ES2211123T3

ES2211123T3 - Reactivos para el ensayo fluorescente cyp2d.

Info

Publication number: ES2211123T3
Application number: ES99933887T
Authority: ES
Inventors: Vaughn P. Miller; Charles L. Crespi
Original assignee: Gentest Corp
Current assignee: Gentest Corp
Priority date: 1998-07-16
Filing date: 1999-07-12
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2019-07-12
Also published as: EP1095032B1; DK1095032T3; US6130342A; ATE256120T1; EP1095032A1; DE69913533D1; DE69913533T2; WO2000004008A1

Abstract

Un compuesto de fórmula I: **FORMULA** (a) en la que R1 se selecciona del grupo que consiste en un hidruro y un haluro; (b) en la que R2 se selecciona del grupo que consiste en un alquilo y un arilo; (c) en la que R3 se selecciona del grupo que consiste en un hidruro y un haluro; (d) en la que R4 se selecciona del grupo que consiste en un hidruro, un nitrilo, un alquilo y un arilo; (e) en la que R5 se selecciona del grupo que consiste en un hidruro y un alquilo; (f) en la que R6 es un alquilo; (g) en la que R7 es un alquilo; (h) en la que n es un número entero seleccionado del grupo que consiste en 0, 1, 2, 3 y 4; (i) en la que m es 1; y (j) en la que X- es un contraión cargado negativamente.

Description

Reactivos para el ensayo fluorescente CYP2D.

Campo de la invención

Esta solicitud reivindica prioridad bajo título 35 \NAK19(e), de la solicitud provisional de Estados Unidos nº 60/092.995, presentada el 16 de julio de 1998, y titulada NOVEL CYP2D FLUORESCENT ASSAY REAGENTS, cuyo contenido completo se incorpora aquí como referencia.

Esta invención se refiere al campo de fármacos y metabolismo xenobiótico. La invención incluye sustratos sonda fluorescentes nuevos de citocromo P450 CYP2D, métodos para su preparación y su uso como reactivos de ensayo.

Antecedentes de la invención

Los citocromos P450 (CYP) son las enzimas principales en el metabolismo oxidativo de muchos fármacos, procarcinógenos, promutágenos y contaminantes ambientales. El citocromo P450 es un sistema multienzimático unido a membrana que contiene hemo, que está presente en muchos tejidos in vivo, pero que está presente en mayor nivel en el hígado. En el hígado humano, se estima que hay 15-20 formas diferentes de citocromo P450 metabolizadoras de productos xenobióticos. Se ha desarrollado una nomenclatura estándar basada en la similitud de las secuencias de aminoácidos. Se sabe que ciertas formas de P450 (tales como CYP2D6 y CYP2C19) son polimórficas en humanos, y algunas (tales como CYP1A2 y CYP3A4) se regulan en respuesta a productos químicos ambientales. La competición por el metabolismo por una forma particular de citocromo P450 es el mecanismo principal de algunas interacciones fármaco-fármaco clínicamente significativas.

La identificación de las enzimas responsables del metabolismo se está convirtiendo en un aspecto importante del desarrollo de fármacos. Tales identificaciones consideran tanto el metabolismo del fármaco nuevo como la inhibición por el fármaco nuevo. La identificación de las enzimas implicadas en el metabolismo del fármaco nuevo permite la predicción, basándose en el conocimiento de la capacidad de los fármacos coadministrados para inhibir las mismas enzimas, de qué fármacos coadministrados pueden inhibir el metabolismo del fármaco nuevo. Esta información se puede usar también para predecir la variabilidad individual, basada en los polimorfismos metabólicos conocidos. La identificación de las enzimas más sensibles a la inhibición por el fármaco nuevo permite la predicción, basándose en el conocimiento de qué fármacos coadministrados son metabolizados por la misma enzima, de qué metabolismo del fármaco coadministrado puede ser inhibido por el fármaco nuevo. El obtener información para una serie de fármacos candidatos al principio del proceso de descubrimiento del fármaco puede ayudar en la elección del mejor fármaco candidato para desarrollo posterior.

CYP2D6 es el único miembro de la subfamilia CYP2D que se expresa en humanos. CYP2D6 es responsable del metabolismo de muchos fármacos importantes, por ejemplo: antitusivos, antiarrítmicos y fármacos psicotropos. CYP2D6 también es polimórfico. Alrededor del 5-10% de los caucásicos y 1-3% de los asiáticos y africanos son deficientes de esta enzima. Alrededor del 5% de los caucásicos son metabolizadores ultrarrápidos, tienen niveles muy altos de CYP2D6 (S. Rendic y F.J. Di Carlo, Drug Metab. Rev. 29, 413-580 (1997)). La importancia de este P450 en el metabolismo de fármacos, así como su variabilidad en actividad debida a los polimorfismos, hace importante el cribado del metabolismo e inhibición de esta enzima en el desarrollo de fármacos.

Los ensayos de CYP2D se han centrado en el metabolismo de moléculas de fármaco o fármacos candidatos. Se ha informado que varios fármacos se metabolizan mediante CYP2D6 por medio de O-desalquilación. Por ejemplo, dextrometorfano se O-desmetila mediante CYP2D6 (Kupfer, A., Schmid, B., Preisig, R., y G. Pfaff (1984) Lancet i, p 517). Los sustratos tales como dextrometorfano o bufuralol son efectivos para evaluar la actividad e inhibición de CYP2D, pero no son adecuados para la tecnología de ensayos de cribado de alto rendimiento (ambos necesitan una separación que requiere tiempo de los productos de reacción de CYP2D, que usa HPLC). Además, ninguno de estos sustratos tiene las propiedades fluorescentes necesarias que hacen útil el sustrato para análisis de fluorescencia en placa in situ.

Se ha informado previamente el uso del compuesto disponible comercialmente 3-ciano-7-etoxicumarina (CEC) como sustrato fluorescente para evaluar la actividad de CYP2D6 en modo de alto rendimiento (véase Crespi et al. Anal Biochem. 248, 188-190, (1997)). Sin embargo, el bajo número de recambio enzimático y la especificidad pobre de este sustrato lo hacen de utilidad limitada.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a sustratos fluorescentes nuevos de la enzima P450 humana CYP2D6. Estos sustratos son útiles para evaluar la actividad enzimática de CYP2D6, y para seleccionar compuestos que inhiben la actividad enzimática de CYP2D6. En consecuencia, el compuesto y los métodos de la invención son útiles para identificar interacciones farmacológicas potencialmente adversas que están mediadas por la inhibición de la actividad enzimática de CYP2D6.

Los compuestos de la invención son sustratos que son específicos de CYP2D, y se caracterizan porque tienen propiedades que permiten la cuantificación sensible de la actividad de CYP2D usando análisis de fluorescencia in situ. Para cumplir estos requisitos, los compuestos de la invención incluyen: 1) amonio o una función de amina básica para marcar un sitio activo de CYP2D, 2) un núcleo de 7-hidroxicumarina para la detección fácil de fluorescencia, y 3) un grupo O-alquilo a 5-7 angstroms del nitrógeno, que puede ser O-desalquilado fácilmente por la enzima.

Según un aspecto de la invención, se proporcionan compuestos de fórmula I:

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1

(a): en la que R1 se selecciona del grupo que consiste en un hidruro y un haluro;

(b): en la que R2 se selecciona del grupo que consiste en un alquilo y un arilo;

(c): en la que R3 se selecciona del grupo que consiste en un hidruro y un haluro;

(d): en la que R4 se selecciona del grupo que consiste en un hidruro, un nitrilo, un alquilo y un arilo;

(e): en la que R5 se selecciona del grupo que consiste en un hidruro y un alquilo;

(f): en la que R6 es un alquilo;

(g): en la que R7 es un alquilo;

(h): en la que n es un número entero seleccionado del grupo que consiste en 0, 1, 2, 3 y 4;

(i): en la que m es 1; y

(j): en la que X^{-} es un contraión cargado negativamente.

Cada uno de los sustituyentes R1, R2, R3, R4, R5, R6 y R7 se selecciona independientemente de los grupos enumerados anteriormente.

Preferiblemente, R1 y R3 son ambos hidruro o haluro. En las realizaciones más preferidas, uno o ambos de R1 y R3 son hidruro.

Preferiblemente, R2 es un alquilo insaturado que contiene de 1 a 5 átomos de carbono inclusive, o un arilo tal como bencilo.

Preferiblemente, R4 es un hidruro o un alquilo. Los alquilos de R4 preferidos son alquilos saturados que contienen 1-5 átomos de carbono inclusive. El R4 más preferido es un alquilo que se sustituye para contener un grupo atractor de electrones, p.ej. CF_{3} o CN.

Estos grupos alquilo sustituidos imparten diferentes propiedades fluorescentes a los compuestos de fórmula I.

Preferiblemente, R6 y R7 son, independientemente, alquilos insaturados que contienen 1-5 átomos de carbono inclusive. Más preferiblemente, R6 y R7 son alquilos que contienen 1, 2 ó 3 átomos de carbono y, lo más preferiblemente, los alquilos de R6 y R7 son etilo.

En las realizaciones preferidas, n es 0, 1, 2, 3 ó 4 y, más preferiblemente, n es 2.

