ES2294861T3 - 7-alcoxicumarinas como sustratos para cyp2c9. - Google Patents
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Abstract
Un ensayo para probar agentes inhibidores de la enzima CYP2C9, que comprende poner en contacto la enzima y un compuesto de fórmula (I): ** ver fórmula** en la que R1 representa un grupo alquilo de C1-2, con un compuesto a ensayar y medir la inhibición de la O-desalquilación del compuesto de fórmula (I) por la enzima.
Description
7-alcoxicumarinas como sustratos
para CYP2C9.
Esta invención se refiere a compuestos, a
procedimientos para prepararlos y a su uso como sustratos
enzimáticos.
La mayoría de las interacciones de los fármacos
basadas en el metabolismo son un resultado de la inhibición de las
enzimas del grupo del citocromo P450. Las interacciones de fármacos
que implican enzimas P450 individuales pueden predecirse usando
métodos in vitro. Los ensayos típicos in vitro con
enzimas P450 implican la incubación de un sustrato apropiado con
una fuente de la enzima. Tradicionalmente, para la detección de
metabolitos en estas incubaciones se han usado métodos
cromatográficos de larga duración. Más recientemente, la
disponibilidad de lectores fluorimétricos de placas ha facilitado
en general los ensayos enzimáticos de mayor productividad. Adaptar
los ensayos con enzimas P450 a la tecnología de lectores de placas
fluorescentes requiere la identificación de sustratos con productos
fluorescentes apropiados para enzimas individuales. Entre los
citocromos P450 que metabolizan compuestos xenobióticos, el
citocromo CYP2C9 es uno de los normalmente responsables del
metabolismo de fármacos.
Para los ensayos de alta productividad de
exploración de la inhibición del citocromo CYP2C9 se ha descrito la
3-ciano-7-etoxicumarina
(Crespi et al, Anal. Biochem., 1997; 248,
188-190). Sin embargo, la velocidad del metabolismo
de la
3-ciano-7-etoxicumarina
por el citocromo CYP2C9 es baja y la extensión de la inhibición de
la
3-ciano-7-etoxicumarina
O-desalquilasa no siempre se correlaciona bien con
un ensayo de extracción en fase sólida para el citocromo CYP2C9,
por tanto la
3-ciano-7-etoxicumarina
no es adecuada para los ensayos de exploración de alta
productividad.
Ahora, se han identificado ciertos compuestos
que son mejores sustratos del citocromo CYP2C9 y que son de uso
para configurar ensayos de exploración de la inhibición de alta
productividad.
Según la presente invención, se proporciona un
ensayo para probar agentes inhibidores de la enzima CYP2C9 el cual
comprende poner en contacto a la enzima y a un compuesto de fórmula
(I):
en la que R^{1} representa un
grupo alquilo de C_{1-2}, con un compuesto a
ensayar y medir la inhibición de la
O-desalquilación del compuesto de fórmula (I) por la
enzima.
En un aspecto preferido de la invención R^{1}
es un grupo metilo.
En general, se conocerá la velocidad de
O-desalquilación del compuesto de fórmula (I) en
ausencia de compuesto a ensayar, como se conocerá la extensión de
O-desalquilación en momentos de tiempo dados. El
ensayo puede probar la inhibición de la
O-desalquilación continuamente o en momentos de
tiempo especificados.
La O-desalquilación del
compuesto de fórmula (I) tras la incubación con el citocromo CYP2C9
da un producto fluorescente fácilmente cuantificable de fórmula
(II):
el cual puede someterse a un
barrido con longitudes de onda de excitación y de emisión adecuadas,
por ejemplo una longitud de onda de excitación de 410 nm y una
longitud de onda de emisión de 510
nm.
\newpage
El ensayo puede llevarse a cabo en disolución o
usando un producto sólido. Cuando el ensayo se lleva a cabo en
disolución, los disolventes adecuados incluyen metanol, acetonitrilo
y DMSO.
El compuesto a ensayar puede preincubarse con la
enzima antes de la adición del sustrato, o alternativamente el
sustrato se puede añadir simultáneamente. Para conseguir una
velocidad adecuada de procesado para llevar a cabo el ensayo se
calculan las concentraciones finales de enzima y sustrato. Si se
desea, la reacción puede pararse, por ejemplo por adición de un
ácido o de un disolvente. El producto fluorescente de fórmula (II)
puede analizarse usando cualquier sistema convencional de detección
de fluorescencia, por ejemplo un sistema tipo placa de múltiples
pocillos/lector de placas fluorescentes.
Los compuestos de fórmula (I) y (II) son nuevos
y como tales forman parte de la invención.
