ES2265340T3 - Anticuerpo y liposoma ligado a un polialquilenglicol. - Google Patents
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Abstract
Un liposoma en el que un anticuerpo está unido a través de un grupo tioéter a un liposoma que comprende lípidos cuyo componente parcial tiene el extremo terminal maleimidado y en el que una cantidad del anticuerpo unido es de 0, 4 a 0, 7 moles % basados en un mol de los lípidos maleimidados contenidos en el liposoma.
Description
Anticuerpo y liposoma ligado a un
polialquilenglicol.
La presente invención se refiere a un liposoma.
Más específicamente, la presente invención se refiere a un liposoma
unido a un anticuerpo y, opcionalmente, a un polialquilenglicol, que
tiene mayor retención de sangre y un efecto terapéutico.
Se ha propuesto un procedimiento que incluye la
etapa de encapsular un fármaco en un liposoma y unir un anticuerpo
a la superficie del liposoma, como medio para transportar una gran
cantidad de un fármaco a un sitio específico. En particular, en el
campo del tratamiento del cáncer, se han hecho una serie de informes
sobre la eficacia de un liposoma unido a un anticuerpo en el que se
encapsula un agente antitumoral (Konno y colaboradores, Cancer
Tes., 47, 4.471, 1987; publicación sin examinar de patente japonesa
(Kokai) nº 58-134032). Por otra parte, se ha
propuesto un procedimiento de unión de polietilenglicol a un
liposoma, como procedimiento para resolver los problemas con un
liposoma, es decir, pérdida de sustancias encapsuladas, aglutinación
de liposomas, captura en órganos retículoendoteliales y similares
(publicaciones sin examinar de patentes japonesas (Kokai) n^{os}
1-249717 y 2-149512; Klibanovet, A.
L. y otros, FEBS Lett., 268, 235, 1990).
La publicación sin examinar de patente japonesa
(Kokai) nº 4-346918, que corresponde al documento EP
0 526 700, describe un liposoma unido a una proteína que encapsula
un fármaco, en el que el liposoma se caracteriza por tener una
proteína y un residuo de compuesto que contiene una fracción de
polialquilenglicol, ambos unidos a través de sus respectivos grupos
tiol a grupos maleimida en la superficie del liposoma que encapsula
un fármaco. Este liposoma se produce al reaccionar un grupo tiol
unido al anticuerpo y un grupo tiol unido al compuesto que contiene
una fracción de polialquilenglicol con los grupos maleimida en la
superficie del liposoma. El liposoma tiene una característica en
esa respuesta no específica en el sistema reticuloendotelial, como
se observa en hígado y bazo en liposomas convencionales,
suprimiéndose y pudiendo lograrse quimioterapia selectiva.
En la publicación de patente anterior, no se
explica ninguna cantidad específica del compuesto que contenga una
fracción de polialquilenglicol unida al liposoma. El documento, sin
embargo, describe que de 0,1 a 20 moles % de anticuerpos tiolados
se hacen reaccionar con 1 mol de grupos maleimida (lípidos
maleimidados) y se añade después una cantidad en exceso,
preferentemente multiplicada por dos o más, del compuesto que
contiene una fracción de poliaquilenglicol tiolado basada en los
grupos maleimida remanentes, para obtener un liposoma unido a un
anticuerpo modificado con polialquilenglicol (Paragraph 0016). En el
procedimiento para preparar un liposoma descrito específicamente en
los ejemplos, 5 micromoles de un compuesto que contiene una fracción
de polietilenglicol tiolado, se hacen reaccionar con 100 mg de
lípidos totales (que corresponden a 3,1 moles % del total de
lípidos). Se considera que se obtiene un liposoma modificado con una
cantidad teórica de polietilenglicol (es decir, la cantidad de
grupos maleimida que permanecen en la superficie del liposoma),
mediante la reacción de una cantidad muy en exceso del compuesto
que contiene una fracción de polietilenglicol tiolado basado en los
lípidos.
Además, en la publicación de patente anterior,
no se explica ninguna cantidad específica de los anticuerpos unidos
al liposoma. La publicación explica que de 0,1 a 20 moles % de
anticuerpos tiolados se hacen reaccionar con 1 mol de grupo
maleimida del lípido maleimidado (que corresponde a entre 0,3 y 60
mg por 100 mg de los lípidos totales). En el procedimiento para
preparar el liposoma descrito específicamente en los ejemplos, 5 mg
de los anticuerpos se unieron a 100 mg de los lípidos totales (que
corresponden a 1,7 moles % basados en los lípidos maleimidados).
Sin embargo, la publicación anterior no contiene una descripción
específica sobre una cantidad de unión distinta a la
anterior.
anterior.
Sobre la base de los liposomas descritos en la
publicación sin examinar de patente japonesa (Kokai) nº
4-346918, los inventores de la presente invención,
llevaron a cabo varios estudios para proporcionar un liposoma que
tuviera una mayor retención de sangre y más seguridad. Como
resultado, se descubrió de manera sorprendente que, cuando se
reducía por debajo del valor teórico (es decir, la cantidad de los
grupos maleimida que permanecen en la superficie del liposoma) una
cantidad de polialquilenglicol que modifica el liposoma, en el
liposoma descrito en la publicación de patente japonesa (Kokai) nº
4-346918, se obtenía casi el mismo nivel de
retención de sangre con el liposoma conocido que mediante el
liposoma que tenía una cantidad de modificación menor que el valor
teórico.
Por otra parte, sobre la base del liposoma
descrito en la publicación sin examinar de patente japonesa (Kokai)
nº 4-346918, los inventores de la presente
invención, llevaron a cabo además estudios para proporcionar un
liposoma que pudiera lograr un efecto terapéutico mayor. Como
resultado, se descubrió de manera sorprendente que, al reducir la
cantidad de anticuerpos unidos del liposoma descrito en la
publicación sin examinar de patente japonesa (Kokai) nº
4-346918, el efecto terapéutico logrado era mucho
mayor que el del liposoma descrito en los ejemplos de la
publicación anterior. La presente invención se logró según estas
conclusiones.