En las realizaciones más preferidas, el compuesto de fórmula I es el compuesto Ia (AMMC, C_{18}H_{26}NO_{3}, nombre: 3-[2-(N, N-dietil-N-metilamonio)etil]-4-metil-7-metoxicumarina) o el compuesto Ib (C_{18}H_{23}F_{3}NO_{3}, nombre: 3-[2-(N,N-dietil-N-metilamonio) etil]-7-metoxi-4-trifluorometilcumarina) o el compuesto Ic (C_{17}H_{20}F_{3}NO_{3}, nombre: 3-[2-(dietilamino) etil]-7-metoxi-4-trifluorometilcumarina) o el compuesto Id (AMC, C_{17}H_{23}NO_{3}, nombre: 3-[2-(dietilamino) etil]-7-metoxi-4-metilcumarina). Más preferiblemente, el compuesto es 3-[2-(N, N-dietil-N-metilamonio)etil]-7-metoxi-4-metilcumarina.

En las realizaciones más preferidas, el producto producido mediante el proceso de dejar reaccionar una enzima CYP2D con un compuesto de fórmula I es el compuesto IIa (AMHC, C_{17}H_{24}NO_{3}, nombre: 3-[2-(N,N-dietil-N-metilamonio)etil]-7-hidroxi-4-metilcumarina).

2

Las sales de los compuestos de fórmula I se incluyen también dentro de los compuestos de la invención. En particular, se prefieren las sales de AMMC y AMC.

Según aun otro aspecto de la invención, se proporciona una composición que comprende un compuesto de fórmula I. El compuesto está presente en la composición a una concentración mayor que al menos el 50% en peso. La composición más preferida contiene una concentración del compuesto de fórmula I que es al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 90%, y lo más preferiblemente al menos el 95% en peso. Las composiciones preferidas están sustancialmente libres de producto de reacción detectable, es decir, las composiciones de la invención no contienen niveles del producto de conversión catalizado por CYP2D de un compuesto de fórmula II.

Las composiciones pueden contenerse en viales, que son componentes de un equipo para ensayar la actividad enzimática de CYP2D. Preferiblemente, los viales contienen cantidades preseleccionadas de las composiciones para facilitar la disolución del contenido, para conseguir una concentración preseleccionada del compuesto para realizar un ensayo enzimático de CYP2D.

En otro aspecto de la invención, se proporciona 3-[2-(dietilamino)etil]-7-metoxi-4-metilcumarina (AMC, C_{17}H_{23}N
O_{3}).

Según aun otro aspecto de la invención, se proporciona un método para ensayar la actividad enzimática de CYP2D, que comprende un método para ensayar la actividad de CYP2D que comprende:

en contacto una enzima CYP2D con un compuesto de fórmula I:

3

(f): en la que R6 es un alquilo;

(g): en la que R7 es un alquilo;

(i): en la que m se selecciona del grupo que consiste en 0 y 1; y

(j): en la que X^{-} es un contraión cargado negativamente;

en condiciones en las que la enzima CYP2D cataliza la conversión del compuesto reivindicado a un producto fluorescente.

El ensayo se puede realizar in vivo o in vitro. Por ejemplo, los compuestos de la invención (p.ej., los compuestos de fórmula I) se pueden administrar a un modelo animal para, p.ej., localizar y, opcionalmente, cuantificar la actividad enzimática de CYP2D (p.ej., observando los productos de reacción en muestras de líquido biológico o tejido del animal). Más preferiblemente, el método para ensayar la actividad enzimática de CYP2D se usa para detectar la actividad de un CYP2D que puede estar contenido en una muestra de líquido biológico o muestra sólida (p.ej., una muestra de biopsia de hígado, cerebro o intestino), o que se puede expresar en un sistema que contiene células o en un sistema sin células (p.ej., un microsoma que contiene CYP2D expresado de cADN). De esta manera, se pueden detectar las enfermedades asociadas a deficiencias o sobreexpresión de actividad enzimática de CYP2D. Así, la enzima CYP2D puede estar contenida en una muestra que es una muestra hepática tal como un homogeneizado bruto, parcialmente purificado, o enzima hepática purificada obtenida de una biopsia, un CYP2D expresado de cADN, en hepatocitos o en microsomas.

Según aun otro aspecto de la invención, se proporciona un método de cribado para seleccionar agentes que inhiben la actividad enzimática de CYP2D, que comprende poner en contacto una enzima CYP2D con un compuesto de fórmula I:

4

(f): en la que R6 es un alquilo;

(g): en la que R7 es un alquilo;

(i): en la que m se selecciona del grupo que consiste en 0 y 1; y

(j): en la que X^{-} es un contraión cargado negativamente;

en presencia de un inhibidor enzimático putativo de CYP2D, y en condiciones en las que la enzima CYP2D cataliza la conversión de dicho compuesto a un producto fluorescente; y seleccionar un agente que inhibe la actividad enzimática de CYP2D como inhibidor enzimático de CYP2D.

En las realizaciones preferidas, el método de cribado es un ensayo de cribado de alto rendimiento.

Según otro aspecto de la invención, se proporciona un método para visualizar una enzima CYP2D, que comprende poner en contacto una muestra que contiene enzima CYP2D con un compuesto de fórmula I:

5

(d): en la que R4 se selecciona del grupo que consiste en un hidruro, un nitrilo, un alquilo, y un arilo;

(f): en la que R6 es un alquilo;

(g): en la que R7 es un alquilo;

(i): en la que m se selecciona del grupo que consiste en 0 y 1; y

(j): en la que X^{-} es un contraión cargado negativamente;

y someter a la enzima CYP2D y el compuesto reivindicado a condiciones en las que la enzima CYP2D cataliza la conversión de dicho compuesto a un producto fluorescente.

En las realizaciones preferidas, el método para visualizar una enzima CYP2D se realiza en una muestra de sección de tejido, es decir, la muestra que contiene enzima CYP2D es una sección de tejido tal como la derivada de una muestra de biopsia.

Según aun otro aspecto de la invención, se proporcionan equipos para detectar y/o medir la actividad enzimática de CYP2D. Los equipos contienen un compuesto de fórmula I e instrucciones para usar los equipos para medir la actividad enzimática de CYP2D. Los equipos pueden contener además instrucciones para calcular K_{i} y/o CI_{50} para un inhibidor de CYP2D. Los compuestos preferidos de fórmula I son compuestos que tienen una alta especificidad de unión por la enzima, y para los cuales la enzima exhibe una velocidad alta de transformación de sustrato. Estos parámetros se reflejan típicamente en los valores de Km y Vmax para la conversión catalizada por la enzima del sustrato (es decir, el compuesto de la invención) a un producto fluorescente. En general, una afinidad relativa mayor de la enzima CYP2D por un primer sustrato comparado con un segundo sustrato está indicada por un valor de Km menor para el primer sustrato comparado con el segundo sustrato. Un número de recambio catalítico mayor para un primer sustrato comparado con un segundo sustrato está indicado por una Vmax mayor para el primer sustrato. Los compuestos preferidos de la invención tienen una Km mayor de alrededor de 50 nM, con una Vmax mayor de alrededor de 0,05 m^{-1}. En general, los compuestos de la invención tienen una Km de alrededor de 1 a 100 mM y una Vmax de alrededor de 0,05 a alrededor de 20 min^{-1}, con un intervalo preferido de Km que es mayor de alrededor de 50 nM, y un intervalo preferido de Vmax que es de alrededor de 0,2 a alrededor de 20 min^{-1}.

Según aun otro aspecto de la invención, se proporcionan productos fluorescentes nuevos. Los productos nuevos son compuestos de fórmula II. Así, en un aspecto adicional de la invención, se proporciona un proceso para preparar un producto que comprende un compuesto de fórmula II:

6

(b): en la que R3 se selecciona del grupo que consiste en un hidruro y un haluro;

(c): en la que R4 se selecciona del grupo que consiste en un hidruro, un nitrilo, un alquilo y un arilo;

(d): en la que R5 se selecciona del grupo que consiste en un hidruro y un alquilo;

(e): en la que R6 es un alquilo;

(f): en la que R7 es un alquilo;

(g): en la que n es un número entero seleccionado del grupo que consiste en 0, 1, 2, 3 y 4;

(h): en la que m se selecciona del grupo que consiste en 0 y 1; y

(i): en la que X^{-} es un contraión cargado negativamente;

dejando reaccionar una enzima CYP2D con un sustrato que es un compuesto de fórmula I:

7

(f): en la que R6 es un alquilo;

(g): en la que R7 es un alquilo;

(i): en la que m se selecciona del grupo que consiste en 0 y 1; y

(j): en la que X^{-} es un contraión cargado negativamente;

en condiciones en las que la enzima CYP2D convierte el sustrato a un compuesto de fórmula II. En general, los compuestos de fórmula II se producen como producto de reacción de la reacción catalizada por CYP2D de un sustrato que es un compuesto de fórmula I. En general, estos compuestos tienen estructuras que difieren de las de los compuestos de fórmula I en que tienen un grupo hidroxilo en posición 7 del anillo de cumarina.

En otro aspecto de la invención, se proporciona un compuesto de fórmula II,

8

\vskip1.000000\baselineskip

(e): en la que R6 es un alquilo;

(f): en la que R7 es un alquilo;

(h): en la que m es 1; y

(i): en la que X^{-} es un contraión cargado negativamente.

Los compuestos de fórmula I pueden ser aminas terciarias (es decir, m = 0) o cuaternarias (es decir, m = 1). Preferiblemente, los compuestos de fórmula I son aminas terciarias.

Las características preferidas de los aspectos de la invención se dan en las reivindicaciones dependientes adjuntas.

