ES2312207T3 - 7-alcoxicoumarinas como sustratos de la citocromo p450. - Google Patents
7-alcoxicoumarinas como sustratos de la citocromo p450. Download PDFInfo
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Abstract
Un ensayo para evaluar los inhibidores de la enzima CYP2D6 que comprende poner en contacto la enzima y un compuesto de fórmula (I): (Ver fórmula) en la que R 1 y R 2 independientemente representan hidrógeno o metilo. R 3 es metilo y al menos uno de R 1 y R 2 representa metilo, con un compuesto de ensayo y medir la inhibición de O-desalquilación del compuesto de fórmula (1) por la enzima.
Description
7-alcoxicoumarinas como
sustratos de la citocromo P450.
Esta invención se refiere a un ensayo que
utiliza derivados de cumarina. También se describen procedimientos
su preparación y su uso como sustratos de enzima.
La mayoría de las interacciones de fármacos
basadas en metabolismo son un resultado de la inhibición de las
enzimas citocromo P450. Las interacciones de fármaco que implican
las enzimas P450 individuales se pueden predecir usando
procedimientos in vitro. Los ensayos típicos de enzima P450
in vitro implican la incubación de un sustrato apropiado
con una fuente de enzima. Tradicionalmente, se han usado
procedimientos cromatográficos que requieren tiempo largo para la
detección de metabolitos en estas incubaciones. Más recientemente la
disponibilidad de los lectores de placas fluorimétricas ha
facilitado el mayor rendimiento de los ensayos de enzima en
general. La adaptación de los ensayos de P450 a la tecnología de
lector de placas fluorescentes requiere la identificación de
sustratos con productos fluorescentes apropiados para las enzimas
individuales. Entre los citocromos P450 que metabolizan
xenobióticos, CPY2D6 es uno de los responsables comúnmente usados
para el metabolismo de fármacos.
3-Ciano-7-etoxicumarina
se ha descrito para la selección de la inhibición de CYP2D6 (Crespi
et al, Anal. Biochem., 1997, 248; 188-190).
También se han descrito otros sustratos de CYP2D6 (Koymans et
al, Chem. Res. Toxicol., 1992, 5, 211-219), sin
embargo éstos no proporcionan productos fluorescentes adecuados para
la selección de alto rendimiento.
Ahora se han identificado ciertos compuestos que
mejoran los sustratos para CYP2D6 y que son de uso para
configurar los ensayos de selección de inhibición de alto
rendimiento.
De acuerdo con la presente invención se
proporciona un ensayo para ensayar los inhibidores de la enzima
CYP2D6 que comprende poner en contacto la enzima y un compuesto
de fórmula (I):
en la que R^{1} y R^{2}
independientemente representan hidrógeno o metilo y R^{3} es
metilo, y al menos uno de R^{1} y R^{2} representa metilo, con
un compuesto de ensayo y medir la inhibición de
O-desalquilación del compuesto de fórmula (I) por
la
enzima.
Preferiblemente R^{1} es hidrógeno y R^{2}
es metilo.
En general se conocerá la velocidad de
O-desalquilación del compuesto de fórmula (I) en
ausencia del compuesto de ensayo, así como el grado de
O-desalquilación en momentos dados. El ensayo se
puede hacer para determinar la inhibición de la
O-desalquilación de manera continua o en momentos
especificados.
La O-desalquilación del
compuesto de fórmula (I) por la CYP2D6 proporciona un producto
fluorescente fácilmente cuantificable de fórmula (II):
en la que R^{1} y R^{2} son
como se definen para al fórmula (I), que se puede explorar con
longitudes de onda de excitación y emisión adecuadas por ejemplo
una longitud de onda de excitación de 409 nm y una longitud de onda
de emisión de 485
nm.
El ensayo se puede llevar a cabo o bien en
solución o utilizando un soporte sólido. Cuando el ensayo se lleva
a cabo en solución los disolventes adecuados incluyen metanol,
acetonitrilo y DMSO.
