proteína tal como un antígeno, un anticuerpo o transferrina, a, por ejemplo, un fármaco, un isótopo o una sustancia marcadora.
En particular, la expectativa es utilizar una proteína tal como un anticuerpo como fármaco específico a sede o un agente de diagnóstico muy específico por unión del mismo a un fármaco tal como un fármaco anti-cáncer, un radio isótopo o una proteína tal como una toxina. Además, en la práctica se ha utilizado un complejo que lleva unido un anticuerpo a una enzima tal como fosfatasa alcalina, como reactivo de ensayo.
Esta formación de complejo se lleva a cabo por unión directa o a través de un vehículo tal como un liposoma. Por ejemplo, en el caso de un anticuerpo, se puede emplear, por ejemplo, un método donde se oxida una cadena de azúcar del anticuerpo a aldehido que se une a una sustancia activa que lleva impartido grupo hidrazida (tal como una enzima o un liposoma), un método donde un grupo maleimido es introducido en un grupo amino del anticuerpo, y un grupo tiol es introducido en una sustancia activa, seguido de unión, un método donde se reduce un grupo disulfuro endógeno por un agente reductor para formar un tiol, que se hace reaccionar entonces, y un método donde la unión se hace a través de avidina/biotina (Introduction to Enzyme Immunoessay, 3ª edición, Ishikawa y col., Igaku Shoin (1987)).
Por otra parte, un polietilen glicol (que en adelante se citará a veces como "PEG") es un polímero hidro-soluble flexible y ha sido estudiado en muchos casos como un modificador de proteínas: el PEG es conocido por su baja toxicidad y baja inmunogenicidad, y se sabe que por modificación con PEG, se puede mejorar notablemente la retención de proteína en sangre ("Progress of DDS 1995-1996", Nakayama Shoten, páginas 82-94 (1995)).
Recientemente, se ha realizado también un estudio de investigación donde este PEG se utiliza como espaciador como se ha mencionado antes. En particular, en el campo de liposomas, ha sido muy activa la investigación sobre un liposoma unido a anticuerpo utilizando un radical de PEG como espaciador.
Un lípido que tiene un grupo polar, un polímero anfipático o similar formará partículas finas de, por ejemplo, una micela de lípido, una micela de polímero, un liposoma o una micela de lípido cerrada por doble capa.
Se han realizado muchos intentos para utilizar estas finas partículas como un vehículo para un fármaco, ácido nucleico o similar. El liposoma puede incluir una substancia lipófíla en la fase lipídica y una substancia hidrosoluble en la fase acuosa interna, y puede servir de soporte no solamente a un compuesto de bajo peso molecular sino también a una macromolécula tal como una proteína. Según esto, se han llevado a cabo muchos estudios de investigación para su utilización como vehículo en un sistema de administración de fármaco (DDS - de Drug Delivery System)) para un fármaco, una proteína, un ácido nucleico, etc. En años recientes, se ha progresado en la investigación de la aplicación práctica de un liposoma que tiene una función de inserción dirigida o similar impartida por unión, por ejemplo, de una anticuerpo o una cadena de azúcar a la superficie del liposoma, así como el efecto de, por ejemplo, la reducción de toxicidad por encapsulación de un fármaco.
Por otra parte, se ha sabido que se pueden reducir las desventajas de un liposoma, tales como la aglomeración y la captura no-específica en el sistema reticuloendotelial, por ejemplo el hígado o el bazo, por la incorporación de un polímero hidrosoluble tal como polietilen glicol, poliacrilamida, polivinil pirrolidona o poliglicerina, al liposoma. Se han realizado muchos estudios, especialmente con respecto a la modificación de polietilen glicol, y se ha llegado a la conclusión de que la modificación de polietilen glicol es eficaz para suprimir la captación en el sistema reticuloendotelial.
Además, se describe un liposoma donde, con el fin de impartir a un liposoma tanto una función de inserción dirigida como el efecto de evitar el sistema reticuloendotelial, se une después un ligando de inserción dirigida tal como un anticuerpo a un terminal de polietilen glicol de un liposoma modificado con polietilen glicol.
Por consiguiente, se describe un método de formación de complejo de un anticuerpo y un liposoma a través de un derivado de polietilen glicol-lípido que tiene grupos funcionales impartidos, pudiéndose mencionar las siguientes referencias. Klibanov y col., J. Liposome Res. 2 (1992) 321, JP-A-126152, JP-A-6-220070, WO94/22429 Hansen y col., BBA 1239 (1995) 133 y Shahinian y col., BBA 1237 (1995) 99.
En estas referencias, se hacen reaccionar un lípido y un derivado de polietilen glicol en un disolvente orgánico para sintetizar un compuesto representado por lípido-PEG-grupo funcional. Además, el compuesto se forma dentro de un liposoma junto con otros lípidos que forman liposoma, seguido de unión a un anticuerpo para obtener un complejo de anticuerpo-PEG-liposoma.
Como derivado específico de polietilen glicol-lípido, la patente JP-A- 6-126152 describe hidrocarburo alifático-PEG-carbonilimidazol; la patente JP-A-6-220070 y BBA 1237 (1995) 99 describen fosfatidiletanolamina (PE)-PEG-maleimida, y la patente WO94/22429 y Hansen y col., BBA 1239 (1995) 133, describen un liposoma unido a anticuerpo que emplea PE-PEG-NH_{2}-biotina, diestearoil-fosfatidiletanolamina (DSPE)-PEG-hidrazida (Hz) o DSPE-PEG-3-(2-piridiltio)propionilo (PDP).
Se ha demostrado que, por esta formación de complejo, se puede mejorar la eficacia de la copulación del anticuerpo y se puede mejorar la cinética en la sangre.
Al mismo tiempo, sin embargo, han sido señalados algunos problemas. Es decir, se ha encontrado que en el método en el que se utiliza DSPE-PEG-Hz, la actividad del anticuerpo decrece durante el tratamiento del anticuerpo y la eficacia de copulación del anticuerpo no mejora mucho. En el caso de DSPE-PEG-PDP, es necesario un tratamiento de reducción después de la formación de liposoma, lo que puede afectar al fármaco encapsulado, y la operación es tediosa. Con PE-PEG-NH_{2}-biotina, la unión es a través de avidina/biotina, por lo que en su administración in vivo, lo más probable es que aparezca inmunogenicidad, ya que la avidina/biotina se puede tomar como una proteína extraña. Además, con hidrocarburo alifático-PEG-carbonilimidazol, se ha señalado el problema de la probabilidad de que el derivado de PEG reaccione con un grupo amino del fármaco que se incluye.
Además, con el fin de unir el anticuerpo con eficacia adecuada, se debe incorporar al liposoma una cantidad en exceso, respecto al anticuerpo, del derivado de PEG-lípido. Según esto, incluso después de la unión al anticuerpo, los radicales de PEG que tienen grupos activos quedarán en exceso en la región fronteriza donde son fácilmente reactivos con otros componentes (componentes biológicos en el caso de administración in vivo). Se ha señalado además que si se incorpora tal cantidad en exceso de derivado de un derivado de lípido-PEG-grupo funcional a un liposoma, la pérdida de la sustancia incluida en el liposoma tiende a acelerarse (BBA 1237 (1995) 99).
Desde estos puntos de vista, las técnicas anteriores no han resultado necesariamente satisfactorias por completo.
Allen y col. (1995) BBA 1237, 99-108, y Haselgruebler y col. (1995) Bioconjug. Chem., 242-248, describen polímeros bifuncionales que tienen un radical piridilditiopropionilo (PDP) en uno de los extremos, el cual tiene una estructura representada por PDP-PEG. El PDP tiene una estructura de terminal representada por piridilo-S-S- y no contiene grupo acetiltio.
Maruyama y col. (1997) Polymer Reprints, 541-542, describe un polímero bifuncional representado por DPPE-PEG-maleimido que tiene un radical dipalmitoil fosfatidil etanolamina en un extremo. El polímero bifuncional no comprende un grupo acetiltio.