Estos y otros aspectos de la invención, así como diversas ventajas y utilidades, serán más evidentes con referencia a la descripción detallada de las realizaciones preferidas.

Descripción de las figuras

La Figura 1 es la selectividad para la desalquilación de compuesto Ia mediante un panel de enzimas P450 humanas.

La Figura 2 es la selectividad para la desalquilación de compuesto Ic mediante un panel de enzimas P450 humanas.

La Figura 3 es la selectividad para la desalquilación de compuesto Ib mediante un panel de enzimas P450 humanas.

Descripción detallada de la invención I. Definiciones

A lo largo de este documento se usa CYP2D en referencia a la enzima que cataliza la conversión de un compuesto de la invención a un producto fluorescente. Se sobreentiende que se puede usar cualquier miembro de la familia CYP2D en cualquiera de las reacciones enzimáticas discutidas aquí, y que CYP2D representa una realización particularmente preferida de la invención.

Los términos moleculares, cuando se usan en esta solicitud, tienen su significado común a menos que se especifique de otra manera. El término hidruro denota un único átomo de hidrógeno. El término amino denota un átomo de nitrógeno que contiene dos sustituyentes que pueden ser iguales o diferentes. Los sustituyentes del grupo amino se seleccionan independientemente del grupo que consiste en grupos hidruro, alquilo, cicloalquilo y arilo.

Los grupos alquilo pueden ser lineales o ramificados, saturados o insaturados, y tienen hasta 10 átomos de carbono. Los grupos alquilo preferidos son saturados. Más preferiblemente, los grupos alquilo son grupos alquilo inferiores que tienen 1-5 átomos de carbono inclusive. Los grupos alquilo ejemplares incluyen metilo, etilo, propilo, butilo y pentilo. Los grupos alquilo ejemplares adicionales incluyen isopropilo y tert-butilo.

Los grupos arilo pueden contener 0-4 heteroátomos seleccionados de oxígeno, nitrógeno y azufre, en un sistema cíclico carbocíclico o heterocíclico, simple o fusionado, que tiene 5-15 miembros inclusive. Se pueden reemplazar uno o más átomos de hidrógeno por un grupo sustituyente seleccionado de un grupo acilo, amino, carboalcóxido, carboxilo, carboxiamido, nitrilo, halógeno, hidroxilo, nitro, tiol, alquilo, arilo, cicloalquilo, alcóxido, arilóxido, sulfóxido y guanidino.

Una clase preferida de grupos arilo son los grupos fenilo no sustituidos y los grupos fenilo en los que se ha reemplazado uno o más hidrógenos con un grupo alquilo, alcóxido, arilóxido o halógeno. Los grupos arilo ejemplares incluyen fenilo, fenil naftilo, bifenilo, terfenilo, piridinilo y otros derivados diversos de fenilo.

Los grupos cicloalquilo tienen, preferiblemente, sistemas cíclicos saturados o parcialmente insaturados, cada uno conteniendo de cero a cuatro heteroátomos seleccionados de oxígeno, nitrógeno y azufre en un sistema cíclico carbocíclico o heterocíclico, simple o fusionado, que tiene de tres a quince miembros. Se puede reemplazar también uno o más átomos de hidrógeno con un grupo sustituyente seleccionado de grupos acilo, amino, carboalcóxido, carboxilo, carboxiamido, nitrilo, halógeno, hidroxilo, nitro, carbonilo, tiol, alquilo, arilo, cicloalquilo, alcóxido, arilóxido y guanidino, o dos sustituyentes juntos pueden formar un anillo cicloalquilo fusionado. Los ejemplos de grupo cicloalquilo incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclohexilo, cicloheptilo, morfolinilo, piperidinilo, y pirrolidinilo. Un grupo alcóxido denota un átomo de oxígeno sustituido con un grupo acilo, alquilo o cicloalquilo. Los ejemplos incluyen metóxido, tert-butóxido, bencilóxido y ciclohexilóxido. Un grupo arilóxido denota un átomo de oxígeno sustituido con un grupo arilo. Los ejemplos de grupos arilóxido son fenóxido, 4-carbobenciloxifenóxido, 4-fenoxifenóxido. Los grupos arilóxido preferidos son fenóxido y grupos fenóxido sustituidos. Los grupos sulfóxido comprenden un átomo de azufre hexavalente unido a dos o tres sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en grupos carbonilo, alquilo, arilo y cicloalquilo, en los que al menos uno de dichos sustituyentes es carbonilo.

Las sales aceptables de los compuestos de fórmula I incluyen sales de adición de ácido. Tales sales, que se destinan a la administración a un animal, p.ej., un modelo animal para estudios metabólicos, pueden ser una sal farmacéuticamente aceptable, es decir, es una sal que es no tóxica y aceptable para la administración a un animal de acuerdo con las normativas gubernamentales. El término sales incluye las sales comúnmente usadas para formar sales de adición de iones amonio. La naturaleza de la sal no es crítica. Se pueden preparar sales de adición de ácido adecuadas de los compuestos de fórmula I a partir de un ácido inorgánico o un ácido orgánico. Los ejemplos de tales ácidos inorgánicos son ácido clorhídrico, bromhídrico, yodhídrico, nítrico, carbónico, sulfúrico y fosfórico. Los ácidos orgánicos apropiados se pueden seleccionar de clases alifáticas, cicloalifáticas, aromáticas, arilalifáticas, heterocíclicas, carboxílicas y sulfónicas de ácidos orgánicos, ejemplos de los cuales son ácido fórmico, acético, propiónico, succínico, glicólico, glucónico, maleico, embónico (pamoico), metanosulfónico, etanosulfónico, 2-hidroxietanosulfónico, pantoténico, bencenosulfónico, toluensulfónico, sulfanílico, mesílico, ciclohexilaminosulfónico, esteárico, algénico, b-hidroxibutírico, malónico, láctico y galacturónico. Todas estas sales se pueden preparar mediante medios convencionales a partir del compuesto correspondiente de fórmula I tratando, por ejemplo, el compuesto de fórmula I con el ácido
apropiado.

II. Descripción

La invención proporciona compuestos de fórmula I, métodos para su fabricación y uso. Los compuestos de fórmula I son útiles para ensayar la actividad de CYP2D. Los compuestos son particularmente útiles para medir la inhibición potencial de CYP2D6, preferiblemente en un ensayo de cribado de alto rendimiento. Por ejemplo, la invención proporciona un método para ensayar CYP2D que implica poner en contacto una enzima CYP2D con un compuesto de fórmula I, en condiciones en las que la enzima CYP2D interacciona con el compuesto de fórmula I y cataliza la desalquilación en la posición 7 del compuesto, para formar un producto de 7-hidroxi cumarina. Tales condiciones son conocidas para los expertos en la técnica (véase también, p.ej., los Ejemplos para las condiciones). Este método se puede realizar usando fuentes in vivo o in vitro de enzima CYP2D. En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para evaluar la inhibición de CYP2D potencial de un producto químico de prueba, preferiblemente en un ensayo de cribado de alto rendimiento. Tales condiciones son conocidas para los expertos en la técnica, y se ejemplifican en los Ejemplos.

La presente invención comprende, en un primer aspecto, compuestos de fórmula I:

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9

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Estructura genérica para un sustrato

(a): en la que R1 es un hidruro o un haluro (p.ej., F, Cl, Br y I);

(b): en la que R2 es un alquilo (p.ej., metilo, etilo, propilo, butilo y pentilo), un cicloalquilo (p.ej., ciclohexilo) o un arilo (p.ej., bencilo);

(c): en la que R3 es un hidruro o un haluro (p.ej., F, Cl, Br y I);

(d): en la que R4 es un hidruro, un alquilo (p.ej., metilo, etilo, CF_{3}, CN) o un arilo (p.ej., bencilo);

(e): en la que R5 es un hidruro, un alquilo (p.ej., metilo, etilo) o un arilo (p.ej., bencilo);

(f): en la que R6 es un alquilo (p.ej., metilo, etilo, propilo);

(g): en la que R7 es un alquilo (p.ej., metilo, etilo, propilo);

(h): en la que n es 0, 1, 2, 3 ó 4;

(i): en la que m es 0 ó 1; y

(j): en la que X^{-} es un contraión cargado negativamente (p.ej., un haluro tal como Cl, F, Br, I o una base orgánica tal como AcO-).

Preferiblemente, R1 y R3 son ambos hidruro o haluro. Por ejemplo, R1 y R3 pueden ser flúor, cloro, bromo o yodo. El haluro preferido es flúor. Más preferiblemente, uno o ambos de R1 y R3 son hidruro.

Preferiblemente, R2 es un alquilo, un cicloalquilo o un arilo. Más preferiblemente, R2 es un alquilo o un arilo. Los alquilos de R2 preferidos son alquilos insaturados que contienen de 1 a 5 átomos de carbono inclusive. El arilo de R2 preferido es bencilo.

Preferiblemente, R4 es un hidruro o un alquilo. El alquilo de R4 puede estar sustituido o no sustituido; sin embargo, los alquilos de R4 preferidos son alquilos saturados que contienen 1-5 átomos de carbono inclusive. El R4 más preferido es un alquilo que está sustituido para contener un grupo atractor de electrones, p.ej., CF_{3} o CN. Estos grupos alquilo sustituidos imparten diferentes propiedades fluorescentes a los compuestos de fórmula I. Así, alterando la identidad del grupo R4, se pueden cambiar previsiblemente las longitudes de onda de excitación y emisión del producto fluorescente que resulta de la acción de CYP2D sobre un compuesto de fórmula I.