La presente invención proporciona un liposoma en
el que un anticuerpo se une a través de un grupo tioéter a un
liposoma que comprende lípidos cuyo componente parcial tiene el
extremo terminal maleimidado, en el que una cantidad del anticuerpo
unido es 0,4 a 0,7 moles % basado en un mol de los lípidos
maleimidados; el liposoma anteriormente mencionado que se obtiene
haciendo reaccionar un liposoma que tiene un grupo maleimida y un
grupo que contiene azufre derivado del anticuerpo para formar una
unión tioéter; el liposoma anteriormente mencionado en el que el
anticuerpo es un anticuerpo GAH; el liposoma anteriormente
mencionado en el que el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo
F(ab')_{2}; y el liposoma anteriormente mencionado en el
que se une además a la superficie del liposoma un compuesto que
contiene una fracción de polialquilenglicol.
La presente invención proporciona también un
liposoma en el que un compuesto que contiene dos fracciones de
polialquilenglicol y un anticuerpo se unen a través de grupos
tioéter a un liposoma que comprende lípidos cuyo componente parcial
tiene el extremo terminal maleimidado, en el que una cantidad del
compuesto unido es entre 15 y 30 moles % y una cantidad del
anticuerpo unido es entre 0,4 y 0,7 moles % basado en un mol de los
lípidos maleimidados contenidos en el liposoma; el liposoma
anteriormente mencionado que se obtiene haciendo reaccionar un
grupo maleimida del lípido maleimidado con el compuesto que
contiene dos fracciones de polialquilenglicol introducidas con un
grupo tiol; el liposoma anteriormente mencionado en el que el
compuesto se une a una superficie del liposoma; el liposoma
anteriormente mencionado en el que el polialquilenglicol es
polietilenglicol; el liposoma anteriormente mencionado en el que el
compuesto tiene dos grupos polietilenglicol; el liposoma
anteriormente mencionado en el que el polietilenglicol tiene un
peso molecular de 2.000 a 7.000 Da; el liposoma anteriormente
mencionado en el que el polietilenglicol tiene un peso molecular de
aproximadamente 5.000 Da; el liposoma anteriormente mencionado que
es un liposoma que se obtiene haciendo reaccionar un liposoma que
tiene un grupo maleimida y un grupo que contiene azufre derivado
del anticuerpo para formar una unión tioéter; el liposoma
anteriormente mencionado en el que el anticuerpo es un anticuerpo
GAH y el liposoma anteriormente mencionado en el que el anticuerpo
es un fragmento de anticuerpo F(ab')_{2}.
La presente invención también proporciona el
liposoma anteriormente mencionado, que es un agente anticancerígeno;
el agente anticancerígeno anteriormente mencionado en el que el
cáncer es cáncer de estómago o cáncer de colon y el uso del
liposoma para la preparación de un medicamento para tratar el
cáncer.
La Fig. 1 muestra la correlación entre la
cantidad de polietilenglicol unida a un liposoma (encapsulando
doxorrubicina (DXR) y sin unión a anticuerpo) y la concentración en
plasma de DXR. El eje horizontal indica la cantidad de PEG (en
moles % basados en un mol de DPPC). La cantidad de PEG en moles %
basada en los lípidos totales y DPPE maleimidado es 0,16 y 8,9
(0,25); 0,32 y 17,8 (0,5); 0,48 y 26,7 (0,75); 0,64 y 35,6 (1) y
0,81 y 45 (1,25), respectivamente (los valores entre paréntesis
indican moles % basados en un mol de DPPC).
La Fig. 2 muestra la correlación entre la
cantidad de polietilenglicol unido a un liposoma (encapsulando DXR
y unida a anticuerpos) y la concentración de DXR en plasma. El eje
horizontal indica la cantidad de PEG (la cantidad de PEG (mg) por
100 mg de lípidos). Las cantidades de PEG en moles % basadas en un
mol de DPPC, lípidos totales y DPPE maleimidado son 0,25, 0,16 y 8
(2,5); 0,50, 0,31 y 17 (5); 0,75, 0,47 y 26 (7,5) y 1,0, 0,62 y 34
(10), respectivamente (los valores entre paréntesis indican las
cantidades de PEG (mg) por 100 mg de lípidos).
La Fig. 3 muestra la correlación entre la
cantidad de anticuerpos unidos a un liposoma (encapsulando DXR) y
el efecto inhibitorio tumoral (% T/C).
La Fig. 4 muestra la correlación entre la
cantidad de DXR en plasma (retención de sangre) y la cantidad de
anticuerpos unidos en muestras en las que la cantidad de los
anticuerpos unidos es 2 mg o más por 100 mg de lípidos.
Ejemplos de lípidos que constituyen el liposoma
de la presente invención incluyen lecitinas naturales (por ejemplo,
lecitina de yema de huevo y lecitina de soja), fosfolípidos tales
como dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC),
dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), distearoilfosfatidilcolina
(DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC),
dimiristoilfosfatidiletanolamina (DMPE),
dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE),
dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), ácido dipalmitoilfosfatídico
(DPPA), dipalmitoilfosfatidil glicerol (DPPG) y ácido
dimiristoilfosfatídico (DMPA), glicolípidos tales como
esfingoglicolípidos y gliceroglicolípidos, ácidos grasos,
dialquildimetilamonio anfífilos, alquil éteres de poliglicerol y
alquil éteres de polioxietileno (Liposome Technology, 2nd edition,
vol. 1, 141, 1993), alquilglicósidos, alquilmetilglucamida, alquil
ésteres de sucrosa, éter de dialquilpolioxietileno, éter de
dialquilpoliglicerol y así sucesivamente (Liposome Technology, 2nd
edition, vol. 1, 141, 1993), copolímeros en bloque anfipáticos
tales como ácido polioxietilen poliláctico (publicación sin examinar
de patente internacional en japonés (Kohyo) nº
6-508831) y similares. Sin embargo, los lípidos no
se limitan a estos ejemplos. Estos lípidos pueden usarse solos o en
combinación de dos o más tipos y pueden usarse también en
combinación con una sustancia no polar tal como colesterol o un
derivado de colesterol tal como DC-col
(3\beta-[N-(N',N'-dimetilaminoetil)
carbamoil]colesterol).