WO 9738731 A y WO 9422429 A describen polímeros bifuncionales, DSPE-PEG-maleimido, que tiene una diestearoilfosfatidildietanolamina, pero no un grupo acetiltio, en un extremo.
EP-A-0607978 describe un polímero bifuncional (PEG) que tiene radicales de maleimida en ambos extremos, pero no un grupo acetilo.
Blume y col. (1993) BBA 1149, 180 -184, describe polímeros bifuncionales, DSPE-PEG-COOH que no contienen grupo tiol, para unir sustancias de inserción dirigida a inmunoliposomas.
Los autores de la presente invención han llevado a cabo un extenso estudio para resolver estos problemas convencionales y, como resultado de ello, han encontrado que se pueden resolver los problemas convencionales por utilizar como espaciador un polímero hidrosoluble hetero-bifuncional que es un derivado de polímero hidrosoluble sintético y que tiene un grupo succinimida como radical reactivo con grupo amino y un grupo tiol latente como grupo S-acetiltio.
Además, han encontrado un método para producir fácilmente un complejo de ligando unido, donde el derivado de polímero hidro-soluble hetero-bifuncional se une primeramente a un ligando y luego se une, por el otro extremo, a una substancia activa seleccionada desde un liposoma y, después, si es necesario, se une a la substancia activa un polímero hidrosoluble monovalente que tiene reactividad con la substancia activa.
Según esto, la presente invención proporciona un derivado de polímero hidrosoluble bifuncional, como se define en la reivindicación 1, que tiene un grupo succinimida como radical reactivo con grupo amino y un grupo S-acetiltio como radical de grupo tiol latente. El derivado de polímero hidrosoluble está representado preferiblemente por la siguiente fórmula (I)
1
donde S es el radical del citado grupo S-acetiltio, P es un polímero hidro-soluble, N es el citado grupo succinimida reactivo con un grupo amino, y cada R^{1} y R^{2} es un grupo enlazante opcional, pero R^{1} y/o R^{2} no son esenciales. En el derivado de polímero, el polímero hidrosoluble es preferiblemente un polímero biodegradable o un polietilen glicol, más preferiblemente un polietilen glicol.
La presente invención proporciona también un complejo que tiene un ligando y una substancia activa seleccionada desde un liposoma unidos a través de un derivado de polímero hidrosoluble. El complejo está representado preferiblemente por la siguiente fórmula (II):
2
donde L es el citado liposoma, A es un ligando, y S, R^{1}, P, R^{2} y N son como se han definido antes. El ligando es preferiblemente un anticuerpo, más preferiblemente un anticuerpo 1-3-1. A la substancia activa puede ir unido un derivado de polímero hidrosoluble monofuncional que tiene reactividad con la substancia activa.
Además, la presente invención proporciona una composición farmacéutica tal como un agente antitumor, o una composición de diagnóstico, que contiene este complejo.
Aún más, la presente invención proporciona un método para producir tal complejo, que comprende las etapas de unión del derivado de polímero hidrosoluble bifuncional antes mencionado a un ligando y posterior unión al otro extremo del derivado de polímero hidrosoluble, a una substancia activa seleccionada desde un liposoma. El método puede contener además una etapa de unión de un derivado de polímero hidrosoluble monofuncional que tiene reactividad con la substancia activa, a la substancia activa. En el método, el derivado de polímero hidrosoluble bifuncional y el ligando se unen preferiblemente a través de un grupo amino del ligando. Además, en el método, el derivado de polímero hidro-soluble bifuncional y la substancia activa se unen de manera que un radical reactivo con un grupo tiol de la substancia activa se une a un radical de grupo tiol del derivado de polímero hidrosoluble reactivo bifuncional.
Según esto, el polímero hidrosoluble de la presente invención (citado a veces de aquí en adelante como "el presente compuesto polímero" o "el presente polímero hidrosoluble") se une primero a un ligando para formar un complejo PEG-ligando con grupo tiol impartido (en el caso de un grupo S-acetiltio, después de desacetilación bajo condiciones suaves) y luego se mezcla y se hace reaccionar con una substancia activa seleccionada desde liposoma que tiene radical reactivo con tiol impartido, con lo que se obtiene un complejo ligando-PEG-substancia activa.
Según este método, no se requieren oxidación o reducción que llevarían lo más probablemente a deterioro de la actividad de un ligando tal como un anticuerpo. Además, se ha hecho posible formar el complejo por reacción a través de un grupo tiol que prácticamente no influye sobre la substancia activa.
Se ha encontrado sorprendentemente que, cuando por ejemplo, se unen un anticuerpo y un liposoma a través del presente compuesto polímero, se presenta una elevada actividad de unión a una célula diana al comparar con el caso en que la unión se lleva a cabo a través de un compuesto de bajo peso molecular que tiene la misma combinación de grupos funcionales, que no tiene radical de polímero. Se ha encontrado además un efecto de reducción de pérdida de la substancia incluida que no había sido señalado hasta ahora.
Según el método de la presente invención, es posible además formar primero un derivado de ligando (tal como un anticuerpo)- PEG, con lo que es posible formar un complejo ligando-PEG sin introducir una cantidad en exceso de un derivado funcional PEG-lípido en una sustancia activa termodinámicamente inestable (tal como liposomas) como en el método convencional. Según esto, se puede formar una sustancia activa utilizando adecuadamente las técnicas convencionales para producción de una substancia activa tales como un liposoma o para encapsulación de un fármaco o similar, sin que haya influencia de efecto adverso que sería un probable resultado debido al grupo funcional -PEG-lípido convencional.
Además, el método de la presente invención está libre del problema del método convencional como es que, después de la unión del ligando, los radicales de PEG que tienen grupos activos tienden a permanecer en exceso en la vecindad de la frontera donde reaccionan fácilmente con otros componentes (componentes biológicos en el caso de la administración in vivo).
Además, utilizando el derivado de polímero hidrosoluble hetero-bifuncional, es innecesario realizar una oxidación o reducción que probablemente daría lugar a deterioro de la actividad de un ligando tal como un anticuerpo.
A continuación se describe con detalle la presente invención.
El derivado de polímero hidrosoluble de la presente invención es bifuncional. En la presente invención "bifuncional" significa que hay dos grupos reactivos con grupos funcionales ,en una misma molécula, y que son diferentes entre sí.
El polímero hidrosoluble utilizado en la presente invención es un polímero sintético tal como un polietilen glicol, una poliacrilamida, una polivinilpirrolidona, una poliglicerina, un poli ácido láctico, un poli ácido glicólico o un poli amino ácido, preferiblemente un polietilen glicol. Además, se puede utilizar adecuadamente un polímero biodegradable tal como un poli amino ácido y poli hidroxi ácido. El peso molecular es, preferiblemente, de aproximadamente 500 a 20.000, más preferiblemente de 1.500 a 10.000, lo más preferiblemente de 2.000 a 6.000.
El derivado de polímero hidrosoluble de la presente invención tiene un radical de grupo S-acetiltio como radical de tiol latente en un extremo terminal del polímero hidrosoluble antes mencionado y un grupo succinimida como un radical reactivo con un grupo amino en el otro extremo.
El radical tiol latente es un radical tiol protegido, es decir, un radical de grupo acetiltio, y puede desbloquearse por un procedimiento adecuado si es necesario.
El grupo tiol latente puede estar unido directamente al polímero hidrosoluble o puede unirse a través de un grupo de unión tal como un grupo alquileno, carbonilo, éster o amido interpuesto entre ellos.
El grupo succinimida como radical reactivo con un grupo amino significa un radical cuyo grupo carboxilo o grupo hidroxilo es capaz de una reacción de condensación con el grupo amino. Específicamente, puede obtenerse por medio de, por ejemplo, un éster de succinamida. El radical reactivo con un grupo amino se puede también unir directamente al polímero hidrosoluble o se puede unir a través de un grupo de unión como se ha mencionado antes.