Para los compuestos de fórmula I que son aminas cuaternarias, R5 se selecciona del grupo que consiste en un hidruro, un alquilo o un arilo. Los alquilos de R5 preferidos son alquilos saturados o insaturados que contienen 1-5 átomos de carbono inclusive. Los alquilos de R5 más preferidos son metilo o etilo. El arilo de R5 más preferido es bencilo.

Los grupos de R6 y R7 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en un hidruro, un alquilo y un arilo. Los grupos de R6 y R7 más preferidos son alquilos insaturados que contienen 1-5 átomos de carbono inclusive. Los R6 y R7 más preferidos son grupos alquilo que contienen 1, 2 ó 3 átomos de carbono y, más preferiblemente, los alquilos de R6 y R7 son etilo.

Los compuestos de fórmula I pueden ser aminas terciarias (es decir, m = 0) o cuaternarias (es decir, m = 1). Las aminas cuaternarias de fórmula I necesitan un contraión cargado negativamente, tal como un haluro o una base orgánica. El haluro puede ser un flúor, cloro, bromo o yodo, prefiriéndose cloro. Las bases orgánicas que pueden ser contraiones incluyen formiato, acetato, maleato y succinato.

En las realizaciones más preferidas, el compuesto de fórmula I es el compuesto Ia (AMMC, C_{18}H_{26}NO_{3}, nombre: 3-[2-(N,N-dietil-N-etilamonio)etil]-7-metoxi-4-metilcumarina) o el compuesto Ib (C_{18}H_{23}F_{3}NO_{3}, nombre: 3-[2-(N,N-dietil-N-metilamonio)etil]-7-metoxi-4-trifluorometilcumarina) o el compuesto Ic (C_{17}H_{20}F_{3}NO_{3}, nombre: 3-[2-(dietilamino)etil]-7-metoxi-4-trifluorometilcumarina) o el compuesto Id (AMC, C_{17}H_{23}NO_{3}, nombre: 3-[2-(dietilami-
no)etil]-7-metoxi-4-metilcumarina). Más preferiblemente, el compuesto es 3-[2-(N,N-dietil-N-metilamonio)etil]-7-metoxi-4-metilcumarina.

En las realizaciones más preferidas, el producto producido mediante el proceso de dejar reaccionar una enzima CYP2D con un compuesto de fórmula I es un compuesto de fórmula II. Los compuestos ejemplares de fórmula II incluyen el compuesto IIa (AMHC, C_{17}H_{24}NO_{3}), nombre: 3-[2-(N,N-dietil-N-metilamonio)etil]-7-hidroxi-4-metilcumarina):

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Más particularmente, el compuesto II es el producto de reacción de la reacción de CYP2D que usa el sustrato AMMC (compuesto Ia).

Las sales de los compuestos de fórmula I se incluyen también dentro de los compuestos de la invención.

Según aun otro aspecto de la invención, se proporciona una composición que comprende un compuesto de fórmula I. El compuesto está presente en la composición a una concentración mayor que al menos el 50% en peso, y, más preferiblemente está presente en la composición a una concentración mayor que al menos el 75% en peso. Las composiciones más preferidas contienen una concentración del compuesto de fórmula I que es al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 90%, y lo más preferiblemente al menos el 95% en peso.

Las composiciones se pueden contener en viales, que son componentes de un equipo para ensayar la actividad enzimática de CYP2D. Los viales pueden contener cantidades preseleccionadas de las composiciones para facilitar la disolución del contenido, para conseguir una concentración preseleccionada del compuesto para realizar un ensayo enzimático de CYP2D. Por consiguiente, en ciertas realizaciones de la invención, las composiciones contienen los tampones apropiados para realizar una reacción enzimática en la que el compuesto de fórmula I sirve como sustrato para formar un producto fluorescente.

Según aun otro aspecto de la invención, se proporciona un método para ensayar la actividad enzimática de CYP2D. El método implica poner en contacto una enzima CYP2D con un compuesto de fórmula I. El método para ensayar la actividad enzimática de CYP2D se usa para detectar la actividad de un CYP2D que puede estar contenido en una muestra de líquido biológico o muestra sólida (p.ej., una muestra de biopsia de hígado, cerebro o intestino) o que se puede expresar en un sistema que contiene células o en un sistema sin células (p.ej., un microsoma que contiene CYP2D expresado de cADN). De esta manera, se pueden detectar enfermedades asociadas a deficiencias o sobreexpresión de la actividad enzimática de CYP2D.

Según aun otro aspecto de la invención, se proporciona un método de cribado para identificar agentes que inhiben la actividad enzimática de CYP2D. El método implica poner en contacto una enzima CYP2D con un compuesto de fórmula I en presencia de un inhibidor enzimático putativo de CYP2D, e identificar un agente que inhibe la actividad enzimática de CYP2D como inhibidor enzimático de CYP2D. En las realizaciones preferidas, el método de cribado es un ensayo de cribado de alto rendimiento. Más preferiblemente, el ensayo de cribado se realiza en una placa multipocillo (p.ej., microtitulación) o en un envase para contener un volumen relativamente pequeño, p.ej., el compuesto de fórmula I se pone en contacto con el inhibidor enzimático putativo de CYP2D y la enzima CYP2D en un pocillo de placa de microtitulación o en un vial pequeño. En ciertas realizaciones, los compuestos de fórmula I se pueden proporcionar en el pocillo de placa de microtitulación o en el vial pequeño. Por ejemplo, los compuestos de fórmula I se pueden distribuir en uno o más viales, que se liofilizan después o se secan de otra manera, para proporcionar un producto que tiene una duración de almacenado incrementada. Si el producto se proporciona para uso en un equipo para medir la actividad enzimática de CYP2D, el equipo puede contener además instrucciones para redisolver el compuesto de fórmula I y, opcionalmente, un tampón apropiado (p.ej., tampón de reacción enzimática) para efectuar la disolución.

Según otro aspecto de la invención, se proporciona un método para visualizar una enzima CYP2D. El método implica poner en contacto una muestra que contiene enzima CYP2D con un compuesto de fórmula I, y someter a la enzima CYP2D y al compuesto a condiciones en las que la enzima CYP2D cataliza la conversión del compuesto de fórmula I a un producto fluorescente. En las realizaciones preferidas, el método para visualizar una enzima CYP2D se realiza en una muestra de sección de tejido, es decir, la muestra que contiene enzima CYP2D es una sección de tejido tal como la derivada de una muestra de biopsia.

Según aun otro aspecto de la invención, se proporcionan equipos para detectar y/o medir la actividad enzimática de CYP2D. Los equipos contienen un compuesto de fórmula I e instrucciones para usar los equipos para medir la actividad enzimática de CYP2D. Los compuestos preferidos de fórmula I son compuestos que tienen una alta especificidad de unión para la enzima, y por los cuales la enzima exhibe una velocidad alta de transformación de sustrato. Estos parámetros se reflejan típicamente en los valores de Km y Vmax para la conversión catalizada por la enzima del sustrato (es decir, el compuesto de la invención) a un producto fluorescente. En general, una afinidad relativa mayor de la enzima CYP2D por un primer sustrato comparado con un segundo sustrato está indicada por un valor de Km menor para el primer sustrato comparado con el segundo sustrato. Un número de recambio catalítico mayor para un primer sustrato comparado con un segundo sustrato está indicado por una Vmax mayor para el primer sustrato. Los compuestos preferidos de la invención tienen una Km mayor de alrededor de 50 nM, con una Vmax mayor de alrededor de 0,05 min^{-1}. En general, los compuestos de la invención tienen una Km de alrededor de 1 a alrededor de 100 mM, y una Vmax de alrededor de 0,05 a alrededor de 20 min^{-1}, con un intervalo preferido de Km que es mayor de alrededor de 50 nM, y un intervalo preferido de Vmax que es de alrededor de 0,2 a alrededor de 20 min^{-1}.

Según aun otro aspecto de la invención, se proporcionan productos fluorescentes nuevos. Los productos fluorescentes se producen como un producto de reacción de la reacción catalizada por CYP2D de un sustrato que es un compuesto de fórmula I. En general, estos compuestos (los compuestos de fórmula II) tienen estructuras que difieren de las de los compuestos de fórmula I en que tienen un grupo hidroxilo en posición 7 del anillo de cumarina.

Procedimientos generales de síntesis

Procedimiento general 1

Se convierte un compuesto de fórmula II o un reactivo disponible comercialmente en un compuesto de fórmula I, que es una amina cuaternaria, mediante tratamiento con un reactivo A y una base, tal como carbonato potásico, en un disolvente apropiado, tal como tetrahidrofurano, acetona, dimetilsulfóxido, acetonitrilo o dimetilformamida a temperaturas que oscilan de 0ºC a 75ºC. Un compuesto preferido para realizar esta reacción es el compuesto IIa (nº de registro 15776-59-7, nombre: hidrocloruro de 3-[2-(dietilamino) etil]-7-hidroxi-4-metilcumarina), disponible comercialmente (Aldrich Chem. Co., Milwaulkee, WI), para producir un compuesto preferido de fórmula I, el compuesto Ia (AMMC).