En el liposoma de la presente invención, un
lípido maleimidado (al que se hace referencia de aquí en adelante
como "lípido maleimidado") tal como fosfatidiletanolamina
maleimidada, se requiere para ser usado como una parte de los
componentes del lípido para la unión de un compuesto que contenga
polialquilenglicol y, si se requiere, una proteína tal como
anticuerpos. Una proporción del lípido maleimidado al total de
lípidos es usualmente alrededor de 0,5 a 10 moles %.
Se explicará la fosfatidiletanolamina
maleimidada como un ejemplo. Este compuesto se obtiene haciendo
reaccionar un compuesto que contiene maleimida que tenga
reactividad con un grupo amino de fosfatidiletanolamina (PE). El
compuesto que contiene maleimida puede contener un residuo tal como
un grupo caproilo, un grupo benzoilo o un grupo fenilbutirilo.
Ejemplos de tal compuesto incluyen
N-(\varepsilon-maleimidocaproiloxi) succinimida,
N-succinimidil-4-(\rho-maleimidofenil)-butilato,
N-succinimidil-4-(\rho-maleimidofenil)propionato,
N-(\gamma-maleimido-buti-riloxi)succinimida
y similares. Como PE pueden usarse fosfatidiletanolaminas tales
como dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE),
dimiristoilfosfatidiletanolamina (DMPE) o
dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) y se prefiere DPPE. Además,
puede también estar contenida como un componente del lípido, una
sustancia cargada tal como estearilamina o dicetilfosfato. El
liposoma de la presente invención puede ser un liposoma con
capacidad de fusión que incorpora una parte o el virus completo, por
ejemplo, un liposoma fundido con el virus Sendai.
Para un liposoma típico, puede usarse por
ejemplo una composición lipídica que contenga de 0,3 a 1 mol,
preferentemente de 0,4 a 0,6 moles, de colesterol y de 0,01 a 0,2
moles, preferentemente de 0,02 a 0,1 moles, más preferentemente de
0,02 a 0,05 moles, de fosfatidiletanolamina maleimidada por mol de
fosfatidilcolina. Cuando se añade el ácido fosfatídico, puede
usarse una composición lipídica que contenga 0,4 moles o menos,
preferentemente 0,15 moles o menos, de ácido fosfatídico.
No están limitados en particular los
procedimientos para la preparación del liposoma de la presente
invención y puede usarse cualquier procedimiento disponible para
aquellos expertos en la técnica. Además, no está en particular
limitada una estructura del liposoma de la presente invención y el
liposoma puede estar en cualquier estructura. Por ejemplo, el
liposoma puede ser cualquier liposoma de estructura multilaminar
(MLV) obtenido añadiendo una solución acuosa a una membrana
lipídica delgada formada en una pared de un cristal y sometiendo la
membrana a agitación mecánica; un liposoma de estructura unilaminar
pequeño (SUV) obtenido mediante el procedimiento de sonicación, el
procedimiento de inyección de etanol o el procedimiento de prensa
francés y un gran liposoma de estructura unilaminar (LUV) obtenido
mediante el procedimiento de eliminación del tensioactivo, el
procedimiento de evaporación en fase reversa (Liposome, Sunamoto J.
y otros, Nankodo Co., Ltd., 1998), o el procedimiento de extrusión,
en el que MLV se extrude a través de una membrana que tiene un
tamaño de poro uniforme mediante presurización (Liposome
Technology, 2nd edition, vol.1, 141, 1993). El diámetro de
partícula del liposoma es, por ejemplo, 300 nm o menor,
preferentemente entre 30 y 200 nm.
Puede encapsularse un medicamento en el liposoma
de la presente invención. No están particularmente limitados los
tipos de medicamentos. Por ejemplo, medicamentos que pueden usarse
incluyen agentes antitumorales tales como doxorrubicina
(adriamicina), daunomicina, vinblastina, cisplatina y
5-fluorouracilo (5-FU); agentes que
bloquean la adrenalina tales como timolol; agentes antihipertensivos
tales como clonidina; fármacos antieméticos tales como
procainamida; agentes antimaláricos tales como cloroquinina y sales
farmacéuticamente aceptables y derivados de los mismos; sustancias
radiactivas tales como renio 186, yodo 131 e itrio 90; sustancias
activas fisiológicamente tales como ricina A, toxina diftérica y
TFN y ADN codificando la sustancia y similares. Sin embargo, los
medicamentos que pueden encapsularse en el liposoma de la presente
invención no están limitados a estos
ejemplos.
ejemplos.
Como sales aceptables farmacéuticamente de los
medicamentos anteriormente mencionados, los ejemplos preferidos
incluyen sales con sustancias aniónicas multivalentes aceptables
farmacéuticamente, tales como citratos, tartratos, glutamatos y
sales con derivados de los mismos. Se prefieren los agentes
antitumorales como el medicamento encapsulado en el liposoma de la
presente invención. Sin embargo, los medicamentos no se limitan a
estos ejemplos.
Los procedimientos para encapsular los
medicamentos en el liposoma no están limitados particularmente y
puede aplicarse cualquier procedimiento disponible por los expertos
en la técnica. Por ejemplo, al formular un liposoma, puede añadirse
un medicamento como una solución acuosa y encapsulada en el
liposoma. Además, puede aplicarse, después de la formulación del
liposoma, un procedimiento en el que se forme un gradiente de
concentración tal como un gradiente de pH a través de una vesícula
y este potencial se use como una fuerza de conducción para
incorporar un fármaco ionizable en el liposoma (Cancer Res., 49,
5922, 1989; BBA, 455, 269, 1976).
El liposoma de la presente invención se
caracteriza porque el liposoma puede modificarse con un compuesto
que contenga dos fracciones de polialquilenglicol y que se modifique
además con una cantidad específica de un anticuerpo. Como
polialquilenglicol puede usarse, por ejemplo, polietilenglicol
(PEG), polipropilenglicol o similares y se prefiere
polietilenglicol. Cuando se usa polietilenglicol, pueden usarse
aquellos que tengan un peso molecular de aproximadamente entre
2.000 y 7.000 Da, preferentemente aproximadamente 5.000 Da.