El compuesto de ensayo se puede incubar
previamente con enzima antes de la adición del sustrato, o como
alternativa el sustrato se puede añadir de manera simultánea. Las
concentraciones finales de enzima y sustrato se calculan de manera
que se logre una velocidad adecuada de procesado para llevar a cabo
el ensayo. Si se desea, la reacción se puede detener, por ejemplo
mediante la adición de ácido o disolvente. El producto se puede
analizar usando cualquier sistema convencional de detección
fluorescente, por ejemplo mediante un lector de placa de pocillos
múltiples/de placa fluorescente.
Ciertos compuestos de fórmula (I) son de
particular interés, por ejemplo un compuesto de fórmula (I), como
se ha definido anteriormente, en el que al menos uno de R^{1} y
R^{2} representa metilo.
Ciertos compuestos de fórmula (II) son de
particular interés, por ejemplo un compuesto de fórmula (II), como
se ha definido anteriormente, en la que R^{1} es metilo y R^{2}
es hidrógeno.
Los compuestos de fórmula (I) se pueden preparar
mediante procedimientos convencionales, por ejemplo como se muestra
en el esquema I:
Esquema
I
De este modo un procedimiento para la producción
de un compuesto de fórmula (I) comprende reacción de un compuesto
de fórmula (III):
en la que L es un grupo saliente
por ejemplo, Br, y R^{3} es metilo, con un compuesto de fórmula
(IV):
(IV)NHR^{1}R^{2}
en la que R^{1} y R^{2} son
como se han definido para la fórmula (I) con la condición de que al
menos uno de R^{1} y R^{2} representa
metilo.
La reacción se lleva a cabo preferiblemente en
presencia de una base, por ejemplo, carbonato de potasio.
Puesto que la inhibición de las enzimas
citocromo P450 es a menudo el mecanismo para las interacciones
fármaco/fármaco, el ensayo de acuerdo con la invención es
particularmente útil para identificar compuestos que pueden da lugar
a interacciones adversas fármaco/fármaco. Por lo tanto el ensayo se
puede usar en combinación con la modificación química de los
compuestos de ensayo para incrementar el potencial del compuesto de
ensayo para uso como un compuesto farmacéutico.
De este modo un procedimiento para reducir la
actividad inhibidora de la enzima CYP2D6 de un compuesto puede
comprender las etapas de identificar los compuestos como un
inhibidor de la CYP2D6 en el ensayo descrito anteriormente; y a
continuación producir la versión modificada químicamente del
compuesto de ensayo en el que la funcionalidad sospechosa de ser
responsable de la inhibición de CYP2D6 se cambia o elimina.
La modificación química de los compuestos de
ensayo de acuerdo con este procedimiento se puede realizar usando
las técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica.
La invención se ilustra mediante los siguientes
ejemplos.
Una solución de metilamina en tetrahidrofurano
(2M, 1,10 ml) se añadió a una mezcla enfriada de
4-bromometil-7-metoxicumarina
(0.30 g), carbonato de potasio (0,5 g) y diclorometano (10 ml). La
mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 días después se
añadió a una solución acuosa de carbonato de potasio. Se lavó la
fase orgánica con agua, se secó (MgSO_{4}) y se evaporó. El
residuo se purificó mediante cromatografía sobre gel de sílice
(eluyente 10% de metanol en diclorometano), después se cristalizó en
metanol proporcionando el compuesto del título en forma de un
sólido de color blanco (0,14 g). p. de f.
109,0-109,5ºC;
Encontrado: C, 65,64; H, 5,93; N, 6,34,
C_{12}H_{13}NO_{3} requiere C, 65,74; H, 5,98; N, 6,39%;
\delta_{H} (CDCl_{3}): 2,54 (s, 3H), 3,87 (s, 3H), 3,90 (d, J
= 1,1 Hz, 2H), 6,36 (d, J = 1,1 Hz, 1H), 6,83-6,88
(m, 2H), 7,58 (d, J = 8,2 Hz, 1H); espectro de masas m/ z 220
(MH+).