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en la que R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, m y n se definen como anteriormente; en la que A es un reactivo alquilante de alcoholes tal como yodometano, yodoetano, bromuro de bencilo, diazometano o (trimetilsilil)diazometano.

Procedimiento general 2

El compuesto 1, o un reactivo disponible comercialmente, se convierte en el compuesto 3 mediante reacción con malonato de dialquilo, compuesto 2, en un disolvente apropiado tal como tetrahidrofurano, éter dietílico o dimetilformamida, a temperaturas que oscilan de 0ºC a 100ºC. En las reacciones siguientes, cada uno de los intermedios se purifica opcionalmente por medio de los métodos de purificación descritos en los ejemplos específicos.

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en la que R2, R6, R7 y n se definen como anteriormente; en la que Lg es un grupo saliente tal como un haluro o tosilato; en la que M es un metal monovalente tal como sodio, litio o potasio.

El compuesto 3 se convierte a compuesto 4 mediante desesterificación con B, descarboxilación con C y esterificación con D, en un disolvente apropiado tal como agua, a temperaturas que oscilan de 0ºC a 100ºC.

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en la que R2, R6, R7 y n se definen como anteriormente; en la que B es una base tal como hidróxido sódico o hidróxido de litio; en la que C es un ácido tal como ácido clorhídrico; en la que D es un alcohol tal como metanol o etanol.

El compuesto 4 se convierte en compuesto 6 por medio del procedimiento descrito en Linderman y Graves J. Org. Chem., 54, 661-668, (1989). El compuesto 4 se convierte en su enolato respectivo con E en un disolvente apropiado, tal como tetrahidrofurano a -78ºC, y después se acila mediante la adición de compuesto 5 para formar compuesto 6 a temperaturas que oscilan en 0-75ºC.

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en la que R2, R4, R5, R6, R7 y n se definen como anteriormente; en la que E es una base tal como diisopropilamina de litio (LDA).

El compuesto 6 se convierte en un compuesto de Fórmula I mediante tratamiento con compuesto 7 y un ácido, tal como ácido trifluoroacético, por medio del procedimiento descrito en Bayer et al., J. Fluorine Chem., 20, 187-202, (1982) a temperaturas que oscilan en 0-200ºC.

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en la que R1, R2, R3, R4, R6, R7 y n se definen como anteriormente.

Procedimiento general 3

El compuesto 8, un compuesto disponible comercialmente o sintetizado usando el procedimiento general 2, se convierte en compuesto 10 mediante tratamiento con compuesto 9, sin disolvente o con un disolvente apropiado tal como acetona, tetrahidrofurano o dimetilformamida a temperaturas que oscilan en 0-100ºC.

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en la que R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, X^{-} y n se definen como anteriormente; en la que R8 es un hidruro, alquilo, cicloalquilo o arilo; en la que X es un haluro. Si R8 es hidruro, el compuesto 10 es de fórmula II. Si R8 es un alquilo, cicloalquilo o arilo, el compuesto 10 es de fórmula I.

Procedimiento general 5

El compuesto 6, un compuesto disponible comercialmente o sintetizado usando el procedimiento general 2, se convierte en compuestos de fórmula II mediante tratamiento con compuesto 11 y un ácido tal como ácido trifluoroacético, por medio del procedimiento descrito en Bayer et al., J. Fluorine Chem., 20, 187-202, (1982) a temperaturas que oscilan en 0-200ºC.

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en la que R1, R2, R3, R4, R6, R7 y n se definen como anteriormente.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos son descripciones detalladas de los métodos de preparación de los compuestos de fórmula I y fórmula II. Estas preparaciones detalladas entran dentro del alcance de, y sirven para ejemplificar, los procedimientos generales anteriormente descritos, que forman parte de la invención. Estos ejemplos se presentan solamente con propósito ilustrativo, y no pretenden limitar el alcance de la invención. La Tabla I es una lista de ejemplos específicos dentro de las fórmulas I y II.

Ejemplo 1 Preparación de 3-[2-(N,N-dietil-N-metilamonio)etil]-7-metoxi-4-metilcumarina (compuesto Ia)

A una disolución de hidrocloruro de 3-[2-(dietilamino)etil]-7-hidroxi-4-metilcumarina (0,5 g) en acetona (200 ml) se le añadió carbonato potásico (5 g) y yodometano (2,25 g). Tras agitación a temperatura ambiente durante 24 horas, se secó la mezcla con sulfato sódico anhidro, se filtró y se evaporó hasta sequedad para dar 3-[2-(N,N-dietil-N-metilamonio)etil]-7-metoxi-4-metilcumarina (Ia) en forma de polvo blanco. ^{1}H-RMN (CD_{3}OD) d 7,75 (d, 1H, ArH), 7,10-6,91 (m, 1H, ArH), 6,92-6,90 (m, 1H, ArH), 3,89 (s, 3H,OCH_{3}), 3, 52-3,42 (m, 2H, NCH_{2}), 3,34-3,30 (m, 2H, ArCH_{2}), 3,12-3,05 (m, 5H, NCH_{2}, NCH_{3}), 2,52 (s, 3H, ArCH_{3}), 1,46-1,41 (m, 6H, CH_{2}CH_{3}) p.f. 245-246,5ºC. Anal. calc. para C_{18}H_{26}INO_{3}: C, 49,71; H, 6,12; I, 29,18; N, 3,22. Hallado: C, 49,37; H, 6,11; I, 29,21; N, 3,24.

Ejemplo 2 Preparación de 3-[2-(dietilamino)etil]-7-metoxi-4-trifluorometilcumarina (compuesto Ic)

A una disolución agitada de malonato de dietilo (110,8 g, 0,691 moles) en tetrahidrofurano (400 ml) se le añadió sodio (15,9 g, 0,691 moles), y la disolución resultante se hirvió durante la noche. Después, se añadió a esta disolución a 50-60ºC cloruro de 2-dietilaminoetilo en éter etílico (100 ml), después de completar la adición se incrementó la temperatura y se hirvió la disolución durante 5 h. Después la mezcla de reacción se enfrió en atmósfera de nitrógeno, se echó en hielo y se extrajo con éter dietílico, y después se secó con sulfato sódico anhidro. La evaporación del disolvente a presión reducida dio el residuo bruto, que se sometió a cromatografía en gel de sílice (50% éter etílico en hexanos con 2% de metanol y 2% de hidróxido amónico) y dio (2-carboxietil-4-dietilamino)butirato de etilo (aceite amarillo, 128,2 g, 75%).

Se hidrolizó (2-carboxietil-4-dietilamino)butirato de etilo (128,2 g, 0,495 moles) en tetrahidrofurano (600 ml) y metanol (200 ml) con hidróxido de litio (45,7 g, 1,09 moles) en agua (200 ml), agitando a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno durante la noche. Se eliminaron los disolventes y se acidificó el residuo con 290 ml de ácido clorhídrico 6 M (hasta pH = 1-2), y se hirvió durante la noche. Se enfrió la mezcla de reacción. Después se añadió metanol (3 L) y ácido clorhídrico concentrado (30 ml), y la disolución resultante se hirvió durante la noche. Se eliminó el metanol y se enfrió y neutralizó el residuo hasta pH\sim9 con hidróxido amónico concentrado. Se extrajo el producto con cloruro de metileno, y se secó con sulfato sódico anhidro. La concentración a presión reducida dio (4-dietilamino)butirato de metilo (aceite amarillo, 45,7 g, 53%).

Se ajustó un matraz de 4 bocas con un agitador mecánico y dos embudos de adición. Se añadió a este matraz diisopropilamina (43,87 g, 0,433 moles) en tetrahidrofurano (500 ml) en atmósfera de nitrógeno. Después se enfrió la disolución a -78ºC, y se le añadió n-butillitio 2,5 M en hexanos (173,5 ml, 0,433 moles). Después se agitó la disolución resultante a -78ºC durante 30 min. Después se añadió metil-4-dietilaminobutirato en tetrahidrofurano (300 ml), y se agitó la disolución resultante a -78ºC durante 2 h. Después se añadió acetato de trifluoroetilo (82,13 g, 0,578 moles) en tetrahidrofurano (200 ml). Después se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se enfrió a 0ºC y se paró con agua (50 ml). Después se agitó la disolución durante 30 min, y se concentró al vacío. El residuo se diluyó con cloruro de metileno, se lavó con agua, salmuera, y se secó con sulfato sódico anhidro. La evaporación de los disolventes a presión reducida dio (2-trifluoroaceto-4-dietilamino)butirato de metilo en forma de un semisólido marrón (60,4 g, 78%).

A una disolución agitada y enfriada (0ºC) de (2-trifluoroaceto-4-dietilamino)butirato de metilo (32,33 g, 0,12 moles) y metil resorcinol (14,92 g, 0,12 moles) se le añadió ácido trifluoroacético (60 ml), y la disolución resultante se hirvió durante 3 días. La mezcla de reacción se enfrió, se neutralizó con hidróxido amónico (pH 9,5-10), y se extrajo con acetato de etilo. Después se lavó la fase orgánica con agua, salmuera, y después se secó con sulfato sódico anhidro. La evaporación del disolvente a presión reducida dio el sólido bruto, que se sometió a cromatografía en gel de sílice (40% acetato de etilo/hexano \rightarrow 80% acetato de etilo/hexano) y dio 3-[2-(dietilamino)etil]-7-metoxi-4-trifluorometilcumarina (compuesto Ic) en forma de sólido blanco 3,3 g [Rf\sim0,3 (70% acetato de etilo/hexano), 7,9%] ^{1}H-RMN (CDCl_{3}) d 7,70-7,64 (m, 1H, ArH), 6,90-6,83 (m, 2H, ArH), 3,88 (s, 3H, OCH_{3}), 3,05-2,96 (m, 2H, ArCH_{2}), 2,73-2,55 (m, 6H, NCH_{2}), 1,10-1,04 (m, 6H, NCH_{2}CH_{3}), p.f. 75-76,5ºC. Anal. calc. para C_{17}H_{20}F_{3}NO_{3}: C, 59,77; H, 6,0; N, 4,03. Hallado: C, 60,20; H, 5,96; N, 3,74.