El liposoma de la presente invención está en una
estructura en la que el compuesto que contiene un polialquilenglicol
se une a través de una unión tioéter a un lípido maleimidado en la
superficie del liposoma. El liposoma unido con polialquilenglicol
puede usualmente prepararse mediante la introducción de un grupo
tiol en un compuesto que contenga polialquilenglicol y reaccionando
después el compuesto con un grupo maleimida en un liposoma.
Ejemplos del compuesto que contiene polialquilenglicol incluyen
generalmente un compuesto que tenga un grupo polietilenglicol y un
extremo terminal que puede ser tiolado o un compuesto que tenga un
grupo mercapto en un extremo terminal del mismo. Específicamente,
ejemplos incluyen un compuesto en el que un grupo polialquilenglicol
está unido a triacina y un compuesto en el que la triacina se
sustituye además con un aminoácido o similar. El compuesto tiene
dos grupos polialquilenglicol (tipo doble cadena).
Si se usa polietilenglicol como el
polialquilenglicol, procedimientos que pueden aplicarse incluyen,
por ejemplo, un procedimiento de condensación de
monometoxipolioxietilenamina y cualquiera de los distintos ácidos
tiolcarboxílicos mediante deshidratación; un procedimiento de
introducción de un grupo piridilditiopropionilo en
monometoxipolioxietilenamina usando SPDP y reduciendo además el
producto; un procedimiento de introducción de un grupo tiol en
monometoxipolioxietilenamina usando iminotiolano; un procedimiento
de unión a un éster de ácido monometoxipolioxietilencarboxílico
activo y cualquiera de las distintas tiolaminas; un procedimiento
de condensación de un polietilenglicol derivado de triacina con una
tiolamina o similar. Más específicamente, puede obtenerse un PEG 2
activado unido a cisteína haciendo reaccionar
2,4-bis(polietilenglicol)-6-cloro-s-triacina
(PEG 2 activado, Seikagaku Corporation) con cistina y reduciendo
además el producto.
No está limitada en particular una cantidad
introducida del compuesto que contiene dos fracciones de
polialquilenglicol en el liposoma de la presente invención y puede
reaccionar con los lípidos maleimidados remanentes una excesiva
cantidad del compuesto. Una cantidad introducida preferida del
polialquilenglicol es aproximadamente de 0,28 a 0,90 moles %, más
preferentemente aproximadamente de 0,28 a 0,56 moles %, basado en
los lípidos totales, aproximadamente de 15 a 50 moles %, más
preferentemente aproximadamente de 15 a 30 moles %, basado en los
lípidos maleimidados y aproximadamente de 0,44 a 1,45 moles %, más
preferentemente aproximadamente de 0,44 a 0,89 moles %, basado en
DPPC.
El liposoma de la presente invención está
modificado con un anticuerpo. Como anticuerpo, puede usarse un
anticuerpo en sí o un fragmento de un anticuerpo, un derivado de un
anticuerpo o similar e incluso un anticuerpo en sí o un fragmento
de un anticuerpo pueden usarse como anticuerpos. El término
"anticuerpo" usado en la especificación engloba anticuerpos
derivados o modificados y similares, así como anticuerpos en sí y
fragmentos de anticuerpos y el término debería interpretarse en el
sentido más amplio. Como anticuerpo, puede también usarse un
anticuerpo que tenga reactividad con tejidos, células, bacterias,
virus o similares, que tengan por objetivo tratamientos
terapéuticos. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos policlonales
que deriven de distintos animales, anticuerpos monoclonales de
ratón, anticuerpos quiméricos humano-ratón,
anticuerpos monoclonales humanos y similares. El más preferido es
un anticuerpo monoclonal humano, aunque el anticuerpo no sea una
proteína de un animal heterogéneo. Como anticuerpo, puede usarse
preferentemente el anticuerpo monoclonal humano descrito en la
publicación sin examinar de patente japonesa (Kokai) nº
5-304987 (anticuerpo GAH). Por ejemplo, puede
prepararse un liposoma modificado con un anticuerpo GAH según el
procedimiento descrito específicamente en el ejemplo 7 de la
publicación anterior. Como se describe en la publicación sin
examinar de patente japonesa (Kokai) nº 5-304987,
aunque el anticuerpo GAH tenga reactividad con el cáncer de estómago
y el cáncer de colon, el liposoma de la presente invención es útil
como un agente anticancerígeno para el tratamiento de cáncer de
estómago, cáncer de colon y similares. Puede producirse un liposoma
que tenga un excelente efecto terapéutico eligiendo de manera
apropiada una combinación del tipo de un anticuerpo y un medicamento
para encapsular.
Después de introducir un grupo tiol en un
anticuerpo, puede modificarse un liposoma con el anticuerpo mediante
la reacción de un grupo maleimida en el liposoma con el anticuerpo
tiolado. La adición de un grupo tiol al anticuerpo, se lleva a cabo
mediante la reacción de un compuesto usado de manera ordinaria para
la tiolación de una proteína tal como
N-succimidil-3-(2-piridilditio)propinato
(SPDP) (Carlsson, J. y otros, Biochem. J., 173, 723, 1978),
iminotiolano o mercaptoalquilimidato (Traut, R. R., y otros,
Biochemistry, 12, 3266, 1973) con un grupo amino del anticuerpo.
Además, puede reducirse un grupo ditiol endógeno de un anticuerpo y
reaccionar como un grupo tiol. Desde un punto de vista de actividad
de anticuerpo sostenida, se prefiere el procedimiento que usa un
grupo tiol endógeno.
Por ejemplo, cuando se usa IgG, puede obtenerse
un fragmento F(ab')_{2} usando una enzima tal como pepsina
y después un grupo tiol, generado en un fragmento Fab' que se
obtiene mediante la reducción del fragmento F(ab')_{2}
usando ditiotreitol, pudiendo utilizarse en la reacción de unión con
un liposoma (Martín, F. J. y otros, Biochemistry, 20, 4229, 1981).