El derivado de polímero hidrosoluble de la presente invención no está limitado en particular, pero puede ser el obtenido, por ejemplo, por reacción de mercaptoetilamina con un polietilen glicol activado con un éster de N-hidroxisuccinimida. También se puede obtener por reacción de un polietilen glicol que tiene un grupo amino y un grupo carboxi con un éster de N-hidroxisuccinimidade ácido S-acetiltioglicólico (SATA), un éster de N-hidroxisuccinimida de ácido S-acetiltiopropiónico o anhidrido de ácido S-acetiltioacético para introducir el radical de grupo S-acetiltio, seguido de reacción con N-hidroxisuccinimida y N,N'-diciclohexilcarbodiimida o trifluoroacetato de p-nitrofenilo para activar el grupo carboxilo.
El derivado de polímero hidrosoluble bifuncional de la presente invención obtenido como se ha descrito antes puede formar un complejo que tiene un ligando y una sustancia activa unidos a él.
El ligando tiene preferiblemente un grupo amino y se unirá al radical reactivo con un grupo amino del polímero hidrosoluble de la presente invención. El ligando puede ser, por ejemplo, una lectina, un antígeno, un anticuerpo, una hormona o una substancia de transmisión, preferiblemente un anticuerpo, más preferiblemente un anticuerpo 1-3-1. Además, se puede utilizar también un ligando tal como el descrito aquí después en relación con un método de producción del complejo.
La unión del ligando que tiene grupo amino al polímero hidrosoluble se puede llevar a cabo fácilmente por mezcla del ligando y el polímero hidrosoluble en una solución acuosa y dejándolos reaccionar a temperatura ambiente. La relación molar de derivado de polímero a ligando es, preferiblemente de aproximadamente 0,3 a 50, más preferiblemente de 0,8 a 30.
Cuando se utiliza el polímero que tiene impartido grupo S-acetiltio como polímero hidrosoluble, se puede unir al ligando como se ha descrito antes, seguido de desacetilación para formar un grupo tiol, y después someterlo a unión con una substancia activa como se describe después. Las condiciones para la desacetilación no están limitadas en particular siempre que sean condiciones suaves bajo las cuales el ligando permanezca sustancialmente estable. Preferiblemente, la desacetilación se puede llevar a cabo por una reacción empleando hidroxilamina en una solución neutra de agente tampón a temperatura ambiente de manera que la concentración final esté en el intervalo de 5 a 200 mM, preferiblemente de 20 a 200 mM, más preferiblemente de 20 a 100 mM.
Después de unir un ligando como se ha descrito antes, se puede unir una sustancia activa seleccionada desde un liposoma al otro extremo del polímero hidrosoluble.
El fármaco que puede incluirse en el liposoma puede ser, por ejemplo, un agente antitumor tal como adriamicina, daunomicina, vinblastina, cisplatino, mitomicina, bleomicina, actinomicina o 5-FU (fluorouracilo), un bloqueante adrenérgico tal como timolol, un fármaco de hipertensión tal como clonidina, un agente antiemético tal como procainamida, un agente antimalaria tal como cloroquina, un antibiótico tal como anfotericina, así como sales farmacéuticamente aceptables y sus derivados; una proteína tóxica tal como ricina A o toxina de la difteria, o ADN que la codifica, ADN que codifica un gen de una citocina tal como TNF y un nucleótido tal como ADN antisentido. Como sal farmacéuticamente aceptable del anterior agente antitumor o similar, se prefiere una sal con una substancia aniónica polivalente, tal como sal de ácido cítrico, sal de ácido tartárico o sal de ácido glutámico. El preferido en particular es un agente antitumor.
El agente de diagnóstico puede ser, por ejemplo, un agente de formación de imagen, tal como un elemento radiactivo tal como indio o tecnecio; agente de contraste de MRI tal como compuestos de gadolinio; agente de contraste de rayos X tal como compuestos de yodo; agente de contraste ultrasónico tal como dióxido de carbono; una enzima tal como peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina; una substancia fluorescente tal como un derivado de europio o carboxifluoresceína; una substancia emisora de luz tal como un derivado de N-metilacridinio.
La introducción de tal fármaco o agente de diagnóstico en un liposoma se puede llevar a cabo por un método conocido en general. Por ejemplo, se puede utilizar un método en el que se forme un gradiente de concentración tal como un gradiente del pH en el momento de la formación del liposoma, y se capte un fármaco ionizable empleando este potencial como fuerza de impulso (Cáncer Res. 49 5922 (1989)).
A la substancia activa se imparte, por un método conocido, un radical reactivo con grupo tiol. Es decir, se puede utilizar un grupo reactivo seleccionado entre, por ejemplo, un grupo maleimido, un grupo haluro de alquilo, un grupo aziridina y un grupo piridiltio. Sin embargo, el preferido es un grupo maleimido. Como ejemplo específico, sin que quede limitada con él la presente invención, se puede citar la formación de un liposoma que tiene radical de grupo maleimido por formación de liposoma de un lípido que tiene radical de grupo maleimido tal como maleimidocaproildipalmitil fosfatidil-etanolamina (JP-A-4-346918 o maleimido fenilbutiroil fosfatidiletanolamina junto con fosfatidilcolina o colesterol según un método conocido (Liposome, Capítulo 2, editado por Nojima y col. Konando (1988)). Como liposoma se pueden emplear varios liposomas tales como MLV, LUV y SUV. Se prefiere sin embargo el LUV.
Además, se puede obtener una proteína que tiene un radical maleimido por reacción de N-succinimidil-6-maleimidohexanoato con una proteína. Se puede utilizar también un colorante fluorescente tal como maleimido fluoresceína o eosin maleimida.
Se puede formar fácilmente complejo de la substancia activa que tiene impartido tal grupo reactivo tiol, por mezcla con el complejo de polímero hidrosoluble-ligando que tiene un grupo tiol obtenido como se ha descrito antes, en una solución tampón cercana a la neutralidad, con lo que puede obtenerse un complejo compuesto del deseado ligando-PEG-substancia activa. Además, el producto se puede purificar por un medio tal como por ultrafiltración, cromatografía de permeación de gfel, cromatografía de intercambio de iones, según lo requiera el caso.
En los dibujos adjuntos:
La Figura 1 ilustra la introducción de Ac-S-PEG-Suc en un anticuerpo y formación de un grupo tiol por desbloqueo. La abcisa indica la relación molar de Ac-S-PEG-Suc a anticuerpo en el momento de reacción, y la ordenada indica el número de moléculas de grupo tiol formadas por molécula de anticuerpo. Los circulitos en blanco representan el anticuerpo desbloqueado con hidroxilamina después de la reacción con Ac-S-PEG-Suc, y los circulitos negros representan el anticuerpo que no está desbloqueado con hidroxilamina.
La Figura 2 ilustra la actividad de unión de un liposoma con carboxifluoresceína encapsulada que tiene unido un anticuerpo anti-CEA que tiene un grupo tiol introducido por medio de Ac-S-PEG-Suc o SATA. Los respectivos inmunoliposomas y un liposoma que no tiene unido anticuerpo se hicieron reaccionar con placas de CEA fijado, y después de lavar, se midieron por fluorescencia las cantidades de liposomas unidos a las placas. La abcisa indica las cantidades de los respectivos liposomas (cantidades de lípido), y la ordenada indica la intensidad de la fluorescencia a una longitud de onda de emisión de 520 nm con una longitud de onda de excitación de 492 nm. Los círculos representan un inmunoliposoma que utiliza un anticuerpo que tiene un grupo tiol introducido por medio de Ac-S-PEG-Suc, los cuadrados representan un inmunoliposoma que utiliza un anticuerpo que tiene un grupo tiol introducido por medio de SATA, y los x representan un liposoma que no tiene unido anticuerpo.