Ejemplo 3 Preparación de yoduro de 3-[2-(N,N-dietil-N-metilamonio)etil]-7-metoxi-4-trifluorometilcumarina (compuesto Ib)

Se agitó 3-[2-(dietilamino)etil]-7-metoxi-4-trifluorometilcumarina (compuesto Ic) (100 mg, 0,29 mmoles) en yoduro de metilo (1 ml) en un vial de reacción cerrado durante 4 h. Después se filtró el sólido blanco, se lavó con acetato de etilo y pentano, y dio 120 mg (85%) de yoduro de 3-[2-(N,N-dietil-N-metilamonio)etil]-7-metoxi-4-trifluorometilcumarina (compuesto Ib). ^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}) d 7,70-7,67 (m, 1H, ArH), 7,18-7,17 (m, 1H, ArH), 7,10-7,00 (m, 1H, ArH), 3,92 (s, 3H, OCH_{3}), 3,45-3,39 (m, 4H, NCH_{2}), 3,34-3,27 (m, 2H, NCH_{2}), 3,18-3,09 (m, 2H, ArCH_{2}), 3,03 (s, 3H, NCH_{3}), 1,28-1,25 (m, 6H, NCH_{2}CH_{3}). p.f. 214ºC. Anal. calc. para C_{18}H_{23}F_{3}INO_{3}: C, 44,55; H, 4,78; N, 2,89. Hallado: C, 44,49; H, 4,79; N, 2,80.

Ejemplo 4 Preparación de 3-[2-(dietilamino)etil]-7-hidroxi-4-trifluorometilcumarina (compuesto IIc)

A una disolución agitada y enfriada (0ºC) de (2-trifluoroaceto-4-dietilamino)butirato de metilo (10,9 g, 0,04 moles) y resorcinol (4,46 g, 0,04 moles) se le añadió ácido trifluoroacético (33,5 ml), y la disolución resultante se hirvió durante 3 días. La mezcla de reacción se enfrió, se neutralizó con hidróxido amónico (pH 8-9), y se extrajo con acetato de etilo. Después se lavó la fase orgánica con agua, salmuera, y se secó con sulfato sódico anhidro. La evaporación del disolvente a presión reducida dio el residuo bruto, que se sometió a cromatografía en gel de sílice (40-70% acetato de etilo/hexano), que dio el producto 3-[2-(dietilamino)etil]-7-hidroxi-4-trifluorometilcumarina (compuesto IIc) en forma de un sólido amarillo (1,15 g, 8,6%). Rf\sim0,3 (70% EtOAc/hexano), ^{1}H-RMN (acetona-d_{6}) d 7,65-7,62 (m, 1H, ArH), 6,94-6,90 (m, 1H, ArH), 6,81-6,80 (m, 1H, ArH), 2,96-2,93 (m, 2H, ArCH_{2}), 2,69-2,61 (m, 2H, NCH_{2}), 2,58-2,51 (m, 4H, NCH_{2}), 1,02-0,97 (m, 6H, NCH_{2}CH_{3}). p.f. 122-123ºC. Anal. calc. para C_{16}H_{18}F_{3}NO_{3}: C, 58,36; H, 5,51; N, 4,25. Hallado: C, 58,49; H, 5,62; N, 4,13.

Ejemplo 5 Preparación de yoduro de 3-[2-(N,N-dietil-N-metilamonio)etil]-7-hidroxi-4-trifluorometilcumarina (compuesto IIb)

A una disolución agitada de 3-[2-(dietilamino) etil]-7-hidroxi-4-trifluorometilcumarina (compuesto IIc) (60 mg, 0,18 mmoles) en acetona (0,3 ml) se le añadió yoduro de metilo (0,5 ml), y se agitó la disolución resultante durante 5 min. El sólido blanco que se formó se filtró y se lavó con acetona y pentano. De esta manera se aisló el producto yoduro de 3-[2-(N,N-dietil-N-metilamonio)etil]-7-hidroxi-4-trifluorometilcumarina (compuesto IIb) en forma de sólido blanco (47 mg, 53,5%). ^{1}H-RMN (DMSO-d_{6}) d 7,64-7,60 (m, 1H, ArH), 6,99-6,90 (m, 1H, ArH), 6,84-6,83 (m, 1H, ArH), 3,45-3,39 (m, 4H, NCH_{2}), 3,34-3,25 (m, 2H, NCH_{2}), 3,14-3,05 (m, 2H, ArCH_{2}), 3,02 (s, 3H, NCH_{3}), 1,30-1,25 (m, 6H, NCH_{2}CH_{3}). p.f. 220-221ºC. Anal. calc. para C_{17}H_{21}F_{3}INO_{3}, 0,6 H_{2}O: C, 42,36; H, 4,64; N, 2,91. I, 26,32. Hallado: C, 41,98; H, 4,84; N, 2,85; I, 26,30.

TABLA I

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Evaluación biológica

La evaluación de los compuestos de fórmula I para utilidad como sustratos de CYP2D incluye: (1) La cinética enzimática para los compuestos de fórmula I se realizó usando CYP2D expresada de cADN; (2) La especificidad de los compuestos de fórmula I como sustratos para CYP2D se examinó usando un panel de enzimas P450 humanas expresadas de cADN; (3) La especificidad de los compuestos de fórmula I como sustratos para CYP2D se examinó en microsomas de hígado humano; y (4) Los valores de CI_{50} para inhibidores conocidos de CYP2D6, medidos en un ensayo de cribado de alto rendimiento, de compuestos de fórmula I se correlacionaron con los valores de sustratos conocidos útiles para esta solicitud.

(1) Cinética enzimática con CYP2D6 expresado de cADN

La evaluación de los compuestos de fórmula I se realizó inicialmente midiendo la cinética de la transformación usando CYP2D6 expresado de cADN. Los valores de Vmax y Km son importantes para la optimización de las condiciones de ensayo y para ajustar los parámetros para los experimentos de inhibición. Los ensayos fluorimétricos para la transformación de compuestos de fórmula I mediante CYP2D6 se realizaron basándose en una modificación del método de Crespi et al. Anal. Biochem. 248, 188-190, (1997), (descrito más adelante). Las comparaciones de la cinética enzimática (Tabla II) para los compuestos de fórmula I y el sustrato, 3-ciano-7-etoxicumarina (CEC), muestran que CYP2D6 tiene una afinidad mayor por los compuestos de fórmula I (menor Km) y un número de recambio catalítico mayor para los compuestos de fórmula I (mayor Vmax). Dentro de la serie Ia-Ic, el compuesto Ia tiene el número de recambio catalítico mayor, y por lo tanto es el sustrato más útil. Sin embargo, los compuestos Ib y Ic contienen el grupo 4-trifluorometilo (R4), que desplaza las propiedades fluorescentes de estas moléculas a longitudes de onda mayores. En caso de que un inhibidor putativo tenga propiedades fluorescentes competitivas con el compuesto Ia, los compuestos Ib y Ic son sustratos de CYP2D útiles a pesar de su número de recambio catalítico menor, comparado con el compuesto Ia.

TABLA II

Compuesto #	K_{m} (\muM)	V_{max} (min^{-1})
CEC	67	0,017
Ia	1,1	1,0
Ib	0,8	0,16
Ic	3,3	0,2

Compuesto ejemplo Ia. Los ensayos se llevaron a cabo en placas de microtitulación de 96 pocillos (Corning COSTAR, nº cat. 3915). El sustrato, compuesto Ia, se preparó en tampón de fosfato potásico a pH 7,4 (0,1 M). Tras la adición de sustrato, se precalentaron las placas a 37ºC. Se iniciaron las incubaciones mediante la adición de enzima y cofactores precalentados. Las enzimas estaban disponibles comercialmente, CYP2D6 humano expresado en baculovirus/células de insecto (SUPERSOMES®, GENTEST Corporation). La cantidad de enzima añadida por pocillo fue 1,5 pmoles. Las concentraciones finales de cofactor fueron NADP 0,0082 mM, glucosa-6-fosfato 0,41 mM y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa 0,2 U/ml. El volumen final de incubación fue 0,2 ml. Las incubaciones se llevaron a cabo durante 45 minutos, y se detuvieron mediante la adición de 0,075 ml de 80% de acetonitrilo, 20% de Tris base. La fluorescencia por pocillo se midió usando un BMG FLUOstar Model 403 controlado con un ordenador compatible con IBM. Se midió el metabolito usando una longitud de onda de excitación de 390 nm y una longitud de onda de emisión de 460 nm. Los datos se exportaron y analizaron usando una hoja de cálculo de Excel. Se cuantificó la actividad comparando con una curva patrón de hidrocloruro de 3-[2-(N, N-dietilamino)etil]-7-hidroxi-4-metilcumarina. Se calcularon los valores aparentes de Km y Vmax mediante cinética no lineal, usando soporte lógico SigmaPlot 4.0.