Una mezcla de clorhidrato de dimetilamina (0,18
g),
4-bromometil-7-metoxicumarina
(0,30 g), carbonato de potasio (0,5 g) y diclorometano (10 ml) se
agitó a temperatura ambiente durante 2 días. Se retiró el sólido
por filtración y se concentró el filtrado. El residuo se purificó
mediante cromatografía sobre gel de sílice (eluyente 5% de metanol
en diclorometano), después se cristalizó en metanol proporcionando
el compuesto del título en forma de un sólido de color blanco
(0.145 g).
p. de f. 97,0ºC;
\delta_{H} (CDCl_{3}): 2,31 (s, 6H), 3,50
(s, 2H), 3,87 (s, 3H), 6,31 (s, 1H), 6,82-6,87 (m,
2H), 7,76 (d, J = 8,6 Hz, 1H);
espectro de masas m/z 234 (MH+).
7-metoxi-4-(metilaminometil)cumarina
5 mM (es decir, 1,095 mg/ml en metanol) - almacenar a aprox. -20ºC
en la oscuridad 2% (p/v)
NaHCO_{3} - almacenar a aprox. 4ºC
tampón fosfato de sodio 50 mM, pH 7,4
Solución de cofactor preparada recientemente:-
aprox. lo siguiente por ml de 2% (p/v) de NaHCO_{3}
1,7 mg de NADP, sal monosódica
7,8 mg
glucosa-6-fosfato, sal
monosódica
6 Unidades de
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa,
Tipo VII de Levadura de panadería
\vskip1.000000\baselineskip
1) Mezclar 1 ul (5 mM) de
7-metoxi-4-(metilaminometil)cumarina,
5 ul (50 ug) de proteína microsómica CYP2D6 y 214 ul de tampón por
incubado (proporcionando 20 uM de
7-metoxi-4-(metilaminometil)cumarina
y 200 ug/ml de concentración de proteína final).
2) A cada pocillo de una placa de 96 pocillos
añadir 220 ul de mezcla de incubación y 5 ul del compuesto de
ensayo (o 5 ul de disolvente apropiado para los pocillos de control
- se puede usar metanol, acetonitrilo o DMSO ).
3) Preincubar la placa de pocillos múltiples en
el lector de placas a 37ºC durante 5 minutos. Calentar previamente
la solución de cofactor a 37ºC durante 5 minutos.
4) Añadir 25 ul de solución de cofactor a cada
pocillo y explorar con longitud de onda de excitación de 409 nm y
una longitud de onda de emisión de 485 nm con una gananciade 80.
Explorar durante 10 ciclos a intervalos de 1 minuto.
La confirmación de
7-metoxi-4-(metilaminometil)cumarina
como un sustrato de CYP2D6 se logró usando quinidina, un inhibidor
de diagnóstico de CYP2D6 (Otton et al, J. Pharm. Expt. Ther.,
1988, 247, 242-247). Con quinidina, se
inhibió el metabolismo (O-desaquilación) de
7-metoxi-4-(metilaminometil)cumarina
con una CI_{50} de 17 nM (Figura 1), un valor de inhibición
típico para otros, sustratos de CYP2D6, bien caracterizados.
Figura 1: Inhibición del metabolismo de
7-metoxi-4-(metilaminometil)cumarina
con quinidina.
Claims (5)
1. Un ensayo para evaluar los inhibidores de la
enzima CYP2D6 que comprende poner en contacto la enzima y un
compuesto de fórmula (I):
en la que R^{1} y R^{2}
independientemente representan hidrógeno o metilo. R^{3} es metilo
y al menos uno de R^{1} y R^{2} representa metilo, con un
compuesto de ensayo y medir la inhibición de
O-desalquilación del compuesto de fórmula (1) por
la
enzima.
2. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 1
en el que la inhibición de O-desalquilación del
compuesto de fórmula (I) por la enzima se mide cuantificando el
compuesto de fórmula (II):
en la que R^{1} y R^{2} son
como se definen en la reivindicación 1; mediante la detección de la
fluorescencia.
3. El ensayo de acuerdo con la reivindicación 2
en el que el compuesto de fórmula (II) se cuantifica mediante
exploración a una longitud de onda de excitación de 409 nm y una
longitud de onda de emisión de 485 nm.
4. El ensayo de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes en el que R^{1} es hidrógeno y R
es metilo.
5. El ensayo de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1-3 en el que R^{1} y R^{2}
ambos representan metilo.
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