La Figura 3 ilustra las actividades de unión a células de cáncer MKN 45, de un anticuerpo fluorescente preparado por maleimido fluoresceína y un anticuerpo que tiene un grupo tiol introducido por medio de Ac-S-PEG-Suc. Después de la reacción con células, se llevó a cabo un análisis con el citómetro de flujo. En la Figura, a representa un grupo de células que no han reaccionado con el anticuerpo fluorescente, y b representa un grupo de células que han reaccionado con el anticuerpo fluorescente. La abcisa indica la intensidad de la fluorescencia y la ordenada indica el número de células.
La Figura 4 muestra una comparación entre la pérdida de la carboxifluoresceína incluida desde un inmunoliposoma (círculos blancos) empleando Ac-S-PEG-Suc y pérdida desde un liposoma no-modificado (cuadrados negros). La ordenada representa el % de carboxifluoresceína que permanece en el liposoma, y la abcisa indica el tiempo de incubación.
La Figura 5 ilustra un método para producir una micela con ligando unido según la presente invención. A es un grupo funcional en el ligando, A' es un grupo que tiene reactividad con A, B es un grupo reactivo introducido en una partícula de micela y tiene reactividad específica con B' y B''.
La Figura 6 muestra las actividades de unión de liposomas con carboxifluoresceína encapsulada que tienen unidos anticuerpo anti-CEA que tiene un grupo tiol introducido por medio de Ac-S-PEG-Suc o SATA y recubierto después con un polietilen glicol modificado con tiol. La abcisa indica las cantidades de los respectivos liposomas (cantidades de lípido) y la ordenada indica una intensidad de fluorescencia a una longitud de onda de emisión de 520 nm con una longitud de onda de excitación de 492 nm. Los círculos representan un inmunoliposoma que emplea un anticuerpo que tiene un grupo tiol introducido por medio de Ac-S-PEG-Suc, los cuadrados representan un inmunoliposoma que emplea un anticuerpo que tiene un grupo tiol introducido por medio de SATA, y los puntos x representan un liposoma que no tiene anticuerpo unido.
La Figura 7 muestra una comparación de cambios en la concentración en sangre. La ordenada indica la concentración de adriamicina en plasma sanguíneo, y la abcisa indica el tiempo. Cada punto representa una media de un grupo de cuatro y SD (desviación típica). En la Figura, los círculos representan un inmunoliposoma que emplea un anticuerpo que tiene un grupo tiol introducido por medio de Ac-S-PEG-Suc, los cuadrados representan un liposoma que tiene solamente unido PEG modificado con tiol, y los puntos x representan un liposoma simple que no tiene unido PEG modificado con tiol.
La Figura 8 es una gráfica que muestra las reactividades de anticuerpo 1-3-1 frente a células DLD-1 y células SV-3T. La ordenada representa un valor obtenido por substracción del valor del caso en el que no hay contenido de anticuerpo, como valor de base, de un número de canal medio.
La Figura 9 es una gráfica que muestra las actividades inhibidoras de la proliferación de células del inmunoliposoma obtenido en el Ejemplo 8 frente a células DLD-1 y células SV-3T. La ordenada indica el número de células en el momento de la adición de la muestra de liposoma (absorbancia en ensayo MTT) en relación con el control que es 100%. La abcisa indica el liposoma como la concentración de adriamicina. El símbolo \Box indica células DLD1, y el símbolo O representa la relación de proliferación de SV-T3.
A continuación se describe con detalle el método de producción del complejo.
La Figura 5 ilustra las directrices del método de la presente invención. En la Figura, el polímero 1 es el derivado de polímero hidrosoluble bifuncional antes mencionado que comprende el radical A' que tiene reactividad con un grupo funcional A en un ligando y un radical B' unido a un radical reactivo B incorporado a una substancia activa. El polímero 2 tiene B'' para unirse a B. B' y B'' pueden ser radicales iguales. Según esto, en la presente invención, se puede unir un polímero monofuncional que tiene reactividad con una substancia activa.
En la presente invención, se une primeramente un polímero hidrosoluble hetero-bifuncional 1 a un ligando, y se une entonces a través de su otro extremo a una substancia activa. Además, se puede unir un polímero monofuncional 2 que tiene reactividad con la substancia activa para obtener un complejo.
Como A del ligando se puede emplear un grupo amino o un radical de cadena de un azúcar, pero el preferido es un grupo amino. A' como grupo reactivo con un grupo amino es tal como se ha descrito antes.
La combinación de B y B' se selecciona entre las combinaciones en las que el enlace B-B' se forma específicamente sin reacción substancial de B con el ligando. Sin embargo, se prefiere una combinación donde B' es un grupo tiol, y B es un grupo reactivo con un grupo tiol. El grupo tiol puede ser un grupo tiol latente protegido, es decir un grupo S-acetiltio, antes de la reacción, como se ha mencionado antes. En este caso, el grupo S-acetiltio se somete a desbloqueo en el momento de la reacción.
El ligando que se utiliza en la presente invención puede ser un ligando seleccionado entre proteína tal como transferrina, EGF o \alpha-fetoproteína (AFP), un péptido tal como insulina y un anticuerpo tal como un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal, además de los mencionados antes, y puede estar completo o puede ser un fragmento obtenible, por ejemplo, por tratamiento enzimático. Cuando se utiliza para tratamiento de varias enfermedades, es preferible un anticuerpo quimera ratón-humano o un anticuerpo humano.
Los polímeros hidrosolubles 1 y 2 pueden ser los antes mencionados. Los polímeros 1 y 2 pueden estar en una combinación diferente o en la misma combinación.
La reacción del ligando y el polímero 1 es tal como se ha descrito antes.
Tal como se ha mencionado antes, en el caso del empleo de un polímero que tiene grupo S-acetiltio impartido, este grupo S-acetiltio, una vez unido al ligando, se puede desacetilar a grupo tiol.
En la presente invención, la substancia activa puede ser tal como la antes mencionada. En la siguiente descripción, el complejo será descrito a veces con referencia a una micela o a un liposoma como un ejemplo típico de substancia activa.
La micela se compone de moléculas anfipáticas. Como molécula anfipática que constituye la micela, se puede emplear cualquier molécula siempre que contenga radicales hidrófilos y radicales hidrófobos, y sea capaz de formar una micela por un método de los conocidos en general. Se pueden mencionar los lípidos como moléculas anfipáticas preferidas, entre otras.
Los lípidos capaces de formar micelas en la presente invención pueden ser, por ejemplo, fosfatidilcolina natural tal como fosfatidilcolina de yema de huevo (EYPC); una fosfatidilcolina (PC), tal como dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC), dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC), diestearoil fosfatidil colina (DSPC) o dioleoil fosfatidilcolina (DOPC); fosfatidiletanolamina natural tal como fosfatidil-etanolamina de yema de huevo (EYPC); una fosfatidiletanolamina (PE) tal como dipalmitoil fosfatidiletanolamina (DPPE) o dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE); una fosfatidilglicerina (PG), tal como dipalmitoil fosfatidilglicerina (DPPG); fosfatidilserina (PS); fosfatidilinosita (PI); y un fosfolípido tal como ácido fosfatídico, un esfingoglicolípido, o un gliceroglicolípido. Estos lípidos se pueden utilizar solos o en combinación como una mezcla de dos o más de ellos, o en una combinación de tales lípidos con una substancia no polar tal como colesterol.
A la micela de la presente invención se puede incorporar, además del lípido y la substancia no-polar anteriores, un derivado de lípido para su unión a la combinación ligando-polímero 1 o polímero 2. Como tal derivado de lípido se puede emplear un derivado de fosfolípido que tiene un grupo reactivo seleccionado entre un grupo maleimido, un grupo haluro de alquilo, un grupo aziridina y un grupo piridilditio, como un radical reactivo B incorporado a la micela, es decir, como radical reactivo con grupo tiol, pero el grupo reactivo es preferiblemente grupo maleimido. Como ejemplo específico, que no significa limitación de la presente invención, se puede emplear un lípido que tiene un radical de grupo maleimido tal como maleimidocaproildipalmitil fosfatidil-etanolamina (JP-A-4-346918) o maleimidofenilbutiroil fosfatidiletanolamina.