Compuestos ejemplo Ib y Ic. El siguiente procedimiento se aplica a los compuestos Ib y Ic como sustratos. Los ensayos se llevaron a cabo en placas de microtitulación de 96 pocillos (Corning COSTAR, nº cat. 3915). Los sustratos, Ib y Ic, se prepararon en acetonitrilo. Tras la adición de cofactores se precalentaron las placas a 37ºC. Se iniciaron las incubaciones mediante la adición de enzima y sustrato precalentados. Las enzimas estaban disponibles comercialmente, CYP2D6 humano expresado en baculovirus/células de insecto (SUPERSOMES®, GENTEST Corporation). La cantidad de enzima añadida por pocillo fue 5-10 pmoles. Las concentraciones finales de cofactor fueron NADP 1,3 mM, glucosa-6-fosfato 3,3 mM, MgCl_{2} 3,3 mM y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa 0,4 U/ml. El volumen final de incubación fue 0,2 ml. Las incubaciones se llevaron a cabo durante 45 minutos, y se detuvieron mediante la adición de 0,075 ml de 80% de acetonitrilo, 20% de Tris base 0,5 M. Se midió la fluorescencia por pocillo usando un escáner de placas BMG FLUOstar Model 403 controlado con un ordenador compatible con IBM. Se midió el metabolito usando una longitud de onda de excitación de 410 nm y una longitud de onda de emisión de 538 nm. Los datos se exportaron y analizaron usando una hoja de cálculo de Excel. Se cuantificó la actividad enzimática comparando con una curva patrón de yoduro de 3-[2-(N,N-dietil-N-metilamonio)etil]-7-hidroxi-4-trifluorometilcumarina (compuesto IIb) al ensayar el metabolismo de Ib, o 3-[2-(dietilamino)etil]-7-hidroxi-4-trifluorometilcumarina (compuesto IIc) al ensayar el metabolismo de Ic. Se calcularon los valores aparentes de Km y Vmax mediante cinética no lineal, usando soporte lógico SigmaPlot 4.0.

(2) Selectividad en un panel de enzimas P450 expresadas de cADN

Se examinó la selectividad de diversas isoformas de P450 para la desalquilación de los compuestos Ia, Ib y Ic usando un panel de enzimas humanas expresadas de cADN disponibles comercialmente. Un sustrato que es selectivo para una única isoforma de P450 (el sustrato es transformado catalíticamente por una única isoforma de P450) es una característica deseable, ya que su actividad se puede examinar dentro de una mezcla heterogénea de enzimas, por ejemplo en microsomas de hígado humano. El sustrato de cribado de alto rendimiento publicado previamente, 3-ciano-7-etoxicumarina (CEC) es metabolizado significativamente por otros citocromos P450 humanos (Crespi et al. Anal. Biochem. 248, 188-190, (1997). La comparación de la selectividad catalítica para los compuestos de fórmula I se muestra en las figuras 1, 2 y 3. El compuesto Ia es selectivo para CYP2D6, mientras los compuestos Ib y Ic son también sustratos para otras enzimas P450 humanas. El compuesto Ia es, por lo tanto, un sustrato más útil para sondear la actividad de CYP2D en una mezcla heterogénea que los compuestos Ib, Ic y el sustrato previo CEC.

Compuestos ejemplo Ia, Ib y Ic. Los compuestos Ia, Ib y Ic se incubaron como se describió en los ejemplos (1) anteriores, excepto que la fuente de enzima consistió en una de varias enzimas P450 de citocromo humano expresadas en baculovirus/células de insecto (SUPERSOMES®, GENTEST Corporation) disponibles comercialmente.

(3) Microsomas de hígado humano

Los microsomas de hígado humano (HLM) contienen varios citocromos P450 metabolizadores de fármacos (xenobióticos). Cuando se usan HLM como fuente de enzima, es crítico que la biotransformación sonda sea catalizada específicamente por la enzima de interés. Si múltiples enzimas contribuyen significativamente a la biotransformación sonda, la interpretación de datos es imposible. Se examinó la especificidad de CYP2D6 de sustratos de compuesto I usando HLM y quinidina, bien caracterizada, muy potente e inhibidora específica de CYP2D6. Se descubrió que el metabolismo medible del compuesto I es debido exclusivamente a CYP2D6. En consecuencia, en contraste con el sustrato de cribado de alto rendimiento publicado previamente, 3-ciano-7-etoxicumarina (CEC), que también es metabolizado significativamente por otros citocromos P450 humanos (Crespi et al. Anal Biochem. 248, 188-190, (1997)), el compuesto I es un sustrato específico de CYP2D6.

Compuesto ejemplo I. Se incubó a 37ºC durante 5, 10 y 15 minutos una reacción de 1,0 ml que contenía 1,0 mg/ml de microsomas de hígado humano que contenían CYP2D6 (donante H023, GENTEST Corporation), NADP+ 0,0082 mM, glucosa-6-fosfato 3,3 mM, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa 0,4 U/ml, cloruro de magnesio 3,3 mM y compuesto I 5,0 \muM en fosfato potásico 100 mM (pH 7,4), en presencia y ausencia de quinidina 5 \muM. Tras la incubación, se añadieron 100 \mul de la reacción a 1,9 ml de Tris 100 mM (pH 9), y se determinó la fluorescencia con excitación a 390 nm y emisión a 460 nm en un espectrofluorímetro. Se cuantificó la actividad comparando con una curva patrón de hidrocloruro de 3-[2-(dietilamino)etil]-7-hidroxi-4-metilcumarina (Tabla III):

Tiempo (min)	pmoles de	pmoles de producto
	producto	con quinidina
0	0	0
5	3,3	0
10	6,3	0
15	8,5	-0,7

(4) Cribado de inhibición de CYP2D6 de alto rendimiento

El potencial para medir el potencial de inhibición de CYP2D6 de compuestos de fórmula I se basaba en una modificación del método publicado por Crespi et al. Anal Biochem. 248, 188-190, (1997). Este estudio publicado examinó la CI_{50} para el potente inhibidor de CYP2D6, quinidina, usando CEC como sustrato. Se vio una buena concordancia con la cinética de inhibición publicada para la quinidina y los microsomas de hígado humano (Zanger et al., Biochemistry, 27, 5447-5454, (1988)). Se examinó una serie de inhibidores selectivos de CYP2D6 con este sistema, usando CEC o compuestos de fórmula I como sustrato. Se halló que los valores de CI_{50} se correlacionaban en gran medida entre CEC y los compuestos Ia y Ib, ilustrando la utilidad de estos compuestos como sustratos para la inhibición de CYP2D6.

Compuesto ejemplo I. Los ensayos se llevaron a cabo en placas de microtitulación de 96 pocillos. Los sustratos, compuestos de fórmula I, se prepararon en tampón de fosfato potásico de pH 7,4 o acetonitrilo. Las concentraciones de reserva de sustrato fueron el doble de la concentración final (concentración final elegida para ser aproximadamente la Km aparente, por ejemplo 2 \muM para el compuesto I). Se usaron los 12 pocillos de una fila para una prueba. Los pocillos 1 a 8 contuvieron diluciones 1:3 en serie de los inhibidores. Los pocillos 9 y 10 no contuvieron inhibidor, y las filas 11 y 12 fueron blancos para la fluorescencia de fondo (disolución de parada añadida antes que la enzima). Tras la adición de sustrato e inhibidor, se precalentaron las placas a 37ºC. Se iniciaron las incubaciones mediante la adición de enzima y cofactores precalentados. Las enzimas estaban disponibles comercialmente, CYP2D6 humano expresado en baculovirus/células de insecto (SUPERSOMES®, nº cat. P217, GENTEST Corporation). La cantidad de enzima añadida por pocillo fue 1,5 a 10 pmoles. Las concentraciones finales de cofactores fueron NADP 8,2 \muM, glucosa-6-fosfato 3,3 mM y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa 0,4 U/ml para el compuesto Ia, o NADP 1,3 mM, glucosa-6-fosfato 3,3 mM, MgCl_{2} 3,3 mM y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa 0,4 U/ml para los compuestos Ib y Ic. El volumen final de incubación fue 0,2 ml. Las incubaciones se llevaron a cabo durante 45 minutos, y se detuvieron mediante la adición de 0,075 ml de 80% de acetonitrilo, 20% de Tris 0,1 M a pH 9. Se midió la fluorescencia por pocillo usando un escáner de placas BMG FLUOstar Model 403 controlado con un ordenador compatible con IBM. Se midió el metabolito usando una longitud de onda de excitación de 390 nm y una longitud de onda de emisión de 460 nm (compuesto Ia), o una longitud de onda de excitación de 410 nm y una longitud de onda de emisión de 538 nm (compuestos Ib y Ic). Los datos se exportaron y se analizaron usando una hoja de Excel. Se calcularon los valores de CI_{50} mediante interpolación lineal (tablas IV y V):

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TABLA IV Compuestos inhibidores de prueba

19

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TABLA V Sustratos de HTS de CYP2D6: Valores de CI_{50} (\muM)

20

Lo precedente es meramente una descripción detallada de ciertas realizaciones preferidas. Por lo tanto, debería ser aparente para los expertos en la técnica que se pueden hacer diversas modificaciones y equivalentes, sin apartarse del espíritu o alcance de la invención.