Donde se use IgM, puede utilizarse un grupo tiol de una región Fc
de las IgMs obtenidas por reducción de la cadena J bajo condiciones
suaves para unirse a un liposoma según el procedimiento de Mirror y
otros (J. Biol. Chem., 257, 286, 1965). Cuando se usa el anticuerpo
GAH descrito en la publicación sin examinar de patente japonesa
(Kokai) nº 5-304987, se usa preferentemente un
fragmento F(ab')_{2}. La unión de una proteína tal como un
anticuerpo añadida a un grupo tiol y un liposoma que contiene un
grupo maleimida, se logra mediante una reacción en un tampón neutro
(pH 6,5 a 7,5) durante 2 a 16 horas.
La forma de realización más preferida de la
presente invención es un liposoma unido a un anticuerpo y un
compuesto que contenga una fracción de polialquilenglicol. Para
producir este liposoma, reacciona un anticuerpo tiolado con un
liposoma que tenga un grupo maleimida en un tampón neutro. Por
ejemplo, anticuerpos tiolados en una cantidad de 0,1 moles %
(específicamente, 0,17 moles %) a aproximadamente 2 moles %
(específicamente, 1,5 moles %, 1,8 moles %), preferentemente 0,4 a
0,7 moles %, pueden reaccionar con un mol de los grupos maleimida
(lípidos maleimidados) de modo que 0,5 a 5,3 mg, 0,5 a 4,5 mg,
preferentemente 1,2 a 2 mg, de anticuerpos se unen por 100 mg de
lípidos totales que constituyen el liposoma. Por lo tanto, un
compuesto que contenga una fracción de polialquilenglicol, puede
reaccionar con los grupos maleimida remanentes para preparar un
liposoma unido al anticuerpo y el compuesto que contenga una
fracción de polialquilenglicol. Más específicamente, se añaden 15 a
50 moles%, preferentemente 15 a 30 moles % de un compuesto que
contenga una fracción de polialquilenglicol tiolado, a un mol de
grupos lipídicos maleimidados (es decir, 0,28 a 0,90 moles %,
preferentemente 0,28 a 0,56 moles % basados en los lípidos totales
y, si se usa DPPC, 0,44 a 1,45 moles %, preferentemente 0,44 a 0,89
moles % basados en DPPC) para producir un liposoma unido al
anticuerpo y el compuesto que contiene una fracción de
polialquilenglicol.
Como una forma de realización preferida del
liposoma de la presente invención, se proporciona un liposoma que
encapsula un medicamento, preferentemente un agente antitumoral tal
como doxorrubicina, y se une a un compuesto que contiene una
fracción de polietilenglicol y un anticuerpo antitumoral. El
liposoma que contiene un medicamento, puede formularse mediante un
procedimiento conocido, por ejemplo, el procedimiento de
deshidratación (publicación sin examinar de patente internacional
en japonés (Kohyo) nº 2-502348), procedimiento en el
que el liposoma se añade a un estabilizante y se usa como una
preparación líquida (publicación sin examinar de patente japonesa
(Kokai) nº 64-9331), el procedimiento de
liofilización (publicación sin examinar de patente japonesa (Kokai)
nº 64-9931) o similar. El liposoma puede
administrarse a un paciente a través de administración
intravascular, administración intravesical, administración
intraperitoneal, administración local o similar para tratamientos
de distintas enfermedades tales como cánceres. Puede elegirse
apropiadamente una dosis, dependiendo del tipo de medicamento
encapsulado como ingrediente activo. Por ejemplo, si se administra
un liposoma que encapsula doxorrubicina, el liposoma puede usarse
en una cantidad de 50 mg/kg o menos, preferentemente 10 mg/kg o
menos, más preferentemente 5 mg/kg o menos, como peso de un
ingrediente activo.
La presente invención se explicará más
específicamente con referencia a los ejemplos.
Ejemplo
1
Se añadió a una mezcla lipídica (1,6 g) de
dipalmitoilfosfatidilcolina
(DPPC)/colesterol/\varepsilon-maleimidocaproildipalmitoilfosfatidiletanolamina
(MC-DPPE) (18:10:0,5 en proporción molar), 16 ml de
tampón citrato (pH 4,0) 0,3 M y se hidrató. Después, se congeló y
descongeló la mezcla tres veces, usando nitrógeno líquido y un baño
caliente a 60ºC para producir liposomas de estructura multilaminar.
Las partículas, mediante el procedimiento de extrusión, tuvieron un
tamaño de 0,1 \mum. La solución de liposomas resultante se
neutralizó añadiendo NaOH 1 M gota a gota. Después, la solución se
calentó a 60ºC y se añadió una solución de doxorrubicina acuosa
(DXR, a la que también se hace referencia como adriamicina, ADM) en
una cantidad de 0,5 ml de 20 mg/ml por 100 mg de lípidos para la
encapsulación.
El anticuerpo GAH (14,4 ml, 3 mg/ml, de un
anticuerpo monoclonal descrito en las publicaciones sin examinar de
patentes japonesas (Kokai) nº^{s} 4-346918 y
5-304987 reactivo para el cáncer de estómago y el
cáncer de colon), disuelto en tampón fosfato (pH 7,5) 50 mM que
contenía EDTA 1 mM, se añadió a 92,4 \mul de iminotiolano 3
mg/ml y se hizo reaccionar a 37ºC durante 1 hora para introducir
grupos tiol (Biochemistry, 12, 3206, 1973). La mezcla de reacción
se sometió a filtración en gel y el tampón se intercambió con el
tampón fosfato (pH 6,0) 0,1 M, que contenía EDTA 1 mM. Después, se
hizo reaccionar el anticuerpo tiolado resultante (0,21 mg, 1,7
mg/ml) por 1 mg de doxorrubicina liposomial con el liposoma a 25ºC
durante 1 hora para formar la unión del anticuerpo al liposoma.