El anterior derivado de lípido se puede utilizar normalmente en una cantidad de 0,1 a 8% en moles, preferiblemente de 0,5 a 3% en moles, más preferiblemente de 1 a 3% en moles, a las moléculas anfipáticas que forman la micela. El colesterol se puede utilizar en una cantidad de 0 a 100% en moles, preferiblemente de 40 a 70% en moles, a las moléculas anfipáticas que forman micela.
La micela de la presente invención puede ser la producida por cualquier método y se puede producir utilizando los materiales antes mencionados por medio de una técnica conocida en general. Por ejemplo, es posible emplear una liposoma multilaminar (MLV) formado por adición de una solución acuosa a una delgada película de lípido depositada en una pared de vidrio y sometiéndolo a sacudida mecánica, un pequeño liposoma monolaminar (SUV) obtenido por un método de tratamiento ultrasónico, un método de inyección de etanol o un método de prensa francesa, o un liposoma monolaminar grande (LUV) obtenido, por ejemplo, por el método de eliminación de agente tensioactivo, un método de evaporación de fase inversa (Liposome, Junichi Sunamoto y col., Nankodo, 1988) o un método de extrusión donde se excluye MLV a través de una membrana que tiene un tamaño de poros uniforme Liposome Technology, Vol. 1, 2ª edición).
Además, en la micela se puede incluir un fármaco o un agente de diagnóstico. El fármaco o agente de diagnóstico que se puede incluir en la micela es tal como los antes descritos.
La reacción del complejo ligando-polímero 1 con el anterior liposoma o micela se puede realizar fácilmente mezclándolos en una solución neutra de agente tampón a una temperatura de aproximadamente 4 a 40ºC. Además, en el caso en que el tiol está protegido, éste se puede desbloquear antes de la reacción, como se ha mencionado antes.
El pH durante la reacción es, preferiblemente, de aproximadamente 5 a 8, más preferiblemente de 5,5 a 7,0. Durante la reacción, se puede añadir aproximadamente 1 mM de EDTA.
El complejo ligando-polímero 1 se puede utilizar para la reacción en una cantidad de un equivalente como máximo al lípido reactivo incorporado a la micela. En el caso en que se puede obtener la deseada capacidad de inserción dirigida con una pequeña cantidad de ligando, no es necesario unir una gran cantidad de ligando y se puede añadir el polímero 2 y hacerlo reaccionar con los grupos reactivos restantes sobre la micela. Además, por adición del polímero 2, se puede asegurar la retención en sangre del complejo micela -polímero 1 - ligando cuando este se emplea, por ejemplo, como fármaco o como agente de diagnóstico.
En la presente invención, el polímero 2 es tal como se ha descrito antes. El polímero 2 tiene sustancialmente solo un punto de enlazado covalente a la micela.
Como polímero 2 se pueden emplear, aunque no queda particularmente limitado a ellos, un derivado de PEG que tiene un grupo tiol que comprende cisteína y 2,4-bis(polietilen glicol)-6-cloro-S-triazina (JP-A-4-346918) o N-propionato-3-(tiol)metoxipolioxietilenamina (J. Controlled Release 28 (1994) 155).
El polímero 2 se puede hacer reaccionar después de la reacción de la micela con el complejo ligando-polímero 1, o se puede añadir después de purificación del complejo micela-ligando-polímero 1.
La cantidad que se añade puede ser de 0,2 a 5 moles, preferiblemente de 0,5 a 2 moles, por cada mol de lípido reactivo incorporado a la micela, y la reacción se puede llevar a cabo por simple mezclado de los mismos en una solución neutra de agente tampón a una temperatura de 4 a 40ºC.
El pH durante la reacción es, preferiblemente, de 5 a 8, más preferiblemente de 5,5 a 7,0.
Durante la reacción, se puede añadir aproximadamente 1 mM de EDTA.
La micela unida a ligando obtenida por la presente invención puede purificarse además por un método tal como ultrafiltración, cromatografía de permeación de gel, antes de su uso, cuando el caso lo requiera.
A continuación se describe la presente invención con más detalle con referencia a Ejemplos. Sin embargo, deberá entenderse que la presente invención no queda restringida a estos Ejemplos específicos
Ejemplo 1
A 1 g de poli(etilen glicol)-bis-\omega-amino-\alpha-carboxilo (peso molecular medio de PEG: 3400, Shearwater Polymers, Inc) disuelto en 10 ml de cloruro de metileno, se añadieron 74,8 mg de éster de N-hidroxisuccinimida de ácido S-acetiltioglicólico (Sigma) y 41 \mul de trietanolamina, se agitaron y disolvieron. Se añadieron entonces 10 mg de éster de N-hidroxisuccinimida de ácido S-acetiltioglicólico, seguido de agitación para que tuviera lugar la reacción a temperatura ambiente durante 3,5 horas. El progreso de la reacción se comprobó por TLC (cloroformo/metanol = 85/10, revelado de color de yodo, después de lo cual se llevó a cabo una TLC en las mismas condiciones) por un deslizamiento de la mancha de bajo Rf del poli(etilen glicol)-bis-\omega-amino-\alpha-carboxilo añadido a Rf alto (aproximadamente 0,6).
Se eliminó el disolvente por destilación en atmósfera de nitrógeno y el producto de reacción se disolvió por adición de 10 ml de cloroformo. Se añadió la solución a Sep-pak (SILICA PLUS Wates) se hinchó con cloroformo y se eluyó con cloroformo/metanol (4/1 (v/v)) para pre-tratamiento de la muestra. Se volvió a eliminar por destilación el disolvente en atmósfera de nitrógeno, y el producto se disolvió en cloroformo. Se añadió entonces la solución a una columna de gel de sílice (columna Rover, LiChroprep Si60 25x310 cm, fabricada por Kanto Kagaku). Después de lavar con cloroformo, se reveló el producto y se eluyó con cloroformo/metanol (85/15 (v/v)) para obtener un producto principal con Rf de TLC de aproximadamente 0,6, el cual fue purificado. Se eliminó el disolvente por destilación en una atmósfera de nitrógeno, y se obtuvieron 583 mg del producto. Se disolvieron 543 mg del mismo en aproximadamente 2 ml de cloruro de metileno deshidratado, se hizo precipitar por adición de éter dietílico, se recuperó por filtración y se secó a presión reducida mediante una bomba de vacío. El producto se disolvió en 5 ml de cloruro de metileno deshidratado, y se añadieron 17,8 mg de N-hidroxiauccinimida (Sigma), seguido de agitación durante 10 minutos. Además, se añadieron a ello 31,9 mg de N,N'-diciclohexilcarbodiimida, seguido de reacción durante toda la noche a temperatura ambiente en una atmósfera de nitrógeno con agitación. Se separó el precipitado por filtración, y se eliminó por destilación el disolvente en una atmósfera de nitrógeno. El producto se disolvió en una pequeña cantidad de cloruro de metileno deshidratado. Se añadió a lo anterior éter etílico, recogiéndose por filtración el precipitado formado y se secó a presión reducida por utilización de una bomba de vacío y se sometió a TLC para obtener 337 mg del producto uniforme deseado (que en adelante se citará como "Ac-S-PEG-Suc"). El producto deseado se confirmó por ^{1}H-NMR.
3
TABLA 1
ppm Atribución
2,38 s 3H a
2,80 a 2,85 m 4H i
2,88 t 2H h
3,40 dd 2H d
3,52 dd 2H e
3,55 s 2H b
3,60 - - f
3,82 t 2H g
6,65 s 1H c
Se confirmó además la formación del producto deseado por un experimento de unión a \gamma-globulina humana.