Claims

1. Un compuesto de fórmula I:

21

(f): en la que R6 es un alquilo;

(g): en la que R7 es un alquilo;

(i): en la que m es 1; y

(j): en la que X^{-} es un contraión cargado negativamente.

2. Un compuesto según la reivindicación 1, en el que R1 es un haluro.

3. Un compuesto según la reivindicación 1, en el que R1 es un hidruro.

4. Un compuesto según la reivindicación 1, en el que R2 es un alquilo.

5. Un compuesto según la reivindicación 4, en el que el alquilo es un alquilo insaturado.

6. Un compuesto según la reivindicación 5, en el que el alquilo insaturado se elige del grupo que consiste en etilo, propilo, butilo, pentilo y bencilo.

7. Un compuesto según la reivindicación 1, en el que R3 es un haluro.

8. Un compuesto según la reivindicación 1, en el que R3 es un hidruro.

9. Un compuesto según la reivindicación 1, en el que R4 se selecciona del grupo que consiste en un hidruro, un nitrilo y un alquilo.

10. Un compuesto según la reivindicación 9, en el que el alquilo se selecciona del grupo que consiste en metilo, etilo y CF_{3}.

11. Un compuesto según la reivindicación 1, en el que R4 es un hidruro.

12. Un compuesto según la reivindicación 1, en el que R5 se selecciona del grupo que consiste en un hidruro y un alquilo.

13. Un compuesto según la reivindicación 12, en el que el alquilo se selecciona del grupo que consiste en metilo y etilo.

14. Un compuesto según la reivindicación 1, en el que R5 es un hidruro.

15. Un compuesto según la reivindicación 1, en el que R6 se selecciona del grupo que consiste en metilo, etilo y propilo.

16. Un compuesto según la reivindicación 1, en el que R7 se selecciona del grupo que consiste en metilo, etilo y propilo.

17. Un compuesto según la reivindicación 1, en el que n es 2.

18. Un compuesto según la reivindicación 1, en el que X^{-} es un haluro.

19. Un compuesto según la reivindicación 1, en el que X^{-} es una base orgánica.

20. Un compuesto según la reivindicación 19, en el que X^{-} se selecciona del grupo que consiste en formiato, acetato, maleato y succinato.

21. Un compuesto según la reivindicación 1, en el que el compuesto tiene una Km mayor de 50 nM y una Vmax mayor de 0,05 min^{-1} para la reacción catalizada por CYP2D.

22. Un compuesto según la reivindicación 1, en el que el compuesto se selecciona del grupo que consiste en compuestos en los cuales:

R1 y R3 son flúor;

R2 es metilo, etilo o bencilo; y

R4 es trifluorometilo o nitrilo.

23. Un compuesto según la reivindicación 1, en el que el compuesto es 3-[2-(N,N-dietil-N-metilamonio)etil]-7-metoxi-4-metilcumarina (AMMC, C_{18}H_{26}NO_{3}).

24. 3-[2-(dietilamino)etil]-7-metoxi-4-metilcumarina (AMC, C_{17}H_{23}NO_{3}).

25. Una composición que comprende un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-24, en la que el compuesto está presente en la composición a una concentración mayor que al menos 50%, 75%, 80%, 90% o 95% en peso.

26. Un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 2, 7 ó 18, en el que el haluro se selecciona del grupo de consiste en F, Cl, Br y I.

27. Un método para ensayar la actividad de CYP2D que comprende:

poner en contacto una enzima CYP2D con un compuesto de fórmula I:

22

(f): en la que R6 es un alquilo;

(g): en la que R7 es un alquilo;

(i): en la que m se selecciona del grupo que consiste en 0 y 1; y

(j): en la que X^{-} es un contraión cargado negativamente;

28. El método según la reivindicación 27, en el que la enzima CYP2D está contenida en una muestra biológica.

29. Un método según la reivindicación 28, en el que la muestra se selecciona del grupo que consiste en una muestra hepática tal como un homogeneizado bruto, parcialmente purificado o enzima hepática purificada, obtenida de una biopsia, CYP2D expresada de cADN, hepatocitos y microsomas.

30. Un método de cribado para seleccionar agentes que inhiben la actividad enzimática de CYP2D que comprende:

poner en contacto una enzima CYP2D con un compuesto de fórmula I:

23

(f): en la que R6 es un alquilo;

(g): en la que R7 es un alquilo;

(h): en la que n es un número entero seleccionado del grupo consiste en 0, 1, 2, 3 y 4;

(i): en la que m se selecciona del grupo que consiste en 0 y 1; y

(j): en la que X^{-} es un contraión cargado negativamente;

en presencia de un inhibidor enzimático putativo de CYP2D, y en condiciones en las que la enzima CYP2D cataliza la conversión de dicho compuesto a un producto fluorescente; y seleccionar un agente que inhibe la actividad enzimática de CYP2D como un inhibidor enzimático de CYP2D.

31. Un método según la reivindicación 30, en el que dicho compuesto se pone en contacto con el inhibidor enzimático putativo de CYP2D en un pocillo de placa multipocillo.

32. Un método para visualizar una enzima CYP2D que comprende:

poner en contacto una muestra que contiene enzima CYP2D con un compuesto de fórmula I:

24

(f): en la que R6 es un alquilo;

(g): en la que R7 es un alquilo;

(i): en la que m se selecciona del grupo que consiste en 0 y 1; y

(j): en la que X^{-} es un contraión cargado negativamente;

33. Un método según la reivindicación 32, en el que la muestra que contiene enzima CYP2D es preferiblemente una sección de tejido.

34. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 33, en el que R1 es un haluro.

35. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 33, en el que R1 es un hidruro.

36. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 33, en el que R2 es un alquilo.

37. Un método según la reivindicación 36, en el que el alquilo es un alquilo insaturado.

38. Un método según la reivindicación 37, en el que el alquilo insaturado se elige del grupo que consiste en etilo, propilo, butilo, pentilo y bencilo.

39. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 33, en el que R3 es un haluro.

40. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 33, en el que R3 es un hidruro.

41. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 33, en el que R4 se selecciona del grupo que consiste en un hidruro, un nitrilo y un alquilo.

42. Un método según la reivindicación 41, en el que el alquilo se selecciona del grupo que consiste en metilo, etilo y CF_{3}.

43. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 33, en el que R4 es un hidruro.

44. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 33, en el que R5 se selecciona del grupo que consiste en un hidruro y un alquilo.

45. Un método según la reivindicación 44, en el que el alquilo se selecciona del grupo que consiste en metilo y etilo.

46. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 33, en el que R5 es un hidruro.

47. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 33, en el que R6 se selecciona del grupo que consiste en metilo, etilo y propilo.

48. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 33, en el que R7 se selecciona del grupo que consiste en metilo, etilo y propilo.

49. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 33, en el que n es 2.

50. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 33, en el que X^{-} es un haluro.

51. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 33, en el que X^{-} es una base orgánica.

52. Un método según la reivindicación 51, en el que X^{-} se selecciona del grupo que consiste en formiato, acetato, maleato y succinato.

53. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 33, en el que el compuesto tiene una Km mayor de 50 nM y una Vmax mayor de 0,05 min^{-1} para la reacción catalizada por CYP2D.

54. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 33, en el que el compuesto se selecciona del grupo que consiste en compuestos en los que:

R1 y R3 son flúor;

R2 es metilo, etilo o bencilo; y

R4 es trifluorometilo o nitrilo.

55. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 33, en el que el compuesto es 3-[2-(N,N-dietil-N-metilamonio)etil]-7-metoxi-4-metilcumarina (AMMC, C_{18}H_{26}NO_{3}), o 3-[2-(dietilamino)etil]-7-metoxi-4-metilcumarina (AMC, C_{17}H_{23}NO_{3}).

56. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 34, 39 ó 50, en el que el haluro se selecciona del grupo que consiste en F, Cl, Br y I.

57. Un proceso para preparar un producto que comprende un compuesto de fórmula II:

25

(e): en la que R6 es un alquilo;

(f): en la que R7 es un alquilo;

(h): en la que m se selecciona del grupo que consiste en 0 y 1; y

(i): en la que X^{-} es un contraión cargado negativamente;

permitiendo reaccionar una enzima CYP2D con un sustrato que es un compuesto de fórmula I:

26

(f): en la que R6 es un alquilo;

(g): en la que R7 es un alquilo;

(i): en la que m se selecciona del grupo que consiste en 0 y 1; y

(j): en la que X^{-} es un contraión cargado negativamente;

en condiciones en las que la enzima CYP2D convierte el sustrato en un compuesto de fórmula II.

58. Un proceso según la reivindicación 56, en el que el sustrato es un compuesto que se selecciona del grupo que consiste en compuestos de fórmula I en los que:

R1 y R3 son flúor;

R2 es metilo, etilo o bencilo; y

R4 es trifluorometilo o nitrilo.

59. Un proceso según la reivindicación 56, en el que el sustrato es un compuesto que es 3-[2-(N,N-dietil-N-metilamonio)etil]-7-metoxi-4-metilcumarina (AMMC, C_{18}H_{26}NO_{3}), o 3-[2-(dietilamino)etil]-7-metoxi-4-metilcumarina (AMC, C_{17}H_{23}NO_{3}).

60. Un compuesto de fórmula II,

27

(e): en la que R6 es un alquilo;

(f): en la que R7 es un alquilo;

(h): en la que m es 1; y

(i): en la que X^{-} es un contraión cargado negativamente.