Se hizo reaccionar cistina con
2,4-bis(polietilenglicol)-6-cloro-s-triacina
según el procedimiento de la publicación sin examinar de patente
japonesa (Kokai) nº 4-346918 y después se redujo
para preparar polietilenglicol (doble cadena tipo PEG) que contenía
grupos tiol. Más específicamente, el PEG tiolado (30 mg/ml, doble
cadena tipo PEG de un peso molecular de 2.000 (PEG 2000) y una
doble cadena tipo PEG de un peso molecular de 5.000 (PEG 5000)) se
produjeron usando cistina y cada uno de ellos se añadió a la mezcla
de reacción anterior en una cantidad de 0,18 ml por 1 ml de la
mezcla de reacción para una reacción de unión a 10ºC. Después de
transcurridos entre 5 y 240 minutos desde el comienzo de la
reacción, se muestreó y aplicó la mezcla de reacción a una columna
de Sefarosa CL6B para parar la reacción eliminando el PEG tiolado
que no reaccionó para obtener inmunoliposomas conteniendo
diferentes cantidades de PEG. Se prepararon de manera similar
inmunoliposomas no unidos a PEG sometiendo inmunoliposomas sin el
tratamiento de unión de PEG a filtración con gel utilizando Sefarosa
CL6B.
Se prepararon liposomas unidos a anticuerpos y
PEG haciendo reaccionar el PEG tiolado preparado anteriormente (3)
con los liposomas unidos a anticuerpo preparados anteriormente
(2).
Se determinó mediante HPLC (cromatografía
líquida de alta resolución) la cantidad de PEG unida a
inmunoliposomas. Una solución de inmunoliposoma preparada como una
solución de SDS hasta una concentración final de 2%, se calentó a
60ºC durante 30 minutos para solubilizar completamente los
liposomas. Se eluyó la solución usando una columna GPC (2000SWXL,
Tosoh Corporation) con un tampón a pH 7,5 (NaH_{2}PO_{4} 25 mM,
SDS 0,1%, metanol 70%) para separar PEG. Se detectó el PEG a 215 nm
y se cuantificó usando valores de área.
Se añadieron 50 \mul de una muestra a 950
\mul de propanol 50%/ácido clorhídrico 0,5 M y se midió la
absorción a 500 nm para cuantificar DXR.
Se eluyeron y separaron los anticuerpos usando
una columna GPC (3000SWXL, Tosoh Corporation) con un tampón a pH
7,0 (NaH_{2}PO_{4} 25 mM, Na_{2}SO_{4} 200 mM, SDS 0,1%) de
la misma manera que en la cuantificación de PEG. Se cuantificaron
los anticuerpos usando valores de área del pico de anticuerpo
detectado a 280 nm.
Se cuantificaron los lípidos (cantidad total de
DPPC y colesterol) mediante HPLC. Se cargaron los liposomas en una
columna L ODS (4,6 mm x 250 mm, Chemicals Inspection & Testing
Institute) y se eluyeron los lípidos con tetrahidrofurano
(THF)/acetonitrilo/agua (2:1:1 (v/v/v), ácido trifluoroacético
0,1%). Los lípidos se detectaron a 215 nm y se cuantificaron a
partir de los valores de área de los picos de DPPC y colesterol. Se
preparó una muestra para la cuantificación de lípidos añadiendo 9
veces el volumen del eluente anterior a un volumen de la muestra de
liposoma.
Ejemplo
2
(Referencia)
Se prepararon liposomas, según el procedimiento
del ejemplo 1, que se introdujeron con PEG en una cantidad de 0 a
aproximadamente 0,7 moles % basados en un mol del total de lípidos
que constituyen los liposomas, 0 a aproximadamente 1 moles %
basados en un mol de DPPC, o 0 a aproximadamente 40 moles % basados
en un mol de lípidos maleimidados (encapsulando DXR sin anticuerpos
unidos y unidos a PEG 2000 o PEG 5000).
\vskip1.000000\baselineskip
| Liposoma | Concentración DXR | Cantidad PEG* | Cantidad PEG** | Cantidad PEG*** |
| (mg/ml) | ||||
| 1 | 1,14 | 0,083 (PEG 5000) | 0,13 | 4,61 |
| 2 | 1,17 | 0,22 (PEG 5000) | 0,34 | 12,2 |
| 3 | 1,27 | 0,40 (PEG 5000) | 0,63 | 22,2 |
| 4 | 1,32 | 0,48 (PEG 5000) | 0,75 | 26,7 |
| 5 | 1,16 | 0,096 (PEG 2000) | 0,15 | 5,33 |
| 6 | 1,08 | 0,30 (PEG 2000) | 0,47 | 16,7 |
| 7 | 1,47 | 0,60 (PEG 2000) | 0,94 | 33,3 |
| 8 | 1,55 | 0,70 (PEG 2000) | 1,09 | 38,9 |
| 9 | 3,49 | - | - | - |
| * \hskip0,25cm % moles por lípidos totales | ||||
| ** \hskip0,1cm % moles por DPPC | ||||
| *** % moles por lípidos maleimidados DPPE |
Se usaron en los experimentos ratones BALB/cAjcl
machos (de 6 semanas de edad). Se usó un grupo de ratones que
constaba de cuatro ratones para cada uno de los liposomas y se usó
un ratón sin tratar como control en el experimento. Se
administraron los liposomas en la vena de la cola a una dosis de 2
mg/kg como DXR. Transcurridas 16 horas después de la
administración, se administró a los ratones, vía intraperitoneal,
una solución en inyección de Nembutal (Dainippon Pharmaceutical
Co., Ltd.) y se llevó a cabo una toracotomía bajo anestesia para
recoger sangre. Se separó el plasma sanguíneo y se usó para el
análisis de DXR.
Se añadieron 100 \mul del plasma con 1 ml de
ácido clorhídrico 0,3 M/etanol (etanol clorhídrico) y se calentó a
60ºC durante 10 minutos para extraer DXR. Se enfrió el extracto a
4ºC y se centrífugó a 15.000 rpm durante 10 minutos para recoger un
sobrenadante. Se diluyó la muestra 4 veces con etanol clorhídrico y
se midió su fluorescencia a una longitud de onda de fluorescencia
de 590 nm con una longitud de onda de excitación de 490 nm. Se
preparó una curva de calibración usando DXR diluido con etanol
clorhídrico para conocer concentraciones y se usó en la
cuantificación de DXR en plasma. La recuperación de DXR del plasma
del ratón fue 95 a 98% en una proporción de 3,75 a 30 \mug/ml de
DXR (Referencia: Cancer Res., 47, 4471, 1989).