Es decir, se añadieron 30 mg/ml de Ac-S-PEG-Suc disuelto en metanol deshidratado a 0,9 ml de \gamma-globulina humana (IgG, F(ab')_{2}) (4,7 mg/ml) disuelta en una solución de agente tampón que comprendía solución de agente tampón fosforado 50 mM (pH 7,0) y 1 mM de EDTA. La cantidad añadida fue de 0 a 8 veces por relación molar a anticuerpo, y se examinó la relación entre la cantidad añadida y la cantidad de PEG introducida. Después de reacción a 25ºC durante una hora tras adición de Ac-S-PEG-Suc, se purificó el producto por cromatografía de gel por revelado con la solución de agente tampón antes mencionada utilizando Sephacryl S100 (Pharmacia) para separar el Ac-S-PEG-Suc (peso molecular del PEG: 3,4 K) y el anticuerpo (peso molecular: 100 K) sin reaccionar.
Una parte del anticuerpo modificado obtenido se desbloqueó con hidroxilamina. Es decir, se añadió 0,1 ml de una solución de hidroxilamina ( hidroxilamina 0,5 M, HEPES 0,5 M, EDTA 25 mM, pH 7,0) a 0,9 ml de la solución de anticuerpo y se hizo reaccionar a 25ºC durante 10 minutos, seguido de desacetilación, y luego se eliminaron las moléculas de peso molecular bajo con PD-10 (Pharmacia) equilibrado con una solución de tampón fosfato 0,1 M de pH 6,0 y EDTA 1 mM para obtener un anticuerpo con un grupo tiol. El grupo tiol introducido en el anticuerpo se midió por un método que empleaba 4,4'-ditiopiiridina (Sigma) (Continued Biochemistry Experiment Lecture 5, p 109, compilado por Japan Biochemistry). Se midió de la misma manera el contenido de tiol de cada anticuerpo modificado que no había sido sometido a tratamiento desbloqueante con hidroxilamina, como control. Como muestra la Figura I, el resultado fue que la \gamma-globulina humana modificada por Ac-S-PEG-Suc tenía un grupo tiol latente formado por desbloqueo con hidroxilamina, es decir, un grupo S-acetiltio, y se confirmó que tal grupo tiol latente aumenta adición de Ac-S-PEG-Suc dependiendo de la cantidad.
Ejemplo 2
De la misma manera que en el Ejemplo 1, se hizo reaccionar Ac-S-PEG-Suc con anticuerpo monoclonal de ratón anti-CEA (IgG_{1}, F(ab')_{2}) para obtener un anticuerpo modificado, y después se purificó la proteína de anticuerpo por resina de intercambio de catión. Es decir, la solución de reacción (2 ml de 3,4 mg/ml) se ajustó a pH 4 por una adición de ácido acético 0,1 M y se añadió a un lecho de 2 ml de Sepharose SP (Pharmacia) equilibrada con solución de tampón acetato 0,1 M de pH 4,0. Después de lavar con 4 ml de la misma solución de agente tampón, se eluyó la proteína con solución de agente tampón fosfato 50 mM (pH 7,5). Por medio de ultrafiltro Centricon 30 (Amicon), se ajustó la solución de agente tampón a solución de tampón fosfato 50 mM (pH 7,0) que contenía EDTA 1 mM, y se llevó a cabo el desbloqueo por adición de hidroxilamina de la misma manera que en el Ejemplo 1. El anticuerpo que tenía impartido grupo SH se sometió a desalinificación por PD-10 y se intercambió con solución de tampón fosfato 0,1 M de pH 6,0 y solución de EDTA 1 mM, y después se utilizó para unión a liposoma como se describe después. Además, Ac-S-PEG-Suc y Ac-S-PEG-COOH (compuesto previo a la modificación con succinimida del Ejemplo 1) que corresponde a un hidrolizado de Ac-S-PEG-Suc no se unían a Sepharose SP en las mismas condiciones.
Como control, se hizo reaccionar con el mismo anticuerpo, en lugar de Ac-S-PEG-Suc, éster de N-hidroxisuccinimida de ácido S-acetiltioglicólico (Sigma) que no tenía radical de PEG entre el grupo S-acetilo y el grupo succinimida (al que se citará en adelante a veces como "SATA"), seguido de desalinificación por PD-10, desbloqueo con hidroxilamina y desalinificación por PD-10 (tampón fosfato 0,1 M de pH 6,0 y EDTA 1 mM) para obtener un anticuerpo que tenía impartido grupo tiol.
Se estudió la unión con el anterior anticuerpo utilizando un liposoma que tenía encapsulado un colorante fluorescente carboxifluoresceína y que tenía, como componente de membrana, un lípido modificado con maleimida que tenía reactividad con tiol.
Es decir, se añadió 1 ml de una solución acuosa de carboxifluoresceína 0,1 M (ajustada a pH de aproximadamente 7) a 100 mg de una mezcla de lípidos que comprendía dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC)/colesterol (CHOL)/ maleimidocaproildipalmitoil fosfatidiletanolamina (JP-A-4-346918) en una relación molar de 18/10/0,5 para hidratación para obtener un liposoma multilaminar. Después se llevó a cabo el ajuste del tamaño de partícula con una membrana de policarbonato 0,1 \mum por utilización de una extrusora (LIpex Biomembranes).
La unión del anticuerpo y el liposoma se llevó a cabo por reacción a 25ºC durante una hora en una solución de tampón citrato 0,1 M de pH 6 a una concentración final del anticuerpo de 0,48 mg/ml y a una concentración final de liposoma (como lípido) de 19 mg/ml, y, después de la reacción, el producto se sometió a cromatografía de permeación de gel con Sepharose CL6B (Pharmacia) para separar y eliminar el anticuerpo sin reaccionar y la carboxifluoresceína no-encapsulada.
La actividad de cada inmunoliposoma así preparado se determinó midiendo la cantidad unida a una placa de plástico de 96 pocillos que tenía fijado antígeno, por medida de la cantidad de fluorescencia de la carboxifluoresceína encapsulada. Es decir, se añadieron 20 \mug/ml del antígeno CEA a una placa de 96 pocillos (Falcon) en una cantidad de 50 \mul/pocillo y se fijaron a 37ºC durante dos horas. Después de separar el CEA, se lavó la placa con PBS, seguido de bloqueo con albúmina de suero bovino al 5%. Se añadió a la placa una solución de liposoma diluida a cada concentración con albúmina de suero bovino al 1%, lavando después con PBS, en una cantidad de 50 \mul/pocillo y se hizo reaccionar a 4ºC durante 90 minutos. Después de lavado a fondo con PBS, se añadió PBS contenía 2% de tritón x 100 en una cantidad de 100 \mul/pocillo, seguido de incubación a 37ºC durante 30 minutos, para eluir carboxifluoresceína desde el liposoma. Se recogió una muestra de lo anterior y se diluyó con PBS, midiendo la fluorescencia a una longitud de onda de emisión de 520 nm con una longitud de onda de excitación de 492 nm, y se compararon las cantidades de liposomas unidos a la placa de antígeno.
Como resultado de ello, tal como se muestra en la Figura 2, se observó una alta actividad de unión con el inmunoliposoma preparado por introducción de SH al anticuerpo empleando Ac-S-PEG-Suc.
Ejemplo 3
Se preparó un complejo por utilización de maleimido fluoresceína (Funakoshi) que es un colorante fluorescente que contiene maleimida, en lugar del liposoma del Ejemplo 2. Es decir, se añadieron 5 \mul de una solución de DMSO que contenía 3,8 mg/ml de maleimido fluoresceína a 35 ml de anticuerpo SH-PEG-anti-CEA de 2,5 mg/ml (una solución de fosfato 0,1 M de pH 6,0, una solución de EDTA 1 mM) como se muestra en el Ejemplo 2, y se hizo reaccionar a 25ºC durante 30 minutos con agitación.