Los compuestos de fórmula (I) y (II) pueden
prepararse por métodos convencionales, como por ejemplo se muestra
en el Esquema 1:
Esquema
1
Así, según otro aspecto de la invención se
proporciona un procedimiento para la producción de un compuesto de
fórmula (I) o (II), el cual comprende:
a) reacción de resorcinol y un
trifluoroacetosuccinato de dialquilo en el que los grupos alquilo se
seleccionan independientemente de un grupo alquilo de
C_{1-2}, en presencia de ácido polifosfórico;
b) Para los compuestos de fórmula (I), reacción
de la 7-hidroxicumarina resultante con un compuesto
de fórmula R^{1}Hal, en la que R^{1} es un grupo alquilo de
C_{1-2} y Hal es un átomo de halógeno, por ejemplo
yodo o bromo; y
c) hidrólisis del éster para dar el ácido de
fórmula (I) o (II).
La reacción de resorcinol con un
trifluoroacetosuccinato de dialquilo en presencia de ácido
polifosfórico puede realizarse adecuadamente a una temperatura de
aproximadamente 15-30ºC.
Las condiciones típicas de reacción para la
alquilación de una 7-hidroxicumarina con un haluro
de alquilo son bien conocidas por los expertos en la técnica e
incluyen un disolvente tal como acetona a reflujo en presencia de
una base tal como carbonato de potasio.
Las condiciones de reacción típicas para la
hidrólisis del éster son bien conocidas por los expertos en la
técnica e incluyen ácido clorhídrico diluido en metanol o etanol a
reflujo.
Los trifluoroacetosuccinatos de dialquilo de
fórmula 1 pueden prepararse a partir de los correspondientes
bromoacetato de alquilo y trifluoroacetoacetato de alquilo según la
ruta descrita en C. Aubert et al, J. Fluorine Chem. 1989,
44, 361. Los bromoacetatos y trifluoroacetoacetatos de alquilo están
comercialmente disponibles.
Puesto que la inhibición de las enzimas del
grupo del citocromo P450 es con frecuencia el mecanismo de las
interacciones fármaco/fármaco, el ensayo según la invención es
particularmente útil para identificar compuestos que pueden dar
lugar a interacciones fármaco/fármaco adversas. Por lo tanto, el
ensayo puede usarse en combinación con la modificación química de
los compuestos a ensayar para aumentar el potencial del compuesto a
ensayar para su uso como fármaco.
La modificación química del compuesto a ensayar
según este método puede realizarse usando técnicas bien conocidas
por los expertos en la técnica.
La actividad farmacéutica de tales compuestos
puede averiguarse fácilmente usando métodos biológicos de
exploración convencionales conocidos por los expertos en la
técnica.
La invención se ilustra por los siguientes
ejemplos.
Ejemplo
Se añade ácido polifosfórico (45 g) a una mezcla
de resorcinol (4,06 g) y trifluoroacetosuccinato de dietilo (9,96
g) (Aubert, C.; Begue, J. P.; Charpentier-Morize,
M.; Nee, G.; Langlois, B. J. Fluorine Chem. 1989, 44, 361). La
mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 24 h. Se añadió hielo
triturado y la mezcla se extrajo con diclorometano. La fase
orgánica se lavó con agua, después se secó (MgSO_{4}) y se
evaporó. El residuo se purificó por cromatografía de gel de sílice
(eluyente metanol al 2% en diclorometano) para dar el compuesto del
título (1,24 g) p.f. 112,5 - 114,0ºC.
\delta_{H}(CDCl_{3}) 1,30 (t, 3H), 3,96 (m, 2H), 4,24
(q, 2H), 6,66 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,75 (dd, J = 9,0,
2,5 Hz, 1 H), 7,55 (m, 1H); espectro de masas m/z 317
(MH^{+}).
Se añadió yoduro de metilo (0,41 mL) a una
mezcla de 2 (0,7 g), carbonato de potasio (0,46 g) y acetona (15
mL). La mezcla se calentó a reflujo durante 5 h. Después de enfriar,
el disolvente se evaporó y el residuo se repartió entre
diclorometano y agua. La fase orgánica se lavó con agua y después se
secó (MgSO_{4}) y se evaporó. El residuo se purificó por
cromatografía de gel de sílice (eluyente, metanol al 0,5% en
diclorometano) para dar el compuesto del título (0,62 g).
\delta_{H}(CDCl_{3}) 1,26 (t, 3H), 3,90 (s, 3H), 3,94
(m, 2H), 4,19 (q, 2H), 6,86 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 6,91 (dd,
J = 9,2, 2,6 Hz, 1H), 7,70 (m, 1H); espectro de masas
m/z 331 (MH^{+}).