Los valores medios (\pm desviación estándar)
de concentraciones de DXR en plasma en los grupos de liposomas
respectivos se muestran en la Fig. 1. Se descubrió que la
concentración de DXR en plasma como índice de retención de los
liposomas en sangre, aumentó dependiendo de la cantidad de PEG unido
a los liposomas tanto para PEG 5000 como para PEG 2000.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se prepararon liposomas introducidos con PEG en
una cantidad de 0 a 0,6 moles % basados en el total de lípidos del
liposoma, 0 a aproximadamente 1 moles % basados en DPPC y 0 a
aproximadamente 30 moles % basados en DPPE maleimidado
(encapsulando DXR, unido a anticuerpos y PEG 5000), según el
procedimiento del ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
| Liposoma | Concentración DXR | Anticuerpo | Cantidad | Cantidad | Cantidad |
| (mg/100 mg lípidos) | (mg/100 mg lípidos) | PEG* | PEG** | PEG*** | |
| 1 | 10,2 | 1,5 | 0 | 0 | 0 |
| 2 | 10,4 | 1,6 | 0,06 | 0,10 | 3 |
| 3 | 10,3 | 1,6 | 0,10 | 0,16 | 5 |
| 4 | 10,3 | 1,6 | 0,15 | 0,24 | 8 |
| 5 | 11,1 | 1,6 | 0,28 | 0,44 | 15 |
| 6 | 10,5 | 1,6 | 0,30 | 0,48 | 16 |
| 7 | 10,2 | 1,6 | 0,36 | 0,56 | 19 |
| 8 | 11,0 | 1,8 | 0,48 | 0,76 | 26 |
| 9 | 10,8 | 1,3 | 0,52 | 0,82 | 28 |
| 10 | 10,8 | 1,7 | 0,61 | 0,97 | 33 |
| * \hskip0,25cm % moles basados en lípidos totales | |||||
| ** \hskip0,1cm % moles basados en un mol de DPPC | |||||
| *** % moles basados en un mol de lípidos maleimidados DPPE |
\vskip1.000000\baselineskip
Se cuantificó DXR en plasma de la misma manera
que en el ejemplo 2. Los valores medios (\pm desviación estándar)
de concentraciones de DXR en plasma en los grupos de liposomas
respectivos se muestran en la Fig. 2. La concentración DXR en
plasma aumentó dependiendo de la cantidad de PEG unido a los
liposomas, pero se descubrió que la concentración alcanzó una
meseta a una cantidad de PEG introducida de aproximadamente 0,3
moles % basados en los lípidos totales, aproximadamente 0,5 moles %
basados en DPPC y aproximadamente 17 moles % basados en DPPE
maleimidado. Cuando DXR salió de los liposomas, se verificó la
salida de DXR por la desaparición rápida de sangre y, por
consiguiente, se consideró que las concentraciones DXR en plasma
mostradas en los resultados de los ejemplos 2 y 3, se atribuyen al
DXR encapsulado en el liposoma.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se prepararon, según el procedimiento del
ejemplo 1, los siguientes liposomas 2 a 7, en los que se unieron
0,5; 1,2; 2,0; 4,5; 5,3 y 11,4 mg de anticuerpos a 100 mg de lípidos
totales del liposoma (encapsulando DXR, unido a PEG 5000). De
manera similar, se prepararon liposomas 1 sin unión a anticuerpo. En
los liposomas unidos a PEG, la retención de cada liposoma en sangre
fue equivalente dentro de la proporción de la cantidad de PEG unido
(> 4,4 mg/100 mg de lípidos). Por lo tanto, los resultados
experimentales mostrados más abajo dependen de la cantidad unida de
anticuerpos.
| Liposoma | Cantidad de anticuerpos unidos | Cantidad de DXR incluído | Cantidad de PEG unido |
| (mg/100 mg lípidos) | (mg/100 mg lípidos) | (mg/100 mg lípidos) | |
| 1 | 0 | 9,5 | 8,2 |
| 2 | 0,5 | 9,1 | 8,2 |
| 3 | 1,2 | 9,5 | 8,1 |
| 4 | 2,0 | 8,9 | 5,3 |
| 5 | 4,5 | 9,6 | 6,2 |
| 6 | 5,3 | 9,7 | 6,4 |
| 7 | 11,4 | 10,0 | 3,2 |
Se situaron vía transcutánea cepas de células de
cáncer de estómago MKN45 en dos sitios (1 x 10^{6} células por
sitio) en el lado dorsal de ratas desnudas. Se comenzaron
administraciones de liposomas con diferentes cantidades de
anticuerpos unidos, para el "test de eficacia", cuando el tumor
alcanzó un tamaño suficientemente grande para medir sus diámetros
largo y corto. La dosis de los liposomas fue 5,0 mg/kg (como
cantidad de DXR) por administración. Se proporcionó un grupo al que
se administró DXR (5,0 mg/kg) como control positivo y se administró
suero fisiológico salino al grupo control. Todos los grupos se
administraron vía intravenosa en el día de comienzo de la
administración (día 0), día 3 y día 6.
Se midieron los diámetros de los tumores
(diámetros mayores y menores) frente al tiempo y se calculó el peso
de tumor estimado ((diámetro menor)^{2} x diámetro
mayor/2)). Tras las tres veces de administración, se continuó la
medida hasta el día 19. El intervalo de proliferación del tumor se
calculó basado en el peso estimado de cada tumor en el día del
comienzo de la administración, que se tomó como 1,0 para evaluar el
efecto inhibitorio en la proliferación del tumor de cada grupo
tratado en relación al grupo control y el grupo al que se administró
DXR. El último día de la medida (día 19) se calculó para cada grupo
tratado un valor T/C % (intervalo de proliferación del tumor del
grupo tratado/ intervalo de proliferación del tumor del grupo
control x 100). Se obtuvo la cantidad de anticuerpos unidos que
logró el máximo efecto inhibitorio frente a la proliferación del
tumor (una dosis óptima) basada en la cantidad de anticuerpos
unidos en cada muestra.