Después de la reacción, se sometió el producto a permeación de gel con PD-10 (Pharmacia) equilibrado con PBS para eliminar la maleimido fluoresceína sin reaccionar. La relación de la maleimido fluoresceína introducida se calculó a partir de la absorbancia a 495 nm y 280 nm, encontrándose que se habían introducido 0,9 moléculas de maleimido fluoresceína por anticuerpo. Este anticuerpo marcado fluorescentemente se añadió a línea celular de cáncer gástrico humano MKN45 y se mezcló con suero sanguíneo humano a 50 \mug/ml durante 1 hora bajo enfriamiento con hielo. Después de lavar a fondo con PBS, se observó la unión a las células de cáncer con un citómetro de flujo. Como resultado de ello, tal como se muestra en la Figura 3, se confirmó que el complejo se unía a las células de cáncer y presentaba fluorescencia.
Ejemplo 4
En 1 ml de cloroformo, se disolvieron 20 mg (4 \mumoles) de succinato de PEG disuccinimidilo (Sunbright 40001, fabricado por Nippon Oil y Fat Co., Ltd.,, peso molecular medio de PEG: 5000). Mientras se agitaba la solución de PEG, se añadieron, gota a gota a la misma, 4 \mumoles de hidrocloruro de mercaptoetilamina (Sigma) disuelto en metanol deshidratado. Después se añadieron 56 \mul de trietilamina 72 mM (en metanol deshidratado). Después de una reacción en atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente durante 7 horas, se examinó el consumo de grupo amino por una reacción de ninhidrina, viéndose que la reacción de ninhidrina era negativa y por tanto se confirmó que había reaccionado con disuccinamida PEG. La SH-PEG-succinimida obtenida se evaporó a sequedad en una corriente de nitrógeno y se volvió a disolver en 1 ml de metanol deshidratado. Se eliminó por filtración la materia insoluble y el filtrado se utilizó para la siguiente reacción con un anticuerpo.
Se añadieron 48,7 \mul del derivado de PEG a 0,5 ml de \gamma-globulina humana a 3,9 mg/ml disuelta en una solución de tampón fosfato 50 mM de pH 7,5 y EDTA 1 mM con agitación y sacudida a 37ºC durante 1 hora. Se separaron el derivado de PEG y el sin reaccionar por cromatografía de permeación de gel empleando columna Sephadex G75 (1,2 cm x 12 cm) equilibrada con solución de tampón fosfato 0,1 M de pH 6,0 y EDTA 1 mM. Por revelado con la misma solución tampón, se recogió la primera fracción de anticuerpo eluída, y se analizó cuantitativamente la cantidad de tiol introducida de la misma manera que en el Ejemplo 1. Como resultado de ello, se encontró que habían sido introducidas 0,75 moles de tiol por mol del anticuerpo.
Se llevó a cabo además la unión a liposoma de la misma manera que en el Ejemplo 2 y se analizó el liposoma por SDS-PAGE, con lo que se confirmó la unión del anticuerpo.
Ejemplo 5 Comparación de la pérdida de carboxifluoresceína
Se hizo reaccionar el polietilen glicol modificado con tiol (JP-A-4-3461918) con el liposoma con carboxifluoresceina encapsulada 0,1 M unido a anticuerpo preparado de la misma manera que en el Ejemplo 2, para obtener un inmunoliposoma que tenía el anticuerpo y polietilen glicol unidos a él. El producto se sometió a permeación de gel en columna de PD-10 equilibrada con una solución de tampón fosfato 20 mM y NaCl 0,3 M para separar carboxifluoresceína no-encapsulada. Además, se incubó el inmunoliposoma a 37ºC, midiéndose a continuación la cantidad de carboxifluoresceína perdida desde el liposoma.
La pérdida de carboxifluoresceína se determinó cuantitativamente por el método de Shahinian y col. (BBA 1239 (1995) 157). Es decir, al finalizar un tiempo predeterminado, se tomó una muestra del liposoma bajo incubación, y se diluyó con la misma solución tampón, midiéndose la cantidad de fluorescencia (longitud de onda de excitación: 492 nm, longitud de onda de emisión: 520 nm). Al mismo tiempo, se midió la cantidad de fluorescencia después de añadir el liposoma a una solución de SDS al 2% y de solubilizarlo (destruirlo). La carboxifluoresceína encapsulada está en un estado de auto-apagado, y la intensidad de fluorescencia refleja la cantidad de carboxifluoresceína perdida desde el liposoma. Según esto, la cantidad de pérdida se calcula a partir de la relación entre los dos.
Como se muestra en la Figura 4, el anticuerpo-PEG-liposoma mostraba una estabilidad al menos igual a la del liposoma no-modificado (EMC-liposoma).
Shahinian y col. (BBA 1239 (1995) 157) han señalado que un liposoma que tiene grupo maleimido introducido en el extremo distal de PEG (maleimido-PEG-liposoma o PEG-liposoma unido a anticuerpo) muestra una pérdida mayor que el liposoma que emplea EMC-PE que no tiene radical de PEG. Mientras tanto, el liposoma preparado por el método de la presente invención mostraba una estabilidad al menos igual al correspondiente EMC-liposoma.
Ejemplo 6
Se preparó, de la misma manera que en el Ejemplo 2, un liposoma unido a anticuerpo que llevaba encapsulada carboxifluoresceína. Se añadió después un polietilen glicol modificado con tiol preparado utilizando un PEG que tenía un peso molecular de 6.000 (JP-A-4-346918) a la solución de reacción de liposoma. Es decir, el polietilen glicol modificado con tiol disuelto en solución de tampón fosfato 0,1 M de pH 6,0 y EDTA 1 mM se añadieron, en una cantidad de 2,5 \mumoles a 100 mg del lípido y se hicieron reaccionar a 10ºC durante toda la noche. Después de la reacción, el producto se sometió a cromatografía de permeación de gel por Sepharose CL6B (Pharmacia) para separar y eliminar el anticuerpo, polietilen glicol modificado con tiol, sin reaccionar, y carboxifluoresceína no encapsulada.
Se determinó, además, de la misma manera que en el Ejemplo 2, la cantidad unida a una placa de plástico de 96 pocillos que tenía un antígeno fijado, midiendo la cantidad de fluorescencia de la carboxifluoresceína encapsulada. El resultado fue que había también en el liposoma unido a anticuerpo recubierto con un polietilen glicol modificado con tiol una elevada actividad de unión con el inmunoliposoma preparado por introducción de SH al anticuerpo empleando Ac-S-PEG-Suc, como se muestra en la Figura 6.
Ejemplo 7
Se preparó un liposoma encapsulado con adriamicina que tiene el anticuerpo y PEG unidos (PEG inmunoliposoma) de la misma manera que en el Ejemplo 5 excepto en que se utilizó como liposoma un liposoma con adriamicina encapsulada como se muestra después y, como anticuerpo, IgG humana. Como controles, se prepararon un liposoma que tenía solamente unido PEG modificado con tiol (PEG liposoma) y un liposoma que no tenía ninguno de ellos unido (liposoma).
El liposoma de adriamicina encapsulada se preparó añadiendo 1 ml de un agente tampón citrato 0,3 M de pH 4,0 por 100 mg de una mezcla de lípidos sólida que comprendía dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) /colesterol (CHOL) /maleimidocaproildipalmitoil fosfatidiletanolamina en una relación molar de 18/10/0,5 y se hidrató en una mezcladora de agitación con varilla para preparar un liposoma multilaminar. Se extruyó después este liposoma a través de membranas de policarbonato con tamaños de poro de 0,2 \mum y 0,1 \mum (LIpex Biomembranes) a su vez bajo calentamiento a 60ºC para obtener un liposoma con un tamaño de partícula ajustado. La solución de liposoma obtenida se neutralizó con NaOH 1 M y luego se añadió adriamicina (Kyowa Hakko) en una cantidad de 1/10 en peso del peso de lípido para encapsular al menos 97% de adriamicina.