Se calentó a reflujo una mezcla de 3 (0,615 g),
etanol (5 mL) y ácido clorhídrico diluido (3 M, 100 mL). Después de
6 h, la mezcla se enfrió y el sólido se recogió por filtración. El
sólido secado se cristalizó en éter de dietilo/hexano para dar el
compuesto del título (0,475 g) p.f. 198,5 - 200,0ºC (Encontrado: C,
51,60: H, 2,82. C_{13}H_{9}F_{3}O_{5} requiere C, 51,67; H,
3,00%); \delta_{H}(CDCl_{3}) 3,90 (s, 3H), 3,94 (m,
2H), 6,87 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 6,92 (dd J = 9,2, 2,6
Hz, 1H), 7,70 (m, 1H): espectro de masas m/z 325 (M +
Na^{+}), 303 (MH^{+}), 285 (M - OH^{-}).
Ácido
7-metoxi-4-trifluorometilcumarin-3-acético
6,25 mM (es decir, 1,88 mg/mL en DMSO).
NaHCO_{3} al 2% en peso - almacenado a
aproximadamente 4ºC.
Disolución amortiguadora del pH de fosfato de
potasio 50 mM, pH 7,4.
Disolución del cofactor recientemente preparada:
aproximadamente lo siguiente por mL de NaHCO_{3} al 2% en
peso:
NADP, sal monosódica, 1,7 mg.
Glucosa-6-fosfato,
sal monosódica, 7,8 mg.
6 unidades de
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa,
Tipo VII, de Bakers.
Levadura.
1) Se mezclan, por incubación, 1 \muL de ácido
7-metoxi-4-trifluorometilcumarin-3-acético
6,25 mM, 10 \muL (100 \mug) de proteína microsomal de citocromo
CYP2C9 y 209 \muL de disolución amortiguadora del pH (lo que da
una concentración final de 25 \muM de ácido
7-metoxi-4-trifluorometilcumarin-3-acético
y 400 \mug/mL de proteína).
2) A cada pocillo de una placa de 96 pocillos se
añadieron 220 \muL de mezcla de incubación y 5 \muL de
compuesto a ensayar en metanol. (o 5 \muL de disolvente apropiado
para los pocillos testigo - pueden usarse metanol, acetonitrilo o
DMSO).
3) La placa de múltiples pocillos se preincuba
en un lector de placas a 37ºC durante 5 minutos. La disolución del
cofactor se precalienta a 37ºC durante 5 minutos.
4) Se añaden 25 \muL de disolución del
cofactor a cada pocillo y se realiza un barrido con una longitud de
onda de excitación de 410 nm y una longitud de onda de emisión de
510 nm con una ganancia de 80. Se realiza el barrido durante 10
ciclos a intervalos de 1 minuto.
La confirmación del ácido
7-metoxi-4-trifluorometilcumarin-3-acético
como sustrato del citocromo CYP2C9 se logró usando sulfafenazol, un
agente inhibidor de diagnóstico del citocromo CYP2C9 (Back et
al, British Journal of Clinical Pharmacology, 1988, 26,
23-29). El ácido
7-metoxi-4-trifluorometilcumarin-3-acético
fue inhibido por el sulfafenazol con un IC_{50} de 0,29 \muM
(Figura 1), un valor típico de inhibición de otros sustratos, bien
caracterizados, del citocromo CYP2C9.
Claims (7)
1. Un ensayo para probar agentes inhibidores de
la enzima CYP2C9, que comprende poner en contacto la enzima y un
compuesto de fórmula (I):
en la que R^{1} representa un
grupo alquilo de C_{1-2}, con un compuesto a
ensayar y medir la inhibición de la
O-desalquilación del compuesto de fórmula (I) por la
enzima.
2. El ensayo según la reivindicación 1, en el
que R^{1} es un grupo metilo.
3. El ensayo según la reivindicación 1 ó 2, en
el que la inhibición de la O-desalquilación del
compuesto de fórmula (I) por la enzima se mide cuantificando el
compuesto de fórmula (II):
4. El ensayo según la reivindicación 3, en el
que el compuesto de fórmula (II) se cuantifica mediante detección
de fluorescencia.
5. El ensayo según la reivindicación 4, en el
que el compuesto de fórmula (II) se cuantifica realizando un
barrido a una longitud de onda de excitación de 410 nm y una
longitud de onda de emisión de 510 nm.
6. Un compuesto de fórmula (I) o (II), según la
reivindicación 1 ó 3.
7. Un procedimiento para la producción de un
compuesto de fórmula (I) o (II) según la reivindicación 1 ó 3, que
comprende:
a) reacción de resorcinol y un
trifluoroacetosuccinato de dialquilo en el que los grupos alquilo se
seleccionan independientemente de un grupo alquilo de
C_{1-2}, en presencia de ácido polifosfórico;
b) para los compuestos de fórmula (I), reacción
de la 7-hidroxicumarina resultante con un compuesto
de fórmula R^{1}Hal, en la que R^{1} es un grupo alquilo de
C_{1-2} y Hal es un átomo de halógeno, por ejemplo
yodo o bromo; e
c) hidrólisis del éster para dar el ácido de
fórmula (I) o (II).
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