Como resultado, se descubrieron, en todos los
grupos tratados en comparación con el control, efectos inhibitorios
significativos frente a la proliferación del tumor. Como se muestra
en la Fig. 3, cuando se hace la comparación al grupo al que se
administró DXR, se observaron efectos inhibitorios significativos
frente a la proliferación del tumor, en las muestras con las
cantidades de anticuerpos unidos dentro del intervalo de 0,5 a 5,3
mg/100 mg de lípidos totales. Se observó la actividad inhibitoria
frente a la proliferación del tumor, con un pico próximo a 2 mg/100
mg de lípidos totales como cantidad de anticuerpos unidos.
En el "test farmacocinético", se
administraron vía intravenosa, los liposomas 4 a 7 anteriores, con
diferentes cantidades de anticuerpos unidos (2,0; 4,5; 5,3 y 11,4
mg/100 mg de lípidos totales) a ratones (cada grupo constaba de 2 ó
3 ratones, y de una cantidad de 1,0 mg/kg como cantidad de DXR).
Cuatro horas después de la administración, se recogió plasma
sanguíneo de cada animal. Se midió la cantidad de DXR en plasma
mediante el procedimiento de medida de fluorescencia de la misma
manera que en el Ejemplo 2. Se compararon las cantidades de DXR en
plasma en las muestras respectivas tras la administración para
encontrar correlación entre la cantidad de anticuerpos unidos y la
retención en sangre de los liposomas que encapsulan DXR y unidos a
anticuerpos. En el test farmacocinético, se obtuvo la correlación
entre la cantidad de DXR en plasma tras la administración de cada
muestra y la cantidad de anticuerpos unidos de cada muestra, para
muestras que tenían una cantidad de anticuerpos unidos de 2 mg/100
mg de lípidos o más (Fig. 4). Como resultado, se descubrió que, si
la cantidad de los anticuerpos unidos excede de 2 mg/100 mg de
lípidos, la retención en sangre disminuirá dependiendo de la
cantidad aumentada de los anticuerpos unidos.
El liposoma de la presente invención se
caracteriza por una excelente retención en sangre y una cantidad
reducida del polialquilenglicol unido en comparación con liposomas
convencionales. Por lo tanto, el liposoma de la presente invención
puede evitar los efectos secundarios causados por el
polialquilenglicol y tiene ventajas desde un punto de vista de
productividad industrial. El liposoma de la presente invención se
caracteriza además porque puede lograr más efectos terapéuticos
excelentes en comparación con los liposomas unidos a anticuerpos
convencionales.
Claims (19)
1. Un liposoma en el que un anticuerpo
está unido a través de un grupo tioéter a un liposoma que comprende
lípidos cuyo componente parcial tiene el extremo terminal
maleimidado y en el que una cantidad del anticuerpo unido es de 0,4
a 0,7 moles % basados en un mol de los lípidos maleimidados
contenidos en el liposoma.
2. El liposoma según la reivindicación
1, que se obtiene mediante reacción de un liposoma que tiene un
grupo maleimida y un grupo que contiene azufre derivado del
anticuerpo para formar una unión tioéter.
3. El liposoma según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 2, en el que el anticuerpo es un anticuerpo
GAH.
4. El liposoma según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo es un fragmento
de anticuerpo F(ab')_{2}.
5. El liposoma según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, en el que un compuesto que contiene una
fracción polialquilenglicol está unido además a una superficie del
liposoma.
6. Un liposoma en el que un compuesto
que contiene dos grupos polialquilenglicol y un anticuerpo se unen
a través de grupos tioéter a un liposoma que comprende lípidos cuyo
componente parcial tiene el extremo terminal maleimidado y en el
que una cantidad del compuesto unido es 15 a 30 moles % y una
cantidad del anticuerpo unido es 0,4 a 0,7 moles % basados en un
mol de los lípidos maleimidados contenidos en el liposoma.
7. El liposoma según la reivindicación
6, que se obtiene haciendo reaccionar un grupo maleimida del lípido
maleimidado con el compuesto que contiene dos grupos
polialquilenglicol introducidos con un grupo tiol.
8. El liposoma según la reivindicación 6
o la reivindicación 7, en el que el compuesto está unido a una
superficie del liposoma.
9. El liposoma según una cualquiera de
las reivindicaciones 6 a 8, en el que el polialquilenglicol es
polietilenglicol.
10. El liposoma según la reivindicación 9,
en el que el compuesto tiene dos grupos polietilenglicol.
11. El liposoma según la reivindicación
10, en el que el polietilenglicol tiene un peso molecular de 2.000
a 7.000 daltons.
12. El liposoma según la reivindicación
10, en el que el polietilenglicol tiene un peso molecular de
aproximadamente 5.000 daltons.
13. El liposoma según una cualquiera de
las reivindicaciones 6 a 12, que es un liposoma obtenido haciendo
reaccionar un liposoma que tenga un grupo maleimida y un grupo que
contenga azufre derivado del anticuerpo para formar una unión
tioéter.
14. El liposoma según una cualquiera de
las reivindicaciones 6 a 13, en el que el anticuerpo es un
anticuerpo GAH.
15. El liposoma según una cualquiera de
las reivindicaciones 6 a 14, en el que el anticuerpo es un fragmento
de anticuerpo F(ab')_{2}.
16. Un medicamento adecuado para el
tratamiento de cáncer según una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 15.
17. El medicamento según la reivindicación
16, en el que el cáncer es cáncer de estómago o cáncer de
colon.
18. Uso del liposoma según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 17 para la preparación de un medicamento
para el tratamiento de cáncer.
19. El liposoma según la reivindicación 6,
en el que la cantidad de anticuerpos unidos es de 0,5 a 4,5 mg,
preferentemente de 1,2 a 2 mg, por 100 mg de lípidos totales que
constituyen el liposoma.
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