Para comparar la retención en sangre de los respectivos liposomas, se administró una cantidad de adriamicina de 2 mg/kg en la vena caudal a un ratón BALB/c. Después de cada período de tiempo, se sacrificó el ratón y se recogió el plasma. La cantidad de adriamicina se analizó cuantitativamente por medición de la fluorescencia después de la extracción con ácido clorhídrico/etanol según el método de Konno y col. (Cáncer Res. 47 4471 (1987)).
La adriamicina libre desaparecía rápidamente después de la administración, y no se detecta en este estado. Según esto, la cantidad de adriamicina detectada se considera reflejo del comportamiento del liposoma correspondiente.
Los resultados se muestran en la Figura 7, donde el anticuerpo preparado por este método y el liposoma que incluía adriamicina unido a PEG presentaban la propiedad de circulación prolongada en sangre.
Ejemplo 8
Se examinó in vitro la actividad antitumor frente a células de tumor, del inmunoliposoma que emplea el derivado de polímero hidrosoluble bifuncional que tenía adramicina encapsulada. Utilizando un ejemplo de un anticuerpo humano que tenía reactividad a cáncer de colon humano, se confirmó el efecto antitumor del presente inmunoliposoma frente a células diana.
Anticuerpo 1-3-1 reactivo a cáncer de colon
Se sometió a digestión con pepsina (JP-A-4-346918) anticuerpo monoclonal humano 1-3-1, reactivo a cáncer de colon humano descrito en JP-A-5-304987 desarrollado en células CHO, que se cambió de clase a IgG por un método convencional, para utilizarlo como fragmento F(ab')_{2}.
Para el propósito de confirmación de la reactividad de un anticuerpo, se preparó el anticuerpo anterior marcado con fluorescencia con FITC, y se midieron las reactividades frente a células de cáncer de colon humanas DLD-1 (fabricado por Dainippon Seiyaku) y frente a células SV-3T derivadas de células endoteliales vasculares umbilicales humanas (Agric. Biol. Chem. 55 (11), 2847-2853, 1991) empleando un citómetro de flujo.
Es decir, se ajustó el anticuerpo fluorescente por solución de BSA (PBS que contenía BSA al 1%) para que fuera 50 \mug/ml, se añadió entonces a las células y se hizo reaccionar durante una hora bajo enfriamiento con hielo. Después de lavar una vez con la solución de BSA, se añadió yoduro de propidium (PI) a una concentración final de 2 \mug/ml, seguido de medida en el citómetro de flujo (FACScan, Becton Dickinson).
Se seleccionaron células vivas, es decir, células negativas a PI por una operación de conmutación, y con respecto al valor de canal medio que representa la intensidad de fluorescencia de FITC, en la Figura 8 se muestra un valor obtenido por substracción, como valor de base, el valor donde no hay contenido de anticuerpo en las respectivas células.
Esto confirmó que el anticuerpo 1-3-1 mostraba una reactividad más alta frente a células DLD-1 que frente a células SV-3T.
Preparación de inmunoliposoma
De la misma manera que en el Ejemplo 7, se preparó un inmunoliposoma con PEG con adriamicina encapsulada.
Actividad inhibidora de proliferación de células (Citotoxicidad)
Se diluyó secuencialmente el presente inmunoliposoma con suero sanguíneo de una persona sana para preparar una serie de sistema de diluciones que comenzaba con 40 \mug/ml como concentración de adriamicina. Se añadió cada muestra a las células seguido de incubación a 37ºC durante 1 hora, luego se lavaron las células una vez con el medio de cultivo y se cultivaron a 37ºC. Cuando un control que no contenía muestra de liposoma se hizo confluente, se llevó a cabo un ensayo MTT (J. Immunol. Methods, 65 55 (1983), y se hizo una estimación del número de células.
El número de células a cada concentración del liposoma se mostró como un valor relativo respecto al número de células del control que es 100%.
La Figura 9 muestra las actividades inhibidoras de la proliferación frente a células DLD-1 humanas y frente a células SV-3T. El presente inmunoliposoma mostraba un efecto inhibidor más específico frente a células de cáncer de colon diana DLD-1. Es decir, es evidente que el presente inmunoliposoma tiene un efecto antitumor.
Si se utiliza el derivado de polímero hidrosoluble bifuncional de la presente invención, se puede obtener fácilmente un complejo ligando-polímero-substancia activa mezclándolo y haciéndolo reaccionar con un ligando activo y una substancia tal como un liposoma. Con el derivado de polímero soluble en agua de la presente invención, es posible evitar el deterioro en la actividad del ligando o evitar un efecto adverso a una substancia activa.
Según el método de la presente invención, se une primero un ligando tal como un anticuerpo a un derivado de polímero tal como PEG y se une después a una micela, con lo que es posible producir un complejo unido a ligando sin introducir una cantidad excesiva de un derivado de polímero tal como PEG a una micela termodinámicamente inestable y por tanto, sin efecto adverso de la misma.
Además, en la presente invención, cuando se incluye un fármaco o similar en la micela, es posible reducir la pérdida de la substancia incluida, y se puede obtener una elevada actividad de unión a una molécula diana tal como un antígeno.

Claims (17)

1. Un derivado de polímero hidrosoluble bifuncional como espaciador para unión a un ligando y una substancia activa seleccionada desde un liposoma, teniendo el derivado de polímero un grupo succinimida como radical reactivo con un grupo amino, y un radical de grupo S-acetiltio como radical de grupo tiol latente.
2. El derivado de polímero hidrosoluble según la reivindicación 1, que está representado por la siguiente fórmula (I):
4
donde S es el citado radical de grupo S-acetiltio, N es el citado grupo succinimido, P es un polímero hidrosoluble y cada uno entre R^{1} y R^{2} es un grupo opcional de unión, pero R^{1} y/o R^{2} no son esenciales.
3. El derivado de polímero según la reivindicación 1 o la 2, donde el polímero soluble en agua es un polímero biodegradable o un polietilen glicol.
4. El derivado de polímero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el polímero hidrosoluble es un polietilen glicol.
5. Un complejo que tiene un ligando y una substancia activa seleccionada de un liposoma, unidos a través del derivado de polímero como el definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. El complejo según la reivindicación 5, que está representado por la siguiente fórmula (II):
5
donde L es el citado liposoma, A es un ligando, y S, R^{1}, P, R^{2} y N son tales como se han definido antes.
7. El complejo según las reivindicaciones 5 ó 6, donde el ligando es un anticuerpo.
8. El complejo según las reivindicaciones 5 ó 6, donde el ligando es un anticuerpo 1-3-1.
9. El complejo según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, donde se une al liposoma un derivado de polímero hidrosoluble monofuncional que tiene reactividad con el liposoma.
10. El complejo según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, donde se incluye un fármaco o agente de diagnóstico en el liposoma.
11. Una composición farmacéutica que contiene el complejo como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10.
12. La composición farmacéutica según la reivindicación 11, que se utiliza como agente anti-tumor.
13. Una composición de diagnóstico que contiene el complejo como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10.
14. Un método para producir el complejo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, que comprende las etapas de unión del derivado de polímero hidrosoluble bifuncional como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, a un ligando y posterior unión, a través del otro extremo del derivado de polímero hidrosoluble, a un liposoma.
15. El método según la reivindicación 14, que contiene además una etapa de unión de un derivado de polímero hidrosoluble monofuncional que tiene reactividad con el liposoma, al liposoma.
16. El método según la reivindicación 14 o la 15, donde el derivado de polímero hidrosoluble bifuncional y el ligando se unen a través de un grupo amino del ligando.
\newpage
17. El método según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, donde el derivado de polímero hidrosoluble bifuncional y el liposoma se unen de manera tal que se une un radical reactivo con un grupo tiol del liposoma a radical de grupo S-acetiltio del derivado de polímero hidrosoluble bifuncional.
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